ES2869199T3 - Sistemas de expresión - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un sistema de expresión que comprende un vector viral de adenovirus que comprende polinucleótidos que codifican proteínas de pneumovirus, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el sistema de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, un segundo polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, y un tercer polinucleótido que codifica una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, en la que: el pneumovirus es virus sincitial respiratorio humano (RSV); la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el primer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV seleccionada del grupo que consiste en proteínas de Matriz M y M2; la proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, codificada por el segundo polinucleótido, es una proteína estructural y/o de superficie de RSV que es la proteína de fusión (F); la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el tercer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV que es la nucleoproteína N; y en la que el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína artificial.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas de expresión
Campo de la invención
La invención se refiere a un sistema de expresión que comprende polinudeótidos que codifican proteínas del virus sincitial respiratorio (RSV), en el que el sistema de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica al menos una proteína, péptido o variante del mismo, que induce una respuesta de células T, y un segundo polinucleótido que codifica al menos una proteína péptido o variante del mismo, que induce una respuesta antipatogénica de células B también se divulgan mezclas de proteína codificadas por el sistema de expresión y células que comprenden el sistema de expresión o la mezcla de proteína y composiciones farmacéuticas que comprenden el sistema de expresión o la mezcla de proteína. El sistema de expresión, polinucleótidos, proteínas, células, y composiciones farmacéuticas son útiles en la profilaxis o tratamiento de infecciones. También se divulgan construcciones de nucleótidos y sistemas de expresión que codifican una hemaglutinina de influenza modificada (HA).
Antecedentes de la invención
Las enfermedades infecciosas siguen siendo una gran amenaza para la humanidad. Una forma de prevenir o tratar enfermedades infecciosas es la inducción artificial de una respuesta inmunitaria por vacunación que es la administración de material antigénico a un individuo de tal manera que se desarrolle una respuesta inmunitaria adaptativa contra el antígeno respectivo. El material antigénico puede ser patógenos (por ejemplo, microorganismos o virus) que están estructuralmente intactos pero inactivados (es decir, no infecciosos) o que están atenuados (es decir, con infectividad reducida), o componentes purificados del patógeno que se ha encontrado que son altamente inmunogénicos. Otro enfoque para inducir una respuesta inmunitaria contra un patógeno es la provisión de sistemas de expresión que comprenden uno o más vectores que codifican proteínas o péptidos inmunogénicos del patógeno. Dicho vector puede estar en forma de ADN plasmídico desnudo, o las proteínas o péptidos inmunogénicos se suministran utilizando vectores virales, por ejemplo, sobre la base de virus vaccinia modificados (por ejemplo, Vaccinia Ankara modificada; MVA) o vectores adenovirales. Dichos sistemas de expresión tienen la ventaja de comprender componentes bien caracterizados que tienen una baja sensibilidad frente a las condiciones ambientales.
Es un objetivo particular cuando se desarrollan sistemas de expresión en base a vectores que la aplicación de estos sistemas de expresión a un paciente provoque una respuesta inmunitaria que sea protectora contra la infección por el patógeno respectivo. Sin embargo, aunque inducen una respuesta inmunogénica contra el patógeno, algunos sistemas de expresión no pueden provocar una respuesta inmunitaria que sea lo suficientemente fuerte como para proteger completamente contra las infecciones por el patógeno. De acuerdo con lo anterior, todavía subsiste la necesidad de sistemas de expresión que sean capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora contra un patógeno, por ejemplo, un agente infeccioso similar a un virus.
Virus
Los virus son un grupo de patógenos/agentes infecciosos que no tienen metabolismo propio y se pueden considerar como endoparásitos obligatorios de las respectivas células anfitrionas utilizando al menos partes de las instalaciones de la célula anfitriona para llevar a cabo la expresión de proteínas virales y la replicación del virus. Los virus se pueden clasificar sobre la base del tipo (ADN/ARN), la cadena (cadena sencilla (ss) o cadena doble (ds)), el sentido (sentido negativo o sentido positivo) del ácido nucleico que constituye su genoma y su replicación (clasificación de Baltimore). De acuerdo con lo anterior, los virus se clasifican generalmente en virus de ADN y ARN. Los virus se pueden clasificar adicionalmente en virus de ADN o ARN de cadena sencilla (cs) o de cadena doble (cd), cuyo genoma es un ácido nucleico de cadena sencilla o de cadena doble. Algunos virus tienen un genoma parcialmente de cadena doble y parcialmente de cadena sencilla (por ejemplo, hepadnavirus). La orientación o “sentido” del genoma y/o en la fabricación de un medicamento para su uso en la profilaxis o tratamiento de un patógeno y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de un patógeno, en el que el patógeno cumple una función importante para el ciclo de vida viral de virus, en particular en el ciclo de vida del virus de ARNcs o virus ADNcs. Un genoma de ARNcs de sentido positivo (+) tiene la misma orientación que un ARNm celular y se puede traducir directamente en proteínas virales. En el ciclo de vida de los virus que tienen un genoma de ARN de cadena sencilla de sentido negativo (ARNcs (-)), es necesario que las secuencias genómicas se transcriban en ARNm de sentido positivo que la célula anfitriona pueda traducir en proteínas virales. Un genoma de cadena sencilla que contiene tanto sentido positivo como negativo se denomina “ambisentido” (por ejemplo, ARNcs (+/-), ADNcs (+/-)).
Aunque el genoma de los virus puede ser bastante grande (por ejemplo, en el caso de virus de ADN), en particular los virus de ARN pequeños tienen estrategias desarrolladas evolutivamente para expresar sus productos génicos (por ejemplo, proteínas y péptidos) de una manera muy eficaz. Una de estas estrategias es la expresión de una o más poliproteínas codificadas por el genoma viral, que se procesan de forma conjunta o postraduccional en proteínas y/o péptidos individuales. Esta estrategia está adaptada, por ejemplo, por algunos virus de ARN de cadena doble (cd) o virus de ARN de cadena sencilla (cs) que tienen un genoma de sentido positivo. Los “virus envueltos”, tale como los ortomixovirus, paramixovirus, retrovirus, flavivirus, rabdovirus y alfavirus, están rodeados por una bicapa lipídica que se origina en la membrana plasmática del anfitrión (1).
Las glicoproteínas de adhesión se encuentran en todos los virus envueltos y median en la interacción inicial entre la envoltura viral y la membrana plasmática de la célula anfitriona a través de su unión a fracciones de carbohidratos o dominios de adhesión celular de proteínas u otras moléculas sobre la membrana plasmática de las células anfitrionas. De ese modo, las glicoproteínas de adhesión cierran la brecha entre el virus y la membrana de la célula anfitriona. Las glicoproteínas de adhesión designadas como “H” poseen actividad de hemaglutinina, las glicoproteínas designadas como “HN poseen actividades de hemaglutinina y neuraminidasa. Las glicoproteínas de adhesión se designan como “G” cuando no tienen actividad hemaglutinante ni neuraminidasa.
Paramixovirus
Los paramixovirus son una familia de virus animales que comprende un ARN de sentido negativo no segmentado de cadena sencilla. Los paramixovirus son responsables de una serie de enfermedades animales y humanas. El genoma de ARN de los paramixovirus tiene una longitud de 15 a 19 kilo bases (kb) y codifica de 6 a 10 genes. Cada gen contiene señales de inicio/detención de la transcripción al principio y al final, que se transcriben como parte del gen. La secuencia de genes se conserva a través de los paramixovirus debido a un fenómeno conocido como polaridad transcripcional en el que los genes más cercanos al extremo 3' del genoma se transcriben en mayor abundancia que los del extremo 5'. Después de que se transcribe cada gen, la polimerasa de ARN dependiente de ARN se pausa para liberar el nuevo ARNm cuando encuentra una secuencia intergénica. Cuando la polimerasa de ARN está en pausa, existe la posibilidad de que se disocie del genoma del ARN. Si se disocia, debe volver a ingresar al genoma en la secuencia líder, en lugar de continuar transcribiendo la longitud del genoma. Como resultado, cuanto más genes en dirección descendente de la cadena sean de la secuencia líder, menos serán transcritos por la polimerasa de ARN. Los genes de los paramixovirus están dispuestos en orden relativo de proteínas necesarias para una infección exitosa. La secuencia de genes conservada es Nucleocápside - Fosfoproteína - Matriz - Fusión - Adhesión - Grande (polimerasa).
Muchos genomas de paramixovirus siguen la denominada “regla de los seis”. De acuerdo con esta regla, la longitud total del genoma es casi siempre un múltiplo de seis. Sin embargo, los miembros de la subfamilia Pneumovirinae que comprende el virus sincitial respiratorio (RSV) no siguen esta regla.
Virus sincitial respiratorio (RSV)
El virus envuelto designado como virus sincitial respiratorio (RSV) es la causa más importante de enfermedad viral del tracto respiratorio inferior (LRTI) en lactantes y niños en todo el mundo (2). En los Estados Unidos, se estima que 70.000- 126.000 lactantes son hospitalizados anualmente con neumonía o bronquiolitis por RSV y que la tasa de hospitalización por bronquiolitis ha aumentado desde 1980 (3). Los niños se infectan a los 2 años de edad y la OMS ha estimado que el RSV provoca la enfermedad en aproximadamente 64 millones de niños cada año y 160.000 muertes. En los países industrializados, el RSV es responsable de al menos el 50 % de las hospitalizaciones por enfermedad respiratoria en niños, y hasta el 6 % de todas las infecciones por RSV en niños resultan en hospitalización (4). La infección por RSV no provoca una inmunidad duradera, por lo que los huéspedes humanos experimentan ciclos de infección y reinfección de por vida. Aunque tradicionalmente se considera un patógeno pediátrico, el RSV también causa una enfermedad grave en los ancianos y en las personas inmunodeprimidas (5). La carga de la enfermedad por RSV en los ancianos es comparable a la de la influenza estacional y se estima que el impacto económico de la enfermedad relacionada con el RSV en adultos es mayor que el de la influenza en relación con el número de días perdidos en el trabajo (6, 7). La profilaxis con anticuerpos monoclonales es eficaz para reducir en un 50 % las hospitalizaciones por RSV en lactantes con alto riesgo de enfermedad grave (8). Sin embargo, actualmente no existe una vacuna contra el RSV o una terapia antiviral eficaz.
