WO2022019671A1 - 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자 - Google Patents

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sars
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spike protein
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김민수
김철민
서지민
심은영
이지헌
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Definitions

  • the present invention relates to a SARS-coronavirus-2 neutralizing binding molecule that binds to an epitope of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • SARS-coronavirus-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2
  • SARS-CoV-2 is a positive sense single-stranded RNA coronavirus based on DNA sequencing.
  • SARS-CoV-2 is contagious to humans and is the cause of coronavirus disease 2019 (COVID-19). The first outbreak of COVID-19 was in Wuhan, Hubei Province, China.
  • SARS-CoV-2 may have mild to severe symptoms such as fever, cough, shortness of breath, and diarrhea. People with complications or diseases and the elderly are more likely to die.
  • coronavirus disease 2019 2019 (COVID-19)
  • the existing treatment is administered to the patient to expect a therapeutic effect.
  • Antiviral agents favipiravir, remdesivir, and galidesivir, which are Ebola treatment or treatment candidates, and hepatitis C treatment ribavirin are being used as COVID-19 treatments.
  • the antimalarial drug Chloroquine has been shown to have a therapeutic effect on COVID-19 and is undergoing public clinical trials.
  • hepatitis C treatment ribavirin may have severe side effects such as anemia, and the antiviral drug interferon is also recommended to be used with caution due to concerns about various side effects.
  • the COVID-19 Central Clinical Task Force prepared the treatment principle for COVID-19 on February 13, 2020, and as the first-line treatment, AIDS treatment Kaletra, malaria treatment chloroquine and hydroxy Chloroquine (Hydroxychloroquine) is recommended, and ribavirin and interferon are not recommended as first-line treatment due to concerns about side effects.
  • TF Central Clinical Task Force
  • Rapid diagnostic test is called by various names such as immunochromatographic analysis and rapid kit analysis. Users can simply detect analytes from biological or chemical samples with rapid diagnostic testing.
  • the rapid diagnostic test is a method that can qualitatively and quantitatively test an analyte in a short time by using the property that biological or chemical substances specifically adhere to each other.
  • the rapid diagnostic test is one of the most advanced analysis kits among detection methods developed recently in terms of simplicity and speed, and is usefully used to diagnose causative agents of various diseases, such as antigens or antibodies of infectious pathogens, cancer factors, and markers of heart disease.
  • SARS-CoV-2 does not yet have a specific prophylactic or therapeutic agent for this virus. Accordingly, the present inventors attempted to develop an antibody specific for SARS-CoV-2. As a result of repeated research to develop an antibody having excellent binding force, neutralizing ability and/or diagnostic effect, the present invention has been completed.
  • Another object to be solved by the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the binding molecule according to the present invention.
  • Another object to be solved by the present invention is to provide an expression vector into which a nucleic acid molecule according to the present invention is inserted.
  • Another object to be solved by the present invention is to provide a cell line transformed with the expression vector according to the present invention.
  • Another object to be solved by the present invention is to provide a composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) comprising the binding molecule according to the present invention.
  • Another object to be solved by the present invention is to provide a kit for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) comprising the binding molecule according to the present invention.
  • S protein spike protein
  • RBD Receptor Binding Domain
  • SARS-CoV-2 spike protein (S protein) of SARS-CoV-2 binds to an epitope in the Receptor Binding Domain (RBD).
  • SARS - provides a method of producing a binding molecule for the diagnosis, prevention or treatment of a disease caused by coronavirus infection.
  • the present invention is SARS-coronavirus-2 that binds to an epitope in the Receptor Binding Domain (RBD) of the spike protein (S protein) of SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2)
  • RGD Receptor Binding Domain
  • S protein spike protein
  • SARS-CoV-2 SARS-CoV-2
  • a neutralizing binding molecule wherein the epitope of the binding molecule is selected from the group consisting of amino acid positions 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 and 505 of the spike protein of SARS-Coronavirus-2.
  • a binding molecule comprising one or more selected amino acid residues is provided.
  • the epitope of the binding molecule further comprises one or more amino acid residues selected from the group consisting of amino acid positions 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 and 495 of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the position of the epitope amino acid in the RBD of the SARS-coronavirus-2 spike protein is numbered from the N-terminus of the SARS-CoV-2 spike protein (NCBI Accession No.: YP_009724390.1, SEQ ID NO: 2321). (numbering starting with signal peptide).
  • the epitope of the binding molecule comprises amino acid residues at amino acid positions 449, 455, 456, 484, 486, 489, 490 and 493 of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the epitope of the binding molecule may further include amino acid residues at amino acid positions 450, 452, 485, 492 and 494 of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the binding molecule of the present invention is a SARS-coronavirus-2, preferably a SARS-coronavirus-2 spike protein, more preferably a SARS-coronavirus-2 spike protein RBD , Most preferably, as a binding molecule that recognizes or binds to an epitope in the RBD of the SARS-coronavirus-2 spike protein, a heavy chain variable region, preferably a para to one or more of CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region binding molecules comprising PARATOPE.
  • the binding molecule of the present invention may include the amino acid S in CDR1 of the heavy chain variable region, preferably at position 32, S32.
  • CDR1 of the heavy chain variable region may include the sequence TSGX 11 GVX 12 , wherein X 11 may be M or V, and X 12 may be G or S.
  • CDR1 of the heavy chain variable region of the present invention may include TSGVGVG.
  • the binding molecule of the present invention may include one or more of D, W, N and Y in CDR2 of the heavy chain variable region, preferably 54, 55, 56, 57, 58 And at one or more positions of 60, each independently may include D54, W55, D56, D57, N58 and Y60.
  • CDR2 of the heavy chain variable region may include the sequence LIDWDDNKYX 21 TTSLKT, wherein X 21 may be Y or H.
  • CDR2 of the heavy chain variable region of the present invention may include LIDWDDNKYHTTSLKT.
  • the binding molecule of the present invention comprises, at position 32 of CDR1 of the heavy chain variable region, S32;
  • the binding molecule according to the present invention will comprise a heavy chain variable region comprising the CDR1 region of SEQ ID NO: 832, the CDR2 region of SEQ ID NO: 833, and/or the CDR3 region of SEQ ID NO: 834.
  • the binding molecule of the present invention is a binding molecule comprising the above-described heavy chain variable region, and includes the light chain variable region shown in Table 1 and/or Table 2 below, or a light chain variable region derived therefrom. and a light chain variable region comprising the CDR1 region of SEQ ID NO: 829, the CDR2 region of SEQ ID NO: 830, and/or the CDR3 region of SEQ ID NO: 831, preferably, but is not limited thereto.
  • the binding molecule of the present invention is a binding molecule that recognizes or binds to the above-mentioned epitope, and includes the binding molecules shown in Tables 1 and / or 2 below, or binding molecules derived therefrom. .
  • the binding molecule of the present invention is a binding molecule that recognizes or binds to the above-mentioned epitope, and is a binding molecule other than one or more of the binding molecules described in Table 1 and / or Table 2 below.
  • the binding molecule is the binding molecule No. in Table 1 below. 89 to No. 194, and No. It may be any one selected from the group consisting of 248. In Table 1 below, No. means the number of each binding molecule.
  • the CDRs of the variable region according to the present invention were determined by a conventional method according to the system devised by Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. Although the Kabat method was used for CDR numbering used in the present invention, binding molecules comprising CDRs determined according to other methods such as the IMGT method, Chothia method, and AbM method are also included in the present invention.
  • the binding molecule according to the present invention is a binding molecule No. in Table 2 below. 89 to No. 194, and No. It may be any one selected from the group consisting of 248. In Table 2 below, No. means the number of each binding molecule.
  • the epitope of the binding molecule according to the present invention is at amino acid positions 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 of the SARS-coronavirus-2 spike protein. and an amino acid residue of 505.
  • the epitope of the binding molecule may further include amino acid residues at amino acid positions 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 and 495 of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the binding molecule is the binding molecule No. in Table 1 and / or Table 2 above. 89 to No. 194, and No. 248 may be any one selected from the group consisting of, preferably binding molecule No.
  • the binding molecule is the binding molecule No. in Table 2 above. 89 to No. 127, No. 129 to No. 194, and No. It may be any one selected from the group consisting of 248.
  • the epitope of the binding molecule according to the invention is a conformational epitope.
  • the binding molecule according to the present invention is 1x10 -8 M or less, preferably 1x10 -9 M or less, more preferably 1x10 -10 M to the RBD of the SARS-coronavirus-2 spike protein. It may bind with the following binding affinity (K D ), but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, the binding molecule according to the present invention exhibited a very high binding affinity to the RBD of the SARS-coronavirus-2 spike protein at a binding affinity (K D ) of 1x10 -10 M or less.
  • the binding molecule according to the present invention has a monomer ratio (%) of 97% or more, preferably 98% or more according to Size Exclusion Chromatography (SEC-HPLC). , more preferably 99% or more, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, the binding molecule according to the present invention showed a very high purity with a monomer ratio (%) of 99.87% according to SEC-HPLC.
  • the binding molecule according to the present invention has a purity ratio of 85% of intact IgG in non-reduced conditions through capillary electrophoresis (CE). or more, preferably 86% or more, more preferably 87% or more, still more preferably 88% or more, and most preferably 89% or more, but is not limited thereto.
  • the binding molecule according to the present invention showed a very high purity with a purity ratio of Intact IgG of 89% under non-reducing conditions through CE.
  • the binding molecule according to the present invention has an antibody heavy chain / light chain combination ratio (Sum of Heavy & Light Chain) under reduced conditions through capillary electrophoresis (CE). 95% or more, preferably 96% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, the binding molecule according to the present invention showed a very high purity with an antibody heavy chain/light chain combination ratio of 99% under reducing conditions through CE.
  • CE capillary electrophoresis
  • the binding molecule according to the present invention is a SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), preferably a SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) spike protein, more Preferably, the SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) spike protein RBD (Receptor Binding Domain) and ACE2 (Angiotensin-converting enzyme 2) receptor of the target cell can be inhibited from binding.
  • SARS-CoV-2 SARS-coronavirus-2
  • SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 spike protein RBD (Receptor Binding Domain)
  • ACE2 Angiotensin-converting enzyme 2 receptor of the target cell
  • the binding molecule according to the present invention is a spike protein of SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), preferably SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2), more Preferably, it can compete with any one binding molecule selected from the group consisting of the binding molecules of Table 1 for binding to the receptor binding domain (RBD) of the spike protein of SARS-CoV-2. . In one embodiment of the present invention, the binding molecule may compete with any one binding molecule selected from the group consisting of the binding molecules of Table 2 for binding of the RBD of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • SARS-CoV-2 spike protein of SARS-coronavirus-2
  • SARS-CoV-2 SARS-CoV-2
  • the binding molecule may compete with any one binding molecule selected from the group consisting of the binding molecules of Table 2 for binding of the RBD of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the binding molecule according to the present invention comprises a light chain variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 829, a CDR2 region of SEQ ID NO: 830, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 831; and/or a heavy chain variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 832, a CDR2 region of SEQ ID NO: 833, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 834.
  • the binding molecule according to the present invention comprises a light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2017; and a heavy chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2018.
  • SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) spike protein (S protein) of the present invention may consist of or include the sequence of SEQ ID NO: 2321, and derivatives thereof and/or variants.
  • the binding molecule according to the present invention may be an antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the binding molecule may be a scFv fragment, an scFv-Fc fragment, a Fab fragment, an Fv fragment, a diabody, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody, but is not limited thereto.
  • One embodiment of the present invention provides an scFv-Fc that binds to the SARS-CoV-2 S protein.
  • another embodiment of the present invention provides a fully human antibody (Full IgG) that binds to the SARS-CoV-2 S protein.
  • the term 'antibody' is used in the broadest sense, specifically, an intact monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a multispecific antibody formed from two or more intact antibodies (eg, a bispecific antibody), and the purpose antibody fragments that exhibit biological activity.
  • Antibodies are proteins produced by the immune system that are capable of recognizing and binding to specific antigens. In terms of their structure, antibodies usually have a Y-shaped protein consisting of four amino acid chains (two heavy chains and two light chains). Each antibody mainly has two regions: a variable region and a constant region. The variable region located in the distal portion of the arm of Y binds and interacts with the target antigen.
  • variable region comprises a complementarity determining region (CDR) that recognizes and binds a specific binding site on a specific antigen.
  • CDR complementarity determining region
  • the constant region located at the tail of Y is recognized and interacted with by the immune system.
  • Target antigens have multiple binding sites, called epitopes, which are generally recognized by CDRs on multiple antibodies. Each antibody that specifically binds to a different epitope has a different structure. Thus, an antigen may have more than one corresponding antibody.
  • a binding molecule according to the present invention comprises a functional variant of said binding molecule.
  • the variant according to the present invention may compete with the binding molecule of the present invention for specific binding to SARS-CoV-2 or its S protein.
  • it is regarded as a functional variant of the binding molecule of the present invention if it has the ability to neutralize SARS-CoV-2.
  • the functional variant includes, but is not limited to, derivatives that are substantially similar in primary structural sequence.
  • the functional variant includes in vitro or in vivo modification, modification by chemical and/or biochemical agents.
  • the functional variant is not found in the parental monoclonal antibody of the present invention.
  • modifications include, for example, acetylation, acylation, covalent bonding of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent bonding of lipids or lipid derivatives, crosslinking, disulfide bond formation, glycosylation, hydroxylation, methylation, oxidation, pegylation, proteolysis. or phosphorylation and the like.
  • the functional variant may be an antibody comprising an amino acid sequence optionally containing one or more amino acid substitutions, insertions, deletions or combinations thereof compared to the amino acid sequence of the parent antibody.
  • the 'parent antibody' refers to an antibody that does not contain mutations.
  • the functional variant may include a truncated form of the amino acid sequence at at least one of the amino terminus or the carboxy terminus.
  • functional variants of the present invention may have the same, different, higher or lower binding affinity compared to the parent antibody of the present invention, but still be capable of binding to SARS-CoV-2 or its S protein. have.
  • the amino acid sequence of a variable region including, but not limited to, a framework structure, a hypervariable region, in particular, a complementarity-determining region (CDR) of a light or heavy chain may be modified.
  • a light or heavy chain region comprises three hypervariable regions, comprising three CDR regions, and a more conserved region, namely a framework region (FR).
  • a hypervariable region comprises amino acid residues from a CDR and amino acid residues from a hypervariable loop.
  • Functional variants within the scope of the present invention include about 50%-99%, about 60%-99%, about 80%-99%, about 90%-99%, about 95%-99%, or about 97%-99% amino acid sequence identity.
  • Gap or Bestfit known to those skilled in the art among computer algorithms may be used to optimally align amino acid sequences to be compared and to define similar or identical amino acid residues.
  • the functional variant may be obtained by changing the parent antibody or a part thereof by a known molecular biological method including PCR method, mutagenesis using oligomeric nucleotides, etc. and partial mutagenesis, or by organic synthesis method.
  • a known molecular biological method including PCR method, mutagenesis using oligomeric nucleotides, etc. and partial mutagenesis, or by organic synthesis method.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the World Health Organization classifies SARS-Coronavirus-2 into six types based on amino acid changes due to differences in gene sequence. First, it was classified into S and L types, then again into L, V, and G types, and as G was divided into GH and GR, it is classified into a total of six types: S, L, V, G, GH, and GR. At the beginning of the COVID-19 outbreak, types S and V were prevalent in Asia including Wuhan, China, and after that, different types were discovered for each continent. Among them, it has been reported that the GH type has the potential to appear high in transmission power.
  • GH type a variant of the G type prevalent in Europe and the United States, and this type is known to have high virus transmission power.
  • type G virus in which amino acid 614 of the spike protein, which plays an important role in virus invasion, has been changed from aspartic acid (D) to glycine (G), has increased rapidly in Europe and the United States since March, and is now almost It appears in most areas.
  • the neutralizing binding molecule of the present invention is S-type (the amino acid at position 614 of the S protein is D), G (the amino acid at position 614 of the S protein is G) based on the SARS-CoV-2 virus amino acid mutation. ), V-type, L-type, GH-type and / or GR-type strains (strain) such as may exhibit neutralizing ability, but is not limited to this strain (strain).
  • SARS-CoV-2 virus type S is the BetaCoV/Korea/KCDC03/2020 strain, but is not limited thereto.
  • Examples of the SARS-CoV-2 virus type G include, but are not limited to, hCoV-19/South Korea/KUMC17/2020 and hCoV-19/South Korea/KCDC9481/2020 strains.
  • An example of the SARS-CoV-2 virus type V is hCoV-19/Korea/KCDC31/2020 strain, but is not limited thereto.
  • An example of the SARS-CoV-2 virus type L is hCoV-19/South Korea/KNIH04/2020 strain, but is not limited thereto.
  • An example of the SARS-CoV-2 virus type GH is hCoV-19/Korea/KCDC10847/2020 strain, but is not limited thereto.
  • SARS-CoV-2 virus type GR is hCoV-19/South Korea/KUMC17/2020 strain, but is not limited thereto.
  • the neutralizing binding molecule of the present invention exhibited excellent neutralizing ability even in a mutant virus in which D614G mutation occurred at amino acid position 614 of the spike protein S1 region of SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2).
  • the neutralizing binding molecule of the present invention is SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) surface protein (RBD) mutant proteins A435S, F342L, G476S, K458R, N354D, V367F, V483A, and / or exhibiting excellent binding force to W436R.
  • the neutralizing binding molecule of the present invention is a SARS-coronavirus-2 strain isolated to date, for example, UNKNOWN-LR757996 strain (Strain), SARS-CoV-2/Hu of unknown date and place of isolation. /DP/Kng/19-027 strain; Wuhan-Hu-1 strain isolated from China in December 2019; BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-01/2019 strain first isolated in China on December 23, 2019; BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-02/2019 strain, BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-03/2019 strain, BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-04/2019 strain, WIV02 isolated on December 30, 2019 in China strain, WIV04 strain, WIV05 strain, WIV06 strain, WIV07 strain; 2019-nCoV/Japan/TY/WK-521/2020 strain isolated from Japan in January 2020, 2019-nCoV/Japan/TY/WK-501/2020 strain, 2019-nCoV/Japan/TY/TY/S
  • the binding molecule according to the present invention has the ability to neutralize a mutant virus in which the SARS-coronavirus-2 spike protein is mutated. In one embodiment of the present invention, the binding molecule has the ability to neutralize a mutant virus having a mutation in a region other than the RBD region of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the binding molecule has the ability to neutralize SARS-coronavirus-2 S type, L type, V type, G type, GH type and/or GR type, but is not limited thereto.
  • the binding molecule has the ability to neutralize a mutant virus having a D614G mutation at amino acid position 614 of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the neutralizing binding molecule of the present invention has the ability to neutralize any one or more mutant viruses selected from the group consisting of the following 1) to 76), but is not limited to this mutant virus:
  • the neutralizing binding molecule of the present invention has the ability to neutralize any one or more mutant viruses selected from the group consisting of the following 1) to 76), but is not limited to this mutant virus:
  • SARS-Coronavirus-2 a mutant virus having G446V mutation or G446S mutation at amino acid position 446 of the spike protein
  • SARS-Coronavirus-2 mutant virus in which T478K mutation or T478I mutation occurs at amino acid position 478 of the spike protein;
  • SARS-Coronavirus-2 a mutant virus having P521R mutation or P521S mutation at amino acid position 521 of the spike protein;
  • the present invention provides an immunoconjugate in which one or more tags are additionally bound to the binding molecule according to the present invention.
  • a drug may be further attached to the binding molecule.
  • the binding molecule according to the present invention may be used in the form of an antibody-drug conjugate to which a drug is bound.
  • ADCs antibody-drug conjugates
  • immunoconjugates for local delivery of drugs allows for targeted delivery of the drug moiety to infected cells, which when administered unconjugated to normal cells as well. This is because unacceptable levels of toxicity can result. Maximal efficacy and minimal toxicity of ADCs can be improved by increasing drug-connectivity and drug-releasing properties, as well as selectivity of polyclonal and monoclonal antibodies (mAbs).
  • the invention provides a nucleic acid molecule encoding a binding molecule according to the invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention includes all nucleic acid molecules in which the amino acid sequence of the antibody provided in the present invention is translated into a polynucleotide sequence as known to those skilled in the art. Therefore, in the present invention, various polynucleotide sequences can be prepared by an open reading frame (ORF), and these can be included in the nucleic acid molecule of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • the present invention provides an expression vector into which a nucleic acid molecule according to the present invention is inserted.
  • the expression vector Celltrion's own expression vector, MarEx vector (refer to Korean Patent No. 10-1076602) and commercially widely used pCDNA vectors, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vector; cosmid; phage such as lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7; and an expression vector selected from any one selected from the group consisting of plant viruses, but is not limited thereto.
  • all expression vectors known to those skilled in the art as expression vectors can be used in the present invention, and selection of the expression vector depends on the properties of the target host cell.
  • the vector introduction into the host cell may be performed by calcium phosphate transfection, virus infection, DEAE-dextran controlled transfection, lipofectamine transfection or electroporation, but is not limited thereto.
  • a person skilled in the art can select and use an introduction method suitable for the expression vector and host cell to be used.
  • the vector according to the present invention contains one or more selectable markers, but is not limited thereto, and a vector that does not contain a selectable marker may be used to select depending on whether a product is produced.
  • the selection of the selection marker is selected by a desired host cell, which uses a method already known to those skilled in the art, so the present invention is not limited thereto.
  • a tag in order to facilitate purification of the binding molecule of the present invention, a tag (or tag sequence) may be inserted into an expression vector and fused.
  • the tag includes, but is not limited to, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, a myc tag, or a flag tag, and any tag facilitating purification known to those skilled in the art is the present invention available in
  • the present invention provides a cell line transformed with the expression vector according to the present invention.
  • the expression vector is transformed into a host cell to provide a cell line producing a binding molecule having neutralizing ability by binding to SARS-CoV-2.
  • the cell line is selected from the group consisting of CHO cells, F2N cells, COS cells, BHK cells, Bowes melanoma cells, HeLa cells, 911 cells, HT1080 cells, A549 cells, HEK 293 cells and HEK293T cells. It may be any one selected, but is not limited thereto, and any cell that can be used as a mammalian host cell known to those skilled in the art can be used.
  • the present invention provides a composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) comprising the binding molecule according to the present invention.
  • the composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable excipient in addition to the binding molecule.
  • the pharmaceutically acceptable excipient is an excipient well known to those skilled in the art.
  • the description of the binding molecule is applied as it is.
  • the composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) of the present invention comprises the binding molecule according to the present invention, and SARS-coronavirus-2 A mutant virus with a mutation in the spike protein has neutralizing ability.
  • the composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) of the present invention is located in a region other than the RBD region of the SARS-coronavirus-2 spike protein. Including those having the ability to neutralize the mutated virus, SARS-Coronavirus-2 includes those having neutralizing ability to S type, L type, V type, G type, GH type or GR type.
  • composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) of the present invention is to neutralize any one or more mutated viruses selected from the group consisting of the following 1) to 76) can:
  • SARS-Coronavirus-2 a mutant virus having G446V mutation or G446S mutation at amino acid position 446 of the spike protein
  • the composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection is SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), preferably SARS- A spike protein of coronavirus-2 (SARS-CoV-2), more preferably, RBD (Receptor Binding Domain) of a spike protein of SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) and ACE2 (Angiotensin- converting enzyme 2) It may be to inhibit the binding of the receptor.
  • SARS-CoV-2 SARS-coronavirus-2
  • SARS-CoV-2 SARS- A spike protein of coronavirus-2
  • RBD Receptor Binding Domain
  • ACE2 Angiotensin- converting enzyme 2
  • the composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) is SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), preferably SARS- The binding molecules of Table 1 to the binding of the spike protein of coronavirus-2 (SARS-CoV-2), more preferably the receptor binding domain (RBD) of the spike protein of SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2). It may be for competition with any one binding molecule selected from the group consisting of.
  • the composition for diagnosis, prevention or treatment of SARS-coronavirus infection (COVID-19) according to the present invention is the binding of Table 2 to the RBD binding of the SARS-coronavirus-2 spike protein It may be for competition with any one binding molecule selected from the group consisting of molecules.
  • the composition of the present invention may further include at least one other therapeutic agent or diagnostic agent.
  • a binding molecule that binds to a nucleocapsid protein (N protein) on the surface of SARS-CoV-2 may be further included.
