CN111303255A - 一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种COVID‑19‑S‑RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，用CuMVTT基因与pET28a质粒连接后构建pET28a‑CuMVTT重组质粒，用COVID‑19‑S‑RBD基因与pFUSE质粒构建pFUSE‑COVID‑19‑S‑RBD重组质粒；重组质粒分别转入大肠杆菌表达菌株和293F细胞表达细胞株，培养大肠杆菌表达株，离心分离生物质，获得病毒样颗粒，培养293F细胞重组表达细胞株获得COVID‑19‑S‑RBD蛋白；病毒样颗粒与COVID‑19‑S‑RBD通过化学偶联试剂SMPH偶联。本发明易于通过菌体培养获得，比嵌合表达产量高，便于工业生产，免疫快。

Description

一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，属 于生物医药技术领域。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)的症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐 出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正 的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。该病毒已确认存在人传人现象，且潜伏期 具有传染性，所致疾病没有特异治疗方法。但是不同形式的疫苗正在研发， 新闻报道的比如2020年2月25日，专注于mRNA药物和疫苗研发的临床阶 段的生物技术公司Moderna宣布，已经生产了第一批供人体试验使用的新型 冠状病毒的疫苗mRNA-1273。还有2020年2月25日天津大生命科学学院黄 金海教授团队宣布已经研发出新型冠状病毒口服疫苗，该疫苗以食品级安全 酿酒酵母为载体，以新型冠状病毒S蛋白为靶点产生抗体。目前科研团队正 在寻求合作方，希望能推动疫苗早日走向临床，为疫情防控发挥作用。
病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的发展为如何研发既保 持构象表位并且无毒力回复风险的疫苗提供了一种新的研究策略。VLP疫苗 是通过分子生物学技术，表达病毒一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白天然 的自装配能力，可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒，没有病毒的 核酸，不能自主复制，没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险， 并且表面有高密度的病毒抗原，保持了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样 的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。
cVLP通过基因融合表达或以VLP为载体通过化学偶联的方法将外源抗 原与其偶联制备而成，后一种方法制备的重组VLP也常被称作偶联VLP。
融合表达的方法如下，在制备无包膜VLP的基础上，将外源抗原DNA与 具有自我组装能力的多肽基因融合，进一步制备无包膜cVLP；类似于有包膜 VLP的制备方法，将不同种(型)的病毒蛋白或嵌合蛋白组合，形成cVLP(包 膜型或无包膜型)。但是嵌合疫苗产量比较低，生产成本比较高，且在大规 模生产时，易导致产品结构和组分上不相容，限制了其在疫苗中的发展。
化学偶联方法是依靠模块化系统，分别合成VLP和靶抗原，在体外以共 价键或非共价键结合的形式，将抗原与预装配的VLP相连。其优势在于靶抗 原的大小和结构不受VLP单体折叠和颗粒组装等条件的限制，可以在VLP表 面展示短线性肽、肽环和全长蛋白，甚至多糖和半抗原等非蛋白形式的抗原。 瑞士Cytos生物制药公司将尼古丁共价偶联与噬菌体QβVLP表面，制备戒 烟疫苗，Ⅰ/Ⅱ期临床评估结果表明，尼古丁-QβcVLP可以诱导高滴度尼古 丁特异性抗体。并且单独的病毒样颗粒可以在大肠杆菌中稳定表达，提高了 产量的同时降低了成本。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗 粒、疫苗及其制备方法，易于通过菌体培养获得，连接效率高，比嵌合表达 产量高，便于工业化生产,免疫反应快。
本发明的第一个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，所述 病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的 pET28a-CuMVTT重组质粒通过表达菌株表达获得。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内切酶和BamHⅠ内切酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶将CuMVTT和pET28a质粒双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组 质粒。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述表达菌株采用大肠 杆菌T7Shuffle表达菌株。用50ug/ml浓度的卡那霉素筛选得到 pET28a-CuMVTT T7 Shuffle重组表达菌株。