El efecto desastroso de una vacuna de RSV inactivada con formalina (FI) en lactantes en la década de 1960 ha obstaculizado el desarrollo de vacunas. La vacuna no protegió contra la infección por RSV e indujo una enfermedad respiratoria exacerbada (9) que se ha atribuido a la inducción de anticuerpos de baja afinidad, de baja neutralización y de título alto, la falta de cebado de células T CD8+ y la inducción de una respuesta inmunitaria sesgada por Th2 (10, 11 y 12). Existe evidencia de que el RSV afecta la inducción de una respuesta inmunitaria adaptativa adecuada de las células T (13).
La vacunación en ganado bovino utilizando vectores plasmídicos de ADN que emplean los antígenos F y N del RSV bovino, seguido de refuerzo de proteína con virus muerto completo, se divulga por Boxus M. et. al. Journal of Virology Vol, 81 (2007) pp. 6879-89.
Por tanto, subsiste una clara necesidad de una vacuna eficaz no solo para proteger a los lactantes, sino también para reforzar la inmunidad en los ancianos y reducir la circulación del RSV en hermanos y adultos, que son la principal fuente de infección por RSV para infantes. Es especialmente deseable una vacuna contra el RSV capaz de inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes y una respuesta potente y amplia de las células T para cebar las respuestas de las células T en personas que aún no han sido infectadas con el RSV (lactantes) o para reforzar una respuesta de las células T preexistente en las personas que necesitan 'restablecer' la respuesta de la memoria a niveles más altos (ancianos).
Ortomixovirus
Los ortomixovirus son una familia de virus de ARN que incluye cinco géneros: virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Isavirus y Thogotovirus. Recientemente se ha descrito un sexto género. Los primeros tres géneros contienen virus que provocan influenza en vertebrados, que incluyen aves, humanos y otros mamíferos. Los tres géneros de virus de la influenza tienen diferencias antigénicas en su nucleoproteína y proteína de matriz. El virus de la influenza A infecta a los humanos, a otros mamíferos y aves, y provoca todas las pandemias de influenza. El virus de la influenza B infecta a humanos y focas. El virus de la influenza C infecta a humanos y cerdos.
Los virus de la familia Ortomixovirus contienen de 6 a 8 segmentos de ARN de cadena sencilla lineal de sentido negativo. La longitud total del genoma es de 12000 - 15000 nucleótidos (nt). El segmento más grande 2300 - 2500 nt; del segundo más grande 2300 - 2500 nt; del tercero 2200 - 2300 nt; de cuarto 1700 - 1800 nt; del quinto 1500 - 1600 nt; del sexto 1400- 1500 nt; del séptimo 1000- 1100 nt; del octavo 800-900 nt. La secuencia del genoma tiene secuencias repetidas terminales; repetidas en ambos extremos. Las repeticiones terminales en el extremo 5' tienen una longitud de 12-13 nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos del extremo 3' son idénticas a las mismas en géneros de la misma familia; la mayoría en ARN (segmentos), o en todas las especies de ARN. Repeticiones terminales en el extremo 3' de 9 - 11 nucleótidos de longitud.
El virus de la influenza es uno de los patógenos respiratorios más importantes. Solo en los EE.UU., la infección por influenza es responsable de 20.000 a 40.000 muertes y más de 100.000 hospitalizaciones al año (1). Los lactantes, los ancianos y las personas con sistemas cardíacos, pulmonares o inmunitarios comprometidos corren un gran riesgo de sufrir complicaciones graves después de una infección por influenza.
La inmunización demuestra ser la medida más eficaz para prevenir la enfermedad. Una de las características comunes que comparten todas las vacunas contra la influenza actuales consiste en dirigirse principalmente a la inducción de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la principal proteína de la envoltura viral, la hemaglutinina (HA).
Sumario de la invención
La invención proporciona en un primer aspecto una composición que comprende un sistema de expresión que comprende un vector viral de adenovirus que comprende polinucleótidos que codifican proteínas de pneumovirus, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el sistema de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, un segundo polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, y un tercer polinucleótido que codifica una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, en la que:
el pneumovirus es virus sincitial respiratorio humano (RSV);
la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el primer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV seleccionada del grupo que consiste en proteínas de Matriz M y M2;
la proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, codificada por el segundo polinucleótido, es una proteína estructural y/o de superficie de RSV que es la proteína de fusión (F);
la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el tercer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV que es la nucleoproteína N; y en el que el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína artificial.
También se divulga una mezcla de proteína aislada codificada por el sistema de expresión como se define en el primer aspecto.
También se divulga una célula anfitriona aislada que contiene el sistema de expresión como se define en el primer aspecto y/o la mezcla de proteína.
También se divulga una composición que comprende el sistema de expresión como se define en el primer aspecto, o la mezcla de proteína, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la composición que comprende el sistema de expresión como se define en el primer aspecto para su uso en medicina en particular en el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas, preferentemente una enfermedad viral.
También se divulga un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad viral que comprende la administración de una cantidad eficaz del sistema de expresión como se define en el primer aspecto, la mezcla de proteína, la célula y la composición de la divulgación.
También se divulga un procedimiento de mejora de una respuesta inmunitaria que comprende la administración del sistema de expresión del primer aspecto, la mezcla de proteína, la célula y la composición de la divulgación.
También se divulgan construcciones de nucleótidos que codifican la hemaglutinina de la influenza (HA), un sistema de expresión que comprende estas construcciones de nucleótidos, y proteínas o poliproteínas codificadas por las construcciones de nucleótidos o el sistema de expresión, en el que el sitio de escisión HA0 tiene una secuencia multibásica.
También se divulga el uso del sitio de escisión HA0 multibásico para construir sistemas de expresión capaces de expresar hemaglutinina de la influenza (HA) in vitro y/o in vivo.
El resumen anterior no describe necesariamente todos los aspectos de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1: Diagrama esquemático de la poliproteína de la vacuna contra RSV. conF0 = secuencia de consenso de la proteína F, 2A = sitio de escisión traduccional del virus de la fiebre aftosa, conN = secuencia de consenso de la proteína N, conM2-1 = consenso de la proteína M2-1.
Fig. 2: El antígeno de vacuna F0ATM-N-M2-1 se procesa eficazmente en células de mamífero. Análisis de transferencia Western de lisados de células HeLa; nt: Hela no transfectada. RSV transf: células HeLa transfectadas con F0ATM-N-M2-1. RSV inf: células Hep2 infectadas con la cepa A de RSV.
Fig. 3: La proteína F secretada forma un homotrímero. Análisis de transferencia Western del sobrenadante de células HeLa transfectadas; RSV: F0ATM-N-M2-1 transfectado, F0: F0ATM transfectado, Ctrl: plásmido vacío transfectado
Fig. 4: La proteína F expresada a partir de la poliproteína de vacuna es un mejor inmunógeno que la proteína F sola. A. Análisis de transferencia Western del sobrenadante de células HeLa infectadas con PanAd3/F0ATM-N-M2-1 que se sondearon con diferentes diluciones de sueros de ratones inmunizados con F0ATM o F0ATM-N-M2-1 B. barrido densitométrico de la transferencia Western sobre el panel A. Los datos se expresan como la Intensidad Relativa del área correspondiente a la banda de proteína.
Fig. 5: La vacuna contra RSV indujo una potente inmunidad de células T sistémica en ratones mediante una única inyección intramuscular. Ensayo de IFNg-Elispot de esplenocitos de ratones Balb/C inmunizados con PanAd3/F0ATM-N-M2-1 utilizando péptidos inmunodominantes mapeados de proteínas RSV F y M.
Fig. 6: Diagrama esquemático de la poliproteína de la vacuna contra la influenza. NP = secuencia consenso de la proteína NP, M1 = secuencia consenso de la proteína M1,2A = sitio de escisión traduccional del virus de la Fiebre Aftosa, H1p = secuencia consenso de la proteína HA de H1N12009.
Fig. 7 Análisis de transferencia Western de la expresión de H1p en células HeLa transfectadas. Lisado total de células HeLa transfectadas con PVJ-H1p (Columna 1), con PVJ-H1 (Columna 2) y CTR no transfectadas (Columna 3). Las flechas muestran las bandas correspondientes a la forma HA0 no escindida (70 kD) y la HA2 escindida (28 Kd). El suero policlonal anti-HA reconoce epítopos en el fragmento de proteína HA2. Se muestra que la proteína H1p está completamente procesada.
Fig. 8 Análisis FACS de células completas de proteínas HA mostradas en la membrana. Los histogramas representan el análisis de la mediana de la fluorescencia de las células HeLa transfectadas con HA de tipo silvestre (panel superior derecho) y H1 (panel inferior derecho). Las células se incubaron con suero policlonal de ratón hiperinmunitario producido contra H1p y luego con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con PE. En los paneles superior e inferior izquierdo, las células se incubaron con suero preinmuniario de ratón para establecer el nivel de fluorescencia de fondo.
Fig. 9 H1p es capaz de inducir títulos de anticuerpos más altos. Ensayo ELISA sobre HA recombinante recubierta (H1N1 California 2009). Los títulos de anticuerpos se midieron en sueros de animales inmunizados con H1 y H1p. Los títulos se calcularon mediante diluciones seriadas de los sueros y representan la dilución que da un valor de DO tres veces mayor que el fondo.
Fig. 10 La infección por virus pseudotipado de células MDCK con HA (H1N1Mexico2009) se neutraliza de forma más potente mediante el suero de animales inmunizados con H1p. Resultados de un ensayo ELISA sobre HA recombinante recubierta (H1N1 California 2009) con sueros de animales inmunizados con H1p y NPM1H1p.
