CN111154871A - 一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法和应用。本发明采用核酸质谱检测技术，检测与结直肠癌显著相关的11个基因突变位点的特定组合，综合这11个位点的定量检测结果，用于评估个体罹患CRC的风险。本发明通过核酸质谱技术对基因突变位点进行检测，相比于TaqMan‑PCR和二代平台测序，该检测方法具有简便、灵活性强、高通量、低成本等特点。本发明可用于CRC罹患风险的早期评估和大规模筛查，为CRC患病风险评估、诊断提供重要参考依据。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变方法和应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，大城市的情况尤其严峻，结直肠癌早已超越胃癌成为消化系统的首要恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤中，结直肠癌的发病率和死亡率均仅次于肺癌居第2位。虽然结直肠癌的治疗在近年有了长足的进步，但总体疗效并没有很大的改善，手术后的5年生存率在50％左右。而结直肠癌的早期患者治疗效果较好，5年生存率可在90％以上。导致CRC发病的因素主要包括环境和遗传。通过对CRC的基因突变进行检测，可以提前预知CRC患病的风险，对CRC的早期诊断和有效预防具有重大的指导意义。在早期的CRC中，肿瘤细胞可能脱落进入肠腔，并与粪便混合，由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，因此从粪便样本中提取DNA稳定性和敏感性更高。
CRC有多种早期检测的方法，包括以粪便为基础的检查如粪便隐血试验(FOBT)、粪便免疫化学试验(FIT)；内镜检查如柔性乙状结结肠镜检查、结肠镜和胶囊内镜检查；影像检查如结肠气钡双重造影、结肠CT成像等。结肠镜检查是CRC筛查的“金标准”，但是在检查前需要对患者做禁食、服用泻药等准备，检查过程又属于侵入性的检查方式，过程长且痛苦，还有穿孔等高风险的并发症可能，因此不易被患者接受，也难以作为CRC的早期筛查手段。FOBT及FIT 试验属于无创检测手段，但是其敏感性和特异性均较低，需要重复试验的验证，且检查结果易受药物等因素的影响而产生假阳性，只能作为初筛手段。
研究表明，癌症进化发育过程中促进癌前病变向原位癌进化的主要分子事件，包括体细胞基因突变、表观遗传修饰以及肿瘤“干性”相关信号分子等。从中发现肿瘤诊疗新标志物，提出阻遏癌前病变和肿瘤侵袭的有效手段，为准确界定高危癌前病变和开展癌症早期特异性预防和靶向治疗奠定基础。其中与CRC发生相关的原癌驱动基因有RAS-RAF-ERK信号通路的KRAS/NRAS、WNT信号通路的 APC基因以及抑癌基因TP53基因突变。
目前常用的检测SNP的方法主要是采用TaqMan-PCR及其二代平台测序，但是其存在诸如设计的灵活性不够、检测的准确性不高以及检测容量小的问题。本项目选择在MassRRAY飞行质谱仪(MALDI-TOF)技术平台上开发一套检测粪便基因突变的方法，早期发现CRC和CRC的癌前病变腺瘤。
发明内容
本发明为了弥补现有检测方法，在检测结直肠癌相关基因突变位点，用以鉴别肿瘤和肺肿瘤样本中效率的不足。使用核酸质谱检测技术，选择中等通量基因突变检测位点，检测结直肠癌基因突变。该方法操作简便、检测样本量大、准确率高，并且成本低。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其包括如下步骤：
(1)筛选出用于评估个体罹患结直肠癌风险相关的基因突变位点；
(2)设计步骤(1)中结直肠癌易感基因突变位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物，本发明所有引物扩张基因片段的长度应不超过200bp；
(3)将步骤(2)中的扩增引物分组，各组中所含的基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到相应的扩增引物混合液，每组扩增引物混合液的最终工作浓度为 0.5μM；
(4)对应于步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分组，得到单碱基延伸引物混合液；
(5)以待测样本DNA为模板，利用步骤(3)中的扩增引物分别进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段；
(6)SAP反应消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)利用各组相对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
(8)洁净树脂脱盐纯化延伸产物；
(9)MassARRAY平台对结直肠癌风险相关性的SNP位点进行基因分型检测，通过对不同基因型质量大小的分析，确定是否存在基因变异。
所述步骤(1)中可用来评估个体罹患结直肠癌风险相关性的SNP位点在NCBI 中的SNP数据库的rs号分别为rs121913529、rs121913530、rs112445441、 rs121913535、rs121912656、rs28934575、rs28934576、rs121912651、rs28934574、 rs121913328、rs121913329。