本发明通过构建并培养能够表达CuMVTT病毒样颗粒的大肠杆菌重组表达 菌株，成功的获得了一种易于通过菌体培养获得，适合工业化生产，且便于 纯化的CuMVTT病毒样颗粒。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得。
本发明的第二个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD疫苗，包括上述的 CuMVTT病毒样颗粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成 的pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD 蛋白。
所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂 SMPH偶联后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗。
本发明通过一定浓度的CuMVTT病毒样颗粒与一定量的 COVID-2019-S-RBD蛋白在特定条件下通过化学偶联试剂SMPH偶联成 COVID-2019-S-RBD-CuMVTT，适合工业化生产，且便于纯化。
作为COVID-19-S-RBD疫苗的优选方案，所述表达细胞株采用293F表达 细胞株，所述pFUSE-COVID-2019-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获 得pFUSE-COVID-2019-S-RBD重组表达细胞株。本发明通过构建并培养能够 表达COVID-2019-S-RBD蛋白的293F细胞重组表达细胞株，成功的获得了一 种易于通过哺乳细胞培养获得，适合工业化生产，且便于纯化COVID-2019-S-RBD蛋白。
作为COVID-19-S-RBD疫苗的优选方案，所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重 组质粒是将COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒均用EcoRⅠ内切酶和BgⅢ 内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质 粒双酶切产物连接得到。
本发明的第三个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方 法，包括以下步骤：
(11)重组质粒的构建：用黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连 接后构建pET28a-CuMVTT重组质粒；
(12)重组质粒转入表达菌株：将所述pET28a-CuMVTT重组质粒转入大 肠杆菌T7Shuffle表达菌株，得到pET28a-CuMVTT重组表达菌株；
(13)菌体培养及CuMVTT病毒样颗粒纯化：培养所述pET28a-CuMVTT重组 表达菌株，离心分离生物质获得CuMVTT病毒样颗粒。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法的优选方案，CuMVTT病毒样颗 粒纯化是将大肠杆菌重组表达菌株培养菌液离心10min，取沉淀，然后向沉 淀物中加入适量的裂解液，再离心12min，取上清，上清液经1％Triton X-100、 4％PEG8000沉淀、30％蔗糖，超速离心获得CuMVTT病毒样颗粒。
本发明的第四个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，包 括以下步骤：
(21)重组质粒的构建：采用COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接 后构建pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒；
(22)重组质粒转入表达细胞株：将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组 质粒转入293F表达细胞株，得到pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株；
(23)细胞培养及COVID-19-S-RBD蛋白纯化：培养所述 pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株，离心分离上清液，所述上清液经 镍柱纯化后，获得COVID-19-S-RBD蛋白；
