CN114717205A - 一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用 - Google Patents

一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用含有RBDdm变异体蛋白预防新型冠状病毒及其变异体的疫苗的方法；以及(1)其序列选自：(c1)SEQ ID NO：2；(c2)与(c1)80％以上同源、且所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及(c3)(c1)或(c2)的截短体；或者(2)其序列选自选自：(d1)SEQ ID NO：4；(d2)与(d1)80％以上同源、且所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及(d3)(d1)或(d2)的截短体。利用本申请RBD变异体蛋白制备的疫苗可以预防冠状病毒引起的疾病，具有广谱预防新型冠状病毒引起的疾病的潜力，且制备方法简单，利于进行新型冠状病毒疫苗的大规模生产，具有良好的应用前景。

Description

一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别地涉及一种冠状病毒RBD变异体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2已在全球上百个国家和地区传播，截止到2022年1月12日，已导致超过3.1亿人感染，造成超过550万人死亡。SARS-CoV-2病毒侵入人体细胞后会快速复制。然而因其为单链RNA病毒，复制时出错率高，冠状病毒宿主的广泛性以及其自身的基因组结构，使得SARS-CoV-2极易发生基因突变以及基因重组。
自2020年初爆发新冠肺炎疫情以来，全球各地出现了多种新冠病毒变异株，部分变异株展现出了传播力增强的特性。2020年12月下旬，英国根据样本的全基因组测序报告了一种新的SARS-CoV-2变异，即Alpha(B.1.1.7谱系)变体。Alpha变体包括病毒基因组中的17个突变，其中，刺突蛋白(S蛋白)中有8个突变(Δ69-70缺失、Δ144缺失、N501Y、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H)。
2020年10月在南非发现了一种具有多个刺突蛋白突变的SARS-CoV-2谱系的新变种Beta,(即B.1.351谱系或501Y.V2)，导致第二波COVID-19感染。Beta变体在刺突蛋白中包含9个突变(L18F、D80A、D215G、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V)，其中3个突变(K417N、E484K和N501Y)位于RBD中，并增加对ACE2受体的结合亲和力。
B.1.1.28变种，也称为501Y.V3或Gamma谱系变体，于2020年12月在巴西被发现，并于2021年1月在美国首次被发现。Gamma变体在刺突蛋白中包含10个突变(L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027IV1176、K417T、E484K和N501Y)，其中三个突变(L18F、K417N、E484K)位于RBD中，类似于Beta(B.1.351)变体。
2020年10月在印度首次被发现，目前已在多个国家均检测到感染的变异株B.1.617已经进一步演化出三个不同突变：B.1.617.1、B.1.617.2(Delta)和B.1.617.3。
最先在非洲博茨瓦纳发现的新型冠状病毒变异株Omicron(B.1.1.529)，随后在南非引发大面积感染。Omicron变异株已在国际上传播，并导致病例数量迅速增加，特别是在南非。Omicron变异株在刺突蛋白上含32个突变位点，其中位于RBD区的突变有15个，分别是G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493K、G496S、Q498R、N501Y、Y505H。
冠状病毒刺突蛋白的突变和碱基缺失，使得SARS-CoV-2表现出丰富的遗传多样性。根据已有的被世卫组织(WHO)列入值得关注的变异株(VOC)变种，已证明了SARS-CoV-2的突变可导致其的传染性增加、毒性增加或者临床表现改变，甚至一些变异株可发生免疫逃逸，使得疫苗或特异性抗体对机体保护能力下降。
截至目前，累计接种新冠疫苗86.7亿剂，然而面对不断出现的新冠病毒变异株持续造成的一轮又一轮疫情，新冠疫苗对机体的保护能力受到挑战和考验。因此，现亟需一种具有广谱的新冠病毒候选疫苗，对抗不断突变的SARS-CoV-2。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种制备预防冠状病毒及其变异体的疫苗的方法，包括：(1)提供至少一种基于冠状病毒刺突糖蛋白的免疫原性片段或者包括所述免疫原性片段的免疫原性组合物；其中，所述免疫原性片段为包括冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质；其中：①所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的氨基酸序列选自:(a1)SEQ ID NO：1；(a2)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及(a3)(a1)或(a2)的截短体；或者②所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的氨基酸序列选自：(b1)SEQ ID NO：3；(b2)由SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及(b3)(b1)或(b2)的截短体。以及(2)将(1)中所述免疫原性片段或所述免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合；其中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2病毒，其变异体包括但不限于Alpha变异体、Beta变异体、Delta变异体、Kappa变异体、Lambda变异体、Delta变异体、Omicron变异体。
如上所述的方法，其中，所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的氨基酸序列由编码基因编码，其中：①所述编码基因选自：(c1)SEQ ID NO：2；(c2)与SEQ ID NO：2所示核酸序列80％以上同源、所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及(c3)(c1)或(c2)的截短体；或者②所述编码基因选自：(d1)SEQID NO：4；(d2)与SEQ ID NO：4所示核酸序列80％以上同源、所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及(d3)(d1)或(d2)的截短体。
一种分离的核酸分子，其编码冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质；以及①其序列选自：(c1)SEQ ID NO：2；(c2)与SEQ ID NO：2所示核酸序列80％以上同源、且所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及(c3)(c1)或(c2)的截短体；或者②其序列选自选自：(d1)SEQ ID NO：4；(d2)与SEQ ID NO：4所示核酸序列80％以上同源、且所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及(d3)(d1)或(d2)的截短体。
如上所述核酸分子，其中，所述冠状病毒为β冠状病毒或其变异体。
如上所述核酸分子，其中，所述β冠状病毒或其变异体为SARS-CoV-2病毒或其变异体
如上所述的核酸分子，其中，SARS-CoV-2病毒变异体包括但不限于Alpha变异体、Beta变异体、Delta变异体、Kappa变异体、Lambda变异体、Delta变异体、Omicron变异体。
一种重组载体，包括：如权利要求1所述的核酸分子；以及表达载体。
一种融合细胞，包括：如权利要求2所述的重组载体；以及表达细胞。
