CN113637055A

CN113637055A - 一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原及应用

Info

Publication number: CN113637055A
Application number: CN202110933825.9A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 宰晓东; 徐俊杰; 周楚格; 于蕊; 张军; 殷瑛; 张跃; 李汭桦; 李耀辉; 赵晓帆
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-08-15
Filing date: 2021-08-15
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2041-08-15
Also published as: CN113637055B

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒受体结合区(Receptor Bind Domain，RBD)糖基化改造抗原，所述糖基化改造抗原是将新冠病毒受体结合区RBD进行N糖基化位点截短并串联形成单链多聚体形式，减少RBD表面天然糖基遮蔽以更好地暴露抗原表位。该抗原相较于野生型RBD单体与RBD多聚体形式，能够激发机体产生更高水平的新冠病毒特异性抗体与中和抗体；一针免疫即可达到与野生型RBD单体两针免疫同等的免疫效果；免疫血清针对原始毒株与变异毒株具有相近的中和效价，呈现了良好的交叉保护作用。本发明还提供了所述糖基化改造抗原在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。

Description

一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原及应用

技术领域

本发明涉及一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原和应用，属于多肽技术领域。

背景技术

迄今为止，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已造成约1.8亿人感染和近400万人死亡，给人类健康带来极大威胁(https://covid19.who.int/)。SARS-CoV-2主要通过呼吸道和密切接触传播，目前尚无特效治疗药物，疫苗是预防和控制疫情的最有效手段。在全球范围内先后开展了上百项SARS-CoV-2疫苗研究，其中mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗等多种疫苗类型已取得重要进展。部分疫苗已获批上市，为应对新冠病毒疫情提供了强大科技支撑。随着疫情的不断蔓延，新冠病毒毒株一直处于不断变异中，目前已经出现多种被世界卫生组织(WHO)标记为“需要关注”的新冠病毒变异毒株，包括Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)和Delta(B.1.617.2)等(https://www.who.int)。与原始毒株相比，已有疫苗免疫后血清针对以Beta(B.1.351)为代表的部分变异毒株的中和活性显著降低(Cell Res 31:732-741(2021))。因此，研制一种更为高效、广谱的新冠疫苗以更好地应对变异毒株显得尤为重要。

新冠病毒刺突糖蛋白S位于膜结构的最外层，在介导病毒与宿主受体结合以及病毒进入细胞的过程中扮演重要角色。其受体结合区(Receptor Bind Domain，RBD)位于S蛋白的N端S1域，可通过受体结合序列(Receptor Binding Motif，RBM)与细胞表面的ACE2特异结合。RBD不仅是病毒与宿主受体结合和进入宿主细胞的靶标位点，同样也是主要的中和表位区域，成为重组亚单位疫苗开发的重要目标。国内外多家单位以RBD为主要抗原的疫苗已经推向临床，结果显示RBD能够激发特异性的抗体与中和抗体反应，但是仍然存在免疫原性较低、交叉保护不足等缺点，需要对其进行改造与优化以提升其免疫效力(Nature 586:572–577(2020)；Cell 182:722–733(2020))。糖基化是蛋白的一种常见翻译后修饰形式，糖基化的改变会对蛋白质的结构和功能产生显著影响。以往研究表明，在存在过度糖基化修饰的酵母表达系统中，糖基化改造对SARS的RBD抗原免疫原性具有重要影响(Vaccin.Immunother.10:648–658(2014))。

