CN113151440A - 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151440A CN113151440A CN202110380394.8A CN202110380394A CN113151440A CN 113151440 A CN113151440 A CN 113151440A CN 202110380394 A CN202110380394 A CN 202110380394A CN 113151440 A CN113151440 A CN 113151440A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aspirin
- kit
- pear1
- ltc4s
- adverse reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 31
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000008873 Angiotensin II receptor Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108050000824 Angiotensin II receptor Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims abstract description 3
- 101000978210 Homo sapiens Leukotriene C4 synthase Proteins 0.000 claims abstract 12
- 102100023758 Leukotriene C4 synthase Human genes 0.000 claims abstract 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 102100037111 Uracil-DNA glycosylase Human genes 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 5
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims 1
- 101000606878 Homo sapiens Platelet endothelial aggregation receptor 1 Proteins 0.000 abstract description 26
- 102100039710 Platelet endothelial aggregation receptor 1 Human genes 0.000 abstract description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 11
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 108010087711 leukotriene-C4 synthase Proteins 0.000 description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 5
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 208000025870 aspirin resistance Diseases 0.000 description 3
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 101150116826 LTC4S gene Proteins 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033309 Analgesic asthma syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000007211 cardiovascular event Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007213 cerebrovascular event Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000009862 primary prevention Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000009863 secondary prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用,其中,所述试剂盒针对LTC4S(A‑444C)、PEAR1(rs12041331)两个基因的多态性血管紧张素II受体抑制剂设计特异性扩增引物和测序引物,所述试剂盒包括如下组分:扩增反应液、LTC4S(A‑444C)测序引物、PEAR1(rs12041331)测序引物和阳性对照。本发明采用采用非对称多重PCR一管扩增产生大量的单链DNA,通过直接与羧基修饰素结合的氨基标记单链DNA特异捕获单链DNA,洗涤后加入测序引物和测序原料,进行焦磷酸测序,减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤,简化了测序处理的流程和时间,检测结果判读便捷、明确,能从基因层面指导阿司匹林的用药,为临床个性化用药给出基因角度的建议。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用,属于药物基因组检测领域。
背景技术
阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药,可抑制血小板活化、聚集,防止血栓形成,在心脑血管病的一、二级防治中,起着至关重要的作用。然而,临床发现部分长期服用阿司匹林的患者,心脑血管事件的发生率并未降低,即可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗(Aspirin resistance,AR)现象。有研究报道5%-40%的人存在阿司匹林抵抗。
白三烯C4合成酶(LTC4S)基因多态性rs730012(-444A>C)是位于LTC4S基因中的一个SNP,LTC4S基因启动区域第一个密码子上游的第444位核酸,形成了A至C的易位,基于rs730012,人群中存在三种基因型,AA/AC/CC。研究显示,LTC4S启动子上的rs730012(-444A>C)多态性与阿司匹林超敏反应的产生有关联,阿司匹林性哮喘患者中C等位基因频率更高,与阿司匹林高敏性有关。AA基因型,使用阿司匹林发生荨麻疹或哮喘的风险较低,AC基因型次之,CC基因型风险最高。
