CN104278085B - 一种与早发胃癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域,公开了一种与早发胃癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431和rs4790224的组合。该标志物可用于制备早发胃癌辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域,涉及一种与早发胃癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织估计,2012年全球范围内大约63万胃癌新发病例,占全部肿瘤发病的8.5%,仅次于肺癌、前列腺癌和结直肠癌。全球近50%的胃癌病例发生在中国。在我国,胃癌年龄标化发病率为22.7/10万,仅次于肺癌。大约90%-95%的胃癌为腺癌,起源于胃部上皮组织。从解剖学上可分为贲门癌和非贲门癌。贲门癌是发生在胃贲门部食管胃交界线下2cm范围内的腺癌。非贲门癌主要包括发生在胃底、胃角、胃窦和幽门部恶性肿瘤。胃癌是一种具有高死亡率的疾病(每年约有800,000人死亡),这使得它成为继肺癌之后世界范围内癌症死亡的第二常见的原因。尽管全球范围内胃癌的发病率及死亡率均处于下降趋势,而我国仍处于较高发病的及死亡水平。随着人口基数的不断增大和胃癌期望寿命的延长,庞大的胃癌患病和死亡人数,将在未来相当长一段时期内给我国带来沉重的负担,是肿瘤预防及控制的重点。
早发胃癌是指在50岁之前被诊断为胃癌的患者,大约有10%的胃癌患者属于早发胃癌。年轻患者发生弥漫性损伤的概率较高,这种弥漫性损伤常在组织学上呈现为“正常”胃粘膜,不易被诊断。由于年轻患者较少暴露于环境致癌物,故而遗传因素在早发胃癌中的作用较大。肿瘤的早期检测是患有肿瘤(包括胃肿瘤)的患者存活的主要决定因素。在早期检测到胃癌并得到治疗时,患者的存活率将得到很大程度的提高。与诊断为晚期的患者只有大约10%的5年以上的存活率相比,早期胃癌患者有90%的5年以上的存活率。然而,由于在胃癌早期,通常没有临床症状或仅表现出非特异性的症状,因而在很多病例中,在疾病到达晚期之前无法做出诊断,这通常导致较差的预后。因此,胃癌的早期诊断可以改善的患者预后。
目前,胃癌的初步诊断方法主要为病史询问、体格检查、实验室检查、胃肠X线检查、纤维内窥镜检查、脱落细胞学检查、B超以及CT检查、肿瘤标记物检测等。其鉴别诊断主要依靠X线钡餐造影、胃镜和活组织病理检查。但是现在临床常用的X线钡餐造影和纤维内窥镜检查也存在一些弊端。X线钡餐造影对局部粘膜上较小的肿瘤难以发现,或难以肯定;检查有一定的盲区,可能漏掉小病变,不能确定病变的性质,可能有假阳性或假阴性。纤维内窥镜检查对胃壁整体蠕动情况及胃的形态观察欠完整;对肿瘤的浸润深度、有无转移了解不清;对外压性肿物还是胃壁内肿物难以区别。目前临床所用胃癌标志物特异性不强。血清癌胚抗原(CEA)对诊断意义不大,虽半数患者的胃液中CEA有明显升高,超过100ng/ml,但也与慢性萎缩性胃炎的胃液中含量有重叠。病理活组织检查作为胃癌诊断的金标准,在临床胃癌确诊中居于重要地位,但由于需要做胃镜取尾部组织,不适合作为临床健康筛查。由于胃癌的普遍性及其对患者预期寿命的严重影响,因此需要诊断、监测和治疗胃癌的新方法。
胃癌的形成是一个复杂的多因素、多阶段的过程,从慢性萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生等癌前病变最终进展为胃癌。不过其确切发病机制还不是很清楚。宏观流行病学及遗传流行病学研究表明,胃癌的发生是由环境因素和个体遗传因素共同作用的结果。其中,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染已在1994年被世界卫生组织(WHO)确认为一级致癌物,是胃癌明确的危险因素。然而,相同的环境危险因素暴露下仅有少数个体最终发生胃癌,这说明不同个体对环境暴露的反应存在不同的易感性,这种易感性目前被认为是由个体的遗传因素所决定的。例如,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的感染与年龄、地理位置、种族等有关,全球人群的Helicobacter pylori感染率大约在40%-80%,但只有15-20%感染者会发展为胃或十二指肠溃疡疾病,但其中只有1%的Helicobacter pylori感染患者进展为胃癌,这说明遗传因素在胃癌的发生发展中起了重要的作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个体不同的表型性状,以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性,因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱诊断疾病的发生,灵敏、准确和快速,具有广阔的应用前景。近年来,利用SNP诊断疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点,在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病的应用价值已初见端倪。
然而,目前还没有将SNP应用于早发胃癌诊断的报道,若能筛选出早发胃癌易感的SNP作为生物标志物,并研制相应的诊断试剂盒,对我国胃癌诊断现状必将是一次有力的推动,也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题,提出一种与早发胃癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物在制备早发胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供早发胃癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究胃癌患者及与其年龄性别匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性,寻找一组与早发胃癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP,并研制出可便于临床应用的胃癌辅助诊断试剂盒,为胃癌的筛查和诊断提供数据支持,为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的:
一种与早发胃癌辅助诊断相关的SNP标志物,该标志物为rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431,和rs4790224的组合。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物,该引物为:
rs10737808的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2;
rs10193016的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5;
rs7607715的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8;
rs2904350的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11;
rs17312167的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14;
rs13168609的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17;
rs561443的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20;
rs7810066的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23;
rs10257532的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26;
rs3849222的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29;
rs11817406的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32;
rs7193854的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35;
rs12447431的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38;
rs4790224的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物,该引物为:
rs10737808的引物序列为SEQ ID No:3;rs10193016的引物序列为SEQ ID No:6;rs7607715的引物序列为SEQ ID No:9;rs2904350的引物序列为SEQ ID No:12;rs17312167的引物序列为SEQ ID No:15;rs13168609的引物序列为SEQ ID No:18;rs561443的引物序列为SEQ ID No:21;rs7810066的引物序列为SEQ ID No:24;rs10257532的引物序列为SEQID No:27;rs3849222的引物序列为SEQ ID No:30;rs11817406的引物序列为SEQ ID No:33;rs7193854的引物序列为SEQ ID No:36;rs12447431的引物序列为SEQ ID No:39;rs4790224的引物序列为SEQ ID No:42。
所述的SNP标志物在制备早发胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备早发胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备早发胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种早发胃癌辅助诊断试剂盒,该试剂盒用于检测外周血DNA中rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431,和rs4790224。
所述的诊断试剂盒,该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述诊断试剂盒,该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂,如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等;还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说,本发明解决问题的技术方案包括:(1)建立统一标准的标本库和数据库:以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测:选择胃癌病例,与病例年龄、性别匹配的对照,利用高密度SNP芯片,在全基因组范围内找出与早发胃癌相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP,进一步在样本中进行检测,以判断其关联的稳定性。(4)胃癌辅助诊断试剂盒的研制:根据胃癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人口学资料、临床资料等,并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描,Sequeom MassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
1.研究样本的选择
(1)经病理学明确诊断的胃癌病例;
(2)病例发病年龄在50岁之前;
(3)与病例年龄、性别匹配的对照;
本研究共采用287例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA,按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA,纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Affymetrix6.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本;
(2)在Affymetrix6.0芯片(购于美国昂飞公司,下同)上进行全基因组扫描;
(3)检测并比较各基因型在胃癌病例与健康对照中的分别差异。
4.单个SNP的Sequeom MassARRAY基因分型
(1)取受试者DNA样本;
(2)设计单个SNP的特异性引物对;
(3)进行PCR反应;
(4)检测并比较胃癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定胃癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP,作为胃癌诊断的指标。最后筛选出的与胃癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431,和rs4790224)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物和特异性荧光探针对,以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这14个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果,我们构建了一个数学公式,综合考虑每个SNP与胃癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说,我们对每个SNP的三种基因型进行评分,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,变异纯合型=“2”,以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重,综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下:危险分值=(0.706×rs10737808的评分)+(-0.820×rs10193016的评分)+(-0.792×rs7607715的评分)+(0.670×rs2904350的评分)+(0.795×rs17312167的评分)+(-0.740×rs13168609的评分)+(-0.910×rs561443的评分)+(0.981×rs7810066的评分)+(-0.732×rs10257532的评分)+(0.732×rs3849222的评分)+(0.753×rs11817406的评分)+(-0.851×rs7193854的评分)+(-0.849×rs12447431的评分)+(0.702×rs4790224的评分),获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的287例样本中。(以rs10737808为例:0.706为rs10737808的回归系数(见表1);rs10737808的评分,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,变异纯合型=“2”,某个SNP的基因型由仪器检测结果确定;某个样本的总评分是这些个SNP分别评分的总和,单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程,不需要知道具体基因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05,所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明:
在上述129例符合条件的胃癌病例及158例健康对照中,两组年龄、性别无统计学差异。我们将这两组人群经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Affymetrix6.0芯片检测,本发明人检测到在“胃癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括:rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431,和rs4790224。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明,这14个SNP与胃癌的发病存在着显著关联。
进一步分析这14个SNP的组合用于胃癌诊断的效果,发现其组合能够很好地区分病例与对照。
根据上述实验结果,本发明人制备了一种能用于早发胃癌辅助诊断的试剂盒,包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言,这14个SNP的组合,或者这14个SNP的特异性引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于胃癌的辅助诊断,为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度,及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果:
本发明提供的SNP标志物作为早发胃癌辅助判断的标志物的优越性在于:
(1)SNP是一种新型基因生物标志物,区别于传统生物标志物,稳定、微创、易于检测,将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,该类生物标志物的成功开发将为早发胃癌的诊断和治疗开创全新局面,为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒,可用于早发胃癌的辅助诊断,有助于反映患者的疾病状态,为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系,本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱,并应用TaqMan基因分型方法在大样本中进行了验证;以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用,也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄、性别、吸烟、饮酒等对疾病发展的影响因素,研究SNP在胃癌辅助诊断的应用前景,阐述SNP对于胃癌进展的影响,揭示其诊断价值。因此,本发明获得了胃癌发病相关SNP谱和特异性标志物;通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用,可使得胃癌的诊断更加方便易行,为临床医生快速准确掌握患者病情,为临床治疗效果评价奠定基础,并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1:显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示胃癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2004年开始至2010年从南京医科大学肿瘤中心收集了的胃癌患者血标本,通过对样品资料的整理,发明人从中选择了287例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP Sequeom MassARRAY基因分型的实验样品:
1、病理学明确诊断的胃癌患者,患者年龄小于50岁;
2、与病例年龄、性别匹配的健康对照;
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描
在上述符合条件的129例胃癌患者和158例健康对照中,两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为:
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液,40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20ml混合后,用TrisHcl溶液定容至2000ml,下同),颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞:用溶血试剂将5ml离心管补至4ml,颠倒混匀,4000rpm离心10分钟,弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂,再次颠倒混匀清洗一次,4000rpm离心10分钟,弃上清。
3、抽提DNA:向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠,14.4ml0.5M乙二胺四乙酸,15ml10%十二烷基硫酸钠,148.1ml双蒸水,下同)和8μl蛋白酶K,震荡器上充分震荡混匀,37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质:加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇=24:1,v/v,下同),充分混匀后(手摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇,上下轻摇,可见白色絮状沉淀物,再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤:在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA,纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全基因组扫描:在Affymetrix6.0芯片(购于美国昂飞公司,下同)上进行全基因组扫描。
9、数据分析与处理:在“胃癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出,结果见表1。
表1.病例组与对照组全基因组关联分析结果
实施例3单个SNP的Sequeom MassARRAY基因分型
将上述全基因组扫描发现与胃癌发病有关的SNP在129胃癌病例和158健康对照中进行检测,具体步骤为:
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂,颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞:用溶血试剂将5ml离心管补至4ml,颠倒混匀,4000rpm离心10分钟,弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂,再次颠倒混匀清洗一次,4000rpm离心10分钟,弃上清。
3、抽提DNA:向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K,震荡器上充分震荡混匀,37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质:加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇=24:1),充分混匀后(手摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇,上下轻摇,可见白色絮状沉淀物,再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤:在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA,纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行Sequenom MassARRAY基因分型:
1)使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件对全基因组扫描发现的14个阳性关联的SNP设计PCR扩增引物及单碱基延伸引物(表2)。反应体系包括4μl Sequenom MassARRAY基因分型PCR master mix(Hotstar Taq0.5U,每条扩增引物0.5pmol,0.1μl的25mM dNTPs、1.9μl双蒸水),加入1μl DNA。仪器使用的是SequenomMassARRAY Nanodispenser,PCR反应条件为:94℃4分钟;94℃20秒,56℃30秒,72℃1分钟,45个循环;72℃3分钟;4℃保持。
2)在PCR反应结束后,将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase,虾碱性磷酸酶)处理,以去除体系中游离的dNTPs。
3)在碱性磷酸酶处理结束后,进行单碱基延伸反应,反应体系包括:2μl EXTENDMix(单碱基延伸反应液,包括其中各延伸反应引物混合物0.94μl,iPLEX酶0.041μl,延伸混合物0.2μl),7μl SAP处理后PCR产物。PCR反应条件:I.94℃30秒;II.94℃5秒;III.52℃5秒;IV.80℃5秒;V.重复III、IV4个循环;VI.重复II、III、IV、V39个循环;VII.72℃3分钟;VII.4℃保持
4)树脂纯化:
(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中;
(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内;
(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触;
(4)离心使树脂沉入孔底部。
5)芯片点样:启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上
6)质谱检测:将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization–time of fligh,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析,检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
9、数据处理和分析:利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异,结果与全外显子扫描类似不再列出。
实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与胃癌发病
根据上述结果,本发明人通过对2组样品(“胃癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较,选择阳性关联的SNP,以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重,进一步求得危险分值,绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性,进而评估这些SNP对胃癌发病的判断能力。对14个SNP标志物的联合分析发现,这14个SNP以88.67%的AUC将健康对照组和胃癌病例组分开,最佳临界点的灵敏度为69.77%,特异度为94.30%(图1)。
