ES2682998T3 - Vacuna de péptido modificado derivada de M2 de influenza - Google Patents
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Abstract
Un péptido modificado que se prepara insertando uno o varios residuos de cisteína en un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de las posiciones Núm. 2 a Núm. 24 de la proteína matriz 2 en el virus de la influenza (M2e), en donde dichos uno o varios residuos de cisteína se insertan una posición entre la Núm. 20 y la Núm. 21 de M2e, o en una combinación de dos o más posiciones entre la Núm. 15 y la Núm. 16, entre la Núm. 20 y la Núm. 21, entre la Núm. 21 y la Núm. 22, entre la Núm. 22 y la Núm. 23 y entre la Núm. 23 y la Núm. 24 de M2e.
Description
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DESCRIPCION
Vacuna de peptido modificado derivada de M2 de influenza Campo tecnico
La presente invencion esta definida por las reivindicaciones. La presente invencion se refiere a un peptido modificado que se prepara insertando uno o varios residuos de cistema en un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos de las posiciones Num. 2 a Num. 24 de la protema matriz 2 en el virus de la influenza (M2e), en donde dichos uno o varios residuos de cistema se insertan en una posicion entre la Num. 20 y la Num. 21 de M2e, o en una combinacion de dos o mas posiciones entre la Num. 15 y la Num. 16, entre la Num. 20 y la Num. 21, entre la Num. 21 y la Num. 22, entre la Num. 22 y la Num. 23 y entre la Num. 23 y la Num. 24 de M2e.
Tecnica anterior
El virus de la influenza pertenece a la familia Orthomyxoviridae y es un virus de ARN monocatenario de hebra negativa. El tamano de la partmula viral es de 80 a 120 nm. La partmula viral tiene aglutinina eritrocitaria (hemaglutinina, HA), neuraminidasa (NA) y protema matriz 2 (M2) en la membrana bicapa lipfdica de la capa superficial, que esta revestida con protema matriz 1 (M1). Un ARN de hebra negativa segmentado dentro de la capa superficial forma un complejo (RNP) con una protema nuclear (NP) y una ARN polimerasa (PA, PB1, PB2). El virus de la influenza se clasifica en tipo A, B o C dependiendo de la antigenicidad de la protema interna, entre los cuales el tipo A y el tipo B pueden causar una epidemia de influenza en seres humanos. Es el tipo A el que puede causar una pandemia de influenza con una potente patogenicidad. Para el virus de la influenza tipo A, se sabe que hay muchos serotipos resultantes de la combinacion de 16 subtipos para HA y 9 subtipos para NA.
Se sabe que, en general, un virus de ARN es susceptible a la mutacion. El virus de la influenza no es una excepcion y su antigenicidad ha cambiado ano tras ano a traves de la mutacion puntual de un gen que codifica HA o NA (deriva antigenica). Para el virus de la influenza tipo A, se sabe que una nueva cepa de virus antigenicamente diferente se desarrolla por una mutacion discreta que reemplaza uno o ambos HA y NA por otro u otros subtipos en un intervalo de varias decadas (cambio antigenico). La mutacion viral de la influenza por la deriva y/o cambio antigenico continuamente causa danos a los seres humanos. En el pasado, se habfan producido varios cambios de antigenicidad en el mundo, que causaban epidemias (pandemias) que produdan muchas vmtimas. Espedficamente, hubo gripe espanola en 1918, gripe asiatica en 1957, gripe de Hong Kong en 1968 y gripe rusa en 1977.
La influenza causada por la infeccion del virus de la influenza es una de las enfermedades infecciosas graves que se producen en epidemias a escala mundial. Ha habido muchos casos de muerte o encefalitis en ancianos, ninos o pacientes con un sistema inmunologico debil. Incluso si la infeccion por el virus de la influenza no provoca la muerte en los pacientes, los smtomas ffsicos como fiebre, dolor de cabeza y fatiga pueden obligar a los pacientes a suspender las actividades sociales durante un penodo de tiempo determinado, lo que da como resultado una gran perdida economica. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer una medida preventiva eficaz incluso contra una nueva cepa de virus, debido a la mayor probabilidad de que se produzca una nueva cepa de virus por cambio de antigenicidad, ademas de la importancia de la proteccion convencional contra la infeccion por virus de la influenza.
Una medida preventiva contra la influenza es realizar la vacunacion todos los anos. Las vacunas actualmente en uso practico son vacunas divididas que comprenden como ingrediente principal HA purificada a partir de una cepa para la preparacion de una vacuna cultivada con huevos embrionados de pollo. Por lo tanto, como cepa para la preparacion de una vacuna se utiliza un virus que se predice que aparecera en epidemias en el ano. Por lo tanto, es necesario determinar una cepa para la preparacion de una vacuna cada ano prediciendo la cepa que causa epidemias, y en caso de disparidad entre la cepa para la preparacion de una vacuna y la cepa que causa epidemias, la vacuna sena menos efectiva. En comparacion con las vacunas que brindan inmunidad durante al menos varios anos con un solo calendario de vacunacion como DPT (difteria, tos ferina, tetanos) y encefalitis japonesa, las vacunas actuales contra la influenza necesitan vacunacion cada ano y por lo tanto son inconvenientes tanto para quienes reciben la vacuna como para los medicos que se inyectan la vacuna y sena una carga para el gasto. Ademas, en caso de que se produzca una cepa de virus diferente de una cepa de virus esperada debido a un fallo en la prediccion de epidemias, los que reciban la vacuna podna aun ser infectados por el virus de la influenza a pesar de la vacunacion. En particular, en caso de que se produzca una nueva cepa de influenza generada por cambio que de como resultado una antigenicidad significativamente diferente, dado que diffcilmente se esperanan efectos protectores con las vacunas convencionales contra la influenza, se producina una prevalencia explosiva del virus, la llamada pandemia.
Como se describio anteriormente, debido a que las vacunas actuales contra la influenza no pueden hacer frente de manera suficiente a la mutacion en el virus, es altamente deseada una vacuna universal contra la influenza menos afectada por la mutacion antigenica para resolver dicho problema.
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Puesto que el virus de la influenza que causa dicha epidemia es el virus de la influenza tipo A, se obtendna una vacuna contra la influenza deseada no solo contra la epidemia anual sino tambien contra la pandemia desarrollando una vacuna que proporcione inmunogenicidad comun en el virus de la influenza tipo A. Desde ese punto de vista, se realizado una vacuna que se dirige a una protema M2 comun en el virus de la influenza tipo A (Vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 1). La protema M2 es una protema de superficie viral con una secuencia de aminoacidos relativamente bien conservada entre virus de la influenza tipo A. Esta presente en una cantidad relativamente pequena en partmulas de virus de la influenza (Vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 2) pero se expresa a un nivel relativamente alto en celulas infectadas con virus (Vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 3).
Se ha informado de que un anticuerpo contra M2 inhibe la replicacion del virus de la influenza tipo A tanto en modelos in vivo como in vitro (Vease, por ejemplo, las Referencias no relacionadas con patentes 4 y 5). Ademas, Slepushkin et al. Han informado de que, en ratones a los que se inocula M2, se previene la infeccion mortal por virus de la influenza heterologa tipo A y se facilita la eliminacion del virus del tejido pulmonar (Vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 1). Tambien se ha informado de que una protema M2 modificada en la que se elimina un dominio transmembrana hidrofobo es util para la preparacion de una vacuna (vease, por ejemplo, la Referencia de patente 1).
Por otro lado, Neirynck et al., han informado de que se utiliza como antfgeno de vacuna un dominio extracelular de M2 fusionado al N-terminal de un antigeno central del virus de la hepatitis B (Vease, la Referencia no relacionada con patentes 6). De acuerdo con Neirynck et al., se expresa en E. coli una partmula central del virus de la hepatitis B que expone M2 sobre su superficie, la partmula se purifica de la E. coli, y se induce un anticuerpo contra M2 administrando la partmula junto con un coadyuvante.
