CN113929774A - 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113929774A
CN113929774A CN202111205710.4A CN202111205710A CN113929774A CN 113929774 A CN113929774 A CN 113929774A CN 202111205710 A CN202111205710 A CN 202111205710A CN 113929774 A CN113929774 A CN 113929774A
Authority
CN
China
Prior art keywords
val
ser
leu
asn
phe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111205710.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113929774B (zh
Inventor
高福
吴燕
李世华
张根
谭曙光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN202111205710.4A priority Critical patent/CN113929774B/zh
Publication of CN113929774A publication Critical patent/CN113929774A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113929774B publication Critical patent/CN113929774B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及免疫学和分子病毒学技术领域，具体公开了一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；和/或，其轻链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。本发明的单克隆抗体能够以高亲和力与新型冠状病毒及其各突变株S蛋白RBD结合，并且中和活性强，具有理想的预防和治疗新型冠状病毒及其各突变株感染的临床应用价值。

Description

一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学和分子病毒学技术领域，具体地说，涉及一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，即新型冠状病毒，传播快速、广泛，致死率高，对公众的生命和健康造成重大威胁。
与此同时，以SARS-CoV-2的Alpha、Beta、Gamma和Delta为代表的各种变种快速传播，本领域正努力应对新的病毒变种。之前已经报道了针对SARS-CoV-2的S蛋白及其RBD的研究，最近的几项研究也已经确定了一些可以逃逸某些单克隆抗体的病毒突变，这些突变发生在中和抗体与病毒结合的关键位置，从而影响中和抗体的效果。
SARS-CoV-2是导致新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体，是一种具有囊膜结构的单链正链RNA病毒，它与重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属冠状病毒科。该病毒表面的刺突蛋白(Spike,S蛋白)在感染宿主的过程中，通过结合宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，从而触发病毒膜与宿主细胞膜融合机制，导致宿主细胞感染病毒。其中S蛋白分为S1和S2两部分，已有研究证实S1的C端(CTD)的受体结合结构域(RBD)与ACE2结合，从而介导膜融合过程。
迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的帕利珠单抗(Synagis)，治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的Rabishield。此外，还有多种针对不同病毒的单抗处于临床研究的不同阶段(https://clinicaltrials.gov/)。抗体主要通过两方面起作用。一方面，具有中和活性的抗体可通过结合病毒囊膜蛋白，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染。另一方面，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)可募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。
因此，筛选出具有更高亲和力并且能够对各种突变体表现出中和活性的单克隆抗体是紧迫而重要的，它在提供一种新的有效预防和治疗新型冠状病毒感染的手段的同时，还可以更广泛的保护公众的生命和健康安全。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则其所使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本发明中(若有涉及)所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本发明中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本发明中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本发明，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423 426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879 5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444 6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121 1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体9K)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本发明中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本发明中所使用的，术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见Journal of virological methods,2009,158(1-2):171-179)。
如本发明中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。
如本发明中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本发明中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本发明中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本发明中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合能力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体9K)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，新型冠状病毒S蛋白的RBD)，此数值使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE 8K设备中测定。
在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母或三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本发明中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本发明中所使用的，术语“新型冠状病毒”和“SARS-CoV-2”是指，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)正式分类名的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本发明中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种与新型冠状病毒及其各突变株亲和力高的单克隆抗体及其应用。