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒受体结合区RBD糖基化改造抗原，减少RBD表面天然糖基遮蔽并更好的暴露抗原表位，以使所述抗原能够激发更高水平的针对新型冠状病毒的特异性抗体与中和抗体，一针免疫即可达到较好的免疫效果，同时可提供针对新冠病毒变异毒株的强烈交叉保护。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种新型冠状病毒受体结合区(Receptor BindDomain，RBD)糖基化改造抗原。糖基化是蛋白的一种常见翻译后修饰形式，糖基化的改变会对蛋白质的结构和功能产生显著影响。根据已报道的新冠病毒RBD蛋白的两个重要N糖基化位点(分别位于第331和343位氨基酸处)(Science 369:330-333(2020))，对RBD进行N-糖基化改造，减少RBD表面天然糖基遮蔽并更好地暴露抗原表位以提升其免疫原性，改造方式为截短全长RBD_{219(R319-K537)}区域的N-糖基位点或者对其进行点突变。

在本发明的抗原N-糖基化改造技术方案中，所述糖基化改造抗原是去除新冠病毒受体结合区RBD 1或2个糖基化位点的截短型抗原。

在一个优选的实施方案中，所述糖基化改造抗原是将新冠病毒受体结合区RBD₂₁₉进行N1糖基化位点截短(截短去掉319位精氨酸R至331位天门冬酰胺N共13个氨基酸)而成的截短型抗原，所述截短型抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其次，本发明还提供了一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，所述糖基化改造抗原为由上述的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原串联而成的多聚体。

在一个优选的实施方案中，所述多聚体可以为串联形成的单链二聚体形式，也可以为三聚体或以上的多聚体。本领域技术人员可以知晓，只要不影响去糖基遮蔽并暴露了抗原表位，应用以上单体糖基化改造抗原构建3个以上的多聚体，也都能够符合本发明的发明构思，达到本发明所需求的技术效果。

本发明提供的单体抗原RBD₂₀₆及其多聚体相较于野生型RBD₂₁₉单体与多聚体形式，去除了糖基遮蔽并暴露了抗原表位，能够激发更高水平的针对新冠病毒的特异性抗体与中和抗体。联合高效佐剂后，一针免疫即可达到较好的免疫效果；同时可提供针对新冠变异毒株的强烈交叉保护。

设计并通过Expi293F哺乳动物细胞表达系统成功制备了3种糖基化改造抗原(RBD₂₁₉-N331A、RBD₂₁₉-N343Q、RBD_{206(I332-K537)})。将糖基化改造RBD蛋白通过与铝佐剂联用免疫小鼠并进行血清抗体检测，实验结果表明截短去除N1糖基化位点的糖基化改造抗原RBD₂₀₆与野生型RBD₂₁₉抗原相比能够显著提升所激发的抗体水平(p<0.001)。随后，通过结构优化设计，将RBD₂₀₆糖基化改造抗原进行串联重复以形成单链多聚体形式进一步提升其免疫原性。初步免疫评价结果显示，二聚体RBD₂₀₆-dimer、三聚体RBD₂₀₆-trimer与单体RBD₂₀₆相比抗体水平显著提升(P<0.01)，且二聚体与三聚体无显著性差异。因此，后续评价以RBD₂₀₆-dimer为代表抗原详细展开。

通过与铝佐剂联用免疫小鼠进行免疫评价，试验结果表明RBD₂₀₆-dimer两次免疫后抗体滴度达到约10⁶，约为野生型RBD₂₁₉抗原激发抗体滴度的近百倍(p<0.001)，也显著优于糖基改造单体RBD₂₀₆(p<0.001)以及野生型二聚体RBD₂₁₉-dimer抗原(p<0.001)，中和抗体水平与特异性抗体水平趋势相似。

通过使用高效佐剂，将RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CpG2006佐剂共同免疫，发现RBD₂₀₆-dimer免疫原性进一步提高，两次免疫后特异性抗体水平提升至约10⁷，显著优于野生型单体RBD₂₁₉与糖基改造单体RBD₂₀₆(p<0.01)，中和抗体水平与特异性抗体水平趋势相似。

在单针免疫情况下，RBD₂₀₆-dimer抗原单针免疫后28d，所激发的抗体水平可达约10⁶，中和抗体水平达到约10³，均达到野生型单体RBD₂₁₉两针免疫同等水平。免疫评价结果说明，RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CpG佐剂激发了高效的免疫反应，单针免疫即可达到较高的抗体与中和抗体水平。