Asimismo, con un experimento que utiliza ratones, Wu et al. (Vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 7) y Mozdzanowska et al. (Vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 8) han informado de que un peptido (M2e) que corresponde a una region que consiste en 23 residuos de aminoacidos generados despues de la eliminacion de un dominio transmembrana hidrofobo de M2 tambien puede proteger de la infeccion fatal por virus de la influenza heterologo tipo A mediante la utilizacion de un coadyuvante o un peptido de oligomero denominado MAP. Tambien se revela que esta presente al menos uno de los epftopos contra el anticuerpo protector producido por inmunizacion con M2e en una region de aminoacidos desde las posiciones Num. 6 a Num. l3 de M2e (Vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 9).
La preparacion de las vacunas convencionales contra la influenza requirio procesos largos y laboriosos, es decir, prediciendo primero una cepa de virus prevalente en el ano, adaptando el virus al cultivo en huevos, cultivando el virus en una gran cantidad de huevos, aislando el virus del cultivo, inactivando el virus y purificando una protema antigenica. El desarrollo de una nueva vacuna que haga innecesario predecir una cepa de virus prevalente en el ano para preparar una cepa de vacuna y que pueda hacer frente a una pandemia contribuina en gran medida al bienestar nacional y reducina los gastos medicos.
Referencia de patente 1: Patente de Estados Unidos Num. 6169175 Referencia de patente 2: Documento JP-A-2001-512748
Referencia no relacionada con patentes 1: Slepushkin etal., 1995, Vaccine 13: pag. 1399-1402 Referencia no relacionada con patentes 2: Zebedee y Lamb, 1988 J. Virol. 62: pag. 2762-2772 Referencia no relacionada con patentes 3: Lamb et al., 1985 Cell 40: pag. 627-633 Referencia no relacionada con patentes 4: Hughey et al., 1995 Virology 212: pag. 411-421 Referencia no relacionada con patentes 5: Treanor et al., 1990 J. Virol. 64: pag. 1375-1377 Referencia no relacionada con patentes 6: 1999 Nature Med. 5: pag. 1157-1163 Referencia no relacionada con patentes 7: 2007 Vaccine 25: pag. 8868-8873 Referencia no relacionada con patentes 8: 2007 Virology J. 4: 118 doi: 10.1186/1743-422X-4-118 Referencia no relacionada con patentes 9: Wanli et al., 2004 Immunol. Lett 93: pag. 131-136
Descripcion de la invencion
(Problema tecnico a resolver por la invencion)
Un objeto de la presente invencion es proporcionar un peptido modificado que tiene una potente inmunogenicidad derivada de la protema matriz 2 (en lo sucesivo tambien denominada "M2"), una de las protemas de la capa superficial del virus de la influenza y un metodo para la utilizacion del peptido modificado.
(Medios para resolver los problemas)
Bajo las circunstancias, los autores de la presente invencion han continuado investigando asiduamente para
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alcanzar el objeto descrito anteriormente y como consecuencia han encontrado que un peptido (en lo sucesivo tambien denominado "peptido M2eC") que se forma mediante la insercion de uno o varios residuos de cistema en un peptido (en lo sucesivo tambien denominado "M2e") que consta de 23 residuos de aminoacidos de las posiciones Num. 2 a Num. 24 de M2 en el virus de la influenza tipo A tiene una inmunogenicidad mucho mayor (de dos a 20 veces mayor) que la que se habfa referido$para M2e hasta ahora para completar asf la presente invencion.
De acuerdo con la presente invencion, se proporcionan el peptido M2eC que se forma insertando uno o varios residuos de cistema en un peptido (M2e) que consiste en 23 residuos de aminoacido de las posiciones Num. 2 a Num. 24 de M2 (Vease, la Referencia de patente 2), consistiendo dicho M2 en 97 residuos de aminoacido y siendo una de las protemas de la capa superficial; una protema de fusion del peptido M2eC y otro polipeptido; una vacuna contra la influenza que comprende el peptido M2eC o la protema de fusion como ingrediente activo; un fragmento de acido nucleico que consiste en una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos del peptido M2eC o la protema de fusion; un vector de expresion (que incluye un vector de virus) en el que se incorpora el fragmento de acido nucleico; y un anfitrion en el que se introduce el vector de expresion y un anticuerpo que reconoce M2.
El peptido M2eC y el fragmento de acido nucleico que consiste en una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos del peptido M2eC pueden utilizarse eficazmente para la prevencion y el tratamiento de la infeccion por influenza. Por lo tanto, la presente invencion incluye lo siguiente:
[1] Un peptido modificado que se prepara insertando uno o varios residuos de cistema en un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos de las posiciones Num. 2 a Num. 24 de la protema matriz 2 en el virus de la influenza (M2e), en donde dichos uno o varios residuos de cistema se inserta o insertan en una posicion entre la Num. 20 y la Num. 21 de M2e, o en una combinacion de dos o mas posiciones entre la Num. 15 y la Num. 16, entre la Num. 20 y la Num. 21, entre la Num. 21 y la Num. 22, entre la Num. 22 y la Num. 23 y entre la Num. 23 y la Num. 24 de M2e.
[2] El peptido modificado del apartado [1], en donde el virus de la influenza es el virus de la influenza tipo A.
[3] El peptido modificado del apartado [1], en donde el numero total de dichos residuos de cistema insertados es de 1 a 5.
[4] El peptido modificado del apartado [3], en donde el numero de residuos de cistema insertados en cada posicion insertada es de hasta 3.
[5] Una protema de fusion que consiste en el peptido modificado de cualquiera de los apartados [1] a [4] y un polipeptido.
[6] La protema de fusion del apartado [5], en donde el polipeptido es anexina V o albumina.
[7] Una vacuna contra la influenza que comprende el peptido modificado de cualquiera de los apartados [1] a
[4] o la protema de fusion del apartado [5] o [6] como ingrediente activo.
[8] Un dispositivo que puede administrarse al organismo a traves de una barrera biologica, comprendiendo dicho dispositivo la vacuna contra la influenza del apartado [7] y dicho dispositivo seleccionado entre una microaguja y un parche de gel hidrofilo en diversas formas para inducir inmunidad a traves de la piel, y diversas capsulas entericas, liposomas y partmulas de virus sin envoltura para inducir inmunidad a traves del tracto intestinal.
[9] Un fragmento de acido nucleico que consiste en una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos del peptido modificado de cualquiera de los apartados [1] a [4] o la protema de fusion del apartado [5] o [6].
[10] Un vector de expresion en el que se incorpora el fragmento de acido nucleico de [9].
[11] Un anfitrion en el que se introduce el vector de expresion del apartado [10].
[12] Un metodo de produccion de
(a) los peptidos o protemas de fusion modificados de uno cualquiera de los apartados [1] a [6] que comprende la expresion de los peptidos modificados o las protemas de fusion de un vector introducido en un anfitrion, o (b) los peptidos modificados de cualquiera de los apartados [1] a [4] que comprende la smtesis qrnmica de los peptidos modificados.
Tambien se describen en este documento los siguientes elementos:
[1] Un peptido modificado que se prepara insertando uno o varios residuos de cistema en un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos desde las posiciones Num. 2 a Num. 24 de la protema matriz 2 en el virus de la influenza (M2e).
[2] El peptido modificado del apartado [1], en donde el virus de la influenza es el virus de la influenza tipo A.
[3] El peptido modificado del apartado [1] o [2], en donde dichos uno o varios residuos de cistema se insertan entre la posicion Num. 15 y la Num.16 de M2e o en el C-terminal para situarse entre la Num. 15 y la Num. 16 de M2e.
