JPWO2011024748A1 - インフルエンザm2由来の改変ペプチドワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク2の2〜24位のアミノ酸配列から成るペプチド(M2e)にシステイン残基が挿入された改変ペプチド。
〔2〕インフルエンザウイルスが、A型であることを特徴とする、〔1〕に記載の改変ペプチド。
〔3〕前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位のアミノ酸間よりC末側であることを特徴とする、〔1〕又は〔2〕に記載の改変ペプチド。
〔4〕前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位、20位と21位、21位と22位、22位と23位、又は23位と24位のアミノ酸間の何れか一つ、またはこれらの二つ以上の組み合わせからなることを特徴とする、〔3〕に記載の改変ペプチド。
〔5〕前記システイン残基の挿入総数が、1〜5個であることを特徴とする、〔1〕ないし〔4〕の何れかに記載の改変ペプチド。
〔6〕前記の各挿入位置に対するシステイン残基の挿入数が、最大3個であることを特徴とする、〔5〕に記載の改変ペプチド。
〔7〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチドとポリペプチドからなる融合タンパク質。
〔8〕ポリペプチドがアネキシンV又はアルブミンであることを特徴とする、〔7〕に記載の融合タンパク質。
〔9〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチド又は〔7〕又は〔8〕に記載の融合タンパク質を有効成分として含有するインフルエンザワクチン。
〔10〕〔9〕に記載のインフルエンザワクチンを含んでなる、生物学的障壁を横切って生体内に送達可能なデバイス。
〔11〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチド又は〔7〕若しくは〔8〕に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸断片。
〔12〕〔11〕に記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクター。
〔13〕〔12〕に記載の発現ベクターが導入された宿主。
〔14〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチドを認識し、インフルエンザウイルスに対する防御効果を有する抗体。
以下、実施例に従って更に詳述するが、本発明は、何らこれらの実施例に限定されるものではない。
1.材料と方法
(1)M2eCペプチド
M2eCペプチド作製の鋳型としたM2eのアミノ酸配列は、よりユニバーサルな配列(1999 Nature Med.5:1157-1163)を持つA/New Caledonia/20/1999(H1N1)株(GeneBank Accession number ACF41880)の配列をもとに合成した(株式会社ベックス)。表1に合成したM2e及び各M2eCペプチドを示した。合成した各ペプチドは1mM EDTAを含有する窒素ガス置換した注射用蒸留水にて5mg/mLに調製し、これを原液として使用時まで-80℃以下で保存した。
雌のBALB/c(7週齢、SPF、日本チャールズリバー社)をSPF環境下で予備飼育した。約1週間の予備飼育の後、免疫実験を実施した。
(3)-1 M2eにシステイン残基1個を挿入したM2eCペプチドの免疫原性評価
24匹のマウスを一群4匹の6群に分け、表2に示すように各群にM2e及び5種のM2eCペプチドを免疫した。
24匹のマウスを4匹ずつの6群に分け、表3に示すように各群にM2e及び5種のM2eCペプチドを免疫した。
32匹のマウスを4匹ずつの8群に分け、表4に示すように各群にM2e及び7種のM2eCペプチドを免疫した。
免疫の前日に-80℃以下で保存中の各ペプチド原液をPBS(INVITROGEN社)で1mg/mLに希釈し、等量のAlumアジュバント(ALHYDROGEL, BRENNTAG BIOSECTOR社)と混合して一夜静置した。
前日に調製した各免疫物をPBSで0.2mg/mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いて背部皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:各ペプチド20μg)。免疫は2週間隔で2回行った。
2回目の免疫から2週間後にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血して殺処分した。採取した血液はマイクロティナ(BECTON DICKINSON社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心により血清を分離した。分離した血清は測定まで-20℃にて保存した。