  • N protein nucleocapsid protein
  • interferon, anti-S protein monoclonal antibody, anti-S protein polyclonal antibody, nucleoside analog, DNA polymerase inhibitor, siRNA agent, or therapeutic vaccine as an antiviral drug together with the binding molecule may include
  • the composition comprising the binding molecule of the present invention is a sterile injection solution, a lyophilized formulation, a pre-filled syringe solution, an oral formulation, and an external formulation according to a conventional method, respectively. Or it may be formulated in the form of a suppository, etc., but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention by administering the composition of the present invention to mammals including humans, it is possible to prevent or treat SARS-CoV-2 infection or diseases caused by SARS-CoV-2 infection.
  • the dosage of the binding molecule (eg, antibody) according to the present invention depends on the subject to be treated, the severity of the disease or condition, the rate of administration, and the judgment of the prescribing physician.
  • the present invention is SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) immunochromatographic analysis comprising a binding molecule that binds to the spike protein (S protein) on the surface strips are provided.
  • the strip for immunochromatographic analysis may further include a binding molecule that binds to the nucleocapsid protein (N protein) of the coronavirus.
  • the coronavirus is SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), human coronavirus 229E (HCoV-229E), human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), severe acute respiratory syndrome coronavirus ( SARS-CoV), human coronavirus NL63 (HCoV-NL63), human coronavirus HKU1, and may be any one selected from the group consisting of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), but is not limited thereto.
  • SARS-coronavirus-2 SARS-coronavirus-2
  • HoV-229E human coronavirus OC43
  • SARS-CoV severe acute respiratory syndrome coronavirus
  • HKU1 human coronavirus HKU1
  • MERS-CoV Middle East respiratory syndrome coronavirus
  • the strip for immunochromatographic analysis includes: i) a support; ii) a specimen pad; iii) a conjugate pad; iv) a signal detection pad; and v) an absorbent pad.
  • the strip for immunochromatographic analysis is
  • a signal detection pad including a signal detection unit for detecting whether or not the coronavirus is present in the sample and a control unit for checking whether the sample has moved to the absorbent pad regardless of the presence or absence of an analyte;
  • v) it may include an absorbent pad for absorbing the sample after the signal detection reaction has been completed.
  • the strip according to the present invention contains a binding molecule that binds to a spike protein (S protein) on the surface of SARS-CoV-2 to the conjugate pad and the signal detection pad, respectively.
  • S protein spike protein
  • the SARS-CoV-2 S protein binding molecule included in the conjugate pad and the signal detection pad may be the same or different.
  • the SARS-CoV-2 S protein binding molecule included in the conjugate pad and the signal detection pad may be a binding molecule including the above-described sequence.
  • the binding molecules contained in the conjugate pad may be labeled with metal particles, latex particles, fluorescent substances, or enzymes.
  • the metal particles may be gold particles.
  • the gold particles may be colloidal gold particles, but is not limited thereto.
  • the binding molecule of the present invention may be detectably labeled on the conjugate pad of the strip for immunochromatographic analysis according to the present invention.
  • the various methods available for labeling biomolecules are well known to those skilled in the art and are contemplated within the scope of the present invention.
  • examples of the types of labels that can be used in the present invention include enzymes, radioactive isotopes, colloidal metals, fluorescent compounds, chemiluminescent compounds and bioluminescent compounds.
  • the label that can be used is a fluorescent substance (eg, fluorescein, rhodamine, Texas red, etc.), an enzyme (eg, horseradish peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase). ), radioactive isotopes (eg, 32P or 125I), biotin, digoxigenin, colloidal metals, chemiluminescent or bioluminescent compounds (eg, dioxetane, luminol or acridinium).
  • a fluorescent substance eg, fluorescein, rhodamine, Texas red, etc.
  • an enzyme eg, horseradish peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase.
  • radioactive isotopes eg, 32P or 125I
  • biotin digoxigenin
  • colloidal metals eg, chemiluminescent or bioluminescent compounds
  • the labeling method includes, but is not limited to, an enzyme or biotinyl group covalent bonding method, iodination method, phosphorylation method, biotinylation method, and the like.
  • the detection method includes, but is not limited to, autoradiography, fluorescence microscopy, direct and indirect enzymatic reactions, and the like. Commonly used detection assays include radioactive isotope or non-radioactive isotope methods.
  • an example of the detection assay Western blotting, overlay-assay, RIA (Radioimmuno Assay) and IRMA (ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA (Enzyme Immuno Assay), ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA (Fluorescent Assay) Immuno Assay) or CLIA (Chemioluminescent Immune Assay).
  • the detection may be read by visual, optical, electrochemical, or electrical conductivity, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a kit for diagnosis of SARS-coronavirus infection (COVID-19), comprising the strip for immunochromatographic analysis according to the present invention.
  • COVID-19 SARS-coronavirus infection
  • the diagnostic kit of the present invention can be used to detect the presence or absence of SARS-CoV-2 by contacting a sample with the binding molecule according to the present invention, and then checking the reaction.
  • the sample may be any one selected from the group consisting of sputum, saliva, blood, sweat, lung cells, lung tissue mucus, respiratory tissue and saliva, but is not limited thereto, and is not limited thereto. It is possible to prepare a sample by a phosphorus method.
  • the present invention provides a method for detecting SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) using the diagnostic kit.
  • the present invention provides a method for diagnosing SARS-coronavirus infection (COVID-19) using the diagnostic kit.
  • the present invention provides a kit for diagnosing, preventing or treating SARS-coronavirus infection (COVID-19) comprising the binding molecule according to the present invention.
  • the diagnostic kit of the present invention can be used to detect the presence or absence of SARS-CoV-2 by contacting a sample with the binding molecule according to the present invention, and then checking the reaction.
  • the sample may be any one selected from the group consisting of sputum, saliva, blood, sweat, lung cells, lung tissue mucus, respiratory tissue and saliva, but is not limited thereto, and is not limited thereto. It is possible to prepare a sample by a phosphorus method.
  • It provides a kit for diagnosing, preventing or treating a disease caused by SARS-CoV-2 comprising a.
  • a solid carrier may be included in the kit container.
  • the antibody of the present invention may be attached to a solid carrier, and the solid carrier may be porous or non-porous, planar or non-planar.
  • the present invention is SARS- comprising administering a composition according to the present invention in a therapeutically effective amount to a subject having a disease caused by coronavirus infection (COVID-19), SARS- A method for diagnosing, preventing or treating a disease caused by a coronavirus infection is provided.
  • the diagnosis, prevention, or treatment method may further comprise administering an anti-viral drug, a virus entry inhibitor or a virus adhesion inhibitor.
  • the present invention provides a method for screening a binding molecule for diagnosis, prevention or treatment of a disease caused by SARS-coronavirus infection.
  • the present invention confirms whether or not binding to an epitope in RBD (Receptor Binding Domain) of a spike protein (S protein) of SARS-CoV-2 , SARS- A method of screening a binding molecule for the diagnosis, prevention or treatment of a disease caused by infection, wherein the epitope of the binding molecule is at amino acid positions 417, 449, 453 of the SARS-coronavirus-2 spike protein; 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 and 505, wherein the binding molecule is SARS- It provides a method, characterized in that it is determined as a candidate material for diagnosis, prevention or treatment of a disease caused by coronavirus infection.
  • the epitope of the binding molecule according to the present invention is one or more amino acid residues selected from the group consisting of amino acid positions 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 and 495 of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the 'binding molecule' all contents related to the binding molecule described above in this specification are applied as it is.
  • the present invention provides a method for producing a binding molecule for diagnosis, prevention or treatment of a disease caused by SARS-coronavirus infection.
  • the present invention confirms whether or not binding to an epitope in RBD (Receptor Binding Domain) of a spike protein (S protein) of SARS-CoV-2
  • RBD Receptor Binding Domain
  • S protein spike protein
  • the epitope of the binding molecule according to the present invention is one or more amino acid residues selected from the group consisting of amino acid positions 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 and 495 of the SARS-coronavirus-2 spike protein.
  • the 'binding molecule' all contents related to the binding molecule described above in this specification are applied as it is.
  • binding molecule refers to an intact immunoglobulin, including monoclonal antibodies, such as chimeric, humanized or human monoclonal antibodies, or antigen-binding, which is an immunoglobulin that binds to an antigen. Includes fragments. For example, in binding to the spike protein of SARS-CoV-2, it refers to a variable domain, enzyme, receptor, or protein comprising an immunoglobulin fragment that competes with an intact immunoglobulin. Regardless of structure, the antigen-binding fragment binds to the same antigen recognized by the intact immunoglobulin.
  • the antigen-binding fragment comprises two or more contiguous groups of the amino acid sequence of the antibody, 20 or more contiguous amino acid residues, 25 or more contiguous amino acid residues, 30 or more contiguous amino acid residues, 35 or more contiguous amino acid residues, 40 at least 50 contiguous amino acid residues, at least 60 contiguous amino acid residues, at least 70 contiguous amino acid residues, at least 80 contiguous amino acid residues, at least 90 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, 125 a peptide or polypeptide comprising an amino acid sequence of at least 150 contiguous amino acid residues, at least 150 contiguous amino acid residues, at least 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, or at least 250 contiguous amino acid residues.
  • the term "antigen-binding fragment” particularly refers to Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, complementarity determining region (CDR) fragments, single-chain antibodies (scFv). , bivalent single-chain antibodies, single-chain phage antibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, polypeptides containing one or more fragments of an immunoglobulin sufficient to bind a particular antigen to the polypeptide. etc.
  • the fragment may be produced synthetically or by enzymatic or chemical degradation of complete immunoglobulin, or may be genetically engineered by recombinant DNA technology.
  • the fragment generation method refers to a production method well known in the art.
  • the term "pharmaceutically acceptable excipient” refers to an inert substance that is combined into an active molecule such as a drug, agent or antibody to prepare an acceptable or convenient dosage form.
  • the pharmaceutically acceptable excipient is an excipient that is non-toxic, or at least toxic, is acceptable for its intended use to the recipient at the used dose and concentration, and includes a drug, agent or binding agent. It is compatible with the other ingredients of the formulation.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to an amount of the binding molecule of the present invention effective for prophylaxis or treatment before or after exposure to SARS-CoV-2.
  • the binding molecule of the present invention specifically binds to a specific epitope in the RBD of the spike protein on the SARS-coronavirus-2 surface, has an excellent binding ability, and has an excellent neutralizing effect on SARS-coronavirus-2, so SARS- Very useful for diagnosis, prevention or treatment of coronavirus infection (COVID-19).
  • 1A is a result of measuring the virus titer in a nasal wash sample of a ferret using Vero cells after SARS-CoV-2 virus inoculation during a ferret animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 1b shows the results of measuring the virus titer in the nasal wash, saliva and rectal swab samples of ferrets using qRT-PCR after SARS-CoV-2 virus inoculation during an animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 1c is a result of measuring the virus titer in the nasal turbinate tissue and lung tissue of the ferret using Vero cells after SARS-CoV-2 virus inoculation during a ferret animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 1d shows the results of measuring the viral titers in the nasal turbinate tissue and lung tissue of the ferret using qRT-PCR after SARS-CoV-2 virus inoculation during a ferret animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • FIG. 2 is a micrograph of the lung tissue of a ferret after autopsy on the 3rd and 7th days of SARS-CoV-2 virus infection in a ferret animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 3a is a result of evaluating the weight of each individual in each group every day for 6 days before and after SARS-CoV-2 virus infection in a Golden Syrian hamster animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 3b is a result of measuring the lung virus titer of the Golden Syrian hamster using qRT-PCR after SARS-CoV-2 virus inoculation during an animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 3c shows the results of measuring the turbinate virus titer of the Golden Syrian hamster using qRT-PCR after SARS-CoV-2 virus inoculation during animal experiments using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 3d shows the results of measuring the duodenal virus titer of the Golden Syrian hamster using qRT-PCR after SARS-CoV-2 virus inoculation during animal experiments using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 3e is a result of measuring the viral titer of the lung tissue of the Golden Syrian hamster using Vero cells after SARS-CoV-2 virus inoculation during animal experiments using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 4a is a result of evaluating the body weight of each individual in each group every day for 6 days before and after SARS-CoV-2 virus infection in a mouse animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 4b is a result of measuring the virus titer of the lung tissue of the mouse using Vero cells after SARS-CoV-2 virus inoculation during a mouse animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • Figure 4c is a result of measuring the virus titer of the nasal wash of the mouse using Vero cells after SARS-CoV-2 virus inoculation during a mouse animal experiment using the binding molecule of the present invention.
  • 5a is a ferret animal experiment using the binding molecule of the present invention before and after infection with SARS-CoV-2 wild-type and mutant virus (B.1.351), respectively, for 6 days and 4 days, each individual body weight of each group was evaluated. is a result
  • Figure 5b is a ferret nasal wash solution, nasal turbinate, lung virus titers using qRT-PCR after SARS-CoV-2 wild-type and mutant virus (B.1.351) inoculation during an experiment in a parrot animal using the binding molecule of the present invention. is a result
  • Figure 5c is a ferret nasal lavage solution, nasal turbinate, lung virus titers were measured using Vero cells after SARS-CoV-2 wild-type and mutant virus (B.1.351) inoculation during a ferret animal experiment using the binding molecule of the present invention. It is the result.
  • Figure 6a is the result of the mouse neutralizing ability evaluation experiment for the Brazilian mutant virus using the binding molecule of the present invention, showing the change in body weight of the population according to the administration of the binding molecule of the present invention
  • a is p ⁇ 0.0001
  • b indicates the significance level between the control group at p ⁇ 0.05 and the 80 mg/kg administration group at p ⁇ 0.01
  • c shows the control group at p ⁇ 0.0001 and the control group at p ⁇ 0.01 and 5, 20 , indicates the significance level between the groups administered with 40 and 80 mg/kg
  • d indicates the level of significance between the control group at p ⁇ 0.0001 and the control group at p ⁇ 0.001 and the groups administered with 5, 20, 40, and 80 mg/kg).
  • Figure 6b is the result of the mouse neutralizing ability evaluation experiment for the Brazilian mutant virus using the binding molecule of the present invention, showing the virus titer in the lung tissue measured by plaque analysis (in Figure 6b, * and **** are Significance levels between the control group and the administration group of p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.0001 are shown, respectively).
  • Figure 6c shows the results of the mouse neutralizing ability evaluation experiment for the Brazilian mutant virus using the binding molecule of the present invention, showing the virus titer in the nasal wash as measured by plaque analysis.
  • FIG. 7a is a No. 7 according to an embodiment of the present invention using X-ray diffraction analysis. The results of analysis of the amino acid sequence binding to the 139 antibody fragment on the SARS-CoV-2 RBD protein are shown.
  • Figure 7b shows the structure of the SARS-CoV-2 RBD / ACE2 protein complex (PDB code, 6LZG).
  • FIG. 7c shows SARS-CoV-2 RBD/No.
  • the figure shows the superimpose of 139 antibody and SARS-CoV-2 RBD / ACE2.
  • 7d is a No. 7 according to an embodiment of the present invention.
  • the epitope position at which the 139 antibody binds to the SARS-CoV-2 RBD protein is indicated on the RBD spatial structure.
  • FIG. 8 is a No. 8 according to an embodiment of the present invention. The detailed binding of the heavy chain CDR 1/2/3 of antibody 139 and the SARS-CoV-2 RBD protein is shown.
  • FIG. 9 is a No. 9 according to an embodiment of the present invention for various purified recombinant SARS-CoV-2-RBD proteins. The results of determining the binding affinity of the 139 antibody are shown.
  • Figure 10 is using size exclusion chromatography (Size Exclusion Chromatography, SEC-HPLC), the occurrence of abnormal fragments (Fragment, LMW) or aggregation (Aggregation, HMW) of the antibody, evaluation of the ratio of the antibody structure of the normal antibody one result is shown.
  • FIG. 12 is a No. 12 according to an embodiment of the present invention. The results of evaluation of the binding specificity of the 139 antibody by Octet analysis are shown.
  • FIG. 13 is a No. 13 according to an embodiment of the present invention.
  • the mechanism of action of the 139 antibody shows the results of evaluation by performing Biolayer interference (BLI) analysis using Octet.
  • Example 1 Isolation of PBMCs from the blood of patients recovering from SARS-CoV-2
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • RPMI:FBS:DMSO 5:4:1
  • variable regions of the light and heavy chains of the antibody are amplified by PCR (polymerase chain reaction) method using high fidelity Taq polymerase (Roche) and degenerative primer set (IDT) from the synthesized cDNA. did.
  • the separated variable region fragments of the light and heavy chains are made into a scFv-type gene by the overlap PCR method so that they are connected as one sequence in a random combination, amplified, cut with restriction enzymes, and then subjected to 1% agarose gel electrophoresis and scFv was isolated using a gel extraction kit (Qiagen) method.
  • the phage vector was also cut with the same restriction enzyme and separated, mixed with the scFv gene, added with T4 DNA ligase (New England Biolab), and reacted at 16° C. for more than 12 hours.
  • the reaction solution was mixed with ER2738 competent cells and transformed by electroporation.
  • the transformed ER2738 was cultured with shaking, and then VCSM13 helper phage (Agilent Technologies) was added and incubated for more than 12 hours.
  • the phage library culture medium prepared in Example 2 was centrifuged to remove host cells, 4% PEG and 0.5 M NaCl were added thereto, centrifuged to settle the phage, and the supernatant was removed.
  • the precipitated phage was diluted in 1% BSA/TBS to obtain a phage library. Thereafter, panning was independently performed through binding and dissociation reactions to various SARS-CoV-2 Spike proteins (hereinafter, S protein) to isolate scFv-phages having binding ability to SARS-CoV-2 S protein.
  • S protein SARS-CoV-2 Spike proteins
  • the phage library was placed on an ELISA plate to which the receptor binding domain (RBD) region (residues N331 to V524 on S1 glycoprotein), a part of the SARS-CoV-2 S protein, was bound, and reacted at room temperature for 2 hours. After removing the reaction solution, the ELISA plate was washed with PBS containing 0.05% tween 20, and 60 ⁇ l of 0.1M glycine-HCl (pH 2.2) was added to remove the antigen-bound scFv-phage, and 2M Tris (pH 9.1) was added. was used for neutralization.
  • RBD receptor binding domain
  • helper phage was added and cultured to be used for the next panning. A portion of the infected ER2738 was plated on an LB plate before adding auxiliary phages, and colonies were obtained the next day.
  • Colonies formed for each panning were put into a culture medium contained in a 96-well deep well plate (Axygen) and cultured with shaking. When the OD600 reached a value of 0.7 or higher, auxiliary phages were added and then cultured with shaking at 37°C for more than 12 hours. The culture medium was centrifuged to remove host cells, and a supernatant containing scFv-phages was prepared.
  • the prepared scFv-phage supernatant was diluted 1:1 with 6% BSA/PBS, and then put into each well of a 96-well microtiter plate in which SARS-CoV-2 S proteins were adsorbed and blocked and placed at 37°C for 2 hours. been in politics for a while.
  • Each well was washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween 20, then HRP (mustard peroxidase, horseradish peroxidase)-labeled anti-M13 antibody was added thereto, and then left at 37°C for 1 hour.
  • the scFv-phage selected in Example 3 was then cultured with shaking to obtain DNA and then sequenced for the antibody variable region was analyzed. Among them, the selected scFv-phages were cloned into a vector in the form of an scFv antibody fragment (scFv-Fc) in order to evaluate the expression ability in the candidate antibody animal cell line, except for duplicated clones as amino acid sequences.
  • CHO cells were transfected and expressed using a transfection reagent, and the ability of the scFv-Fc antibody fragment to bind to two S proteins of SARS-CoV-2 was confirmed by ELISA using the culture medium.
  • SARS-CoV-2 S proteins were attached to an ELISA plate and the expressed antibody fragment was added. After washing the unbound antibody with PBS containing 0.05% Tween 20, HRP (horseradish peroxidase)-conjugated anti-human IgG antibody was used to select and evaluate antigen-bound antibody fragments.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the positive control antibody is an antibody known to strongly bind to the SARS-CoV-2 S protein (Xiaolong Tian et al., Emerg Microbes Infect. 2020 Feb 17;9(1):382-385). No. in Table 3 below refers to the same binding molecule as No. of each binding molecule shown in Tables 1 and 2 above.
  • the genetic information of the selected antibody fragment was converted into a fully human antibody, and an antibody culture medium was prepared according to the method of Example 4, and the antigen binding and antibody expression levels in the fully human antibody were confirmed.
  • 23 types of fully human antibodies out of 106 types were selected.
  • the expression levels of the selected 23 kinds of fully human antibodies are shown in Table 4 below.
  • Example 6-1 No. Evaluation of neutralizing ability of 139 antibody against SARS-CoV-2 pseudo mutant virus (1)
  • a test was carried out to determine whether the neutralizing ability of the 139 antibody was performed.
  • the SARS-CoV-2 spike mutant pseudovirus was No.
  • Some positions of the epitope of the 139 antibody (see Table 12 in Examples 8-5) and the article (A. Baum et al., Science, 2020 Aug 21;369(6506):1014-1018., Korber et al., 2020 , Cell 182, 812-827) was prepared with reference to the published mutant virus.
  • the amount of the mutated pseudovirus was fixed at 1.73x10 7 copies, and the neutralizing ability test was performed on the mutant virus by diluting it 3 times to the highest concentration of 100 ng/mL of antibody in 10 steps. As a result, the neutralizing ability was confirmed as shown in Table 5 below. .
  • each mutation position is numbered from the N-terminus of the coronavirus spike protein (NCBI ACCESSION number: YP_009724390.1, SEQ ID NO: 2321).
  • Example 6-2 No. Evaluation of neutralizing ability of 139 antibody against SARS-CoV-2 pseudo mutant virus (2)
  • the amount of pseudomutant virus was fixed at 1.73x10 7 copies, and the neutralizing ability test was performed on the mutant virus by diluting 3 times to the highest antibody concentration of 1000 ng/mL in 10 steps. As a result, the neutralizing ability was confirmed as shown in Table 6 below. .
  • each mutation position is numbered from the N-terminus of the coronavirus spike protein (NCBI ACCESSION number: YP_009724390.1, SEQ ID NO: 2321).
  • Example 6-3 No. Evaluation of neutralizing ability of 139 antibody against SARS-CoV-2 pseudo mutant virus (3)
  • the SARS-CoV-2 spike mutant pseudovirus was No.
  • Some positions of the epitope of the 139 antibody (see Table 12 in Examples 8-5) and the article (A. Baum et al., Science, 2020 Aug 21;369(6506):1014-1018., Korber et al., 2020 , Cell 182, 812-827., Wang et al., 2021, doi: 10.1038/s41586-021-03398-2.) was prepared with reference to the mutated virus.
  • the amount of the mutated pseudovirus was fixed at 1.73x10 7 copies, and the neutralizing ability was confirmed as shown in Table 7 below by diluting the antibody 100 ng/mL to the highest concentration in 10 steps. .
  • each mutation position is numbered from the N-terminus of the coronavirus spike protein (NCBI ACCESSION number: YP_009724390.1, SEQ ID NO: 2321). Also, UK 501Y.V1 (B.1.1.7) mutation, South African 501Y.V2 (B.1.351) mutation, Brazil 501Y.V3 (P.1), California mutation (B.1.429), New York mutation (B. 1.525) and the New York variant (B.1.526) are respectively as shown in Reference Table A below.
  • Example 7 No. through animal testing. Evaluation of SARS-CoV-2 virus neutralizing ability of 139 antibody (Full IgG)
  • the group consisted of a control group and a treatment group (low dose and high dose administration of No. 139 antibody), a total of 3 groups and 5 animals per group.
  • samples of ferret nasal lavage, saliva, and rectal swabs from each group were collected, and virus titers were measured by using Vero cells and by using qRT-PCR.
  • virus titers were measured by using Vero cells and by using qRT-PCR.
  • 2 ferrets per group on the 3rd day and 3 ferrets in each group on the 7th day were sacrificed to obtain turbinate and lung tissues, and virus titers were measured in the same way.
  • the No. The virus titer was significantly decreased in the 139 antibody high-dose administration group, and no virus was measured on day 6 ( FIG. 1A ).
  • the virus titers were similar to those of the control group on the 2nd day after infection, but on the 4th and 6th days No. Virus titer was decreased in the low-dose and high-dose groups of the 139 antibody ( FIG. 1B ).
