CN109880903A - 一种用于非小细胞肺癌辅助诊断的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与非小细胞肺癌相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963的组合。该标志物能够很好地将健康对照和非小细胞肺癌患者区分，可用于制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
肺癌是危害人类健康最严重的恶性肿瘤之一。据国际癌症研究署(IARC)估计，2018年全球肺癌新发病例209.4万人，占全部癌症新发病例的11.6％；肺癌死亡人数176.1万，占全部癌症死亡病例的18.4％。由于人口老龄化加剧、烟草消费持续增长、以及生活方式的改变，我国肺癌的疾病负担亦日趋严峻，发病率和死亡率呈持续上升趋势。据中国肿瘤登记中心最新数据估计，2015年我国男性和女性的肺癌发病人数约为50.9万和22.4万，肺癌死亡人数分别为43.2万和17.8万，均高于世界平均水平。由此可见，肺癌已成为一个亟待解决的重大公共卫生问题，严重威胁全世界及我国人民的生命和健康。
肺癌依据组织病理学类型可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的85％，包含腺癌、鳞癌和大细胞癌。烟草暴露是肺癌发生最主要的环境危险因素。肺癌家庭聚集性研究显示，遗传因素在肺癌的发生中同样扮演重要角色。尽管80％以上的肺癌可以归咎为烟草暴露，但仅有不到20％的吸烟者发生肺癌，说明在同等环境暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，它的存在被认为赋予了个体不同的表型和性状，并且影响个体对疾病(包括肿瘤)的易感性、以及对药物的反应性等。
采用与特定疾病相关的SNP谱辅助诊断疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP谱的构建，还可以实现对疾病作出早期的“基因诊断”。近年来，利用SNP辅助诊断疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在包括肺癌在内的常见重大疾病早期诊断上的应用价值已初见端倪。然而，非小细胞肺癌和小细胞肺癌在细胞学形态、肿瘤基因组和遗传易感性方面存在一定的差异，目前还没有将SNP应用于非小细胞肺癌辅助诊断的报道，若能找出与非小细胞肺癌相关的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国非小细胞肺癌的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过检测非小细胞肺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与非小细胞肺癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，为非小细胞肺癌的早期辅助诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963的组合。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物，这些引物为：
rs2293607的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs10429489的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs1200399的引物序列为SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs17038564的引物序列为SEQ IDNo:22和SEQ ID No:23；rs55768116的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs1853837的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；rs12265047的引物序列为SEQ IDNo:31和SEQ ID No:32；rs401681的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs77468143的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs3817963的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物，该引物为：
rs2293607的引物序列为SEQ ID No:3；rs10429489的引物序列为SEQ ID No:6；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:9；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:12；rs1200399的引物序列为SEQ ID No:15；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:18；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:21；rs17038564的引物序列为SEQ ID No:24；rs55768116的引物序列为SEQID No:27；rs1853837的引物序列为SEQ ID No:30；rs12265047的引物序列为SEQ ID No:33；rs401681的引物序列为SEQ ID No:36；rs77468143的引物序列为SEQ ID No:39；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:42；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:45；rs3817963的引物序列为SEQ ID No:48。
所述的SNP标志物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性扩增引物为：
rs2293607的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs10429489的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs1200399的引物序列为SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs17038564的引物序列为SEQ IDNo:22和SEQ ID No:23；rs55768116的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs1853837的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；rs12265047的引物序列为SEQ IDNo:31和SEQ ID No:32；rs401681的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs77468143的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs3817963的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性延伸引物为：
rs2293607的引物序列为SEQ ID No:3；rs10429489的引物序列为SEQ ID No:6；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:9；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:12；rs1200399的引物序列为SEQ ID No:15；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:18；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:21；rs17038564的引物序列为SEQ ID No:24；rs55768116的引物序列为SEQID No:27；rs1853837的引物序列为SEQ ID No:30；rs12265047的引物序列为SEQ ID No:33；rs401681的引物序列为SEQ ID No:36；rs77468143的引物序列为SEQ ID No:39；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:42；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:45；rs3817963的引物序列为SEQ ID No:48。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择非小细胞肺癌病例、与非小细胞肺癌病例年龄、性别匹配的健康对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与非小细胞肺癌相关的SNP。(3)非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据非小细胞肺癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Illumina Global Screening Array(GSA)v1.0芯片进行全基因组扫描。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为非小细胞肺癌；