检测并比较抗原免疫小鼠血清针对原始毒株与变异毒株的抗体与中和抗体水平，结果显示RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CpG2006佐剂两针免疫后血清针对原始毒株与Beta(B.1.351)变异毒株具有相近的中和效价，呈现了良好的交叉保护作用。

第三，本发明提供了上述的新型冠状病毒RBD糖基化改造抗原在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。本发明的RBD糖基化改造抗原RBD₂₀₆-dimer相较于野生型RBD₂₁₉抗原以及野生型二聚体RBD₂₁₉-dimer抗原，能够显著提升宿主针对新冠病毒的抗体与中和抗体水平；联合高效佐剂后，一针免疫即可达到与野生型RBD₂₁₉两针免疫同等的免疫效果；且免疫血清针对原始毒株与Beta(B.1.351)变异毒株具有相近的中和效价，呈现了良好的交叉保护作用。本发明的抗原制备方法简单，具有较好的应用前景。

在根据上述应用制备的一个具体疫苗的技术方案中，所述疫苗还包括铝佐剂和/或CpG佐剂。

第四，本发明提供了编码上述RBD糖基化改造抗原的多核苷酸分子。

在一个优选的实施方案中，所述多核苷酸分子的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子为由上述的在一个优选的DNA序列如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸分子串联而成的。

在一个优选的实施方案中，所述多聚体可以为二聚体，即将SEQ ID NO：2多核苷酸序列重复串联后获得，可选择地，多聚体可以为三聚体。

第五，本发明提供了上述的多核苷酸分子在制备新型冠状病毒DNA疫苗中的应用。在本发明提供的上述如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸分子的基础上，采用本领域常规的技术手段，即可提供所述的应用。例如，以pcDNA3.1、pVAX1等真核表达载体为骨架，对上述多核苷酸分子基因启动密码子ATG的前碱基序列做设计和调整，使其符合Kozak规则，构建编码RBD₂₀₆-dimer的DNA疫苗，转染真核细胞鉴定目的蛋白的瞬时表达情况后，以肌肉注射等方式免疫宿主发挥免疫保护效果。

第六，本发明提供了根据上述的多核苷酸分子转录的mRNA。在本发明的一个具体实施方案中，根据如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸分子转录的mRNA的序列如SEQ ID NO：3所示。

第七，本发明提供了上述mRNA在制备新型冠状病毒mRNA疫苗中的应用。在本发明提供的上述如SEQ ID NO：3所示的mRNA分子的基础上，采用本领域常规的技术手段，即可提供所述的应用。例如，以上述表达RBD₂₀₆-dimer的多核苷酸分子mRNA序列为基础，分别进行5'UTR或3'UTR的选择、mRNA的二级结构优化、PolyA尾巴的优化、mRNA密码子的优化、修饰核苷酸的选择等，获得稳定表达的优化后序列，联合脂质体等高效递送系统将mRNA疫苗递送至宿主体内发挥免疫保护效果。

最后，本发明提供了制备上述新型冠状病毒RBD糖基化改造抗原的方法，所述方法为：将编码所述RBD糖基化改造抗原的多核苷酸分子5’端添加标签蛋白与信号肽tPA序列，在启动密码子ATG的附近碱基序列做符合Kozak规则的调整，在本发明的一个具体的技术方案中，所述符合Kozak规则的调整为，设置ATG前6位碱基为GCCACC，设置ATG后第1位碱基为G，即启动密码子ATG被置换为GCCACCATGG；在3’端加上标签蛋白序列与翻译终止密码子TGA，通过酶切位点将基因连接至真核表达载体，使用哺乳动物细胞表达系统等表达并纯化抗原蛋白。

