CN114941030B - 一种用于胃癌辅助诊断的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种用于胃癌辅助诊断的SNP标志物及其应用。该标志物为rs7366775、rs72706172、rs138554234、rs9841504、rs11937064、rs11098765、rs10074991、rs77651534、rs36012714、rs863241、rs114080964、rs28749114、rs9381024、rs2294693、rs1679709、rs2585177、rs10105842、rs10087426、rs7849280、rs10509670、rs11187838和rs11851309的组合。该诊断试剂盒有较好效果。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及胃癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤，其发病率占恶性肿瘤的第五位，死亡率居第二位。据国际癌症研究署(IARC)估计，2018年全球胃癌新发病例103.3万人，占全部癌症新发病例的5.7％；胃癌死亡人数78.3万，占全部癌症死亡病例的8.2％。在我国，胃癌年龄标化发病率为22.7/10万，胃癌死亡率仅次于肺癌居我国恶性肿瘤第二位，每年46.4万人死于胃癌，约占全球胃癌死亡人数的47％。胃癌起病隐匿、进展迅速、预后较差，生存率低，严重影响患者健康，给家庭和社会带来了沉重的疾病负担。胃癌患者的预后与确诊时的分期密切相关，进展期胃癌术后5年生存率低于30％，而早期胃癌在积极治疗后5年生存率超过90％。然而由于胃癌缺乏特异性症状和体征，目前我国早期胃癌检出率不到10％，大多数患者首诊时已经是中晚期。随着人口基数的不断增大和胃癌期望寿命的延长，胃癌患病和死亡人数，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担，由此可见，如何精准识别早期胃癌、降低其发病率和死亡率已成为一个亟待解决的重大公共卫生问题。
胃癌是一种慢性复杂性疾病，是环境和遗传因素长期共同作用的结果，其形成是一个多因素、多阶段、复杂的过程，从慢性萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生等癌前病变最终进展为胃癌。不过目前其确切发病机制还不是很清楚。遗传流行病学研究表明，个体遗传因素在胃癌发生发展中发挥重要的作用，不同的个体对环境暴露的反应存在易感性差异，这种易感性目前被认为是由个体的遗传因素所决定的。双生子研究表明，胃癌的遗传度为22％，提示遗传因素在胃癌的发生发展中扮演极其重要的角色。单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，它的存在被认为赋予了个体不同的表型和性状，并且影响个体对疾病(包括肿瘤)的易感性、以及对药物的反应性等，有助于深入阐明胃癌发生发展的分子机制，而且通过对潜在的胃癌特异遗传标志物的鉴定，更有利于胃癌的早期发现、精准预防和个体化治疗。
目前，胃癌初步诊断的方法主要包括病史询问、体格检查、实验室检查、胃肠X线检查、纤维内窥镜检查、脱落细胞学检查、B超以及CT检查、肿瘤标记物检测等。鉴别诊断主要依靠X线钡餐造影、胃镜和活组织病理检查。但临床常用的X线钡餐造影和纤维内窥镜检查仍存在许多弊端，如难以发现较小的肿瘤或癌前病变、检查存在盲区以及报告假阴性或假阳性结果等。虽然病理活组织检查是胃癌诊断的金标准，但由于需要做胃镜取胃部组织，具有侵入性，不适宜作为临床健康筛查的手段。
利用疾病易感的SNP谱早期辅助诊断疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP谱的构建，还可以实现对疾病作出前瞻性的“基因诊断”。近年来，利用SNP早期辅助诊断疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在包括胃癌在内的常见重大疾病早期辅助诊断上的应用价值已初见端倪。然而，目前还没有将SNP应用于胃癌辅助诊断的报道，若能筛选出胃癌的易感SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国胃癌的早期诊断和筛查必将是一次有力的推动，能够有效识别高危人群并针对性进行管理，从而降低胃癌发病率和死亡率，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
在该研究中，发明人筛选出人群中与胃癌高度相关的特异性和敏感性较好的SNP，本发明的目的是提出了一种与胃癌辅助诊断相关的SNP标志物。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用以及诊断试剂盒。
发明人通过检测胃癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与胃癌高度相关的特异性和敏感性较好的SNP，并研制出可便于临床应用的胃癌辅助诊断试剂盒，为胃癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与胃癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs7366775、rs72706172、rs138554234、rs9841504、rs11937064、rs11098765、rs10074991、rs77651534、rs36012714、rs863241、rs114080964、rs28749114、rs9381024、rs2294693、rs1679709、rs2585177、rs10105842、rs10087426、rs7849280、rs10509670、rs11187838和rs11851309的组合。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物，这些引物为：
rs7366775的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs72706172的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs138554234的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs9841504的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs11937064的引物序列为SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14；rs11098765的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs10074991的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs77651534的引物序列为SEQ IDNo:22和SEQ ID No:23；rs36012714的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs863241的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；rs114080964的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs28749114的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs9381024的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs2294693的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ IDNo:41；rs1679709的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs2585177的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；rs10105842的引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；rs10087426的引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；rs7849280的引物序列为SEQ IDNo:55和SEQ ID No:56；rs10509670的引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；rs11187838的引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62；rs11851309的引物序列为SEQ IDNo:64和SEQ ID No:65。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物，该引物为：
rs7366775的引物序列为SEQ ID No:3；rs72706172的引物序列为SEQ ID No:6；rs138554234的引物序列为SEQ ID No:9；rs9841504的引物序列为SEQ ID No:12；rs11937064的引物序列为SEQ ID No:15；rs11098765的引物序列为SEQ ID No:18；rs10074991的引物序列为SEQ ID No:21；rs77651534的引物序列为SEQ ID No:24；rs36012714的引物序列为SEQ ID No:27；rs863241的引物序列为SEQ ID No:30；rs114080964的引物序列为SEQ ID No:33；rs28749114的引物序列为SEQ ID No:36；rs9381024的引物序列为SEQ ID No:39；rs2294693的引物序列为SEQ ID No:42；rs1679709的引物序列为SEQ ID No:45；rs2585177的引物序列为SEQ ID No:48；rs10105842的引物序列为SEQ ID No:51；rs10087426的引物序列为SEQ ID No:54；rs7849280的引物序列为SEQID No:57；rs10509670的引物序列为SEQ ID No:60；rs11187838的引物序列为SEQ ID No:63；rs11851309的引物序列为SEQ ID No:66。
