CN111228483A

CN111228483A - 用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂

Info

Publication number: CN111228483A
Application number: CN202010196848.1A
Authority: CN
Inventors: 李燕; 沈鑫; 卫韡; 包丽荣; 晏彩霞; 张程; 李佳; 李明远
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2020-06-05

Abstract

本发明公开了一种抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体，通过以下方法制备：构建新型冠状病毒和非典型肺炎病毒的重组抗原；以重组抗原制备免疫制剂免疫产蛋禽类，从免疫禽蛋中获得的特异性复合IgY抗体。采用该抗体制备喷剂，用于广谱杀灭新型冠状病毒和非典型肺炎病毒两种病毒，适用于喷涂在鼻腔、口腔、皮肤等部位；该抗体制剂有特异性中和病毒作用，能有效控制传染源、保护易感人群、一线医护人员消毒防护，预防新型冠状病毒传播。

Description

用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂

技术领域

本发明涉及特异性IgY及其制备方法，具体涉及一种用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的急性冠状病毒病(coronary virus disease 2019，COVID-19)成为国际关注的突发公共卫生事件。SARS-CoV-2感染人数众多，传播性极强，病死率较高，急需寻求安全高效的特异药物治疗。治疗性抗体作为一种可以特异性识别抗原发挥体液免疫功能的生物制剂，具有功能强靶向性高的特点。

SARS-CoV-2是单股正链RNA病毒，基因组全序列显示其与SARS-CoV结构相似性高达80％，受体结合域(Receptor binding domain,RBD)同源性达到73％，是SARS-CoV的姊妹病毒，但是也存在编码蛋白的差异如8a蛋白缺失等。单链RNA病毒具有高度变异性，因此研发可中和两种亚型病毒的广谱中和抗体成为研究的焦点。

刺突蛋白(spike protein，S)是冠状病毒的表面结构蛋白，是病毒识别宿主细胞表面受体血管紧缩素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)的关键分子，在病毒入侵机体时起关键作用。S蛋白含有大量的抗原决定簇，可以诱导保护性抗体的产生。SARS康复病人的血清中普遍存在抗S蛋白的抗体。

研究发现SARS-CoV抗体CR3022可以与SARS-CoV-2RBD有效结合，但另外一些抗体如m396、CR3014则不能，表明两种亚型之间S蛋白差异序列影响已有抗体的有效性，急需开发可以特异性中和两种亚型病毒的新型广谱治疗性抗体。新冠病毒感染人数众多，并且传播性极强，急需寻求安全高效、快速制备、成本低廉的抗病毒消毒制剂。针对冠状病毒的防治，各国批准上市的家用或医用消毒剂虽能有效杀灭新型冠状病毒，但口腔、鼻腔等吸入或服用等体内应用，尚缺乏特异性强、安全有效的产品。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了解决上述问题的用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂。

本发明通过下述技术方案实现：

一种抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体，通过以下方法制备得：构建新型冠状病毒和非典型肺炎病毒的重组抗原；以重组抗原制备免疫制剂免疫产蛋禽类，从免疫禽蛋中获得的特异性复合IgY抗体。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和非典型肺炎病毒(SARS-CoV)结构相似性高达80％，但是也存在编码蛋白的差异。作为典型的单链RNA病毒，其可怕的变异性才最值得警惕，因此研发功能强大、靶向性高、可同时中和两种姊妹病毒的广谱治疗性抗体成为研究的焦点。

卵黄抗体(immunoglobulin yolk，IgY)是指用特定的抗原免疫产蛋禽类后，从免疫禽蛋中获得的特异性抗体。本发明通过构建新型冠状病毒和非典型肺炎病毒的重组抗原；以重组抗原制备免疫制剂免疫产蛋禽类，从免疫禽蛋中获得的特异性复合IgY抗体，能够同时杀灭两种SARS-CoV-2和SARS-CoV S姊妹病毒。

进一步地，所述复合抗原包括新型冠状病毒和非典型肺炎病毒重组S蛋白、或者新型冠状病毒和非典型肺炎病毒的S蛋白表位多肽。

本发明可基于pcDNA6B-FLAG构建的SARS-CoV-2和SARS-CoV的重组S蛋白质粒，通过纯化两种S蛋白，或通过生物信息学筛选姊妹病毒的通用S抗原表位；将全长抗体进行小型化，开发表位抗体；利用复合S抗原，获得一种安全高效、快速制备、成本低廉、能够杀灭两种SARS-CoV-2和SARS-CoV S姊妹病毒的抗体。