所述易感SNP位点的PCR特异性扩增引物序列对和延伸引物分别为：检测rs121913529的MU00101F和MU00101R、MU001011E；检测rs121913530的 MU00101F和MU00101R、MU001012E；检测rs112445441的MU00101F和 MU00101R、MU001013E；检测rs121913535的MU00101F和MU00101R、 MU001014E；检测rs121912656的MU00201F和MU00201R、MU002011E；检测 rs28934575的MU00201F和MU00201R、MU002012E；检测rs28934576的 MU00301F和MU00301R、MU003011E；检测rs121912651的MU00301F和MU00301R、MU003012E；检测rs28934574的MU00302F和MU00302R、 MU003021E；检测rs121913328的MU00303F和MU00303R、MU003031E；检测 rs121913329的MU00304F和MU00304R、MU003041E。
所述步骤(3)中扩增引物分组具体方法为：将步骤(2)中的扩增引物分为2组，第一组W1为包括rs121913529、rs121913329、rs121913530、rs28934576、 rs121913328、rs121912651共6个位点的4对扩增引物，第二组W2为包括 rs112445441、rs121913535、rs121912656、rs28934574、rs28934575共5个位点的3对扩增引物。按分组将每组中上下游扩增引物等摩尔混合，得到2管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM。
所述步骤(4)中单碱基延伸引物分组具体方法为：将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为2组，第一组包括：MU001011E、MU001012E、MU003011E、MU003012E、 MU003031E、MU003041E；第二组包括：MU001013E、MU001014E、MU002011E、 MU002012E、MU003021E；按分组，将每组中延伸引物等摩尔混合，得到2管延伸引物混合液。
所述步骤(5)的PCR扩增条件为：95℃2min，(95℃30s→56℃30s→72℃60s) 45个循环，72℃5min。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
所述步骤(7)的反应条件为94℃30s，[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个循环]40 个循环，72℃3min。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
上述基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因易感SNP的方法在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或者是否具有形成结直肠癌的风险的制剂中的用途。
本发明通过核酸质谱技术对基因突变位点进行检测，相比TaqMan-PCR和二代平台测序，该检测方法具有检测通量高、检测靶点组合灵活、成本低等特点。本发明可用于结直肠癌的早期筛查、辅助诊断、术后随访等。
附图说明
图1为本发明rs121913530位点野生型质谱仪检测图；
图2为本发明rs121913530位点突变型质谱仪检测图；
图3为本发明rs121913530位点杂合型质谱仪检测图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
实施例：通过本发明技术检测粪便中提取的人DNA结直肠癌早期诊断相关基因突变位点：
一、检测对象
从50例病理已经诊断为结直肠癌患者，以及30例健康志愿者的粪便中，检测一组结直肠癌早期诊断相关基因的突变位点。
二、使用Qiagen QIAamp Fast DNA Stool Mini试剂盒，提取粪便样本DNA，得粪便人DNA提取液。
1.取2.0ml离心管，加入干粪便样本约200mg，置于冰盒上。
2.在每个粪便样本中加入1ml InhibitEX缓冲液。连续漩涡1分钟，直至粪便样品完全均匀。
3.将混匀后的样本于14500rpm(约20000×g)离心1min。
4.取干净的2.0ml离心管，加入25μl蛋白酶K。
5.取第3步离心产物的上清液600μl加入已装好蛋白酶K的离心管中。
6.加入600μl Buffer AL并涡旋15s。
7.将混匀后的样本置于70℃金属浴中孵育10min。
8.再加入600μl无水乙醇，上下颠倒混匀。
9.取离心柱，加入第8步下混合液600μl，14500rpm离心1min，丢弃含有滤液的收集管。
10.更换干净的2.0ml收集管，重复第9步操作，直至所有的混合液均转移完毕(共需转移3次)。
11.更换干净的2.0ml收集管，加入500μl Buffer AW1，14500rpm离心1min，弃去含有滤液的收集管。
12.更换干净的2.0ml收集管，加入500μl Buffer AW2，14500rpm离心3min，弃去含有滤液的收集管。