PEAR1(platelet endothelial aggregation receptor 1)基因是近年发现的与血小板聚集密切相关的基因,位于1号染色体,在血小板和内皮细胞均有高度的表达,其编码Ⅰ型膜蛋白,在胞外有多个酪氨酸和脯氨酸残基,在胞内有5个脯氨酸残基和1个NPXY922区域,均为磷酸化酪氨酸的结合位点。该基因可通过调控PI3K/PTEN通路,影响血小板的功能,为非Cox依赖性途径影响血小板聚集。在PEAR1的遗传变异中,rs12041331(A/G)可以改变它的表达。与G携带者相比,A携带者的阿司匹林肾上腺素诱导的血小板聚集显著降低,且AA诱导的血小板聚集不受阿司匹林剂量的影响。因此,rs12041331(A/G)位点多态性的检测有助于提供合理的用药治疗方案。
目前,对于基因多态性检测的方法有很多种,如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中,测序法和芯片法,操作步骤繁琐,检测周期长,且扩增产物容易产生污染;高分辨率熔解曲线法步骤简单,特异性偏低,且对仪器设备的要求较高;等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增,其引物设计难以最优化,检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高,对于多个基因的扩增通量不高。因此,需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物,PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50~100∶1。在PCR反应的最初10~15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后,非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。
常规焦磷酸测序前处理操作较为复杂和耗时,因此,设计开发一款可以结合不对称PCR技术的快速检测的焦磷酸检测试剂盒是十分必要的。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明的目的是以非对称多重PCR扩增和优化焦磷酸测序技术为基础,获得一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用。
为实现上述发明目的之一,本发明采用的一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用的技术方案如下:
本发明的试剂盒针对LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)两个基因的多态性血管紧张素II受体抑制剂设计特异性扩增引物和测序引物,所述试剂盒包括如下组分:扩增反应液、LTC4S(A-444C)测序引物、PEAR1(rs12041331)测序引物和阳性对照。
优选地,所述设计特异性引物,如下表所示:
即,所述LTC4S(A-444C)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2所示;所述PEAR1(rs12041331)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:4所示。
优选的,所述的LTC4S(A-444C)测序引物、PEAR1(rs12041331)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5~SEQ ID NO:6所示。
更优选的,所述的测序引物,为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物,既充当测序引物又作为捕获探针。该引物与扩增的单链DNA结合以后,经过简单洗涤即可直接用于测序反应。
更优选的,所述的测序引物,其制备过程包括将合成氨基标记的测序引物在结合液的情况下与羧基修饰素琼脂糖凝胶微颗粒混合,洗涤去除游离的测序引物,在保存液中2-8℃保存。
优选的,所述的扩增反应液,包括LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)特异性扩增引物,还包括PCR Buffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶、海藻糖、无核酸酶水;
更优选的,反应液各组分浓度分别为:LTC4S(A-444C)后引物(1.2uM),LTC4S(A-444C)后引物(0.02uM),PEAR1(rs12041331)前引物(1.2uM),PEAR1(rs12041331)后引物(0.02uM),PCR Buffer(1.5×),dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U),BSA(0.05mg/ml),海藻糖(0.2%),dUTP(0.5mM)、UDG酶(1U)和无核酸酶水(将体系补充至20μL)。
优选的,所述的阳性对照,包括浓度为20ng/ul的LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型,对未知样本的型别判定提供参考,同时对反应液的有效性进行质控。
本发明的另一个目的是公开一种采用上述试剂盒的血管紧张素II受体抑制剂用药相关的基因多态性检测方法,所述检测方法对待测的LTC4S(A-444C)和PEAR1(rs12041331)位点进行焦磷酸测序。所述焦磷酸测序的待测基因采用非对称多重PCR方式扩增获得。
具体的,所述检测方法包括以下步骤:
a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA,采用非对称多重PCR扩增进行扩增;
b.将10ul反应产物与3ul测序引物分别进行结合;
c.焦磷酸测序;
d.确定LTC4S(A-444C)位点、PEAR1(rs12041331)位点血管紧张素II受体抑制剂位点的基因型。
优选的,所述的反应体积为25ul,扩增条件为:酶处理37℃3min;预变性95℃,5min;
40个循环,95℃15s,60℃25s,72℃25s;最后延伸72℃4min。
本发明还公开了一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法的应用,所述用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒用于同时检测LTC4S(A-444C)和PEAR1(rs12041331)位点,以判断样本源的代谢类型。以从基因层面指导血管紧张素II受体抑制剂的用药。
本发明还公开了一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及方法的应用,所述检测试剂盒对LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)进行检测,以从基因层面指导阿司匹林疗效及不良反应预测。
与现有技术相比,本发明采用非对称多重PCR一管扩增LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331),产生大量的单链DNA。通过直接与羧基修饰素结合的氨基标记单链DNA特异捕获单链DNA,洗涤后加入测序引物和测序原料,进行焦磷酸测序,减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤,简化了测序处理的流程和时间,检测结果判读便捷、明确,能从基因层面指导阿司匹林的用药,为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