如上所述的核酸分子编码的冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的制备方法，包括：获得核酸分子；将核酸分子转化入表达细胞；在表达细胞内表达冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质；以及纯化所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质。
如上所述的制备方法，进一步包括：构建包含核酸分子的重组载体；以及将所述重组载体转化入表达细胞内。
一种疫苗组合物，包括：至少一种免疫原性片段或者包括所述免疫原性片段的免疫原性组合物；其中，所述免疫原性片段为由权利要求1所述的核酸分子编码的冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质；以及佐剂。
如上所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂包括氢氧化铝和CpG；所述免疫原性片段与CpG、氢氧化铝的混合质量比为1:(5-20):(10-40)，优选为1:10:20。
如上所述的核酸分子在制备预防冠状病毒引起疾病的药物或疫苗方面的用途。
本发明的冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异株具有制备预防冠状病毒感染的潜力，利用本申请RBD变异株制备的疫苗可以预防多种冠状病毒引起的疾病，具有广谱预防新型冠状病毒引起的疾病的潜力，且制备方法简单，利于进行新型冠状病毒疫苗的大规模生产，具有良好的应用前景。
附图说明
下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
图1是根据本发明一个实施例的新冠病毒刺突糖蛋白(S蛋白)结构示意图；
图2是根据本发明一个实施例的pPICZα-RBDdm表达载体BglII线性化电泳分析图；
图3是根据本发明一个实施例的CGMCC19488/pPICZα-SARS2 S-RBDdm阳性克隆筛选图；
图4是根据本发明一个实施例的CGMCC19488/pPICZα-S-RBDdm不同诱导时间电泳检测图；
图5是根据本发明一个实施例的SARS-CoV-2S-RBDdm纯化样品SDS-PAGE图；
图6A是根据本发明一个实施例的二免14天后小鼠血清抗RBDwt抗体滴度；
图6B是根据本发明一个实施例的二免14天后小鼠血清抗RBDdm抗体滴度；
图7A是根据本发明一个实施例的SARS-CoV-2-Fluc WT假病毒中和试验结果；
图7B是根据本发明一个实施例的SARS-CoV-2-Fluc 501Y.V2-1假病毒中和试验结果；
图7C是根据本发明一个实施例的SARS-CoV-2-Fluc B.1.617.2假病毒中和试验结果；以及
图7D是根据本发明一个实施例的SARS-CoV-2-Fluc B.1.1.529假病毒中和试验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑的改变。
本发明所有表达系统均可以在公开的文献中获得。本领域技术人员应当了解，即使是同一种菌或物种，由于来源不同等，生长等特性会略有差别，但其功能基本相同，因此，本发明中提及的菌或细胞也可包括这些菌或细胞的改构体。
本申请中使用的术语具有以下含义：
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
术语“左右”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
术语“冠状病毒”是指系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的病毒。冠状病毒有4种属，即α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒、δ冠状病毒。其中，α属和β属冠状病毒主要来源于人和其他动物，尤其是哺乳动物，如蝙蝠、猪、猫、犬、鼠、牛、马；δ属和γ属冠状病毒主要来源于禽类，如鸡、鸭、鹅、麻雀、鸽子。
其中，β属人冠状病毒(HCoV)包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)和2019新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)。
2019新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。
术语“新冠病毒”、“新型冠状病毒”、“SARS-CoV-2”、“2019-nCoV”均表示国际病毒分类委员会于2020年2月11日命名为SARS-CoV-2的冠状病毒，其于2019年逐步席卷全球，造成全球新冠疫情大流行。新冠病毒具有高传染性和高隐蔽性的传播特性，主要的传播途径为呼吸道飞沫传播和接触传播。人感染了新型冠状病毒后常见体征有：呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
截至目前已知的新型冠状病毒SARS-CoV-2的变异体包括但不限于Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon、Zeta、Eta、Theta、Iota、Kappa、Lambda、Delta、Omicron。本申请的糖蛋白疫苗涉及SARS-CoV-2及其变异体，其中变异体包括但不限于上述变异体。
本申请所说的“变异体”为与野生株蛋白质相比，具有构型改变的蛋白或蛋白质，或者其序列的一个或多个位点经替换、添加或删除后的氨基酸或核苷酸序列，或者其序列截短后的氨基酸或核苷酸序列。
GISAID将毒株hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019(WIV04)的全基因组序列(EPI_ISL_402124)作为正式的参考序列。一般将WIV04毒株定义为野生株或原始株。在本申请中，术语“SARS-CoV-2野生株”通常指WIV04毒株。
术语“假病毒”是指非病毒DNA被与病毒外型相同的蛋白质外壳包裹成的微生物颗粒。在本申请中，假病毒具有冠状病毒及其变异体的糖蛋白，但不具有冠状病毒及其变异体的复制活性，但具有感染细胞的活性。
术语“疫苗”或者“疫苗组合物”是指针对疾病的致病源或其相关的蛋白(多肽、肽)、多糖或核酸，以一种或多种成分，直接或通过载体经免疫接种进入机体后，能诱导产生特异的体液和/或细胞免疫，从而使机体获得预防该病的免疫能力。
基因工程疫苗是指利用DNA重组技术，克隆并表达保护性免疫原性片段基因，利用表达的免疫原性片段产物或重组体本身制成的疫苗。制备基因工程疫苗时，使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后制得疫苗。应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗。
糖蛋白疫苗为基因工程疫苗的一种。在一些实施例中，本申请的糖蛋白疫苗中包括免疫原性片段和佐剂。在一些实施例中，本申请的糖蛋白疫苗中包括免疫原性组合物和佐剂。
术语“免疫原性组合物”通常是指一种亚单位组合物。在本申请中，亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50％、至少60％、70％、80％、90％纯度的组合物。例如，亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。例如，亚单位组合物可包含洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含非-离子、两性离子或离子洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含脂类。在一些情形中，免疫原性组合物中包括免疫原性片段。例如，在一些情形中，免疫原性片段可以为RBD或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性片段可以为RBD变异体或其功能活性片段。
进一步地，术语“免疫原性片段”是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。根据本申请的一个实施例，免疫原性片段为冠状病毒S蛋白受体结合区变异体RBDdm。更进一步地，在一些实施例中，免疫原性片段为序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其蛋白质。