为了实现该目的，本发明经过大量的实验研究后发现了一种抗体，其能够特异性识别并靶向新型冠状病毒及几种主要流行突变株的S蛋白，特别是S蛋白的受体结合结构域(RBD)，并且能够阻断S蛋白的RBD与细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合，显示出了高效的中和病毒的能力。因此，本发明的抗体特别适合用于诊断、预防和治疗新型冠状病毒以及几种流行突变株感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。
具体地，本发明提供以下技术方案：
一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；和/或，
其轻链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
优选，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链可变区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；和/或，其轻链可变区具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
更优选地，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；且其轻链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
进一步优选地，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链可变区具有如SEQID NO：7所示的氨基酸序列；且其轻链可变区具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体在重链可变区的N端还具有前导序列。在某些优选的实施方案中，所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体在轻链可变区的N端还具有前导序列。在某些优选的实施方案中，所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
优选地，本发明所述前导序列具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
本发明的所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
在某些优选的实施方案中，所述的单克隆抗体还包括重链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在某些优选的实施方案中，所述的单克隆抗体还包括轻链恒定区。在某些优选的实施方案中，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在某些优选的实施方案中，所述的单克隆抗体的轻链为κ型。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合新型冠状病毒的刺突蛋白(S蛋白)。在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够靶向新型冠状病毒的刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)。在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够抑制S蛋白的受体结合域(RBD)介导的受体结合和/或膜融合过程，抑制病毒对细胞的感染。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有中和能力(例如，能够中和新型冠状病毒)。在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够抑制新型冠状病毒感染或进入宿主细胞。由此，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够中和新型冠状病毒，并由此预防和治疗新型冠状病毒的感染。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子不受限于其产生的方法，并且可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
具体地，本发明还提供一种核酸分子，其编码上述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
优选，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区；SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子还包含编码前导序列的核苷酸序列，其位于所述能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列的5’端。在某些优选的实施方案中，所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述编码前导序列的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子还包含编码前导序列的核苷酸序列，其位于所述能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列的5’端。在某些优选的实施方案中，所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述编码前导序列的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含第一多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列和能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列；以及，第二多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列和能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含第一多核苷酸，其包含如SEQ IDNO:16所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；以及，第二多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子还包含，能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子还包含，能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含第一多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列、能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列和能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的核苷酸序列；以及，第二多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列、能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列和能够编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含第一多核苷酸，其包含如SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；以及，第二多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
本发明另提供一种载体，其包含上述的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含上述核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明另提供了一种组合物，其包含如上所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞。