(2)与病例年龄、性别匹配的健康对照；
本研究共采用19546例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Illumina GSA v1.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)Illumina GSA v1.0芯片上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在非小细胞肺癌病例与健康对照中的分布差异。
4.统计分析方法
运用t2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这16个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与非小细胞肺癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.10×rs17038564的评分)+(0.12×rs2293607的评分)+(0.27×rs13167280的评分)+(0.14×rs401681的评分)+(0.18×rs2517873的评分)+(0.06×rs3817963的评分)+(0.14×rs1853837的评分)+(0.16×rs4236709的评分)+(0.10×rs10429489的评分)+(0.09×rs35201538的评分)+(0.09×rs4573350的评分)+(0.13×rs12265047的评分)+(0.12×rs55768116的评分)+(0.06×rs11610143的评分)+(0.10×rs1200399的评分)+(0.08×rs77468143的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的19546例样本中。(以rs17038564为例：0.10为rs17038564的回归系数(见表1)；rs17038564的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体某因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SNPTEST v2.5)。统计学显著性水平P值设为0.01，所有统计学检验均为双侧检验。
5.诊断试剂盒制备方法
Illumina GSA v1.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定非小细胞肺癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为非小细胞肺癌诊断的指标。最后筛选出的与非小细胞肺癌发病有关的SNP用于制作辅助诊断试剂盒(rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物，以及Taq酶、dNTP等试剂，这些物质可以全部装配在一个试剂盒中，也可以分散在一系列试剂盒中组合使用。
以下是本发明进一步的说明：
在上述10248例符合条件的非小细胞肺癌病例及9298例健康对照中，两组年龄均衡可比。我们将这两组人群使用Illumina GSA v1.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Illumina GSA v1.0芯片检测，本发明人检测到在“非小细胞肺癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963。
多因素Logistic回归分析结果表明，这16个SNP与非小细胞肺癌的发病存在着显著关联。
进一步分析这16个SNP的组合用于非小细胞肺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于非小细胞肺癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言，这16个SNP的组合，或者这16个SNP的特异性引物构成的相关诊断试剂盒有助于非小细胞肺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为非小细胞肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为非小细胞肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于非小细胞肺癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄、性别等对疾病发展的影响因素，研究SNP在非小细胞肺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于非小细胞肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了非小细胞肺癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得非小细胞肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示非小细胞肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2005月4月开始至2017年8月从南京医科大学附属肿瘤医院和南京医科大学第一附属医院收集了大量的非小细胞肺癌血标本，并从同期参加慢性非传染性疾病筛查项目的社区人群中收集外周血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择19546例符合下列标准的样本进行全基因组芯片扫描：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为非小细胞肺癌；
(2)与病例年龄、性别匹配的健康对照；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描
在上述符合条件的10248例非小细胞肺癌患者和9298例健康对照中，两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Illumina GSA v1.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全基因组扫描：在Illumina GSA v1.0芯片上进行全基因组扫描。
9、数据分析与处理：在“非小细胞肺癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1病例组与对照组全基因组关联分析结果
实施例3利用危险度评分方法进一步分析SNP与非小细胞肺癌发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“非小细胞肺癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来分析诊断的灵敏性和特异性，来评价这些SNP对非小细胞肺癌的辅助诊断效果。对16个SNP标志物的联合分析发现，这16个SNP以57.9％的AUC将健康对照组和非小细胞肺癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为56.5％，特异度：55.3％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963的组合能够很好地将健康对照和非小细胞肺癌患者区分。
实施例4用于非小细胞肺癌辅助诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Illumina GSA v1.0芯片检测和Sequenom MassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列引物：rs2293607的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs10429489的引物序列为SEQ IDNo:4和SEQ ID No:5；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs1200399的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ IDNo:14；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs17038564的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs55768116的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs1853837的引物序列为SEQ IDNo:28和SEQ ID