(24)制备疫苗：将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化 学偶联试剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，将所述 COVID-19-S-RBD-CuMVTT经过脱盐柱纯化后再与等体积弗氏完全佐剂相混合 制成COVID-19-S-RBD疫苗。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，步骤(2)中，将所述 pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转化到细菌DH5α感受态细胞中，然后使用 PEI将提取的质粒转染到293F细胞中，再用博来霉素筛选得到 pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，使用PEI(Invitrogen) 将提取的质粒以3×106细胞/ml的密度转染到293F细胞中。用100ug/ml的 博来霉素筛选得到pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，将所述 COVID-19-S-RBD蛋白采用ACE2蛋白包被进行活性检测。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，COVID-19-S-RBD蛋白 纯化是将重组表达293F细胞株5％CO2、37℃培养96小时后，4500rpm/min 离心10分钟，收集含有分泌的COVID-19-S-RBD蛋白的细胞培养物的上清液， 采用镍柱进行纯化即PBS洗涤20个柱体积，35nM咪唑洗涤10个柱体积，50mM 咪唑洗涤10个柱体积，100mM咪唑洗脱10个柱体积，250mM咪唑洗脱10个 柱体积，获得高纯度的COVID-19-S-RBD蛋白。
本发明的有益效果如下：
第一、黄瓜花叶病毒(CMV，家族，Bromoviridae，属，Cucumovirus) 是一种线性正等径等径植物病毒，具有广泛的宿主范围，且是申请人的VLP 筛选平台独有的技术。
第二、使用在这些VLP上展示的抗原，可以在小鼠，大鼠，猫，狗和马 中诱导高水平的特异性抗体，免疫反应快。
第三、表达本发明CMV病毒样颗粒的大肠杆菌重组表达菌株易于筛选得 到：重组转化子具有卡那霉素抗性标记基因，可以直接直接用卡那霉素进行 筛选，大大简化了重组转化大肠杆菌的筛选过程。
第四、本发明的COVID-19-S-RBD蛋白适于制备疫苗：本发明选择的293F 细胞重组表达细胞株具有真核表达的环境，能克服大肠杆菌表达蛋白因为没 有特殊辅助因子、分子伴侣和翻译后修饰可能会使蛋白丧失功能，引起蛋白 错误折叠的问题，而这些因素都会破坏真核系统多亚基复合物，表面受体和 分泌蛋白的蛋白与蛋白之间的相互作用。293F细胞是从HEK293细胞中分离 出的一种适应于悬浮细胞培养的细胞。用价格便宜的分支型PEI配制的试剂 瞬时转染细胞通过胞吞作用进行表达。这种方法适用于小规模30ml和大规 模300ml的细胞转染，可以获得高产量的纯化蛋白。
第五、适用于产业化：本发明选择的大肠杆菌重组表达菌株具有生长快、 易于培养、遗传操作简单、繁殖速度快，对培养条件要求低，培养基廉价， 能进行高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于工业化生产等特点。
第六、CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白体外连接，条件便于控 制，连接效率高，比嵌合表达产量高，易于操作，便于工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见 地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在 不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附 图。
图1为本发明实施例中提供的COVID-19-S-RBD蛋白与CuMVTT病毒样颗 粒(VLP)的偶联示意图；
图2为本发明实施例中提供的COVID-19-S-RBD蛋白与ACE2的活性检测 图；
图3为本发明实施例中提供的小鼠免疫血清总IgG含量；
图4为本发明实施例中提供的COVID-19-S-RBD疫苗免疫接种诱导阻断 COVID-19-S-RBD蛋白与ACE2结合的抗体；
图5为本发明实施例中提供的血清中和试验示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图 对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细 节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方 式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进， 因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技 术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用 的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文 所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的 组合。
本发明实施例中所采用的酶切、连接等分子生物学实验方法可参考《分 子克隆》第二版。制备本发明CuMVTT病毒样颗粒的基础材料包括：CuMVTT蛋 白核苷酸序列、pET28a质粒、T7Shuffle大肠杆菌菌株和天根质粒小提中量 试剂盒。将核苷酸序列发到基因公司合成pET28a-CuMVTT重组质粒。