Fig. 11 La H1p expresada en el contexto del antígeno triple es capaz de inducir títulos de anticuerpos más altos. Ensayo ELISA sobre HA recombinante recubierta (HlN1 California 2009). Los títulos de anticuerpos se midieron en sueros de animales inmunizados con H1p y NPM1H1p. Los títulos se calcularon mediante diluciones seriales de los sueros y representan la dilución que da un valor de DO tres veces mayor que el fondo.
Fig. 12 El análisis de transferencia Western de la expresión del antígeno NPM1H1p sobre células HeLa transfectadas muestra que la proteína está completamente procesada. Lisado total de células HeLa transfectadas con pNEB-NpM1H1p (Columna 1), con pNEB-NPM1 (Columna 2) y transfectadas de forma simulada (Columna 3). La flecha muestra la banda correspondiente a la proteína de fusión NPM1 (70 kD. Se ha utilizado un anticuerpo anti-NP monoclonal para detectar la proteína intracelular.
Fig. 13 Se muestra H1p derivada del procesamiento de NPM1H1p sobre la membrana celular y se pliega correctamente. Análisis FACS de células completo de células HeLa transfectadas de forma simulada (panel izquierdo) o transfectadas con NPM1H1p (panel derecho). Las células se incubaron con el mAb C179 de ratón que se une a un epítopo conformacional en la región madre HA y luego con un anticuerpo secundario anti-ratón PE-conjugado.
Descripción detallada de la invención
Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, se debe entender que la presente invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente memoria, ya que estos pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.
Preferiblemente, los términos utilizados en la presente memoria se definen como se describe en “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza).
Definiciones
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender” y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de un entero o etapa o grupo de enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.
Las abreviaturas “F” o “F0” se utilizan indistintamente en la presente memoria y se refieren a la proteína de fusión de paramixovirus, preferentemente de RSV.
La abreviatura “G” se refiere a la Glicoproteína de paramixovirus, preferentemente de pneumovirinae, más preferentemente de RSV.
La abreviatura “H” se refiere a la Proteína de Hemaglutinina de paramixovirus, preferentemente de morbilivirus. La abreviatura “HN” se refiere a la Proteína de la Hemaglutinina-Neuraminidasa de paramixovirus, particularmente de Respirovirus, Avulavirus y Rubulavirus.
La abreviatura “N” se refiere a la proteína de Nucleocápside de paramixovirus, preferentemente de RSV.
La abreviatura “M” se refiere a la proteína de Matriz glicosilada de paramixovirus, preferentemente de RSV.
Con respecto a paramixovirus, la abreviatura “M2” o “M2-1” se refiere a la proteína de Matriz no glicosilada de paramixovirus, preferentemente de RSV.
La abreviatura “P” se refiere a la proteína de Fosforoparamixovirus, preferentemente de RSV.
Con respecto a paramixovirus, la abreviatura “NS1” y “NS2” se refieren a las proteínas no estructurales 1 y 2 de paramixovirus, preferentemente de RSV.
La abreviatura “L” se refiere a la subunidad catalítica de la polimerasa de paramixovirus, preferentemente de RSV. La abreviatura “HA” se refiere a la hemaglutinina de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A.
La abreviatura “HA0” se refiere a la proteína precursora de subunidad de hemaglutinina HA1 y HA2 de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A
La abreviatura “H1p” se refiere a la hemaglutinina modificada de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A.
La abreviatura “NA” se refiere a la neuraminidasa de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A.
La abreviatura “NP” se refiere a la nucleoproteína de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A.
La abreviatura “M1” se refiere a la proteína de matriz 1 de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A.
Con respecto un ortomixovirus, la abreviatura “M2” se refiere a la proteína de Matriz M2 de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A.
Con respecto un ortomixovirus, la abreviatura “NS1” se refiere a la proteína no estructural 1 de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente de virus de la influenza A.
La abreviatura “NS2/NEP” se refiere a la proteína no estructural 2 (también mencionada como NEP, proteína de exportación nuclear) de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente virus de la influenza A.
La abreviatura “PA” se refiere a una proteína de subunidad de polimerasa de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente virus de la influenza A.
La abreviatura “PB1” se refiere a una proteína de subunidad de polimerasa de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente virus de la influenza A.
La abreviatura “PB2” se refiere a una proteína de subunidad de polimerasa de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente virus de la influenza A.
La abreviatura “PB1-F2” o “PB1F2” se refiere a una proteína codificada por un marco de lectura alternativo en el segmento del Gen PB1 de ortomixovirus, preferentemente virus de la influenza, más preferentemente virus de la influenza A.
El término “sistema de expresión” como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sistema designado para producir uno o más productos génicos de interés. Normalmente, se designa dicho sistema “artificialmente”, es decir, mediante medios tecnológicos genéticos utilizables para producir el producto génico de interés, ya sea in vitro en sistemas sin células o in vivo en sistemas en base a células. Se entiende que los sistemas de expresión de origen natural, tal como por ejemplo los virus nativos, no están incluidos en el sistema de expresión de la presente invención.
El “producto génico de interés” se refiere normalmente a una macromolécula tal como, pero sin limitarse a, ARN, péptido, polipéptido o proteína, o segmento, epítopo o fragmento del mismo.
En un sistema de expresión, el producto génico de interés está codificado por una o más moléculas de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico se entienden como macromoléculas poliméricas elaboradas de monómeros de nucleótidos. Los monómeros de nucleótidos se componen de una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos (tales como, pero no limitados a ribosa o 2'-desoxirribosa) y de uno a tres grupos fosfato. Normalmente, un polinucleótido se forma a través de enlaces fosfodiéster entre los monómeros de nucleótidos individuales. En el contexto de la presente invención se refieren a moléculas de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, ácido ribonucleico (ARN) y ácido desoxirribonucleico (ADN). Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se utilizan indistintamente en la presente memoria.
En sistemas de expresión sin células, se utilizan polinucleótidos aislados como plantilla para reacciones de traducción in vitro. En los sistemas de expresión basados en células, los polinucleótidos están comprendidos en uno o más vectores. Como se utiliza en la presente memoria, el término “vector” se refiere a una proteína o un polinucleótido o una mezcla de los mismos que es capaz de introducirse o de introducir las proteínas y/o el ácido nucleico comprendidos en el mismo en una célula. En el contexto de la presente invención, es preferente que los genes de interés codificados por el polinucleótido introducido se expresen dentro de la célula tras la introducción del vector o vectores. Ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, fagos, virus o cromosomas artificiales.
La frase “ inducción de la respuesta de células T” se refiere a la generación o la reestimulación de células T CD4+ o CD8+ específicas del virus. El sistema de expresión de la invención puede inducir o volver a estimular una respuesta adaptativa mediada por células T dirigida a los epítopos del MHC de clase I o clase II presentes en las proteínas virales expresadas por el polinucleótido. Dicha respuesta de células T se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica, preferiblemente mediante reestimulación ex vivo de células T con péptidos sintéticos que abarcan todas las proteínas virales y análisis de proliferación o producción de Interferón-gamma.
La frase “ inducción de la respuesta de células B” se refiere a la generación o la reestimulación de células B específicas de virus que producen inmunoglobulinas de clase IgG o IgA. El sistema de expresión de la invención puede inducir o volver a estimular las células B que producen anticuerpos específicos para antígenos patogénicos, por ejemplo virales, expresados por el polinucleótido. Dicha respuesta de células B se puede medir mediante ensayo ELISA (Ensayo inmuno teñido ligado a enzima) con el antígeno sintético de inmunoglobulina de suero o mucosa. Alternativamente, el título de anticuerpos inducidos se puede medir mediante ensayos de neutralización de virus.
La frase “inducción de una respuesta de células B anti-patógenas” se refiere a la generación o la reestimulación de células B específicas de virus que producen inmunoglobulinas de clase IgG o IgA que inactiva, elimina, bloquea y/o neutraliza el patógeno respectivo de tal manera que la enfermedad provocada por el patógeno no brote y/o se alivien los síntomas. Esto también se denomina “respuesta inmunitaria protectora” contra el patógeno. El sistema de expresión de la invención puede inducir o volver a estimular las células B que producen anticuerpos específicos para antígenos patogénicos, por ejemplo virales, expresados por el polinucleótido. Dicha respuesta de células B se puede medir mediante ensayo ELISA (Ensayo inmuno teñido ligado a enzima) con el antígeno sintético de inmunoglobulina de suero o mucosa. Alternativamente, el título de anticuerpos inducidos se puede medir mediante ensayos de neutralización de virus.
La frase “potenciar una respuesta inmunitaria” se refiere al fortalecimiento o intensificación de la respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra un inmunógeno, preferiblemente patógenos, más preferiblemente virus. La potenciación de la respuesta inmunitaria se puede medir al comparar la respuesta inmunitaria provocada por un sistema de expresión de la invención con la respuesta inmunitaria de un sistema de expresión que expresa el mismo antígeno/inmunógeno solo mediante el uso de pruebas descritas en la presente memoria y/o pruebas bien conocidas en el presente campo técnico.
En un sistema de expresión, un gen de interés se puede codificar por un único polinucleótido o por varios polinucleótidos separados. En los sistemas de expresión en base a células, uno o más polinucleótidos pueden estar comprendidos en un solo vector o en varios vectores separados. Cada uno de estos polinucleótidos puede codificar la totalidad o una parte del producto génico de interés.
Adicionalmente, los sistemas de expresión pueden abarcar “secuencias de control de la expresión” que regulan la expresión del gen de interés. Normalmente, las secuencias de control de la expresión son polipéptidos o polinucleótidos tales como, pero no limitados a, promotores, potenciadores, silenciadores, aislantes o represores.