[4] El peptido modificado del apartado [3], en donde dichos uno o varios residuos de cistema se insertan en una o en una combinacion de dos o mas posiciones entre la Num. 15 y la Num. 16, entre la Num. 20 y la
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Num. 21, entre la Num. 21 y la Num. 22, entre la Num. 22 y la Num. 23 y entre la Num. 23 y la Num. 24 de M2e.
[5] El peptido modificado de uno cualquiera de los apartados [1] a [4], en donde el numero total de dichos residuos de cistema insertados es de 1 a 5.
[6] El peptido modificado del apartado [5], en donde el numero de residuos de cistema insertados en cada posicion insertada es de hasta 3.
[7] Una protema de fusion que consiste en el peptido modificado de cualquiera de los apartados [1] a [6] y un polipeptido.
[8] La protema de fusion del apartado [7], en donde el polipeptido es anexina V o albumina.
[9] Una vacuna contra la influenza que comprende el peptido modificado de cualquiera de los apartados [1] a [6] o la protema de fusion del apartado [7] u [8] como ingrediente activo.
[10] Un dispositivo que puede administrarse al organismo a traves de una barrera biologica, comprendiendo dicho dispositivo la vacuna de la influenza del apartado [9].
[11] Un fragmento de acido nucleico que consiste en una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos del peptido modificado de cualquiera de los apartados [1] a [6] o la protema de fusion del apartado [7] u [8].
[12] Un vector de expresion en el que se incorpora el fragmento de acido nucleico del apartado [11].
[13] Un anfitrion en el que se introduce el vector de expresion del apartado [12].
[14] Un anticuerpo que reconoce el peptido modificado de cualquiera de los apartados [1] a [6] y tiene un efecto protector contra el virus de la influenza.
(Efectos mas eficaces que latecnica anterior)
El peptido M2eC de la presente invencion tiene la capacidad de producir un anticuerpo eficaz para la prevencion de la infeccion por el virus de la influenza de dos a 20 veces mas alta que la de M2e sin insercion de uno o varios residuos de cistema. Por ejemplo, el peptido M2eC que consiste en una secuencia de aminoacidos Ser-Leu-Leu-Thr- Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Cys-Asp-Cys-Ser-Cys-Ser-Asp (SEQ ID NO: 10), que es una realizacion del peptido M2eC de la presente invencion, tiene una inmunogenicidad aproximadamente 20 veces mayor que la de M2e referida hasta ahora y puede ser utilizado adecuadamente para una vacuna contra la influenza. Ademas, los 9 residuos de aminoacidos en el N-terminal del peptido M2eC de la presente invencion tienen una secuencia de aminoacidos bien conservada entre los virus de la influenza, y por lo tanto el peptido es independiente de una cepa prevalente. Asimismo, los peptidos de dicho tamano pueden sintetizarse homogeneamente en una gran cantidad a un precio inferior mediante smtesis qmmica, lo que sena una gran ventaja para el suministro inmediato de una vacuna en caso de emergencia de una pandemia. El peptido M2eC de la presente invencion tambien se puede expresar como una fusion con otro polipeptido.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 es un grafico que muestra los tftulos medios de anticuerpos anti-M2e de los respectivos grupos de inmunizacion que se muestran en la Tabla 2.
La Fig. 2 es un grafico que muestra los tftulos medios de anticuerpos anti-M2e de los respectivos grupos de inmunizacion que se muestran en la Tabla 3.
La Fig. 3 es un grafico que muestra los tftulos medios de anticuerpos anti-M2e de los respectivos grupos de inmunizacion que se muestran en la Tabla 4.
La Fig. 4 es un grafico que muestra los tftulos medios de anticuerpos anti-M2e inmediatamente antes de la sensibilizacion con un sistema de sensibilizacion de virus homologo.
La Fig. 5 es un grafico que muestra los tftulos medios de anticuerpo anti-M2e inmediatamente antes de la sensibilizacion con el sistema de sensibilizacion de virus heterologo.
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
La presente invencion presenta un peptido que se prepara insertando uno o varios residuos de cistema en 23 residuos aminoacidos que consisten en una secuencia de aminoacidos de las posiciones Num. 2 a Num. 24 de la protema matriz 2 en el virus de la influenza (M2e) (peptido M2eC).
La M2e utilizada en el peptido M2eC de la presente invencion se puede obtener a partir de cualquier cepa de virus de la influenza tipo A que tenga la capacidad de producir un anticuerpo protector contra el virus de la influenza. Para el virus de la influenza tipo A, se han aislado muchos serotipos resultantes de la combinacion de 16 subtipos para HA y 9 subtipos para NA. Tales serotipos incluyen, como se ha informado, la cepa A/PR/8, la cepa IOWA, la cepa WISC, la cepa tAiW, la cepa LENT, la cepa VIET, la cepa INDO, la cepa HK156, la cepa A/Beijing/262/95, la cepa A/Sydney/5/97, la cepa A/Panama/2007/99, la cepa A/Wyoming/3/2003, la cepa A/Nueva Caledonia/20/99, la cepa A/Nueva York/55/2004, la cepa A/Hiroshima/52/2005, la cepa A/Salomon Islands/3/2006, la cepa A/Brisbane/59/2007, la cepa A/Uruguay/716/2007 y A/California/05/2009 y A/California/06/2009, M2e derivada de M2 en cualquiera de cuyas cepas se puede utilizar.
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M2e puede consistir en una secuencia de aminoacidos representada por la siguiente formula: Ser-X1aa-Leu-Thr- Glu-Val-Glu-Thr-Pro-X2aa-Arg-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Cys-x6aa-Cys-X7aa-X8aa-Ser-X9aa-Asp en donde X1aa es Pro o Leu, X2aa es Ile o Thr, X3aa es Asn o Ser, X4aa es Gly o Glu, X5aa es Gly o Glu, X6aa es Lys o Arg, X7aa es Asn o Ser, X8aa es Gly o Asp y X9aa es Asn o Ser (SEQ ID NO: 20). Dichos X1aa, X2aa, X3aa, X4aa, X5aa, X6aa, X7aa, X8aa y X9aa son los que resultan de la sustitucion de aminoacidos derivados de los serotipos anteriores. Se puede utilizar M2e que consiste en la secuencia de aminoacidos Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn- Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser- Ser-Asp (SEQ ID NO: 1).
Las posiciones y los numeros de los uno o varios residuos de cistema que se deben insertar en M2e no estan espedficamente limitados en la medida en que las regiones epitopicas importantes implicadas en la produccion de un anticuerpo protector puedan no verse afectadas. Con el fin de proporcionar una inmunidad potente contra la enfermedad infecciosa del virus de la influenza, se pueden insertar de uno a cinco residuos de cistema en cualquier posicion entre la Num. 15 y 16, entre la Num. 20 y el 21, entre la Num. 21 y la Num. 22, entre la Num. 22 y la Num. 23 y entre la Num. 23 y la Num. 24 de M2e. Preferiblemente, cada residuo de cistema, cuatro en total, se puede insertar en las posiciones entre la Num. 20 y la Num. 21, entre la Num. 21 y la Num. 22, entre la Num. 22 y la Num. 23 y entre la Num. 23 y la Num. 24 de M2e. Asimismo, se pueden insertar hasta tres residuos de cistema en al menos una de dichas posiciones respectivas descritas anteriormente. Preferiblemente, se insertan tres residuos de cistema entre la posicion Num. 20 y la Num. 21 de M2e.