  • the lung tissue was observed under a microscope after autopsy.
  • inflammatory findings such as an increase in neutrophil cells and an increase in alveolar wall thickness were confirmed throughout the lung tissue, and No.
  • the low-dose administration group of the 139 antibody although fewer than those in the infection control group, inflammatory findings were confirmed, and in the high-dose administration group, it was confirmed that the inflammation was significantly reduced compared to the infection control group.
  • the infection control group showed a decrease compared to the 3rd day after infection, but overall, the increase in neutrophil cells and the increase in the thickness of the alveolar wall were maintained.
  • the low-dose and high-dose administration groups of the 139 antibody inflammatory findings were significantly reduced compared to the infection control group, and inflammatory findings were observed only in local areas (FIG. 2).
  • the group consisted of a total of 5 groups and 12 animals per group, including control and treatment groups (No. 139 antibody 15mg/kg, 30mg/kg, 60mg/kg or 90mg/kg), and SARS-CoV-2 virus (NMC-nCoV02) ) 6.4 x 10 4 PFU/80 ⁇ L was instilled into the nasal cavity.
  • control and treatment groups No. 139 antibody 15mg/kg, 30mg/kg, 60mg/kg or 90mg/kg
  • SARS-CoV-2 virus NMC-nCoV02
  • the results of measuring lung, turbinate, and duodenal virus titers using qRT-PCR are as follows.
  • the result of the post-test on the 3rd day after inoculation decreased about 47-fold compared to the control group, and the results of the post-test on the 5th day after inoculation, when administered at 30, 60, and 90 mg/kg, 22, 27 compared to the control group in that order , decreased by 197 fold (Fig. 3b).
  • Virus titers were not measured from the second day after infection in the 60 mg/kg and 90 mg/kg administration groups, except for one animal in the 139 antibody 90 mg/kg administration group. In the case of the 15 mg/kg administration group, the virus titer was not measured on the 2nd day, but the virus titer was measured in one rat on the 3rd and 5th days. In the case of the 30 mg/kg administration group, the virus titer was not measured from the third day ( FIG. 3E ).
  • the group composition consisted of a total of 5 groups of control and administration groups (No. 139 antibody 10 mg/kg, 1 mg/kg, 0 mg/kg or 0.1 mg/kg), 5 or 6 animals per group, respectively, and PBS or No. 24 hours after administration of 139 antibody 0.1 mg/kg, 1 mg/kg, or 10 mg/kg, SARS-CoV-2 virus (NMC-nCoV02) 1 x 10 5 PFU 60 ⁇ L was inoculated into the nasal cavity and observed for up to 6 days. Additionally, body weights of individuals in each group were evaluated daily before and after virus inoculation for 6 days. To measure the virus titer in tissue, mice were sacrificed on the 3rd and 6th days after virus inoculation to obtain lung tissue and nasal wash, and the virus titer of each tissue was measured by plaque assay using Vero cells.
  • Weight loss due to viral infection was significantly reduced in the 1 mg/kg or 10 mg/kg administration group (FIG. 4a).
  • the viral titers of the lung and nasal lavage fluids measured by plaque assay were as follows. At the administration of 0.1, 1, and 10 mg/kg, the lung virus titers were sequentially decreased 9-fold, 4,079-fold, and 9,007-fold compared to the control group on the 3rd day after inoculation. In addition, on the 6th day after inoculation, compared to the control group, lung virus titers were sequentially decreased 25-fold, 478-fold, and 29-fold ( FIG. 4b ).
  • the virus titer in the nasal wash solution was decreased by 2 times, 79 times, and 1304 times in the order of 3 days after inoculation compared to the control group.
  • the virus titer was decreased by 1 fold, 63 fold, and 10 fold compared to the control group ( FIG. 4c ).
  • the group consisted of a control group (administration of excipient) and a treatment group (administration of 80 mg/kg or 160 mg/kg of No. 139 antibody), 6 animals per group, and wild-type SARS- CoV-2 virus (NMC-nCoV02;S-clade) 1x10 5.5 TCID 50 /ml was inoculated into the nasal passages and bronchial tubes, 0.5mL each, for a total of 1mL.
  • excipient or No. 139 antibody 80 mg/kg or 160 mg/kg was administered as a single intravenous injection 24 hours after virus inoculation, and clinical symptoms and body weight were observed before and 6 days after virus inoculation.
  • the group consisted of a control group (excipient administration) and a treatment group (administration of No. 139 antibody 80 mg/kg, 160 mg/kg), total of 3 groups, 6 animals per group, and SARS-CoV-2 South African mutation Virus (B.1.351) 1x10 5.5 TCID 50 /ml was inoculated into the nasal passages and bronchial tubes, 0.5mL each, for a total of 1mL.
  • excipient or No. 139 antibody 80 mg/kg or 160 mg/kg was administered as a single intravenous injection 24 hours after virus inoculation, and clinical symptoms and body weight were observed before and 4 days after virus inoculation.
  • Feret nasal lavage samples were collected from each group before and on the 2nd and 4th days after infection, and virus titers were measured by using Vero cells and by using qRT-PCR.
  • virus titers were measured by using Vero cells and by using qRT-PCR.
  • 3 ferrets were sacrificed in each group on the 2nd and 4th days to secure the turbinate and lung tissue, and the virus titer was measured in the same way.
  • the weight loss due to virus infection was the 3rd day after wild-type SARS-CoV-2 infection between the 160 mg/kg administration group and the control group, between the 160 mg/kg administration group and the control group, the SARS-CoV-2 mutant strain. (B.1.351) On the 2nd day and between the 80 mg/kg administration group and the control group, there was a significant difference on the 2nd, 3rd and 4th days (FIG. 5a). In the graph of FIG. 5A, the difference between 80 mg/kg and the control is indicated by *, and the difference between 160 mg/kg and the control is indicated by #.
  • the viral titers of nasal lavage and turbinate were significantly decreased in the 139 antibody-treated group.
  • lung virus titers in the administration group The limit of quantitation was reached from the 2nd day, and there was a significant decrease compared to the control group, and on the 4th day, no virus was identified in all subjects in the control group and the treatment group (FIG. 5b).
  • virus titers As a result of measuring virus titers in nasal lavage, nasal turbinate, and lung samples of ferrets using qRT-PCR, as shown in FIG. 5c, No. 2, 4, and 6 days .
  • a significant difference in virus titer was confirmed between the 139 antibody-administered group and the control group, and in the case of the administration group, the virus titer decreased to the limit of quantitation from the second day after infection in animals except for one animal in the 80 mg/kg group.
  • virus titers In the turbinate and lung, virus titers decreased to the limit of quantitation from day 3, and there was a significant difference compared to the control group.
  • SARS-CoV-2 mutant B.1.351
  • the viral titers in nasal lavage, nasal turbinate and lung were significantly reduced compared to the control group.
  • the virus titers of the control group and the treatment group decreased to the limit of quantitation on day 4 (FIG. 5c).
  • the group composition consisted of a total of 5 groups of control and administration groups (No. 139 antibody 5, 20, 40, or 80 mg/kg), 11 animals per group, and 55 mice in total. Brazil mutant (P.1; gamma) SARS-CoV -2 Virus 1x10 4 PFU 30 ⁇ L was inoculated into the nasal cavity. 8 hours after virus inoculation, excipient or No. A single intraperitoneal injection of 5, 20, 40 or 80 mg/kg of the 139 antibody was performed, and body weight was evaluated for 10 days before and after virus inoculation and survival was observed. In order to measure the viral titer in the tissue, 4 mice were sacrificed on the 3rd and 6th days after virus inoculation to obtain lung tissue and nasal lavage fluid. Plaque assay using Vero cells was performed to determine the virus titer of each sample. measured.
  • the weight loss of the control subjects started to be seen from the 1st day after inoculation with the virus, and on the 6th day, the average weight loss rate was 27.3%.
  • No.139 antibody was administered at 5, 20, 40, or 80 mg/kg
  • the average weight loss rate on the 6th day after virus inoculation was 18.8%, 16.6%, 16.7%, and 9.2%, in that order, from the 3rd day after the virus inoculation to 6 It was found that the mean weight loss compared to the control group was significantly protected until the first day. Thereafter, the animals of the antibody-administered group showed a tendency to recover body weight until the 10th day of virus inoculation (FIG. 6a).
  • Virus titers in lung tissue as determined by plaque assay were as follows. When the No.139 antibody was administered at 5, 20, 40, or 80 mg/kg, the lung virus titer was decreased by 9.2, 5.5, 2.5, and 3.6 times compared to the control group on the 3rd day after inoculation, in that order. In addition, in the No.139 antibody-administered group, no virus was detected on the 6th day after inoculation, and a significant effect was observed compared to the control group ( FIG. 6b ).
  • the virus titers in the nasal wash as determined by plaque assay were as follows. On the 3rd and 6th days after virus inoculation, one individual in the control group showed viral titers of 2 and 2.3 log 10 (PFU+1)/mL, with an average titer of 0.5 and 0.6 log 10 (PFU+1)/mL. . On the other hand, in the No.139 antibody-administered group, no virus was detected on the 3rd and 6th days after inoculation, and the virus titer decreased ( FIG. 6c ).
  • Example 8 No. 139 Determination of binding site with receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 spike protein of antibody (Full IgG)
  • the expression vector was transfected into CHO cells using Lipofectamine LTX (Invitrogen), and selected under SFM4CHO serum-free medium (HyClone) and 400 nM methotrexate (MTX; Yuhan).
  • SFM4CHO serum-free medium HyClone
  • MTX nM methotrexate
  • a clone stably expressing the SARS-CoV-2 RBD protein was selected and the SARS-CoV-2 RBD protein was mass-produced through fed-batch culture.
  • BalanCD CHO Feed 4 medium (Irvine) and glucose were added at 3, 5 and 7 days of culture using SFM4CHO as a basal medium, and the culture medium was recovered by centrifugation on the 9th day of culture.
  • the SARS-CoV-2 RBD protein in the culture medium was purified by metal affinity chromatography (Ni-NTA agarose column; Qiagen Cat No. 30210). Purified RBD was concentrated using VIVASPIN 30 Membrane 5,000 MWCO PES (Sartorius, Cat No. VS2012) to a concentration of 8.3 mg/ml with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 150 mM NaCl buffer.
  • No. 139 antibody was diluted to 2.0 mg/mL with purified water, and then Papain (Roche, REF#:10108014001) was added with 2X digestin buffer (200mM Tris-HCl (pH 7.4), 4mM EDTA) and final 1mM L-cysteine. ) and 100:1 ratio, followed by enzymatic reaction at 37°C for 1 hour. After that, 1 mg/mL of Antipain dihydrochloride (Sigma, Cat. No. 11004646001) was added at a ratio of 100: 1 and reacted again at 37°C for 45 minutes.
  • the reaction solution removes Fc by separating the Fab and Fc portions using Mabselect SuRe column (GE Healthcare Cat No. 17-5438-03), and VIVASPIN 30 Membrane 5,000 MWCO PES (Sartorius, Cat No. VS2012) using 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl buffer at a concentration of 14.2 mg/ml No. The 139 Fab fragment was concentrated.
  • Example 8-3 Co-crystallization of antibody fragments and SARS-CoV-2 RBD protein
  • No. 139 antibody Fab fragment and purified RBD and No. 139 Fab was mixed in a molar ratio of 1:1.2. extra No.
  • the 139 Fab was prepared by equilibrating HiLoad 16/600 Superdex 200 (GE Healthcare: 28989335) with 10 mM 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 150 mM NaCl buffer, and then equilibrating the excess No. 139 Fab was removed. No. The 139 Fab/RBD complex was concentrated to 6 mg/mL and used for crystallization.
  • Crystals capable of X-ray diffraction analysis were prepared by using the floating droplet vapor diffusion method at 20 °C with 0.4 uL of No. Crystal optimization was carried out for one week under the condition of mixing the same volume of the 139 Fab/RBD complex with a precipitation solution of 10 mM NiCl 2 , 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) and 16% (wt/vol) PEG MME 2000 composition. .
  • Example 8-4 X-ray diffraction analysis
  • X-ray data collection crystals were immersed in the same precipitation solution with 20% ethylene glycol added, and then placed in a 100 Kelvin nitrogen gas stream.
  • the X-ray diffraction data set was collected at the Pohang Accelerator Laboratory (PAL) beamline BL-5C in Korea with a resolution of 2.71 ⁇ .
  • the data set was processed with the XDS program package, and No.
  • the 139 Fab/RBD complex was crystallized in an I222 body cubic system. No. The structure of the 139 Fab/RBD complex was determined by the Molecular Replacement method of the Phaser program.
  • the SARS-CoV-2 RBD/CB6 complex structure (PDB code, 7C01) was used as a search model, and the model construction was performed with the Coot program.
  • the 2F o -F c electron density was well defined throughout the model, and the elaboration and correction of the structure was performed using the Penix package. X-ray diffraction and structural correction statistics are reported in Table 11 (data collection and correction statistics).
  • No. 139 Fab binds to a receptor binding motif in which ACE2 directly binds to SARS-CoV-2 RBD.
  • Epitope analysis was performed using the Contact program of the CCP4i package with a Van der Waals bond distance cut-off of 4.5 ⁇ and a hydrogen bond distance cut-off of 3.5 ⁇ .
  • the RBD-binding sites cover the solvent access surface areas of 824.2 ⁇ 2 and 112.5 ⁇ 2 surface regions, respectively.
  • SARS-CoV-2 RBD epitope (EPITOPE) amino acid positions are numbered from the N-terminus of the SARS-CoV-2 spike protein (NCBI Accession No. YP_009724390.1, SEQ ID NO: 2321) (from signal peptide) start with numbering).
  • No. Paratope amino acid position of Heavy Chain and Light Chain of 139 is No. It is numbered from the N terminus of the heavy and light chain variable region sequences of the antibody 139 (that is, the first amino acid at the N terminus of the heavy and light chain variable region sequences of the No. 139 antibody is set to 1).
  • the amino acid residues to which ACE2 and No. 139 are simultaneously bound are indicated in red letters, as shown in these two figures (Figs. 7d and 7e), 12 out of 21 amino acid residues that bind to ACE2 are No. 139 antibody. It can be confirmed that the binding is the same, and it was confirmed that the No. 139 antibody is evenly distributed in the central region where ACE2 binds on the RBD. Taken together, the No. 139 antibody of SARS-CoV-2 RBD The epitope can be viewed as an epitope that completely inhibits ACE2 and RBD binding.
  • Example 9 Determination of antigen-antibody affinity using surface plasmon resonance technology
  • the Surface Plasmon Resonance assay determines the binding affinity of an antibody by kinetic measurements of forward and reverse rate constants.
  • KD Kd/Ka. Binding is recorded as a function of time and reaction rate constants.
  • Size exclusion chromatography SEC-HPLC was used to evaluate the presence or absence of abnormal fragments (Fragment, LMW) or aggregation (HMW) of the antibody. Since this abnormal protein structure affects the antigen-specific binding ability and in vivo pharmacokinetics of the original antibody, the superiority of the general antibody manufacturing method can be indirectly confirmed.
  • Selected NO. 139 showed a ratio of the normal antibody structure of 99.87% or more, and this figure shows the quality equal to or higher than that of a commercially available monoclonal antibody (FIG. 10).
  • Example 5 The binding specificity of the 139 antibody (Full IgG) was evaluated by performing Octet analysis.
  • SARS-CoV S1, HCoV-HKU1 S1, and MERS-CoV RBD refer to surface proteins of viruses that cause SARS, the common cold, and MERS, respectively.
  • SARS-CoV-2 virus can initiate infection of human cells by binding surface protein (RBD) to human receptor (ACE2). Therefore, No.
  • the mechanism of action of the 139 antibody (Full IgG) was evaluated by performing Biolayer interference (BLI) analysis using Octet.
  • BLI Biolayer interference
  • the SARS-CoV-2 virus surface protein (RBD) mutant protein had excellent binding affinity, and as shown in FIG. 13 , the SARS-CoV-2 surface protein (RBD) and the human receptor (ACE2) The bond is No. It was confirmed that it was completely inhibited by the 139 antibody (Full IgG).
  • each mutation position is numbered from the N-terminus of the coronavirus spike protein (NCBI ACCESSION No.: YP_009724390.1, SEQ ID NO: 2321).

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Abstract

본 발명은 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질의 RBD 내 특정 에피토프에 특이적으로 결합하고, 우수한 결합 능력을 가지며, 사스-코로나바이러스-2에 우수한 중화 효과를 가지므로, 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)에 대한 진단, 예방 또는 치료에 매우 유용하다.

Description

사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자
본 발명은 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자에 관한 것이다.
사스-코로나바이러스-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 유전적 배열(DNA sequencing)상 전도 기능(Positive sense) 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA) 코로나바이러스이다. SARS-CoV-2는 인간에게 전염성이 있고 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)의 원인이다. COVID-19의 최초 발생지는 중국 후베이성의 우한시이다.
SARS-CoV-2에 감염된 사람들은 열, 기침, 호흡 곤란, 설사 등과 같이 경증 내지 중증의 증상을 보일 수 있다. 합병증이나 병을 가진 사람들, 노인은 사망할 가능성이 크다.
특히 심장질환 및 당뇨병 등의 기저질환 보유자가 감염에 더 취약하며, 합병증이나 장기 손상 등을 겪기 때문에 조기 발견과 치료가 매우 중요하다. 2019년 12월 8일부터 2020년 3월 20일 현재까지 245,550명의 환자가 발생하였고, 그 중 10,049명이 사망하여 치사율은 4.09%에 달한다(WHO). 현재까지 한국을 포함한 177개국에서 발생하였다.
현재 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)의 치료제는 없고, 기존 치료제를 환자에게 투여하여 치료 효과를 기대하고 있는 실정이다. 에볼라 치료제 혹은 치료 후보 물질인 항바이러스제 파비피라비르 (favipiravir), 렘데시비르 (remdesivir), 갈리데시비어 (galidesivir)와 C형 간염 치료제인 리바비린 (ribavirin) 등을 COVID-19 치료제로 사용하고 있다. 또한, 말라리아치료제 클로로퀸 (Chloroquine)도 COVID-19에 치료 효과를 보이는 것으로 나타나 공개 임상시험 진행 중에 있다. 그러나 C형 간염 치료제인 리바비린은 빈혈과 같은 부작용이 심할 수 있고, 항바이러스제인 인터페론 (interferon)도 여러 가지 부작용을 우려하여 주의해서 사용할 것을 권고하고 있다.
비록 이러한 약물들이 COVID-19 환자 치료에 활용되어 치료 효과를 보고 있지만, 아직 어떠한 근거로 치료 효과를 내는지는 아직 명확히 입증되지 않았다. 중국에서 COVID-19 회복 환자의 현장을 주입하는 혈장 요법을 시행하여 중증 환자의 치료에 효과를 보였다고 발표하였으나, 치료 효과가 불분명하고 불확실성이 크다.
한국의 경우, COVID-19 중앙임상 테스크포스(TF)가 2020년 2월 13일 COVID-19의 치료 원칙을 마련하여, 1차 치료제로 에이즈 치료제인 칼레트라 (Kaletra), 말라리아치료제인 클로로퀸과 하이드록시클로로퀸(Hydroxychloroquine)을 권하며, 리바비린과 인터페론은 부작용을 우려해 1차 치료제로 권하지 않기로 발표했다. 경증이거나 젊은 환자, 발병 10일이 지난 경우에는 항바이러스제를 투여하지 않아도 증상이 호전된다고 판단하고, 고령자, 기저질환자, 중증 환자에게는 항바이러스 치료제를 투여하기로 합의했다.
미국 CDC는 i) COVID-19가 계절성 유행 바이러스가 아닌 메르스처럼 토착화되어 감염을 일으킬 수 있다고 발표하였고, ii) 바이러스가 올해 또는 내년 어느 시점에 커뮤니티로 전파될 수 있으며, 비록 코로나 바이러스가 실제 커뮤니티에 잠복되어 있다는 증거는 없으나, 데이터 기반으로 결론을 내릴 수 있도록 감시강화의 필요성을 언급하였다(2020.2.13).
한국 질병관리본부(현, 질병관리청)는 i) COVID-19도 인플루엔자처럼 장기적으로 유행할 수 있다고 판단하여, 인플루엔자와 같이 감시 체계에 포함하겠다고 발표하였고, ii) 사람 사이에 유행하는 코로나바이러스(4종)도 겨울~봄에 유행하고 있어서 COVID-19도 토착화될 수 있다는 가능성을 열어두고 있다(2020.2.17).
사스나 메르스와는 다르게 COVID-19의 세계적 유행 (pandemic) 현실화에 대한 우려가 있지만 봄 이후 (4월) 소강 상태가 될 가능성도 있어, 추이를 보며 신중하게 접근하는 전문가들이 많다. 아직 COVID-19에 대한 정보 부족으로 전문가들도 추후 전개 양상에 대해서는 의견이 분분하나, 단시일 내에 해결되리라 전망하는 전문가는 거의 없다. COVID-19의 유행 양상과 특징이 정확히 분석되고 이번 COVID-19로 인한 위기 상황이 얼마나 지속되는지에 영향을 받겠지만, 무증상 감염자가 전세계에 퍼지게 될 경우 풍토병화 될 가능성에 대한 우려가 있다. 중국 및 국내에서의 토착화를 통한 국내 COVID-19 재발병 가능성에 대한 대응책 마련이 시급하다.
신속진단검사(Rapid diagnostic test, RDT)는 면역크로마토그래피 분석, 래피드 키트 분석 등 다양한 명칭으로 불린다. 사용자는 신속진단검사로 생물학적 또는 화학적 샘플로부터 분석 물질을 간단하게 검출할 수 있다. 신속진단검사는 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법이다.
신속진단검사는 간편성 및 신속성 측면에서 최근까지 개발된 검출 방법 중 가장 진보된 분석 키트 중 하나로서 감염성 병원체의 항원 또는 항체, 암 인자, 심장병 마커 등 다양한 질병의 원인 물질을 진단하는데 유용하게 사용한다.
SARS-CoV-2는 아직까지 이 바이러스에 특이적인 예방제 또는 치료제가 없다. 이에 따라, 본 발명자들은 SARS-CoV-2에 특이적인 항체를 개발하고자 하였다. 결합력, 중화능 및/또는 진단 효과가 우수한 항체를 개발하기 위해 지속적인 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(S 단백질, Spike protein, S protein)에 대한 결합 능력을 갖는 결합 분자를 개발하였다. 본 발명자들은 상기 결합 분자가 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD 상의 특정 에피토프에 특이적으로 결합함을 규명하였고, SARS-CoV-2에 대하여 우수한 결합력 및/또는 중화 효력을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 특정 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명에 따른 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명에 따른 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명에 따른 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19) 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)으로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 본 발명에 따른 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프와의 결합 여부를 확인하여, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프와의 결합 여부를 확인하여, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자로서, 상기 결합 분자의 에피토프가 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함하는, 결합 분자를 제공한다. 여기서, 상기 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 상기 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD 내 에피토프 아미노산 위치는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(NCBI Accession No.: YP_009724390.1, 서열번호: 2321)의 N 말단부터 넘버링(numbering) 한 것이다(signal peptide 부터 시작하여 numbering함).