实施例1
提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病 毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的pET28a-CuMVTT重组质粒通过表 达菌株表达获得。
具体的，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内 切酶和BamHⅠ内切酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶将CuMVTT和pET28a质粒 双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组质粒。所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因 以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得。所述表达菌株采用大肠杆 菌T7 Shuffle表达菌株。用50ug/ml浓度的卡那霉素筛选得到pET28a-CuMVTT T7 Shuffle重组表达菌株。
上述COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
(11)重组质粒的构建：用黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连 接后构建pET28a-CuMVTT重组质粒；
(12)重组质粒转入表达菌株：将所述pET28a-CuMVTT重组质粒转入大 肠杆菌T7Shuffle表达菌株，得到pET28a-CuMVTT重组表达菌株；
(13)菌体培养及CMV病毒样颗粒纯化：培养所述pET28a-CuMVTT重组 表达菌株，离心分离生物质获得CuMVTT病毒样颗粒。
具体的，质粒测序与提取的步骤如下：
(a1)将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5ul接种到5mL的2YT培养基 (含50ug/ml卡那霉素)，37℃震荡培养14-16小时，做一个平行(平行送 去测序公司进行测序)；
(a2)其中一支室温下10000xg离心1min，收集菌体，并尽可能的吸去 上清；
(a3)加入250μl Buffer A1(确保已加入Rnase A)，用移液枪或涡 流震荡充分悬浮细菌细胞；
(a4)加入250μl Buffer B1,轻轻地反转5-10次以混合均匀，然后静 置2-5分钟至溶液粘稠而澄清；
(a5)加入350μl Buffer N1,立即反转多次，至溶液充分混匀，此 时出现白色絮状沉淀；
(a6)将离心管转至高速离心机，在室温下13000rpm离心10min(若上 清中有白色沉淀，可再次离心)；
(a7)向离心柱中加入500ulDNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇)， 室温下，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到 收集管中；
(a8)将离心柱放回高速离心机中，13000rpm室温下开盖离心2min， 以彻底去除残留的乙醇；
(a9)将离心柱转至一个新的1.5ml离心管中，向DNA柱的正中间加入 50～100μl(体积>50μl)的ddH2O(pH在7.0-8.5之间)或Elution Buffer， 室温放置2min，13000rpm离心1min，洗脱质粒DNA。
测序反馈结果是正确的。
具体的，大肠杆菌感受态T7Shuffle的制备步骤如下：
(b1)将冰箱的菌株融化后在2YT固体培养基生划线培养一晚上；
(b2)挑取生长良好的单菌落接种到含有5ml 2YT液体培养基的三角瓶 内培养过夜；
(b3)将1ml菌液接种到含100ml 2YT液体培养基的三角瓶内摇床培养 (37℃、225rpm/min)，通常此时菌液的浓度大约是OD＝0.1，半个小时后测 下OD值，此后每隔20min测下OD值，当OD值在0.6～0.8时最好；
(b4)将摇好的菌放入盛有冰的盆里，并将盆放在4℃冰箱30min(至 少15min以上)；
(b5)将50ml离心管提前放在冰里预冷，将菌液在4℃冰箱内倒入离心 管，之后在提前预冷的超低温离心机里离心，条件是4500rpm/min离心5min；
(b6)将提前预冷的CaCl2溶液没管倒入30-40ml，用移液枪轻轻吹起 菌体再离心，条件是4500rpm/min离心5min，弃掉上清；
(b7)步骤同(b6)再洗涤一次，过程中将菌体合并成1管；
(b8)加入20％甘油3-4ml，轻轻将菌体吹散，分装到提前预冷的1.5ml 离心管中，每管100ul，放入-80℃冰箱保存。
具体的，转化T7Shuffle感受态细胞的步骤如下：
(c1)取出4管T7Shuffle感受态放冰上融化5min；
(c2)将提取的质粒各取5ul加入到感受态细胞中冰浴30min；
(c3)42℃水浴锅内热击1min；
(c4)拿出放冰上冰浴5min；
(c5)加入900ul2YT液体培养基培养1h(37℃、225rpm/min)；
(c6)分别取100μl涂板(含卡那抗性)。
具体的，2YT培养基配制步骤如下：