El peptido M2eC de la presente invencion se puede obtener mediante smtesis qmmica con un sintetizador de peptidos (por ejemplo, el sintetizador de peptidos 430A: PerkinElmer Japan Co., Ltd., Applied Biosystems) basandose de una secuencia de aminoacidos pronosticada a partir de la secuencia de nucleotidos de Protema M2 derivada de diversos virus de la influenza hasta ahora referidos (vease, por ejemplo, la Referencia no relacionada con patentes 5) y el diseno relacionado con las inserciones de uno o varios residuos de cistema descrito anteriormente. Actualmente, hay muchos proveedores para la smtesis de peptidos, por ejemplo, BEX CO., LTD, Toray Research Center, Inc., TAKARA BIO Inc. e Invitrogen, por lo que se les puede confiar sus smtesis.
El peptido M2eC de la presente invencion se puede utilizar como una protema de fusion junto con diversos polipeptidos tales como albumina, anexina V y protema de virus (protema del nucleo del VHB, etc.). Dicho polipeptido no esta espedficamente limitado, pero preferiblemente es uno que se expresa en un anfitrion seleccionado a un nivel superior. El fragmento de acido nucleico que codifica dicho polipeptido se puede obtener utilizando la tecnica de recombinacion de genes de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989). Se puede preparar un fragmento de acido nucleico que codifica una protema de fusion conectando el fragmento de acido nucleico que codifica el peptido M2eC de la presente invencion a un fragmento de acido nucleico que codifica otro polipeptido con PCR o un procedimiento que utiliza una ADN sintetasa. Por ejemplo, cuando se obtiene un fragmento de acido nucleico que codifica una protema de fusion con PCR, un cebador que consiste en la secuencia de nucleotidos que codifica el peptido M2eC de la presente invencion y la secuencia de nucleotidos (21 nucleotidos) que codifica una porcion del polipeptido que se va a fusionar y se puede utilizar otro cebador para el polipeptido que se va a fusionar (se puede determinar una direccion de cada cebador mediante cualquiera de los polipeptidos situados en el extremo N). Se puede insertar o anadir una secuencia de nucleotidos del sitio de escision para la enzima de restriccion adecuada al extremo de un cebador.
El fragmento de acido nucleico asf obtenido que codifica el peptido M2eC o la protema de fusion de la presente invencion se puede incorporar a un vector de expresion deseado y el vector se puede introducir en un anfitrion para la expresion del fragmento de acido nucleico. Se puede utilizar un plasmido y un vector de virus como un vector de expresion. En promotor que se debe incorporar en dicho vector de expresion se puede seleccionar entre un promotor tal como Lac, tac, pho5, adh, temprano de SV40, tardfo de SV40, p-actina, dependiendo de los microorganismos o celulas animales utilizados como anfitrion. Las bacterias, las levaduras, las celulas animales, las celulas vegetales y las celulas de insectos se pueden utilizar generalmente como anfitriones, pero se pueden seleccionar dependiendo del proposito de uso. Para la transformacion de una celula anfitriona, se puede utilizar un procedimiento conocido. Por ejemplo, se puede utilizar fosfato de calcio, DEAE dextrano, liposoma del sistema de lipofectina, fusion de protoplastos con polietilenglicol y electroporacion, y se puede seleccionar un metodo deseado dependiendo de la celula anfitrion utilizada.
La purificacion del peptido M2eC y la protema de fusion de la presente invencion se puede llevar a cabo combinando de forma adecuada los metodos habitualmente utilizados en la qmmica de protemas, tales como, por ejemplo, centrifugacion, precipitacion por adicion de sales, ultrafiltracion, precipitacion isoelectrica, electroforesis, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de filtracion en gel, cromatograffa de afinidad, cromatograffa hidrofoba, cromatograffa con hidroxiapatita y similares.
Ademas, con el fin de facilitar la purificacion del peptido M2eC de la presente invencion, el peptido se puede expresar como una fusion con otro polipeptido o peptido. Un vector que expresa dicha protema de fusion incluye el sistema de expresion con etiqueta de His que anade oligohistidina (Novagen), un sistema que expresa una protema
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de fusion a la cual se agrega una etiqueta FLAG (Sigma), un sistema de purificacion de protema de fusion glutation S transferasa (GST) que prepara una protema de fusion con GST (GE Healthcare Bioscience), MagneHis Protein Purification System (Promega Inc) y similares. Por ejemplo, el peptido M2eC de la presente invencion se puede expresar como un peptido de fusion con oligohistidina y a continuacion el peptido se puede purificar de forma espedfica y facil usando una columna de afinidad de mquel (GE Healthcare Bioscience).
La cantidad del peptido M2eC obtenido se puede determinar mediante gravimetna con una espectrometna de equilibrio y ultravioleta (espectrometna a una longitud de onda de 214 nm). La cantidad de la protema de fusion con el peptido M2eC se puede determinar mediante BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology, Inc), Protein Assay Kit (Bio-Rad Japan, Inc), etc.
La evaluacion como vacuna del peptido M2eC y la protema de fusion del peptido M2eC y otro polipeptido de la presente invencion (en lo sucesivo tambien denominado simplemente "antfgeno") se puede realizar inmunizando animales pequenos tales como pollo, raton, rata, cobaya, perro o mono con el antigeno, y a continuacion obteniendo sangre del animal inmunizado, aislando el suero del mismo y determinando un tttulo de anticuerpo contra el peptido M2eC de la presente invencion o un tftulo de anticuerpo neutralizador contra un virus de la influenza en dicho suero en un sistema in vitro , o administrando una dosis letal de virus de la influenza a dicho animal inmunizado, y a continuacion observando las condiciones de vida o muerte o enfermedad del animal inmunizado en un sistema in vivo . Para una medicion de anticuerpos en el sistema in vitro, se pueden utilizar comunmente ELISA, PHA o analisis en placa. El peptido M2eC asf obtenido de la presente invencion tiene una capacidad de producir un anticuerpo eficaz para inhibir una infeccion del virus de la influenza de dos a 20 veces mayor que la de M2e, y se puede utilizar como antfgeno inmunizante de una vacuna contra la influenza. Cuando se utiliza como antfgeno inmunizante de una vacuna contra la influenza, se puede utilizar un solo peptido M2eC, o tambien se pueden utilizar dos o mas peptidos M2eC o el peptido M2eC combinado con otros antfgenos del virus de la influenza tales como el antfgeno HA, NA y NP.
El protocolo de inmunizacion, por ejemplo, la via de administracion, p.ej. subcutaneamente, intradermicamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, nasalmente, oralmente y sublingualmente, y el intervalo de inmunizacion, pueden ser cualquier metodo que pueda inducir inmunidad tal como un metodo de inmunizacion convencional comunmente utilizado para investigar la inmunogenicidad de una vacuna o inmunizacion utilizando un dispositivo que puede ser suministrado al organismo a traves de una barrera biologica. Tal dispositivo incluye una microaguja y un parche de gel hidrofilo en diversas formas para inducir inmunidad a traves de la piel, y diversas capsulas entericas, liposomas y partmulas de virus sin envoltura para inducir inmunidad a traves del tracto intestinal. Se puede anadir cualquier coadyuvante que pueda ser utilizado en seres humanos, tal como, por ejemplo, gel de hidroxido de aluminio, gel de fosfato de aluminio, oligonucleotido CpG, MDP, QS21 y emulsion MPL+TDM a un antfgeno utilizado para la inmunizacion con el fin de aumentar su capacidad de inmunizacion. Ademas, con el fin de estabilizar o mantener la forma de un antfgeno, se pueden anadir diversos aditivos farmaceuticamente aceptables al antfgeno. Dichos aditivos incluyen un agente estabilizante (arginina, Polisorbato 80, Macrogol 4000, etc.) y un excipiente (manitol, sorbitol, sacarosa, lactosa). Una composicion que comprende el peptido M2eC asf preparado o la protema de fusion de la presente invencion como ingrediente activo se puede someter a filtracion 3en condiciones esteriles, dispensacion, liofilizacion y similares para su formulacion y utilizar como vacuna para la prevencion de la infeccion del virus de la influenza y la aparicion de enfermedad.