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 449, 455, 456, 484, 486, 489, 490 및 493의 아미노산 잔기(residue)를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 450, 452, 485, 492 및 494의 아미노산 잔기(residue)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는, 사스-코로나바이러스-2, 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질, 더욱 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD, 가장 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD 내 에피토프를 인식하거나 이에 결합하는 결합 분자로써, 중쇄 가변영역, 바람직하게는 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상의 영역에 파라토프(PARATOPE)를 포함하는 결합 분자를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는, 중쇄 가변영역의 CDR1에 아미노산 S를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 32번 위치에, S32를 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열 TSGX11GVX12을 포함하고, 여기서 X11은 M 또는 V이고, X12는 G 또는 S일 수 있다. 가장 바람직하게 본 발명의 중쇄 가변영역의 CDR1은 TSGVGVG을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는, 중쇄 가변영역의 CDR2에 D, W, N 및 Y 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 54, 55, 56, 57, 58 및 60 중 하나 이상의 위치에, 각각 독립적으로 D54, W55, D56, D57, N58 및 Y60을 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 중쇄 가변영역의 CDR2는 서열 LIDWDDNKYX21TTSLKT를 포함하고, 여기서 X21는 Y 또는 H일 수 있다. 가장 바람직하게 본 발명의 중쇄 가변영역의 CDR2는 LIDWDDNKYHTTSLKT을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는, 중쇄 가변영역의 CDR3에 P, G, L, R 및 Y 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 101, 102, 104, 105, 106, 107, 109, 111 및 113 중 하나 이상의 위치에, 각각 독립적으로 P101, G102, L104, R105, Y106, R107, R109, Y111 및 Y113을 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 중쇄 가변영역의 CDR3은 서열 IPGFLRYRNRYYYYGX31DV를 포함하고, 여기서 여기서 X31는 M 또는 V일 수 있다. 가장 바람직하게 본 발명의 중쇄 가변영역의 CDR3은 IPGFLRYRNRYYYYGMDV을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는,중쇄 가변영역의 CDR1의 32번 위치에, S32를 포함하거나;
중쇄 가변영역의 CDR2의 54, 55, 56, 57, 58 및 60 중 하나 이상의 위치에, 각각 독립적으로 D54, W55, D56, D57, N58 및 Y60을 포함하거나; 및/또는
중쇄 가변영역의 CDR3의 101, 102, 104, 105, 106, 107, 109, 111 및 113 중 하나 이상의 위치에, 각각 독립적으로 P101, G102, L104, R105, Y106, R107, R109, Y111 및 Y113을 포함하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 서열번호: 832의 CDR1 영역, 서열번호: 833의 CDR2 영역, 및/또는 서열번호: 834의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 상술한 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자로써, 하기 표 1 및/또는 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역이나, 이로부터 유도된 경쇄 가변영역을 포함하는 결합분자를 포함하며, 바람직하게는 서열번호: 829의 CDR1 영역, 서열번호: 830의 CDR2 영역, 및/또는 서열번호: 831의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 상술한 에피토프를 인식하거나 이에 결합하는 결합 분자로써, 하기 표 1 및/또는 표 2에 기재된 결합 분자나, 이로부터 유도된 결합 분자를 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 상술한 에피토프를 인식하거나 이에 결합하는 결합 분자로써, 하기 표 1 및/또는 표 2에 기재된 결합 분자 중 하나 이상을 제외한 결합 분자를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 하기 표 1의 결합 분자 No. 89 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 하기 표 1에서 No.는 각 결합 분자의 번호를 의미한다.
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본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 가변영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 넘버링은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 결합 분자도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 하기 표 2의 결합 분자 No. 89 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 하기 표 2에서 No.는 각 결합 분자의 번호를 의미한다.
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본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505의 아미노산 잔기(residue)를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 상기 표 1 및/또는 표 2의 결합 분자 No. 89 내지 No. 194, 및 No. 248 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 표 1의 결합 분자 No. 89 내지 No. 127, No. 129 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 상기 표 2의 결합 분자 No. 89 내지 No. 127, No. 129 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자의 에피토프는 구조 에피토프(conformational epitope)이다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD에 1x10-8M 이하, 바람직하게는 1x10-9M 이하, 더욱 바람직하게는 1x10-10M 이하의 결합친화도(KD)로 결합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD에 1x10-10 M 이하의 결합 친화도(KD)에서 매우 높은 결합 친화도를 나타내었다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 크기 배제 크로마토그래피법(Size Exclusion Chromatography, SEC-HPLC)에 따른 모노머(monomer) 비율(%)이 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 SEC-HPLC에 따른 monomer 비율(%)이 99.87%로, 매우 높은 순도를 보여주었다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 모세관 전기영동 분석 (Capillary Electrophoresis, CE)을 통한 비환원 조건 (Non-reduced condition)에서의 온전한 IgG(Intact IgG)의 순도 비율이 85% 이상, 바람직하게는 86% 이상, 더욱 바람직하게는 87% 이상, 더욱더 바람직하게는 88% 이상, 가장 바람직하게는 89% 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 CE를 통한 비환원 조건에서의 Intact IgG의 순도 비율이 89%로, 매우 높은 순도를 보여주었다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 모세관 전기영동 분석 (Capillary Electrophoresis, CE)을 통한 환원 조건 (Reduced condition)에서의 항체 중쇄/경쇄합 비율 (Sum of Heavy & Light Chain)이 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 CE를 통한 환원 조건에서의 항체 중쇄/경쇄합 비율이 99%로, 매우 높은 순도를 보여주었다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2), 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질, 더욱 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질의 RBD(Receptor Binding Domain)와 표적 세포의 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2) 수용체의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2), 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질, 더욱 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질의 RBD(Receptor Binding Domain)의 결합에 표 1의 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 결합 분자와 경쟁할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD의 결합에 표 2의 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 결합 분자와 경쟁할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 서열번호: 829의 CDR1 영역, 서열번호: 830의 CDR2 영역, 및 서열번호: 831의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및/또는 서열번호: 832의 CDR1 영역, 서열번호: 833의 CDR2 영역, 및 서열번호: 834의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 서열번호: 2017의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역; 및 서열번호: 2018의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein, S 단백질)은 서열번호: 2321의 서열로 구성되거나, 이를 포함하는 것일 수 있으며, 이들의 유도체 및/또는 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예는 SARS-CoV-2 S 단백질에 결합하는 scFv-Fc를 제공한다. 또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 SARS-CoV-2 S 단백질에 결합하는 완전한 인간 항체(Full IgG)를 제공한다.
본 명세서에서 '항체'는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 온전한(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 상기 결합 분자의 기능적 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 변이체는 SARS-CoV-2 또는 이것의 S 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 결합 분자와 경쟁할 수 있다. 본 발명에 있어, SARS-CoV-2에 중화 능력을 보유한다면 본 발명의 결합 분자의 기능적 변이체로 간주된다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 기능적 변이체는 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품에 의한 변형을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 있어, 상기 기능적 변이체는 본원 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 또는 인산화 등이 포함된다. 본 발명에 있어, 상기 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명에서, '부모 항체'는 변이가 포함되지 않은 항체를 의미한다. 더욱이, 본 발명에 있어, 상기 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 이상에서 아미노산 서열의 절단체(truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어, 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 SARS-CoV-2 또는 이것의 S 단백질에 결합할 수 있다. 일 예로, 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 경쇄 또는 중쇄의 상보성 결정 영역(Complementarity-determining region, CDR)을 포함하나 이에 한정되지 않는 가변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 일반적으로 경쇄 또는 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 일반적으로 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 약 50%~99%, 약 60%~99%, 약 80%~99%, 약 90%~99%, 약 95%~99%, 또는 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 본 발명에 있어, 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드 등을 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 분자생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
세계보건기구(WHO)는 사스-코로나 바이러스-2를 유전자 염기서열 차이로 인한 아미노산 변화를 기준으로 6개 유형으로 분류하고 있다. 먼저 S, L 유형으로 분류되었다가 다시 L, V, G 유형으로 나뉘고 G가 GH와 GR로 나뉘면서 S, L, V, G, GH, GR 의 총 6개 유형으로 분류하고 있다. COVID-19 발생 초기에 중국 우한을 비롯한 아시아 지역에는 S와 V 유형이 유행하였고, 이후 대륙별로 서로 다른 유형이 발견되었다. 이 중 GH 유형이 전파력이 높게 나타날 가능성이 있다고 보고된 바 있다. 국내의 경우 코로나바이러스 감염증 환자에서 채취한 유전자를 분류한 결과, 대부분은 유럽과 미국에서 유행한 G형의 변종인 GH형인 것으로 나타났고, 이 유형은 바이러스 전파력이 높은 것으로 알려져 있다. 이 중 바이러스의 세포 내 침입 시 중요한 역할을 하는 스파이크 단백질의 614번 아미노산이 아스파트산 (D)에서 글리신 (G)으로 바뀐 G형의 바이러스는 3월 이후 유럽과 미국에서 급격히 증가해 현재는 거의 대부분 지역에서 나타나고 있다. 최근 보고된 바에 따르면 70여개 넘는 코로나바이러스 변이가 발생한 것으로 확인되었고, 전파력이 증가된 변이가 8개 (D614G 등), 중화항체를 회피하는 변이가 10개 (A841V 등), 혈장치료 효과가 낮은 변이 17개 (I472V 등)가 확인되었다.
일 구체예로, 본 발명의 중화 결합 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 아미노산 변이 기준으로 S형(S 단백질의 614번 위치의 아미노산이 D), G형(S 단백질의 614번 위치의 아미노산이 G), V형, L형, GH형 및/또는 GR형 등의 균주(strain)에 중화능을 나타낼 수 있으나, 이 균주(strain)에 한정되는 것은 아니다. 상기 SARS-CoV-2 바이러스 S형의 일 예로는 BetaCoV/Korea/KCDC03/2020 균주가 있으나, 이 균주에 한정되는 것은 아니다. 상기 SARS-CoV-2 바이러스 G형의 일 예로는 hCoV-19/South Korea/KUMC17/2020, hCoV-19/South Korea/KCDC9481/2020 균주가 있으나, 이 균주에 한정되는 것은 아니다. 상기 SARS-CoV-2 바이러스 V형의 일 예로는 hCoV-19/Korea/KCDC31/2020 균주가 있으나, 이 균주에 한정되는 것은 아니다. 상기 SARS-CoV-2 바이러스 L형의 일 예로는 hCoV-19/South Korea/KNIH04/2020 균주가 있으나, 이 균주에 한정되는 것은 아니다. 상기 SARS-CoV-2 바이러스 GH형의 일 예로는 hCoV-19/Korea/KCDC10847/2020 균주가 있으나, 이 균주에 한정되는 것은 아니다. 상기 SARS-CoV-2 바이러스 GR형의 일 예로는 hCoV-19/South Korea/KUMC17/2020 균주가 있으나, 이 균주에 한정되는 것은 아니다. 일 실시예로, 본 발명의 중화 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질 S1 부위의 614번 아미노산 위치에서 D614G 변이가 일어난 변이 바이러스에도 우수한 중화능을 나타내었다. 일 실시예로, 본 발명의 중화 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 표면 단백질 (RBD)의 변이 단백질 A435S, F342L, G476S, K458R, N354D, V367F, V483A, 및/또는 W436R에 대해 우수한 결합력을 나타내는 것을 포함한다.
일 구체예로, 본 발명의 중화 결합 분자는 현재까지 단리된 사스-코로나바이러스-2 균주, 예를 들어 단리 일시와 장소를 알 수 없는 UNKNOWN-LR757996 균주(Strain), SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027 균주; 2019년 12월 중국에서 단리된 Wuhan-Hu-1 균주; 2019년 12월 23일 최초로 중국에서 단리된 BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-01/2019 균주; 2019년 12월 30일 중국에서 단리된 BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-02/2019 균주, BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-03/2019 균주, BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-04/2019 균주, WIV02 균주, WIV04 균주, WIV05 균주, WIV06 균주, WIV07 균주; 2020년 1월 일본에서 단리된 2019-nCoV/Japan/TY/WK-521/2020 균주, 2019-nCoV/Japan/TY/WK-501/2020 균주, 2019-nCoV/Japan/TY/WK-012/2020 균주, 2019-nCoV/Japan/KY/V-029/2020 균주; 2020년 1월 대한민국에서 단리된 SNU01 균주; 대한민국에서 단리된 BetaCoV/Korea/KCDC03/2020 균주; 2020년 1월 1일 중국에서 단리된 BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-05/2020 균주; 2020년 1월 2일 중국에서 단리된 2019-nCoV WHU02 균주, 2019-nCoV WHU01 균주; 2020년 1월 8일 중국에서 단리된 SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN 균주; 2020년 1월 10일 중국에서 단리된 2019-nCoV_HKU-SZ-002a_2020 균주; 2020년 1월 11일 중국에서 단리된 2019-nCoV_HKU-SZ-005b_2020 균주; 2020년 1월 17일 중국에서 단리된 SARS-CoV-2/Yunnan-01/human/2020/CHN 균주; 2020년 1월 19일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-WA1/2020 균주; 2020년 1월 20일 중국에서 단리된 HZ-1 균주; 2020년 1월 21일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-IL1/2020 균주; 2020년 1월 22일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-CA2/2020 균주, 2019-nCoV/USA-AZ1/2020 균주; 2020년 1월 23일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-CA1/2020 균주; 2020년 1월 25일 호주에서 단리된 Australia/VIC01/2020 균주; 2020년 1월 25일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-WA1-F6/2020 균주, 2019-nCoV/USA-WA1-A12/2020 균주; 2020년 1월 27일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-CA6/2020 균주; 2020년 1월 28일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-IL2/2020 균주; 2020년 1월 29일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-MA1/2020 균주, 2019-nCoV/USA-CA5/2020 균주, 2019-nCoV/USA-CA4/2020 균주, 2019-nCoV/USA-CA3/2020 균주; 2020년 1월 29일 핀란드에서 단리된 nCoV-FIN-29-Jan-2020 균주; 2020년 1월 29일 중국에서 단리된 SARS-CoV-2/IQTC02/human/2020/CHN 균주; 2020년 1월 31일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-WI1/2020 균주; 2020년 1월 31일 타이완에서 단리된 SARS-CoV-2/NTU01/2020/TWN 균주; 2020년 2월 5일 타이완에서 단리된 SARS-CoV-2/NTU02/2020/TWN 균주; 2020년 2월 6일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-CA7/2020 균주; 2020년 2월 7일 스웨덴에서 단리된 SARS-CoV-2/01/human/2020/SWE 균주; 2020년 2월 10일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-CA8/2020 균주; 2020년 2월 11일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-TX1/2020 균주; 2020년 2월 23일 미국에서 단리된 2019-nCoV/USA-CA9/2020 균주; 2020년 2월 28일 브라질에서 단리된 SARS-CoV-2/SP02/human/2020/BRA 균주; 단리 일시와 장소를 알 수 없는 UNKNOWN-LR757995, UNKNOWN-LR757997, UNKNOWN-LR757998, SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020; 2020년 1월 일본에서 단리된 2019-nCoV/Japan/AI/I-004/2020; 2020년 1월 13일 네팔에서 단리된 SARS0CoV-2/61-TW/human/2020/ NPL; 2020년 2월 5일 중국에서 단리된 SARS-CoV-2/IQTC01/human/2020/CHN 균주; 및/또는 대한민국에서 단리된 hCoV-19/South Korea/KUMC17/2020 균주와 향후 단리될 사스-코로나바이러스-2 균주에 대하여 중화 가능하나, 이들 균주에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 돌연변이가 생긴 변이 바이러스에 중화능이 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD 영역 이외의 부위에 돌연변이가 생긴 변이 바이러스에 중화능이 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2 S형, L형, V형, G형, GH형 및/또는 GR형에 중화능이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 614번 아미노산 위치에서 D614G 변이가 생긴 변이 바이러스에 중화능이 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 중화 결합 분자는 하기 1) 내지 76)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이 바이러스에 중화능이 있으나, 이 변이 바이러스에 한정되는 것은 아니다:
1) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 69번 및 70번 아미노산 위치 중 하나 이상에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
2) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 80번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
3) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 222번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
4) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 234번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
5) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 337번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
6) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 338번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
7) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 348번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
8) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 367번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
9) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 370번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
10) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 372번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
11) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 341번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
12) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 342번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
13) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 344번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
14) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 352번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
15) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 354번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
16) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 359번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
17) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 377번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
18) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 378번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
19) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 384번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
20) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 385번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
21) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 393번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
22) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 395번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
23) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 405번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
24) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 406번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
25) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 408번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
26) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 409번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
27) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 414번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
28) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 417번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
29) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 420번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
30) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 435번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
31) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 436번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
32) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 439번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
33) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 440번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
34) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 444번 아미노산 위치에서 K444Q 변이 또는 K444R 변이가 생긴 변이 바이러스;
35) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 445번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
36) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 446번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
37) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 449번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
38) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 452번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
39) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 453번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
40) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 455번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
41) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 456번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
42) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 458번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
43) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 460번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
44) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 471번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
45) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 472번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
46) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 473번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
47) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 475번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
48) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 476번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
49) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 477번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
50) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 478번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
51) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 479번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
52) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 481번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
53) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 482번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
54) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 483번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
55) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 484번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
56) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 485번 아미노산 위치에서 생긴 변이 바이러스;
57) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 486번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
58) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 489번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
59) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 490번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
60) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 493번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
61) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 494번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
62) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 498번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
63) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 499번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
64) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 501번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
65) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 503번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
66) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 505번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
67) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 508번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
68) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 520번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
69) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 521번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
70) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 522번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
71) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 614번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
72) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 677번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
73) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 681번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
74) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 685번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
75) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 701번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스;
및
76) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 1176번 아미노산 위치에서 변이가 생긴 변이 바이러스.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 중화 결합 분자는 하기 1) 내지 76)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이 바이러스에 중화능이 있으나, 이 변이 바이러스에 한정되는 것은 아니다:
1) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 69번 및 70번 아미노산 위치 중 하나 이상이 결실된 변이 바이러스;
2) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 80번 아미노산 위치에서 D80A 변이가 생긴 변이 바이러스;
3) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 222번 아미노산 위치에서 A222V 변이가 생긴 변이 바이러스;
4) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 234번 아미노산 위치에서 N234Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
5) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 337번 아미노산 위치에서 P337S 변이가 생긴 변이 바이러스;
6) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 338번 아미노산 위치에서 F338L 변이가 생긴 변이 바이러스;
7) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 348번 아미노산 위치에서 A348S 변이가 생긴 변이 바이러스;
8) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 367번 아미노산 위치에서 V367F 변이가 생긴 변이 바이러스;
9) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 370번 아미노산 위치에서 N370S 변이가 생긴 변이 바이러스;
10) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 372번 아미노산 위치에서 A372S 변이, A372T 변이 또는 A372V 변이가 생긴 변이 바이러스;
11) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 341번 아미노산 위치에서 V341I 변이가 생긴 변이 바이러스;
12) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 342번 아미노산 위치에서 F342L 변이가 생긴 변이 바이러스;
13) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 344번 아미노산 위치에서 A344S 변이가 생긴 변이 바이러스;
14) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 352번 아미노산 위치에서 A352S 변이가 생긴 변이 바이러스;
15) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 354번 아미노산 위치에서 N354D 변이가 생긴 변이 바이러스;
16) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 359번 아미노산 위치에서 S359N 변이가 생긴 변이 바이러스;
17) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 377번 아미노산 위치에서 F377L 변이가 생긴 변이 바이러스;
18) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 378번 아미노산 위치에서 K378R 변이 또는 K378N 변이가 생긴 변이 바이러스;
19) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 384번 아미노산 위치에서 P384L 변이가 생긴 변이 바이러스;
20) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 385번 아미노산 위치에서 T385A 변이가 생긴 변이 바이러스;
21) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 393번 아미노산 위치에서 T393P 변이가 생긴 변이 바이러스;
22) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 395번 아미노산 위치에서 V395I 변이가 생긴 변이 바이러스;
23) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 405번 아미노산 위치에서 D405V 변이가 생긴 변이 바이러스;
24) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 406번 아미노산 위치에서 E406Q 변이 또는 E406W 변이가 생긴 변이 바이러스;
25) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 408번 아미노산 위치에서 R408I 변이가 생긴 변이 바이러스;
26) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 409번 아미노산 위치에서 Q409E 변이가 생긴 변이 바이러스;
27) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 414번 아미노산 위치에서 Q414A 변이, Q414E 변이 또는 Q414R 변이가 생긴 변이 바이러스;
28) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 417번 아미노산 위치에서 K417N 변이, K417T 변이 또는 K417E 변이가 생긴 변이 바이러스;
29) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 420번 아미노산 위치에서 D420N 변이가 생긴 변이 바이러스;
30) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 435번 아미노산 위치에서 A435S 변이가 생긴 변이 바이러스;
31) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 436번 아미노산 위치에서 W436R 변이가 생긴 변이 바이러스;
32) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 439번 아미노산 위치에서 N439K 변이가 생긴 변이 바이러스;
33) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 440번 아미노산 위치에서 N440K 변이 또는 N440D 변이가 생긴 변이 바이러스;
34) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 444번 아미노산 위치에서 K444Q 변이 또는 K444R 변이가 생긴 변이 바이러스;
35) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 445번 아미노산 위치에서 V445A 변이 또는 V445F 변이가 생긴 변이 바이러스;
36) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 446번 아미노산 위치에서 G446V 변이 또는 G446S 변이가 생긴 변이 바이러스;
37) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 449번 아미노산 위치에서 Y449N 변이가 생긴 변이 바이러스;
38) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 452번 아미노산 위치에서 L452R 변이가 생긴 변이 바이러스;
39) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 453번 아미노산 위치에서 Y453F 변이가 생긴 변이 바이러스;
40) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 455번 아미노산 위치에서 L455F 변이가 생긴 변이 바이러스;
41) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 456번 아미노산 위치에서 F456L 변이 또는 F456E 변이가 생긴 변이 바이러스;
42) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 458번 아미노산 위치에서 K458R 변이 또는 K458Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
43) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 460번 아미노산 위치에서 N460T 변이가 생긴 변이 바이러스;
44) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 471번 아미노산 위치에서 E471Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
45) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 472번 아미노산 위치에서 I472V 변이가 생긴 변이 바이러스;
46) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 473번 아미노산 위치에서 Y473F 변이가 생긴 변이 바이러스;
47) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 475번 아미노산 위치에서 A475V 변이가 생긴 변이 바이러스;
48) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 476번 아미노산 위치에서 G476S 변이가 생긴 변이 바이러스;
49) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 477번 아미노산 위치에서 S477N 변이, S477R 변이, S477I 변이 또는 S477R 변이가 생긴 변이 바이러스;
50) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 478번 아미노산 위치에서 T478K 변이 또는 T478I 변이가 생긴 변이 바이러스;
51) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 479번 아미노산 위치에서 P479S 변이가 생긴 변이 바이러스;
52) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 481번 아미노산 위치에서 N481D 변이가 생긴 변이 바이러스;
53) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 482번 아미노산 위치에서 G482S 변이가 생긴 변이 바이러스;
54) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 483번 아미노산 위치에서 V483A 변이 또는 V483I 변이가 생긴 변이 바이러스;
55) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 484번 아미노산 위치에서 E484K 변이, E484G 변이 또는 E484Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
56) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 485번 아미노산 위치에서 G485S변이가 생긴 변이 바이러스;
57) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 486번 아미노산 위치에서 F486S 변이, F486L 변이, F486V 변이 또는 F486I 변이가 생긴 변이 바이러스;
58) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 489번 아미노산 위치에서 Y489H 변이가 생긴 변이 바이러스;
59) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 490번 아미노산 위치에서 F490S 변이가 생긴 변이 바이러스;
60) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 493번 아미노산 위치에서 Q493K 변이, Q493R 변이, Q493M 변이, Q493Y 변이 또는 Q493A 변이가 생긴 변이 바이러스;
61) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 494번 아미노산 위치에서 S494Q 변이, S494L 변이 또는 S494P 변이가 생긴 변이 바이러스;
62) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 498번 아미노산 위치에서 Q498H 변이가 생긴 변이 바이러스;
63) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 499번 아미노산 위치에서 P499R 변이가 생긴 변이 바이러스;
64) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 501번 아미노산 위치에서 N501Y 변이, N501T 변이 또는 N501F 변이가 생긴 변이 바이러스;
65) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 503번 아미노산 위치에서 V503F 변이가 생긴 변이 바이러스;
66) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 505번 아미노산 위치에서 Y505C 변이가 생긴 변이 바이러스;
67) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 508번 아미노산 위치에서 Y508H 변이가 생긴 변이 바이러스;
68) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 520번 아미노산 위치에서 A520S 변이 또는 A520V 변이가 생긴 변이 바이러스;
69) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 521번 아미노산 위치에서 P521R 변이 또는 P521S 변이가 생긴 변이 바이러스;
70) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 522번 아미노산 위치에서 A522S 변이 또는 A522V 변이가 생긴 변이 바이러스;
71) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 614번 아미노산 위치에서 D614G 변이가 생긴 변이 바이러스;
72) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 677번 아미노산 위치에서 Q677H 변이가 생긴 변이 바이러스;
73) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 681번 아미노산 위치에서 P681H 변이 또는 P681R 변이가 생긴 변이 바이러스;
74) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 685번 아미노산 위치에서 R685H 변이가 생긴 변이 바이러스;
75) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 701번 아미노산 위치에서 A701V 변이가 생긴 변이 바이러스;
및
76) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 1176번 아미노산 위치에서 V1176F 변이가 생긴 변이 바이러스.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 결합 분자에 약물이 추가로 부착될 수 있다. 본 발명에 있어, 본 발명에 따른 결합 분자는 약제가 결합된 항체-약물 접합체(conjugate)의 형태로 사용될 수 있다. 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체(ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 상기 약물 모이어티를 감염된 세포에 표적화 전달할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 투여하게 되면, 정상 세포에 대해서도 허용될 수 없는 수준의 독성이 야기될 수 있기 때문이다. 약물-연결성 및 약물-방출성 뿐만 아니라 폴리클로날 및 모노클로날 항체(mAb)의 선택성을 높임으로써 ADC의 최대 효능과 최소 독성을 개선할 수 있다.