在本申请中，免疫原性组合物还可包括佐剂。术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当与免疫原性片段一起注射或预先注入机体时，可增强机体对免疫原性片段的免疫应答或改变免疫应答类型。本申请不对佐剂进行限定。例如，佐剂可以包括铝盐(例如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝)，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。例如，免疫原性组合物还可以选择为Th1型应答优先诱导物。例如，Th1型应答优先诱导物可以包括单磷酰脂质A或其衍生物。例如，佐剂可以是单磷酰脂质A(例如，3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL))和铝盐的组合。一种佐剂增强系统可以包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是WO94/00153公开的QS21和3D-MPL的组合，或者如WO96/33739公开的用胆固醇将QS21猝灭从而使反应原性较弱的一种组合物。例如，所述佐剂还可以是WO95/17210中所述的佐剂，其在水包油乳剂中含有QS21、3D-MPL和生育酚。例如，所述佐剂可以是吐温80、山梨糖醇三油酸酯和角鲨烯混合后于高压条件下进行微流化形成的均一小滴状乳液。例如，佐剂可包含寡核苷酸的未甲基化CpG(WO96/02555)。
根据本申请的一个实施例，糖蛋白疫苗中，冠状病毒S蛋白受体结合区、CpG和氢氧化铝的混合质量比为1:(5-20):(10-40)。在一些实施例中，冠状病毒S蛋白受体结合区、CpG和氢氧化铝的混合质量比为1:(5):(10)。在一些实施例中，冠状病毒S蛋白受体结合区、CpG和氢氧化铝的混合质量比为1:10:20。在一些实施例中，冠状病毒S蛋白受体结合区、CpG和氢氧化铝的混合质量比为1:20:40。
术语“受试者”是指接受疫苗或疫苗组合物接种，或者接受药物预防或治疗冠状病毒感染的人或被选定的动物，甚至可以为人或者被选定的动物的细胞。
术语“中和抗体”是指由B淋巴细胞分泌的一种抗体，为可溶性蛋白。当病原微生物(如病毒)侵入机体时，机体会产生相应的抗体。病原微生物入侵靶细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子(如S蛋白)与靶细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体能够与病原微生物表面的免疫原性片段结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止其侵入细胞。
术语“免疫逃逸”是指免疫抑制病原体通过其结构和非结构产物，拮抗、阻断和抑制机体的免疫应答。包括：1.抗原性的变化病原体的中和免疫原性片段，可经常地持续性地发生突变，逃逸已建立的抗感染免疫抗体的中和和阻断作用，导致感染的存在。例如新冠病毒的持续变异导致的免疫逃逸。2.持续性感染胞内病原体可隐匿于胞内呈休眠状态，逃避细胞免疫和体液免疫的攻击，长期存活，形成持续性感染。如人在未建立人体免疫的婴幼儿时期即感染乙肝病毒导致的免疫逃逸。
术语“Spike蛋白”、“S蛋白”、“刺突蛋白”、“刺突糖蛋白”是指冠状病毒衣壳表面糖蛋白。属于Ⅰ型膜蛋白，且被N-糖基化修饰，其单体由约1300个氨基酸构成，单体折叠后聚合形成同源三聚体。SARS-COV-2通过S蛋白与ACE2受体结合并侵入细胞。S蛋白由1213个氨基酸组成，含有一个跨膜区，包含来自冠状病毒的衣壳表面糖蛋白从N端起或从第14位氨基酸起至少到1213氨基酸片段，或者来自其它SARS病毒的相应区域。S1蛋白是S蛋白的亚单位1，主要指从N端或第14位氨基酸起到第685氨基酸片段。
图1是根据本申请一个实施例的新冠病毒刺突糖蛋白(S蛋白)结构示意图。如图1所示，S蛋白单体由N末端的S1亚基和C末端的S2亚基构成，介导宿主细胞的受体与新冠病毒蛋白膜之间的融合。其中S1亚基负责与宿主细胞受体结合，S1结构域的N末端与C末端均可与宿主受体结合；S2亚基负责与宿主细胞膜融合。新冠病毒被宿主细胞摄取后，S2亚基靠近融合肽的S2位点被宿主蛋白酶切割，触发S蛋白构象改变，进而S2亚基介导膜融合(参考文献：lexandra C Walls,M Alejandra Tortorici,Brandon Frenz,Joost Snijder,WentaoLi,Félix A Rey,Frank DiMaio,Berend-Jan Bosch&David Veesler.Glycan shield andepitope masking of a coronavirus spike protein observed by cryo-electronmicroscopy.Nature Structural&Molecular Biology.volume 23,pages899–905(2016))。
术语“融合肽”是指位于上述S蛋白S2亚基的多肽。如图1所示，S病毒的S2亚基含有多个关键分子，包括多个融合肽和两个保守肽重复序列(HRs)，来驱动病毒与宿主细胞之间的融合。HRs可以三聚成卷曲结构，将病毒包膜和宿主细胞双层紧密靠近。融合肽进一步介导膜融合。
术语“膜蛋白”、“跨膜蛋白”是指整合性膜蛋白，或整合性跨膜蛋白。根据Singer分类法，整合性膜蛋白具有以下6种类型：I型膜蛋白具有一次跨膜，多肽链的N端在胞膜外，C端在胞内，如免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。本发明涉及的新冠病毒S蛋白也属于I型膜蛋白。II型膜蛋白具有一次跨膜，多肽链的C端在胞膜外，N端在胞内，如肿瘤坏死因子超家族成员的分子。III型膜蛋白为一条多肽链多次跨膜，跨膜数有2-7次不等，例如四次跨膜超家族(TM4-SF)和七次跨膜受体超家族(STR-SF)。趋化因子受体均属STM-SF，又称为G蛋白偶联受体(GPCR，G Protein-Coupled Receptor)。IV型膜蛋白是由多个跨膜亚单位组成的膜蛋白。V型膜蛋白的多肽链以糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接于细胞膜的脂双层中。如GPI连接的CD16、CD55和CD58等。VI型膜蛋白为多肽链的一端以GPI形式连接于细胞质膜，另一端具有一次或多次跨膜，如膜桥蛋白。
术语“糖基化修饰”是指蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。蛋白质的糖基化类型主要可分为两种：N-糖基化和O-糖基化。其中，“O-糖基化修饰”是指O-糖链与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的自由OH基共价连接。O-糖基化位点没有保守序列,糖链也没有固定的核心结构,组成既可是一个单糖,也可以是巨大的磺酸化多糖。本发明中涉及的“N-糖基化修饰”是指N-糖链通过与蛋白质的天冬氨酸的自由-NH2基共价连接。
术语“ACE2”是指血管紧张素转化酶2受体，是宿主细胞表面与新冠病毒刺突糖蛋白(CoV Spike)结合体，是新型关键病毒(SARS-CoV-2)的关键结合位点。ACE2是一种I型跨膜糖蛋白，包含一个由两个α螺旋构成的N端胞外域。新冠病毒受体结合域RBD利用其外部结构域与宿主细胞受体的N末端结合。
术语“RBD”是指新冠病毒受体结合域(Receptor Binding Domain)，如图1所示，其定位于上述S蛋白的S1亚基。进一步地，在本申请中，所述RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)310-560氨基酸之间的肽段或其变异体，也可以截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸，或延长N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，所述RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)319-541氨基酸之间的肽段或其变异体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸，或延长N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，所述RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)331-524氨基酸之间的肽段或其变异体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸，或延长N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，延长的氨基酸可以是RBD本身的氨基酸，也可以是为了获得特定功能而添加的氨基酸标签，如为适宜蛋白沉降而在C端添加一段氨基酸序列。在本申请中，“变异体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。