Como se describio anteriormente, el peptido M2eC de la presente invencion es capaz de producir un anticuerpo protector contra el virus de la influenza y el anticuerpo obtenido se puede utilizar como material para tratar a un paciente que padece influenza y material para construir un sistema de deteccion del virus de la influenza, por ejemplo, un sistema de deteccion a traves de una medicion de anticuerpo tal como ELISA, transferencia Western y transferencia puntual. Dicho anticuerpo protector (anticuerpo policlonal) se puede obtener a partir del suero de animales inmunizados mediante el protocolo de inmunizacion anterior. Para la purificacion de un anticuerpo, se puede utilizar la purificacion de una protema como se describio anteriormente.
Se puede obtener un anticuerpo monoclonal como se describe a continuacion. A saber, las celulas productoras de anticuerpos tales como las celulas del bazo o los linfocitos se retiran del animal inmunizado y se fusionan con la cepa de celulas de mieloma para preparar hibridomas, de acuerdo con p.ej. Milstein et al., Method Enzymol., 73, 346, 1981. Se pueden utilizar cepas de celulas de mieloma de raton tales como NSI-Ag4/1 (EUR. J. Immunol., 6: 511, 1976), P3X63-Ag8.U1 (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81:1, 1978), X63-Ag8.653 (J. Immunol., 123:1548, 1979), y similares. Los hibridomas se pueden obtener mediante cultivo en un medio HAT durante un penodo de tiempo suficiente para que las celulas no fusionadas desaparezcan, generalmente de varios dfas a varias semanas. A partir de los hibridomas asf obtenidos, los que producen un anticuerpo de interes se seleccionan a continuacion y se clonan con dilucion limitante normal usando su fluido de cultivo. La seleccion de un clon que produce un anticuerpo que se une espedficamente al peptido de la presente invencion se puede realizar con tecnicas analtticas comunmente utilizadas tales como ELISA, RIA o transferencia Western. Tambien se puede preparar un anticuerpo que se une al peptido M2eC de la presente invencion mediante la tecnica para la preparacion de anticuerpos usando visualizacion en fagos (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Editado por Brian K. Kay et al.,
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Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al., ANTIBODY ENGINEERING segunda edicion editado por Carl A. K. BORREBAECK).
La presente invencion se explica con mas detalle por medio de los siguientes ejemplos, pero no se limita a estos Ejemplos de ninguna manera.
Ejemplo 1:
<Evaluacion de la inmunogenicidad de peptidos M2eC que se preparan insertando uno o varios residuos de cisteina en M2e>
1. Materiales y metodos
(1) Peptido M2eC
Se sintetizo una secuencia de aminoacidos de M2e como molde para preparar el peptido M2eC basandose en la secuencia de aminoacidos de la cepa A/New Caledonia/20/1999 (HlN1) (numero de acceso de GeneBank ACF41880) que tiene una secuencia mas universal (1999 Nature Med. 5: 1157-1163) (BEX Co., Ltd.). El M2e sintetizado y los respectivos peptidos M2eC se muestran en la Tabla 1. Los peptidos sintetizados respectivos se prepararon a 5 mg/ml con agua destilada para inyectables sustituida por gas nitrogeno que contema EDTa 1 mM, y se almacenaron como una solucion de partida por debajo de -80°C hasta su uso.
Tabla 1
- Abreviaturas
- Secuencias de aminoacidos
- M2e
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO: 1)
- M2eC16
- SLLTEVETPIRNEWCGCRCNDSSD (SEQ ID NO: 2)
- M2eC21
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDSSD (SEQ ID NO: 3)
- M2eC22
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNDCSSD (SEQ ID NO: 4)
- M2eC23
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSCSD (SEQ ID NO: 5)
- M2eC24
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSCD (SEQ ID NO: 6)
- M2eC1621
- SLLTEVETPIRNEWCGCRCNCDSSD (SEQ ID NO: 7)
- M2eC2122
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSSD (SEQ ID NO: 8)
- M2eC2123
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDSCSD (SEQ ID NO: 9)
- M2eC212223
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSCSD (SEQ ID NO: 10)
- M2eC151621
- SLLTEVETPIRNECWCGCRCNCDSSD (SEQ ID NO: 11)
- M2eC162122
- SLLTEVETPIRNEWCGCRCNCDCSSD (SEQ ID NO: 12)
- M2eC21222324
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSCSCD (SEQ ID NO: 13)
- M2eC16212223
- SLLTEVETPIRNEWCGCRCNCDCSCSD (SEQ ID NO: 14)
- CM CO CM CM CM CM CD O (D CM
- SLLTEVETPIRNEWCGCRCNCDCSCSCD (SEQ ID NO: 15)
- M2eC212121
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNCCCDSSD (SEQ ID NO: 16)
(2) Ratones recibieron administracion
Se criaron preliminarmente ratones hembra BALB/c (siete semanas de edad, SPF, Charles River Japan Inc.) en condiciones de SPF. Despues de aproximadamente una semana de reproduccion preliminar, se realizo una prueba de inmunizacion.
(3) Grupos de inmunizacion
(3)-1 Evaluacion de la inmunogenicidad del peptido M2eC que se prepara insertando un residuo de cistema en M2e
Se dividieron en seis grupos veinticuatro ratones, cada uno de los cuales constaba de cuatro ratones. Cada grupo se inmunizo con M2e o cada uno de los cinco peptidos M2eC como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2
- Grupos de inmunizacion
- Peptidos (abreviatura) Num. de ratones
- Grupo 1
- M2e 4
- Grupo 2
- M2eC16 4
- Grupo 3
- M2eC21 4
- Grupo 4
- M2eC22 4
- Grupo 5
- M2eC23 4
- Grupo 6
- M2eC24 4
(3)-2 Evaluacion de la inmunogenicidad de peptidos M2eC que se preparan insertando hasta 3 residuos de cisteina en M2e
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Se dividieron en seis grupos veinticuatro ratones, cada uno de los cuales constaba de cuatro ratones. Cada grupo se inmunizo con M2e o cada uno de los cinco peptidos M2eC como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3
- Grupos de inmunizacion
- Peptidos (abreviatura) Num. de ratones
- Grupo 1
- M2e 4
- Grupo 2
- M2eC21 4
- Grupo 3
- M2eC1621 4
- Grupo 4
- M2eC2122 4
- Grupo 5
- M2eC2123 4
- Grupo 6
- M2eC212223 4
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(3)-3 Evaluacion de la inmunogenicidad de peptidos M2eC que se preparan de la insercion de 3 o mas residuos de cistema en M2e
Se dividieron en ocho grupos treinta y dos ratones, cada uno compuesto por cuatro ratones. Cada grupo se inmunizo 15 con M2e o cada uno de los siete peptidos M2eC como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4
- Grupos de inmunizacion
- Peptidos (abreviatura) Num. de ratones
- Grupo 1
- M2e 4
- Grupo 2
- M2eC212223 4
- Grupo 3
- M2eC151621 4
- Grupo 4
- M2eC162122 4
- Grupo 5
- M2eC21222324 4
- Grupo 6
- M2eC16212223 4
- Grupo 7
- M2eC1621222324 4
- Grupo 8
- M2eC212121 4
(4) Preparacion de sustancia inmunologica
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El dfa anterior de la inmunizacion, cada solucion de partida de peptido almacenada por debajo de -80°C se diluyo a 1 mg/ml con PBS (INVITROGEN) y se mezclo con una cantidad igual de coadyuvante de Alum (ALHYDRoGeL, BRENNTAG BIOSECTOR), y la mezcla se dejo reposar durante la noche.