De acuerdo con lo anterior, un vector que comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más productos génicos de interés puede comprender secuencias de control de expresión adicionales. En un vector que comprende más de un polinucleótido que codifica uno o más productos génicos de interés, la expresión se puede controlar conjuntamente o por separado mediante una o más secuencias de control de la expresión. Más específicamente, cada polinucleótido comprendido en el vector se puede controlar mediante una secuencia de control de expresión separada o todos los polinucleótidos comprendidos en el vector se pueden controlar mediante una única secuencia de control de expresión. Los polinucleótidos comprendidos en un único vector controlado por una única secuencia de control de expresión forman preferiblemente un marco de lectura abierto.
El término “sistema de expresión” abarca adicionalmente la expresión del producto génico de interés que comprende la transcripción de los polinucleótidos, corte y empalme de ARN, traducción en un polipéptido y modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.
El término “marco de lectura abierto” (ORF) se refiere a una secuencia de nucleótidos, que se puede traducir en aminoácidos. Normalmente, dicho ORF contiene un codón de inicio, una región posterior que generalmente tiene una longitud que es un múltiplo de 3 nucleótidos, pero no contiene un codón de detención (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA o UGA) en el marco de lectura dado. Normalmente, los ORF se producen de forma natural o se construyen artificialmente, es decir, por medios de tecnología genética. Un ORF codifica una proteína en la que los aminoácidos en los que se puede traducir forman una cadena ligada a un péptido.
Los términos “proteína”, “polipéptido” y “péptido” se utilizan indistintamente en la presente memoria y se refieren a cualquier cadena de aminoácidos ligada a péptidos, independientemente de la longitud o modificación postraduccional.
El término “postraduccional” utilizado en la presente memoria se refiere a eventos que ocurren después de la traducción de un triplete de nucleótidos en un aminoácido y la formación de un enlace de péptido al aminoácido que procede en la secuencia. Dichos eventos postraduccionales pueden ocurrir después de que se formó el polipéptido completo o ya durante el proceso de traducción sobre aquellas partes del polipéptido que ya se han traducido. Los eventos postraduccionales normalmente alteran o modifican las propiedades químicas o estructurales del polipéptido resultante. Ejemplos de eventos postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, eventos tales como glicosilación o fosforilación de aminoácidos, o escisión de la cadena de péptidos, por ejemplo, por una endopeptidasa.
El término “cotraduccional” utilizado en la presente memoria se refiere a eventos que ocurren durante el proceso de traducción de un triplete de nucleótidos en una cadena de aminoácidos. Estos eventos normalmente alteran o modifican las propiedades químicas o estructurales de la cadena de aminoácidos resultante. Ejemplos de eventos cotraduccionales incluyen pero no se limitan a eventos que pueden detener el proceso de traducción por completo o interrumpir la formación de enlaces de péptidos dando como resultado dos productos de traducción discretos.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos “poliproteína” o “poliproteína artificial” se refieren a una cadena de aminoácidos que comprende, o consiste esencialmente en o consiste en dos cadenas de aminoácidos que no están conectadas naturalmente entre sí. La poliproteína puede comprender una o más cadenas de aminoácidos adicionales. Cada cadena de aminoácidos es preferiblemente una proteína completa, es decir, que abarca un ORF completo, o un fragmento, dominio o epítopo del mismo. Las partes individuales de una poliproteína pueden estar conectadas entre sí de forma permanente o temporal. Las partes de una poliproteína que están conectadas permanentemente se traducen a partir de un único ORF y no se separan posteriormente co o postraduccionalmente. Las partes de las poliproteínas que están conectadas temporalmente también pueden derivar de un único ORF pero se dividen cotraduccionalmente debido a la separación durante el proceso de traducción o postraduccionalmente debido a la escisión de la cadena de péptidos, por ejemplo, por una endopeptidasa. Adicional o alternativamente, también se pueden derivar partes de una poliproteína de dos ORF diferentes y estar conectadas postraduccionalmente, por ejemplo a través de enlaces covalentes.
Las proteínas o poliproteínas utilizables en la presente divulgación (que incluyen derivados de proteínas, variantes de proteínas, fragmentos de proteínas, segmentos de proteínas, epítopos de proteínas y dominios de proteínas) se pueden modificar adicionalmente mediante modificación química. Esto significa que dicho polipéptido modificado químicamente comprende otros grupos químicos además de los 20 aminoácidos de origen natural. Ejemplos de dichos otros grupos químicos incluyen, sin limitación, aminoácidos glicosilados y aminoácidos fosforilados. Las modificaciones químicas de un polipéptido pueden proporcionar propiedades ventajosas en comparación con el polipéptido original, por ejemplo, una o más de estabilidad mejorada, vida media biológica aumentada o solubilidad en agua aumentada. Las modificaciones químicas aplicables a las variantes utilizables en la presente divulgación incluyen, sin limitación: PEGilación, glicosilación de polipéptidos originales no glicosilados o la modificación del patrón de glicosilación presente en el polipéptido original. Dichas modificaciones químicas aplicables a las variantes utilizables en la presente divulgación se pueden producir de forma co o postraduccional.
El término “segmento” se refiere a cualquier parte de una macromolécula (por ejemplo, un polipéptido, proteína o poliproteína) en la que se puede dividir esta macromolécula. Una macromolécula puede constar de uno o más segmentos. Dicha segmentación puede existir debido a propiedades funcionales (por ejemplo, que tienen características inmunorreactivas o funciones de adhesión a la membrana) o estructurales (por ejemplo, secuencia de nucleótidos o aminoácidos, o estructura secundaria o terciaria) de la macromolécula y/o del segmento individual. En el contexto de la presente invención, es preferente que el término “segmento” se refiera a una parte de una proteína o poliproteína. Es particularmente preferente que dicho segmento se pliegue y/o funcione independientemente del resto de la proteína o poliproteína.
Un “epítopo”, también conocido como determinante antigénico, es el segmento de una macromolécula que es reconocido por el sistema inmunitario, específicamente por anticuerpos, células B o células T. Dicho epítopo es la parte o segmento de una macromolécula capaz de unirse a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En este contexto, el término “unión” se refiere preferiblemente a una unión específica. En el contexto de la presente invención, es preferente que el término “epítopo” se refiera al segmento de proteína o poliproteína que es reconocido por el sistema inmunitario. Los epítopos por lo general consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y por lo general tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “dominio” se refiere al segmento de una secuencia o estructura de proteínas o poliproteínas (o secuencia de nucleótidos correspondiente) que puede evolucionar, funcionar y/o existir independientemente del resto de la cadena de proteína. Normalmente, una proteína consta de uno o varios dominios, cada uno de los cuales tienen una estructura tridimensional que es estable y se pliega independientemente del resto de la cadena de la proteína. Dicho dominio forma normalmente una unidad funcional independiente dentro de la proteína (por ejemplo, dominios transmembrana, dominios similares a inmunoglobulina o dominios de unión al ADN).
Como se utiliza en la presente memoria, el término proteína o segmento “variante” se debe entender como un polipéptido (o segmento) que difiere en comparación con el polipéptido (o segmento, epítopo o dominio) del que se deriva por uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos. El polipéptido del que se deriva una variante de proteína también se conoce como polipéptido original. Asimismo, el segmento del que se deriva una variante de segmento se conoce como segmento original. Normalmente, una variante se construye artificialmente, preferiblemente por medios tecnológicos genéticos. Normalmente, el polipéptido original es una proteína de tipo silvestre o un dominio de proteína de tipo silvestre. En el contexto de la presente invención, es adicionalmente preferente que un polipéptido original (o segmento original) sea la secuencia consenso de dos o más polipéptidos de tipo silvestre (o segmentos de tipo silvestre). Adicionalmente, las variantes utilizables en la presente divulgación también pueden derivarse de homólogos, ortólogos o parálogos del polipéptido original o de una variante construida artificialmente, con la condición de que la variante exhiba al menos una actividad biológica del polipéptido original. Los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden ser intercambios de aminoácidos, inserciones, supresiones, truncamientos de terminal N o truncamientos de terminal C, o cualquier combinación de estos cambios, que puedan ocurrir en uno o varios sitios. En realizaciones preferentes, una variante utilizable en la presente divulgación exhibe un número total de hasta 200 (hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200) cambios en la secuencia de aminoácidos (es decir intercambios, inserciones, supresiones, truncamientos de terminal N, y/o truncamientos de terminal C). Los intercambios de aminoácidos pueden ser conservadores y/o no conservadores. En realizaciones preferentes, una variante utilizable en la presente divulgación difiere de la proteína o dominio del cual se deriva en hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 intercambios de aminoácidos, preferentemente cambios de aminoácidos conservadores.
Alternativa o adicionalmente, se puede caracterizar una “variante” como se utiliza en la presente memoria, por un cierto grado de identidad de secuencia con el polipéptido original o polinucleótido original del cual se deriva. Más precisamente, una variante de proteína en el contexto de la presente invención exhibe al menos 80 % de identidad de secuencia con su polipéptido original. Una variante de polinucleótido en el contexto de la presente invención exhibe al menos 80 % de identidad de secuencia con su polinucleótido original. Preferentemente, la identidad de secuencia de variantes de proteína está sobre un tramo continuo de 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos. Preferentemente, la identidad de secuencia de las variantes de polinucleótido está sobre un tramo continuo de 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 o más nucleótidos.
El término “al menos 80 % de identidad de secuencia” se utiliza en toda la memoria descriptiva con respecto a comparaciones de secuencias de polipéptidos y polinucleótidos. Esta expresión preferentemente se refiere a una identidad de secuencia de al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % con el polipéptido de referencia respectivo o con el polinucleótido de referencia respectivo. Preferentemente, el polipéptido en cuestión y el polipéptido de referencia exhiben la identidad de secuencia indicada sobre un tramo continuo de 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos o en toda la longitud del polipéptido de referencia. Preferentemente, el polinucleótido en cuestión y el polinucleótido de referencia exhiben la identidad de secuencia indicada sobre un tramo continuo de 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 o más nucleótidos o en toda la longitud del polipéptido de referencia.