(d1)添加16g Bacto胰蛋白；
(d2)添加10g Bacto酵母提取物；
(d3)添加5g NaCl；
(d4)用5M NaOH将pH调节至7.0；
(d5)用蒸馏水调节至1L；
(d6)或使用预混合的粉末,通过高压灭菌；
具体的，pET28a-CuMVTT重组表达菌株诱导表达的步骤如下：
(e1)挑选单菌落放入50ml培养基(卡那霉素50mg/L)，培养4h；
(e2)将50ml菌液加入到800ml培养基(卡那霉素50mg/L)，在30℃， 200rpm振荡下培养，直到OD(600)＝0.8；
(e3)添加0.2mM IPTG,培养25℃，24h，200rpm/min摇动；
(e4)收集生物质10min，4500rpm/min。
具体的，CuMVTT病毒样颗粒纯化的步骤如下：
(f1)将获得的生物质放在冰上解冻；
(f2)向解冻的沉淀物中加入10ml裂解液含50mM柠檬酸盐，，5mM EDTA(100mM储备液)，5mM ME，pH 9.0，超声处理16min；
(f3)离心12min，11000rpm/min；
(f4)配制10ml裂解液：50mM柠檬酸盐，5mM EDTA，5mM Et-SH， pH 9.0；
(f5)将(f4)中溶液稀释至40ml：加入1％Triton X-100；0.5M氯 化钠；
(f6)离心12min(15000xg)取上清液中的VLP；
(f7)将VLP溶于1％TritonX-100，0.5M NaCl，5mM硼酸钠缓冲液， 2mM EDTA，pH9.0；
(f8)向VLP中添加4％PEG 8000；在4℃的旋转器上孵育2小时，离 心取VLP沉淀；
(f9)通过离心(12min，15000xg)收集沉淀物
(f10)将沉淀溶于10ml裂解液中，让沉淀在4℃下在旋转器上溶解；；
(f11)加入3体积的硫酸铵，在旋转器上于4℃孵育3小时；
(f12)离心12min，20000xg，沉淀中含有VLP，将沉淀溶解在10ml NaP 缓冲液；
(f13)在8000MWCO中以2000ml 5mM NaP，2mM EDTA，pH7.5进行透析， 在4℃下过夜透析；
(f14)24小时再置换缓冲液在4℃下进行另一轮3-4小时的透析；
(f15)从透析中收集；
(f16)离心(12min，15000xg)，收集含有上清液的VLP；
(f17)用Amicon浓缩至3mg/ml使用0.2μm过滤器过滤；
(f18)取装有无菌缓冲液的超速离心管：30％蔗糖，1xPBS，1％Tx-100 轻轻移液，将样品小心地覆盖在蔗糖垫上。将VLP放在冰上,将试管超速离 心：50000rpm/min，4小时；
(f19)弃清液将每管沉淀重悬于15ml无菌硼酸盐缓冲液中；
(f20)步骤同(f18)；
(f21)弃上清液向每管沉淀添加3ml无菌缓冲液：5mM NaP，2mM EDTA， pH7.5。
实施例2
提供一种COVID-19-S-RBD疫苗，包括上述的COVID-19-S-RBD病毒样颗 粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成的 pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD蛋 白；所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂 SMPH偶联成COVID-19-S-RBD-CuMVTT后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗。
具体的，所述表达细胞株采用293F表达细胞株，所述 pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获得 pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株。
上述COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，包括以下步骤：
(21)重组质粒的构建：采用COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接 后构建pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒；
(22)重组质粒转入表达细胞株：将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组 质粒转入293F表达细胞株，得到pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株；
(23)细胞培养及COVID-19-S-RBD蛋白纯化：培养所述 pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株，离心分离上清液，所述上清液经镍 柱纯化后，获得COVID-19-S-RBD蛋白；
(24)制备疫苗：将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化 学偶联试剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，将所述 COVID-19-S-RBD-CuMVTT经过脱盐柱纯化后再与等体积弗氏完全佐剂相混合 制成COVID-19-S-RBD疫苗。