因此,本发明人证明了采用rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431,和rs4790224的组合能够很好地将健康对照和胃癌患者区分。
实施例5用于胃癌辅助诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和SequenomMassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列引物:rs10737808的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2;rs10193016的引物序列为SEQ ID No:4和SEQID No:5;rs7607715的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8;rs2904350的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11;rs17312167的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14;rs13168609的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17;rs561443的引物序列为SEQ IDNo:19和SEQ ID No:20;rs7810066的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23;rs10257532的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26;rs3849222的引物序列为SEQ IDNo:28和SEQ ID No:29;rs11817406的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32;rs7193854的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35;rs12447431的引物序列为SEQ IDNo:37和SEQ ID No:38;rs4790224的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41),和/或特异性延伸引物(包括下列引物:rs10737808的引物序列为SEQ ID No:3;rs10193016的引物序列为SEQ ID No:6;rs7607715的引物序列为SEQ ID No:9;rs2904350的引物序列为SEQID No:12;rs17312167的引物序列为SEQ ID No:15;rs13168609的引物序列为SEQ ID No:18;rs561443的引物序列为SEQ ID No:21;rs7810066的引物序列为SEQ ID No:24;rs10257532的引物序列为SEQ ID No:27;rs3849222的引物序列为SEQ ID No:30;rs11817406的引物序列为SEQ ID No:33;rs7193854的引物序列为SEQ ID No:36;rs12447431的引物序列为SEQ ID No:39;rs4790224的引物序列为SEQ ID No:42);还可以有相应PCR技术所需的常用试剂,如:dNTPs,MgCl2,双蒸水,Taq酶等,这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的,另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品,通过最精简和特异的引物及荧光探针对检测SNP,再通过SNP谱辅助判断胃癌,不仅稳定,检测方便,且精确,大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,因此将此试剂盒投入实践,可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物信息
F:Forward Primer,上游引物;R:Reverse Primer,下游引物;E:ExtendedPrimer,延伸引物。
Claims (5)
1.一种与早发胃癌辅助诊断相关的SNP标志物,其特征在于该标志物为rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431和rs4790224的组合。
2.用于检测权利要求1所述的SNP标志物的特异性引物组,其特征在于该特异性引物组包括特异性扩增引物和特异性延伸引物,其中,
该特异性扩增引物为:
rs10737808的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2;
rs10193016的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5;
rs7607715的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8;
rs2904350的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11;
rs17312167的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14;
rs13168609的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17;
rs561443的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20;
rs7810066的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23;
rs10257532的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26;
rs3849222的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29;
rs11817406的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32;
rs7193854的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35;
rs12447431的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38;
rs4790224的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41;
该特异性延伸引物为:
rs10737808的引物序列为SEQ ID No:3;rs10193016的引物序列为SEQ ID No:6;rs7607715的引物序列为SEQ ID No:9;rs2904350的引物序列为SEQ ID No:12;rs17312167的引物序列为SEQ ID No:15;rs13168609的引物序列为SEQ ID No:18;rs561443的引物序列为SEQ ID No:21;rs7810066的引物序列为SEQ ID No:24;rs10257532的引物序列为SEQID No:27;rs3849222的引物序列为SEQ ID No:30;rs11817406的引物序列为SEQ ID No:33;rs7193854的引物序列为SEQ ID No:36;rs12447431的引物序列为SEQ ID No:39;rs4790224的引物序列为SEQ ID No:42。
3.权利要求2所述的用于检测SNP标志物的特异性扩增引物和特异性延伸引物在制备早发胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
4.一种早发胃癌辅助诊断试剂盒,其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的特异性扩增引物和特异性延伸引物,用于检测外周血DNA中rs10737808,rs10193016,rs7607715,rs2904350,rs17312167,rs13168609,rs561443,rs7810066,rs10257532,rs3849222,rs11817406,rs7193854,rs12447431和rs4790224。
5.根据权利要求4所述诊断试剂盒,其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
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