25 (5) Protocolo y calendario de inmunizacion
Cada material inmunizante preparado el dfa anterior se diluyo a 0,2 mg/ml con PBS, y cada 100 pL por raton del
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material se administro por via subcutanea al dorso de los ratones utilizando una jeringa de tuberculina de 1 ml (Terumo, SS-01T2613S) (dosis por individuo: 20 pg de cada peptido). La inmunizacion se realizo dos veces en un intervalo de dos semanas.
(6) Extraccion de sangre
Dos semanas despues de la segunda inmunizacion, todos los ratones se sometieron a extraccion de sangre de la vena abdominal inferior mientras se anestesiaba con pentobarbital sodico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, somnopentilo) y se sacrificaron. La sangre obtenida se transfirio a Microtina (Becton Dickinson), y despues de coagular suficientemente a temperatura ambiente, se centrifugo a 5.000 rpm x 10 min. para aislar el suero. El suero aislado se almaceno a -20°C hasta la medicion.
(7) Preparacion del suero patron de raton
Para comparar el aumento de anticuerpo anti-M2e en cada grupo de inmunizacion, los sueros de 15 ratones inmunizados subcutaneamente en el dorso con M2e mostrados en la Tabla 1 (10 pg/cuerpo/inyeccion) y coadyuvante de Alum tres veces en un intervalo de tres semanas se agruparon como suero patron de raton que tema un anticuerpo anti-M2e.
(8) Medicion del anticuerpo anti-M2e (IgG)
M2e se diluyo a 2 pg/ml con tampon de Carbonato 0,1 M, pH 9,6, se anadio a una placa de 96 pocillos (Nunc, Immobilizer Amino) a 100 pL/pocillo y se dejo reposar a 4°C durante la noche para la inmovilizacion. Al dfa siguiente, cada pocillo se lavo tres veces con 300 pL de tampon de fosfato que contema Tween 20 al 0,05% (PBST), se anadieron 300 pL/pocillo de monoetanolamina 10 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diluida con Tampon de carbonato 0,1 M, pH 9,6, y se dejo reposar a temperatura ambiente durante una hora.
Despues de una hora, se retiro suficientemente la monoetanolamina 10 mM y a esto se anadieron 100 pl/pocillo de muestras diluidas con PBST (por duplicado para cada muestra). Despues de la reaccion a temperatura ambiente durante una hora, se extrajo cada suero diluido y se lavo con 300 pL/pocillo de PBST tres veces. Despues del lavado, la solucion de lavado en cada pocillo se retiro suficientemente y se anadio un anticuerpo de cabra anti-IgG de raton marcado con HRP (American Qualax, A131PS) diluido con PBST 2000 veces a 100 pL/pocillo para la reaccion a temperatura ambiente durante una hora. Despues de la reaccion, se retiro la solucion diluida que comprendfa el anticuerpo marcado, y el pocillo se lavo con 300 pL/pocillo de PBST dos veces y un volumen igual de agua destilada dos veces, y se anadio una solucion de sustrato cromogenico TMB+ (Dako) a 100 pL/pocillo bajo proteccion de la luz para la reaccion a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuacion, al pocillo se le anadio acido sulfurico 1 N a 100 pL/pocillo para detener la reaccion cromogenica y se midio la absorbancia a 450 nm (valor DO 450).
(9) Calculo del tftulo de anticuerpos anti-M2e en suero patron
Los sueros de 32 ratones no inmunizados (C57BL/6, macho) se diluyeron con una solucion de dilucion para muestra hasta 200 veces y se determino la DO 450 por duplicado. Un promedio de la DO 450 medida mas el doble de su desviacion tfpica se definio como corte. A continuacion, el suero patron se diluyo de 15.000 a 960.000 veces a traves de una dilucion seriada 1:2, determinada por su DO 450, y la escala de dilucion maxima sobre el valor de corte se definio como el tftulo de anticuerpo del suero patron. Dado que los valores de DO 450 estuvieron sobre el corte en este sistema de ensayo hasta una dilucion de aproximadamente 400.000 veces, se determino que el tftulo de anticuerpo anti-M2e de una solucion de partida del suero patron era 400.000 unidades.
(10) Tftulo de anticuerpos anti-M2e en sangre
Se calculo un tftulo de anticuerpos de suero de raton en cada grupo inmunizado con cada uno de los diversos peptidos como se describe a continuacion. En primer lugar, el suero patron se diluyo con una solucion de dilucion para la muestra para proporcionar 1, 2, 4, 8, 16 y 32 unidades para preparar el patron para la determinacion de un tftulo de anticuerpo. A continuacion, el suero de raton de cada grupo de inmunizacion se diluyo con una solucion de dilucion para la muestra de manera que el suero diluido pudiera estar dentro del alcance del patron tal como se preparo. La muestra de prueba preparada como se describio anteriormente se determino en el sistema como se muestra en el Ejemplo 1- (8) y se calculo el tftulo de anticuerpo anti-M2e de cada muestra de suero en raton utilizando una lrnea patron entre la unidad patron obtenida y el valor DO 450.
2. Resultados
La Fig. 1 muestra tftulos de anticuerpos anti-M2e en sangre obtenidos dos semanas despues de dos inmunizaciones en un intervalo de dos semanas en grupos de inmunizacion para M2e o cada peptido M2eC en el que se inserta un
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residuo de cistema. Como se muestra en la Fig. 1, excepto el peptido M2eC22 en el que se inserta un residuo de cistema en la posicion entre la Num. 21 y la Num. 22 de M2e, se aumento el tftulo de anticuerpo anti-M2e del grupo de inmunizacion con peptido M2eC de dos a cuatro veces en comparacion con el de los grupos de inmunizacion para M2e.
Como resultado, se demostro que los peptidos en los que se inserta un residuo de cistema en una posicion entre la Num. 15 y la Num. 16, entre la Num. 20 y la Num. 21, entre la Num. 22 y la Num. 23 o entre la Num. 23 y la Num. 24 de M2e tienen una inmunogenicidad mas alta en comparacion con la del peptido M2e convencional.
A continuacion, se evaluo la inmunogenicidad de los peptidos M2eC en los que se insertan dos o tres residuos de cistema utilizando un tftulo de anticuerpos anti-M2e. Como se muestra en la Fig. 2, se confirmo que M2eC1621, M2eC2122 y M2eC2123 en los que se insertan dos residuos de cistema en M2e, es decir, en los que se inserta adicionalmente un residuo de cistema en M2eC21 en el que se inserta residuo de cistema entre la posicion Num. 21, teman un mayor tftulo de anticuerpos anti-M2e que M2eC21. Ademas, el grupo de inmunizacion de M2eC212223 en el que cada residuo de cistema se inserta en posiciones entre la Num. 20 y la Num. 21, entre la Num. 21 y la Num. 22 y entre la Num. 22 y la Num. 23 de M2e, es decir, en el que se insertan un total de tres residuos de cistema, mostraron una inmunogenicidad extremadamente alta, es decir, el tftulo de anticuerpo anti-M2e era 20 veces mayor que el de los grupos de inmunizacion de M2e.
De manera similar, la inmunogenicidad del peptido M2eC en el que se inserta un mayor numero de residuos de cistema se evaluo mediante el tftulo de anticuerpo anti-M2e. Como se muestra en la Fig. 3, M2eC162122 en el que se insertan tres residuos de cistema podna inducir un tftulo de anticuerpo mas alto que el de M2e de igual forma que M2eC212223. Sin embargo, M2eC151621 en el que se insertan tres residuos de cistema de forma similar solo podna inducir un tftulo de anticuerpos comparable al de M2e. A partir de esto, se estima que un epftopo de M2e podna verse afectado al insertar residuos de cistema entre la posicion Num. 14 y la Num. 15.