具体的，步骤(22)中，将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转化 到细菌DH5α感受态细胞中，然后使用PEI将提取的质粒转染到293F细胞中， 再用博来霉素筛选得到pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株。将所 述COVID-19-S-RBD蛋白采用ACE2蛋白包被进行活性检测。
本发明实施例中制备COVID-19-S-RBD蛋白的基础材料包括：
COVID-19-S-RBD蛋白CDS序列、pFUSE质粒、PEI转染试剂、天根质粒小提 中量试剂盒和293F细胞。将COVID-19-S-RBD蛋白CDS序列发到基因公司合 成pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒。质粒测序与提取的步骤同上。
具体的，对处于对数生长期的293F细胞进行取样计数，确定细胞量足 够以及活率高于95％以上进行瞬转，将提取的质粒转染到293F细胞中步骤如 下：
(g1)在瞬时转染前一天对细胞进行全离心换液；
(g2)根据实验需求收集一定量的细胞悬液，1000rpm室温离心5min；
(g3)用含0.1％F68的RPMI1640轻轻重悬细胞至一定细胞密度；
(g4)取1.5ml无菌EP管，根据需要添加一定浓度的质粒，待其充分 混合后，加入到一定量的PEI中，混匀静置5min；
(g5)将DNA/PEI复合物加入细胞悬液中，使DNA/PEI复合物和细胞 充分混匀；
(g6)放入摇床中37℃，180rpm/min悬浮培养3h后，加入EX-CELL293 无血清培养基继续培养；
(g7)每天收样，检测细胞密度及活率，待细胞活率低于50％停止收样。
具体的，收集的细胞培养液1000rpm/min室温离心5min，收集上清，用ELISA法检测COVID-19-S-RBD浓度，COVID-19-S-RBD蛋白浓度测定步骤如 下：
(h1)包被：将包被液用ACE2蛋白按1:1000比例稀释，100μl/孔，4℃ 冰箱包被过夜；
(h2)扣干包被液，PBST每次300μl，每次3min，洗1次；
(h3)加样：用样品稀释液将ACE2标准品稀释至浓度梯度：6.25ng/ml、 3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.78125ng/ml、0.39063ng/ml、0.19531ng/ml、 0.09766ng/ml。用样品稀释液将样品稀释到适宜浓度。每孔加样100μl，设 置3复孔，37℃孵育1h；
(h4)洗板：扣干样品液，PBST每次300μl，每次3min，洗3次；
(h5)用二抗稀释液将抗His标签抗体按1:1000比例稀释，100μl/孔， 37℃放置1h；
(h6)洗板：扣干二抗，PBST每次300μl，每次3min，洗5次；
(h7)显色：显色液100μl/孔加入板中，37℃避光显色15min；
(h8)终止：3mol/l NaOH 100μl/孔加入板中，终止显色；
(h9)用酶标仪进行405nm波长检测；
(h10)结果计算与分析：
用OD405nm的吸光值对标准品浓度做曲线，得到曲线方程：y＝ax+b(y 为IgG浓度，x为OD405时的吸光值)，根据标准曲线，拟合求出a和b的 值，将待测样品的吸光值代入公式中，再乘以稀释倍数，得到COVID-19-S-RBD 浓度。
具体的，COVID-19-S-RBD蛋白纯化步骤如下：
(i1)将收获的细胞培养液4000rpm/min室温离心20min，取上清，用 0.45μm滤膜过滤；
(i2)用10个柱体积超纯水冲洗柱子，然后用20个柱体积的PBS平衡 柱子；
(i3)上样(可重复两次)；
(i4)35nM咪唑洗涤10个柱体积；
(i5)50mM咪唑洗涤10个柱体积；
(i6)100mM咪唑洗脱10个柱体积；
(i7)250mM咪唑洗脱10个柱体积；
将上述(i4)至(i7)步骤流传液各取10ul，跑SDS-PAGE蛋白胶，用 于检测蛋白大小及纯度如图2；
浓缩含有蛋白的咪唑溶液获得高纯度的COVID-19-S-RBD蛋白。
具体的，将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试 剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，步骤如下：
(j1)偶联物质用量计算
CuMVTT用量：分子量24.5kD，即24.5mg/ml＝1mM；
SMPH用量：分子量378.4g/mol，配制10mg/ml，；
COVID-19-S-RBD用量：分子量58kD，即58mg/ml＝1mM；
TCEP用量：分子量286.65g/mol；
(j2)将CuMVTT与SMPH混合，置于25℃摇床，200rpm，孵育25min， 反应结束后使用除盐柱脱去副反应产物，取样10μl用于SDS-PAGE鉴定；
(j3)将COVID-19-S-RBD与TCEP混合，置于25℃摇床，200rpm/min， 孵育25min，反应结束后使用除盐柱脱去副反应产物，取样10μl用于 SDS-PAGE鉴定；
(j4)将除盐后的CuMVTT+SMPH与COVID-19-S-RBD+TCEP进行混合，置 于25℃，200rpm/min，孵育3小时，取样10μl用于SDS-PAGE鉴定，将待 鉴定的样品点入SDS-PAGE电泳胶，检查偶联效果。