所述组合物可为诊断剂或治疗剂。
本发明再提供一种试剂盒，其包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段，或进一步包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
优选地，所述药物组合物还包含其他药学活性剂，例如法匹拉韦，瑞德西韦，干扰素等。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体包括：氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3，和/或氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的VL CDR1-3；优选地，所述单克隆抗体包括：如SEQ ID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
本发明还提供一种上述单克隆抗体或其抗原结合片段在以下任一方面的应用：
(1)在制备用于检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
(2)在制备用于中和样品中的新型冠状病毒的毒力的产品中的应用；
(3)在制备药物中的应用，所述药品用于中和样品中新型冠状病毒的毒力，或用于预防或治疗受试者的新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病。
在另一个方面，本发明提供了检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的方法，其包括，使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的(例如，所述样品是来自患者的样品)，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了新型冠状病毒的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在来自所述受试者的样品中的存在。在某些优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体。
在另一个方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备产品，如试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了新型冠状病毒。
在某些优选的实施方案中，所述样品包括但不限于来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、肺泡灌洗液等。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3，和/或氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1-3；优选地，其包括：如SEQ ID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
使用单克隆抗体或其抗原结合片段来检测目标病毒或抗原(例如，新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD)在样品中的存在或其水平的一般方法是本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中，所述检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
在另一个方面，本发明提供了用于中和样品中新型冠状病毒的毒力的方法，其包括，将包含新型冠状病毒的样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。此类方法可以用于治疗目的，或非治疗目的(例如所述样品是细胞样品，而不是患者或来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中新型冠状病毒的毒力。在另一个方面，本发明提供了如上所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于中和样品中新型冠状病毒的毒力。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。在另一个方面，本发明提供了如上所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于预防或治疗受试者的新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的新型冠状病毒感染或新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。
在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
可通过任何适当的施用途径来将本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物施用给受试者。此类施用途径包括但不限于，口服、口腔、舌下、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、或鼻腔途径。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3，和/或氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1-3；优选地，其包括：如SEQ ID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
本发明所提供的药物或药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与其他药学活性剂(例如抗病毒药物，如法匹拉韦、瑞德西韦和干扰素等)联合使用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明的单克隆抗体(例如9K抗体)能够以高亲和力与新型冠状病毒及其各突变株S蛋白RBD结合，并且对新型冠状病毒及其几种流行突变株具有很强的中和活性。例如，本发明9K抗体对不同突变RBD具有很高的亲和力以及对新型冠状病毒各突变株假病毒的中和滴度数据(半抑制浓度，IC50)非常优秀。更重要的是，9K抗体抗SARS-CoV-2野生型(WT)和南非株(B.1.351)活病毒也具有优良的中和活性，其中和滴度(半抑制浓度，IC50)分别为49.42μg/mL和11.50μg/mL，并且在小鼠模型中可以起到明显的预防和保护作用。因此，本发明的单克隆抗体(例如9K抗体)具有理想的预防和治疗新型冠状病毒及其各突变株感染的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1的新型冠状病毒S蛋白RBD的分子筛层析结果与SDS-PAGE检测结果。其中，凝胶图上的“-”表示没有添加DTT(非还原性SDS-PAGE)；“+”表示添加了DTT(还原性SDS-PAGE)。
图2为本发明实施例4的重组表达的9K抗体的分子筛层析结果与SDS-PAGE检测结果，其中，凝胶图上的“-”表示没有添加DTT(非还原性SDS-PAGE)；“+”表示添加了DTT(还原性SDS-PAGE)。
图3和图4为本发明实施例5的9K抗体结合SARS-CoV-2不同突变体RBD蛋白的动力学曲线结果。各结果图中，横坐标为时间(秒)，纵坐标为响应值(RU)。
图5为本发明实施例6的不同浓度的9K抗体抗SARS-CoV-2不同突变株假病毒的中和活性。
图6为本发明实施例7的不同浓度的9K抗体抗SARS-CoV-2野生型和南非株B.1.351活病毒的中和活性。
图5、图6中，Neutralization(％)代表中和百分比，concentration为浓度。
图7为本发明实施例8的9K抗体在小鼠模型中，抗SARS-CoV-2野生型活病毒的预防和治疗效果。Prophylaxis代表预防组，Treatment代表治疗组，图中，*代表P<0.05，***代表P<0.001，****代表P<0.0001。P值越小，差异越显著。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了获得具有保护效果的中和抗体，本发明首先以293F表达的SARS-CoV-2的S蛋白RBD作为抗原，通过流式分选术，从感染了SARS-CoV-2且痊愈出院的人员的外周血单核细胞(PBMCs)中筛选到能够特异性结合S蛋白RBD的记忆B细胞，然后，对筛选获得的单一B细胞进行RT-PCR，获得编码抗体可变区的序列。进一步，将编码抗体可变区的序列与恒定区基因连接至表达载体中，并在哺乳动物细胞中进行表达和纯化，从而获得抗体9K。对抗体9K进行一系列的功能检测，结果显示，抗体9K能够特异性结合S蛋白RBD，阻断S蛋白RBD与ACE2的结合，抑制SARS-CoV-2对人细胞的感染，具有抗SARS-CoV-2感染的中和活性。