13.更换干净的2.0ml离心管(非试剂盒提供)，14500rpm离心3min，弃去含有滤液的离心管。
14.更换干净的1.5ml离心管(非试剂盒提供)，加入200μl Buffer ATE，室温放置2min，然后14500rpm离心1min，1.5ml离心管中即为提取完成的 DNA样本溶液，可直接用于下一步操作，若暂不使用可密封并置于-20℃保存。
三、检测样本质量
1.打开NANO DROP2000仪器的上盖，用无尘纸擦干净仪器检测小孔外缘。
2.用移液枪吸取Buffer ATE约2μl，仔细滴到检测仪器的小孔中，盖上检测仪器的上盖。
3.在电脑操作软件中输入待测样本名称，点击Blank，后点击Measure键读取实验结果。
4.打开检测仪器的上盖，用无尘纸擦干净仪器检测小孔外缘。
5.用移液枪吸取DNA样本约2μl，仔细滴到检测仪器的小孔中，盖上检测仪器的上盖。
6.在电脑操作软件中输入待测样本名称，点击Measure键读取实验结果。
7.检测完毕后DNA样品可直接用于下一步操作，若暂不使用可密封并置于 -20℃保存。
四、PCR扩增
以提取的粪便中DNA为模板，如表1所示将扩增引物分为2组，扩增引物W1 为第1组，扩增引物W2为第2组；将每条扩增引物等摩尔混合，得到2管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM，进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR 产物片段。
1.PCR扩增反应体系(5μl)为：
2.PCR反应程序：
95℃2min→(95℃30s→56℃30s→72℃60s)×45cycles→72℃5min→4℃∞。
表1：易感SNPs位点的特异性扩增引物序列对
五、PCR产物SAP酶处理
1.处理上步获得的PCR产物，消除反应体系中剩余的dNTP。
SAP酶处理反应体系为7μl(每一个反应)：
2.消化反应条件为：
37℃40min→85℃5min→4℃∞。
六、单碱基延伸
1.在SAP酶处理结束后，对目标产物的位点进行单碱基延伸，所用延伸引物如表2所示。
单碱基延伸反应体系为9μl(每一个反应)：
2.单碱基延伸PCR反应程序：
94℃30s→[94℃5s→(52℃5s→80℃5s)×5cycles]×40cycles→72℃3min→4℃∞。
表2：易感SNPs位点的延伸引物序列对
七、洁净树脂脱盐纯化
向上一步的产物中加入树脂，对延伸产物进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。具体步骤为：
向384孔板的每孔延伸产物中加入20μl水，以及干燥的洁净树脂6mg。用封板膜将板密封，低速垂直旋转15min，使树脂与反应物充分接触；3200g离心5min，准备点样。
八、芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
九、质谱分析
将点样后的Spectro CHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization-time offligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
以rs121913530位点为例，质谱仪检测显示的结果如图1-图3所示，分别显示了位点是野生型、突变型、杂合型的情况。其他9个位点，判断的方式类似。
十、结论
结果显示，本实施例检测的50例病理已经诊断为结直肠癌患者，以及30例健康志愿者的粪便中，每个肿瘤患者的粪便DNA中，都能检测到本发明中3个以上 CRC基因突变位点。而健康志愿者的粪便DNA中，都只能检测到0个或者1个CRC基因突变位点。说明本发明技术能够有效的检测到结直肠癌患者体内存在的突变。
Claims (8)
1.一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)筛选出用于评估个体罹患结直肠癌风险相关的基因突变位点；
(2)设计步骤(1)中结直肠癌易感基因突变位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物；
(3)将步骤(2)中的扩增引物分组，各组中所含的基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到相应的扩增引物混合液，每组扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM；
(4)对应于步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分组，得到单碱基延伸引物混合液；
(5)以待测样本DNA为模板，利用步骤(3)中的扩增引物分别进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段；
(6)SAP反应消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)利用各组相对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
(8)洁净树脂脱盐纯化延伸产物；