Las variantes pueden comprender adicionalmente o alternativamente supresiones de aminoácidos, que pueden ser truncamientos de terminal N, truncamientos de terminal C o supresiones internas o cualquier combinación de estos. Dichas variantes que comprenden truncamientos de terminal N, truncamientos de terminal C y/o supresiones internas se refieren como “variante de supresión” o “fragmentos” en el contexto de la presente aplicación. Los términos “variante de supresión” y “fragmento” se utilizan indistintamente en la presente memoria. Un fragmento puede ser de origen natural (por ejemplo, variantes de corte y empalme) o se puede construir artificialmente, preferiblemente por medios tecnológicos genéticos. Preferiblemente, un fragmento (o variante de supresión) tiene una supresión de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos en su terminal N y/o en su terminal C y/o internamente en comparación con el polipéptido original, preferiblemente en su terminal N, en su terminal N y C, o en su terminal C. En caso de que se comparen dos secuencias y no se especifique la secuencia de referencia en comparación con la cual se calculará el porcentaje de identidad de secuencia, la identidad de secuencia se calculará con referencia a la más larga de las dos secuencias que se van a comparar, si no específicamente indicado de otra manera. Si se indica la secuencia de referencia, la identidad de secuencia se determina sobre la base de la longitud completa de la secuencia de referencia indicada por SEQ ID, si no se indica específicamente lo contrario. Por ejemplo, una secuencia de péptidos que consta de 50 aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína F de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 puede exhibir un porcentaje máximo de identidad de secuencia del 10,04 % (50/498) mientras que una secuencia con una longitud de 249 los aminoácidos pueden exhibir un porcentaje máximo de identidad de secuencia del 50,00 % (249/498).
La similitud de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, es decir, el porcentaje de identidad de secuencia, se puede determinar mediante alineaciones de secuencia. Dichas alineaciones se pueden llevar a cabo con varios algoritmos conocidos en la técnica, preferiblemente con el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), con hmmalign (paquete HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) o con el algoritmo CLUSTAL (Thompson, J.D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res.22, 4673-80) disponible, por ejemplo, en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o en http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html. Los parámetros preferidos que se utilizan son los predeterminados, ya que se establecen en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. El grado de identidad de secuencia (coincidencia de secuencia) se puede calcular utilizando, por ejemplo, BLAST, BLAT o BlastZ (o BlastX). Un algoritmo similar se incorpora a los programas BLASTN y BLASTP de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Las búsquedas de polinucleótidos BLAST se realizan con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de polinucleótidos que son homólogas a aquellos ácidos nucleicos que codifican F, N o M2-1. Las búsquedas de proteínas BLAST se realizan con el programa BLASTP, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas al polipéptido F, polipéptido N o polipéptido M2-1. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, se utiliza Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389­ 3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros predeterminados de los programas respectivos. El análisis de coincidencia de secuencias se puede complementar mediante técnicas de mapeo de homología establecidas como Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162) o campos aleatorios de Markov. Cuando se hace referencia a porcentajes de identidad de secuencia en la presente solicitud, estos porcentajes se calculan en relación con la longitud completa de la secuencia más larga, si no se indica específicamente lo contrario.
Los polinucleótidos de la divulgación codifican proteínas, péptidos o variantes de los mismos que comprenden aminoácidos que se designan siguiendo el código estándar de una o tres letras de acuerdo con el estándar WIPO ST.25 a menos que se indique lo contrario. Si no se indica lo contrario, el código de una o tres letras se dirige a los L-aminoácidos de origen natural y la secuencia de aminoácidos se indica en la dirección desde el terminal N hasta el terminal C de la proteína, péptido o variante respectivo del mismo.
La “hibridación” también se puede utilizar como una medida de identidad de secuencia u homología entre dos secuencias de ácido nucleico. Se puede utilizar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención, o una porción de cualquiera de estas, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar. La hibridación de una sonda respectiva con ADN o ARN de una fuente de prueba es una indicación de la presencia del ADN o ARN objetivo, respectivamente, en la fuente de prueba. Las condiciones de hibridación son conocidas por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 6.3.1-6.3.6, 1991. Las “condiciones de hibridación moderadas” se definen como equivalente a la hibridación en cloruro de sodio 2X/citrato de sodio (SSC) a 30 °C, seguido de un lavado en SSC1X, SDS al 0,1 % a 50 °C. Las “condiciones muy rigurosas” se definen como equivalentes a la hibridación en cloruro de sodio/citrato sódico (SSC) 6X a 45 °C, seguido de un lavado en SSC 0,2 X, Sd S al 0,1% a 65 °C.
Adicional o alternativamente, se puede producir una variante de supresión no debido a supresiones estructurales de los respectivos aminoácidos como se describió anteriormente, sino debido a que estos aminoácidos están inhibidos o no son capaces de cumplir con su función biológica. Normalmente, dicha supresión funcional ocurre debido a las inserciones o intercambios en la secuencia de aminoácidos que cambia las propiedades funcionales de la proteína resultante, como por ejemplo, pero sin limitarse a, alteraciones en las propiedades químicas de la proteína resultante (es decir, intercambio de aminoácidos hidrofóbicos a aminoácidos hidrófilos), alteraciones en las modificaciones postraduccionales de la proteína resultante (por ejemplo, escisión postraduccional o patrón de glicosilación), o alteraciones en la estructura de la proteína secundaria o terciaria. Adicional o alternativamente, también se puede producir una supresión funcional debido al silenciamiento de genes transcripcional o postranscripcional (por ejemplo, mediante ARNip) o la presencia o ausencia de moléculas inhibidoras tales como, pero sin limitarse a, inhibidores de proteínas o anticuerpos inhibidores.
En el contexto de la presente invención, es preferente que una proteína (o un segmento o un dominio o un epítopo) que está “funcionalmente suprimido” se refiere al hecho de que los aminoácidos o nucleótidos de la secuencia correspondiente están suprimidos o presentes pero no cumpliendo su función biológica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “consenso” se refiere a una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que representa los resultados de una alineación de múltiples secuencias, en el que las secuencias relacionadas se compararon entre sí. Dicha secuencia de consenso está compuesta por los aminoácidos o nucleótidos más comúnmente observados en cada posición. En el contexto de la presente invención, es preferente que las secuencias utilizadas en la alineación de secuencias para obtener la secuencia consenso sean secuencias de cepas de diferentes subtipos/serotipos virales aislada s en diversos brotes de enfermedades diferentes en todo el mundo. Cada secuencia individual utilizada en la alineación de secuencias se denomina secuencia de un “aislado” de virus particular. En la sección de Ejemplos se proporciona una descripción más detallada de los procedimientos matemáticos para obtener dicho consenso. En caso de que para una posición dada no pueda determinarse ningún “nucleótido consenso” o “aminoácido consenso”, por ejemplo, porque sólo se compararon dos aislados, es preferente que se utilice el aminoácido de cada uno de los aislados. La proteína resultante se evalúa por su respectiva capacidad de inducción de células B y/o células T.
Un “péptido ligador” (o corto: “ ligador”) en el contexto de la presente invención se refiere a una secuencia de aminoácidos de entre 1 y 100 aminoácidos. En realizaciones preferentes, un péptido ligador de acuerdo con la presente invención tiene una longitud mínima de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 aminoácidos. En realizaciones preferentes adicionales, un péptido ligador de acuerdo con la presente invención tiene una longitud máxima de 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, o 15 aminoácidos o menos. Es preferente que los ligadores de péptido proporcionen flexibilidad entre las dos proteínas de aminoácido, fragmentos, segmentos, epítopos y/o dominios que se ligan juntos. Dicha flexibilidad en general se aumenta si los aminoácidos sin pequeños. De esta manera, preferentemente el péptido ligador de la presente invención tiene un mayor contenido de aminoácidos pequeños, en particular de glicinas, alaninas, serinas, treoninas, leucinas e isoleucinas. Preferentemente, mayor que 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o más de los aminoácidos del péptido ligador son aminoácidos pequeños. En una realización preferente los aminoácidos del ligador se seleccionan de glicinas y serinas. En realizaciones especialmente preferidas, se pueden combinar las longitudes mínimas y máximas preferidas indicadas anteriormente del péptido ligador de acuerdo con la presente invención. En realizaciones preferentes adicionales, el péptido ligador de la presente invención no es inmunogénico; en realizaciones particularmente preferidas, el péptido ligador no es inmunogénico para los humanos.
El término “sitio de escisión” como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos en la que esta secuencia dirige la división, por ejemplo porque es reconocido por una enzima de escisión y/o se puede dividir. Normalmente, se escinde una cadena de polipéptidos mediante hidrólisis de uno o más enlaces de péptido que ligan los aminoácidos y una cadena de polinucleótidos se escinde mediante hidrólisis de uno o más del enlace fosfodiéster entre los nucleótidos. La escisión de enlaces de péptido o fosfodiéster se puede originar a partir de una escisión química o enzimática. La escisión enzimática se refiere a que dicha escisión que es alcanzada por enzimas proteolíticas que incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción (por ejemplo, enzimas de restricción tipo I, tipo II, tipo II, tipo IV o enzimas de restricción artificiales) y endo o exopeptidasas o -proteasas (por ejemplo, proteasas de serina, proteasas de cisteína, metalo proteasas, proteasas de treonina, proteasas de aspartato, proteasas de ácido glutámico). Normalmente, la escisión enzimática se produce debido a la autoescisión o es efectuada por una enzima proteolítica independiente. La escisión enzimática de una proteína o polipéptido puede ocurrir co o postraduccionalmente. De acuerdo con lo anterior, el término “sitio de escisión de endopeptidasa” utilizado en la presente memoria, se refiere a un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos en la que esta secuencia se escinde o es escindida por una endopeptidasa (por ejemplo, tripsina, pepsinaa, elastasa, trombina, colagenasa, furina, termolisina, endopeptidasa V8, catepsinas). Alternativa o adicionalmente, la poliproteína de la presente invención se puede escindir mediante una autoproteasa, es decir, una proteasa que escinde los enlaces de péptidos en la misma molécula de proteína que también comprende la proteasa. Ejemplos de dichas autoproteasas son la proteasa NS2 de flavivirus o la proteasa VP4 de bimavirus.