所述的SNP标志物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
用于扩增所述的SNP标志物的引物组合在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种胃癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有用于检测上述SNP标志物的引物组合。
所述的试剂盒，该试剂盒含有基于Sequenom MassARRAY基因分型技术检测外周血DNA中上述SNP标志物的引物组合，包括特异性扩增引物和特异性延伸引物。
所述的试剂盒，该试剂盒含有上述的引物组合，即该试剂盒含有的SNP标志物的特异性扩增引物为：
rs7366775的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs72706172的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs138554234的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs9841504的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs11937064的引物序列为SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14；rs11098765的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs10074991的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs77651534的引物序列为SEQ IDNo:22和SEQ ID No:23；rs36012714的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs863241的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；rs114080964的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs28749114的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs9381024的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs2294693的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ IDNo:41；rs1679709的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs2585177的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；rs10105842的引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；rs10087426的引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；rs7849280的引物序列为SEQ IDNo:55和SEQ ID No:56；rs10509670的引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；rs11187838的引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62；rs11851309的引物序列为SEQ IDNo:64和SEQ ID No:65。
该试剂盒含有的SNP标志物的特异性延伸引物为：
rs7366775的引物序列为SEQ ID No:3；rs72706172的引物序列为SEQ ID No:6；rs138554234的引物序列为SEQ ID No:9；rs9841504的引物序列为SEQ ID No:12；rs11937064的引物序列为SEQ ID No:15；rs11098765的引物序列为SEQ ID No:18；rs10074991的引物序列为SEQ ID No:21；rs77651534的引物序列为SEQ ID No:24；rs36012714的引物序列为SEQ ID No:27；rs863241的引物序列为SEQ ID No:30；rs114080964的引物序列为SEQ ID No:33；rs28749114的引物序列为SEQ ID No:36；rs9381024的引物序列为SEQ ID No:39；rs2294693的引物序列为SEQ ID No:42；rs1679709的引物序列为SEQ ID No:45；rs2585177的引物序列为SEQ ID No:48；rs10105842的引物序列为SEQ ID No:51；rs10087426的引物序列为SEQ ID No:54；rs7849280的引物序列为SEQID No:57；rs10509670的引物序列为SEQ ID No:60；rs11187838的引物序列为SEQ ID No:63；rs11851309的引物序列为SEQ ID No:66。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择胃癌病例、与胃癌病例年龄、性别匹配的健康对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与胃癌相关的SNP。(3)胃癌辅助诊断试剂盒的研制：根据胃癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Illumina
Global Screening Array(GSA)v1.0芯片进行全基因组扫描。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为胃癌；
(2)与病例年龄、性别匹配的健康对照；
本研究共采用21168例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Illumina
GSA v1.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)Illumina
GSA v1.0芯片上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在胃癌病例与健康对照中的分布差异。
4.统计分析方法
运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这22个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与胃癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.34×rs7366775的评分)+(0.25×rs72706172的评分)+(0.45×rs138554234的评分)+(0.12×rs9841504的评分)+(0.14×rs11937064的评分)+(0.11×rs11098765的评分)+(0.25×rs10074991的评分)+(0.24×rs77651534的评分)+(0.24×rs36012714的评分)+(0.19×rs863241的评分)+(0.17×rs114080964的评分)+(0.13×rs28749114的评分)+(0.13×rs9381024的评分)+(0.13×rs2294693的评分)+(0.13×rs1679709的评分)+(0.22×rs2585177的评分)+(0.14×rs10105842的评分)+(0.13×rs10087426的评分)+(0.11×rs7849280的评分)+(0.25×rs10509670的评分)+(0.11×rs11187838的评分)+(0.12×rs11851309)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的21168例样本中。(以rs7366775为例：0.34为rs7366775的回归系数(见表1)；rs7366775的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体某因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SNPTEST v2.5)。统计学显著性水平P值设为0.01，所有统计学检验均为双侧检验。
5.诊断试剂盒制备方法
Illumina
GSA v1.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定胃癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为胃癌诊断的指标。最后筛选出的与胃癌发病有关的SNP用于制备辅助诊断试剂盒(rs7366775、rs72706172、rs138554234、rs9841504、rs11937064、rs11098765、rs10074991、rs77651534、rs36012714、rs863241、rs114080964、rs28749114、rs9381024、rs2294693、rs1679709、rs2585177、rs10105842、rs10087426、rs7849280、rs10509670、rs11187838和rs11851309)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。
