CN113584161A - 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113584161A
CN113584161A CN202110662478.0A CN202110662478A CN113584161A CN 113584161 A CN113584161 A CN 113584161A CN 202110662478 A CN202110662478 A CN 202110662478A CN 113584161 A CN113584161 A CN 113584161A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fentanyl
primer
sequencing
amplification
detection kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202110662478.0A
Other languages
English (en)
Inventor
孙悦
刘丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Feisite Precision Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Hunan Feisite Precision Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Feisite Precision Medical Technology Co ltd filed Critical Hunan Feisite Precision Medical Technology Co ltd
Priority to CN202110662478.0A priority Critical patent/CN113584161A/zh
Publication of CN113584161A publication Critical patent/CN113584161A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测芬太尼代谢标志物ABCB C3435T、OPRM1A118G两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：ABCB1C3435T扩增引物、ABCB1C3435T测序引物、OPRM1A118G扩增引物、OPRM1A118G测序引物和阳性对照。本发明以血液直扩、快速扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对芬太尼剂量和疗效预测相关的基因多态性进行检测，为芬太尼剂量和疗效预测临床使用给出基因角度的建议。

Description

一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
背景技术
疼痛是中晚期癌症患者的常见症状之一，目前世界疼痛大会已将疼痛确认为“第五大生命指征”。据估计，全球上千万癌症患者中，约30％以上的患者有不同程度的癌症相关性疼痛晚期癌症患者的疼痛发生率高达75％。药物治疗是癌症疼痛治疗的主要方法之一，而阿片类止痛药物是中重度癌痛治疗的一线药物，其中包括吗啡、羟考酮、芬太尼等，不同患者阿片类药物有效镇痛剂量有明显个体差异。由于受到多种因素的影响，我国仅有41％的癌痛患者能够得到有效治疗，而晚期癌痛患者中仅25％可以得到有效缓解。阿片类药物的镇痛作用及不良反应主要通过阿片受体介导，经典阿片受体有μ阿片受体(MOR)、δ阿片受体(DOR)及κ阿片受体(KOR)，其中μ阿片受体是目前大多数阿片类药物的主要作用受体。μ阿片受体又可分为μ1和μ2两种亚型，阿片类药物主要激动μ1受体产生镇痛作用，激动μ2受体产生不良。目前现有阿片类药物对μ阿片受体激动无明显选择性,研究发现，μ阿片受体编码基因(OPRM1)多态性与阿片类药物镇痛作用有关，以A118G位点关系最为密切，该基因位点突变常导致镇痛疗效、不良反应和阿片耐受出现个体差异，以及阿片成瘾倾向的变化。
OPRM1(A118G)基因突变会引起编码μ阿片受体蛋白改变，影响吗啡活性代谢产物吗啡－6－葡萄糖醛酸对受体的激动，导致吗啡的镇痛疗效存在个体差异。A118G突变是OPRM1基因第118位的核苷酸由腺苷酸(A)突变为鸟苷酸(G)，使μ阿片受体第40位氨基酸天冬酰胺被天冬氨酸取代。OPRM1(A118G)基因可根据突变类型分为AA型、AG型及GG型三种基因型。AG及GG基因型为G等位基因携带，AA及AG基因型为A等位基因携带。OPRM1(A118G)基因位点突变也使得μ阿片受体的数量减少及其活化受抑制，最终导致阿片类药物作用效能下降，在癌症患者吗啡镇痛治疗的研究中发现，OPRM1(A118G) 基因G等位基因的携带会增加吗啡的使用剂量。OPRM1(A118G)基因突变会降低癌痛患者对阿片类药物的敏感性，导致镇痛作用下降，从而增加阿片类药物用量
ATP结合盒B亚家族成员1转运蛋白(ATP-binding cas-sette subfamily Bmember 1 transporter，ABCBI)基因位于人体7号染色体的q21，片段大小在49、209个碱基对之间，包含28个外显子。P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，也可称为多药耐药性蛋白1(multidruesistance protein 1，MDRI),是ABCBI/MDRI基因编码的转运蛋白。P-gp在体内存在于具有分泌功能的上皮细胞，包括结肠、小肠、胆管、胰腺、肾上腺以及肾近端小管等，并且在脑部的微血管内皮细胞中存在高度表达，在多种药物转运和通过血脑屏障中起到重要作用。常用的阿片类药物如美沙酮、吗啡、哌替啶等均是P-gp的底物。药物作用靶点或受体基因(如OPRMI)、转运蛋白基因(如ABCBI)多态性的对阿片类药物镇痛治疗效果和不良反应的发生及程度均有一定影响，尤其药物受体基因OPRMI基因对态性影响较明显，因此开展阿片类药物相关用药基因检测，可减少用药盲目性，提高药物治疗精准性。目前，对于基因多态性检测的方法主要有直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉的检测基因多态性的方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
本发明的快速反应试剂盒针对ABCB(C3435T)、OPRM1(A118G)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、ABCB(C3435T) 测序引物、OPRM1(A118G)测序引物、阳性对照。
优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
Figure BDA0003115656310000021
Figure BDA0003115656310000031
优选的，所述ABCB(C3435T)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:2所示；所述OPRM1(A118G)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。
优选的，所述的ABCB(C3435T)测序引物、OPRM1(A118G)测序引物分别如序列表SEQID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定