本发明将新冠病毒受体结合区RBD进行N1糖基化位点截短并串联形成单链多聚体形式，所获得的糖基化改造抗原RBD₂₀₆-dimer相较于野生型RBD₂₁₉单体与RBD₂₁₉单链二聚体形式，能够显著提升宿主针对新冠病毒的特异性抗体与中和抗体水平，一针免疫即可达到与野生型RBD₂₁₉两针免疫同等的免疫效果；且免疫血清针对原始毒株与Beta(B.1.351)变异毒株具有相近的中和效价，呈现了良好的交叉保护作用。本发明还提供了所述RBD糖基化改造抗原在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。本发明抗原制备方法简单，具有较好的应用前景。

附图说明

图1.新型冠状病毒受体结合区RBD糖基化改造设计图；

图2.新型冠状病受体结合区糖基化改造抗原蛋白SDS-PAGE图；

图3.糖基化改造RBD单体抗原联合铝佐剂免疫评价结果图；

图4.糖基化改造抗原RBD₂₀₆单体、二聚体与三聚体免疫原性评价结果图；

图5.糖基化改造RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝佐剂免疫评价结果图；

图6.糖基化改造RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CPG佐剂免疫评价结果图；

图7.糖基化改造RBD₂₀₆-dimer抗原免疫血清中和抗体针对突变毒株交叉保护评价结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。除非特别说明，本发明所采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。

实施例1新型冠状病毒受体结合区RBD单体的糖基化改造设计与表达纯化

首先根据已报道的新冠病毒RBD蛋白(序列如Genebank，YP_009724390.1，R319-K537)的两个重要N糖基化位点(分别位于第331和343位氨基酸处)(Science 369:330-333(2020))，对RBD进行N-糖基化改造，去除糖基遮蔽并暴露抗原表位以提升其免疫原性。改造方式为首先获得全长RBD₂₁₉抗原(R319-K537，由于其C端C538位半胱氨酸可能形成分子间二硫键而出现多聚体，因此截止至K537位)，随后通过截短全长RBD_{219(R319-K537)}区域的N-糖基位点或者对其进行点突变，设计3种糖基化改造抗原RBD₂₁₉-N331A(将331位氨基酸由天门冬酰胺N突变为丙氨酸以破坏N1糖基化位点)、RBD₂₁₉-N343Q(将343位氨基酸由天门冬酰胺N突变为谷氨酰胺Q以破坏N2糖基化位点)、RBD_{206(I332-K537)}(截短去掉319位精氨酸R至331位天门冬酰胺N共13个氨基酸)，在其N端增加分泌性信号肽tPA(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSNS)以及His纯化标签(HHHHHH)，序列设计见图1。

将该序列经哺乳动物细胞密码子人工优化，在启动密码子ATG的前碱基序列做设计和调整，使其符合Kozak规则(GCCACCATGG)，具体的调整策略为：设置ATG前6位碱基为GCCACC，设置ATG后第1位碱基为G，即启动密码子ATG被置换为GCCACCATGG；在3’端加上翻译终止密码子TGA，通过EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶切位点将基因连接至pcDNA3.1真核表达载体。使用Expi293F哺乳动物细胞表达系统表达野生型RBD₂₁₉与RBD单体糖基化改造抗原蛋白，使用GE公司His-trap亲和层析柱进行蛋白纯化。获得重组蛋白后使用BCA法和紫外分光光度计测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE实验对纯化蛋白进行鉴定，野生型RBD₂₁₉蛋白和RBD单体糖基化改造抗原蛋白纯度均大于90％，分子量大小符合理论预期(见图2)。