图1是本发明提供的LTC4S(A-444C)焦磷酸检测结果示例图;
图2是本发明提供的PEAR1(rs12041331)焦磷酸检测结果示例图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明,均为市场购买得到。
1、试剂盒的制备
本发明的试剂盒针对LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)设计了特异性扩增引物和测序引物,用于焦磷酸PCR检测。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。
本实施例的检测试剂盒包括如下组分:
本实施例的检测试剂盒扩增反应液单人份配置体系如下:
成分 | 体积(ul) |
水(自制) | 12.35 |
10×PCR buffer | 3.25 |
dNTPS(25mM) | 0.3 |
LTC4S(A-444C)后引物(20μM) | 1.5 |
LTC4S(A-444C)前引物(10μM) | 0.05 |
PEAR1(rs12041331)后引物(20μM) | 1.5 |
PEAR1(rs12041331)前引物(10μM) | 0.05 |
BSA(5mg/ml) | 0.25 |
海藻糖(20%) | 0.25 |
HS Taq(5U/μL) | 0.25 |
UNG酶(5U/μL) | 0.25 |
以上引物探针购自生工、dNTP(25mM)购自诺唯赞、10×PCR buffer、HS Taq(5U/μL)购自TAKARA、UNG酶(5U/μL)Thermo Fisher。
本实施例的检测试剂盒测序引物制备过程如下:
(1)MES溶液配置
①100mM MES,pH 4.8(100mL):
②2.13g MES(2-[N-morpholino]ethane sulfonic acid,MW 213.25).
③pH 4.8
(2)TT Buffer(50mL)
①12.5mL of 1M Tris buffer pH 8
(3)封闭液
(4)捕获磁珠制备
1)取500ul磁珠,吸磁1min,去上清;
2)取1000ml 100MES溶液洗涤吸磁1min,去上清,重复洗涤2次;
3)取10mg/ml EDS和10mg/ml NHS各500ul,加入捕获引物10ul。
4)25℃杂家30min
5)取1000ml封闭液混合均匀,吸磁1min,去上清;
6)取1000ml TT Buffer混合均匀,吸磁1min,去上清;重复洗涤3次;
7)加入1ml TE缓冲液溶解。
2、焦磷酸检测
本发明中采用的仪器如下:PCR扩增仪:ABI 2720 PCR仪;
焦磷酸测序仪:武汉菲思特生物科技有限公司。
(1)试剂准备
提前将试剂取出,室温融化,并将各组分涡旋振荡15秒,将试剂盒各组分低速离心待用。确定反应数N,N=待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μL/管分装至PCR反应管中。
(2)加样检测
将样本DNA、阳性对照和空白对照按5μL加样量加入到PCR反应管中,盖紧管盖,低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底,然后立即进行PCR扩增反应。所加入的待测样本DNA应大于20copies。
(3)PCR扩增
采用PCR仪进行PCR扩增,PCR反应体系为25μL,扩增条件:
(4)焦磷酸测序
1)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒与DNA序列的结合物3ul,再向其中加入PCR产物10μL,置于台式振荡器上,1100rpm振荡10min,使测序引物和单链PCR产物充分结合;
2)7,000×g离心1min,弃上清;
3)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液,7000g离心1min,弃上清;
4)测序管中分别加入3uL测序酶和3uL测序底物;
5)取一个dNTP排管,自圆滑一端向平端依次加入20μldATPαS、20μl dTTP、20μldGTP、20μl dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面,使得碱基平铺在排管底部;
6)根据仪器使用说明进行测序。测序结果如图1和图2所示。
(5)结果判读
1)有效性判定:
本试剂盒空白对照品的不通过,阳性对照品的检出结果为LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)型。
2)结果判定标准
a.LTC4S(A-444C)的DNA测序峰值图中,
C的频率≧90%,A的频率≦10%,即为CC型;
40%≦C的频率≦60%,40%≦A的频率≦60%,即为CA型;
A的频率≧90%,C的频率≦10%,即为AA型;
b.PEAR1(rs12041331)的DNA测序峰值图中,
A的频率≧90%,G的频率≦10%,即为PEAR1(rs12041331)AA型;
40%≦A的频率≦60%,40%≦G的频率≦60%,即为PEAR1(rs12041331)AG型;
G的频率≧90%,A的频率≦10%,即为PEAR1(rs12041331)GG型;
3、基因检测结果与代谢活性的相关性总结
通过检测结果可以判断样本源的代谢类型,从而进一步指导相应代谢途径的药物的用药剂量。
最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(19)
<400> 1
cttccgcaga ggagggttt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 2
cagaccccca catcatgctg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(21)
<400> 3
attcacaccc aggcttgaac t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(23)
<400> 4
cgaccctaca aaggaagcac taa 23
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 5
agcctggatg gggac 15
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(18)
<400> 6
ccttctgctg tctcactt 18
Claims (10)
1.一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒针对LTC4S A-444C、PEAR1 rs12041331两个基因的多态性血管紧张素II受体抑制剂设计特异性扩增引物和测序引物,所述试剂盒包括如下组分:扩增反应液、LTC4S A-444C测序引物、PEAR1 rs12041331测序引物和阳性对照。
