CN108456724A - 一种包含阿片受体基因的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，包含两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物及两个甲基化特异性测序引物，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关；同时，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物均包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物。本发明通过检测与阿尔茨海默病相关的两对阿片受体基因启动子区甲基化程度辅助诊断阿尔茨海默病，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于阿尔茨海默病的早起发现和及时治疗。
Description
技术领域
本发明涉及检测阿尔茨海默病的试剂盒技术领域，尤其涉及一种包含阿片受体基因的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种系统性神经退行性疾病，其临床表现为高级认知功能低下，主要特征包括脑细胞内神经纤维缠结及细胞外老年斑。阿尔茨海默病患者需要终生护理，因此给社会和家庭带来极大的经济负担。阿尔茨海默病是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，寻找阿尔茨海默病相关基因进而阐明痴呆症发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展阿尔茨海默病的病因研究，且研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性与阿尔茨海默病的关联性上，但其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了阿尔茨海默病预防及治疗水平的提高。
阿片受体(opioid receptor)广泛存在于人的神经系统中。μ阿片受体(mu-opioidreceptor)由OPRM1基因编码，是吗啡的主要靶分子及其药理作用的主要目标。有趣的是，最近的研究结果表明，μ阿片受体能够减轻β蛋白低聚物诱导的神经毒性。阿片受体孤啡肽受体1(OPRL1)在中枢神经系统中广泛表达，包括海马齿状回的皮层，纹状体，丘脑，下丘脑。OPRL1已发现在认知中起着重要的作用，同时参与炎症调节和免疫反应。此外，本申请人之前还研究得到，κ阿片受体基因(OPRK1)与δ阿片受体基因(OPRD1)甲基化的增加与阿尔茨海默病发病有紧密的联系。
目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与阿尔茨海默病相关的阿片受体基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测准确率高，针对性强、检测方便的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，包含两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物及两个甲基化特异性测序引物，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关；同时，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物均包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物。
优选地，所述阿片受体基因OPRM1启动子区甲基化特异性扩增引物包括以下核苷酸序列：
所述OPRM1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5'-biotin-TAGTTAGGATTGGTTTTTGTAAGAAATAG-3'；
所述OPRM1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5'-ATACCCCAAAACATCAATACAATTACTAAC-3'；
所述OPRM1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5'-CTATACCAAATAACCAAAAACAC-3'；
优选地，所述阿片受体基因OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物包括以下核苷酸序列：
所述OPRL1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5'-biotin-GTTTGTTTAGTTTGGGAAAGAGG-3'；
所述OPRL1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5'-ACACAAAAATCTCCCCCTTC-3'；
所述OPRL1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5'-ACCCCCCACAACACA-3'。
一种包含阿片受体基因的检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；
步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶，并加入一对所述OPRM1、OPRL1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤四：将步骤三中得到的PCR扩增产物中加入至包含退火缓冲液的PSQ96板中并充分反应，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，使用真空准备工具吸附磁珠后，再将放有PCR扩增产物的PSQ96板加热至80℃并冷却至室温后，进行焦磷酸测序。
优选地，所述的步骤三中的PCR扩增条件为：首先在温度95℃加热10min至变性，然后重复30-50个退火反应，所述退火反应的条件为在温度95℃加热30s，复性40s，在温度72℃下延伸50s；最后在温度72℃延伸7min。
与现有技术相比，本发明的优点在于通过检测与阿尔茨海默病相关的两对阿片受体基因启动子区甲基化程度辅助诊断阿尔茨海默病，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于阿尔茨海默病的早起发现和及时治疗。
附图说明
图1为OPRM1基因被检测序列所在区域以及6个CpG位点的相关性示意图；
图2为OPRL1基因被检测序列所在区域以及4个CpG位点的相关性示意图；
F：正向引物(Forward primer)；S：测序引物(Sequencing primer)；R：反向引物(Reverse primer)。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
如图1-2所示，本发明的一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，包含两对阿片受体基因(OPRM1、OPRL1)启动子区甲基化特异性扩增引物及两个甲基化特异性测序引物，这两对阿片受体基因(OPRM1、OPRL1)启动子区域的高甲基化水平能够导致阿尔茨海默病基因的高表达，从而影响阿尔茨海默病的发生和发展。同时，这两对阿片受体基因(OPRM1、OPRL1)启动子区甲基化特异性扩增引物均包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物。具体为：