Alternativamente, el término “sitio de escisión” se refiere a una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos que previene la formación de enlaces de péptido o fosfodiéster entre aminoácidos o nucleótidos, respectivamente. Por ejemplo, la formación de enlaces se puede evitar debido al autoprocesamiento cotraduccional del polipéptido o poliproteína dando como resultado dos productos de traducción discontinuos que se derivan de un solo evento de traducción de un solo marco de lectura abierto. Normalmente, dicho autoprocesamiento se efectúa mediante un “salto ribosómico” provocado por una secuencia de pseudocodón de detención que induce al complejo de traducción a moverse de un codón al siguiente sin formar un enlace de péptido. Los ejemplos de secuencias que inducen un salto ribosómico incluyen, pero no se limitan a, péptidos 2A virales o péptidos similares a 2A (en la presente memoria ambos se denominan colectivamente como “péptido 2A” o de forma intercambiable como “sitio 2A” o “sitio de escisión 2A”) que se utilizan por varias familias de virus, que incluyen Picornavirus, virus de insectos, Aphtoviridae, Rotavirus y Trypanosoma. Los más conocidos son los sitios 2A de rinovirus y virus de la fiebre aftosa de la familia Picornaviridae que se utilizan normalmente para producir múltiples polipéptidos a partir de un único ORF.
De acuerdo con lo anterior, el término “sitio de autoescisión” como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos en la que esta secuencia se escinde o es escindible sin que dicha escisión implique ninguna molécula adicional o en la que la formación de enlaces de péptidos o fosfodiéster en esta secuencia se evita en el primer lugar (por ejemplo, mediante el autoprocesamiento de cotraducción como se describió anteriormente).
Se entiende que los sitios de escisión comprenden normalmente varios aminoácidos o están codificados por varios codones (por ejemplo, en aquellos casos en los que el “sitio de escisión” no se traduce en proteína sino que conduce a una interrupción de la traducción). Por tanto, el sitio de escisión también puede servir para el propósito de un ligador de péptido, es decir, separa estéricamente dos péptidos. Por tanto, en algunas realizaciones, un “sitio de escisión” es un ligador de péptido y proporciona la función de escisión descrita anteriormente. En esta realización, el sitio de escisión puede abarcar aminoácidos de terminal N y/o C adicionales.
El término “célula anfitriona”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una célula que alberga un vector (por ejemplo, un plásmido o virus). Dicha célula anfitriona puede ser una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana) o eucariota (por ejemplo, una célula fúngica, vegetal o animal).
“Farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos.
El término “portador”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva tal como, pero sin limitarse a, un diluyente, excipiente o portado con el que se administra el ingrediente terapéuticamente activo. Dichos vehículos portadores pueden ser líquidos o sólidos. El portador líquido incluye, pero no se limita a, líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, que incluyen aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Una solución salina es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa o intranasal mediante un nebulizador.
Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares.
Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados en “Remington's Pharmaceutical Sciences” de E.W. Martin.
El término “composición” pretende incluir la formulación del compuesto activo con material encapsulante como portador que proporciona una cápsula en la que el componente activo, con o sin otros portadores, está rodeado por un portador, que, por tanto, está asociado con este.
El término “adyuvante” se refiere a agentes que aumentan, estimulan, activan, potencian o modulan la respuesta inmunitaria al ingrediente activo de la composición a nivel celular o humoral, por ejemplo, los adyuvantes inmunológicos estimulan la respuesta del sistema inmunitario al antígeno real, pero no tienen ningún efecto inmunológico por sí mismos. Ejemplos de dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes inorgánicos (por ejemplo, sales metálicas inorgánicas tales como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), adyuvantes orgánicos (por ejemplo, saponinas o escualeno), adyuvantes a base de aceite (por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), citocinas (por ejemplo, IL-1p, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS e INF-y) adyuvantes en partículas (por ejemplo, complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), liposomas o microesferas biodegradables), virosomas, adyuvantes bacterianos (por ejemplo, monofosforil lípido A o péptidos de muramilo), adyuvantes sintéticos (por ejemplo, copolímeros de bloques no iónicos, análogos de péptidos de muramilo o lípido A sintético) o adyuvantes de polinucleótidos sintéticos (por ejemplo, poliarginina o polilisina).
El término “ ingrediente activo” se refiere a la sustancia en una composición o formulación farmacéutica que es biológicamente activa, es decir, que proporciona valor farmacéutico. Una composición farmacéutica puede comprender uno o más ingredientes activos que pueden actuar junto o independientemente entre sí.
El ingrediente activo se puede formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo libres tales como, pero no limitado a, aquellas derivadas de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, un “paciente” significa cualquier mamífero, reptil o ave que se puede beneficiar de un tratamiento con una vacuna contra el tumor descrito en la presente memoria. Preferentemente, un “paciente” se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (que incluyen, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga, tortuga, serpiente o lagarto) o primates, que incluyen chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Es particularmente preferente que el “paciente” sea un ser humano.
Como se utiliza en la presente memoria, “tratar”, “que trata” o “tratamiento” de una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de los siguientes: (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos de los trastornos que se tratan; (c) inhibir el empeoramiento de los síntomas característicos del trastorno o trastornos que se están tratando; (d) limitar o prevenir la recurrencia del (de los) trastorno(s) en pacientes que han tenido previamente el (los) trastorno(s); y (e) limitar o prevenir la recurrencia de los síntomas en pacientes que previamente presentaban síntomas del (de los) trastorno(s).
Como se utiliza en la presente memoria, “prevenir”, “que previene”, “prevención” o “profilaxis” de una enfermedad o trastorno significa prevenir que dicha enfermedad o trastorno se produzca en el paciente.
Como se utiliza en la presente memoria, “administrar” incluye la administración in vivo, así como la administración directamente al tejido ex vivo, tal como injertos de venas.
Una “cantidad eficaz” es una cantidad de un agente terapéutico suficiente para lograr el propósito pretendido. La cantidad eficaz de un agente terapéutico dado variará con factores tales como la naturaleza del agente, la ruta de administración, el tamaño y la especie del animal que recibirá el agente terapéutico y el propósito de la administración. La cantidad eficaz en cada caso individual puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica de acuerdo con procedimientos establecidos en la técnica.
Realizaciones de la invención
La presente invención se describirá ahora con más detalle. En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto así definido se puede combinar con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa se puede combinar con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
En un primer aspecto la invención proporciona una composición que comprende un sistema de expresión que comprende un vector viral de adenovirus que comprende polinucleótidos que codifican proteínas de pneumovirus, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el sistema de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, un segundo polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta de células B antipatogénica, y un tercer polinucleótido que codifica una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, en la que:
el pneumovirus es virus sincitial respiratorio humano (RSV);
la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el primer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV seleccionada del grupo que consiste en proteínas de Matriz M y M2;
la proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, codificada por el segundo polinucleótido, es una proteína estructural y/o de superficie de RSV que es la proteína de fusión (F);
la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el tercer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV que es la nucleoproteína N; y
en el que el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína artificial.
Una de las ventajas proporcionadas por la presente invención es el hecho de que se puede potenciar la respuesta de células B a la proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, si al mismo tiempo se administra una proteína que induce una respuesta de células T.
En el contexto de la presente invención, el término “sistema de expresión” se refiere preferentemente a una o más secuencias de polinucleótidos que comprenden además del primer y segundo polinucleótidos los elementos para dirigir la transcripción y traducción de las proteínas codificadas por el primero y segundo y polinucleótido adicional, que se puede incluir en las realizaciones preferentes que se describen a continuación. Dichos elementos incluían elementos promotores y potenciadores para dirigir la transcripción de ARNm en un sistema sin células o en base a células, preferentemente un sistema en base a células. En otra realización, en la que los polinucleótidos se proporcionan como ARN traducibles, se prevé que el sistema de expresión comprenda aquellos elementos que son necesarios para la traducción y/o estabilización de ARN que codifican la proteína inductora de células T y células B, por ejemplo, cola poli-A, IRES, estructuras cap, etc.
De acuerdo con una realización preferente del primer aspecto, el primer polinucleótido codifica una proteína que induce una reacción del sistema inmunitario (es decir, respuesta inmunitaria) en un anfitrión que es mediado por células T. Una respuesta de células T implica la activación de linfocitos T específicos de antígeno tal como, pero no limitados a, células T citotóxicas (CTL), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM) y células T reguladoras (células Treg). Una respuesta de célula T contra una proteína se induce si los péptidos de la proteína se procesan dentro de la célula y se presentan a las células T sobre la superficie de la célula a través de la ruta MHC I o MHC II. Por tanto, en el contexto de la presente invención, esas proteínas o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta de células T que normalmente no están expuestas a, por ejemplo, proteínas no estructurales o internas o partes de proteínas estructurales o internas de un virus no accesible para células B.
El segundo polinucleótido codifica una proteína o péptido que induce una respuesta de células B antipatogénica. La respuesta de células AB es una respuesta inmunitaria en base a la activación de los linfocitos B, que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen, pero no se limitan a, células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1. Por tanto, en el contexto de la presente invención, aquellas proteínas patogénicas, por ejemplo, virales, o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta de células B que están expuestas sobre el exterior del virus, por ejemplo, proteínas estructurales o al menos aquellas partes de proteínas estructurales accesibles a células B en el exterior del patógeno (virus).