可通过如下具体步骤制备获得：

步骤1，构建SARS-CoV-2和SARS-CoV重组S蛋白

构建SARS-CoV-2、SARS-CoV重组S蛋白的pcDNA6B-FLAG质粒，转染HEK-293细胞，通过抗性筛选获得稳定表达株，扩大培养后裂解细胞，RT-PCR和免疫印迹鉴定，Flag吸附柱亲和层析纯化S蛋白，酶切去除FLAG标签。

步骤2，生物信息学进行抗原表位筛选：

应用生物信息学技术，分析两种病毒亚型筛选S蛋白的受体结合域(receptorbinding domain,RBD)抗原表位，构建表位多肽，将合成的多肽与恢复期COVID-19病人血清进行交叉反应，筛选最佳抗原表位多肽。

步骤3，制备特异性抗SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白的IgY抗体

利用IgY产生的原理，将重组S蛋白或抗原表位多肽作为抗原与弗氏佐剂乳化制备免疫制剂，采用多次多点双翅下肌肉注射的方式免疫产蛋来航鸡；收集免疫前一周及免疫后四个月内的鸡蛋；通过水稀释、饱和硫酸铵溶液沉淀及离心过滤器等纯化方法，获得纯净的IgY抗体，SDS-PAGE蛋白电泳检测IgY纯度，Western blot法鉴定IgY的特异性；间接ELISA法检测鸡IgY各周期的效价变化；BCA法测定蛋白浓度。加速实验法37℃90天评价热稳定性。

进一步地，新型冠状病毒的S全蛋白和非典型肺炎病毒的S全蛋白按照质量配比1:1混合作为重组抗原；或者新型冠状病毒和非典型肺炎病毒两者各自的S蛋白受体结合域的表位肽，按质量配比1:1比例混合为复合抗原表位肽作为重组抗原。

上述的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体在制备预防和治疗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎制剂中的应用。

一种用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂，组分包含上述的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体。

本发明提供的用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂，能够同时适用于杀灭新型冠状病毒和非典型肺炎病毒两种病毒，是一种广谱杀灭两种病毒的喷剂；所述喷剂不依托全毒株为免疫原，降低灭活不彻底、散毒和病毒残存等风险；所述喷剂是一种可适用于鼻腔、口腔、皮肤等部位的复合生物消毒喷剂，弥补防控制剂缺乏的不足；所述抗体制剂有特异性中和病毒作用，能有效控制传染源、保护易感人群、一线医护人员消毒防护，预防新型冠状病毒传播。

进一步地，所述抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体在喷剂中的效价≥1:32。

本发明具有如下的优点和有益效果：

SARS-CoV-2和SARS-CoV结构相似性高达80％，但是也存在编码蛋白的差异。作为典型的单链RNA病毒，其可怕的变异性才最值得警惕，因此研发功能强大、靶向性高、可同时中和两种姊妹病毒的广谱治疗性抗体成为研究的焦点。基于目前构建的SARS-CoV-2和SARS-CoV重组S蛋白、生物信息学筛选姊妹病毒的S抗原表位，研发并制备广谱杀灭两种病毒、适用于鼻腔、口腔、皮肤等部位的复合生物消毒喷剂，弥补防控制剂缺乏的不足。该抗体制剂有特异性中和病毒作用，能有效控制传染源、保护易感人群、一线医护人员消毒防护，预防新型冠状病毒传播；该喷剂不依托全毒株为免疫原，降低灭活不彻底、散毒和病毒残存等风险。

本发明提供的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体制备原理为：合成SARS-CoV-2和SARS-CoV的重组S蛋白按1:1比例混合组成复合抗原，或复合抗原表位，免疫产蛋禽类后，从免疫禽蛋中获得的针对免疫抗原产生的特异性抗体，再加入稳定剂制备成喷剂。通过生物技术提取的禽类卵黄抗体，具有特异性广谱中和、清除SARS-CoV-2和SARS-CoV的作用。