以下是本发明进一步的说明：
在上述10254例符合条件的胃癌病例及10914例健康对照中，两组年龄均衡可比。我们将这两组人群使用Illumina
GSA v1.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Illumina
GSA v1.0芯片检测，本发明人检测到在“胃癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs7366775、rs72706172、rs138554234、rs9841504、rs11937064、rs11098765、rs10074991、rs77651534、rs36012714、rs863241、rs114080964、rs28749114、rs9381024、rs2294693、rs1679709、rs2585177、rs10105842、rs10087426、rs7849280、rs10509670、rs11187838和rs11851309。
多因素Logistic回归分析结果表明，这22个SNP与胃癌的发病存在着显著关联。
进一步分析这22个SNP的组合用于胃癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于胃癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言，这个SNP的组合，或者这22个SNP的特异性引物构成的相关诊断试剂盒有助于胃癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为胃癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，该类生物标志物的成功开发将为胃癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于胃癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄、性别等对疾病发展的影响因素，研究SNP在胃癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于胃癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了胃癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得胃癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示胃癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2005月4月开始至2018年8月从南京医科大学附属肿瘤医院、南京医科大学第一附属医院、苏北人民医院、复旦大学附属肿瘤医院、天津医科大学肿瘤医院收集了大量的胃癌血标本，并从同期参加慢性非传染性疾病筛查项目的社区人群中收集外周血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择21168例符合下列标准的样本进行全基因组芯片扫描：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为胃癌；
(2)与病例年龄、性别匹配的健康对照；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描
在上述符合条件的10254例胃癌患者和10914例健康对照中，两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Illumina
GSA v1.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全基因组扫描：在Illumina
GSA v1.0芯片上进行全基因组扫描。
9、数据分析与处理：在“胃癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1 病例组与对照组全基因组关联分析结果
实施例3利用危险度评分方法进一步分析SNP与胃癌发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“胃癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估辅助诊断的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对胃癌发病的判断能力。对22个SNP标志物的联合分析发现，这22个SNP以59.6％的AUC将健康对照组和胃癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为70.1％，特异度：56.3％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs7366775、rs72706172、rs138554234、rs9841504、rs11937064、rs11098765、rs10074991、rs77651534、rs36012714、rs863241、rs114080964、rs28749114、rs9381024、rs2294693、rs1679709、rs2585177、rs10105842、rs10087426、rs7849280、rs10509670、rs11187838和rs11851309的组合能够很好地将健康对照和胃癌患者区分。
实施例4用于胃癌辅助诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Illumina
GSA v1.0芯片检测和Sequenom MassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列引物：rs7366775的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs72706172的引物序列为SEQ IDNo:4和SEQ ID No:5；rs138554234的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs9841504的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs11937064的引物序列为SEQ ID No:13和SEQID No:14；rs11098765的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs10074991的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs77651534的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs36012714的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs863241的引物序列为SEQID No:28和SEQ ID No:29；rs114080964的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs28749114的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs9381024的引物序列为SEQ IDNo:37和SEQ ID No:38；rs2294693的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs1679709的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs2585177的引物序列为SEQ ID No:46和SEQID No:47；rs10105842的引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；rs10087426的引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；rs7849280的引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；rs10509670的引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；rs11187838的引物序列为SEQID No:61和SEQ ID No:62；rs11851309的引物序列为SEQ ID No:64和SEQ ID No:65)，和/或特异性延伸引物(包括下列引物：rs7366775的引物序列为SEQ ID No:3；rs72706172的引物序列为SEQ ID No:6；rs138554234的引物序列为SEQ ID No:9；rs9841504的引物序列为SEQ ID No:12；rs11937064的引物序列为SEQ ID No:15；rs11098765的引物序列为SEQ IDNo:18；rs10074991的引物序列为SEQ ID No:21；rs77651534的引物序列为SEQ ID No:24；rs36012714的引物序列为SEQ ID No:27；rs863241的引物序列为SEQ ID No:30；rs114080964的引物序列为SEQ ID No:33；rs28749114的引物序列为SEQ ID No:36；rs9381024的引物序列为SEQ ID No:39；rs2294693的引物序列为SEQ ID No:42；rs1679709的引物序列为SEQ ID No:45；rs2585177的引物序列为SEQ ID No:48；rs10105842的引物序列为SEQ ID No:51；rs10087426的引物序列为SEQ ID No:54；rs7849280的引物序列为SEQID No:57；rs10509670的引物序列为SEQ ID No:60；rs11187838的引物序列为SEQ ID No:63；rs11851309的引物序列为SEQ ID No:66)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，荧光探针，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱辅助判断胃癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种用于胃癌辅助诊断的SNP标志物及其应用