약물 모이어티를 항체에 부착시키는, 예를 들어 공유 결합을 통하여 연결시키는 통상적인 수단으로는, 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 수많은 부위에 부착되는 불균질한 분자 혼합물이 유발된다. 예를 들어, 세포독성 약물을 전형적으로, 종종 항체의 수많은 리신 잔기를 통하여 항체와 접합시켜 불균질한 항체-약물 접합체 혼합물을 생성킬 수 있다. 반응 조건에 따라서, 이러한 불균질한 혼합물은 전형적으로, 약물 모이어티에 부착된 항체 분포도가 0 내지 약 8 이상이다. 또한, 특별한 정수 비의 약물 모이어티 대 항체를 수반한 접합체의 각 아군은, 약물 모이어티가 항체 상의 각종 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질한 혼합물이다. 항체는 크고, 복잡하며 구조적으로 다양한 생체 분자이고, 종종 많은 반응성 관능기를 갖고 있다. 링커 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도 및 조용매와 같은 요인들에 의해 좌우된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 항체의 아미노산 서열이 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 본 발명에 있어, ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며, 이들은 본 발명의 핵산 분자에 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다. 본 발명에 있어, 상기 발현 벡터로는 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 벡터(한국등록특허 제10-1076602호 참조) 및 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 및 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 선택된 발현 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하며, 발현 벡터의 선택은 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 본 발명에 있어, 숙주세포로의 벡터 도입은 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터도 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선택되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명에 있어, 본 발명의 결합 분자의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 (또는 태그 서열)을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어, 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 형질전환되어, SARS-CoV-2에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 세포주를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 세포주는 CHO 세포, F2N 세포, COS 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, HT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 및 HEK293T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어, 본 발명의 조성물은 상기 결합 분자 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업자에게 이미 잘 알려져 있는 부형제다.
본 발명의 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물은, 상기 결합 분자에 대한 설명이 그대로 적용된다.
본 발명의 일 구체예에 있어, 본 발명의 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물은, 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 것으로, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 돌연변이가 생긴 변이 바이러스에 중화능이 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 있어, 본 발명의 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물은, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD 영역 이외의 부위에 돌연변이가 생긴 변이 바이러스에 중화능이 있는 것을 포함하며, 사스-코로나바이러스-2 S형, L형, V형, G형, GH형 또는 GR형에 중화능이 있는 것을 포함한다.
본 발명에 있어, 본 발명의 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물은, 하기 1) 내지 76)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이 바이러스를 중화하기 위한 것일 수 있다:
1) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 69번 및 70번 아미노산 위치 중 하나 이상이 결실된 변이 바이러스;
2) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 80번 아미노산 위치에서 D80A 변이가 생긴 변이 바이러스;
3) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 222번 아미노산 위치에서 A222V 변이가 생긴 변이 바이러스;
4) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 234번 아미노산 위치에서 N234Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
5) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 337번 아미노산 위치에서 P337S 변이가 생긴 변이 바이러스;
6) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 338번 아미노산 위치에서 F338L 변이가 생긴 변이 바이러스;
7) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 348번 아미노산 위치에서 A348S 변이가 생긴 변이 바이러스;
8) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 367번 아미노산 위치에서 V367F 변이가 생긴 변이 바이러스;
9) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 370번 아미노산 위치에서 N370S 변이가 생긴 변이 바이러스;
10) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 372번 아미노산 위치에서 A372S 변이, A372T 변이 또는 A372V 변이가 생긴 변이 바이러스;
11) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 341번 아미노산 위치에서 V341I 변이가 생긴 변이 바이러스;
12) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 342번 아미노산 위치에서 F342L 변이가 생긴 변이 바이러스;
13) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 344번 아미노산 위치에서 A344S 변이가 생긴 변이 바이러스;
14) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 352번 아미노산 위치에서 A352S 변이가 생긴 변이 바이러스;
15) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 354번 아미노산 위치에서 N354D 변이가 생긴 변이 바이러스;
16) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 359번 아미노산 위치에서 S359N 변이가 생긴 변이 바이러스;
17) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 377번 아미노산 위치에서 F377L 변이가 생긴 변이 바이러스;
18) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 378번 아미노산 위치에서 K378R 변이 또는 K378N 변이가 생긴 변이 바이러스;
19) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 384번 아미노산 위치에서 P384L 변이가 생긴 변이 바이러스;
20) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 385번 아미노산 위치에서 T385A 변이가 생긴 변이 바이러스;
21) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 393번 아미노산 위치에서 T393P 변이가 생긴 변이 바이러스;
22) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 395번 아미노산 위치에서 V395I 변이가 생긴 변이 바이러스;
23) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 405번 아미노산 위치에서 D405V 변이가 생긴 변이 바이러스;
24) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 406번 아미노산 위치에서 E406Q 변이 또는 E406W 변이가 생긴 변이 바이러스;
25) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 408번 아미노산 위치에서 R408I 변이가 생긴 변이 바이러스;
26) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 409번 아미노산 위치에서 Q409E 변이가 생긴 변이 바이러스;
27) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 414번 아미노산 위치에서 Q414A 변이, Q414E 변이 또는 Q414R 변이가 생긴 변이 바이러스;
28) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 417번 아미노산 위치에서 K417N 변이, K417T 변이 또는 K417E 변이가 생긴 변이 바이러스;
29) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 420번 아미노산 위치에서 D420N 변이가 생긴 변이 바이러스;
30) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 435번 아미노산 위치에서 A435S 변이가 생긴 변이 바이러스;
31) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 436번 아미노산 위치에서 W436R 변이가 생긴 변이 바이러스;
32) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 439번 아미노산 위치에서 N439K 변이가 생긴 변이 바이러스;
33) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 440번 아미노산 위치에서 N440K 변이 또는 N440D 변이가 생긴 변이 바이러스;
34) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 444번 아미노산 위치에서 K444Q 변이 또는 K444R 변이가 생긴 변이 바이러스;
35) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 445번 아미노산 위치에서 V445A 변이 또는 V445F 변이가 생긴 변이 바이러스;
36) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 446번 아미노산 위치에서 G446V 변이 또는 G446S 변이가 생긴 변이 바이러스;
37) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 449번 아미노산 위치에서 Y449N 변이가 생긴 변이 바이러스;
38) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 452번 아미노산 위치에서 L452R 변이가 생긴 변이 바이러스;
39) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 453번 아미노산 위치에서 Y453F 변이가 생긴 변이 바이러스;
40) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 455번 아미노산 위치에서 L455F 변이가 생긴 변이 바이러스;
41) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 456번 아미노산 위치에서 F456L 변이 또는 F456E 변이가 생긴 변이 바이러스;
42) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 458번 아미노산 위치에서 K458R 변이 또는 K458Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
43) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 460번 아미노산 위치에서 N460T 변이가 생긴 변이 바이러스;
44) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 471번 아미노산 위치에서 E471Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
45) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 472번 아미노산 위치에서 I472V 변이가 생긴 변이 바이러스;
46) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 473번 아미노산 위치에서 Y473F 변이가 생긴 변이 바이러스;
47) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 475번 아미노산 위치에서 A475V 변이가 생긴 변이 바이러스;
48) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 476번 아미노산 위치에서 G476S 변이가 생긴 변이 바이러스;
49) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 477번 아미노산 위치에서 S477N 변이, S477R 변이, S477I 변이 또는 S477R 변이가 생긴 변이 바이러스;
50) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 478번 아미노산 위치에서 T478K 변이 또는 T478I 변이가 생긴 변이 바이러스;
51) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 479번 아미노산 위치에서 P479S 변이가 생긴 변이 바이러스;
52) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 481번 아미노산 위치에서 N481D 변이가 생긴 변이 바이러스;
53) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 482번 아미노산 위치에서 G482S 변이가 생긴 변이 바이러스;
54) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 483번 아미노산 위치에서 V483A 변이 또는 V483I 변이가 생긴 변이 바이러스;
55) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 484번 아미노산 위치에서 E484K 변이, E484G 변이 또는 E484Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
56) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 485번 아미노산 위치에서 G485S변이가 생긴 변이 바이러스;
57) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 486번 아미노산 위치에서 F486S 변이, F486L 변이, F486V 변이 또는 F486I 변이가 생긴 변이 바이러스;
58) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 489번 아미노산 위치에서 Y489H 변이가 생긴 변이 바이러스;
59) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 490번 아미노산 위치에서 F490S 변이가 생긴 변이 바이러스;
60) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 493번 아미노산 위치에서 Q493K 변이, Q493R 변이, Q493M 변이, Q493Y 변이 또는 Q493A 변이가 생긴 변이 바이러스;
61) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 494번 아미노산 위치에서 S494Q 변이, S494L 변이 또는 S494P 변이가 생긴 변이 바이러스;
62) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 498번 아미노산 위치에서 Q498H 변이가 생긴 변이 바이러스;
63) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 499번 아미노산 위치에서 P499R 변이가 생긴 변이 바이러스;
64) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 501번 아미노산 위치에서 N501Y 변이, N501T 변이 또는 N501F 변이가 생긴 변이 바이러스;
65) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 503번 아미노산 위치에서 V503F 변이가 생긴 변이 바이러스;
66) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 505번 아미노산 위치에서 Y505C 변이가 생긴 변이 바이러스;
67) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 508번 아미노산 위치에서 Y508H 변이가 생긴 변이 바이러스;
68) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 520번 아미노산 위치에서 A520S 변이 또는 A520V 변이가 생긴 변이 바이러스;
69) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 521번 아미노산 위치에서 P521R 변이 또는 P521S 변이가 생긴 변이 바이러스;
70) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 522번 아미노산 위치에서 A522S 변이 또는 A522V 변이가 생긴 변이 바이러스;
71) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 614번 아미노산 위치에서 D614G 변이가 생긴 변이 바이러스;
72) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 677번 아미노산 위치에서 Q677H 변이가 생긴 변이 바이러스;
73) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 681번 아미노산 위치에서 P681H 변이 또는 P681R 변이가 생긴 변이 바이러스;
74) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 685번 아미노산 위치에서 R685H 변이가 생긴 변이 바이러스;
75) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 701번 아미노산 위치에서 A701V 변이가 생긴 변이 바이러스;
및
76) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 1176번 아미노산 위치에서 V1176F 변이가 생긴 변이 바이러스.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2), 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질, 더욱 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질의 RBD(Receptor Binding Domain)와 표적 세포의 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2) 수용체의 결합을 억제하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2), 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질, 더욱 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질의 RBD(Receptor Binding Domain)의 결합에 표 1의 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 결합 분자와 경쟁하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물은, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD의 결합에 표 2의 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 결합 분자와 경쟁하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에 있어, 본 발명의 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 결합 분자와 함께 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 표면의 N 단백질(Nucleocapsid protein, N protein)에 결합하는 결합 분자를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 결합 분자와 함께 인터페론, 항-S 단백질 단일클론 항체, 항-S 단백질 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 폴리머라제 저해제, siRNA 제제 또는 치료백신을 항바이러스 약물로써 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어, 본 발명의 결합 분자를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제 등의 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어, 본 발명의 조성물을 인간을 포함하는 포유동물에게 투여함으로써 SARS-CoV-2 감염 또는 SARS-CoV-2 감염에 의해 유발되는 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 결합 분자(예, 항체)의 투여량은 처리되는 대상, 질병 또는 상태의 심각도, 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에서, 본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 표면의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)에 결합하는 결합 분자를 포함하는 면역크로마토그래피 분석용 스트립을 제공한다. 본 발명에 있어, 상기 면역크로마토그래피 분석용 스트립은 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein, N protein)에 결합하는 결합 분자를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 코로나바이러스는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2), 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63), 인간 코로나바이러스 HKU1 및 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어, 상기 면역크로마토그래피 분석용 스트립은 i) 지지체; ii) 검체 패드; iii) 컨쥬게이트 패드; iv) 신호 검출 패드; 및 v) 흡수 패드를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 있어 상기 면역크로마토그래피 분석용 스트립은
i) 지지체;
ii) 분석하고자 하는 검체를 수용하고 버퍼 투입부 및 검체 투입부를 구비하는 검체 패드;
iii) 상기 검체 패드에서 유입된 검체에 함유되어 있는 코로나바이러스와 특이적으로 결합하는 결합 분자를 함유하는, 컨쥬게이트 패드;
iv) 상기 검체에 코로나바이러스가 존재하는지 여부를 검출하는 신호검출부와 분석 물질의 존재 유무와 관계없이 검체가 흡수 패드로 이동하였는지 여부를 확인하는 대조부를 포함하는 신호 검출 패드; 및
v) 신호 검출 반응이 종료된 검체를 흡수하는 흡수 패드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어, 본 발명에 따른 스트립은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 표면의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)에 결합하는 결합 분자를 컨쥬게이트 패드 및 신호 검출 패드에 각각 포함할 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 컨쥬게이트 패드와 신호 검출 패드에 포함된 SARS-CoV-2 S 단백질 결합 분자는 동일하거나, 다를 수 있다. 또한, 본 발명에 있어, 상기 컨쥬게이트 패드와 신호 검출 패드에 포함된 SARS-CoV-2 S 단백질 결합 분자는 앞서 상술한 서열을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석용 스트립에 있어서, 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 결합 분자는 금속 입자, 라텍스 입자, 형광물질 또는 효소로 라벨링될 수 있다. 일 예로서, 상기 금속 입자는 금 입자일 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 금 입자는 금 콜로이드 입자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 상세히, 본 발명에 있어, 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석용 스트립의 컨쥬게이트 패드에 본 발명의 결합 분자는 검출 가능하게 표식될 수 있다. 생분자들을 표식시키는데 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 본 발명에 있어, 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 사용될 수 있는 표식은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 본 발명에 있어, 표식 방법으로는 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어, 검출 방법으로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 검출 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 본 발명에 있어, 상기 검출 분석법의 일 예로웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 또는 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.
본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석용 스트립에 있어서, 상기 검출은 육안, 광학, 전기화학, 또는 전기전도도에 의해 판독될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로, 본 발명은 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석용 스트립을 포함하는, 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어, 본 발명의 진단용 키트는 샘플과 본 발명에 따른 결합 분자를 접촉시킨 후, 반응을 확인하여 SARS-CoV-2의 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 샘플은 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로, 본 발명은 상기 진단용 키트를 이용하여 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로, 본 발명은 상기 진단용 키트를 이용하여 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19) 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어, 본 발명의 진단용 키트는 샘플과 본 발명에 따른 결합 분자를 접촉시킨 후, 반응을 확인하여 SARS-CoV-2의 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 샘플은 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 본 발명에 따른 결합 분자; 및
b) 용기
를 포함하는 SARS-CoV-2로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단, 예방 또는 치료용 키트에 있어서, 상기 키트 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명에 있어, 본 발명의 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 상기 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)으로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 본 발명에 따른 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 진단, 예방, 또는 치료 방법은 항-바이러스 약물, 바이러스 진입 억제제 또는 바이러스 부착 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프와의 결합 여부를 확인하여, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 선별하는 방법으로서, 상기 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함하고, 상기 에피토프 및 결합 분자가 결합을 보이는 경우 상기 결합 분자를 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다. 여기서, 본 발명에 따른 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 여기서 '결합 분자'는, 본 명세서에서 상술한 결합 분자 관련 일체의 내용이 그대로 적용된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프와의 결합 여부를 확인하여, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함하고, 상기 에피토프 및 결합 분자가 결합을 보이는 경우 상기 결합 분자를 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다. 여기서, 본 발명에 따른 결합 분자의 에피토프는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 여기서 '결합 분자'는, 본 명세서에서 상술한 결합 분자 관련 일체의 내용이 그대로 적용된다.
이하 본 발명에서 사용되는 용어를 다음과 같이 정의한다.
본 발명에 있어, 용어 "결합 분자"는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로불린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로불린인 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(spike protein)과 결합에 있어서, 온전한(intact) 이뮤노글로불린과 경쟁하는 이뮤노글로불린 단편을 포함하는 가변성 도메인, 효소, 수용체, 단백질을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로불린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 본 발명에 있어, 상기 항원-결합 단편은 항체의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어, 용어 "항원-결합 단편"은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디, 테트라바디, 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로불린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 본 발명에 있어, 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 단편 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있는 생성 방법을 의미한다.
본 발명에 있어, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 용인 가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 항체와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 본 발명에 있어, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형의 다른 성분과 양립할 수 있다.
본 발명에 있어, 용어 "치료학적으로 유효한 양"은 SARS-CoV-2의 노출 전 또는 노출 후에 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 결합 분자의 양을 나타낸다.
본원에 기재된 상기 각 특징들은 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 각 특징들이 특허청구범위의 서로 다른 종속항에 기재된다는 사실이 이들이 조합되어 사용될 수 없음을 나타내는 것은 아니다.
본 발명의 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질의 RBD 내 특정 에피토프에 특이적으로 결합하고, 우수한 결합 능력을 가지며, 사스-코로나바이러스-2에 우수한 중화 효과를 가지므로, 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)에 대한 진단, 예방 또는 치료에 매우 유용하다.
도 1a는 본 발명의 결합 분자를 이용한 페렛 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 Vero 세포를 이용하여 페렛의 비강 세척액 샘플 내 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 결합 분자를 이용한 페렛 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 qRT-PCR을 이용하여 페렛의 비강 세척액, 타액 및 직장 스왑 샘플 내 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 1c는 본 발명의 결합 분자를 이용한 페렛 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 Vero 세포를 이용하여 페렛의 비갑개 조직 및 폐 조직 내 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 1d는 본 발명의 결합 분자를 이용한 페렛 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 qRT-PCR을 이용하여 페렛의 비갑개 조직 및 폐 조직 내 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 결합 분자를 이용한 페렛 동물 실험에서 SARS-CoV-2 바이러스 감염 3일째와 7일째 부검 후 페렛의 폐 조직을 관찰한 현미경 사진이다.
도 3a는 본 발명의 결합 분자를 이용한 골든시리안햄스터 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 감염 전 및 후 6일 동안 매일 각 군의 개체별 체중을 평가한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 결합 분자를 이용한 골든시리안햄스터 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 qRT-PCR을 이용하여 골든시리안햄스터의 폐 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 3c는 본 발명의 결합 분자를 이용한 골든시리안햄스터 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 qRT-PCR을 이용하여 골든시리안햄스터의 비갑개 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 3d는 본 발명의 결합 분자를 이용한 골든시리안햄스터 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 qRT-PCR을 이용하여 골든시리안햄스터의 십이지장 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 3e는 본 발명의 결합 분자를 이용한 골든시리안햄스터 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 Vero 세포를 이용하여 골든시리안햄스터의 폐 조직의 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 결합 분자를 이용한 마우스 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 감염 전 및 후 6일 동안 매일 각 군의 개체별 체중을 평가한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 결합 분자를 이용한 마우스 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 Vero 세포를 이용하여 마우스의 폐 조직의 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 4c는 본 발명의 결합 분자를 이용한 마우스 동물 실험 중 SARS-CoV-2 바이러스 접종 후 Vero 세포를 이용하여 마우스의 비강세척액의 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 5a는 본 발명의 결합 분자를 이용한 페렛 동물 실험 중 SARS-CoV-2 wild-type 및 변이 바이러스(B.1.351) 감염 전 및 후 각각 6일, 4일동안 매일 각 군의 개체별 체중을 평가한 결과이다.
도 5b는 본 발명의 결합 분자를 이용한 패렛 동물 실험 중 SARS-CoV-2 wild-type 및 변이 바이러스(B.1.351) 접종 후 qRT-PCR을 이용하여 페렛의 비강 세척액, 비갑개, 폐 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 5c는 본 발명의 결합 분자를 이용한 패렛 동물 실험 중 SARS-CoV-2 wild-type 및 변이 바이러스(B.1.351) 접종 후 Vero 세포를 이용하여 페렛의 비강 세척액, 비갑개, 폐 바이러스 역가를 측정한 결과이다.
도 6a는 본 발명의 결합 분자를 이용한 브라질 변이 바이러스에 대한 마우스 중화능 평가 실험 결과로, 본 발명의 결합 분자 투여에 따른 개체군들의 체중 변화를 나타낸 결과이다 (도 6a에서, a는 p<0.0001의 대조군과 투여군 (pooled) 간의 유의 수준을 나타내며; b는 p<0.01에서 p<0.05의 대조군과 80 mg/kg 투여군 간의 유의 수준을 나타내며; c는 p<0.0001에서 p<0.01의 대조군과 5, 20, 40, 80 mg/kg 투여군 간의 유의 수준을 나타내며; d는 p<0.0001에서 p<0.001의 대조군과 5, 20, 40, 80 mg/kg 투여군 간의 유의 수준을 나타낸다.).
도 6b는 본 발명의 결합 분자를 이용한 브라질 변이 바이러스에 대한 마우스 중화능 평가 실험 결과로, 플라크 분석으로 측정한 폐 조직에서의 바이러스 역가를 나타낸 결과이다 (도 6b에서, *과 ****는 각각 p<0.05와 p<0.0001의 대조군과 투여군 간의 유의 수준을 나타낸다.).
도 6c는 본 발명의 결합 분자를 이용한 브라질 변이 바이러스에 대한 마우스 중화능 평가 실험 결과로, 플라크 분석으로 측정한 비강세척액에서의 바이러스 역가를 나타낸 결과이다.
도 7a는 X선 회절분석법을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 No. 139 항체 분절이 SARS-CoV-2 RBD 단백질 상에 결합하는 아미노산 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 SARS-CoV-2 RBD / ACE2 단백질 복함체 구조 (PDB코드, 6LZG)를 나타낸 것이다.
도 7c는 SARS-CoV-2 RBD / No. 139 항체와 SARS-CoV-2 RBD / ACE2 를 슈퍼임포즈 (superimpose)한 그림을 나타낸 것이다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따른 No. 139 항체가 SARS-CoV-2 RBD 단백질에 결합하는 에피토프 위치를 RBD 공간 구조 위에 표시한 것이다.
도 7e는 ACE2가 SARS-CoV-2 RBD에 결합하는 공간적인 위치를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 No. 139 항체의 중쇄 CDR 1/2/3과 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 상세 결합을 나타낸 것이다.
도 9는 정제된 다양한 재조합 SARS-CoV-2-RBD 단백질에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 No. 139 항체의 결합친화도를 결정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 크기 배제 크로마토그래피법(Size Exclusion Chromatography, SEC-HPLC)을 이용하여, 항체의 비정상적인 파편 (Fragment, LMW) 또는 응집 (Aggregation, HMW)의 발생 유무, 정상 항체의 항체 구조의 비율을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 모세관 전기영동 분석 (Capillary Electrophoresis, CE)을 통해서 비환원 조건 (Non-reduced condition)에서의 Intact IgG의 순도 비율과, 환원 조건 (Reduced condition)에서의 항체 중쇄/경쇄합 비율 (Sum of Heavy & Light Chain)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 No. 139 항체의 결합 특이성을 Octet 분석을 진행하여 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 No. 139 항체의 작용 기전 (mechanism of action)을 Octet을 이용하여 Biolayer interference (BLI) 분석을 진행하여 평가한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되지 않는다.
본 발명에서 인용된 문헌 및 본 출원인이 기출원한 한국등록특허 제10-2205028호 및 PCT국제출원 PCT/KR2021/003498는 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예 1: SARS-CoV-2 회복 환자의 혈액으로부터 PBMC 분리
혈액의 공여자는 2020년 SARS-CoV-2에 감염되었음을 확진 받고 치료를 통하여 더 이상 바이러스가 검출되지 않은 사람들이다. 공여자 선정과 채혈 과정은 임상시험심사 위원회(IRB)의 승인을 받고 이루어졌다. 공여자 선정 후 약 30㎖의 전혈을 채혈하고 Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare) 방법을 사용하여 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. 분리된 PBMC는 인산 완충용액으로 2회 세척한 후, 냉동 배지(RPMI:FBS:DMSO = 5:4:1)로 1x107cells/㎖ 농도로 맞추어 액체 질소 탱크(Liquid Nitrogen Tank)에 보관하였다.