实施例2糖基化改造RBD单体抗原免疫原性评价

将上述制备的野生型RBD₂₁₉蛋白和RBD单体糖基化改造抗原RBD₂₁₉-N331A、RBD₂₁₉-N343Q(将343位氨基酸由天门冬酰胺N突变为谷氨酰胺Q以破坏N2糖基化位点)、RBD_{206(I332-K537)})蛋白进行小鼠免疫实验，比较其免疫原性。选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组6只，将实施例1得到的蛋白用磷酸盐缓冲液稀释为100μg/mL，并与等体积AL(OH)₃佐剂(Alhydrogel，1000μg/mL)混合后室温吸附1h。然后进行分组免疫，分组情况如表1所示。通过肌肉注射方式，每只小鼠分别在第0天、第14天接受两次疫苗免疫，每次接种100μL体积(5μg抗原，50μg铝佐剂)。第14d和21d对小鼠进行尾静脉采血，获得小鼠血清用于后续特异性抗体检测。

表1.糖基化改造RBD单体抗原联合铝佐剂免疫评价小鼠分组情况

通过酶联免疫吸附试验(简称ELISA)检测免疫血清中RBD特异性IgG抗体水平，结果显示，首免(1st)后14天，糖基化改造RBD₂₀₆抗原较野生型RBD₂₁₉激发的IgG抗体水平显著提升(～35倍，p<0.05)，同时也显著高于RBD₂₁₉-N331A、RBD₂₁₉-N343Q；加免(2nd)后7天，RBD₂₀₆抗原激发的抗体水平进一步提升，抗体滴度达到约10⁵，显著优于野生型RBD₂₁₉抗原(提升～50倍，p<0.001)(见图3)。说明通过截短野生型RBD₂₁₉ N1糖基位点区域获得的RBD₂₀₆抗原，可以去除糖基遮蔽并暴露出抗原表位，成功提升了其免疫原性。

实施例3新型冠状病毒糖基化改造抗原RBD₂₀₆-dimer与RBD₂₀₆-trimer的设计与表达纯化

在实施例2基础上，通过结构优化设计，将单体RBD₂₀₆糖基化改造抗原进行串联重复以形成单链多聚体形式，如二聚体RBD₂₀₆-dimer(2个如SEQ ID NO：1所示序列进行正向串联)与三聚体RBD₂₀₆-trimer(3个如SEQ ID NO：1所示序列进行正向串联)，序列设计见图1，以进一步提升其免疫原性(Cell182:722–733(2020))。参见实施例1方法使用Expi293F哺乳动物细胞表达系统表达RBD₂₀₆-dimer、RBD₂₀₆-trimer抗原蛋白，使用GE公司His-trap亲和层析柱进行蛋白纯化。获得重组蛋白后使用BCA法和紫外分光光度计测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE实验对纯化蛋白进行鉴定，RBD₂₀₆-dimer与RBD₂₀₆-trimer蛋白纯度均大于90％，分子量大小符合理论预期(见图2)。

实施例4糖基化改造抗原RBD₂₀₆单体、二聚体、三聚体免疫原性评价

将上述制备的糖基化改造抗原RBD₂₀₆单体、二聚体、三聚体蛋白进行小鼠免疫实验，比较其免疫原性。选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组6只，然后进行分组免疫，分组情况如表2所示。通过肌肉注射方式，每只小鼠分别在第0天、第14天接受两次疫苗免疫，每次接种100μL体积(5μg抗原，50μg铝佐剂)。第14d和21d对小鼠进行尾静脉采血，获得小鼠血清用于后续特异性抗体检测。

表2.糖基化改造抗原RBD₂₀₆单体、二聚体、三聚体免疫原性评价小鼠分组情况

通过酶联免疫吸附试验(简称ELISA)检测免疫血清中RBD特异性IgG抗体水平，结果显示，首免(1st)后14天，糖基化改造抗原二聚体RBD₂₀₆-dimer较单体RBD₂₀₆激发的IgG抗体水平显著提升(提升～11倍，p<0.01)，二聚体RBD₂₀₆-dimer较三聚体RBD₂₀₆-trimer无显著性差异。加免(2nd)后7天，所有三组糖基化改造抗原抗体水平均进一步提升，达到约10⁵。三聚体RBD₂₀₆-trimer显著优于单体RBD₂₀₆(提升～6倍，p<0.01)，且二聚体RBD₂₀₆-dimer与三聚体RBD₂₀₆-trimer仍无显著性差异(见图4)。结果说明通过将糖基化改造抗原单体进行串联可以增强抗原免疫原性，且二聚体与三聚体无显著差异。

