CN113444838A

CN113444838A - 用于检测covid-19易感性的分子标记、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN113444838A
Application number: CN202110700481.7A
Authority: CN
Inventors: 马丁; 吴鹏; 丁文成; 邬堂春; 王超龙; 王志杰
Original assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Current assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2021-09-28

Abstract

本发明公开了一种用于检测COVID‑19易感性的分子标记、试剂盒及应用，属于分子生物和医学技术领域。该分子标记包括在LZTFL1基因序列的第1015位存在一个SNP位点，其中，脱氧核苷酸由A变为G。该检测体外样品是否存在LZTFL1基因的单核苷酸多态性的方法，包括如下步骤，(1)采用特异性引物SEQ ID No：2和SEQ ID No：3扩增样品的LZTFL1基因，得到扩增产物；(2)对步骤(1)的扩增产物进行序列测定，当LZTFL1基因序列的第1015位存在一个SNP位点，且脱氧核苷酸由A变为G时，则为突变LZTFL1基因，仍是A时为正常基因。本发明通过检测体外样品中是否含有LZTFL1基因单核苷酸多态性，能够实现对于COVID‑19高危人群及易感人群的早期诊断、筛查和对于COVID‑19的有效防控。

Description

用于检测COVID-19易感性的分子标记、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)及其与COVID-19的相关性研究，属于分子生物学和医学技术领域，具体地涉及一种用于检测COVID-19易感性的分子标记、试剂盒及应用。

背景技术

据数据模型研究和血清感染研究估计实际感染人数要大得多，表明大多数感染者可能有轻度症状或无症状。COVID-19患者表现出广泛的临床症状：在确诊病例中，多达5％会发展成为包含急性呼吸窘迫综合征(ARDS)在内的严重肺炎。虽然目前研究已发现高龄、男性、高血压、糖尿病、肥胖和心血管疾病等因素与COVID-19的发病密切相关，但仍有大量没有上述危险因素的患者出现严重症状。提示 COVID-19患者的筛选、早期诊断对于疫情防治具有重要意义，因此，寻找和鉴定COVID-19高危人群和易感个体至关重要。

然而现有技术中，没有与COVID-19易感性相关的遗传变异的报道，也没有相关的检测试剂盒和检测方法。因此，本领域急需进一步寻找COVID-19易感性基因，开发检测COVID-19高危人群和易感个体的方法、试剂盒以及相关的治疗药物。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测COVID-19易感性的分子标记、试剂盒及应用。具体地通过检测体外样品中是否含有LZTFL1基因中的单核苷酸多态性，能够实现对于COVID-19高危人群及易感人群的早期诊断、筛查和对于COVID-19的有效防控。

为实现上述目的，本发明公开了一种用于检测COVID-19易感性的分子标记，期特征在于：在LZTFL1基因序列的第1015位存在一个SNP位点，其中，脱氧核苷酸由A变为G。

本发明公开技术方案的其中一个技术目的是上述分子标记在制备用于检测COVID-19易感性的试剂盒中的应用。

进一步地，一种用于检测COVID-19易感性的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示的用于扩增LZTFL1基因的特异性引物。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由 Taq酶、Buffer、dNTP、Mg²⁺和双蒸水组成。

进一步地，所述特异性引物对LZTFL1基因扩增后所得产物长度为250～2010bp。

本发明公开技术方案的另一个技术目的是一种检测体外样品是否存在基因单核苷酸多态性的方法，它包括如下检测过程：

采用特异性引物SEQ ID No：2和SEQ ID No：3扩增样品的 LZTFL1基因，得到扩增产物，对所述扩增产物进行序列测定，当 LZTFL1基因序列的第1015位存在一个SNP位点，且脱氧核苷酸由 A变为G时，则为突变LZTFL1基因，仍是A时为正常基因。

进一步地，采用PCR扩增技术对样品进行扩增，且PCR扩增条件为，94℃:4分钟，94℃:30秒×35次循环，60℃:30秒×35次循环， 72℃:1分钟×35次循环，72℃延伸5分钟。

进一步地，所述样品包括血液、唾液、肺泡冲洗液等。

本发明公开技术方案的余下技术目的是对个体COVID易感性或患病风险进行检测或诊断的方法，它包括如下步骤：

(1)提取受试者血液DNA，应用上述检测试剂盒进行PCR反应，并将产物进行测序，其中，LZTFL1测序引物使用SEQ ID No： 2或SEQ ID No：3。

(2)比对测序结果，若出现SEQ ID No：1中1015A>G的SNP 位点，说明该受试者为COVID-19易感染对象，应提醒该受试者严格注意防护，减少公众场合活动，避免感染，并优先进行疫苗接种；若未出现上述SNP位点，说明该受试者不是COVID-19易感染对象。