<160> 66
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg tctcaaaaaa aaaaaggagg c 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg ctcctgatct cgtgatttgc 30
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaggaggcc gggcac 16
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg actccagact ggacaacgca 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg gccacctcat gactataagc 30
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacctggct ttttttt 17
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg aggttcaagc gattctcctg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg aattaactgg gcgtgatggc 30
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcctcagc ctccc 15
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg acattttgcc cgtacctctc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttggatg gaatctcact gttaaggagc 30
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tccctttttc cctatatatt ttta 24
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgttggatg gcatataaac ggcttgccag 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg gctgtcccta ttatctctac 30
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctttccctat tatctctaca tctatc 26
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgttggatg tctccagaga gagatgtatc 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg gaagcatgga aatctgaatc 30
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagatgtatc atttcaaaag taca 24
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg agcagtggga gttatttagc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgttggatg aaagcggaaa accacacgag 30
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tccttttgct cccagcctat a 21
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg atggataaac acgtatcac 29
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg ctggtatttc agatgaccgc 30
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gggtgcacct gattac 16
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg acggtgaaac cccatctcta 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgttggatg attctcctac ctcagcttcc 30
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaaaaataca aaaaattagc cag 23
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgttggatg cattaagaca tcaaagagg 29
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acgttggatg ttgtgatccg cccgccttg 29
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tacaggcgtg agccacca 18
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg ataggcaaaa tcagtgaggc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg aatacagggc ttctctaggg 30
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gaggcagttg agagag 16
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg acttcattaa aaagtggac 29
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gatcagtgat gggagctttc 30
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctttagaag tgtctgttca 20
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg tagtgccagg tgttcccatc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg acttctctgc tttgcttccg 30
<210> 39
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
actccttgac accca 15
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg agggcacaca ggtgaatcag 30
<210> 41
<211> 30
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<400> 41
acgttggatg tgatgggaca tcaacggtag 30
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cccatcagct ttggg 15
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acgttggatg tagccagttt ccgagagatg 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gctgtgcaac aagtaagtcc 30
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtccttactt gtcatctttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acgttggatg aaatccaaaa tcggcatgg 29
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acgttggatg tgatgcctcc accgttgttt 30
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cggcatggaa ccaca 15
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acgttggatg cttcttgttt ccagactggg 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgttggatg aagtccaccc gtggtccctt 30