各免疫群の抗M2e抗体上昇を比較するために、抗M2e抗体を有するマウス標準血清として、上記表1のM2e(10μg/body/shot)とAlumアジュバントを背部皮下に3週間間隔で3回免疫したマウス15匹分の血清をプールし、標準血清とした。
M2eを0.1M Carbonate buffer, pH9.6で2μg/mLに希釈し、96-well plate(Nunc社、Immobilizer Amino)に100μL/well加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各wellを300μLの0.05%Tween20含有リン酸緩衝液(PBST)で3回洗浄し、0.1M Carbonate buffer, pH9.6で10mMに希釈したモノエタノールアミン(和光純薬)を300μL/wellずつ添加して、室温で1時間静置した。
32匹の未免疫マウス(C57BL/6、雄)血清を検体希釈液にて200倍希釈し、各希釈検体をduplicateにてそれらのOD450値を測定した。測定したOD450値の平均値にその標準偏差値の2倍を加えた値をカットオフ値と設定した。次に、標準血清を15,000倍から960,000倍まで2倍段階希釈してそのOD450値を測定し、カットオフ値を超える最大希釈倍率を標準血清の抗体価とした。なお、本試験系では約400,000倍希釈までカットオフ値を超えたことから、標準血清原液の抗M2e抗体価を400,000単位とした。
各種ペプチドを免疫した各群のマウス血清の抗体価は以下のようにして算出した。先ず、標準血清を検体希釈液にて1, 2, 4, 8, 16, 32単位となるように希釈し、抗体価測定時のスタンダードを調製した。次に各免疫群のマウス血清を調製したスタンダードの範囲に入るように検体希釈液にて希釈した。以上のように調製した被検試料を実施例1-(8)に示す系にて測定し、得られたスタンダードの単位とOD450値の標準直線より各被検マウス血清の抗M2e抗体価を算出した。
2週間間隔で2回免疫後2週間目に採血したM2e及び1個のシステイン残基を挿入した各種M2eCペプチド免疫群の抗M2e抗体価を図1に示した。図1に示すように、M2eの21位と22位間にシステイン残基を挿入したM2eC22ペプチドを除き、M2eCペプチド免疫群ではM2e免疫群に比較して、抗M2e抗体価が2倍から4倍に上昇した。
1.材料と方法
(1)ペプチド
実施例1で使用したM2eCペプチドのうちM2eC212223を使用した。
凍結保存中のインフルエンザウイルス(A/PR8/8/34株、H1N1)を使用した。
実施例1-(2)と同様の方法により行なった。
30匹のマウスを10匹、8匹、12匹の3群に分け、表5に示すように1群と2群にM2eC212223を各々2μg及び20μg免疫し、3群はペプチド非投与群とした。
初回免疫は、免疫日当日に、-60℃以下で保存中のM2eC212223原液をPBS(INVITROGEN社)で0.04mg/mL及び0.4mg/mLに希釈し、等量のフロインドのコンプリートアジュバントと混合し、マウス1匹あたり100μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いて背部皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:2μg又は20μg)。コントロールとなる第三群ではペプチド溶液の代わりにPBSを使用した。二回目の免疫も、初回免疫と同様に調製した。ただし、アジュバントにはフロインドのインコンプリートアジュバントを使用した。免疫は2週間隔で2回行った。
2回目の免疫から1週間後、凍結保存中のインフルエンザウイルス(A/PR8株)液をPBSで希釈し、セボフレン(丸石製薬)麻酔下、マウス一匹あたり20μL(5LD50相当)ずつ経鼻投与した。
被検マウスについて、ウイルス攻撃時より21日目まで観察し、その生死を記録した。
インフルエンザウイルス攻撃後のマウス観察の結果、表6に示すように、M2eの20位と21位、21位と22位及び22位と23位にシステイン残基を1個ずつ、計3個のシステイン残基を挿入したM2eC212223免疫群は、ペプチド非投与群に比べ、高い生存率を示した。この結果から、M2eC212223ペプチドは、マウス一匹あたり2μgの免疫でもインフルエンザウイルスに対して効果的な発症抑制効果を有することが明らかとなった。
1.材料と方法
(1)免疫に使用したペプチドと攻撃ウイルス
ホモのウイルス攻撃系では実施例1で使用したM2e及びM2eC212223を免疫に使用し、ヘテロのウイルス攻撃系では2009年に流行した新型インフルエンザウイルス(A/H1N1型)のM2配列を基に、合成したswM2e及びswM2eC212223を使用した(株式会社ベックス)。合成したペプチドは実施例1に示す方法で原液を調製し、使用時まで-60℃以下で保存した。また、攻撃ウイルスは実施例2と同じインフルエンザウイルスを使用した。
実施例1-(2)と同様の方法により行なった。
(3)-1 ホモのウイルス攻撃系での発症防御能評価
24匹のマウスを8匹ずつの3群に分け、表8に示すように1群にM2e、2群にM2eC212223ペプチドを免疫し、3群はペプチド非投与群(Alum単独群)としてペプチドの代わりにPBSを投与した。