术语“RBDdm”是指新冠病毒受体结合域变异体，区别于RBD野生株(RBDwt，RBDwild type)。在一些实施例中，新冠病毒变异株与野生株相比有1个或多个氨基酸存在不同。在一些实施例中，RBDdm与RBDwt相比，其氨基酸序列在L452和/或T478位点有突变。进一步地，在一些实施例中，RBDdm与RBDwt相比，其氨基酸序列具有L452R和/或T478K位点突变。
术语“RBDdm变异体糖蛋白”是指RBDdm变异体在载体内表达制备的糖蛋白。在一些实施例中，其可通过大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞重组表达制备。在一些实施例中，利用糖基工程酵母制备RBDdm变异体糖蛋白；优选地，利用酵母CGMCC No.19488(即经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母，为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的、保藏编号为CGMCCNo.19488的菌株)制备RBDdm变异体糖蛋白。本申请不限定RBDdm变异体糖蛋白的获得方式，以其他任何方式获得的与本发明具有结构、功能等一致的RBDdm变异体糖蛋白也在本发明的保护范围内。
根据本发明的一个实施例，SARS-CoV-2的RBDdm的氨基酸序列为：(a1)如SEQ IDNO：1所示的序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm的氨基酸序列为：(a2)SEQ ID NO：1所示序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm的氨基酸序列为：(a3)(a1)与(a2)所示序列的截短体。在一些实施例中，(a2)(a3)所示氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列为具有相同构象，或具有相同功能的蛋白质。在另一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm为与SEQ ID NO：1所表示的蛋白质具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性、且具有相同构象或相同功能的蛋白质。
根据本发明的一个实施例，SARS-CoV-2的RBDdm的氨基酸序列为：(b1)如SEQ IDNO：3所示。在一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm的氨基酸序列为：(b2)SEQ ID NO：3所示序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm的氨基酸序列为：(b3)(b1)与(b2)所示序列的截短体。在一些实施例中，(b2)(b3)所示氨基酸序列与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列为具有相同构象，或具有相同功能的蛋白质。在另一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm为与SEQ ID NO：3所表示的蛋白质具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性、且具有相同构象或相同功能的蛋白质。
根据本发明的一个实施例，其中，SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3所示的2个氨基酸序列均根据GenBank号为MN908947.3的SARS-CoV-2"Wuhan-Hu-1"分离株S蛋白的一部分进行设计和突变。具体而言，SEQ ID NoO:1所示氨基酸序列为S蛋白的R319-F534区域进行突变获得RBDdm；SEQ ID NO:3所示氨基酸序列为该RBDdm后添加了柔性接头和6个组氨酸标签后获得的序列(下称RBDdm-histag)。
在一些实施例中，上述蛋白质中术语“同源性”是指氨基酸序列的同一性。在一些实施例中，可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本发明的一些实施例中，术语“重组载体”具体为将所述冠状病毒S蛋白受体结合区变异体(RBDdm)的编码基因克隆到表达载体，如pPICZαA载体(其含有酶切位点，如酶切位点为XhoⅠ和NotⅠ)之间后得到的重组载体。在另一些实施例中，表达载体选自下述载体中的一个或者多个：pPIC9、pPIC9K、pPICZαB、pPICZαB载体、pET系列载体、pGEX系列载体、pMAL系列载体、pQE系列载体、pBADmycHis系列载体、pTrcHis系列载体、pTXB系列、T系列载体等其他载体以及以上载体的改造载体。本申请不限定获取重组载体的方式，通过其他方式获得的本申请重组载体也在本申请的保护范围内。
术语“编码基因”、“核酸分子”是指可编码特定氨基酸肽链的核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)序列。在一些实施例中，编码基因或核酸分子可通过全基因合成、PCR扩增、化学法合成等获得。本申请不对编码基因和核酸分子的获取方式限定。
在一些实施例中，冠状病毒S蛋白受体结合区变异体(RBDdm)的编码基因或核酸分子可为编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的氨基酸序列、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的截短体以及与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所表示的蛋白质具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性的氨基酸序列中任一所示的冠状病毒S蛋白受体结合区的核酸序列。
根据本发明的一个实施例，编码SAR-CoV-2的RBDdm蛋白质的基因序列(DNA序列)SEQ ID NO：2所示序列。在一些实施例中，编码SARS-CoV-2的RBDdm蛋白质的基因序列为：(c2)SEQ ID NO：2所示序列经取代一个或多个碱基、缺失和/或添加3的倍数个碱基后获得的核酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm蛋白质的基因序列为：(c3)(c1)与(c2)所示序列的截短体。在一些实施例中，(c2)(c3)所示核酸序列与SEQ ID NO：2所示核酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码冠状病毒S蛋白受体结合区变异体(RBDdm)的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID NO:3的DNA分子杂交且编码冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)的DNA分子。
根据本发明的一个实施例，编码SAR-CoV-2的RBDdm蛋白质的基因序列(DNA序列)为：(d1)SEQ ID NO：4所示。在一些实施例中，编码SARS-CoV-2的RBDdm蛋白质的基因序列为：(d2)SEQ ID NO：4所示序列经取代一个或多个碱基、缺失和/或添加3的倍数个碱基后获得的核酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2的RBDdm蛋白质的基因序列为：(d3)(d1)与(d2)所示序列的截短体。在一些实施例中，(d2)(d3)所示核酸序列与SEQ ID NO：4所示核酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码冠状病毒S蛋白受体结合区变异体(RBDdm)的DNA分子、所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列，或在严格条件下与SEQ ID NO:4的DNA分子杂交且编码冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)的DNA分子。