Ademas, los anticuerpos anti-M2e en los grupos de inmunizacion M2eC16212223 o M2eC1621222324 fueron mayores que los de M2eC162122, y el tftulo de anticuerpos anti-M2e en el grupo de inmunizacion M2eC21222324 fue mayor que el de M2eC212223. Esto sugiere que la inmunogenicidad podna potenciarse aumentando el numero de residuos de cistema que se deben insertar. Ademas, debido a que el grupo de inmunizacion M2eC212121 en el que se inserta un numero total de tres residuos de cistema entre la posicion 20 y 21 de M2e tambien indujo un alto tftulo de anticuerpos anti-M2e, puede ser posible aumentar la inmunogenicidad insertando multiples residuos de cistema entre la posicion 15 y 16, entre 20 y 21, entre 22 y 23 o entre 23 y 24, cuya insercion de uno o varios residuos de cistema se demuestra que aumenta el tftulo de anticuerpo anti-M2e.
En vista de los resultados anteriores, se observo que el peptido M2eC podna ser una vacuna contra la influenza mas potente al aumentar el numero de residuos de cistema que se deben insertar en M2e.
Ejemplo 2:
<Evaluacion de la capacidad de proteger el inicio de la enfermedad en el peptido M2eC>
1. Materiales y metodos
(1) Peptidos
Entre los peptidos M2eC utilizados en el Ejemplo 1, se utilizo M2eC212223.
(2) Virus de sensibilizacion
Se utilizo virus de la influenza (cepa A/PR8/8/34, H1N1) almacenado mediante congelacion.
(3) Ratones recibieron la administracion
Se realizaron los mismos procedimientos que en el Ejemplo 1-(2).
(4) Grupos de inmunizacion
Se dividieron en tres grupos treinta ratones, cada uno de los cuales consistfa en 10, 8 y 12 ratones. Los ratones del primer y el segundo grupo se inmunizaron con 2 |jg y 20 |jg de M2eC212223, respectivamente, y los ratones del tercer grupo no se inmunizaron como grupo sin administracion de peptido como se muestra en la Tabla 5.
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Tabla 5
- Grupos de inmunizacion
- Peptido (abreviatura) Cantidad de peptido inmunizante Num. de ratones
- Grupo 1
- M2eC212223 2 pg 10
- Grupo 2
- M2eC212223 20 pg 8
- Grupo 3
- ninguno 0 pg 12
(5) Preparacion de material de inmunizacion y protocolo y calendario de vacunacion
Para el cebado, el d^a de la inmunizacion, la solucion de partida de M2eC212223 almacenada por debajo de -60°C se diluyo a 0,04 mg/ml y 0,4 mg/ml con PBS (INVITROGEN), se mezclo con una cantidad igual de coadyuvante completo de Freund, cada 100 pL por raton de la mezcla se administro por v^a subcutanea al dorso de los ratones con una jeringa de tuberculina de 1 ml (Terumo, SS-01T2613S) (dosis por individuo: 2 pg o 20 pg). Para el tercer grupo como control, se utilizo PBS en lugar de la solucion de peptido. Para la segunda inmunizacion, se repitieron los procedimientos como en el cebado siempre que se utilizara coadyuvante de Freund incompleto para el coadyuvante. La inmunizacion se realizo dos veces en un intervalo de dos semanas.
(6) Preparacion de la solucion del virus para la sensibilizacion y modo de sensibilizacion
Una semana despues de la segunda inmunizacion, una solucion de virus de la influenza (cepa A/PR8) almacenada mediante congelacion se diluyo con PBS y se administro nasalmente a ratones anestesiados con Sevofrane (Maruishi Pharmaceutical) a 20 pL (correspondiente a 5 DL50) por raton.
(7) Observacion de ratones
Los ratones de prueba se observaron hasta 21 dfas despues de la sensibilizacion con el virus para registrar su vida y muerte.
2. Resultados
Como resultado de la observacion de ratones despues de la sensibilizacion con el virus de la influenza, el grupo de inmunizacion M2eC212223 en el que cada residuo de cistema se inserta entre las posiciones Num. 20 y Num. 21, entre la Num. 21 y la Num. 22 y entre la Num. 22 y la Num. 23 de M2e, es decir, en donde se insertan un total de tres residuos de cistema, mostraron una tasa de supervivencia mas alta que la del grupo sin administracion de peptido como se muestra en la Tabla 6. Este resultado revelo que el peptido M2eC212223, incluso mediante inmunizacion de 2 pg por raton, tuvo un efecto inhibidor del inicio de la enfermedad por el virus de la influenza.
Tabla 6
- Grupos de inmunizacion
- Peptido (abreviatura) Cantidad de peptido inmunizante Tasa de supervivencia
- Grupo 1
- M2eC212223 2 pg 8/10
- Grupo 2
- M2eC212223 20 pg 7/8
- Grupo 3
- ninguno 0 pg 4/12
Ejemplo 3:
<Comparacion de la capacidad de proteccion del inicio de la enfermedad entre peptidos M2e y M2eC212223 contra sistemas de sensibilizacion de virus homologos y heterologos>
1. Materiales y metodos
(1) Peptido utilizado en inmunizacion y virus de sensibilizacion
Se utilizaron M2e y M2eC212223 del Ejemplo 1 para la inmunizacion en el sistema de sensibilizacion de virus homologo mientras que se utilizaron swM2e y swM2eC212223, sintetizados basandose en la secuencia M2 de una nueva cepa de virus de la influenza (tipo A/H1N1) que se produjo en epidemias en 2009, para la inmunizacion en un sistema de sensibilizacion de virus heterologo (BEX Co., Ltd.). Las soluciones de partida de los peptidos sintetizados se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 y se almacenaron a una temperatura inferior a -60°C hasta su uso. El virus de prueba fue el mismo que el utilizado en el Ejemplo 2.
La Tabla 7 indica las secuencias M2e de peptidos utilizados en la inmunizacion y del virus de sensibilizacion. En el
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sistema de sensibilizacion de virus homologo, existe una diferencia de solo un aminoacido en la posicion Num. 21 entre la secuencia M2e del virus de sensibilizacion y las secuencias de los peptidos inmunizantes. Sin embargo, para el sistema de sensibilizacion de virus heterologo, los aminoacidos en cinco posiciones Num. 11, Num. 13, Num. 16, Num. 20 y Num. 21 son diferentes.
Tabla 7
- Sistema de sensibilizacion
- Virus o peptidos Secuencia de aminoacidos
- Homologo
- Virus de sensibilizacion (A/PR8) SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID No: 17)
- M2e
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID No: 1)
- M2eC212223
- SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSCSD (SEQ ID No: 10)
- Heterologo
- Virus de sensibilizacion (A/PR8) SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSO (SEQ ID No: 17)
- swM2e
- SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD (SEQ ID No: 18)
- swM2eC212223
- SLLTEVETPTRSEWECRCSCDCSCSD (SEQ ID No: 19)
* Los aminoacidos subrayados son aquellos diferentes de los peptidos utilizados en la inmunizacion.
(2) Ratones recibieron administracion
Se realizaron los mismos procedimientos que en el Ejemplo 1-(2).
(3) Grupos de inmunizacion
(3)-1 Evaluacion de la capacidad de proteger el inicio de la enfermedad en el sistema de sensibilizacion de virus homologos
Se dividieron en tres grupos veinticuatro ratones, cada uno compuesto por ocho ratones. Los ratones de los grupos primero y segundo se inmunizaron con peptido M2e y M2eC212223, respectivamente, y a los ratones del tercer grupo se les administro PBS en lugar de peptido como grupo sin administracion de peptido (grupo solo de Alum) como se muestra en la Tabla 8.