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cctcggtccc ttccgacgc 19
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg attgactggg atgggacctc 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acgttggatg cctctgcctt tgcctctttt 30
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tttgcctctt ttaaaaagtt gta 23
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
acgttggatg caaaacgctt ctcagaaggc 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gaattagcct ttaggtgccc 30
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<212> DNA
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cctgggtccc cctcc 15
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acgttggatg taccattttt accagctgtg 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gaacattccc acaatggaag 30
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tacttacact tacagtcata cc 22
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acgttggatg gcacacatac acatgcagaa 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acgttggatg caaaggaagt gaacaaattc 30
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tttattcaat atttatgcat tgaatata 28
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acgttggatg gactacagtt ctgaaggctc 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgttggatg tgaggcccct atgacaaaag 30
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ggtatgaagg ctcctgtgtt a 21
Claims (8)
1.一种与胃癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs7366775、rs72706172、rs138554234、rs9841504、rs11937064、rs11098765、rs10074991、rs77651534、rs36012714、rs863241、rs114080964、rs28749114、rs9381024、rs2294693、rs1679709、rs2585177、rs10105842、rs10087426、rs7849280、rs10509670、rs11187838和rs11851309的组合。
2.用于扩增权利要求1所述的SNP标志物的引物组合，其特征在于该引物组合包括特异性扩增引物和特异性延伸引物，其中
特异性扩增引物为：
rs7366775的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；
rs72706172的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；
rs138554234的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；
rs9841504的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；
rs11937064的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；
rs11098765的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；
rs10074991的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；
rs77651534的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；
rs36012714的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；
rs863241的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；
rs114080964的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；
rs28749114的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；
rs9381024的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；
rs2294693的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；
rs1679709的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；
rs2585177的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；
rs10105842的引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；
rs10087426的引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；
rs7849280的引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；
rs10509670的引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；
rs11187838的引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62；
rs11851309的引物序列为SEQ ID No:64和SEQ ID No:65;特异性延伸引物为：
rs7366775的引物序列为SEQ ID No:3；rs72706172的引物序列为SEQ ID No:6；rs138554234的引物序列为SEQ ID No:9；rs9841504的引物序列为SEQ ID No:12；rs11937064的引物序列为SEQ ID No:15；rs11098765的引物序列为SEQ ID No:18；rs10074991的引物序列为SEQ ID No:21；rs77651534的引物序列为SEQ ID No:24；rs36012714的引物序列为SEQ ID No:27；rs863241的引物序列为SEQ ID No:30；rs114080964的引物序列为SEQ ID No:33；rs28749114的引物序列为SEQ ID No:36；rs9381024的引物序列为SEQ ID No:39；rs2294693的引物序列为SEQ ID No:42；rs1679709的引物序列为SEQ ID No:45；rs2585177的引物序列为SEQ ID No:48；rs10105842的引物序列为SEQ ID No:51；rs10087426的引物序列为SEQ ID No:54；rs7849280的引物序列为SEQID No:57；rs10509670的引物序列为SEQ ID No:60；rs11187838的引物序列为SEQ ID No:63；rs11851309的引物序列为SEQ ID No:66。
3.权利要求1所述的SNP标志物的检测试剂在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的引物组合在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.一种胃癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有用于检测权利要求1所述SNP标志物的引物组合。
6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有基于SequenomMassARRAY基因分型技术检测外周血DNA中权利要求1所述SNP标志物的引物组合。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的引物组合。
8.根据权利要求7所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。
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