根据本发明的一个实施例，SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列是分别根据SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：3的氨基酸序列经密码子优化获得。进一步地，在本申请的一个实施例中，SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为通过全基因合成获得的DNA片段。在本申请中，不限定该核苷酸序列的获得方式，以任何其他方式获得的该核苷酸序列也在本申请的保护范围内。
在一些实施例中，在基因描述中，术语“同源性”是指核苷酸序列的同一性。在一些实施例中，可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
在一些实施例中，上述蛋白质和基因中，术语“95％以上的同源性”可为至少96％、97％、98％的同一性。术语“90％以上的同一性”可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。术语“85％以上的同源性”可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。术语“80％以上的同源性”可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
术语“DNA分子杂交”是指具有互补碱基序列的DNA分子，通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子分离成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。
在本申请的一些实施例中，DNA分子杂交需在“严格条件”下进行。在一些实施例中，严格条件可为：将DNA分子(例如，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的DNA分子)在50℃条件下，在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交；在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗。在另一些实施例中，严格条件还可为：将DNA分子(例如，如SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4所示的DNA分子)在50℃条件下，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗。在另一些实施例中，严格条件还可为：将DNA分子(例如，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的DNA分子)在50℃条件下，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗。在另一些实施例中，严格条件还可为：将DNA分子(例如，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的DNA分子)在50℃条件下，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。在另一些实施例中，严格条件还可为：将DNA分子(例如，如SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4所示的DNA分子)在50℃条件下，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。在另一些实施例中，严格条件也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，将DNA分子(例如，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的DNA分子)在65oC下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。本申请不限定进行DNA分子杂交时的反应条件。
术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的融合蛋白即可。宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO细胞。
术语“重组表达细胞”、“重组细胞”、“表达细胞”是指基因组内整合有外源基因的细胞，或者体内包含表达载体的宿主细胞。在本发明中，重组表达细胞可以是基因组中整合了新冠病毒RBDdm的编码基因，进而可以合成并制备RBDdm糖蛋白的细胞。在一些实施例中，可通过将冠状病毒S蛋白受体结合区变异体(RBDdm)的编码基因导入所述大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母中后得到。
在本申请的一些实施例中，制备重组表达细胞的方式为将冠状病毒S蛋白受体结合区变异体(RBDdm)的编码基因通过重组载体的形式导入大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母等宿主细胞中。本申请不限定重组表达细胞的获取方式，以其他方式获取的本发明的重组表达细胞或重组细胞也在本发明的保护范围内。
在一些实施例中，纯化获得新型冠状病毒S蛋白受体结合区变异体RBDdm的方法包括：将培养重组表达细胞的上清液依次进行阳离子交换层析、疏水层析、G25脱盐、阴离子交换层析。进一步地，在另一些实施例中，也可以通过镍亲和层析纯化获得RBDdm-histag(RBDdm后添加了柔性接头和6个组氨酸标签后获得的序列)。
进一步地，在一些实施例中，纯化获得冠状病毒S蛋白受体结合区变异体的方法包括：将培养组表达细胞的上清通过CaptoMMC层析柱进行目的蛋白的捕获，然后通过含有1MNaCl的缓冲液洗脱获得含有目的蛋白的粗样；之后将粗样用疏水层析柱Phenyl HP纯化，将含有目的蛋白的洗脱峰样品用G25层析柱除盐，然后用阴离子交换层析柱Source30Q吸附杂蛋白，流穿液即是上述目的蛋白。在一些实施例中，目的蛋白为具有哺乳动物糖型结构N-糖链修饰的冠状病毒S蛋白受体结合区。
根据研究报道，发现在新冠变异株中存在多种突变，各个突变有不同的理解，例如，K417N突变位点曾在Beta变异株中被发现，有研究发现该位点的突变可能导致病毒与ACE2受体结合能力增强；N501Y突变位点在Alpha，Beta，Gamma变异株中均有出现；Omicron变异株含E484A突变位点，此前于Beta变异株中发现的E484K突变位点被认为是导致免疫逃逸的重要突变，但Omicron在S蛋白上含32个突变位点，其中位于RBD区的突变有15个，所以信息更为丰富。
现有研究显示，SARS-CoV-2通过受体ACE2侵入人体细胞(参考文献：Danel Wrapp,Nianshuang Wang,Kizzmekia S.Corbett.A.Goldmith,Ching-Lin Hsieh,OlubukolaAbiona,Barney S.Graham,Jason S.Mclellan.Cryo-EM structure of the 2019-nCoVspike in the precusion conformation.SCIENCE.19Feb 2020.Vol 367,Issue6483.pp.1260-1263.)。基于全长SARS-CoV-2S蛋白的疫苗研究发现，S蛋白可诱导机体产生针对SARS-CoV-2的中和抗体，SARS-CoV S蛋白RBD区作为独立的结构域，可形成正确构象，并包含多个空间结构依赖的抗原表位，是亚单位疫苗主要考察的抗原之一。即RBD是除了Spike蛋白S1区、S2区、全长S区、核蛋白几种抗原外的考察抗原之一。但SARS-CoV-2S蛋白RBD有两个潜在的N-糖基化位点，正确的糖型结构对维持RBD天然构象及免疫原性具有重要作用。
本发明提供了一种新的RBD变异体糖蛋白，其中RBDdm(RBD double mutant，命名为RBDdm)变异体与野生型相比有2个氨基酸存在不同，分别为L452R、T478K。