Tabla 8
- Grupos de inmunizacion
- Peptido (abreviatura) Cantidad de peptido inmunizante Num. de ratones
- Grupo 1
- M2e 2 Mg 8
- Grupo 2
- M2eC212223 2 Mg 8
- Grupo 3
- ninguno 0Mg 8
(3)-2 Evaluacion de la capacidad para proteger del inicio de la enfermedad en el sistema de sensibilizacion de virus heterologos
Se dividieron en seis grupos sesenta ratones, cada uno compuesto de diez ratones. Los ratones del primer y el segundo grupo se inmunizaron con swM2e, los ratones del tercer y cuarto grupo se inmunizaron con el peptido swM2eC212223, y los ratones del quinto y sexto grupo no se inmunizaron como grupos sin administracion de peptido como se muestra en la Tabla 9. A los ratones del quinto grupo se les administro unicamente coadyuvante de Alum y a los ratones del sexto grupo se les administro unicamente PBS.
Tabla 9
- Grupos de inmunizacion
- Peptido (abreviatura) Cantidad de peptido inmunizante Num. de ratones
- Grupo 1
- swM2e 2 Mg 10
- Grupo 2
- swM2e 20 Mg 10
- Grupo 3
- swM2eC212223 2 Mg 10
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- Grupos de inmunizacion
- Peptido (abreviatura) Cantidad de peptido inmunizante Num. de ratones
- Grupo 4
- swM2eC212223 20 pg 10
- Grupo 5
- ninguno 0 pg 10
- Grupo 6
- ninguno 0 pg 10
(4) Preparacion de material de inmunizacion y protocolo y calendario de vacunacion
(4)-1 Evaluacion de la capacidad para proteger del inicio de la enfermedad en el sistema de sensibilizacion de virus homologos
El dfa previo a la inmunizacion, se preparo una solucion de partida de peptidos como se describe en el Ejemplo 1-
(4). Al dfa siguiente, cada material inmunizante preparado se diluyo a 0,02 mg/ml con PBS, y cada 100 pL por raton del material se administro por via subcutanea al dorso de los ratones con jeringa de tuberculina de 1 ml (Terumo, SS-01T2613S) (dosis por individuo: cada peptido 2 pg). La inmunizacion se realizo dos veces en un intervalo de dos semanas. El dfa previo a la sensibilizacion con el virus (6 dfas despues de la segunda inmunizacion), se realizo la extraccion parcial de sangre a traves de la vena de la cola en ratones para aislar el suero como se describe en el Ejemplo 1-(6), que se almaceno a -20°C hasta la determinacion de un titulo de anticuerpos anti-M2e.
(4)-2 Evaluacion de la capacidad para proteger del inicio de la enfermedad en el sistema de sensibilizacion de virus heterologos
El dfa previo a la inmunizacion, se preparo una solucion de partida de peptidos como se describe en el Ejemplo 1-
(4) . Al dfa siguiente, cada material inmunizante preparado se diluyo a 0,02 mg/ml o 0,2 mg/ml con PBS, y cada 100 pL por raton del material se administro por via subcutanea al dorso de los ratones con jeringa de tuberculina de 1 ml (Terumo, SS -01T2613S) (dosis por individuo: cada peptido 2 pg o 20 pg). La inmunizacion se realizo dos veces en un intervalo de dos semanas, y se obtuvo suero y se almaceno el dfa anterior de la sensibilizacion con el virus como se describe en el Ejemplo 3-(4)-1.
(5) Titulo de anticuerpos anti-M2e en sangre
La determinacion de un titulo de anticuerpo anti-M2e en suero en cada raton de prueba se realizo como se describe en el Ejemplo 1.
(6) Preparacion de la solucion del virus para la sensibilizacion y modo de sensibilizacion
Se repitieron los procedimientos como se describe en el ejemplo 2.
(7) Observacion de ratones
Se observaron ratones de prueba hasta 21 dfas despues de la sensibilizacion con el virus para registrar su vida y muerte.
2. Resultados
Para el sistema de sensibilizacion de virus homologo, como se muestra en la Fig. 4, el grupo de inmunizacion con 2 pg de M2eC212223 junto con coadyuvante de Alum, que se admite para su uso en seres humanos, pudo inducir un alto titulo de anticuerpos anti-M2e (un anticuerpo contra un peptido que tiene secuencia similar a la secuencia de M2e del virus de sensibilizacion). Sin embargo, el grupo de inmunizacion con M2e en el que no se inserto residuo de cistema no pudo inducir un titulo de anticuerpos anti-M2e a una dosis de 2 pg. En cuanto a los resultados obtenidos despues de la sensibilizacion con el virus, como se muestra en la Tabla 10, el grupo de inmunizacion con M2eC212223 tuvo una tasa de supervivencia significativamente mayor en comparacion con el grupo de inmunizacion con M2e y el grupo sin administracion de peptido. Este resultado revelo que el peptido M2eC212223 junto con el coadyuvante de Alum, que se admite para su uso en seres humanos, tema un alto efecto protector frente a la aparicion de la enfermedad frente al virus de la influenza que tiene una secuencia similar a la del peptido M2eC212223. Ademas, demostro que el peptido M2eC212223 tema una mayor capacidad para proteger del inicio de la enfermedad en comparacion con el peptido M2e.
En vista de los resultados anteriores, se observo que el peptido M2eC en el que se inserta o insertan uno o varios residuos de cistema en el peptido M2e tiene alta inmunogenicidad y un elevado efecto protector contra la infeccion del virus de la influenza, en comparacion con el peptido M2e y preferiblemente se utilizara como material de una vacuna.
Claims (12)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un peptido modificado que se prepara insertando uno o varios residuos de cistema en un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos de las posiciones Num. 2 a Num. 24 de la protema matriz 2 en el virus de la influenza (M2e), en donde dichos uno o varios residuos de cistema se insertan una posicion entre la Num. 20 y la Num. 21 de M2e, o en una combinacion de dos o mas posiciones entre la Num. 15 y la Num. 16, entre la Num. 20 y la Num. 21, entre la Num. 21 y la Num. 22, entre la Num. 22 y la Num. 23 y entre la Num. 23 y la Num. 24 de M2e.
- 2. El peptido modificado de la reivindicacion 1, en donde el virus de la influenza es el virus de la influenza tipo A.
- 3. El peptido modificado de la reivindicacion 1 o 2, en donde el numero total de dichos uno o varios residuos de cistema insertados es de 1 a 5.
- 4. El peptido modificado de la reivindicacion 3, en donde el numero de residuos de cistema insertados en cada posicion de insercion es de hasta 3.
- 5. Una protema de fusion que consiste en el peptido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un polipeptido.
- 6. La protema de fusion de la reivindicacion 5, en donde el polipeptido es anexina V o albumina.
- 7. Una vacuna contra la influenza que comprende el peptido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la protema de fusion de la reivindicacion 5 o 6 como ingrediente activo.
- 8. Un dispositivo que se puede administrar al organismo a traves de una barrera biologica, comprendiendo dicho dispositivo la vacuna contra la influenza de la reivindicacion 7 y seleccionandose dicho dispositivo de una microaguja y un parche de gel hidrofilo en diversas formas para inducir inmunidad a traves de la piel, y diversas capsulas entericas, liposomas y partmulas de virus sin envoltura para inducir inmunidad a traves del tracto intestinal.
- 9. Un fragmento de acido nucleico que consiste en una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos del peptido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la protema de fusion de la reivindicacion 5 o 6.
- 10. Un vector de expresion en el que se incorpora el fragmento de acido nucleico de la reivindicacion 9.
- 11. Un anfitrion en el que se introduce el vector de expresion de la reivindicacion 10.
- 12. Un metodo de produccion de(a) los peptidos modificados o protemas de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende la expresion de los peptidos o protemas de fusion modificados de un vector introducido en un anfitrion, o(b) los peptidos modificados de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la smtesis qrnmica de los peptidos modificados.
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