检验原理：

SNP是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。通过大数据分析研究表明，本发明中SEQ ID No：1中的1015 A>G与新冠肺炎疾病严重程度呈显著相关性，这可能是因为单个氨基酸的改变或突变，进一步导致蛋白质表达异常或结构异常，进而导致相应蛋白质功能异常，影响个体的免疫系统或影响机体不能及时有效清除SARS-Cov-2，最终使得机体感染病毒并发病。

有益效果：

1、本发明设计了一种分子标记及试剂盒，能实现对于COVID-19 高危人群及易感人群的早期诊断和筛查，对于实现COVID-19的有效防控具备重要意义；

2、本发明设计的检测方法操作简单，且检测过程快速，准确度也较高，适合对COVID-19高危人群及易感人群的早期筛查。

附图说明

图1为新冠肺炎相关SNP位点差异曼哈顿图。

具体实施方式

术语解释

SNP：单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。

本发明的发明人经过广泛深入而深入的研究，通过对多中心大样本数据的整合分析，对大量候选基因的SNP进行分析和筛选，首次发现LZTFL1基因的SNP与COVID-19易感性密切相关，可作为 COVID-19易感性检测或早期诊断的分子标记。因此，本发明提供了一种用于检测COVID-19易感性的分子标记、试剂盒及应用。

为更好的解释本发明技术方案，以下结合具体实施例进行详细说明。

实施例1LZTFL1基因突变的检测及其与COVID-19感染的相关性分析；

1.1筛选受试者：

选取无合并症的新冠肺炎确诊患者200例，选择年龄、性别匹配的健康体检对照人群200例。留取受试人员外周血至少1.5mL，-80℃ 冰箱冷冻保存备用。

1.2提取样本DNA：

提取上述步骤1.1的受试人员外周血中DNA；其中，本实施例提取血液样品DNA采用QIAGEN公司DNA纯化试剂盒，货号： 69504。

具体操作过程如下：

取100uL血液样品，加入20uL蛋白酶K，100uL PBS震荡混匀；

加入200uL Buffer AL,震荡混匀后56℃水浴10min；

加入200uL无水乙醇，震荡混匀得混合物；

将混合物转入试剂盒提供的spin column中，6000g离心1min，弃去废液；

更换收集管，在spin column中加入500μL试剂盒提供的Buffer AW1，其中，所述Buffer AW1按说明书要求提前加入无水乙醇，6000g 离心1min，弃去废液；

继续更换收集管，在spin column中加入500μL试剂盒提供的 Buffer AW2，所述Buffer AW2按说明书要求提前加入无水乙醇， 20000g离心3min，弃去废液；

去除收集管，将spin column转入1.5mL离心管中，加入200uL 试剂盒提供的Buffer AE，完全覆盖膜，室温静置至少1min；

6000g离心1min，获得样品DNA，应用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测量DNA浓度，其中，所述Nanodrop 2000微量紫外分光光度计为Thermo公司生产；

1.3 LZTFL1基因特异性引物设计：

检索GenBank数据库中LZTFL1基因组序列，应用Primer3Plus 在线引物设计工具设计引物，且引物序列信息如SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示。

1.4 PCR扩增：

PCR扩增使用北京擎科新业生物技术有限公司的2×Master Mix 目录号为TSE003。

且PCR扩增条件如下：

1.5测序分析：

上述PCR扩增产物由武汉擎科公司完成测序，测序引物使用SEQ ID No：2，测序结果经DNA测序分析软件Chromas，版本v2.6.5进行检查，应用Invitrogen Vector NTI 11软件包附带序列比对软件 AlignX进行比对。通过对比分析，确定是否存在LZTFL1基因的单核苷酸多态性。

1.6SNP分型与COVID-19关联分析：

确定SNP位点后，应用卡方检验对检测结果中SNP位点的分布特征情况进行统计学分析，应用Logistic回归分析对基因型频率、等位基因频率和新冠肺炎患者临床表型的相关性进行评估，计算95％置信区间(confidence interval，CI)和比值比(Odds ratio,OR)，应用SPSS 22.0软件进行统计分析。结果发现SEQ ID No：1中的1015 A>G位点与新冠肺炎疾病严重程度呈显著相关性(P＝3.11×10^-15)，其中，95％CI为1.42～1.79，OR值为1.60。因此可以通过判断体外样品中是否含有LZTFL1基因单核苷酸多态性实现对COVID-19易感性的有效筛选。如下表1为LZTFL1与COVID-19的相关性；