2.根据权利要求1所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒,其特征在于,所述扩增反应液包括LTC4S A-444C、PEAR1 rs12041331两个基因的的特异性引物,所述LTC4SA-444C的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2所示;所述PEAR1rs12041331的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒,其特征在于,所述LTC4S A-444C测序引物、PEAR1 rs12041331测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5~SEQID NO:6所示。
4.根据权利要求3所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒,其特征在于,测序引物为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物。
5.根据权利要求4所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒,其特征在于,所述测序引物为:将合成氨基标记的测序引物在结合液的情况下与羧基修饰素琼脂糖凝胶微颗粒混合而成。
6.根据权利要求1所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒,其特征在于,所述扩增反应液还包括LTC4S A-444C、PEAR1 rs12041331特异性扩增引物,还包括PCRBuffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶和海藻糖。
7.根据权利要求6所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒,其特征在于,所述扩增反应液中各浓度分别为:LTC4S A-444C后引物1.2uM,LTC4S A-444C后引物0.02uM,PEAR1 rs12041331前引物1.2uM,PEAR1 rs12041331后引物0.02uM,PCR Buffer 1.5×,dNTPS 0.3mM、HS-Taq酶1U,BSA 0.05mg/ml,海藻糖0.2%,dUTP 0.5mM、UDG酶1U。
8.一种采用根据权利要求1~7任一所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒的检测方法,其特征在于,所述检测方法对待测的LTC4S A-444C和PEAR1 rs12041331位点进行焦磷酸测序。
9.一种根据权利要求8所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的检测方法,其特征在于,所述焦磷酸测序的待测基因采用非对称多重PCR方式扩增获得。
10.一种根据权利要求1~7任一所述的用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒的应用,其特征在于,所述用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒用于同时检测LTC4SA-444C和PEAR1 rs12041331位点,以判断样本源的代谢类型。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110380394.8A CN113151440A (zh) | 2021-04-09 | 2021-04-09 | 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110380394.8A CN113151440A (zh) | 2021-04-09 | 2021-04-09 | 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113151440A true CN113151440A (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76889194
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110380394.8A Pending CN113151440A (zh) | 2021-04-09 | 2021-04-09 | 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113151440A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113667752A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-11-19 | 菲思特(上海)生物科技有限公司 | 一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 |
CN113755572A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-12-07 | 菲思特(上海)生物科技有限公司 | 一种用于嘌呤类药物代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 |
CN116904584A (zh) * | 2023-09-11 | 2023-10-20 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104946783A (zh) * | 2015-07-18 | 2015-09-30 | 武汉欧瑞康安生物科技有限公司 | 阿司匹林抵抗相关的cox-1基因多态性位点及应用 |
CN106434943A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-02-22 | 中源协和基因科技有限公司 | 一种用于阿司匹林个体化用药相关基因snp检测的试剂盒及其检测方法 |
CN109652532A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-19 | 中国人民解放军总医院 | 一种检测心血管系统用药的标志物 |
CN110066868A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-07-30 | 大连美纳医学检验实验室有限公司 | 一种阿司匹林药物相关基因基因多态性检测的引物组、试剂盒及检测方法 |
CN111057756A (zh) * | 2019-12-03 | 2020-04-24 | 杜睿 | 阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线pcr法检测试剂 |
CN111893173A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-11-06 | 福州艾迪康医学检验所有限公司 | 检测基因pear1 snp位点的引物、方法和试剂盒 |
-
2021