(9)MassARRAY平台对结直肠癌风险相关性的SNP位点进行基因分型检测，通过对不同基因型质量大小的分析，确定是否存在基因变异。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其特征在于：所述步骤(1)中可用来评估个体罹患结直肠癌风险相关性的SNP位点在NCBI中的SNP数据库的rs号分别为rs121913529、rs121913530、rs112445441、rs121913535、rs121912656、rs28934575、rs28934576、rs121912651、rs28934574、rs121913328、rs121913329。
3.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其特征在于：所述易感SNP位点的PCR特异性扩增引物序列对和延伸引物分别为：检测rs121913529的MU00101F和MU00101R、MU001011E；检测rs121913530的MU00101F和MU00101R、MU001012E；检测rs112445441的MU00101F和MU00101R、MU001013E；检测rs121913535的MU00101F和MU00101R、MU001014E；检测rs121912656的MU00201F和MU00201R、MU002011E；检测rs28934575的MU00201F和MU00201R、MU002012E；检测rs28934576的MU00301F和MU00301R、MU003011E；检测rs121912651的MU00301F和MU00301R、MU003012E；检测rs28934574的MU00302F和MU00302R、MU003021E；检测rs121913328的MU00303F和MU00303R、MU003031E；检测rs121913329的MU00304F和MU00304R、MU003041E。
4.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其特征在于：所述步骤(3)中扩增引物分组具体方法为：将步骤(2)中的扩增引物分为2组，第一组W1为包括rs121913529、rs121913329、rs121913530、rs28934576、rs121913328、rs121912651共6个位点的4对扩增引物，第二组W2为包括rs112445441、rs121913535、rs121912656、rs28934574、rs28934575共5个位点的3对扩增引物。按分组将每组中上下游扩增引物等摩尔混合，得到2管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM。
5.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其特征在于：所述步骤(4)中单碱基延伸引物分组具体方法为：将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为2组，第一组包括：MU001011E、MU001012E、MU003011E、MU003012E、MU003031E、MU003041E；第二组包括：MU001013E、MU001014E、MU002011E、MU002012E、MU003021E；按分组，将每组中延伸引物等摩尔混合，得到2管延伸引物混合液。
6.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其特征在于：所述步骤(5)的PCR扩增条件为：95℃2min，(95℃30s→56℃30s→72℃60s)45个循环，72℃5min。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
7.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法，其特征在于：所述步骤(7)的反应条件为94℃30s，[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个循环]40个循环，72℃3min。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
8.权利要求1-7任意之一所述基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因易感SNP 的方法在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或者是否具有形成结直肠癌的风险的制剂中的用途。
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| CN114107505A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-03-01 | 求臻医学科技（北京）有限公司 | 用于结直肠癌易感基因snp检测的引物、检测方法和试剂盒 |
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| CN108070661A (zh) * | 2016-11-10 | 2018-05-25 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | Kras基因检测试剂盒及检测方法 |
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