本发明提供的抗体喷剂为体内应用的特异性广谱SARS-CoV-2和SARS-CoV联合消毒喷剂，其主要成分为通过生物技术提取的禽类卵黄复合IgY抗体，抗体具有特异性中和、清除姊妹冠状病毒的作用。在流行时期，使用者早中晚分别于口腔、鼻腔、手部皮肤表面各处喷此抗体喷剂一次，每次约0.5ml，能有效预防新型冠病毒和非典型肺炎病毒的侵入，实现控制传染源、保护易感人群的效果。且所述抗体喷剂具有以下优势：

1、容易快速生产：两种病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV的结构蛋白S是质粒重组抗原或生信方法筛选的表位抗原，能大量快速扩增，制成大量抗原，免疫禽类，产生特异性卵黄抗体，用于保护易感人群，杀灭病毒；尤其在目前新型冠状病毒肺炎没有疫苗的情况下非常重要；

2、特异性强：用联合S抗原或表位肽免疫禽类，也可将其产生的抗体通过产卵的方式垂直传给子代储存于卵黄中，同样使子代获得免疫力。这种存在于禽类卵黄中的免疫球蛋白即为卵黄抗体；产生的特异性抗体，广谱杀灭SARS-CoV-2、SARS-CoV病毒；

3、安全性高：本发明提供的喷剂不会产生血清交叉反应或过敏反应；没有使用抗生素出现的弊病；为完全的生物制剂成分，对人体皮肤、黏膜没有刺激反应，感受良好；从禽类产蛋中提取，绿色环保，适合所有人使用，这是一般化学消毒剂不能比拟的。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体制备流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

本实施例提供了一种抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体，具体制备方法如下所示：

1、制备SARS-CoV-2和SARS-CoV的复合抗原

(1)构建SARS-CoV-2和SARS-CoV复合S蛋白

构建两种病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV真核表达载体pcDNA6B-FLAG-S，分别转染HEK-293细胞，通过抗性筛选获得稳定表达株，扩大培养后裂解细胞，RT-PCR和免疫印迹鉴定，Flag吸附柱亲和层析纯化S蛋白，酶切去除FLAG标签。

(2)构建SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白受体结合域抗原表位：应用生物信息学预测2种病毒亚型蛋白二级结构和HLA表位；重叠PCR构建RBD的融合基因，linker连接后将合成的多肽与恢复期病人血清进行中和反应，测定抗原性。

SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白抗原表位肽氨基酸序列如下所示

a、B细胞表位肽：

GSTPCNGVEGFNCYFP

FERDISTEIYQAGSTP

EGFNCYFPLQSYGFQP

TGKIADYNYKLPDDFT

TNLCPFGEVFNATKFP

MGCVLAWNTRNIDATS

GSTPCNGVEGFNCYFP

SLQTYVTQQLIRAAEIR

DVVNQNAQALNTLVKQL

b、T细胞表位肽

GTGVADYNY

YRVVVSHAA

NYNYLYRLF

YRLFRKSNL

YYRVVVSNA

GYYRVVVSH

TGKADYNYK

GYQPYRVVVL

QLIRAAEIRASANLAATK

2、复合IgY抗体的制备：

(1)免疫产蛋鸡：采用1mg/mL的复合抗原，用等体积的弗氏完全佐剂(初次免疫)或弗氏不完全佐剂(再次免疫)充分乳化制成疫苗，初次免疫采用皮下多点注射，每只鸡注射弗氏完全佐剂疫苗1mL；再次免疫采用肌肉多点注射，每只鸡注射弗氏不完全佐剂疫苗1mL。其中初次免疫后第2、4、6、10周分别再次免疫。收集5月内鸡蛋。

(2)IgY抗体效价筛选：从免疫后鸡蛋中分离蛋黄，采用灭菌蒸馏水按1:9(g/v)比例稀释。并用1mol/L盐酸调节pH值为5.0～5.2，4℃放置过夜。10000r/min离心15min，取上清液，得水溶性组分(WSF)。抗体效价测定采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。复合S抗原以浓度5μg/mL包被ELISA板，将疫苗免疫后不同时间收集的WSF先用蒸馏水1:100(v/v)稀释，再等比稀释加入ELISA板中。同时加入空白对照(生理盐水)，阴性对照(未免疫蛋黄的WSF,蒸馏水1:100稀释)，然后加入酶标IgY二抗(1:3 000)，以TMB底物溶液显色，2mmol/L硫酸终止，酶标仪450nm处测吸光度(A值)。实验孔A值大于阴性对照孔A值2.1倍的最大稀释度即为效价。收集高效价期间的鸡蛋用于后续IgY的提取。