本发明所涉及的部分序列的信息如下面的表1所示。
表1 部分序列的信息
Figure BDA0003306761280000071
Figure BDA0003306761280000081
Figure BDA0003306761280000091
Figure BDA0003306761280000101
实施例1SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD的表达与纯化
将优化的C-末端带有6个His标签的野生型nCoV-RBD(残基319-541，GenBank：YP_009724390.1)编码序列克隆到哺乳动物表达载体pCAGGS中。将表1中所示的各种突变型RBD(K417N、K417T(存在于P.1(Gamma)RBD中)、L452R(存在于B.1.617.1(Kappa)RBD和B.1.617.2(Delta)RBD中)、Y453F、N460S、T478K(存在于B.1.617.2(Delta)RBD中)、E484K、E484A、F486L、N501Y(存在于B.1.1.7(Alpha)RBD、B.1.351(Beta)RBD、P.1(Gamma)RBD中)、N501T)的编码基因亚克隆到pCAGGS中。之后将质粒(2μg)和PEI按照每毫升HEK293F细胞1:3的质量比瞬时共转染。在310K、5％CO2条件下用SMM 293-TII培养基(Sino Biological)培养细胞，然后在转染后24小时按照35mL/L的比例补充SMS M293-SUPI(Sino Biological)。在第五天收集上清液并用0.22μm膜过滤，然后通过His-trap HP柱(GE Healthcare)进行纯化，并使用AKTA-purifier(GE)和
Figure BDA0003306761280000103
200increase columm(GE Healthcare)在PBS缓冲液(pH7.4)中进一步纯化。纯化结束后，通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)鉴定目的蛋白(S蛋白的RBD)的纯度。结果如图1所示。图1的结果显示，获得了高纯度的RBD蛋白，其大小约为35kDa。
实施例2特异性识别RBD蛋白的记忆B细胞的分离
在感染SARS-CoV-2病毒且痊愈出院的人员的知情同意下，采集10mL的血液，分离PBMCs。将分离的PBMCs以107/mL的密度与终浓度为400nM的RBD蛋白(由实施例1制备的)在冰上孵育结合半小时；然后用PBS洗2次，再与下列抗体(均购自BD)孵育：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-human CD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。在冰上孵育半小时后，用PBS洗PBMCs 2次。随后，用FACSAria III分选PBMCs，收集PE-Cy5-APC-APC-Cy7+ Pacific Blue+ FITC+ PE+的细胞(即B细胞)，直接将其收集到96孔板内，1细胞/孔。
实施例3 9K抗体的分离和鉴定以及重组表达载体的构建
使用Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen)对实施例2获得的B细胞进行逆转录(在55℃，进行60分钟)，其中，所使用的逆转录引物如表2所示。
表2 所使用的逆转录引物的序列信息
Figure BDA0003306761280000102
Figure BDA0003306761280000111
以逆转录产物作为模板，用HotStar Tap Plus酶(QIAgen)进行第一轮PCR(PCRa)，扩增抗体可变区的序列；其中，所使用的引物如表3所示；所使用的反应条件如下：95℃，5min；35个循环的(95℃30s，55℃(重链/κ链)30s，72℃90s)；72℃，7min。随后，以该扩增产物作为模板再进行第二轮PCR(PCRb)；其中，所使用的引物如表4所示；所使用的反应条件如下：95℃，5min；35个循环的(95℃30s，58℃(重链)/60℃(κ链)/64℃(λ链)30s，72℃90s)；72℃，7min。
通过1％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物。回收条带大小在400-500bp的PCR产物，并送测序公司测序。测序结果用NCBI在线软件进行分析。
通过序列测定，获得一株抗体的序列，命名为9K。9K抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示(编码基因如SEQ ID NO:12所示)，重链可变区的CDR1具有如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列。轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示(编码基因如SEQ IDNO:13所示)，轻链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。9K抗体与胚系基因的序列一致性如下面的表5-表6所示。
表3 第一轮PCR(PCRa)所使用的引物
Figure BDA0003306761280000112
表4 第二轮PCR(PCRb)所使用的引物
Figure BDA0003306761280000121
以上引物中，R＝A/G，D＝A/G/T，S＝C/G，Y＝C/T，W＝A/T，K＝G/T。
表5 9K抗体重链与胚系基因的比较
Figure BDA0003306761280000122
表6 9K抗体轻链与胚系基因的比较
Figure BDA0003306761280000123
将分析得到的编码重链/轻链可变区的核苷酸序列分别与相应的编码重链/κ链的恒定区的核苷酸序列通过搭桥PCR进行连接，然后分别克隆至表达载体pCAGGS(购自Addgene)中，从而得到分别编码抗体重链和轻链的重组表达载体。表达重链和轻链的构建体的构建方法如下：
重链编码序列(5’-3’)：CMV启动子-EcoR I酶切位点-前导序列基因-VH基因-CH基因-Xho I酶切位点；
轻链(κ)编码序列(5’-3’)：CMV启动子-Sac I酶切位点-前导序列基因-VL基因-CL(κ)基因-Xho I酶切位点；
其中，前导序列的氨基酸序列如SED ID NO:11所示(编码基因如SEQ ID NO:16所示)，CH的氨基酸序列如SED ID NO:9所示(编码基因如SEQ ID NO:14所示)，CL的氨基酸序列如SED ID NO:10所示(编码基因如SEQ ID NO:15所示)。
实施例4 9K抗体的表达
重链和轻链质粒(实施例3中获得的分别编码抗体重链和轻链的重组表达载体)共转染HEK293F细胞。重链和轻链的摩尔比为1:1.5，每毫升HEK293F细胞转染2μg质粒和4μgPEI(1mg mL-1)。在310K、5％CO2条件下用SMM 293-TII培养基(Sinobiological)培养细胞，然后在转染后24小时按照35mL/L的比例补充SMS M293-SUPI(Sinobiological)。在第五天收集上清液并用0.22μm膜过滤，然后通过His-trap HP柱(GE Healthcare)进行纯化，并使用AKTA-purifier(GE)和
Figure BDA0003306761280000124
200 10/300increase columm(GE Healthcare)在PBS缓冲液(pH7.4)中进一步纯化。随后，通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)检测所纯化的目的蛋白。结果如图2所示。图2的结果显示，获得了经纯化的9K抗体。
实施例5 9K抗体与S蛋白RBD的结合能力的评估
在本实施例中，利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行表面等离子共振分析。具体步骤如下：