表1LZTFL1与COVID-19的相关性

*HGI，即Host Genetics Initiative，宿主遗传学计划。

与此同时，图1为新冠肺炎相关SNP位点差异曼哈顿图，结合图1可知在新冠肺炎人群中，CCR9、LZTFL1、FYCO1、CXCR6、 SLC6A20、XCR1等基因表达差异明显，经过大数据验证得知， LZTFL1基因相关SNP的表达在新冠肺炎人群中具有显著差异。

实施例2

应用COVID-19易感性检测试剂盒判断受试对象COVID-19的易感性；

根据实施例1的相关结果，发现LZTFL1基因与COVID-19易感性密切相关，基于该结果中的突变可设计基因特异性引物，从而制出一种检测试剂盒，用以检测受试患者的血液DNA模板。

上述检测试剂盒(以100人次为例)，包含下表2所示试剂。

表2试剂盒含量列表

其中，上述引物的序列表如下表3所示；

表3引物序列表

与此同时，所述PCR反应混合液包含PCR反应的常规组件： Buffer、Taq酶、dNTP、Mg²⁺和双蒸水组成。

实际应用中，试剂盒包括包装盒、海绵衬垫、装有上游引物的试管、装有下游引物的试管、装有PCR反应Mix的试管、装有阳性对照品的一个试管和装有阴性对照品的一个试管。

进一步地按照实施例1中步骤1.2所述方法提取受试患者血液 DNA，应用表2中所述检测试剂盒进行PCR反应，并将产物进行测序，测序引物使用SEQ ID No：2。

结果判定：比对测序结果，若出现SEQ ID No：1中1015A>G 的SNP位点，则说明该受试者为COVID-19易感染对象，应提醒该受试者严格注意防护，减少公众场合活动，避免感染，并优先进行疫苗接种；否则说明该受试者不是COVID-19易感染对象。

此外，正常LZTFL1基因的基因序列表如下所示：

其中，序列中1015位SNP位点由A表示。

因此，本发明依据SEQ ID No：1中1015A>G的SNP位点，开发出一种检测检测新冠肺炎遗传易感性的试剂盒。该试剂盒涉及SEQ ID No：1中1015A>G的SNP。具体检测方法为通过常规方法提取受试患者外周血标本的DNA，应用该易感性检测试剂盒进行PCR反应，将PCR产物进行常规测序，应用Chromas软件检验测序结果，应用 Invitrogen Vector NTIAlignX软件比对测序序列。若测序结果含有 1015A>G，即可判定该标本对应患者对新冠肺炎的易感性高于正常人群。

以上实施例仅为最佳举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims

1.一种用于检测COVID-19易感性的分子标记，其特征在于，在LZTFL1基因序列的第1015位存在一个SNP位点，其中，脱氧核苷酸由A变为G。

2.一种权利要求1所述分子标记在制备用于检测COVID-19易感性的试剂盒中的应用。

3.一种用于检测COVID-19易感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示的用于扩增LZTFL1基因的特异性引物。

4.根据权利要求3所述用于检测COVID-19易感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由Taq酶、Buffer、dNTP、Mg²⁺和双蒸水组成。

5.根据权利要求3或4所述用于检测COVID-19易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对LZTFL1基因扩增后所得产物长度为250～2010bp。

6.一种检测体外样品是否存在基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括如下检测过程：采用特异性引物SEQ ID No：2和SEQ ID No：3扩增样品的LZTFL1基因，得到扩增产物，对所述扩增产物进行序列测定，当LZTFL1基因序列的第1015位存在一个SNP位点，且脱氧核苷酸由A变为G时，则为突变LZTFL1基因，仍是A时为正常基因。

7.根据权利要求6所述检测体外样品是否存在基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，采用PCR扩增技术对样品进行扩增，且PCR扩增条件为，94℃:4分钟，94℃:30秒×35次循环，60℃:30秒×35次循环，72℃:1分钟×35次循环，72℃延伸5分钟。

8.根据权利要求6或7所述检测体外样品是否存在基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述样品包括血液、唾液、肺泡冲洗液等。