(3)IgY抗体提取及纯化：抗体的产生呈现节律性的变化，分别在8周和16周达到高峰，效价在1:6400左右，选取高效价期间(1:1600～6400，7～17周)的所有鸡蛋进行WSF上清液的收集，然后缓缓加入饱和硫酸铵溶液使终浓度为50％，同时用搅拌子轻轻搅拌，静置4℃放置过夜，离心留沉淀并溶于等体积的0.1mol/L、pH为7.4的PBS中。缓缓加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为33％，轻轻搅拌混匀，静置，离心留沉淀并溶于原卵黄液等体积的蒸馏水中。采用Amicon UItra-100K离心过滤器纯化。SDS-PAGE检测IgY蛋白的纯度，要求大于90％，BCA法测定蛋白浓度，要求不低于1mg/ml。

(4)IgY抗体稳定性评价：加速实验法37℃90天抗体效价和蛋白含量没有明显改变。

实施例2

本实施例提供了一种用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂，具体制备步骤如下所示：

特异性鸡卵黄抗体(SARS-CoV-2抗体≥1:32和SARS-CoV抗体≥1:32)；辅料用量(质量百分含量)：薄荷香精0.1％、三氯蔗糖0.08％、甘氨酸0.2％等。

实施例3

本实施例给出了实施例2提供的用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂的使用方法：

用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂作为一种特异性复合IgY抗体喷剂，能与SARS-CoV-2、SARS-CoV病毒的S结构蛋白特异结合，主要用于中和、杀灭口咽部、鼻腔和皮肤等部位的病毒。

1、剂型、规格：水溶液喷雾剂，18ml/瓶；

2、组成和性状：本品系用SARS-CoV-2和SARS-CoV的复合S抗原或抗原表位，免疫产蛋母鸡后，收集鸡蛋、分离纯化IgY免疫球蛋白，经除菌、病毒灭活后，加入适量稳定剂制成。无色、澄明、带乳光的液体。

3、主要成分和含量：抗新型冠状肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体；

特异性鸡卵黄抗体(SARS-CoV-2抗体≥1:32和SARS-CoV抗体≥1:32)。

4、使用用途：

(1)对口腔、鼻腔和手部皮肤等部位的新新型冠状病毒和非典型病毒病毒有特异性中和作用，能有效阻断病毒入侵、建立局部免疫屏障，预防新型冠状病毒和非典型病毒人际间传播，保护易感人群。

(2)对口腔、鼻腔和手部皮肤有消毒和清洁作用，能减少感染者的病毒载量，降低传播危害，加快病程恢复。

5、使用方法：

(1)在流行时期，用于易感人群消毒时，喷雾于口腔、鼻腔和手部皮肤，早中晚各使用一次，每次按压3～5下(约0.5ml)，保留10分钟，饮水后宜加喷一次。

(2)用于感染者清除病毒时，约间隔2h使用一次，每次按压5～8下(约1ml)，保留10分钟。可根据不同情况酌情重复使用。

6、注意事项：本品能在黏膜皮肤上附着较长时间，可间隔使用。鸡卵黄抗体产品在体表使用，一般不会发生副作用。对鸡蛋高度过敏者慎用。儿童需在家长指导下使用。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体，其特征在于，通过以下方法制备得：构建新型冠状病毒和非典型肺炎病毒的重组抗原；以重组抗原制备免疫制剂免疫产蛋禽类，从免疫禽蛋中获得的特异性复合IgY抗体。

2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体，其特征在于，所述复合抗原包括新型冠状病毒和非典型肺炎病毒重组S蛋白、或者新型冠状病毒和非典型肺炎病毒的S蛋白表位多肽。

3.根据权利要求2所述的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体，其特征在于，新型冠状病毒的S全蛋白和非典型肺炎病毒的S全蛋白按照质量配比1:1混合作为重组抗原；或者新型冠状病毒和非典型肺炎病毒两者各自的S蛋白受体结合域的表位肽，按质量配比1:1比例混合为复合抗原表位肽作为重组抗原。

4.权利要求1至3任一项所述的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体在制备预防和治疗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎制剂中的应用。

5.一种用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂，其特征在于，组分包含权利要求1或2所述的抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体。

6.根据权利要求5所述的用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂，其特征在于，所述抗新型冠状病毒肺炎和非典型肺炎的复合IgY抗体在喷剂中的效价≥1:32。