首先，固定Protein A芯片至Biacore 8K中，设定实验程序：9K作为固定项，固定时间60s。各种倍比稀释后的nCoV-RBD作为流动项，结合时间60s，解离时间60s。然后，以抗体捕获的方式，先让芯片结合纯化的9K抗体。之后将用pH 7.4溶液连续倍比稀释RBD蛋白依次通过各通道(从低浓度开始逐一上样)。记录9K抗体结合RBD蛋白的动力学曲线(图3和图4)，并利用BIAevaluation software 8K(Biacore，Inc.)软件计算动力学常数(如表7所示)，选择“Single-cycle kinetic using Capture”方法进行分析，以“1:1binding”模式进行拟合。图3、图4和表7(三次检测取平均值)的结果显示，9K抗体能够以很高的亲和力结合SARS-CoV-2各种突变体S蛋白的RBD。其中，SARS-Cov-2RBD野生型为实施例1中记载的优化的C-末端带有6个His标签的野生型nCoV-RBD。具体各RBD序列信息参见表1。
表7 9K抗体对不同RBD的亲和力
Figure BDA0003306761280000131
实施例6 9K抗体中和SARS-CoV-2各种假病毒的能力的评估
将复制缺陷型水疱性口炎病毒载体骨架(VSV-ΔG-GFP)质粒(Nie J,Li Q,Wu J,et al.Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay forSARS-CoV-2.Emerg Microbes Infect.2020；9(1):680–686.)和相应的具有18个残基缺失的新型冠状病毒各突变株的S蛋白质粒(将表1中各新型冠状病毒毒株的RBD序列缺失C端18个氨基酸后的S蛋白的编码序列构建连接在pCAGGS上)共转染到HEK293T细胞中以产生假病毒。9K的初始浓度为50μg/mL，设置三份重复，倍比稀释9个梯度，并将等体积的抗体稀释液与假病毒在310K混合30分钟。然后将混合物加入到Vero E6细胞中，在310K的5％CO2中培养15小时。只有假病毒的6个重复孔被设置为对照。数据通过CQ1共聚焦显微镜(Yokogawa)测量，IC50使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。分析结果见图5和表8。由此可见，9K抗体能够以极高的中和活性抑制SARS-CoV-2各种突变体的假病毒。
表8 9K抗体对新型冠状病毒各突变株假病毒的中和滴度(半抑制浓度，IC50)
Figure BDA0003306761280000132
实施例7 9K抗体中和SARS-CoV-2活病毒的能力的评估
在使用前一天将Vero E6细胞接种在预先制备的96孔板中，并确保在测定前细胞密度大约至85％。9K抗体用DMEM培养基连续倍比稀释，起始浓度为200μg/mL，设置8个重复、10个梯度。将50μL 2×103TCID50/mL SARS-CoV-2野生型(WT)(hCoV-19/China/CAS-B001/2020，国家微生物学数据中心NMDCN0000102-3，GISAID号：EPI_ISL_514256-7)和南非株(B.1.351)(由中国疾病预防控制中心病毒病研究所提供)分别与50μL抗体稀释液混合，并在310K、5％CO2下孵育1小时。之后在每孔细胞中加入100μL混合液，阳性对照和阴性对照分别为2×103TCID50/mL活病毒和DMEM培养基。在310K、5％CO2下培养3天后，观察细胞病变效应(CPE)，并使用GraphPad Prism 8.0软件计算9K抗体的中和滴度IC50，结果如图6所示。图6显示了不同浓度的9K抗体抗SARS-CoV-2野生型(WT)和南非株(B.1.351)活病毒的中和活性，其中和滴度(半抑制浓度，IC50)分别为49.42μg/mL和11.50μg/mL，具有优良的中和活性。
实施例8 9K抗体在小鼠模型中对SARS-CoV-2的预防和治疗
在Ad5-hACE2感染后的BALB/c小鼠模型中进行了预防和治疗研究。
首先，在第5天的时候向小鼠(雌性，6周)鼻内注射1.6×1011vp/mL复制缺陷型Ad5-hACE2(Kun Xu,Yaling An,Qunlong Li,et al.Recombinant chimpanzee adenovirusAdC7 expressing dimeric tandem-repeat spike protein RBD protects mice againstCOVID-19.Emerging Microbes&Infections，Volume 10,2021-Issue 1，https://doi.org/10.1080/22221751.2021.1959270；由中国科学院微生物研究所生物安全三级实验室保存并提供)。在预防组中，按照每只小鼠50mg/kg的剂量腹腔注射9K抗体，之后以2×106TCID50/mL SARS-CoV-2野生型(WT)(参见实施例7)的剂量攻毒。治疗组则为在攻毒后12h腹腔注射50mg/kg的9K抗体。在阴性对照组中用PBS处理小鼠。在用病毒攻击后3天处死小鼠并进行尸体剖检。使用qRT-PCR确定每克组织的RNA拷贝量。使用QIAamp Viral RNA mini kit(Qiagen)从肺中提取病毒RNA，并通过COVID-19病毒双重检测试剂盒(MABSKY)在QuantStudio 7实时定量PCR(Applied Biosystems)上进行qPCR测定，并使用以下方法进行扩增程序：50℃30min，95℃3min，然后45个循环，每个循环为95℃5s和55℃30s。结果如图7所示，无论是治疗组还是预防组，都与阴性对照组有明显差异，可见9K抗体在小鼠模型中可以起到明显的预防和保护作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用
<130> KHP211121033.4
<160> 67
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ser Asn Asp Gly Thr Ile Asp
1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Asp Lys Glu Gln Leu Val Pro Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Ala Ser
1
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gly Leu Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Gly Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Thr Ile Asp Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Glu Gln Leu Val Pro Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Pro Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gly
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser
100 105
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcctgtgcag tctctggatt taccttcagt agctacgcca tgcactgggt ccgccaggct 60
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaactat tgattcctac 120
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 180
ctgcgaatga gcagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagataaa 240
gagcagctgg taccgacctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 300
gccagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 360
<210> 13
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tccgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccccggact cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 14
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 60
tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 120