实施例5糖基化改造抗原RBD₂₀₆-dimer联合铝佐剂免疫评价

将上述制备的RBD₂₀₆-dimer抗原蛋白进行小鼠免疫实验，评价其免疫原性。选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组8只，将实施例3得到的RBD₂₀₆-dimer抗原蛋白与三种对照抗原蛋白RBD₂₁₉、RBD₂₀₆、RBD₂₁₉-dimer分别用磷酸盐缓冲液稀释为100μg/mL，并与等体积AL(OH)₃佐剂(Alhydrogel，1000μg/mL)混合后室温吸附1h。然后进行分组免疫，分组情况如表3所示。通过肌肉注射方式，每只小鼠分别在第0天、第14天接受两次疫苗免疫，每次接种100μL体积(5μg抗原，50μg铝佐剂)。第14d和28d对小鼠进行尾静脉采血，获得小鼠血清用于后续特异性抗体与假病毒中和抗体水平检测。

在假病毒中和抗体检测中，首先根据NCBI公布新型冠状病毒Wuhan-Hu-1株序列(NC_045512.2)构建并制备假病毒(Nat Commun 11,4081(2020))，定量后分装冻存于-80℃待使用。采用微量细胞病变中和试验方法检测小鼠血清中和效价，计算中和抑制率：抑制率＝[1－(样品组的发光强度均值－空白对照CC均值)/(阴性组的发光强度VC均值－空白对照值CC均值)]×100％。根据中和抑制率结果，计算小鼠血清样本的假病毒半最大中和效价(NT50)(Nat Commun 11,4081(2020))。

表3.糖基化改造抗原RBD₂₀₆-dimer联合铝佐剂免疫评价小鼠分组情况

抗原或对照	首免(0d)	加强(14d)	佐剂	动物数量
					Sham	-	-	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8
RBD<sub>219</sub>	5μg	5μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8
					RBD<sub>206</sub>	5μg	5μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8
RBD<sub>219</sub>-dimer	5μg	5μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8
					RBD<sub>206</sub>-dimer	5μg	5μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8

通过ELISA方法检测免疫血清中RBD特异性IgG抗体水平，结果显示，首免(1st)后14天，糖基化改造RBD₂₀₆-dimer抗原相对于野生型单体RBD₂₁₉、糖基化改造单体RBD₂₀₆、以及野生型二聚体RBD₂₁₉-dimer激发的抗体水平均显著提升(分别提升>100倍、～4倍、～4倍，p<0.05)；加强免疫(2nd)后14天，RBD₂₀₆-dimer抗原激发的抗体水平进一步提升，抗体滴度达到约10⁶，约为野生型RBD₂₁₉抗原抗体滴度的～76倍(p<0.001)，也显著优于糖基化改造单体RBD₂₀₆(提升～7倍，p<0.001)以及野生型二聚体RBD₂₁₉-dimer抗原(提升～8倍，p<0.001)(见图5)。假病毒中和抗体水平与特异性RBD抗体水平趋势相似，RBD₂₀₆-dimer抗原激发的中和抗体水平均显著优于野生型单体RBD₂₁₉、糖基化改造单体RBD₂₀₆、以及野生型二聚体RBD₂₁₉-dimer(分别提升～8倍、～3倍、～3倍，p<0.05)。免疫评价结果说明将糖基化改造RBD单体进行串联形成二聚体RBD₂₀₆-dimer，可以进一步提升抗原免疫原性。