下面将以实施例对本发明进行说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人通常理解的相同的意思。示例性的方法和材料描述如下，虽然与本文描述的类似或等同的方法和材料也可以用于实施本发明，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文提及的所有出版物和其它参考文献都以引用的方式引入其全文。在不一致的情况下，以本说明书，包括定义，为准。材料，方法和实施例仅是举例说明而不是进行限制。
pPICZαA、GS115毕赤酵母为Invitrogen公司产品。毕赤酵母19488菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.19488。
实验中所使用的Q5酶、Taq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶等购自NEB公司，pfu酶、试剂盒、DH5α感受态细胞为北京全式金有限公司产品。全基因合成、核苷酸合成、引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD-Fc Recombinant Protein
(40592-V02H)为北京义翘神州生物科技有限公司产品；羊抗兔IgG二抗(SAB3700885)为Sigma公司产品；羊抗鼠IgG二抗(ab205719)为abcam公司产品；BglⅡ限制性内切酶为NEB公司产品。假病毒购自南京诺唯赞公司。
实验中用到的Capto MMC层析介质、Phenyl HP、G25、Source30Q、均购自GEHealthcare公司。
实施例1、RBDdm重组酵母菌株的构建
一、RBDdm基因的获取及酵母表达载体的构建
根据SARS-CoV-2"Wuhan-Hu-1"分离株S蛋白的第319位至第541位氨基酸(R319-F541)突变L452R、T478K位点，获得序列SEQ ID NO:1，随后进行密码子优化后委托擎科生物有限公司全基因合成的编码基因序列SEQ ID NO:2，命名为SARS-CoV-2RBDdm，并插入到pPICZαA载体的XhoI和NotI酶切位点之间，获得重组表达载体pPICZα-RBDdm，即RBDdm蛋白表达载体。
二、重组表达载体pPICZα-RBDdm转化酵母菌CGMCC No.19488
将酵母菌划线于YPD平板上复苏，分离单克隆。挑取复苏的单克隆，接种到YPD液体培养基中，试管培养至其对数期后取1ml转接到100ml YPD摇瓶中25℃200rpm摇床培养至OD600至1.3-1.5，1500g 4℃离心5min弃上清，用等体积的预冷的蒸馏水重悬后1500g 4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次；再用等体积的预冷的1M山梨醇重悬后1500g 4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次。以上经3次蒸馏水和3次山梨醇洗涤的菌体沉淀，添加1ml 1M山梨醇悬起，100μl每支分装到无菌离心管中，-80℃保存。
将构建好的表达质粒pPICZα-RBDdm约10μg用限制性内切酶BglII进行单点线性化，酶切体系(50μL)如下：表达质粒pPICZα-RBDdm 43μL、BglII 2μL、10×NEB3.1 buffer 5μL，37℃酶切1h后取样，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，分析质粒是否线性化完全。图2是根据本发明一个实施例的pPICZα-RBDdm表达载体BglII线性化电泳分析图。分离结果如图2所示，线性化完全的酶切产物用离心柱型的DNA片段回收试剂盒进行片段回收，最后洗脱线性化的质粒时用15μL纯水洗脱。
取线性化的表达质粒pPICZα-RBDdm 15μL，加入到100μL毕赤酵母菌(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19488)电击转化感受态细胞，轻轻混匀，转入预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min。按照酵母电转手册要求，2kV电压电击后迅速加入900μL预冷的1M山梨醇，转入一只洁净试管中，置25℃培养箱中静置2小时。之后再加入1ml无抗生素添加的YPD液体培养基，置25℃，200rpm摇床培养3-4小时。将以上摇床培养得到的菌液，取300μL涂布于筛选抗性为Zeocin的YPD平板，25℃温箱倒置培养60-72h。
三、重组表达菌株的筛选
待所涂平板长出单克隆后，随机挑取6个单克隆接种至新的YPD/Zeocin的平板上，25℃温箱倒置培养。待菌落长出后，接种至3ml的YPD/Zeocin液体培养基中，25℃，200rpm摇床培养，待菌液长浓后，按照5％(体积百分含量)的接种量转接到3ml BMGY培养基，培养基中25℃200rpm摇床培养，48小时后每12小时补加0.5％(V/V)甲醇诱导。诱导48h后，12000rpm，3min收集培养上清进行SDS-PAGE检测。
图3是根据本发明一个实施例的CGMCC19488/pPICZα-SARS2 S-RBDdm阳性克隆筛选图。结果如图3所示。由图可见，SDS-PAGE分析2#、4#克隆均有不同水平的蛋白表达，其中4#表达水平较高，选定为下一步实验克隆菌株，并将其命名为CGMCC19488/pPICZα-RBDdm。
实施例2、重组RBDdm糖蛋白的表达与纯化
一、重组菌株CGMCC19488/pPICZα-RBDdm培养
挑取实施例1鉴定得到的阳性克隆(即重组菌株
CGMCC19488/pPICZα-RBDdm)接种到YPD/Zeocin液体培养基中，25℃，200rpm培养至OD600为15～20，以5％(V/V)的接种量转接到BMGY培养基，25℃，200rpm培养24小时后加入体积百分比为0.5％的甲醇诱导RBDdm的表达，每12小时诱导一次，并取样检测表达情况，诱导36小时后离心收集培养上清。
图4是根据本发明一个实施例的CGMCC19488/pPICZα-S-RBDdm不同诱导时间电泳检测图。不同诱导时间SDS-PAGE检测如图4所示。由图可见，目的蛋白随着诱导时间的增加，表达水平也在提高。
二、RBDdm蛋白的纯化
1、阳离子交换层析
将步骤一诱导表达36小时的培养上清调pH至5.5，用Capto MMC层析介质纯化，流动相成分为：
A：20mM pH5.5 PB(磷酸盐缓冲液)；
B：100mM pH8.5 Tris-HCl+1M NaCl。
上样结束用A平衡，然后用B洗脱。
2、疏水层析
将用Capto MMC纯化样品用Phenyl HP纯化，先用40％(体积百分含量)B洗脱杂蛋白，再用20％(体积百分含量)B洗脱目的蛋白，流动相成分为：
A：20mM pH7.5Tris-HCl+1M AS(硫酸铵)；
B：20mM pH7.5 Tris-HCl
3、G25脱盐
将Phenyl HP纯化样品用G25fine层析介质脱盐，收集蛋白样品，流动相成分为：20mM pH8.5 Tris-HCl。
4、阴离子交换层析
将脱盐的样品用SOURCE30Q层析介质纯化，流动相成分为：
A：20mM pH8.5 Tris-HCl；
B：20mM pH8.5 Tris-HCl+1M NaCl。
上样结束用A平衡，然后用B洗脱。
5、阳离子交换层析
Source30Q后样品，用HCl将其pH调至6.5，随后用Source 30S层析柱纯化，流动相成分为：
A：20mM pH6.5 PB
B：20mM pH7.0 PB+1M NaCl
通过SDS-PAGE电泳发现，通过Capto MMC可将RBDdm蛋白捕获；样品经过Source30Q纯化后，目的蛋白流穿，几乎所有杂蛋白被吸附在SOURCE30Q层析介质。图5是根据本发明一个实施例的SARS-CoV-2S-RBDdm纯化样品SDS-PAGE图。SDS-PAGE检测结果如图5所示。
实施例3哺乳动物细胞表达重组RBDdm-histag蛋白与RBDdm-histag蛋白的纯化
在SEQ ID NO:1的C末端加入柔性接头和6个组氨酸标签，所得序列为SEQ ID NO:3，其对应的编码基因序列SEQ ID NO:4，将SEQ ID NO:4所示的完整目的基因进行Nhel/Notl双酶切，之后连接到经过同样酶切的真核表达载体中，得到重组载体pcDNA3.1/RBDdm；将重组载体转化大肠杆菌，按常规方法进行质粒扩增，之后用天根生物有限公司试剂盒提取质粒。
按照Lipofectin试剂盒手册配制DNA-脂质体混合物并转染中国仓鼠CHO细胞，37℃温育2h；换液成含10％BSF的DMEM培养基，继续培养48h。利用Neomycin抗性进行克隆筛选，把转染后的细胞从培养瓶中分离，按1×105细胞/孔加到96孔板中，以含500μg/mLNeomycin的DMEM培养基(加10％BSF)继续培养转染后的细胞，经7d后，选取形成克隆的细胞，扩增培养到6孔板。
NEO抗性克隆经培养后，以1.5×105/mL细胞密度接种到培养瓶，在含5％CO2培养箱中37℃培养72h，取上清得到RBD蛋白。对获得的上清液进行鉴定，并分析RBD-histag蛋白含量。
通过鉴定，SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4均可表达新型冠状病毒RBDdm-histag蛋白，通过10kDa膜包对SEQ ID NO:2表达蛋白进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释后，通过镍亲和层析进行浓缩纯化，备用。
实施例4、RBDdm小鼠免疫实验
免疫方法已经在多篇文献中公开，如《人类疾病动物模型的复制，李才主编，人民卫生出版社出版》。具体如下：取60只6～8周龄大的雌性BALB/c小鼠，随机分为以下6组，每组10只：10μg RBDwt免疫组、2.5μg RBDwt免疫组、10μg RBDdm免疫组、2.5μg RBDdm免疫组、佐剂组和生理盐水组。其中，1-2组为制备得到的CGMCC19488表达的RBDwt糖蛋白，分别按100μl体积含有10μg RBDwt或2.5μg RBDwt和100μg Al(OH)3、50μg CpG用生理盐水配伍疫苗。3-4组RBDdm即为前文制备得到的CGMCC19488表达的RBDdm糖蛋白，分别按100μl体积含有10μg RBDdm或2.5μg RBDdm和100μg Al(OH)3、50μgCpG用生理盐水配伍疫苗。5组佐剂组为100μg Al(OH)3、50μg CpG用生理盐水配伍的佐剂组疫苗。6组为生理盐水即生理盐水组。各组均在第0、14天肌肉免疫100μl，第28天取血。
用间接ELISA法测各组小鼠血清中抗RBD的抗体滴度。用前文制备得到的CGMCC19488表达的RBDwt、RBDdm包板，其他操作步骤参见精编分子生物学实验指南[M].科学出版社,2008.。
图6A-图6B是根据本发明一个实施例的二免14天后小鼠血清抗RBDdm抗体滴度。结果如图6A-图6B所示。由图可知：1-4组RBDwt、RBDdm免疫组产生了抗RBD特异性抗体，抗体滴度可达1：1000000，而对照组仅1：100。
实施例5、病毒中和试验
实施例3中1-5组小鼠在第二次免疫后14天取血清，56℃孵育30min，用生理盐水按一定稀释度稀释。按照常规方法进行病毒中和试验(参考文献：Nie J,Li Q,Wu J,etal.Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020；15(11):3699-3715.doi:10.1038/s41596-020-0394-5)。步骤如下：
1、准备细胞：将HEK293-ACE2细胞(Vazyme，nanjing，货号：DD1401)消化。
2、血清稀释：用含10％FBS(Excell，货号：FND100)和1％双抗(维森特，货号：450-201-CL)的DMEM培养基(Gibco，货号：C11995500BT)按一定稀释度稀释。
3、血清过滤：用0.22μm的滤器过滤。
4、梯度稀释：首孔加入稀释过滤后的血清150μL，取50μL转移至下一稀释度孔内100μL培养基中(3倍比稀释)，共设置6个稀释度(含首孔)。病毒对照孔加入100μL培养基，细胞对照孔加入150μL培养基。
5、病毒稀释：根据病毒(SARS-CoV-2-Fluc WT：Vazyme，货号：DD1702；SARS-CoV-2-Fluc B.1.1.529：Vazyme，货号：DD1768；SARS-CoV-2-Fluc B.1.617.2：Vazyme，货号：DD1754；SARS-CoV-2-Fluc 501Y.V2-1：Vazyme，货号：DD1741)的TCID50值，稀释到2×104TCID50/mL。
6、中和反应：样品孔和病毒对照孔分别加入50μL假病毒稀释液(1-4组：WT，501Y.V2-1，B.1.617.2首孔最终稀释度50倍，B.1.1.529首孔最终稀释度30倍；5组：野生型WT，Beta(501Y.V2-1)，Delta(B.1.617.2)，Omicron(B.1.1.529)首孔最终稀释度30倍)，震荡混匀，37℃中和1小时。
7、加入细胞：稀释细胞至2×104cells/50μL，每孔加入细胞稀释液50μL，震荡混匀，37℃CO2培养箱中培养48小时，拿出细胞板平衡到室温加入报告基因试剂检测(Vazyme，货号：DD1201)，记录数据。
图7A-图7D是根据本发明一个实施例的假病毒中和试验结果。如图7A-图7D所示，对SARS-CoV-2-Fluc野生型WT假病毒的中和活性，RBDwt和RBDdm免疫组血清高、低剂量组之间无显著性差异，RBDwt和RBDdm免疫组之间中和活性无显著性差异；
对SARS-CoV-2-Fluc Beta(501Y.V2-1)假病毒的中和活性，RBDwt免疫组血清高、低剂量组之间无显著性差异，RBDdm免疫组血清10μg剂量组中和活性显著性高于2.5μg剂量组，RBDwt免疫组中和活性与RBDdm免疫组无显著性差异；
对SARS-CoV-2-Fluc Delta(B.1.617.2)假病毒的中和活性，RBDwt和RBDdm免疫组血清高、低剂量组之间无显著性差异，而RBDwt免疫高、低剂量组中和活性都显著低于RBDdm免疫组；
对SARS-CoV-2-Fluc Omicron(B.1.1.529)假病毒的中和活性，RBDwt和RBDdm免疫组血清高、低剂量组之间无显著性差异，10μg RBDwt免疫组中和活性显著低于10μg RBDdm免疫组，2.5μg RBDwt与10μg RBDdm之间无显著性差异。
上述验证中和活性的假病毒仅为发明人选取的具有代表性的新型冠状病毒变异株，事实上，本发明的RBDdm不仅可以中和新型冠状病毒和上述三种变异株，还可以中和其他变异株。新冠病毒变异株包括但不限于Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon、Zeta、Eta、Theta、Iota、Kappa、Lambda及其亚种。
从以上的研究中发现，RBDdm变异体疫苗不仅可以有效地中和Delta变异株，而且我们还惊奇地发现，该变异体疫苗还可以中和新型冠状病毒野生株、Beta变异株，以及新近出现的Omicron变异株，即可以中和WHO定义的多种“关切变异株”(variant of concern,VOC)，这使得RBDdm变异体疫苗极有可能成为一种潜在的广谱的新冠病毒候选疫苗。
实验证明，本发明利用哺乳动物细胞或者是经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母表达的冠状病毒S蛋白RBD变异体具有正确的N-糖链修饰，保证了其天然构象等问题。本发明表达所得的冠状病毒S蛋白RBDdm免疫小鼠后能够产生高滴度的抗RBD的抗体，且能够中和SARS-CoV-2及多个变异株假病毒。尤其发现了本发明提供的工程化巴斯德毕赤酵母菌株具备了构建周期短、生长快、易于大规模生产、安全性高等特点，在突发新型冠状病毒变异株等应急条件下，利于进行新型冠状病毒变异株疫苗高效研发和大规模生产。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 216
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val
210 215
<210> 2
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列（SARS-CoV-2）
<400> 2
agagtacaac caactgaatc cattgttaga tttcctaata tcactaacct gtgcccattt 60
ggtgaagttt ttaacgctac tagatttgct tctgtttacg cctggaacag aaagagaatt 120
tctaactgtg ttgctgatta ctctgttctt tacaactctg cctctttttc tacttttaag 180
tgttatggtg tctctccaac caagttgaac gatttgtgtt ttaccaacgt ttacgctgat 240
tcttttgtta ttagaggtga tgaggttaga caaattgctc ctggtcaaac tggtaagatt 300
gctgattata actacaagtt gcctgatgat tttactggtt gcgtcattgc ttggaactct 360
aataatttgg attctaaggt tggtggaaat tacaactaca gatacagatt gtttagaaag 420
agtaacttga agccatttga aagagatatt tctactgaaa tctaccaagc tggatctaag 480
ccttgtaacg gtgtcgaagg ttttaactgc tactttcctt tgcagtctta cggttttcaa 540
cccactaacg gtgttggtta ccagccctac agagttgttg ttttgtcttt tgagttgctt 600
catgctccag ctactgtttg tggtcctaag aagtctacta acttggtt 648
<210> 3
<211> 227
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser His His His
210 215 220
His His His
225
<210> 4
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列（SARS-CoV-2）
<400> 4
agagtacaac caactgaatc cattgttaga tttcctaata tcactaacct gtgcccattt 60
ggtgaagttt ttaacgctac tagatttgct tctgtttacg cctggaacag aaagagaatt 120
tctaactgtg ttgctgatta ctctgttctt tacaactctg cctctttttc tacttttaag 180
tgttatggtg tctctccaac caagttgaac gatttgtgtt ttaccaacgt ttacgctgat 240
tcttttgtta ttagaggtga tgaggttaga caaattgctc ctggtcaaac tggtaagatt 300
gctgattata actacaagtt gcctgatgat tttactggtt gcgtcattgc ttggaactct 360
aataatttgg attctaaggt tggtggaaat tacaactaca gatacagatt gtttagaaag 420
agtaacttga agccatttga aagagatatt tctactgaaa tctaccaagc tggatctaag 480
ccttgtaacg gtgtcgaagg ttttaactgc tactttcctt tgcagtctta cggttttcaa 540
cccactaacg gtgttggtta ccagccctac agagttgttg ttttgtcttt tgagttgctt 600
catgctccag ctactgtttg tggtcctaag aagtctacta acttggttgg tggtggtggt 660
tctcatcatc atcatcacca t 681

Claims (11)

1.一种制备预防冠状病毒及其变异体的疫苗的方法，包括：
(1)提供至少一种基于冠状病毒刺突糖蛋白的免疫原性片段或者包括所述免疫原性片段的免疫原性组合物；其中，所述免疫原性片段为包括冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质；其中：
①所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的氨基酸序列选自:
(a1)SEQ ID NO：1；
(a2)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及
(a3)(a1)或(a2)的截短体；或者
②所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的氨基酸序列选自：
(b1)SEQ ID NO：3；
(b2)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及
(b3)(b1)或(b2)的截短体；以及
(2)将(1)中所述免疫原性片段或所述免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合；
其中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2病毒，其变异体包括但不限于Beta变异体、Delta变异体、Omicron变异体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的氨基酸序列由编码基因编码，其中：
①所述编码基因选自：
(c1)SEQ ID NO：2；
(c2)与SEQ ID NO：2所示核酸序列80％以上同源、所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及
(c3)(c1)或(c2)的截短体；或者
②所述编码基因选自：
(d1)SEQ ID NO：4；
(d2)与SEQ ID NO：4所示核酸序列80％以上同源、所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及
(d3)(d1)或(d2)的截短体。
3.一种分离的核酸分子，其编码冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质；以及
①其序列选自：
(c1)SEQ ID NO：2；
(c2)与SEQ ID NO：2所示核酸序列80％以上同源、且所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及
(c3)(c1)或(c2)的截短体；或者
②其序列选自选自：
(d1)SEQ ID NO：4；
(d2)与SEQ ID NO：4所示核酸序列80％以上同源、且所编码的蛋白质与冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体蛋白质80％以上同源的核酸序列；以及
(d3)(d1)或(d2)的截短体。
4.根据权利要求3所述核酸分子，其中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2病毒。
5.一种重组载体，包括：
如权利要求3所述的核酸分子；以及
表达载体。
6.一种融合细胞，包括：
如权利要求5所述的重组载体；以及
表达细胞。
7.一种如权利要求3所述的核酸分子编码的冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质的制备方法，包括：
获得核酸分子；
将核酸分子转化入表达细胞；
在表达细胞内表达冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质；以及
纯化所述冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的制备方法，进一步包括：
构建包含核酸分子的重组载体；以及
将所述重组载体转化入表达细胞内。
9.一种疫苗组合物，包括：
至少一种免疫原性片段或者包括所述免疫原性片段的免疫原性组合物；其中，所述免疫原性片段为由权利要求3所述的核酸分子编码的冠状病毒刺突糖蛋白RBD变异体的蛋白质；以及
佐剂。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂包括氢氧化铝和CpG；所述免疫原性片段与CpG、氢氧化铝的混合质量比为1:(5-20):(10-40)，优选为1:10:20。
11.一种如权利要求3所述的核酸分子在制备预防冠状病毒及其变异体引起疾病的药物或疫苗方面的用途。
CN202210323963.XA 2022-03-29 2022-03-29 一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用 Pending CN114717205A (zh)

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