Como se divulga en la presente memoria, el primer y el segundo polinucleótidos están comprendidos en vectores separados o en el mismo vector. De acuerdo con lo anterior, el primer polinucleótido puede estar comprendido en un vector y el segundo polinucleótido puede estar comprendido en un segundo vector. Alternativa o adicionalmente, el primer y segundo polinucleótidos pueden estar comprendidos en el mismo vector. Es preferente que el primer y el segundo polinucleótidos estén comprendidos en el mismo vector. Es particularmente preferente que el primer y el segundo polinucleótido comprendidos en el mismo vector estén ligados de tal manera que se expresen como una poliproteína. Preferentemente, el primer y segundo polinucleótidos forman un marco de lectura abierto.
El primer y segundo polinucleótidos se expresan como una poliproteína artificial. En el contexto de la presente invención, el término “poliproteína artificial” se refiere una poliproteínas que no son de origen natural, por ejemplo, que se generan al utilizar técnicas de ADN recombinante. De acuerdo con lo anterior, las proteínas o péptidos codificados en esta poliproteína artificial se derivan preferentemente de patógenos cuyo genoma no codifica una poliproteína que comprende las proteínas o péptidos codificados por el primer y segundo polinucleótido (y el tercer polinucleótido) de la invención. El primer y segundo polinucleótidos se derivan de un virus que no codifica una poliproteína o una poliproteína en el que los respectivos polinucleótidos tienen un orden y/o secuencia diferente. Más preferentemente, el primer y segundo polinucleótidos se derivan de un virus que se selecciona del grupo que consiste en un virus de ADN, un virus de ARN de cadena sencilla (ARNcs(-)) de sentido negativo o un virus de ARN ambisentido. Más preferentemente, el virus se selecciona de virus de ARN de cadena sencilla negativa (ARNcs(-)). Aún más preferido, el virus se selecciona de virus de ARNcs(-) envueltos, más preferentemente del grupo que consiste en paramixovirus y ortomixovirus.
En el primer aspecto, la proteína que induce una respuesta de células T es una proteína no estructural y/o interna de un virus, y/o la proteína que induce una respuesta de células B antipatogénica es una proteína estructural y/o interna de un virus. o proteína de superficie de un virus seleccionado del grupo que consiste en un virus de ADN, un virus de ARN de cadena negativa o un virus de ARN ambisentido. Aún más preferido, el virus se selecciona de virus de ARN de cadena sencilla negativo (ARNcs(-)). Aún más preferido, el virus se selecciona de virus de ARNcs(-) envueltos, más preferentemente del grupo que consiste en paramixovirus y ortomixovirus.
Es preferente que la secuencia de aminoácidos de la proteína estructural (superficie) y/o no estructural (interna) comprenda segmentos consecutivos o una secuencia consenso de uno o más aislados de virus diferentes.
En el contexto de la presente invención es preferente que el término “segmento” se refiera a una parte de una proteína o poliproteína. Es particularmente preferente que dicho segmento se pliegue y funcione independientemente del resto de la proteína o poliproteína tal como pero no limitado a un dominio, un epítopo o un fragmento del mismo. Se entiende que una variante de proteína en el contexto de la presente invención difiere en comparación con su polipéptido original en cambios en la secuencia de aminoácidos tal como intercambios de aminoácidos, inserciones, supresiones, truncamientos de terminal N, o truncamientos de terminal C, o cualquier combinación de estos cambios, que pueden ocurrir en uno o varios sitios por lo cual la variante exhibe al menos 80 % de identidad de secuencia con su polipéptido original.
En realizaciones preferentes, la proteína o péptido estructural es una proteína o péptido expuesta sobre la superficie del patógeno nativo, por ejemplo un virus. Es preferente que la proteína estructural y/o de superficie active una respuesta inmunitaria independiente de células T tal como pero no limitada a una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo o una activación del sistema completo. En una realización particularmente preferente, la proteína estructural y/o de superficie induce una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo. Dicha respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo se basa en la activación de células B que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen pero no se limitan a células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1.
De acuerdo con una realización preferente del primer aspecto, el segundo polinucleótido codifica una proteína que induce una respuesta antipatogénica de células B. Una respuesta de células B es una respuesta inmunitaria en base a la activación de linfocitos B, que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen pero no se limitan a células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1. De esta manera, en el contexto de la presente invención preferentemente aquellas proteínas o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta de células B que se exponen sobre el exterior de un virus, por ejemplo proteínas estructurales y/o de superficie o al menos aquellas partes de proteínas estructurales y/o de superficie accesibles a células B sobre el exterior de un virus. Una respuesta antipatogénica de células B es una respuesta de células B dirigidas contra un patógeno que inactiva, elimina, bloquea y/o neutraliza el patógeno respectivo de tal manera que la enfermedad provocada por el patógeno no brota y/o se alivian los síntomas. En las realizaciones preferentes de la invención, la respuesta de células B antipatogénica se efectúa mediante anticuerpos que se unen a la superficie de un organismo patogénico y atraen el primer componente de la cascada del complemento con su región Fc e inician la activación del sistema del complemento “clásico”. Esto da como resultado la eliminación de patógenos mediante dos mecanismos. Primero, la unión del anticuerpo y las moléculas del complemento marca al patógeno para ingestión por los fagocitos en un proceso llamado opsonización. En segundo lugar, algunos componentes del sistema del complemento forman un complejo de ataque a la membrana para ayudar a los anticuerpos a destruir el patógeno directamente. Alternativamente, la respuesta de células B antipatogénica se efectúa mediante anticuerpos que se unen a las proteínas estructurales del patógeno bloqueando la adhesión a los receptores celulares. De esta forma, el anticuerpo puede neutralizar la infección. Como alternativa adicional, la respuesta de células B antipatogénica se efectúa mediante anticuerpos que se unen a una región especializada de la proteína de superficie del patógeno, el péptido de fusión, que es necesaria para la entrada del patógeno en la célula anfitriona. La unión del anticuerpo da como resultado la fijación de la proteína en un estado previo a la fusión y el bloqueo de la infección. El experto en la materia puede determinar la capacidad de una proteína o variante para inducir la respuesta de células B que es antipatogénica al aplicar pruebas y/o ensayos bien conocidos en la técnica.
En una realización preferente adicional, un dominio de adhesión a la membrana de la proteína expuesta en la superficie del virus nativo o una variante del mismo se suprime funcionalmente, por lo tanto, se suprime estructuralmente o está presente estructuralmente pero no cumple su función biológica. En una realización particularmente preferente, se suprime la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio de adhesión a la membrana. La supresión de la región de unión a la membrana sirve para determinar que la proteína que induce la respuesta de células B anti­ patógenas se secreta desde la célula en la que se ha introducido el sistema de expresión de la invención.
En una realización preferente adicional, la proteína que induce respuesta de células B anti-patógenas comprende una señal de secreción, que dirige la proteína al retículo endoplasmático (ER). Dichas señales de secreción están presentes preferentemente en el contexto de un dominio de adhesión a la membrana suprimido. El experto en la materia conoce bien diversas señales de secreción de este tipo, que se pueden utilizar como señales de secreción heterólogas, por ejemplo, agregadas al terminal N de la proteína inductora de respuesta de células B antipatogénicas. Alternativa o adicionalmente, se puede utilizar una señal de secreción de origen natural, que está, por ejemplo, presente en la mayoría de las proteínas virales estructurales y/o superficiales. Por tanto, si está presente de forma natural en la proteína respectiva, es preferente que la señal de secreción se mantenga en una versión modificada de la proteína estructural y/o de superficie.
En las realizaciones del primer aspecto, la proteína no estructural es una proteína interna conservada adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el patógeno, preferentemente los virus, que implica la activación de linfocitos T específicos de antígenos tales como, pero no limitados a, Células T citotóxicas (CTL), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM) y células T reguladoras (células Treg). Por tanto, preferentemente la proteína inductora de células T del patógeno (virus) no comprende una señal de secreción.
En el contexto de la presente invención, la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el primer polinucleótido se ubica ya sea en el terminal N o C con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido. En una realización preferente, la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el primer polinucleótido.
De acuerdo con lo anterior, las realizaciones de la presente invención tienen la fórmula X-Y o Y-X, en la que “X” representa la proteína que induce respuesta de células T y “Y” representa la proteína que induce respuesta antipatogénica de células B y un “guión” representa un enlace de péptido.
En realizaciones preferentes del primer aspecto, un polinucleótido que codifica un sitio de escisión se posiciona entre el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido. Está dentro del alcance de la presente invención que cada proteína se pueda combinar con cualquier otra proteína y que cualesquier dos proteínas se 'puedan o no conectar o ligar por un sitio de escisión.
Es preferente que este sitio de escisión sea un sitio de autoescisión (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir sin que dicha escisión involucre cualquier molécula adicional o en la que se evite la formación del enlace de péptido en esta secuencia en el primer lugar) o un sitio de escisión de endopeptidasa (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir mediante una endopeptidasa, por ejemplo tripsina, pepsina, elastasa, trombina, colagenasa, furina, termolisina, endopeptidasa V8, catepsinas). Más preferentemente, el sitio de autoescisión es un sitio de escisión 2A seleccionado del grupo que consiste en un péptido 2A viral o péptido similar a 2A de Picornavirus, virus de insectos, Aphtoviridae, Rotaviruses y Trypanosoma, preferentemente en el que el sitio de escisión 2A es el péptido 2 A del virus de la fiebre aftosa. Alternativa o adicionalmente, la poliproteína de la presente invención se puede escindir mediante una autoproteasa, es decir una proteasa que escinde los enlaces de péptidos en la misma molécula de proteína que también comprende la proteasa. Ejemplos de dichas autoproteasas son la proteasa NS2 de flavivirus o la proteasa VP4 de birnavirus.
En el contexto de la presente invención, el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal N con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el primer polinucleótido y en el terminal C con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido. Alternativamente el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal C con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el primer polinucleótido y en el terminal N con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido.
De acuerdo con lo anterior, las realizaciones de la presente invención tienen la fórmula X-C-Y o Y-C-X, en la que X” representa la proteína que induce respuesta de células T y “Y” representa la proteína que induce respuesta antipatogénica de células B, “C” representa un sitio de escisión, y un “guión” representa un enlace de péptido.