- 2021-04-09 CN CN202110380394.8A patent/CN113151440A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104946783A (zh) * | 2015-07-18 | 2015-09-30 | 武汉欧瑞康安生物科技有限公司 | 阿司匹林抵抗相关的cox-1基因多态性位点及应用 |
CN106434943A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-02-22 | 中源协和基因科技有限公司 | 一种用于阿司匹林个体化用药相关基因snp检测的试剂盒及其检测方法 |
CN109652532A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-19 | 中国人民解放军总医院 | 一种检测心血管系统用药的标志物 |
CN110066868A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-07-30 | 大连美纳医学检验实验室有限公司 | 一种阿司匹林药物相关基因基因多态性检测的引物组、试剂盒及检测方法 |
CN111057756A (zh) * | 2019-12-03 | 2020-04-24 | 杜睿 | 阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线pcr法检测试剂 |
CN111893173A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-11-06 | 福州艾迪康医学检验所有限公司 | 检测基因pear1 snp位点的引物、方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
戴亨纷等: "阿司匹林相关基因的研究及临床应用进展", 《心肺血管病杂志》 * |
邢晓清等: "焦磷酸测序技术对阿司匹林个体化用药相关SNP位点分型", 《中国药科大学学报》 * |
钱豪英等: "对药物基因检测结果分析及应用", 《药学与临床研究》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113755572A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-12-07 | 菲思特(上海)生物科技有限公司 | 一种用于嘌呤类药物代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 |
CN113667752A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-11-19 | 菲思特(上海)生物科技有限公司 | 一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 |
CN116904584A (zh) * | 2023-09-11 | 2023-10-20 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法 |
CN116904584B (zh) * | 2023-09-11 | 2023-12-12 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113151440A (zh) | 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用 | |
CN108251522B (zh) | 人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途 | |
CN104328164A (zh) | 荧光探针杂交法检测人egfr基因突变试剂盒 | |
CN111118138A (zh) | 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法 | |
CN111690748B (zh) | 使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组、试剂盒及微卫星不稳定的检测方法 | |
JP2022189882A (ja) | minor BCR-ABL1遺伝子を検出する方法 | |
CN106834434B (zh) | 用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法 | |
CN104894230A (zh) | 一种hla-dqb1基因分型的组特异性引物pcr-sbt方法及试剂 | |
CN113549686A (zh) | 一种钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 | |
CN113249463A (zh) | 一种用于血管紧张素ii受体抑制剂用药的基因检测试剂盒及其检测方法和应用 | |
CN110592217A (zh) | 一种检测外周血游离dna中kras基因突变的试剂盒及其应用 | |
CN113151441A (zh) | 一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用 | |
EP2450443B1 (en) | Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods | |
KR101359782B1 (ko) | 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성 | |
KR101890350B1 (ko) | 돼지의 육질 예측용 snp 마커 및 이의 용도 | |
CN113403381A (zh) | 一种用于他汀类药物疗效预测的检测试剂盒及其检测方法和应用 | |
CN105018490A (zh) | 用于检测人类mthfr基因多态性的引物对、探针及试剂盒 | |
CN113584161A (zh) | 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 | |
EP3350347B1 (en) | Methods and materials for detection of mutations | |
CN111876482A (zh) | 同时检测人mthfr和mtrr基因的试剂盒 | |
CN110295218B (zh) | 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法 | |
EP3494236B1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
CN108531598B (zh) | Ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
TWI567202B (zh) | 檢測酒精代謝基因之方法及套組 | |
KR101724130B1 (ko) | 장 베체트병 진단용 바이오마커 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210723 |