실시예 2: 항체 디스플레이된 파아지 라이브러리(phage library) 제작
실시예 1에서 분리한 PBMC에서 Trizol Reagent(Invitrogen)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 후 the SuperScriptTM III First-Strand cDNA synthesis system(Invitrogen, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA로부터 항체 라이브러리의 제작은 선행문헌을 참고하였다(Barbas C. et. al. Phage display a laboratory manual. 2001. CSHL Press). 간단히 기술하면 합성된 cDNA로부터 High fidelity Taq polymerase(Roche)와 디제너레이티브 프라이머 세트(degenerative primer set)(IDT)를 이용하여 항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역을 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 증폭하였다. 분리된 경쇄와 중쇄의 가변영역 절편들이 무작위 조합으로 하나의 서열로서 연결되도록 overlap PCR 방법으로 scFv 형태의 유전자로 만들어 증폭한 후 제한 효소로 절단하고 1% 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)과 gel extraction kit(Qiagen) 방법을 사용하여 scFv를 분리하였다. 파아지 벡터도 동일한 제한 효소로 절단하고 분리한 뒤 상기 scFv 유전자와 섞고 T4 DNA ligase(New England Biolab)를 넣은 후 16℃에서 12시간 이상 반응하였다. 반응액을 ER2738 수용성 세포(competent cell)와 섞고 전기천공(electroporation) 방법으로 형질 전환하였다. 형질 전환된 ER2738은 진탕 배양 후 VCSM13 helper phage(Agilent Technologies)를 넣고 12시간 이상 배양하였다.
실시예 3: 파아지 효소 면역분석을 이용한 선별
실시예 2 에서 제작한 파아지 라이브러리 배양액을 원심 분리하여 숙주세포를 제거한 뒤 4% PEG와 0.5M NaCl을 넣고 원심 분리하여 파아지를 침강 시키고 상층액을 제거하였다. 침강된 파아지를 1% BSA/TBS 에 희석하여 파아지 라이브러리를 얻었다. 이후 다양한 SARS-CoV-2 Spike 단백질(이하, S 단백질)들에 대한 결합 및 해리 반응으로 패닝(panning)을 독립적으로 진행하여 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 결합능력을 갖는 scFv-파아지를 분리하였다. SARS-CoV-2 S 단백질의 한 부분인 RBD(Receptor binding domain) 영역(residues N331 to V524 on S1 glycoprotein)이 결합된 ELISA 플레이트(plate)에 파아지 라이브러리를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응액을 제거한 뒤 ELISA 플레이트를 0.05% tween 20이 포함된 PBS로 세척한 뒤 60㎕ 의 0.1M glycine-HCl(pH 2.2)를 넣어 항원에 결합한 scFv-파아지를 떼어내고 2M Tris(pH 9.1)를 이용하여 중화하였다. 중화된 scFv-파아지는 ER2738에 감염시킨 뒤 보조(helper) 파아지를 넣고 배양하여 다음 번 패닝에 사용하였다. 감염시킨 ER2738의 일부는 보조 파아지를 넣기 전에 LB 플레이트에 도말하여 다음날 콜로니(colony)를 얻었다.
각 패닝마다 형성된 콜로니는 96-well deep well plate(Axygen)에 담긴 배양액에 넣어 진탕 배양하고, OD600이 0.7 이상의 값이 되었을 때 보조 파아지를 넣은 후 37℃에서 12시간 이상 진탕 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 숙주세포를 제거하고 scFv-파아지를 포함하는 상등액을 준비하였다.
준비된 scFv-파아지 상등액을 6% BSA/PBS 와 1:1 희석한 뒤 SARS-CoV-2 S 단백질들을 흡착 후 블로킹(blocking)한 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 넣고 37℃에서 2시간 동안 정치하였다. 각 웰을 0.05% Tween 20가 포함된 PBS로 3회 세척한 뒤 HRP(겨자무과산화효소, horseradish peroxidase)가 표지된 항 M13 항체를 넣고 37℃에서 1시간 동안 정치하였다. 각 웰을 0.05% Tween 20가 포함된 PBS로 3회 세척한 뒤 ABTS(2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt)를 넣고 405nm 에서의 흡광도를 측정하여 SARS-CoV-2 S 항원 단백질에 대한 결합력을 갖는 scFv-파아지를 선별하였다.
실시예 4: scFv-Fc 항체 분절의 결합능 확인
실시예 3에서 선별된 scFv-파아지는 이후 콜로니를 진탕 배양하여 DNA를 얻은 다음 항체 가변영역에 대한 서열을 분석하였다. 이 중에서 아미노산 서열로서 중복된 클론을 제외하고 선정된 scFv-파아지를 후보 항체 동물 세포 주에서의 발현능력을 평가하기 위하여 scFv 항체 분절(scFv-Fc) 형태로 벡터에 클로닝하였다. 형질도입 시약(Transfection reagent)을 이용하여 CHO 세포에 형질 감염시켜 발현시킨 후 그 배양액을 이용하여 scFv-Fc 항체 분절의 SARS-CoV-2의 S 단백질 2종에 대한 결합 능력을 ELISA로 확인하였다. 간단하게는, ELISA 플레이트에 SARS-CoV-2 S 단백질들을 붙이고 발현된 항체 분절을 넣어주었다. 결합하지 않은 항체를 0.05% Tween 20가 포함된 PBS로 씻어낸 후 HRP(겨자무과산화효소, horseradish peroxidase)가 결합된 항-인간 IgG 항체를 이용하여 항원과 결합한 항체 분절들을 선별 및 평가하였다.
그 결과, 하기 표 3에서와 같이 다수의 항체 분절들이 SARS-CoV-2의 S 단백질들에 대해 특이적으로 결합하는 것을 확인하고, 양성 대조군 항체와 대비하여 상대적인 값으로 결합력을 표기하였다. 하기 표 3에서 양성 대조군 항체는 SARS-CoV-2 S 단백질에 강하게 결합한다고 알려진 항체이다(Xiaolong Tian et al., Emerg Microbes Infect. 2020 Feb 17;9(1):382-385). 하기 표 3에서 No.는 상기 표 1 및 표 2에 기재된 각 결합 분자의 No.와 동일한 결합 분자를 지칭한다.
No. 결합력 No. 결합력 No. 결합력
1 0.97 108 1.82 243 1.54
2 0.94 113 1.44 244 1.42
3 1.48 118 1.36 245 1.28
4 1.43 128 1.40 246 1.31
6 1.06 129 1.42 247 1.31
7 1.20 139 1.36 249 0.34
8 1.16 152 1.18 250 0.90
9 0.97 195 0.14 251 0.92
13 1.17 196 1.94 252 0.94
14 0.89 197 2.09 254 1.26
31 1.35 201 2.08 256 0.47
44 0.95 203 1.06 259 1.14
46 1.60 204 1.15 260 0.81
47 1.67 205 1.23 261 0.92
48 1.17 206 1.03 263 1.46
49 0.87 207 1.26 265 0.97
53 1.04 208 2.51 266 0.80
55 0.98 209 1.43 268 1.09
56 1.23 212 1.56 270 0.95
65 1.32 213 1.70 271 0.79
66 1.75 214 1.19 274 1.01
69 1.44 215 1.12 275 0.85
70 1.34 216 0.97 276 1.00
71 1.20 217 1.47 278 0.70
72 0.65 218 1.13 279 0.57
79 1.16 219 1.29 280 1.32
81 1.63 220 1.66 281 1.36
83 1.14 221 1.23 283 0.38
86 1.41 224 0.79 284 1.08
88 1.59 230 1.03 285 1.25
89 1.37 232 1.01 287 0.80
90 1.47 235 1.25 288 0.27
91 1.29 236 1.50 289 1.08
93 2.86 239 1.45 290 0.75
95 2.29 241 1.39 양성 대조군 항체 1.00
103 1.13 242 1.47
실시예 5. 완전 인간 항체(Full IgG)로 전환 후 항체 발현율 및 항체 결합 특이성 평가
선정된 항체 분절의 유전정보를 이용하여 완전 인간 항체로 변환하고, 실시예 4의 방법으로 항체 배양액을 준비하여, 완전 인간 항체에서의 항원 결합 및 항체 발현량 등을 확인하였다. 상기 바이러스 중화능 평가 결과와 종합하여 106종 중 23종의 완전 인간항체를 선별하였다. 선별된 23종의 완전 인간 항체의 발현량은 하기 표 4와 같다.
No. ug/ml No. ug/ml
89 42.4 152 15.2
90 39.1 217 35.7
91 37.9 218 5.8
93 66.1 230 15.9
95 30.0 260 19.7
103 48.3 270 53.8
108 22.0 271 28.8
113 61.3 274 7.0
118 58.5 275 30.7
128 49.6 281 34.9
129 20.4 284 54.6
139 65.1
실시예 6-1. No. 139 항체의 SARS-CoV-2 슈도변이바이러스에 대한 중화능 평가(1)
SARS-CoV-2 spike D614와 D614G 및 제작한 SARS-CoV-2 spike 변이 슈도바이러스에 대해 No. 139 항체의 중화능 여부를 확인하는 시험을 진행하였다. 상기 SARS-CoV-2 spike 변이 슈도 바이러스는 No. 139 항체의 에피토프(실시예 8-5의 표 12 참조) 중 일부 위치와 논문(A. Baum et al., Science, 2020 Aug 21;369(6506):1014-1018., Korber et al., 2020, Cell 182, 812-827)에 발표된 변이 바이러스를 참고하여 제작하였다. 변이슈도바이러스의 양을 1.73x107 copies로 고정하고, 항체 100 ng/mL 최고 농도로 3배씩 10단계로 희석하여 변이바이러스에 대한 중화능 시험을 수행한 결과, 하기 표 5와 같이 중화능이 확인되었다.
하기 표 5에서, 각 변이 위치는 코로나바이러스 스파이크 단백질 (NCBI ACCESSION 번호: YP_009724390.1, 서열번호 2321)의 N 말단부터 넘버링(numbering) 한 것이다.
No. SARS-CoV-2 변이 pseudovirus Backbone Vector IC50 (ng/mL)
1 D614 - 0.378
2 S494P D614 -
3 R685H D614 0.442
4 S494P+R685H D614 -
5 E484K D614 3.273
6 Q493K D614 -
7 F490S D614 0.873
8 Y449N D614 8.556
9 L455F D614 10.49
10 F456L D614 0.342
11 L452R D614 13.22
12 E406Q D614 1.521
13 K444Q D614 0.397
14 V445A D614 0.676
15 N234Q D614 0.594
16 A475V D614 0.243
17 D614G - 0.352
18 S477N D614G 0.362
19 A222V D614G 0.41
20 V1176F D614G 0.319
21 N439K D614G 0.332
22 Y453F D614G 0.227
실시예 6-2. No. 139 항체의 SARS-CoV-2 슈도변이바이러스에 대한 중화능 평가(2)
SARS-CoV-2의 변이 슈도 바이러스 15종에 대해 No. 139 항체의 중화능 여부를 확인하는 시험을 진행하였다. 여기서, 상기 No. 139 항체는 표 1 및 표 2에 기재된 No. 139 결합 분자를 지칭한다. 상기 SARS-CoV-2 spike 변이 슈도바이러스는 No. 139 항체(CT-P59, Regdanvimab)의 에피토프 중 일부 위치와 논문(A. Baum et al.,Science, 2020 Aug 21;369(6506):1014-1018, Korber et al., 2020, Cell 182, 812-827)에 발표된 변이 바이러스를 참고하여 제작하였다. 슈도변이바이러스의 양을 1.73x107 copies로 고정하고, 항체 1000 ng/mL 최고 농도로 3배씩 10단계로 희석하여 변이바이러스에 대한 중화능 시험을 수행한 결과, 하기 표 6과 같이 중화능이 확인되었다.
하기 표 6에서, 각 변이 위치는 코로나바이러스 스파이크 단백질 (NCBI ACCESSION 번호: YP_009724390.1, 서열번호 2321) 의 N 말단부터 넘버링(numbering) 한 것이다.
No. SARS-CoV-2 변이 pseudovirus IC50 (ng/ml)
1 D614G 10
2 K417N+E484K+N501Y 840
3 501Y.V2 330
4 D614 0.35
5 K417N 0.25
6 E484K 3.27
7 L452R 13.22
8 Y449N 8.56
9 L455F 10.49
10 F456L 0.34
11 Q493K >100
12 S494P >500
13 E406Q 1.52
14 F490S 0.87
15 K417T 0.15
실시예 6-3. No. 139 항체의 SARS-CoV-2 슈도변이바이러스에 대한 중화능 평가(3)
SARS-CoV-2 spike D614G 그리고 제작한 SARS-CoV-2 spike 변이 슈도바이러스에 대해 No. 139 항체의 중화능 여부를 확인하는 시험을 진행하였다. 상기 SARS-CoV-2 spike 변이 슈도 바이러스는 No. 139 항체의 에피토프(실시예 8-5의 표 12 참조) 중 일부 위치와 논문(A. Baum et al., Science, 2020 Aug 21;369(6506):1014-1018., Korber et al., 2020, Cell 182, 812-827., Wang et al.,2021, doi: 10.1038/s41586-021-03398-2.)에 발표된 변이 바이러스를 참고하여 제작하였다. 변이슈도바이러스의 양을 1.73x107 copies로 고정하고, 항체 100 ng/mL 최고 농도로 3배씩 10단계로 희석하여 변이바이러스에 대한 중화능 시험을 수행한 결과, 하기 표 7과 같이 중화능이 확인되었다.
하기 표 7에서, 각 변이 위치는 코로나바이러스 스파이크 단백질 (NCBI ACCESSION 번호: YP_009724390.1, 서열번호 2321) 의 N 말단부터 넘버링(numbering) 한 것이다. 또한, 영국 501Y.V1 (B.1.1.7) 변이, 남아공501Y.V2 (B.1.351) 변이, 브라질 변이 501Y.V3 (P.1), 캘리포니아 변이 (B.1.429), 뉴욕 변이 (B.1.525) 및 뉴욕 변이 (B.1.526)의 위치는 각각 하기 참고 표 A에 나타낸 바와 같다.
No. SARS-CoV-2 변이 pseudovirus Backbone Vector IC50 (ng/ml)
1 D614 - 0.535
2 D614G - 0.219
3 Q493R D614G -
4 K417E D614G 0.156
5 G446V D614G 0.457
6 G476S D614G 0.374
7 F486V D614G 9.9
8 E406W D614G 3.006
9 N440D D614G 0.398
10 P681H D614G 0.392
11 K417N D614G 0.186
12 A701V D614G 0.381
13 D80A D614G 0.372
14 K417N+E484K+N501Y D614G 36.59
15 Q493M D614G 0.83
16 F486I D614G 4.485
17 Y489H D614G 0.434
18 N501Y D614G 1.202
19 HV69-70 del D614G 0.268
20 HV69-70del + N501Y D614G 0.533
21 N501T D614G 0.228
22 N501F D614G 1.044
23 Q677H D614G 0.226
24 Q498H D614G 0.694
25 N460T D614G 0.255
26 F486S D614G 0.608
27 F486L D614G 0.792
28 T478K D614G 0.213
29 K417T D614G 0.154
30 Q493Y D614G 0.27
31 Q493A D614G 1.352
32 A372V D614G 0.305
33 P384L D614G 0.37
34 S494L D614G -
35 501Y.V3 (P.1) D614G 13.45
36 501Y.V2 (B.1.351) D614G 40.36
37 B.1.526 D614G 1.497
38 E484Q+L452R+P681R D614G 11.08
39 영국 (B.1.1.7) D614G 0.358
40 캘리포니아 (B.1.429) D614G 8.7
41 뉴욕 (B.1.525) D614G 1.581
42 S477R D614G 4.126
43 D420N D614G 0.592
44 Y473F D614G 0.4
45 S494Q D614G 153.4
46 E484G D614G 0.564
47 S477N D614G 0.389
48 S494P D614G -
49 Y453F D614G 0.18
50 N439K D614G 0.277
51 A222V D614G 0.244
52 N234Q D614G 0.386
(참고 표 A)
Figure PCTKR2021009475-appb-img-000018
실시예 7. 동물실험을 통한 No. 139 항체(Full IgG)의 SARS-CoV-2 바이러스 중화능 평가
실시예 7-1. 페렛 중화능 평가 실험
SARS-CoV-2 바이러스에 자연 감염되며 인간과 유사한 임상 증상 및 병변을 보이는 동물 모델인 페렛을 이용하여, No. 139 항체의 생체 내 중화능을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
군 구성은 대조군 및 치료군(No. 139 항체 저용량 및 고용량 투여) 총 3군, 군당 5마리로 구성하였으며, SARS-CoV-2 바이러스(NMC-nCoV02) 1x105.5 TCID50/㎖을 비강과 기관지에 각 0.5mL씩 1mL을 접종하였다. 바이러스 접종 1일 후 SARS-CoV-2 바이러스와 무관한 isotype 대조군 항체 30 ㎎/㎏ 혹은 No. 139 항체 3 ㎎/㎏ 또는 30 ㎎/㎏을 단회 정맥 주사하고 7일동안 관찰하였다. 바이러스 감염 전 및 후 7일 동안 매일 각 군의 개체별 임상증상을 평가하였다. 바이러스 감염 후 2, 4, 6일째 각 군의 개체별 페렛 비강 세척액, 타액 및 직장 스왑 샘플을 채취하였으며, Vero 세포를 이용한 방법 및 qRT-PCR을 이용한 방법으로 바이러스 역가를 측정하였다. 또한, 조직 내 바이러스 역가를 평가하기 위해 3일째 각 군당 2마리의 페렛, 7일째 각 군당 3마리의 페렛을 희생시켜 비갑개 및 폐 조직을 확보하였고, 동일한 방법으로 바이러스 역가를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 8에서와 같이, 임상증상에 있어서 모든 군에서 감염 후 2일째부터 기침, 콧물, 활동성 감소의 증상이 관찰되기 시작하였다. 대조군은 감염 후 3일과 4일째 가장 높은 임상 증상 척도를 보이며 시험 종료까지 콧물 및 활동성 감소를 보였다. 반면, No. 139 항체 저용량 및 고용량 투여군에서는 감염 후 2일째 대조군 대비 낮은 임상 증상(콧물, 활동성 감소) 척도가 관찰되었고 6일째에는 임상 증상이 관찰되지 않고 해소되었음을 확인하였다(표 8).
Figure PCTKR2021009475-appb-img-000019
또한, Vero 세포를 이용하여 페렛의 비강 세척액 샘플 내 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 감염 후 2일째 대조군 대비 No. 139 항체 고용량 투여군에서 바이러스 역가가 유의적으로 감소하였고, 6일째 바이러스가 측정되지 않았다 (도 1a).
qRT-PCR을 이용하여 페렛의 비강 세척액, 타액 및 직장 스왑 샘플 내 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 감염 후 2일째 대조군과 비슷한 바이러스 역가를 보였으나 4일째 및 6일째 No. 139 항체 저용량 및 고용량 투여군에서 바이러스 역가가 감소하였다 (도 1b).
Vero 세포를 이용하여 페렛의 비갑개 조직 내 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 No. 139 항체 저용량 투여군에서 감염 후 3일째 바이러스 역가가 감소하였고, No. 139 항체 고용량 투여군에서는 감염 후 3, 7일째 바이러스 역가가 측정되지 않았다. 동일한 방법으로 폐 조직 내 바이러스 역가를 측정한 결과, No. 139 항체 저용량 투여군에서 감염 후 7일째, 고용량 투여군에서 감염 후 3일째 및 7일째 바이러스 역가가 측정되지 않았다 (도 1c).
qRT-PCR을 이용하여 페렛의 비갑개 조직 내 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 No. 139 항체 저용량 및 고용량 투여군에서 감염 후 3일째 및 7일째 바이러스 역가가 감소하였다. 동일한 방법으로 폐 조직 내 바이러스 역가를 측정한 결과, No. 139 항체 저용량 투여군에서는 감염 후 3일째, No. 139 항체 고용량 투여군에서는 감염 후 3일째 및 7일째 바이러스 역가가 감소하였다 (도 1d).
감염 3일째와 7일째, 부검 후 폐 조직을 현미경 관찰하였다. 바이러스 감염 후 3일째 페렛의 폐조직에서의 병리학적 분석 결과, 감염대조군에서는 폐조직 전반적으로 호중구 세포의 증가 및 폐포벽 두께증가의 염증소견이 확인되었고, No. 139 항체 저용량 투여군에서도 감염대조군보다는 적지만 염증소견이 보이는 곳이 확인되었으며, 고용량 투여군에서는 감염대조군 대비 확연하게 염증소견이 감소된 것을 확인하였다.
감염 후 7일째 페렛의 폐조직에서의 병리학적 분석 결과, 감염대조군에서는 감염 후 3일째보다 감소했지만 전반적으로 호중구 세포의 증가 및 폐포벽 두께증가의 염증소견이 유지되었고, No. 139 항체 저용량 및 고용량 투여군에서는 감염대조군보다는 확연하게 염증소견이 감소되었고 국소적인 부분에서만 염증소견이 관찰되었다 (도 2).
실시예 7-2. 골든시리안햄스터 중화능 평가 실험
SARS-CoV-2 바이러스에 자연 감염되며 인간과 유사한 임상 증상 및 병변을 보이는 동물 모델인 골든시리안햄스터를 이용하여, No. 139 항체의 생체 내 중화능을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
군 구성은 대조군 및 치료군 (No. 139 항체 15mg/kg, 30mg/kg, 60 mg/kg 또는 90 mg/kg) 총 5군, 군당 12 마리로 구성하였으며, SARS-CoV-2 바이러스(NMC-nCoV02) 6.4 x 104 PFU/80 μL를 비강에 점종하였다. 바이러스 접종 1일 후 SARS-CoV-2 바이러스와 무관한 PBS 대조군, 혹은 No. 139 항체 15 ㎎/㎏, 30 mg/kg, 60 mg/kg 또는 90 ㎎/㎏을 단회 복강 주사하고 6일동안 관찰하였다. 추가적으로, 바이러스 감염 전 및 후 6일 동안 매일 각 군의 개체별 체중을 평가하였다. 조직 내 바이러스 역가를 측정하기 위해 바이러스 접종 후 2일째, 3일째 및 5일째 각 군당 4 마리를 희생시켜 폐, 비갑개 및 십이지장 조직을 확보하였고, qRT-PCR을 이용하여 폐, 비갑개 및 십이지장 바이러스 역가를 측정하였고, Vero 세포를 이용하여 폐 조직의 생바이러스 역가를 측정하였다.
그 결과, 하기 도 3a 에서와 같이, 바이러스 감염으로 인한 체중감소는 군 간 별다른 차이가 나지 않았다 (도 3a). 또한, qRT-PCR을 이용하여 폐, 비갑개, 십이지장 바이러스 역가를 측정한 결과는 다음과 같다. 폐에서 90mg/kg 투여 시, 접종 후 3일차 사후 검정 결과, 대조군 대비 약 47배 감소하였고, 접종 후 5일차 사후 검정 결과, 30, 60, 90 mg/kg 투여 시, 대조군 대비 순서대로 22, 27, 197배 감소하였다 (도 3b). 비갑개에서 접종 후 2일차 사후 검정 결과, 30 mg/kg 투여 시, 대조군 대비 약 3배 감소하였고, 접종 후 5일차 사후 검정 결과, 15, 30, 60, 90mg/kg 투여 시, 대조군 대비 약 순서대로 11, 11, 16, 12 배 감소하였다 (도 3c). 십이지장에서 접종 후 2일차 사후 검정 결과, 대조군 대비 60, 90 mg/kg 투여 시, 접종 후 5일차 사후 검정 결과 60, 90 mg/kg 투여 시, 대조군과 비교하였을 때 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 (도 3d).
또한 Vero 세포를 이용하여 폐 조직 내 생바이러스 역가를 측정한 결과 도 3e에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 No. 139 항체 90 mg/kg 투여군 1마리를 제외하고는 60 mg/kg 및 90 mg/kg 투여군에서 감염 후 2일째부터 바이러스 역가가 측정되지 않았다. 15 mg/kg 투여군의 경우 2일째에는 바이러스 역가가 측정되지 않았지만, 3일째 및 5일째 한마리에서 바이러스 역가가 측정되었다. 30 mg/kg 투여군의 경우 3일째부터 바이러스 역가가 측정되지 않았다 (도 3e).
