CN103305604B

CN103305604B - 可用于检测与冠心病相关的cdkn2b基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103305604B
Application number: CN201310172948.0A
Authority: CN
Inventors: 许丽敏; 段世伟; 蒋丹捷
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2033-05-09
Also published as: CN103305604A

Abstract

本发明公开了可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对CDKN2B基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对冠心病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以CDKN2B基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为冠心病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

Description

可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD）简称冠心病，是心血管疾病的重要组成部分。据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）报道，CHD是世界上致死和致残的主要原因之一，在2008年，约有1730万人死于CHD, 在2030年之前，据估计将有2360万人将死于CHD。CHD症状表现为胸腔中央发生一种压榨性的疼痛，并可迁延至颈、颔、手臂、后背及胃部。发作的其他症状可能有眩晕、气促、出汗、寒颤、恶心及昏厥。严重患者可能因为心力衰竭而死亡。CHD是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，寻找其相关基因进而阐明冠心病发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展冠心病的相关研究，但研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）与冠心病的关联性上，其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了冠心病病理机制的理解和预防治疗水平的提高。

细胞周期依赖激酶抑制剂由cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (CDKN2B ， p15) （NC_000009.11：22002902..22009312）编码，是细胞周期抑制分子家族的一员，可以抑制细胞周期依赖激酶4或6的活性而抑制细胞周期，引起细胞的G1期阻滞。与肿瘤抑制基因CDKN2A相邻；而CDKN2B-AS1是最强的心血管疾病的遗传易感基因，也与多种癌症，颅内动脉瘤，2型糖尿病等相关。目前关于CDKN2B基因单核苷酸多态性与CHD相关的研究已较成熟，且已成为公认的CHD易感基因位点。目前已发现多种肿瘤组织中存在着CDKN2B基因表达降低和启动子高甲基化。但其启动子甲基化水平与冠心病的关系目前还处在研究阶段。

目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其中CDKN2B基因启动子区甲基化水平与冠心病的患病率呈正相关，检测效率高，针对性强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括一对CDKN2B基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中

所述的甲基化特异性上游扩增引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：

5’-TAGGGGGAGGAGTTTAAGGGG-3’，

所述的甲基化特异性下游扩增引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列

5’-Biotin-ACACTCTTCCCTTCTTTCC-3’，

所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示：

5’-GGGGTAGTGAGGATT-3’。

一种可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于冠心病辅助诊断、检测或筛查药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，CDKN2B基因启动子区域的高甲基化水平导致CDKN2B基因的低表达，使细胞周期抑制作用减弱，从而血管平滑肌细胞增殖不受控制，这在动脉粥样硬化斑块的形成中发挥了重大作用。因此，CDKN2B基因启动子区甲基化水平与冠心病的患病率呈正相关，以检测CDKN2B基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对冠心病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以CDKN2B基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为冠心病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

附图说明

图1为被检测序列所在区域（具体位置为Chr9:22008743..22009117），以及所检测的7个CpG点之间的关联性分析结果（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.808，CpG2与CpG3的相关系数为0.795）；

图2为甲基化水平检测结果示例（图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图示有CpG1到CpG7的甲基化程度从左到右依次为3%，3%，2%，3%，5%，4%， 4%）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

1、研究对象的收集

募集愿意参加研究的志愿者，根据冠心病的国际诊断标准，将志愿者分为病例组和对照组，并采用调查表的形式调查志愿者的一般情况，同时采取静脉血，进行一般血生化检测，具体如下：

从某医院收集冠心病患者，排除心源性休克、重度心力衰竭、严重室性心律失常、伴有其他严重疾病如恶性肿瘤、严重肝肾疾病等，将冠脉造影结果严重于一支主要动脉狭窄≥50%归为病例组，将相对应的冠脉造影结果轻于一支主要动脉狭窄<50%归为对照组。最后确定冠心病病人36例（18男；18女），同时收集性别匹配、年龄相仿的36名正常者作为对照（(18男；18女)。对所有研究对象空腹抽血检测血脂、血糖等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。

2、基因组DNA的提取

应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪（中国厦门，致善生物科技）提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度，以供CDKN2B基因启动子区DNA甲基化水平的检测。

3、DNA甲基化水平测定

本研究采用焦磷酸测序技术对CDKN2B基因启动子区的7个CpG位点（如图1）进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应（PCR）扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C）碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶（U），然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：

(1)甲基化特异性上游扩增引物（Forward primer）

5’-TAGGGGGAGGAGTTTAAGGGG-3’ （SEQ ID NO.1），

(2)甲基化特异性下游扩增引物（Reverse primer）

5’-Biotin-ACACTCTTCCCTTCTTTCC-3’ （SEQ ID NO.2），

(3)甲基化特异性测序引物（Sequencing primer）

5’-GGGGTAGTGAGGATT-3’ （SEQ ID NO.3）。

具体实验步骤：

A. 采用QIAGEN EpiTect® 亚硫酸氢盐处理试剂盒（EpiTech Bisulfite Kits; Qiagen; #59104）对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

B．取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Pyromark PCR试剂盒（Pyromark PCR Kit; Qiagen; #978703），并加入上述一对α-内收蛋白基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃ 15min的变性；接着95℃ 15s，Tm 30s，72℃ 20s，共50个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 5min。（注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）

C. 焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen; #979009）；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液（PyroMark Binding Buffer; Qiagen; #979006），使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen; #979008）和120ml的变性缓冲液（PyroMark Denaturation Solution; Qiagen; #979007）；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen; #979010）移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；

D.焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒（Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802）对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析（甲基化水平检测结果示例见图2）。

4、数据分析

本次研究采用SPSS 18.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的7个CpG位点间存在显著关联（相关系数r > 0.7，p < 0.01，有统计学意义，见图1）（注：p < 0.05时表示有统计学意义，下同），所以后期我们选择取7个CpG甲基化（如图2所示，CpG1到CpG7的甲基化程度从左到右依次为3%，3%，2%，3%，5%，4%， 4%）的平均值来代表整体的甲基化水平。首先，我们分性别和分组比较了CDKN2B基因启动子区甲基化水平的差异(见表1)，发现性别之间有很大差异(p=0.007)，因此，我们分性别比较了病例组和对照组间CDKN2B基因启动子区甲基化水平的差异，结果（见表 2）发现甲基化水平在女性中与冠心病存在关联（p = 0.001），病例组女性的甲基化水平是对照组的近1.5倍，在男性中没有显著关联。

本发明设计的可用于检测与冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对CDKN2B基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为冠心病的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。

表 1 分性别和分组对甲基化程度的分析(n = 72)

分组

男(n=36)

女(n=36)

p

病例组(n=36)

对照组(n=36)

p

年龄(岁)

61.97±5.36

62.17±5.35

0.896

62.47±5.51

61.67±5.17

0.802

CDKN2B 平均甲基化水平(%)

8.07±2.76

6.02±2.26

0.007

7.66±3.02

6.43±2.23

0.043

表2 性别分层后对病例组和对照组甲基化程度的分析 (n=72)

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种可用于检测与女性冠心病相关的CDKN2B基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括一对CDKN2B基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中

甲基化特异性上游扩增引物如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：

5’-TAGGGGGAGGAGTTTAAGGGG-3’，

甲基化特异性下游扩增引物如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列

5’-Biotin-ACACTCTTCCCTTCTTTCC-3’，

所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示：

5’-GGGGTAGTGAGGATT-3’。