No:29；rs12265047的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs401681的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs77468143的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs3817963的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ IDNo:47)，和/或特异性延伸引物(包括下列引物：rs2293607的引物序列为SEQ ID No:3；rs10429489的引物序列为SEQ ID No:6；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:9；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:12；rs1200399的引物序列为SEQ ID No:15；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:18；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:21；rs17038564的引物序列为SEQID No:24；rs55768116的引物序列为SEQ ID No:27；rs1853837的引物序列为SEQ ID No:30；rs12265047的引物序列为SEQ ID No:33；rs401681的引物序列为SEQ ID No:36；rs77468143的引物序列为SEQ ID No:39；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:42；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:45；rs3817963的引物序列为SEQ ID No:48)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，荧光探针，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)，这些物质可以全部装配在一个试剂盒中，也可以分散在一系列试剂盒中组合使用。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱辅助判断非小细胞肺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种用于非小细胞肺癌辅助诊断的SNP标志物及其应用
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<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcacggtgg cacat 15
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acgttggatg aacaggaatt ccccctcatc 30
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tagtggggac agaca 15
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acgttggatg gggaggaatt tcttccccac 30
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agacatgcta aaggaca 17
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acgttggatg ggtggttaca agtaaccagg 30
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gagtaccctg accctaac 18
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tcgtctggct gagcaagc 18
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tgtagggaag cagttgaa 18
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atgtttagta gcattcccg 19
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acgttggatg cttggcagaa tgggtgtatc 30
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gttgggggtg tatggggac 19
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acatccagac aacttcagag tc 22
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gttattgtga taggatcttt tg 22
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tggattttcc tcaaaaactc ttt 23
Claims (9)
1.一种与非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963的组合。
2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：
rs2293607的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs10429489的引物序列为SEQID No:4和SEQ ID No:5；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs1200399的引物序列为SEQ ID No:13和SEQID No:14；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs17038564的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs55768116的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs1853837的引物序列为SEQID No:28和SEQ ID No:29；rs12265047的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs401681的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs77468143的引物序列为SEQ IDNo:37和SEQ ID No:38；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs3817963的引物序列为SEQ IDNo:46和SEQ ID No:47。
3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：
rs2293607的引物序列为SEQ ID No:3；rs10429489的引物序列为SEQ ID No:6；rs2517873的引物序列为SEQ ID No:9；rs4573350的引物序列为SEQ ID No:12；rs1200399的引物序列为SEQ ID No:15；rs4236709的引物序列为SEQ ID No:18；rs13167280的引物序列为SEQ ID No:21；rs17038564的引物序列为SEQ ID No:24；rs55768116的引物序列为SEQID No:27；rs1853837的引物序列为SEQ ID No:30；rs12265047的引物序列为SEQ ID No:33；rs401681的引物序列为SEQ ID No:36；rs77468143的引物序列为SEQ ID No:39；rs11610143的引物序列为SEQ ID No:42；rs35201538的引物序列为SEQ ID No:45；rs3817963的引物序列为SEQ ID No:48。
4.权利要求1所述的SNP标志物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
7.一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs2293607、rs10429489、rs2517873、rs4573350、rs1200399、rs4236709、rs13167280、rs17038564、rs55768116、rs1853837、rs12265047、rs401681、rs77468143、rs11610143、rs35201538和rs3817963的基因型。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP标志物的特异性扩增引物和/或权利要求3所述SNP标志物的特异性延伸引物。
9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
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