60匹のマウスを10匹ずつの6群に分け、表9に示すように1群及び2群にswM2e、3群及び4群にswM2eC212223ペプチドを免疫し、5群及び6群はペプチド非投与群とした。5群にはAlumアジュバント、6群にはPBSのみを投与した。
(4)-1 ホモのウイルス攻撃系での発症防御能評価
免疫の前日に、実施例1-(4)と同様の方法により調製した。翌日、調製した各免疫物をPBSで0.02mg/mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いて背部皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:各ペプチド2 μg)。免疫は2週間隔で2回行った。なお、ウイルス攻撃の前日(2回目の免疫から6日目)にマウスの尾静脈より部分採血を行い、実施例1-(6)と同様に血清を分離し、抗M2e抗体価の測定まで-20℃以下に保存した。
免疫の前日に、実施例1-(4)と同様の方法により調製した。翌日、調製した各免疫物をPBSで0.02mg/mL又は0.2mg/mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いて背部皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:各ペプチド2又は20μg)。免疫は2週間隔で2回行い、本実施例の(4)-1と同様にウイルス攻撃前日の血清を採取・保存した。
各被検マウス血清の抗M2e抗体価の測定は実施例1と同様に行った。
実施例2と同様に行った。
被検マウスについて、ウイルス攻撃時より21日目まで観察し、その生死を記録した。
ホモのウイルス攻撃系において、図4に示すように、ヒトでの使用が認められているAlumアジュバントでもM2eC212223の2μg免疫群では高い抗M2e抗体価(攻撃ウイルスのM2e配列とほぼ同じ配列のペプチドに対する抗体)を誘導することができた。しかし、システイン残基を挿入していないM2e免疫群では、2μgでは抗M2e抗体価を誘導することはできなかった。さらにウイルス攻撃後の結果をみると、表10に示すように、M2eC212223免疫群は、M2e免疫群及びペプチド非投与群に比べ、明らかに高い生存率を示した。この結果から、M2eC212223ペプチドは、その配列とほぼ同じM2e配列を持つインフルエンザウイルスの攻撃に対して、ヒトでの使用が認められているAlumアジュバントでも高い発症防御効果を有することが明らかとなった。また、M2eペプチドに比べてM2eC212223ペプチドの方が発症防御能が高いことも明らかとなった。
Claims (14)
- インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク2の2〜24位のアミノ酸配列から成るペプチド(M2e)にシステイン残基が挿入された改変ペプチド。
- インフルエンザウイルスが、A型であることを特徴とする、請求項1に記載の改変ペプチド。
- 前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位のアミノ酸間よりC末側であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の改変ペプチド。
- 前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位、20位と21位、21位と22位、22位と23位、又は23位と24位のアミノ酸間の何れか一つ、またはこれらの二つ以上の組み合わせからなることを特徴とする、請求項3に記載の改変ペプチド。
- 前記システイン残基の挿入総数が、1〜5個であることを特徴とする、請求項1ないし4の何れか一項に記載の改変ペプチド。
- 前記の各挿入位置に対するシステイン残基の挿入数が、最大3個であることを特徴とする、請求項5に記載の改変ペプチド。
- 請求項1ないし6の何れか一項に記載の改変ペプチドとポリペプチドからなる融合タンパク質。
- ポリペプチドがアネキシンV又はアルブミンであることを特徴とする、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 請求項1ないし6の何れか一項に記載の改変ペプチド又は請求項7又は8に記載の融合タンパク質を有効成分として含有するインフルエンザワクチン。
- 請求項9に記載のインフルエンザワクチンを含んでなる、生物学的障壁を横切って生体内に送達可能なデバイス。
- 請求項1ないし6の何れか一項に記載の改変ペプチド又は7若しくは8に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸断片。
- 請求項11に記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクター。
- 請求項12に記載の発現ベクターが導入された宿主。
- 請求項1ないし6の何れか一項に記載の改変ペプチドを認識し、インフルエンザウイルスに対する防御効果を有する抗体。
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