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 180
tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaacg cgtggagccc 240
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 300
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 360
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 420
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 480
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 540
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aactatctcc 600
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 660
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 720
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 780
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 840
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 900
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgactcgagc tagcagatcg atggactaca 960
aggacgacga tgacaaggga ccttaaagat 990
<210> 15
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgaactgtgg ctgcaccaag cgtgtttatc ttccctccca gcgacgagca gctgaagagc 60
ggcaccgcca gcgtggtctg tctcctgaac aacttctatc ccagggaggc caaggtccag 120
tggaaagtgg acaacgccct gcaaagcggc aatagccagg agtccgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctgtccagc accctgaccc tcagcaaggc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcttg cgaggtgacc catcagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300
tccttcaaca ggggcgaatg cagctaactc gagctagcag atcgatggac tacaaggacg 360
acgatgacaa gggaccttaa agat 384
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggagacgg atacgctgct cctgtgggtt ttgctgctgt gggttccagg ttccactggt 60
gac 63
<210> 17
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 18
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 19
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 20
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 21
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Gln Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 22
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 23
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 24
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Ser Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 25
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 26
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 27
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Ala Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 28
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 29
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Thr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 30
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg
1 5 10 15
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
20 25 30
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
85 90 95
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
100 105 110
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
115 120 125
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135 140
Asn Tyr Asn Tyr Leu Phe Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
145 150 155 160
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
165 170 175
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
180 185 190
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
195 200 205
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
210 215 220
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atggagtcgg gaaggaagtc 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcacggacgt tgggtggta 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcacggaggt ggcattgga 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
caggcgatga ccacgttcc 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
catgcgacga ccacgttcc 19
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aggtgtgcac gccgctggtc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gcaggcacac aacagaggca 20