1)、OPRM1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5'-biotin-TAGTTAGGATTGGTTTTTGTAAGAAATAG-3'；
2)、OPRM1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5'-ATACCCCAAAACATCAATACAATTACTAAC-3'；
3)、OPRM1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5'-CTATACCAAATAACCAAAAACAC-3'；
4)、OPRL1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5'-biotin-GTTTGTTTAGTTTGGGAAAGAGG-3'；
5)、OPRL1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5'-ACACAAAAATCTCCCCCTTC-3'；
6)、OPRL1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5'-ACCCCCCACAACACA-3'。
下面通过对比实验证明阿片受体基因(OPRM1、OPRL1)启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关。
1、研究对象的收集
从宁波市某三甲医院收集阿尔茨海默病患者，痴呆诊断标准依据世界卫生组织的国际疾病分类第10版(ICD-10)，阿尔茨海默病(AD)诊断标准采用NINCDS-ADRDA标准。排除血管性痴呆，路易体痴呆等疾病后，最后确定阿尔茨海默病人51例作为病例组(80.94±8.88岁)，同时收集年龄匹配且无痴呆家族史的63名正常者作为对照组(79.78±7.87岁)。对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测载脂蛋白、同型半胱氨酸等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。
2、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门，致善生物科技)提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo FisherScientific)检测所得DNA的浓度，以供OPRM1、OPRL1基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
3、DNA甲基化水平测定
本实验采用焦磷酸测序技术分别对OPRM1基因启动子区的6个CpG位点(如图1所示)和OPRL1基因启动子区的4个CpG位点(如图2所示)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：
1)、OPRM1甲基化特异性上游引物(Forward primer)
5'-biotin-TAGTTAGGATTGGTTTTTGTAAGAAATAG-3'，
2)、OPRM1甲基化特异性下游引物(Reverse primer)
5'-ATACCCCAAAACATCAATACAATTACTAAC-3'，
3)、OPRM1甲基化特异性测序引物(Sequencing primer)
5'-CTATACCAAATAACCAAAAACAC-3'。
4)、OPRL1甲基化特异性上游引物(Forward primer)
5'-biotin-GTTTGTTTAGTTTGGGAAAGAGG-3'，
5)、OPRL1甲基化特异性下游引物(Reverse primer)
5'-ACACAAAAATCTCCCCCTTC-3'，
6)、OPRL1甲基化特异性测序引物(Sequencing primer)
5'-ACCCCCCACAACACA-3'。
DNA甲基化水平测定的具体步骤：
第一步：采用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit；ZYMORESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。
第二步：取第一步中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶(ZymoTaqTM PreMix,ZYMO RESEARCH)，并加入上述一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃10min的变性；接着95℃30s，Tm40s，72℃50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃7min。(注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)
第三步：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer；Qiagen)；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3μl)转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer；Qiagen)，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer；Qiagen；)和120ml的变性缓冲液(PyroMarkDenaturation Solution；Qiagen)；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMark Vacuum Prep Filter Probes；Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应。
第四步：焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24Reagents；Qiagen)对第三步中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。具体结果如表1-3所示。
表1病例组与对照组间的比较(n＝114)
表2 OPRM1分层后病例组与对照组间的比较(n＝114)
注：n表示样本个数，p值小于0.05，具有统计学意义；a表示经过对数转换(Log-transformation was used)；
表3 OPRL1分层后病例组与对照组间的比较(n＝114)
注：n表示样本个数，p值小于0.05，具有统计学意义；Median表示中位数，IQR表示四分位间距数；加b表示运用非参数秩和检验(Nonparametric rank test was applied)。
4、数据分析
本次实验采用SPSS 16.0对数据进行整理分析(注：p<0.05时表示有统计学意义)，我们发现：