参见图1，a1示意是疫苗设计策略概述；b1为通过ELISA证实了COVID-19-S-RBD与ACE2的重组表达和结合；c1和d1为COVID-19-S-RBD通 过SATA和SMPH化学交联剂显示在VLP的表面上，产生了一条偶联带(150kd)， 如c1中的SDS-PAGE和d1中的蛋白质印迹。
实施例3
1.1免疫原制备
将上述COVID-19-S-RBD-CuMVTT按照50ug/只小鼠的注射量与弗氏完全 佐剂1:1乳化成疫苗，对照组有两组分别是注射COVID-19-S-RBD、PBS，都 是跟弗氏完全佐剂1:1乳化成疫苗。
1.2小鼠免疫
6周龄的BALB/c小鼠购自北京生命河实验动物技术有限公司，并保存在 安徽农业大学的动物设施中。所有动物实验均按照国家动物保护指南进行， 并得到中国实验动物科学协会的批准。
通过皮下注射50μgCOVID-19-S-RBD-CuMVTT或COVID-19-S-RBD(PBS作 为对照)免疫六周大的新生BALB/c小鼠(每组3只)。在第2周和第3周 加强免疫接种。每次接种后1周收集血清用于ELISA分析。参见图3，为小 鼠免疫血清总IgG含量。具体情况如表1。
表1 BALB/c小鼠分组处理情况
Figure BDA0002408909510000161
1.3免疫应答结果检测(EL1SA)
ELISA实验用于检测免疫动物血清总IgG抗体及鉴定IgG抗体亚型。具 体操作如下:
(k1)包被:96孔EL1SA平板预先包被重组蛋白COVID-19-S-RBD,100ng/ 孔,体积为100μl,置于4℃过夜；
(k2)封闭:弃去包被撤用含有0.05％吐温20的PBS(PBST)洗板3 次,2min/次。加入封闭液(10％小牛血清),200μl/孔,置于37℃静止2h；
(k3)一抗:弃去封闭液,用PBST洗板3次,2min/次。加入系列稀释的 待检血清,同时设正常动物血清对照和空白对照,100μl/孔,置于37℃静止1 小时；
(k4)二抗:弃去血清,用PBST洗板5次,2min/次。分别加入HRP标记 的山羊抗小鼠IgG(1:5000，Sigma)，置于37℃静止1h；
(k5)显色:弃去酶标二抗,用PBST洗板5次,2min/次。加入底物3,3＇， 5,5＇-四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine,TMB)显色5min后,用2M H2SO4终止反应；
(k6)分析:酶标仪测量450nm处吸光值(optical density,OD)。当待 捡血清OD值大于或等于正常小鼠血清OD值的2.1倍定义为阳性。
参见图2，A)为ACE2包板子，S-RBD结合，抗人Fc二抗显色；B)为 S-RBD包板子，ACE2结合，抗His二抗显色。
1.4伪病毒的产生
表达COVID-19-S蛋白的伪病毒是由慢病毒第二代包装系统产生的。使 用Sinfection(Sino Biological)将含有COVID-19-S基因的pwpx1-luc， HIV-1PSD和pCMV3质粒共转染到7x105 293F细胞中。过夜孵育后，将培养 基换成含有10％FBS的新鲜DMEM。转染后48h和72h小时收集含有假病毒的 上清液，并使用0.45μm滤器进行过滤。收集所有过滤的上清液，并保存在 -80℃下直至使用。
1.5滴定假病毒
通过使用慢病毒系统将ACE2基因转染到293T细胞中来制备在细胞膜上 稳定表达ACE2受体的293T-ACE2细胞。将上面制备的伪病毒与100μl聚乙 烯(16μg/ml)加入293T-ACE2细胞(3×104细胞/孔)。48小时后，使 用荧光素酶测定系统(Promega)监测感染。滴度是根据假病毒的系列稀释 度计算的。
1.6中和抗体测定
将小鼠血清样品(2μl)分别稀释至1：10、1：40、1：160、1：640 和1：2560，然后与等体积的假病毒原液混合。在37℃下孵育1小时后，将 混合物接种到293T-ACE2细胞上(3x104细胞/孔)。同时，将伪病毒+DMEM 培养基设置为阳性对照，仅将DMEM培养基设置为阴性对照。将细胞温育72 小时后，通过感染的假病毒的荧光素酶活性测量血清中和。临界值>80％用 于确定中和效价。
采用本发明的COVID-19-S-RBD-CuMVTT诱导高特异性抗体滴度。在第0、 7和14天，用10μg在Montanide中配制的RBD-CuMVTT，单独的RBD或单独 的CuMVTT对小鼠(每组3只)进行免疫，在第7、14和21天收获血清，并 通过ELISA在重组COVID-19-S-RBD上进行测试。在用COVID-19-S-RBD-CuMVTT免疫1周后可以观察到强烈的抗体反应。
参见图4，用COVID-19-S-RBD-CuMVTT免疫接种诱导阻断COVID-19-S-RBD 与ACE2结合的抗体。第三次疫苗接种后，将小鼠血清(1:40稀释度，d21) 与COVID-19-S-RBD孵育，然后置于ACE2包被的板上，通过ELISA确定RBD 结合。