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aggccactgt cacagct 17
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ccatggactg gacctggagg 20
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atggacatac tttgttcca 19
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ccatggagtt tgggctgagc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atgaaacacc tgtggttctt 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
atggggtcaa ccgccatcct 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
atgtctgtct ccttcctcat 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cgcctgagtt ccacgacacc 20
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gctcagctcc tggggct 17
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ggaarcccca gcdcagc 17
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctsttsctyt ggatctctg 19
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctsctgctct gggytcc 17
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gaggcagttc cagatttcaa 20
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cctgggccca gtctgtg 17
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ctcctcasyc tcctcact 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggcctcctat gwgctgac 18
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gttctgtggt ttcttctgag ctg 23
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
acagggtctc tctcccag 18
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acaggtctct gtgctctgc 19
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccctctcsca gsctgtg 17
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tcttgggcca attttatgc 19
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
attcycagrc tgtggtgac 19
<210> 60
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cagtggtcca ggcaggg 17
<210> 61
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aggccactgt cacagct 17
<210> 62
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ctgggttcca ggttccactg gtgaccaggt gcagctggtr cagtctggg 49
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cgcctgagtt ccacgacacc 20
<210> 64
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ctgggttcca ggttccactg gtgacgacat ccagwtgacc cagtctc 47
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gggaagatga agacagatgg t 21
<210> 66
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ctgggttcca ggttccactg gtgaccagtc tgtgytgack cagcc 45
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gggygggaac agagtgacc 19

Claims (10)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其重链可变区的CDR1具有如SEQID NO：1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQID NO：3所示的氨基酸序列；和/或，
其轻链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其重链可变区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；和/或，其轻链可变区具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
4.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，包含权利要求4或5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4或5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体。
8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或进一步包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
10.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在以下任一方面的应用：
(1)在制备用于检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
(2)在制备用于中和样品中的新型冠状病毒的毒力的产品中的应用；
(3)在制备药物中的应用，所述药品用于中和样品中新型冠状病毒的毒力，或用于预防或治疗受试者的新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病。
CN202111205710.4A 2021-10-15 2021-10-15 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用 Active CN113929774B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111205710.4A CN113929774B (zh) 2021-10-15 2021-10-15 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111205710.4A CN113929774B (zh) 2021-10-15 2021-10-15 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113929774A true CN113929774A (zh) 2022-01-14
CN113929774B CN113929774B (zh) 2023-05-02