1、OPRM1被检测的6个CpG位点间存在显著关联(相关系数r>0.521，p<0.001，有统计学意义，如图1所示)，所以我们把CpG1-CpG6求平均值后参与到后续的分析中，如表1所示，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异(p＝0.007)。同时，我们分性别比较了病例组和对照组间阿尔茨海默病基因启动子区甲基化水平的差异，如表2所示，发现CpG3、CpG4在男性中与阿尔茨海默病存在关联(p＝0.007、p＝0.045)，而CpG3在女性中与阿尔茨海默病相关(p＝0.001)。
图1为OPRM1被检测序列所在区域：具体位置为OPRM1(chr6：154331630-154568000)；CpG Island chr6：154360587-154361008；以及所检测的6个CpG点之间的关联性分析结果(例如CpG1与CpG2的相关系数为0.75，CpG2与CpG3的相关系数为0.70)。
2、OPRL1被检测的4个CpG位点间存在显著关联(相关系数r>0.368，p<0.001，有统计学意义，如图2所示)，所以我们把CpG1-CpG4求平均值后参与到后续的分析中，如表1所示，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异(p＝2.987E-06)。同时，我们分性别比较了病例组和对照组间阿尔茨海默病基因启动子区甲基化水平的差异，如表3所示，发现CpG1、CpG2、CpG3在男性中与阿尔茨海默病存在关联(p＝0.014、p＝0.001、p＝1.93E-04)，而CpG1、CpG3在女性中与阿尔茨海默病相关(p＝0.006、p＝0.010)。
图2为被检测序列所在区域：具体位置为OPRL1(chr20:62716369-62731996)；CpGIsland chr2062710770-62711745；以及所检测的4个CpG点之间的关联性分析结果(例如CpG1与CpG2的相关系数为0.436，CpG2与CpG3的相关系数为0.625)。
由该对比实验可以看出，阿片受体基因(OPRM1、OPRL1)启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关，因此本发明的检测试剂盒能够以检测阿尔茨海默病基因启动子区甲基化水平为基础，方便快捷地在分子水平上实现对阿尔茨海默病的检测，检测效率高，针对性强。
本发明的一种包含阿片受体基因的检测试剂盒的检测方法：包括以下步骤：
步骤一：Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度；
步骤二：采用EZDNA甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶，并加入一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增。其中，PCR扩增条件为：首先在温度95℃加热10min至变性，然后重复30-50个退火反应，所述退火反应的条件为在温度95℃加热30s，复性40s，在温度72℃下延伸50s；最后在温度72℃延伸7min。
步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μm甲基化特异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个Eppendorf管中，在琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃2分钟，再冷却到室温；
步骤五：焦磷酸测序：在焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤四中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，其特征在于：包含两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物及两个甲基化特异性测序引物，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关；同时，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物均包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物。
2.如权利要求1所述的一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，其特征在于：所述阿片受体基因OPRM1启动子区甲基化特异性扩增引物包括以下核苷酸序列：
所述OPRM1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5'-biotin-TAGTTAGGATTGGTTTTTGTAAGAAATAG-3'；
所述OPRM1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5'-ATACCCCAAAACATCAATACAATTACTAAC-3'；
所述OPRM1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5'-CTATACCAAATAACCAAAAACAC-3'。
3.如权利要求1所述的一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，其特征在于：所述阿片受体基因OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物包括以下核苷酸序列：
所述OPRL1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5'-biotin-GTTTGTTTAGTTTGGGAAAGAGG-3'；
所述OPRL1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5'-ACACAAAAATCTCCCCCTTC-3'；
所述OPRL1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5'-ACCCCCCACAACACA-3'。
4.利用权利要求1所述的包含阿片受体基因的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括下述步骤：
步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；
步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶，并加入一对所述OPRM1、OPRL1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤四：将步骤三中得到的PCR扩增产物中加入至包含退火缓冲液的PSQ96板中并充分反应，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，使用真空准备工具吸附磁珠后，再将放有PCR扩增产物的PSQ96板加热至80℃并冷却至室温后，进行焦磷酸测序。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤三中的PCR扩增条件为：首先在温度95℃加热10min至变性，然后重复30-50个退火反应，所述退火反应的条件为在温度95℃加热30s，复性40s，在温度72℃下延伸50s；最后在温度72℃延伸7min。
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