실시예 7-3. 마우스 예방능 평가 실험
SARS-CoV-2 바이러스에 자연 감염되며 인간과 유사한 임상 증상 및 병변을 보이는 동물 모델인 TG마우스(B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J [Stock No: 034860 | K18-hACE2] from The Jackson Laboratory)를 이용하여, No. 139 항체의 생체 내 예방능을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
군 구성은 대조군 및 투여군 (No. 139 항체 10 mg/kg, 1mg/kg, 0 mg/kg 또는 0.1 mg/kg) 총 5군, 각각 군당 5 마리 또는 6 마리로 구성하였으며, PBS 혹은 No. 139 항체 0.1 ㎎/㎏, 1 mg/kg, 또는 10 mg/kg 투여 후 24시간 뒤 SARS-CoV-2 바이러스(NMC-nCoV02) 1 x 105 PFU 60μL를 비강에 접종하여 최대 6일간 관찰하였다. 추가적으로, 바이러스 접종 전 및 후 6일 동안 매일 각 군의 개체별 체중을 평가하였다. 조직 내 바이러스 역가를 측정하기 위해 바이러스 접종 후 3일째와 6일째 마우스를 희생시켜 폐조직과 비강세척액을 확보하였고, Vero 세포를 이용한 플라크 분석 (Plaque assay)하여 각 조직의 바이러스 역가를 측정하였다.
그 결과, 대조군에서 2개체가 바이러스 접종 후 2일째에 폐사하였고, 1개체가 6일째에 폐사하였으며, 0.1mg/kg 와 1 mg/kg 투여군에서 각각 1개체가 2일째에 폐사하였다. 초기 폐사(접종 후 2일째)의 경우 CNS에서의 hACE2 단백질 발현으로 인한 뇌염으로 의심되었다.
바이러스 감염으로 인한 체중감소는 1 mg/kg 혹은 10 mg/kg 투여군에서 크게 감소하였다 (도 4a).
또한, 플라크 분석으로 측정한 폐와 비강세척액의 바이러스 역가는 다음과 같다. 0.1, 1, 10mg/kg 투여 시, 접종 후 3일째 대조군 대비 폐 바이러스 역가가 순서대로 9배, 4,079배, 9,007배 감소하였다. 또한, 접종 후 6일째 대조군 대비 폐 바이러스 역가는 순서대로 25배, 478배, 29배 감소하였다 (도 4b).
0.1, 1, 10mg/kg 투여 시, 접종 후 3일째 대조군 대비 비강세척액에서 바이러스 역가가 순서대로 2배, 79배, 1304배 감소하였다. 또한, 접종 후 6일째 대조군 대비 바이러스 역가는 순서대로 1배, 63배, 10배 감소하였다 (도 4c).
실시예 7-4. 남아공 변이 바이러스에 대한 페렛 중화능 평가 실험
SARS-CoV-2 바이러스에 자연 감염되며 인간과 유사한 임상 증상 및 병변을 보이는 동물 모델인 페렛을 이용하여, No. 139 항체의 생체 내 중화능을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 나누어서 진행하였다. 여기서, CT-P59 항체는 No. 139 항체를 지칭한다.
첫번째 시험의 경우, 군 구성은 대조군(부형제 투여) 및 치료군(No. 139 항체 80 mg/kg 또는 160 mg/kg 투여) 총 3군, 군당 6마리로 구성하였으며, 야생형(wild-type) SARS-CoV-2 바이러스(NMC-nCoV02;S-clade) 1x105.5 TCID50/㎖을 비강과 기관지에 각 0.5mL씩 총 1mL을 접종하였다. 부형제 혹은 No. 139 항체 80 mg/kg 또는 160 mg/kg를 바이러스 접종 후 24시간 후 단회 정맥 주사하였으며, 바이러스 접종 전 및 후 6일동안 임상증상 및 체중을 관찰하였다. 바이러스 감염 전(0 dpi) 및 후 2, 4, 6일째 (2,4,6 dpi) 각 군의 개체별 페렛 비강 세척액 샘플을 채취하였으며, Vero 세포를 이용한 방법 및 qRT-PCR을 이용한 방법으로 바이러스 역가를 측정하였다. 또한, 조직 내 바이러스 역가를 평가하기 위해 3일째와 6일째 군당 3마리의 페렛을 희생시켜 비갑개 및 폐 조직을 확보하였고, 동일한 방법으로 바이러스 역가를 측정하였다.
두 번째 시험의 경우, 군 구성은 대조군(부형제 투여) 및 치료군(No. 139 항체 80 mg/kg, 160 mg/kg 투여) 총 3군, 군당 6마리로 구성하였으며, SARS-CoV-2 남아공 변이 바이러스(B.1.351) 1x105.5 TCID50/㎖을 비강과 기관지에 각 0.5mL씩 총 1mL을 접종하였다. 부형제 혹은 No. 139 항체 80 mg/kg 또는 160 mg/kg를 바이러스 접종 후 24시간 후 단회 정맥 주사하였으며, 바이러스 접종 전 및 후 4일동안 임상증상 및 체중을 관찰하였다. 바이러스 감염 전 및 감염 후 2일째 및 4일째 각 군의 개체별 페렛 비강 세척액 샘플을 채취하였으며, Vero 세포를 이용한 방법 및 qRT-PCR을 이용한 방법으로 바이러스 역가를 측정하였다. 또한, 조직 내 바이러스 역가를 평가하기 위해 2일과 4일째 각 군당 3마리의 페렛을 희생시켜 비갑개 및 폐 조직을 확보하였고, 동일한 방법으로 바이러스 역가를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 9와 표 10 에서와 같이, 임상증상에 있어서 SARS-CoV-2 wild-type 혹은 B.1.351을 접종한 모든 군에서 감염 후 2일째부터 기침, 콧물, 활동성 감소 중 하나 이상의 증상이 관찰되기 시작하였다. 대조군은 wild-type 감염의 경우에는 3일째, B.1.351 감염의 경우에는 2일째 가장 높은 임상 증상 척도를 보이며 시험 종료까지 콧물 및 활동성 감소를 보였다. 반면에, No. 139 항체 투여군에서는 모든 군에서 감염 후 2일째부터 대조군 대비 낮은 임상 증상 척도가 관찰되었고, wild-type 감염군의 경우에는 4일째부터 모든 투여 군에서 임상증상이 나타나지 않았으며, B.1.351 감염군의 경우에는 4일째 160 mg/kg 그룹에서 한 마리를 제외한 모든 개체에서 임상 증상이 관찰되지 않고 해소되었음을 확인하였다 (표 9 및 표 10).
Figure PCTKR2021009475-appb-img-000020
Figure PCTKR2021009475-appb-img-000021
도 5a 에서와 같이, 바이러스 감염으로 인한 체중감소는 160 mg/kg 투여군과 대조군 사이에서 Wild-type SARS-CoV-2 감염 후 3일째, 160 mg/kg 투여군과 대조군 사이에서 SARS-CoV-2 변이주(B.1.351) 2일 째 및 80 mg/kg 투여군과 대조군 사이에서 2,3 및4일째 유의성 있는 차이를 보였다 (도 5a). 도 5a의 그래프 내 80 mg/kg 와 대조군 사이의 차이는 *로, 160 mg/kg 와 대조군 사이의 차이는 #으로 표시하였다.
또한, Vero 세포를 이용하여 페렛의 비강 세척액, 비갑개 및 폐 샘플 내 생바이러스 역가를 측정한 결과, 도 5b 에 나타낸 바와 같이, Wild-type SARS-CoV-2 감염 후 2일째부터 대조군 대비 No. 139 항체 투여군에서 비강세척액의 바이러스 역가가 유의적으로 감소하였고, 비갑개에서 3일째부터 감소하였다. 폐에서는 3일째부터 투여군의 바이러스 역가가 정량한계까지 감소하였으며 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보였다. 6일째에는 대조군과 치료군이 유의한 차이를 보이지 않았다. SARS-CoV-2 변이주 (B.1.351) 감염 후 2일째부터 대조군 대비 No. 139 항체 투여군의 비강세척액과 비갑개의 바이러스 역가가 유의적으로 감소하였다. 투여군의 폐 바이러스 역가의 경우. 2일째부터 정량한계에 도달하였으며 대조군 대비 유의적인 감소를 보였고, 4일째 대조군과 치료군의 모든 개체에서 바이러스가 확인되지 않았다(도 5b).
qRT-PCR을 이용하여 페렛의 비강 세척액, 비갑개 및 폐 샘플 내 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, Wild-type SARS-CoV-2 감염 후 비강세척액에서 2, 4 및 6일째 No. 139 항체 투여군과 대조군 사이에서 유의적인 바이러스 역가 차이가 확인되었으며, 투여군의 경우 80 mg/kg 군의 한마리를 제외한 동물에서 감염 후 2일째부터 바이러스 역가가 정량한계까지 감소하였다. 비갑개와 폐에서는 3일부터 바이러스 역가가 정량한계까지 감소하였으며, 대조군 대비 유의한 차이를 보였다. SARS-CoV-2 변이주 (B.1.351) 감염 후에도, 2일째부터 No. 139 항체 투여군에서 비강세척액, 비갑개 및 폐에서의 바이러스 역가가 대조군 대비 유의적으로 감소하였다. 폐의 경우 4일째 대조군과 치료군의 바이러스 역가가 정량한계까지 감소하였다 (도 5c).
실시예 7-5. 브라질 변이 바이러스에 대한 마우스 중화능 평가 실험
SARS-CoV-2 바이러스에 자연 감염되며 인간과 유사한 임상 증상 및 병변을 보이는 동물 모델인 TG마우스(Tg(K18-ACE2)2Prlmn from The Jackson Laboratory)를 이용하여, No. 139 항체의 생체 내 중화능을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 여기서, CT-P59 항체는 No. 139 항체를 지칭한다.
군 구성은 대조군 및 투여군 (No. 139 항체 5, 20, 40 또는 80 mg/kg) 총 5군, 각각 군당 11마리, 총 55마리로 구성하였으며, 브라질 변이 (P.1; 감마) SARS-CoV-2 바이러스 1x104 PFU 30 μL를 비강에 접종하였다. 바이러스 접종 8시간 후 부형제 혹은 No. 139 항체 5, 20, 40 또는 80 mg/kg를 단회 복강 주사하였으며, 바이러스 접종 전 후 10일 동안 체중을 평가하고 생존 여부를 관찰하였다. 조직 내 바이러스 역가를 측정하기 위해 바이러스 접종 후 3일째와 6일째 마우스를 각각 4마리씩 희생시켜 폐 조직과 비강세척액을 확보하였고, Vero 세포를 이용한 플라크 분석 (Plaque assay)을 하여 각 샘플의 바이러스 역가를 측정하였다.
그 결과, 대조군의 2개체가 바이러스 접종 후 7일째에 30% 이상의 체중 감소율을 보여 폐사로 간주하였고, 1개체가 8일째에 폐사하며 8일째부터 0%의 생존율을 보였다. 반면 No.139 항체 투여군에서는 폐사 개체 또는 30% 이상의 체중 감소율을 보이는 개체가 확인되지 않았으며, 생존율 100%로 기록되었다.
바이러스로 접종 후 1일째부터 대조군 개체들의 체중 감소가 보이기 시작하였으며, 6일째에는 평균 27.3%의 체중 감소율을 보였다. No.139 항체를 5, 20, 40 또는 80 mg/kg 투여 시, 바이러스 접종 후 6일째의 평균 체중 감소율은 순서대로 18.8%, 16.6%, 16.7%, 9.2% 였으며, 바이러스 접종 후 3일째부터 6일째까지 대조군 대비 평균 체중 감소가 유의적으로 방어되는 것으로 나타났다. 이 후 항체 투여군의 동물들은 바이러스 접종 10일째까지, 체중을 회복하는 경향을 보였다 (도 6a).
플라크 분석으로 측정한 폐 조직에서의 바이러스 역가는 다음과 같다. No.139 항체를 5, 20, 40 또는 80 mg/kg 투여 시, 접종 후 3일째 대조군 대비 폐 바이러스 역가가 순서대로 9.2, 5.5, 2.5, 3.6배 감소하였다. 또한, No.139 항체 투여군에서는 접종 후 6일째에 바이러스가 검출되지 않으며 대조군 대비 유의한 효과를 보였다 (도 6b).
플라크 분석으로 측정한 비강세척액에서의 바이러스 역가는 다음과 같다. 바이러스 접종 후 3일째와 6일째에 대조군의 각각 한 개체에서 2와 2.3 log10 (PFU+1)/mL의 바이러스 역가를 보이며 평균 0.5와 0.6 log10 (PFU+1)/mL의 역가를 나타내었다. 반면 No.139 항체 투여군에서는 접종 후 3일째와 6일째에 바이러스가 검출되지 않으며 바이러스 역가 감소 효과를 보였다 (도 6c).
실시예 8. No. 139 항체(Full IgG)의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 리셉터 결합 도메인(RBD)과의 결합부위 결정
본 발명의 No. 139 항체(Full IgG)가 SARS-CoV-2 RBD에 결합하는 부위를 결정하기 위하여 X선 회절분석법을 이용하여 항체 분절이 RBD 단백질 상에 결합하는 아미노산 서열을 분석하였다(도 7a). 그 결과 No. 139 항체 에피토프의 주요 구성 요소는 RBD 공간 구조 위에 파란색으로 표기를 하였고 각 아미노산 위치도 표시하였다(도 7d).
실시예 8-1. 재조합 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 발현
X선 회절 분석에 사용하기 위한 재조합 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 생산하기 위하여 'Wuhan-Hu-1'(BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019) 코로나바이러스 스파이크 단백질 (NCBI ACCESSION 번호: YP_009724390.1, 서열번호: 2321) 의 RBD 부분 (아미노산 잔기 319번에서 536번)에 C말단 부위에 8개의 히스티딘 잔기를 추가한 DNA 서열을 MarEx 벡터에 클로닝하였다.
상기 발현 벡터를 Lipofectamine LTX (Invitrogen) 를 이용하여 CHO 세포에 트랜스펙션(transfection) 하고, SFM4CHO 무혈청 배지 (HyClone) 및 400 nM methotrexate (MTX; Yuhan) 하에서 선별하였다. SARS-CoV-2 RBD 단백질을 안정적으로 발현하는 클론을 선정하여 유가식 배양을 통해 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 대량 생산하였다. 구체적으로, SFM4CHO를 기본 배지로 하여 배양 3, 5 및 7일 시점에 BalanCD CHO Feed 4 배지 (Irvine) 및 글루코스를 첨가하고, 배양 9일째 원심분리하여 배양액을 회수하였다.
Metal affinity chromatography (Ni-NTA agarose column; Qiagen Cat No. 30210) 방법으로 배양액 내의 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 정제하였다. 정제된 RBD는 VIVASPIN 30 Membrane 5,000 MWCO PES (Sartorius, Cat No.VS2012) 을 사용하여 10 mM Tris-HCl (pH8.0), 150 mM NaCl 버퍼로 8.3 mg/ml 농도로 RBD를 농축하였다.
실시예 8-2. 항체 분절의 정제
No. 139 항체를 정제수를 이용하여 2.0 mg/mL 농도로 희석을 한 다음 2X digestin 버퍼 (200mM Tris-HCl (pH 7.4), 4mM EDTA) 와 최종 1mM L-cysteine 을 첨가하여 Papain (Roche, REF#:10108014001)과 100:1의 비율로 혼합한 후 37℃에서 1시간동안 효소반응을 진행하였다. 이 후 Antipain dihydrochloride (Sigma, Cat. No.11004646001) 1mg/mL 을 100: 1 비율로 추가하고 다시 37℃에서 45분간 반응을 시켰다.
반응액은 Mabselect SuRe column (GE Healthcare Cat No. 17-5438-03)을 이용하여 Fab과 Fc 부분을 분리함으로써 Fc를 제거하고, VIVASPIN 30 Membrane 5,000 MWCO PES (Sartorius, Cat No.VS2012) 을 사용하여 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl 버퍼로 14.2 mg/ml 농도로 No. 139 Fab 분절을 농축하였다.
실시예 8-3. 항체 분절과 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 동시-결정화
No. 139 항체의 Fab 분절과 SARS-CoV-2 RBD 복합체를 만들기 위해 정제된 RBD 와 No. 139 Fab 을 1:1.2 몰비율로 혼합하였다. 여분의 No. 139 Fab은 10mM 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl 버퍼를 이용하여 HiLoad 16/600 Superdex 200 (GE Healthcare: 28989335)을 평형화 시킨 다음 결합하고 있지 않는 여분의 No. 139 Fab 을 제거하였다. No. 139 Fab/ RBD 복합체는 6mg/mL으로 농축을 하고 결정화에 이용하였다.
X-선 회절분석이 가능한 결정은 20℃에서 부유 방울 증기 확산법을 이용하여 0.4 uL의 No. 139 Fab/RBD 복합체와 동일한 부피의 10 mM NiCl2, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) and 16% (wt/vol) PEG MME 2000 조성의 침전용액을 혼합한 조건에서 일주일 동안 결정 최적화를 진행하였다.
실시예 8-4. X선 회절 분석법
X-선 데이터 수집을 위해 20% ethylene glycol 을 첨가한 동일한 침전용액에 결정을 담갔다가 100캘빈 질소 가스 스트림에 넣었다. X-선 회절 데이터 세트는 2.71Å 해상도로 대한민국 포항 가속기 연구소 (PAL: Pohang Accelerator Laboratory) 빔라인 BL-5C 에서 수집하였다. 데이터 세트는 XDS 프로그램 패키지로 처리를 하였고, No. 139 Fab/ RBD 복합체는 I222 체심사방정계로 결정화되었다. No. 139 Fab/ RBD 복합체 구조는 Phaser 프로그램의 몰레큘라 리플레이스먼트(Molecular Replacement) 방법으로 결정하였다. 몰레큘라 리플레이스먼트(Molecular Replacement) 진행 시 SARS-CoV-2 RBD/CB6 복합 구조(PDB코드, 7C01)를 검색 모델로 사용하였고, 모델 구축은 Coot 프로그램으로 진행하였다. 모델 전반에 걸쳐 2Fo-Fc 전자 밀도는 잘 정의되었고 구조의 정교화 및 보정은 Penix 패키지를 사용하여 수행하였다. X-선 회절 및 구조 보정 통계는 표 11에 기록을 하였다 (데이터 수집과 보정 통계).
Figure PCTKR2021009475-appb-img-000022
실시예 8-5: 구조 데이터의 평가와 분석
No. 139 Fab/ SARS-CoV-2 RBD 복합체 구조에서 No. 139 Fab는 ACE2가 SARS-CoV-2 RBD 와 직접 결합하고 있는 수용체 결합 모티프에 결합한다. CCP4i 패키지의 Contact 프로그램을 이용하여 Van der Waals 결합의 거리 컷 오프를 4.5Å 으로 하고 수소결합 거리 컷 오프를 3.5Å으로 하여 에피토프(epitope) 분석을 진행하였다. No. 139 항체의 중쇄와 경쇄 부분에서 RBD와 상호결합하는 부위는 각각 용매 접근 표면적 824.2 Å2과 112.5 Å2 표면 부위를 각각 감싸고 있다. 대부분의 상호 작용은 중쇄의 3개의 상보성결정부위 (CDR: complementarity-determining region) 부분의 아미노산 잔기 16개와 RBD의 19개 아미노산 잔기를 통해 결합하고 있고, 경쇄의 경우 CDR1, CDR2 의 3개 잔기가 RBD 4개 잔기와 결합하고 있음을 보여 주었다. 특히 중쇄 CDR3 의 beta-hairpin 구조는 ACE2 결합 RBD 표면 (도 8)의 중간에 여러 방향족 아미노산을 포함하고 있는 소수성 상호 작용뿐만 아니라 8개의 수소 결합을 형성함으로써 RBD 와 강하게 결합하는데 결정적인 역할을 하고 있다. 구조 데이터 분석을 통한 에피토프(EPITOPE) 와 파라토프(PARATOPE) 정보는 표 12 에 기재하였다. 표 12에서, SARS-CoV-2 RBD 에피토프(EPITOPE) 아미노산 위치는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(NCBI Accession No. YP_009724390.1, 서열번호: 2321)의 N 말단부터 numbering 한 것이다(signal peptide 부터 시작하여 numbering함). 표 12에서, No. 139의 Heavy Chain, Light Chain의 파라토프(PARATOPE) 아미노산 위치는 No. 139 항체의 중쇄, 경쇄 가변부 서열의 N 말단부터 numbering 한 것이다(즉, No. 139 항체의 중쇄, 경쇄 가변부 서열의 N 말단에서 첫번째 아미노산을 1로 함).
No. 139 항체가 SARS-CoV-2 RBD 와 ACE2 결합을 방해함으로서 바이러스가 세포에 감염되는 것을 막는 것을 구조에 기초하여 분석을 진행하였다. SARS-CoV-2 RBD / ACE2 단백질 복합체 구조 (PDB코드, 6LZG)는 도 7b에 표현하였고, ACE2 의 RBD 결합하는 공간적인 위치는 도 7e에서 확인 할 수 있다. No. 139 항체가 RBD에 결합함으로 인해서 RBD 자체의 콘포메이션(conformation)의 변화를 보여주지는 않고 있음을 두 개의 RBD 구조에서 193개의 alpha 탄소 사이의 상호 루트 평균 제곱 편차가 0.89 Å으로 확인할 수 있었다. 하지만 beta 5번 체인과 6번 사이의 루프 부위 (아미노산 473-488)는 No. 139 항체가 결합으로 인해 국소 변화가 있었다. SARS-CoV-2 RBD 와 ACE2 의 자세한 결합 위치는 표 13에 기재하였다((Wang Q, et al., (2020) Structural and Functional Basis of SARS-CoV-2 Entry by Using Human ACE2. Cell 10.1016/j.cell.2020.03.045). SARS-CoV-2 RBD / No. 139 와 SARS-CoV-2 RBD / ACE2 를 슈퍼임포즈 (superimpose) 한 그림은 도 7c에 나타내었다. 공간적인 슈퍼임포즈 그림에서 보이는 바와 같이 No. 139 의 중쇄는 ACE2 위치와 완전히 오버랩 (overlap) 되는 것을 볼 수 있고, 경쇄는 추가적으로 일부 RBD 와 결합하는 것을 볼 수 있다. 도 7d와 도 7e에서는 각 결합부위를 RBD 상에 표현하였고, ACE2 와 No. 139 가 동시에 결합하고 있는 아미노산 잔기는 빨간색 글자로 표기하였다. 이 두 그림 (도 7d 및 7e) 에서 보는 바와 같이 ACE2 와 결합하는 21개 아미노산 잔기 중 12개가 No. 139 항체가 동일하게 결합하는 것을 확인할 수 있으며, No. 139 항체는 RBD 상에 ACE2가 결합하는 중앙 부위에 골고루 분포를 하고 있음을 확인하였다. 이들을 종합해 보았을 때, SARS-CoV-2 RBD의 No. 139 항체의 에피토프는 ACE2 와 RBD 결합을 완전히 저해하는 에피토프로 볼 수 있다.
하기 표 12에서 No. 139 에피토프(EPITOPE) 및 파라토프(PARATOPE) 정보를, 하기 표 13에서 SARS-CoV-2 RBD 와 상호결합하는 ACE2 아미노산 잔기를 나타내었다.
Figure PCTKR2021009475-appb-img-000023
Figure PCTKR2021009475-appb-img-000024
실시예 9. 표면 플라스몬 공명 기술을 이용한 항원-항체 친화도 결정
표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 검정은 정반응 속도 상수 및 역반응 속도 상수의 역학적 측정에 의해 항체의 결합친화도를 결정한다.