Family

ID=79279629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111205710.4A Active CN113929774B (zh) 2021-10-15 2021-10-15 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113929774B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114316040A (zh) * 2022-03-02 2022-04-12 南昌大学 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN114395034A (zh) * 2022-03-24 2022-04-26 中国科学院微生物研究所 一种高效中和新型冠状病毒的人源抗体及其应用
CN114560930A (zh) * 2022-04-27 2022-05-31 清华大学 抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用
CN114560931A (zh) * 2022-04-27 2022-05-31 清华大学 抗SARS-CoV-2的中和抗体及其应用
CN114573691A (zh) * 2022-03-28 2022-06-03 广州医科大学附属市八医院 一株人源中和抗体或其抗原结合片段及其应用
CN114702576A (zh) * 2022-03-01 2022-07-05 武汉科技大学 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
CN114717205A (zh) * 2022-03-29 2022-07-08 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用
CN114957455A (zh) * 2022-05-06 2022-08-30 深圳国家感染性疾病临床医学研究中心 一种新型冠状病毒单克隆抗体及其应用
CN115073592A (zh) * 2022-03-02 2022-09-20 中国科学院武汉病毒研究所 抗蝙蝠SARS相关冠状病毒RsSHC014感染的中和单克隆抗体及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111398597A (zh) * 2020-03-12 2020-07-10 中科欧蒙未一(北京)医学技术有限公司 用于检测样品中抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的IgM抗体的试剂盒
WO2021184560A1 (zh) * 2020-03-18 2021-09-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111398597A (zh) * 2020-03-12 2020-07-10 中科欧蒙未一(北京)医学技术有限公司 用于检测样品中抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的IgM抗体的试剂盒
WO2021184560A1 (zh) * 2020-03-18 2021-09-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIGONG LU等: "Antibody response and therapy in COVID-19 patients: what can be learned for vaccine development?", 《SCIENCE CHINA.LIFE SCIENCES》 *
肖琦等: "新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定", 《江西农业大学学报》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114702576A (zh) * 2022-03-01 2022-07-05 武汉科技大学 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
CN114702576B (zh) * 2022-03-01 2023-09-01 武汉科技大学 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
CN115073592A (zh) * 2022-03-02 2022-09-20 中国科学院武汉病毒研究所 抗蝙蝠SARS相关冠状病毒RsSHC014感染的中和单克隆抗体及应用
CN115073592B (zh) * 2022-03-02 2024-07-23 中国科学院武汉病毒研究所 抗蝙蝠SARS相关冠状病毒RsSHC014感染的中和单克隆抗体及应用
CN114316040B (zh) * 2022-03-02 2024-03-29 南昌大学 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN114316040A (zh) * 2022-03-02 2022-04-12 南昌大学 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN114395034A (zh) * 2022-03-24 2022-04-26 中国科学院微生物研究所 一种高效中和新型冠状病毒的人源抗体及其应用
CN114395034B (zh) * 2022-03-24 2022-08-05 中国科学院微生物研究所 一种高效中和新型冠状病毒的人源抗体及其应用
CN114573691A (zh) * 2022-03-28 2022-06-03 广州医科大学附属市八医院 一株人源中和抗体或其抗原结合片段及其应用
CN114717205A (zh) * 2022-03-29 2022-07-08 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用
CN114560931A (zh) * 2022-04-27 2022-05-31 清华大学 抗SARS-CoV-2的中和抗体及其应用
CN114560930A (zh) * 2022-04-27 2022-05-31 清华大学 抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用
CN114957455A (zh) * 2022-05-06 2022-08-30 深圳国家感染性疾病临床医学研究中心 一种新型冠状病毒单克隆抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113929774B (zh) 2023-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113929774B (zh) 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用
CN113943368B (zh) 一种新型冠状病毒及其突变体的单克隆抗体及其应用
CN111592594B (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN110066333B (zh) 一种寨卡病毒特异性中和抗体及其应用
JP5808536B2 (ja) 抗ｒｓｖｇタンパク質抗体
WO2021174595A1 (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN106589116B (zh) 一种黄病毒人源单克隆抗体及应用
CN113444169B (zh) 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用
CN113354730B (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
WO2024125667A1 (zh) 一种针对SARS-CoV或SARS-CoV-2的单克隆抗体、其制备方法及应用
CN114989291B (zh) 一种靶向RBD的抗SARS-CoV-2全人源化单克隆抗体及应用
CN115433285A (zh) 靶向冠状病毒的抗体及其应用
WO2021228135A1 (zh) 制备抗原结合单元的方法
CN113372441B (zh) 一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant