CN105039543B - 可用于检测与2型糖尿病相关的ptpn1基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对PTPN1基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对女性人群2型糖尿病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以PTPN1基因甲基化为靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

Description

可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程 度的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus) 是一种慢性代谢性疾病，是血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其患病率随着生活条件的改善生活水平提高都呈逐渐增长的趋势。据统计，目前中国糖尿病患病人数接近一亿，患病率高达9.7%。糖尿病不是单一疾病，是由遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。其中2 型糖尿病发病人数约占糖尿病总发病人数的97%。截至目前尽管能从遗传的角度证实不同基因的表达能引起个体对2 型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM )的易感性不同，相关候选基因的单核苷酸多态性与T2DM的发生也具有关联性，然而遗传因素和环境因素等病因对T2DM发病机制仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了T2D预防及治疗水平的提高。

蛋白酪氨酸磷酸酶N1( protein tyrosine phosphatase, non-receptor type1，PTPN1)基因位于人类染色体20q13.1能够编码蛋白酪氨酸磷酸酶1B( protein tyrosinephosphatase1B，PTP1B)。PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶( protein tyrosine phosphatases，PTPs) 家族中的一员，广泛存在于人肾脏、脾、肌肉、心、肝、脑等组织的细胞质内质网表面。国内外已有大量研究表明在PTP1B主要是通对胰岛素受体激酶或其活性片段和胰岛素受体底物-1、瘦素信号通路JAK2/STAT3、糖酵解途径的丙酮酸激酶等磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用，从而参与胰岛素、瘦素、能量代谢等信号传导通路的负调控。经研究发现，PTP1B 与T2DM和肥胖的发生、发展有密切关系，被认为是治疗T2DM 和肥胖症的一个重要潜在靶点。也有研究报道了PTPN1基因单核苷酸多态性与T2DM发病的关系在不同人群、不同位点的基因突变意义不同，且研究多集中于Pro387L、C981T和1484insG等多态位点。目前，国内外还没有公开任何关于检测2型糖尿病相关PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因甲基化程度的试剂盒及其应用，其中PTPN1基因甲基化水平与女性人群2型糖尿病患病率呈正相关，检测效率高，针对性强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括PTPN1基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物及其甲基化特异性扩增下游引物和甲基化特异性测序引物，其中

所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

5’- TAGGGGTAGGGGATTGTA -3’，

所述的甲基化特异性下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

5’- Biotin-CTCCTTTTCCATCTCCATA -3’，

所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示：

5’- TTTTCCATCTCCATAA -3’。

上述可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。

上述可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于女性人群2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，该检测试剂盒包含一对PTPN1基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，PTPN1基因启动子区高甲基化水平导致PTPN1基因的低表达，参与胰岛素、瘦素、能量代谢等信号传导通路的调控，从而影响2型糖尿病的发生和发展。因此，PTPN1基因启动子区甲基化水平与2型糖尿病的患病率呈正相关，通过检测PTPN1基因启动子区甲基化程度辅助诊断糖尿病，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于的糖尿病的早期预防、早发现和及时治疗。

综上所述，以PTPN1基因启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对2型糖尿病的检测，同时，以PTPN1基因启动子区域DNA甲基化为靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

附图说明

图1为PTPN1基因被检测序列所在区域（具体位置为Chr20:49126957-49127083）及所检测的8个CpG点的相关性示意图；

图2为PTPN1基因甲基化水平检测结果示意图（图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图示有CpG1到CpG8的甲基化程度分别为4%，3%，4%，10%，5%，4%，5%，5%）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

1、研究对象的收集

从深圳市某慢性病研究所收集2型糖尿病患者标本，2型糖尿病诊断标准依据2010年美国糖尿病协会（ADA）指南，排除高血压、冠心病等心脏疾病、肾功能不全、药物滥用、肥胖或其他严重的疾病等疾病后，最后确定T2D97例作为病例组（59.79±9.39岁），同时收集年龄、性别、BMI相匹配且无其他疾病的97名正常者作为对照组（59.79±9.39岁）。对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素和肌酐等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。

2、基因组DNA的提取

应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪（中国厦门，致善生物科技）提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，Thermo FisherScientific）检测所得DNA的浓度，以供GLUD1基因和PTPN1基因启动子区DNA甲基化水平的检测。

3、DNA甲基化水平测定

本研究采用焦磷酸测序技术对PTPN1基因启动子区8个CpG位点（如图1所示）进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应（PCR）扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C）碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶（U），然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，

用于实验的PTPN1基因启动子区甲基化扩增引物和测序引物如下：

(1)甲基化特异性上游引物（Forward primer）

5’- TAGGGGTAGGGGATTGTA -3’（SEQ ID NO.4），

(2)甲基化特异性下游引物（Reverse primer）

5’- Biotin-CTCCTTTTCCATCTCCATA -3’（SEQ ID NO.5），

(3)甲基化特异性测序引物（Sequencing primer）

5’- TTTTCCATCTCCATAA -3’（SEQ ID NO.6）

具体实验步骤：

A. 采用EZ DNA 甲基化试剂盒-Gold（EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit; ZYMORESEARCH）对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

B．取步骤A中转化过的DNA样本30ng加入到Zymo Taq^TM PreMix酶(Zymo Taq^TMPreMix, ZYMO RESEARCH)，并分别加入上述两对谷氨酸脱氢酶基因和蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃ 10min的变性；接着95℃ 30s，Tm 45s，72℃ 60s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 10min。（注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）；

C. 焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen）；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液（PyroMark Binding Buffer; Qiagen），使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen;）和120ml的变性缓冲液（PyroMark Denaturation Solution; Qiagen）；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes;Qiagen）移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；

D.焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒（Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen）对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。甲基化水平检测结果示例见图2PTPN1基因被检测序列所在区域及所检测的8个CpG点的相关性示意图(灰色阴影中显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平-即灰色阴影对应的上方数字)，如图2所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，图中所示CpG1到CpG8的甲基化程度分别为4%，3%，4%，10%，5%，4%，5%，5%。

4、数据分析

本次研究采用SPSS 18.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测PTPN1基因启动子8个CpG位点间存在相关联（相关系数r > 0.153，p < 0.001，有统计学意义，见图1），所以我们把CpG1-CpG8求平均值后参与到后续的分析中，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异及临床生化指标甘油三酯（TG）和肌酐（CRE）也存在显著的统计学差异（p< 0.001，见表 1）。因此，我们分性别比较了病例组和对照组间PTPN1基因启动子区甲基化水平的差异，结果（见表2）发现CpG1-8在女性中均与2型糖尿病存在关联（p< 0.05），而在男性中却与T2DM无相关性，并且由表2可知，病例组的PTPN1基因甲基化水平大于对照组，因此，PTPN1基因启动子区甲基化水平与2型糖尿病患病率呈正相关。

表 1 PTPN1基因病例组与对照组间的比较 (n=194)

表 2 PTPN1基因分层后病例组与对照组间的比较

注：n表示样本个数；加a表示进行过对数转换；加粗的为p值小于0.05，具有统计学意义；。

本发明可用于检测2型糖尿病相关的蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因启动子区甲基化程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对PTPN1基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为2型糖尿病的辅助诊断、检测或筛查药物治疗提供借鉴。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (1)

1.一种可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒在制备辅助检测女性人群2型糖尿病试剂或者辅助诊断女性人群2型糖尿病试剂中的应用，其特征在于：该试剂盒包括PTPN1基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物及其甲基化特异性扩增下游引物和甲基化特异性测序引物，其中

所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

5’-TAGGGGTAGGGGATTGTA-3’，

所述的甲基化特异性下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

5’-Biotin-CTCCTTTTCCATCTCCATA-3’，

所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示：

5’-TTTTCCATCTCCATAA-3’。