优选的，ABCB(C3435T)测序引物对应的测序区域为ABCB(C3435T)待检序列，如序列表SEQ ID NO:7所示；OPRM1(A118G)测序引物对应的测序区域为OPRM1(A118G) 待检序列，如序列表SEQ ID NO:8所示。
优选的，ABCB(C3435T)和OPRM1(A118G)共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:9所示。
优选的，所述的扩增反应液，包括，ABCB(C3435T)和OPRM1(A118G)特异性扩增引物，还包括血液样品直接PCR预混液(2×)、海藻糖；
更优选的，反应液各组分浓度分别为ABCB(C3435T)前引物(0.2uM)，ABCB(C3435T)后引物(0.2uM)，OPRM1(A118G)前引物(0.25uM)，OPRM1(A118G)后引物(0.25uM)， PCR预混液(1×)，海藻糖(0.2％)；
优选的，所述的PCR预混液为Blood Direct PCR Master Mix(2×)，含有耐血的HemoTaq TM DNA聚合酶，对全血中血红素等各种PCR抑制剂表现出超强的抗性。
优选的，为获得最高的检测灵敏度，20μl的PCR扩增体系中最大加入的血液量可以达到4μl，即20％体积。
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul ABCB 3435C/T和OPRM1 118A/G的型基因组DNA，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
优选的，所述的反应体积为20ul，反应条件为：预变性温度设为95℃，预变性时间设为5min，变性温度设为95℃，变性时间设为0s，退火延伸温度设为60℃，退火延伸时间设为0s，扩增40个循环。
优选的，扩增所采用的PCR管密封薄膜，在PCR反应孔处具有与加热柱匹配的凹陷设计，其厚度为85μm，贴合度高，热传递快。更优选的，PCR管密封薄膜具穿透性，可用移液器枪头或探针穿透进行产物回收。PCR反应管的结构示意图见图2。
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的芬太尼剂量和疗效预测相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
a.将所述扩增反应液与4ul待测EDTA抗凝全血混合均匀进行PCR扩增；
b.将含链霉亲和素标记微珠的结合液与扩增产物进行混合；
c.加入洗涤缓冲液漂洗；
d.变性液处理得到单链产物；
e.加入洗涤缓冲液漂洗；
f.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
g.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、ABCB(C3435T) 测序引物、OPRM1(A118G)测序引物、ddTTP；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
h.焦磷酸测序；
i.确定ABCB C3435T、OPRM1 A118G的基因型。
本发明还公开了一种用于芬太尼剂量和疗效预测试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒对ABCB(C3435T)、OPRM1(A118G)进行检测，以从基因层面进行芬太尼剂量和疗效预测。
针对现有技术存在的上述问题，本发明的ABCB(C3435T)、OPRM1(A118G)的快速扩增方法主要从三方面进行了优化，一方面采用血液直扩的方式，免去核酸提取的步骤，只需将样品与其他PCR必须的组分加入反应管中混匀即可。另一方面通过将PCR仪加热模块设计由加热底座和加热柱两部分组成，加热柱四周与底座相连中间与反应孔对应的，该加热模块在PCR扩增时伸入PCR反应管中，使反应液分散在加热柱和PCR管壁之间，从中间和四周同时变化温度，可以显著地提高热传递效率，降低了反应液各部分的温度变化差异，提高了反应液整体的温度一致性和变温速度，为PCR的快速扩增提供了另一关键要素。第三方面采用双重PCR扩增ABCB(C3435T)、OPRM1(A118G)两个位点，同时一次反应进行两个位点的焦磷酸测序。该测序首先加ABCB(C3435T)测序引物与测序原料进行焦磷酸测序，最后一个碱基加入ddNTP终止该测序反应。再加入OPRM1(A118G)测序引物和相应的dNTP进行测序。一次处理先后进行两个位点的测序，减少了操作的时间和提高了测序的通量。
与现有技术相比，本发明以血液直扩、快速扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对芬太尼剂量和疗效预测相关的基因多态性进行检测，为芬太尼剂量和疗效预测临床使用给出基因角度的建议。
附图说明
图1是本发明提供的不同EDTA抗凝全血体积下的电泳效果图；
图2是本发明提供的PCR反应管的结构示意图；
图3是本发明提供的ABCB(C3435T)/OPRM1(A118G)分别为CC/AA型测序结果示例图；
图4是本发明提供的ABCB(C3435T)/OPRM1(A118G)分别为CC/AG型测序结果示例图；
图5是本发明提供的ABCB(C3435T)/OPRM1(A118G)分别为CC/GG型测序结果示例图；
图6是本发明提供的ABCB(C3435T)/OPRM1(A118G)分别为CT/AA型测序结果示例图；
图7是本发明提供的ABCB(C3435T)/OPRM1(A118G)分别为CT/AG型测序结果示例图；
图8是本发明提供的ABCB(C3435T)/OPRM1(A118G)分别为CT/GG型测序结果示例图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1、试剂盒的制备
本发明的快速反应试剂盒针对ABCB(C3435T)、OPRM1(A118G)设计了特异性扩增引物和测序引物，用于扩增和焦磷酸测序检测。基于快速扩增技术设计引物是本发明的关键之一，为保证扩增速度及检测灵敏度，扩增长度应控制在60-90bp。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。
(一)本实施例的引物序列如下：
Figure BDA0003115656310000061
(二)本实施例的检测试剂盒包括如下组分：
Figure BDA0003115656310000062
(三)本实施例的检测试剂盒PCR反应液单人份配置体系如下：
PCR反应液各组分浓度分别为：ABCB(C3435T)前引物(0.2uM)，ABCB(C3435T) 后引物(0.2uM)，OPRM1(A118G)前引物(0.25uM)，OPRM1(A118G)后引物(0.25uM)， PCR预混液(1×)，海藻糖(0.2％)；其中Easy-LoadTM Blood Direct PCR Master Mix(2×)购自上海钰博生物科技有限公司。
成分 体积(ul)
Blood Direct PCR Master Mix(2×) 10
Nuclease-Free Water 4
ABCB(C3435T)前引物(10μM) 0.4
ABCB(C3435T)后引物(10μM) 0.4
OPRM1(A118G)前引物(10μM) 0.5
OPRM1(A118G)后引物(10μM) 0.5
海藻糖(20％) 0.2
配置完成后200ul/管进行分装。
实施例2、焦磷酸检测
本发明中采用的仪器如下：扩增仪、焦磷酸测序仪(武汉菲思特生物科技有限公司)。
(1)试剂准备(试剂准备室)
提前将试剂取出，并将PCR反应液涡旋振荡15秒，低速离心待用。。确定反应数N， N＝待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按16μL/管分装至PCR反应管中。