实施例6糖基化改造RBD₂₀₆-dimer联合铝+CPG佐剂免疫评价

为了进一步提升RBD₂₀₆-dimer与佐剂联合使用下的免疫效果，将AL(OH)₃佐剂与CpG2006(Takara)佐剂进行联合使用，评价RBD₂₀₆-dimer单针免疫与双针免疫效果。选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组8只，分组情况如表4所示。第14d、28d、与42d对小鼠进行尾静脉采血，获得小鼠血清用于后续特异性抗体与中和抗体水平检测。

表4.糖基化改造RBD₂₀₆-dimer联合铝+CPG佐剂免疫评价小鼠分组情况

通过ELISA方法检测免疫血清中RBD特异性IgG抗体水平，结果显示，加强免疫(2st)后14d，糖基化改造RBD₂₀₆-dimer抗原激发的IgG抗体水平提升至约10⁷，且仍显著优于野生型单体RBD₂₁₉与糖基改造单体RBD₂₀₆(分别提升～4倍、～3倍，p<0.01)(见图6)。中和抗体水平检测结果同样显示，加强免疫(2st)后14d，RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CpG佐剂免疫小鼠血清中和抗体NT₅₀可10⁴，显著高于野生型RBD₂₁₉(p<0.001)与糖基改造单体RBD₂₀₆(分别提升～10倍、～3倍，p<0.05)。

在单针免疫情况下，RBD₂₀₆-dimer单针免疫后28d所激发的抗体水平可达约10⁶，中和抗体水平达到约10³，均达到野生型单体RBD₂₁₉两针免疫同等水平。免疫评价结果说明，RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CpG佐剂激发了高效的免疫反应，单针免疫即可达到较高的抗体与中和抗体水平。

实施例7糖基化改造RBD₂₀₆-dimer抗原免疫血清中和抗体针对突变毒株交叉保护评价

已有研究显示，与原始毒株相比，现有疫苗免疫后血清针对以Beta(B.1.351)为代表的部分变异毒株的中和活性显着降低(Cell Res 31:732-741(2021))，因此选择Beta(B.1.351)作为代表性变异毒株，通过检测并比较抗原免疫小鼠血清针对原始毒株与变异毒株的抗体与中和抗体水平，评估RBD₂₀₆-dimer抗原针对新冠变异毒株的交叉保护。

使用实施例5中小鼠免疫后28d与42d血清，进行SARS-CoV-2真病毒中和实验(原始毒株为SARS-CoV-2/human/CHN/Beijing_IME-BJ01/2020(Genbank No.MT291831)；变异毒株为Beta(B.1.351)ACC_20SF18530/Guangdong)。将热灭活的小鼠血清梯度稀释后，与100TCID50的毒株在37℃孵育1小时。将血清-病毒复合物添加到预铺有Vero E6细胞的96孔板中，孵育

小时。用0.05％结晶紫将细胞染色40分钟。加入脱色溶液后，在570nm/630nm处测量OD。根据中和抑制率结果，计算小鼠血清样本的真病毒半最大中和效价(NT50)。

结果显示，在RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CpG佐剂两次免疫后，小鼠血清中针对原始毒株与Beta(B.1.351)变异毒株的特异性抗体水平无显著改变(见图7)。活病毒中和抗体水平显示，RBD₂₀₆-dimer抗原的28d与42d免疫血清针对野生毒株与Beta(B.1.351)变异毒株均具有较强的中和效果，两种毒株之间无显著性差异(28d下降1.9倍，42d下降1.6倍，均无显著性差异),免疫结果显示RBD₂₀₆-dimer抗原联合铝+CpG2006佐剂两针免疫后血清针对原始毒株与Beta(B.1.351)变异毒株具有相近的中和效价，呈现了良好的交叉保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并非用以限定本发明，其他的任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改动和修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe

1 5 10 15

Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

20 25 30

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

35 40 45

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

65 70 75 80

Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

85 90 95

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

115 120 125

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

130 135 140

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro

165 170 175

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

180 185 190

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

195 200 205

<210> 2

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcaccaacc tgtgcccctt tggcgaggtg ttcaacgcca ccagatttgc ctccgtgtac 60

gcctggaaca ggaagaggat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtacaacagc 120

gcctccttct ccacattcaa atgttacggc gtgagcccca ccaagctgaa tgacctgtgt 180

tttacaaatg tgtacgccga ttccttcgtg atcaggggcg atgaggtgag gcagatcgcc 240

cccggccaga ccggaaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgatga ttttacaggc 300

tgtgtgatcg cctggaatag caataatctg gatagcaagg tgggcggcaa ctacaactac 360

ctgtacagac tgttcagaaa gtccaacctg aagccttttg agagagatat cagcaccgag 420

atctaccagg ccggcagcac cccctgcaat ggcgtggagg gcttcaactg ctacttccct 480

ctgcagtcct acggctttca gcctaccaat ggcgtgggct accagcctta cagggtggtg 540

gtgctgagct tcgagctgct gcacgccccc gccaccgtgt gtggaccaaa gaagtccaca 600

aacctggtga agaacaag 618

<210> 3

<211> 618

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aucaccaacc ugugccccuu uggcgaggug uucaacgcca ccagauuugc cuccguguac 60

gccuggaaca ggaagaggau cagcaacugc guggccgacu acagcgugcu guacaacagc 120

gccuccuucu ccacauucaa auguuacggc gugagcccca ccaagcugaa ugaccugugu 180

uuuacaaaug uguacgccga uuccuucgug aucaggggcg augaggugag gcagaucgcc 240

cccggccaga ccggaaagau cgccgacuac aacuacaagc ugcccgauga uuuuacaggc 300

ugugugaucg ccuggaauag caauaaucug gauagcaagg ugggcggcaa cuacaacuac 360

cuguacagac uguucagaaa guccaaccug aagccuuuug agagagauau cagcaccgag 420

aucuaccagg ccggcagcac ccccugcaau ggcguggagg gcuucaacug cuacuucccu 480

cugcaguccu acggcuuuca gccuaccaau ggcgugggcu accagccuua caggguggug 540

gugcugagcu ucgagcugcu gcacgccccc gccaccgugu guggaccaaa gaaguccaca 600

aaccugguga agaacaag 618

Claims

1.一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述糖基化改造抗原是去除新冠病毒受体结合区RBD 1或2个糖基化位点的截短型抗原。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述糖基化改造抗原是去除新冠病毒受体结合区RBD第1个N糖基化位点N331的截短型抗原，所述截短型抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述糖基化改造抗原为由权利要求2所述新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原串联而成的多聚体。

4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述多聚体为二聚体或者三聚体。

5.权利要求1-4任一所述新型冠状病毒RBD糖基化改造抗原在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。

6.根据权利要求5所述应用所制备的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括铝佐剂和/或CpG佐剂。

7.一种编码权利要求2中所述RBD糖基化改造抗原的多核苷酸分子。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

9.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子为由权利要求8所述多核苷酸分子串联而成的多聚体。

10.根据权利要求9所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述多聚体为二聚体或者三聚体。

11.权利要求7-10任一所述多核苷酸分子在制备新型冠状病毒DNA疫苗中的应用。

12.一种根据权利要求7-10任一所述多核苷酸分子转录的mRNA。

13.权利要求12所述mRNA在制备新型冠状病毒mRNA疫苗中的应用。

14.一种制备权利要求1-3中所述新型冠状病毒RBD糖基化改造抗原的方法，其特征在在于：将编码所述RBD糖基化改造抗原的多核苷酸分子5’端添加标签蛋白与信号肽tPA序列，在启动密码子ATG的附近碱基序列做符合Kozak规则的调整，在3’端加上标签蛋白序列与翻译终止密码子TGA，通过酶切位点将基因连接至真核表达载体，使用哺乳动物细胞表达系统表达并纯化抗原蛋白。