参见图5，使用第二代慢病毒包装系统，将表达萤光素酶的HIV假颗粒 质粒共转染到HEK 293T细胞中，从而产生表达COVID-19-S-RBD蛋白的假病 毒。图5中a2、b2为测定原理示意图,c2为表达COVID-19-S-RBD蛋白的伪 病毒可以通过ACE2受体感染细胞，COVID-19-S-RBD-CuMVTT(day21)诱导的 抗体可以有效地中和该病毒。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未 对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这 些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详 细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干 变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围 应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的pET28a-CuMVTT重组质粒通过表达菌株表达获得。
2.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内切酶和BamH Ⅰ内切酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶将CuMVTT基因和pET28a质粒双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组质粒。
3.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述表达菌株采用大肠杆菌T7 Shuffle表达菌株。
4.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得。
5.一种COVID-19-S-RBD疫苗，其特征在于，包括如权利要求1所述的COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成的pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD蛋白；
所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗。
6.根据权利要求5所述的一种COVID-19-S-RBD疫苗，其特征在于，所述表达细胞株采用293F表达细胞株，所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获得pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株。
7.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(11)重组质粒的构建：用黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后构建pET28a-CuMVTT重组质粒；
(12)重组质粒转入表达菌株：将所述pET28a-CuMVTT重组质粒转入大肠杆菌T7 Shuffle表达菌株，得到pET28a-CuMVTT重组表达菌株；
(13)菌体培养及CMV病毒样颗粒纯化：培养所述pET28a-CuMVTT重组表达菌株，离心分离生物质获得CuMVTT病毒样颗粒。
8.根据权利要求5所述的一种COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(21)重组质粒的构建：采用COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后构建pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒；
(22)重组质粒转入表达细胞株：将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株，得到pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株；
(23)细胞培养及COVID-19-S-RBD蛋白纯化：培养所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株，离心分离上清液，所述上清液经镍柱纯化后，获得COVID-19-S-RBD蛋白；
(24)制备疫苗：将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，将所述COVID-19-S-RBD-CuMVTT经过脱盐柱纯化后再与等体积弗氏完全佐剂相混合制成COVID-19-S-RBD疫苗。
9.根据权利要求8所述的一种COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，其特征在于，步骤(22)中，将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转化到细菌DH5α感受态细胞中，然后使用PEI将提取的质粒转染到293F细胞中，再用博来霉素筛选得到pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株。
10.根据权利要求8所述的一种COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，其特征在于，将所述COVID-19-S-RBD蛋白采用ACE2蛋白包被进行活性检测。
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