(2)加样检测(样本制备间)
将EDTA抗凝全血、阳性对照和空白对照按4μL加样量加入到PCR反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。
(3)PCR扩增(扩增间)
采用PCR仪进行扩增，反应体系为20μL，扩增条件：
Figure BDA0003115656310000071
(4)焦磷酸测序
1)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入PCR产物10μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和PCR产物充分结合；
2)7,000×g离心1min，弃上清；
3)加入22uL稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000×g离心1min，EP管收集得到单链产物。
4)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7,000×g离心1min。
5)将EP管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3uL测序酶和3uL测序底物。
6)取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、ABCB(C3435T) 测序引物、OPRM1(A118G)测序引物、ddTTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部。
7)焦磷酸测序；测序结果如图3～8所示。
(5)结果判读
1)有效性判定：
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为ABCB 3435C/T和OPRM1118A/G型。
2)结果判定标准
a.ABCB(C3435T)的DNA测序峰值图中，
CC的频率≧90％，T的频率≦10％，即为CC型；
40％≦C的频率≦60％，40％≦T的频率≦60％，即为CT型；
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为TT型；
b.OPRM1(A118G)的DNA测序峰值图中，
A的频率≧90％，G的频率≦10％，即为AA型；
40％≦A的频率≦60％，40％≦G的频率≦60％，即为AG型；
G的频率≧90％，A的频率≦10％，即为GG型
(6)辅助诊断
不同基因型方案如下：
Figure BDA0003115656310000081
实施例3、不同EDTA抗凝全血体积下的扩增效率
Blood Direct PCR Master Mix(2×)，含有耐血的HemoTaqTM DNA聚合酶和抗抑制剂，对全血中血红素等各种PCR抑制剂表现出超强的抗性。分别加入占PCR反应液5％、10％、20％、30％、40％、50％体积的EDTA抗凝全血。对最大加入全血样本体积进行测试。测试具体结果见图1，试验表明20％体积EDTA抗凝全血对扩增效率无影响。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110>湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120>一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
<160>9
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(24)
<400>1
cattgctgag aacattgcct atgg 24
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(20)
<400>2
ggcatgtatg ttggcctcct 20
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(21)
<400>3
ttggcgtact caagttgctc c 21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(20)
<400>4
ccaggaagtt tccgaagagc 20
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(15)
<400>5
ctttgctgcc ctcac 15<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(19)
<400>6
caacttgtcc cacttagat 19
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(20)
<400>7
datctcttcc tgtgacacca 20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(21)
<400>8
ggcracctgt ccgacccatg c 21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>unsure
<222>(1)..(20)
<400>9
cgtatctcdd tcgtcgactg 20
序列表
<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(24)
<400> 1
cattgctgag aacattgcct atgg 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 2
ggcatgtatg ttggcctcct 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(21)
<400> 3
ttggcgtact caagttgctc c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 4
ccaggaagtt tccgaagagc 20
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 5
ctttgctgcc ctcac 15
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(19)
<400> 6
caacttgtcc cacttagat 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 7
datctcttcc tgtgacacca 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(21)
<400> 8
ggcracctgt ccgacccatg c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 9
cgtatctcdd tcgtcgactg 20

Claims (10)

1.一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测芬太尼代谢标志物ABCB C3435T、OPRM1 A118G两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：ABCB1 C3435T扩增引物、ABCB1 C3435T测序引物、OPRM1 A118G扩增引物、OPRM1 A118G测序引物和阳性对照。
2.根据权利要求1所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1C3435T扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述OPRM1A118G扩增引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1C3435T测序引物如序列表SEQ ID NO:5所示，OPRM1 A118G测序引物如序列表SEQ ID NO:6所示。
5.根据权利要求1所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括血液样品直接PCR预混液和海藻糖。
6.根据权利要求5所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR预混液为Blood Direct PCR Master Mix。
7.根据权利要求1所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分浓度为：ABCB(C3435T)前引物(0.2uM)，ABCB(C3435T)后引物(0.2uM)，OPRM1(A118G)前引物(0.25uM)，OPRM1(A118G)后引物(0.25uM)，PCR预混液(1×)，海藻糖(0.2％)。
8.根据权利要求1所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照，包括浓度为20ng/ul的ABCB1 C3435T、OPRM1 A118G杂合型基因组DNA。
9.一种采用权利要求1～8任一项所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
a.将所述扩增反应液与4ul待测EDTA抗凝全血混合均匀进行PCR扩增；
b.将含链霉亲和素标记微珠的结合液与扩增产物进行混合；
c.加入洗涤缓冲液漂洗；
d.变性液处理得到单链产物；
e.加入洗涤缓冲液漂洗；
f.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
g.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、ABCB C3435T测序引物、OPRM1 A118G测序引物、ddTTP；
h.焦磷酸测序。
10.一种根据权利要求1所述的芬太尼代谢标志物的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于体外检测待测样本中的ABCB1 C3435T和OPRM1 A118G基因多态性。
CN202110662478.0A 2021-06-15 2021-06-15 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 Withdrawn CN113584161A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110662478.0A CN113584161A (zh) 2021-06-15 2021-06-15 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110662478.0A CN113584161A (zh) 2021-06-15 2021-06-15 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113584161A true CN113584161A (zh) 2021-11-02

Family

ID=78243700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110662478.0A Withdrawn CN113584161A (zh) 2021-06-15 2021-06-15 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113584161A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107479A (zh) * 2021-11-04 2022-03-01 上海普然生物科技有限公司 一种用于放疗敏感性检测的试剂盒及其检测方法
CN115547513A (zh) * 2022-11-22 2022-12-30 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) 一种鞘内阿片类镇痛药使用剂量的预测方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766689A (zh) * 2012-04-17 2012-11-07 盛司潼 一种增加测序读长的测序方法
CN103695531A (zh) * 2013-10-17 2014-04-02 山东博思源生物技术有限公司 Abcb1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒
US20140274763A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Pathway Genomics Corporation Method and system to predict response to pain treatments
CN107586838A (zh) * 2017-10-25 2018-01-16 长沙三济生物科技有限公司 用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对及试剂盒
CN108456724A (zh) * 2018-03-23 2018-08-28 宁波大学 一种包含阿片受体基因的检测试剂盒及其检测方法
CN108707658A (zh) * 2018-06-12 2018-10-26 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种个体化用药基因检测试剂盒及应用
CN110093415A (zh) * 2019-04-30 2019-08-06 上海百傲科技股份有限公司 检测cyp3a5基因的方法、试剂盒、引物对及探针
CN111808943A (zh) * 2020-06-18 2020-10-23 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种精神类个体化用药基因检测方法
CN111808944A (zh) * 2020-06-18 2020-10-23 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种儿童个体化用药基因检测方法
CN112626185A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 郑州大学第一附属医院 一种快速、便携式荧光定量pcr检测装置及方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766689A (zh) * 2012-04-17 2012-11-07 盛司潼 一种增加测序读长的测序方法
US20140274763A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Pathway Genomics Corporation Method and system to predict response to pain treatments
CN103695531A (zh) * 2013-10-17 2014-04-02 山东博思源生物技术有限公司 Abcb1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒
CN107586838A (zh) * 2017-10-25 2018-01-16 长沙三济生物科技有限公司 用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对及试剂盒
CN108456724A (zh) * 2018-03-23 2018-08-28 宁波大学 一种包含阿片受体基因的检测试剂盒及其检测方法
CN108707658A (zh) * 2018-06-12 2018-10-26 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种个体化用药基因检测试剂盒及应用
CN110093415A (zh) * 2019-04-30 2019-08-06 上海百傲科技股份有限公司 检测cyp3a5基因的方法、试剂盒、引物对及探针
CN111808943A (zh) * 2020-06-18 2020-10-23 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种精神类个体化用药基因检测方法
CN111808944A (zh) * 2020-06-18 2020-10-23 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种儿童个体化用药基因检测方法
CN112626185A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 郑州大学第一附属医院 一种快速、便携式荧光定量pcr检测装置及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SALUMEH BASTAMI等: "Influence of UGT2B7, OPRM1 and ABCB1 Gene Polymorphisms on Postoperative Morphine Consumption", 《BCPT》, pages 423 - 431 *
张雪莹: "OPRM1 A118G，COMT V158M，ABCB1 C3435T基因多态性对术后患者镇痛效果的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》, pages 4 - 7 *
徐蕾 等: "PCR增强剂在核酸体外扩增检测技术的研究进展", 《生物技术进展》, pages 139 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107479A (zh) * 2021-11-04 2022-03-01 上海普然生物科技有限公司 一种用于放疗敏感性检测的试剂盒及其检测方法
CN114107479B (zh) * 2021-11-04 2024-03-01 武汉菲思特生物科技有限公司 一种用于放疗敏感性检测的试剂盒及其检测方法
CN115547513A (zh) * 2022-11-22 2022-12-30 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) 一种鞘内阿片类镇痛药使用剂量的预测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112080563B (zh) 一种检测慢性病精准用药基因的试剂盒
CN113584161A (zh) 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN104328164A (zh) 荧光探针杂交法检测人egfr基因突变试剂盒
CN110541033A (zh) Egfr基因突变检测用组合物及检测方法
CN113151440A (zh) 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用
CN106755320B (zh) 用于检测人类oprm1基因a118g位点多态性的核酸、试剂盒及方法
CN113755576A (zh) 一种用于静脉血栓风险评估的检测试剂盒及其检测方法和应用
KR101359782B1 (ko) 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성
CN113549686A (zh) 一种钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
US20100093549A1 (en) Polynucleotide associated with a colon cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing a colon cancer using the polynucleotide
CN111349691A (zh) Egfr基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法
CN113755574A (zh) 一种甲强龙代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法
CN113549681A (zh) 一种他莫昔芬代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113667743A (zh) 一种用于布地奈德代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113528629A (zh) 一种甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113512585A (zh) 一种曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒及其检测方法和应用
CN112646869B (zh) 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒
CN113817815A (zh) 一种用于西酞普兰和艾司西酞普兰代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113462758A (zh) 一种顺铂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN111378739B (zh) 一种检测cyp2c19基因多态性的检测位点、引物组合物及其应用
CN112695083B (zh) 一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物及试剂盒
CN113755578A (zh) 一种用于昂丹司琼和托烷司琼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113584143A (zh) 一种硝酸甘油代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113584160A (zh) 一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113584150A (zh) 一种伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20211102