정제된 재조합 SARS-CoV-2-RBD 단백질에 대한 No. 139 항체의 결합은 25°C에서 실행 완충액 HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)을 사용하는 Biacore T200 장비로 표면플라스몬 공명-기본 측정에 의해 결정되었다. 10 mM 아세트산나트륨 (Sodium Acetate, pH 5.0) 중에 희석된 약 150 RU의 SARS-CoV-2-RBD 단백질을 8 ㎍/ml로 제조사의 지침 및 절차에 따라 표준 아민 커플링 키트(Amine coupling kit)를 사용하여 CM5 연구용 바이오센서 칩에 직접적으로 고정시켰다. 바이오센서 표면에서 반응하지 않은 부분을 에탄올아민(ethanolamine)으로 차단하였다. 반응 분석을 위해 Biacore T200 콘트롤 소프트웨어, Biacore T200 이벨루에이션 소프트웨어를 사용하였다. No. 139 항체는 HBS-EP 완충액에 희석하여 20 ㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스상에 주입하였다. 검정 동안에, 모든 측정은 포획된 재조합 SARS-CoV-2-RBD 단백질이 없는 포획 표면을 대조군으로 사용하였다. 결합 및 분리 속도 상수 Ka (M-1s-1) 및 Kd (s-1)은 20 ㎕/분의 유속에서 3배의 희석 시리즈로서 0.04 내지 10 nM 범위의 상이한 항원 농도에서 반응 결합 측정을 실시함으로써 획득하였다. 이어서, 항체와 표적 항원 사이의 반응에 대한 평형 해리 상수 KD (M)를 반응 속도 상수로부터 다음의 등식에 의해 계산하였다: KD = Kd/Ka. 결합은 시간과 반응 속도 상수의 함수를 계산하여 기록한다.
정제된 다양한 재조합 SARS-CoV-2-RBD 단백질에 대한 No. 139 항체의 결합친화도를 결정하였다(표 14 및 도 9). No. 139 항체는 SARS-CoV-2-RBD 항원에 대하여 높은 결합친화도를 나타내었다.
하기 표 14에서 SARS-CoV-2-RBD 단백질에 대한 No. 139 항체의 결합친화도 측정 결과를 나타내었다.
No. Ka (M-1s-1) Kd(s-1) KD(M) Average
No. 139 7 x 106 1.58 x 10-4 2.26 x 10-11 2.71 x 10-11
6.77 x 106 2.14 x 10-4 3.16 x 10-11
실시예 10. No. 139 항체(Full IgG)의 물리화학적 특성 분석
바이러스 중화능 측정 결과를 기반으로 가장 중화능이 크고, 생산 수율이 우수한 후보 1종을 선정하고, 물리화학적 특성 분석을 진행하였다 (표 15).
크기 배제 크로마토그래피법(Size Exclusion Chromatography, SEC-HPLC)을 이용하여, 항체의 비정상적인 파편 (Fragment, LMW)나 응집 (Aggregation, HMW)의 발생 유무를 평가하였다. 이런 비정상적인 단백질 구조는 본래 항체가 가지고 있는 항원 특이적인 결합능, 생체 내 약물동력학에 영향을 주기 때문에, 일반적인 항체 제조 방법의 우월성을 간접적으로 확인할 수 있다. 선정된 NO. 139는 99.87% 이상의 정상 항체 구조의 비율을 보였으며, 이 수치는 상업시판 중인 단일클론 항체와 비교하여 동등 이상의 품질을 보여 주고 있다 (도 10).
모세관 전기영동 분석 (Capillary Electrophoresis, CE)을 통해서 비환원 조건 (Non-reduced condition)에서의 Intact IgG의 순도 비율과, 환원 조건 (Reduced condition)에서의 항체 중쇄/경쇄합 비율 (Sum of Heavy & Light Chain)을 평가하였다 (도 11). 선정된 NO. 139는 비환원 조건에서 Intact IgG의 비율은 89%, 환원조건에서 항체 중쇄/경쇄합 비율은 99%를 보였으며, 이 수치는 상업시판 중인 단일클론 항체와 비교하여 동등 이상의 품질을 보여 주고 있다.
하기 표 15에서 NO. 139 항체의 물리화학적 특성 분석 결과를 나타내었다.
평가 방법 결과
SEC-HPLC Monomer (%) 99.87%
High Molecular Weight (HMW) (%) 0.07%
Low Molecular Weight (LMW) (%) 0.06%
Non-reduced CE-SDS Intact IgG (%) 89%
Reduced CE-SDS Sum of Heavy & Light Chain (%) 99%
실시예 11. No. 139 항체(Full IgG)의 항체 결합 특성 및 작용 기전 평가
실시예 5를 통하여 선정된 No. 139 항체(Full IgG)의 결합 특이성을 Octet 분석을 진행하여 평가하였다.
분석 결과, 도 12과 같이 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적인 결합능력이 확인되었다. 하기 도 12에서 SARS-CoV S1, HCoV-HKU1 S1 및 MERS-CoV RBD는 각각 사스, 일반 감기 및 메르스의 원인이 되는 바이러스의 표면 단백질을 지칭한다.
SARS-CoV-2 바이러스는 표면 단백질 (RBD)를 인간 수용체 (ACE2)에 결합시켜 인체 세포에의 감염을 시작할 수 있다. 그러므로, No. 139 항체(Full IgG)의 작용 기전 (mechanism of action)을 Octet을 이용하여 Biolayer interference (BLI) 분석을 진행하여 평가하였다. 분석 결과, 하기 표 16과 같이 SARS-CoV-2 바이러스 표면 단백질 (RBD)의 변이 단백질에 대해서도 우수한 결합력을 가지며, 도 13와 같이 SARS-CoV-2 표면 단백질 (RBD)와 인간 수용체 (ACE2)의 결합이 No. 139 항체(Full IgG)에 의해 완전하게 억제되는 것이 확인되었다.
하기 표 16에서, 각 변이 위치는 코로나바이러스 스파이크 단백질 (NCBI ACCESSION 번호: YP_009724390.1, 서열번호 2321) 의 N 말단부터 넘버링(numbering) 한 것이다.
No. RBD mutant KD (M)
1 P337S 7.68 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
2 G446S 6.11 x 10-11 (WT: 7.25 x 10-11)
3 F338L 6.04 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
4 L452R 4.71 x 10-10 (WT: 5.10 x 10-11)
5 V341I 5.75 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
6 Y453F 7.24 x 10-11 (WT: 9.33 x 10-11)
7 F342L 5.76 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
8 F456L 7.57 x 10-11 (WT: 7.25 x 10-11)
9 A344S 7.43 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
10 K458R 4.25 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
11 A348S 6.24 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
12 E471Q 5.84 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
13 A352S 9.94 x 10-11 (WT: 1.02 x 10-10)
14 I472V 4.97 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
15 N354D 5.33 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
16 G476S 4.60 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
17 S359N 6.42 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
18 S477I 5.63 x 10-11 (WT: 1.02 x 10-10)
19 V367F 4.10 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
20 S477N 4.89 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
21 N370S 5.07 x 10-11 (WT: 1.02 x 10-10)
22 S477R 4.78 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
23 A372S 4.25 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
24 T478I 4.25 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
25 A372T 5.65 x 10-11 (WT: 1.02 x 10-10)
26 P479S 4.11 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
27 F377L 5.35 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
28 N481D 5.18 x 10-11 (WT: 7.25 x 10-11)
29 K378R 4.88 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
30 G482S 5.69 x 10-11 (WT: 5.10 x 10-11)
31 K378N 6.08 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
32 V483A 4.64 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
33 P384L 4.97 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
34 V483I 6.17 x 10-11 (WT: 6.75 x 10-11)
35 T385A 6.79 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
36 G485S 7.47 x 10-11 (WT: 6.75 x 10-11)
37 T393P 6.24 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
38 F486S 6.58 x 10-11 (WT: 7.25 x 10-11)
39 V395I 7.01 x 10-11 (WT: 1.02 x 10-10)
40 F490S 6.89 x 10-11 (WT: 5.10 x 10-11)
41 E406Q 1.24 x 10-10 (WT: 3.95 x 10-11)
42 S494P 4.49 x 10-8 (WT: 6.75 x 10-11)
43 R408I 5.51 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
44 P499R 7.75 x 10-11 (WT: 7.25 x 10-11)
45 Q409E 6.83 x 10-11 (WT: 1.02 x 10-10)
46 V503F 4.91 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
47 D405V/Q414A 5.60 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
48 Y505C 7.16 x 10-11 (WT: 7.66 x 10-11)
49 Q414E 4.68 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
50 Y508H 4.28 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
51 Q414R 1.14 x 10-10 (WT: 1.02 x 10-10)
52 A520S 7.06 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
53 K417N 5.14 x 10-11 (WT: 5.10 x 10-11)
54 A520V 5.42 x 10-11 (WT: 1.02 x 10-10)
55 A435S 5.52 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
56 P521S 5.59 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
57 W436R 3.98 x 10-11 (WT: 4.72 x 10-11)
58 P521R 5.85 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
59 N439K 6.93 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
60 A522V 5.31 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
61 N440K 5.88 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
62 A522S 5.97 x 10-11 (WT: 5.99 x 10-11)
63 K444R 9.29 x 10-11 (WT: 3.95 x 10-11)
64 K458Q 6.29 x 10-11 (WT: 6.41 x 10-11)
65 V445F 8.76 x 10-11 (WT: 7.25 x 10-11)
66 E484K 1.10 x 10-10 (WT: 6.41 x 10-11)
67 G446V 7.48 x 10-11 (WT: 7.66 x 10-11)
68 N501Y 9.30 x 10-11 (WT: 4.76 x 10-11)
69 F456E 4.47 x 10-10 (WT: 7.25 x 10-11)
70 K417N/E484K/N501Y 9.41 x 10-10 (WT: 9.46 x 10-11)
71 K417T/E484K/N501Y 7.69 x 10-10 (WT: 6.32 x 10-11)

Claims (38)

  1. 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자로서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함하는, 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 449, 455, 456, 484, 486, 489, 490 및 493의 아미노산 잔기(residue)를 포함함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 450, 452, 485, 492 및 494의 아미노산 잔기(residue)를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505의 아미노산 잔기(residue)를 포함함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495의 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는 구조 에피토프(conformational epitope)임을 특징으로 하는 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 1x10-8 M 이하의 결합 친화도(KD)를 가짐을 특징으로 하는 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질의 RBD(Receptor Binding Domain)와 표적 세포의 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2) 수용체의 결합을 억제함을 특징으로 하는 결합 분자.
  10. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 결합 분자는 표 1의 결합 분자 No. 89 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 결합 분자.
  11. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 결합 분자는 표 2의 결합 분자 No. 89 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 결합 분자.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 결합 분자는 표 1의 결합 분자 No. 89 내지 No. 127, No. 129 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 결합 분자.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 결합 분자는 표 2의 결합 분자 No. 89 내지 No. 127, No. 129 내지 No. 194, 및 No. 248로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD의 결합에 표 1의 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 결합 분자와 경쟁함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD의 결합에 표 2의 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 결합 분자와 경쟁함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는
    서열번호: 829의 CDR1 영역, 서열번호: 830의 CDR2 영역, 및 서열번호: 831의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
    서열번호: 832의 CDR1 영역, 서열번호: 833의 CDR2 영역, 및 서열번호: 834의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역
    포함함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는
    서열번호: 2017의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역; 및
    서열번호: 2018의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역
    을 포함함을 특징으로 하는, 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질은 서열번호: 2321의 폴리펩티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 결합 분자.
  20. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체임을 특징으로 하는, 결합 분자.
  21. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 돌연변이가 생긴 변이 바이러스에 중화능이 있음을 특징으로 하는, 결합 분자.
  22. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 RBD 영역 이외의 부위에 돌연변이가 생긴 변이 바이러스에 중화능이 있음을 특징으로 하는, 결합 분자.
  23. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 사스-코로나바이러스-2 S형, L형, V형, G형, GH형 또는 GR형에 중화능이 있음을 특징으로 하는, 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 하기 1) 내지 76)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이 바이러스에 중화능이 있음을 특징으로 하는, 결합 분자:
    1) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 69번 및 70번 아미노산 위치 중 하나 이상이 결실된 변이 바이러스;
    2) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 80번 아미노산 위치에서 D80A 변이가 생긴 변이 바이러스;
    3) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 222번 아미노산 위치에서 A222V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    4) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 234번 아미노산 위치에서 N234Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    5) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 337번 아미노산 위치에서 P337S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    6) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 338번 아미노산 위치에서 F338L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    7) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 348번 아미노산 위치에서 A348S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    8) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 367번 아미노산 위치에서 V367F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    9) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 370번 아미노산 위치에서 N370S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    10) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 372번 아미노산 위치에서 A372S 변이, A372T 변이 또는 A372V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    11) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 341번 아미노산 위치에서 V341I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    12) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 342번 아미노산 위치에서 F342L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    13) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 344번 아미노산 위치에서 A344S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    14) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 352번 아미노산 위치에서 A352S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    15) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 354번 아미노산 위치에서 N354D 변이가 생긴 변이 바이러스;
    16) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 359번 아미노산 위치에서 S359N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    17) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 377번 아미노산 위치에서 F377L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    18) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 378번 아미노산 위치에서 K378R 변이 또는 K378N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    19) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 384번 아미노산 위치에서 P384L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    20) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 385번 아미노산 위치에서 T385A 변이가 생긴 변이 바이러스;
    21) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 393번 아미노산 위치에서 T393P 변이가 생긴 변이 바이러스;
    22) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 395번 아미노산 위치에서 V395I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    23) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 405번 아미노산 위치에서 D405V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    24) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 406번 아미노산 위치에서 E406Q 변이 또는 E406W 변이가 생긴 변이 바이러스;
    25) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 408번 아미노산 위치에서 R408I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    26) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 409번 아미노산 위치에서 Q409E 변이가 생긴 변이 바이러스;
    27) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 414번 아미노산 위치에서 Q414A 변이, Q414E 변이 또는 Q414R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    28) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 417번 아미노산 위치에서 K417N 변이, K417T 변이 또는 K417E 변이가 생긴 변이 바이러스;
    29) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 420번 아미노산 위치에서 D420N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    30) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 435번 아미노산 위치에서 A435S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    31) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 436번 아미노산 위치에서 W436R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    32) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 439번 아미노산 위치에서 N439K 변이가 생긴 변이 바이러스;
    33) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 440번 아미노산 위치에서 N440K 변이 또는 N440D 변이가 생긴 변이 바이러스;
    34) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 444번 아미노산 위치에서 K444Q 변이 또는 K444R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    35) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 445번 아미노산 위치에서 V445A 변이 또는 V445F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    36) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 446번 아미노산 위치에서 G446V 변이 또는 G446S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    37) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 449번 아미노산 위치에서 Y449N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    38) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 452번 아미노산 위치에서 L452R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    39) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 453번 아미노산 위치에서 Y453F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    40) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 455번 아미노산 위치에서 L455F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    41) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 456번 아미노산 위치에서 F456L 변이 또는 F456E 변이가 생긴 변이 바이러스;
    42) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 458번 아미노산 위치에서 K458R 변이 또는 K458Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    43) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 460번 아미노산 위치에서 N460T 변이가 생긴 변이 바이러스;
    44) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 471번 아미노산 위치에서 E471Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    45) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 472번 아미노산 위치에서 I472V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    46) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 473번 아미노산 위치에서 Y473F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    47) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 475번 아미노산 위치에서 A475V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    48) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 476번 아미노산 위치에서 G476S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    49) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 477번 아미노산 위치에서 S477N 변이, S477R 변이, S477I 변이 또는 S477R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    50) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 478번 아미노산 위치에서 T478K 변이 또는 T478I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    51) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 479번 아미노산 위치에서 P479S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    52) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 481번 아미노산 위치에서 N481D 변이가 생긴 변이 바이러스;
    53) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 482번 아미노산 위치에서 G482S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    54) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 483번 아미노산 위치에서 V483A 변이 또는 V483I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    55) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 484번 아미노산 위치에서 E484K 변이, E484G 변이 또는 E484Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    56) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 485번 아미노산 위치에서 G485S변이가 생긴 변이 바이러스;
    57) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 486번 아미노산 위치에서 F486S 변이, F486L 변이, F486V 변이 또는 F486I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    58) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 489번 아미노산 위치에서 Y489H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    59) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 490번 아미노산 위치에서 F490S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    60) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 493번 아미노산 위치에서 Q493K 변이, Q493R 변이, Q493M 변이, Q493Y 변이 또는 Q493A 변이가 생긴 변이 바이러스;
    61) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 494번 아미노산 위치에서 S494Q 변이, S494L 변이 또는 S494P 변이가 생긴 변이 바이러스;
    62) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 498번 아미노산 위치에서 Q498H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    63) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 499번 아미노산 위치에서 P499R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    64) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 501번 아미노산 위치에서 N501Y 변이, N501T 변이 또는 N501F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    65) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 503번 아미노산 위치에서 V503F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    66) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 505번 아미노산 위치에서 Y505C 변이가 생긴 변이 바이러스;
    67) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 508번 아미노산 위치에서 Y508H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    68) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 520번 아미노산 위치에서 A520S 변이 또는 A520V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    69) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 521번 아미노산 위치에서 P521R 변이 또는 P521S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    70) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 522번 아미노산 위치에서 A522S 변이 또는 A522V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    71) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 614번 아미노산 위치에서 D614G 변이가 생긴 변이 바이러스;
    72) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 677번 아미노산 위치에서 Q677H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    73) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 681번 아미노산 위치에서 P681H 변이 또는 P681R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    74) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 685번 아미노산 위치에서 R685H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    75) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 701번 아미노산 위치에서 A701V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    및
    76) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 1176번 아미노산 위치에서 V1176F 변이가 생긴 변이 바이러스.
  25. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트.
  26. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자.
  27. 제26항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  28. 제27항의 발현 벡터로 형질전환된 세포주.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 세포주는 CHO 세포, F2N 세포, COS 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, HT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 및 HEK293T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 세포주.
  30. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 결합 분자를 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    하기 1) 내지 76)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이 바이러스를 중화하기 위한 것인, 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단, 예방 또는 치료용 조성물:
    1) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 69번 및 70번 아미노산 위치 중 하나 이상이 결실된 변이 바이러스;
    2) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 80번 아미노산 위치에서 D80A 변이가 생긴 변이 바이러스;
    3) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 222번 아미노산 위치에서 A222V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    4) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 234번 아미노산 위치에서 N234Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    5) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 337번 아미노산 위치에서 P337S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    6) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 338번 아미노산 위치에서 F338L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    7) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 348번 아미노산 위치에서 A348S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    8) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 367번 아미노산 위치에서 V367F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    9) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 370번 아미노산 위치에서 N370S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    10) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 372번 아미노산 위치에서 A372S 변이, A372T 변이 또는 A372V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    11) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 341번 아미노산 위치에서 V341I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    12) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 342번 아미노산 위치에서 F342L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    13) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 344번 아미노산 위치에서 A344S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    14) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 352번 아미노산 위치에서 A352S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    15) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 354번 아미노산 위치에서 N354D 변이가 생긴 변이 바이러스;
    16) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 359번 아미노산 위치에서 S359N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    17) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 377번 아미노산 위치에서 F377L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    18) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 378번 아미노산 위치에서 K378R 변이 또는 K378N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    19) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 384번 아미노산 위치에서 P384L 변이가 생긴 변이 바이러스;
    20) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 385번 아미노산 위치에서 T385A 변이가 생긴 변이 바이러스;
    21) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 393번 아미노산 위치에서 T393P 변이가 생긴 변이 바이러스;
    22) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 395번 아미노산 위치에서 V395I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    23) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 405번 아미노산 위치에서 D405V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    24) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 406번 아미노산 위치에서 E406Q 변이 또는 E406W 변이가 생긴 변이 바이러스;
    25) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 408번 아미노산 위치에서 R408I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    26) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 409번 아미노산 위치에서 Q409E 변이가 생긴 변이 바이러스;
    27) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 414번 아미노산 위치에서 Q414A 변이, Q414E 변이 또는 Q414R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    28) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 417번 아미노산 위치에서 K417N 변이, K417T 변이 또는 K417E 변이가 생긴 변이 바이러스;
    29) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 420번 아미노산 위치에서 D420N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    30) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 435번 아미노산 위치에서 A435S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    31) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 436번 아미노산 위치에서 W436R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    32) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 439번 아미노산 위치에서 N439K 변이가 생긴 변이 바이러스;
    33) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 440번 아미노산 위치에서 N440K 변이 또는 N440D 변이가 생긴 변이 바이러스;
    34) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 444번 아미노산 위치에서 K444Q 변이 또는 K444R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    35) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 445번 아미노산 위치에서 V445A 변이 또는 V445F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    36) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 446번 아미노산 위치에서 G446V 변이 또는 G446S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    37) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 449번 아미노산 위치에서 Y449N 변이가 생긴 변이 바이러스;
    38) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 452번 아미노산 위치에서 L452R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    39) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 453번 아미노산 위치에서 Y453F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    40) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 455번 아미노산 위치에서 L455F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    41) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 456번 아미노산 위치에서 F456L 변이 또는 F456E 변이가 생긴 변이 바이러스;
    42) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 458번 아미노산 위치에서 K458R 변이 또는 K458Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    43) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 460번 아미노산 위치에서 N460T 변이가 생긴 변이 바이러스;
    44) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 471번 아미노산 위치에서 E471Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    45) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 472번 아미노산 위치에서 I472V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    46) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 473번 아미노산 위치에서 Y473F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    47) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 475번 아미노산 위치에서 A475V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    48) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 476번 아미노산 위치에서 G476S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    49) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 477번 아미노산 위치에서 S477N 변이, S477R 변이, S477I 변이 또는 S477R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    50) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 478번 아미노산 위치에서 T478K 변이 또는 T478I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    51) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 479번 아미노산 위치에서 P479S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    52) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 481번 아미노산 위치에서 N481D 변이가 생긴 변이 바이러스;
    53) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 482번 아미노산 위치에서 G482S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    54) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 483번 아미노산 위치에서 V483A 변이 또는 V483I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    55) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 484번 아미노산 위치에서 E484K 변이, E484G 변이 또는 E484Q 변이가 생긴 변이 바이러스;
    56) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 485번 아미노산 위치에서 G485S변이가 생긴 변이 바이러스;
    57) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 486번 아미노산 위치에서 F486S 변이, F486L 변이, F486V 변이 또는 F486I 변이가 생긴 변이 바이러스;
    58) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 489번 아미노산 위치에서 Y489H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    59) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 490번 아미노산 위치에서 F490S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    60) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 493번 아미노산 위치에서 Q493K 변이, Q493R 변이, Q493M 변이, Q493Y 변이 또는 Q493A 변이가 생긴 변이 바이러스;
    61) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 494번 아미노산 위치에서 S494Q 변이, S494L 변이 또는 S494P 변이가 생긴 변이 바이러스;
    62) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 498번 아미노산 위치에서 Q498H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    63) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 499번 아미노산 위치에서 P499R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    64) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 501번 아미노산 위치에서 N501Y 변이, N501T 변이 또는 N501F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    65) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 503번 아미노산 위치에서 V503F 변이가 생긴 변이 바이러스;
    66) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 505번 아미노산 위치에서 Y505C 변이가 생긴 변이 바이러스;
    67) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 508번 아미노산 위치에서 Y508H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    68) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 520번 아미노산 위치에서 A520S 변이 또는 A520V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    69) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 521번 아미노산 위치에서 P521R 변이 또는 P521S 변이가 생긴 변이 바이러스;
    70) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 522번 아미노산 위치에서 A522S 변이 또는 A522V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    71) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 614번 아미노산 위치에서 D614G 변이가 생긴 변이 바이러스;
    72) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 677번 아미노산 위치에서 Q677H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    73) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 681번 아미노산 위치에서 P681H 변이 또는 P681R 변이가 생긴 변이 바이러스;
    74) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 685번 아미노산 위치에서 R685H 변이가 생긴 변이 바이러스;
    75) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 701번 아미노산 위치에서 A701V 변이가 생긴 변이 바이러스;
    및
    76) 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 1176번 아미노산 위치에서 V1176F 변이가 생긴 변이 바이러스.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조성물은 멸균 주사용액, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제임을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 결합 분자를 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19) 진단, 예방 또는 치료용 키트.
  34. 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)으로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 제31항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법.
  35. 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프와의 결합 여부를 확인하여, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 선별하는 방법으로서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함하고,
    상기 에피토프 및 결합 분자가 결합을 보이는 경우 상기 결합 분자를 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치
    403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  37. 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor Binding Domain) 내 에피토프와의 결합 여부를 확인하여, 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자를 생산하는 방법으로서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 417, 449, 453, 455, 456, 484, 486, 489, 490, 493, 496 및 505로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함하고,
    상기 에피토프 및 결합 분자가 결합을 보이는 경우 상기 결합 분자를 사스-코로나바이러스 감염증으로 인하여 발생하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 위치 403, 450, 452, 483, 485, 492, 494 및 495로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.
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