En el primer aspecto, el sistema de expresión comprende adicionalmente un tercer polinucleótido que codifica una proteína o péptido de un patógeno.
La proteína, péptido o variante del mismo codificado por el tercer polinucleótido es una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, preferentemente el tercer polinucleótido es una proteína o péptido que es una proteína o péptido no estructural o interno que induce una respuesta de células T.
Es preferente que la proteína o péptido codificado por el tercer polinucleótido difiera de la proteína o péptido codificado por el primer polinucleótido o el segundo polinucleótido. Preferentemente, las proteínas, péptidos codificados por el primer, Segundo y el tercer polinucleótido difieran entre sí en que comprenden secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas.
En las realizaciones preferentes un polinucleótido que codifica un ligadorse posiciona entre el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido. Es preferente que el ligador sea un ligador flexible, preferentemente un ligador flexible que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly).
El tercer polinucleótido está comprendido en el mismo vector que el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido.
Es particularmente preferente que el primer y el segundo y el tercer polinucleótido que comprenden el mismo vector se liguen de tal manera que se expresen como una poliproteína. Preferentemente, el primer y el segundo y el tercer polinucleótido comprendidos en el mismo vector forman un marco de lectura abierto y, preferentemente, se expresan como una poliproteína.
En las realizaciones preferentes de este aspecto, la proteína codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional, o la proteína codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional.
En incluso realizaciones más preferentes de este aspecto, el primer polinucleótido se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el segundo polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido o se ubica entre la proteína codificada por el segundo polinucleótido y la proteína codificada por el primer polinucleótido; o la proteína codificada por el primer polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el segundo polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido o se ubica entre la proteína codificada por el segundo polinucleótido y la proteína codificada por el primer polinucleótido.
Las realizaciones preferentes de la presente invención tienen la fórmula X-K-Y, Y-K-X, X-K-Y-Y, Y-Y-K-X, X-Y-K-Y, Y-K-Y-X, X-K-Y-K-Y, Y-K-Y-K-X, X-C-Y, Y-C-X, X-C-Y-Y, Y-Y-C-X, X-Y-C-Y, Y-C-Y-X, X-C-Y-C-Y, Y-C-Y-C-X, X-K-YC-Y, Y-C-Y-K-X, X-C-Y-K-Y, o Y-K-Y-C-X, en la que “X” representa el segundo polinucleótido que codifica al menos una proteína, péptido o variante del mismo, que induce una respuesta de células B antipatogénica y “Y” representa el primer polinucleótido que codifica al menos una proteína, péptido o variante del mismo, que induce una respuesta de células T , “K” indica que uno o más ligadores de péptido están presentes en esta posición, “C” indica que uno o más sitios de escisión están presentes en esta posición y un “guión” representa un enlace de péptido. Las disposiciones preferentes son Y-K-Y-C-X o X-C-Y-K-Y.
Es adicionalmente preferente que la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido sea una proteína interna conservada adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el virus que implica la activación de linfocito T específico de antígenotal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg).
Está dentro del alcance de la presente invención que cada proteína se pueda combinar con cualquier otra proteína y que cualesquier dos proteínas se puedan o no conectar o ligar mediante ya sea un sitio de escisión o un ligador de péptido.
Como se divulga en la presente memoria un vector o vectores que comprenden el primer, y el segundo y/o el tercer polinucleótido se selecciona/n del grupo que consiste en plásmido, cósmido, fago, virus, y cromosoma artificial. Más preferentemente, un vector adecuado para practicar la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en vectores de plásmido, vectores de cósmido, vectores de fago, preferentemente vectores de fago lambda y fago filamentoso, vectores virales. De acuerdo con la presente invención el vector es un vector de adenovirus (por ejemplo, vectores Ad5 no replicable, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd 73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, y PanAd3 o vectores Ad4 y Ad7 con capacidad de replicación). También se divulgan vectores de virus adenoasociados (AAV) (por ejemplo, AAV tipo 5 y tipo 2), vectores de alfavirus (por ejemplo, virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus sindbis (SIN), virus del bosque semliki (SFV), y quimeras VEE-SIN), vectores de virus del herpes (por ejemplo vectores derivados de citomegalovirus, como citomegalovirus rhesus (RhCMV) (14)), vectores de virus arena (por ejemplo vectores del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (15)), vectores del virus del sarampión, vectores de virus de viruela (por ejemplo, virus vaccinia, virus vaccinia Ankara modificada (MVA), NYVAC (derivado de la cepa de Copenhague de vaccinia), y vectores de avipox: vectores de viruela del canario (ALVAC) y viruela aviar (FPV)), vectores de virus de la estomatitis vesicular, retrovirus, lentivirus, partículas como virus, y esporas bacterianas. Los vectores ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se describen en detalle en el documento WO 2005/071093. Los vectores PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, y ChAd147 se describen en detalle en el documento WO 2010/086189. Es particularmente preferente que el vector se seleccione del grupo que consiste en MVA, ChAd63 y PanAd3.
En realizaciones preferentes, el sistema de expresión es para su uso en medicina. En realizaciones más preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección, en la que la infección es preferentemente una infección viral, particularmente preferentemente para su uso en la profilaxis o tratamiento de un patógeno y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de un patógeno y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de un patógeno, en el que el patógeno preferentemente es un virus. Preferentemente, el sistema de expresión es para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección mediante un virus y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de un virus y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de un virus, en el que el patógeno se selecciona del grupo de un virus de ADN, un virus de ARN de cadena sencilla negativo (ARNcs (-)) o un virus de ARN ambisentido. Es adicionalmente preferente que el sistema de expresión sea para su uso en la profilaxis o tratamiento y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de un virus y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección mediante virus de ARN de cadena sencilla de sentido negativo (ARNcs (-)). Incluso más preferente, el sistema de expresión es para su uso en la profilaxis o tratamiento y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de un virus y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección mediante un virus seleccionado de virus (ARNcs(-) envuelto, más preferentemente del grupo que consiste en paramixovirus y ortomixovirus.
En las realizaciones preferentes el sistema de expresión es para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria. En realizaciones más preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria de célula B contra un inmunógeno, preferentemente un patógeno, más preferentemente un virus como se definió anteriormente.
De acuerdo con el primer aspecto de la divulgación, el primer polinucleótido codifica una proteína viral de un paramixovirus o variante del mismo que induce una reacción del sistema inmunitario (es decir respuesta inmunitaria) en un anfitrión que es mediada por células T, y el segundo polinucleótido codifica una proteína viral de un paramixovirus o variante del mismo que induce una respuesta antipatogénica de células B contra paramixovirus - el paramixovirus cuyas proteínas virales se codifican por el primer y segundo polinucleótido seleccionado de la subfamilia de Pneumovirinae, el grupo que consiste en Pneumovirus, específicamente virus sincitial respiratorio humano (RSV).
El primer y el segundo polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector y se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína. Preferentemente, el primer y el segundo polinucleótido forman un marco de lectura abierto.
De acuerdo con el primer aspecto el primer polinucleótido codifica una proteína viral de un paramixovirus o variante del mismo que induce una reacción del sistema inmunitario (es decir respuesta inmunitaria) en un anfitrión que es mediada por células T. Una respuesta de células T implica la activación de linfocito T específico de antígeno tal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg). Se induce una respuesta de células T contra una proteína, si se procesan los péptidos de la proteína dentro de la célula y se presentan a células T sobre la superficie de la célula a través de la ruta MHC I o MHC II. De esta manera, en el contexto de la presente invención preferentemente aquellas proteínas virales o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta de células T que normalmente no se exponen sobre el exterior del virus, por ejemplo proteínas no estructurales o internas o partes de proteínas estructurales o de superficie no accesibles a células B sobre el exterior del virus.
El segundo polinucleótido codifica una proteína viral de un paramixovirus o variante del mismo que induce una respuesta de células B antipatogénica contra el paramixovirus. Una respuesta de células B es una respuesta inmunitaria en base a la activación de linfocitos B, que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen pero no se limitan a células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1. De esta manera, en el contexto de la presente invención preferentemente aquellas proteínas virales o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta antipatogénica de células B que se exponen sobre el exterior del virus, por ejemplo proteínas estructurales o al menos aquellas partes de proteínas estructurales accesibles a células B sobre el exterior del virus.
De acuerdo con el primer aspecto, el segundo polinucleótido codifica una proteína viral de un paramixovirus o variante del mismo que induce una respuesta antipatogénica de células B. Una respuesta de células B es una respuesta inmunitaria en base a la activación de linfocitos B, que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen pero no se limitan a células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1. De esta manera, en el contexto de la presente invención preferentemente aquellas proteínas virales o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta antipatogénica de células B que se exponen sobre el exterior del virus, por ejemplo proteínas estructurales y/o de superficie o al menos aquellas partes de proteínas estructurales y/o de superficie accesibles a células B sobre el exterior del virus.
En el primer aspecto la proteína viral de un paramixovirus, que induce una respuesta de células T es una proteína no estructural y/o interna de un paramixovirus, y/o la proteína viral de un paramixovirus, que induce una respuesta antipatogénica de células B es una proteína estructural y/o de superficie de un paramixovirus.
Es preferente que la secuencia de aminoácidos de la proteína estructural (superficial) y/o no estructural (interna) comprenda segmentos consecutivos o una secuencia de consenso de uno o más aislados de paramixovirus diferentes.
En realizaciones preferentes, la proteína estructural es una proteína expuesta sobre la superficie del paramixovirus nativo o una variante del mismo. Es preferente que la proteína estructural active una respuesta inmunitaria independiente de células T tal como pero no limitada a una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo o una activación del sistema completo. En una realización particularmente preferente, la proteína estructural y/o de superficie induce una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo. Dicha respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo se basa en la activación de células B que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen pero no se limitan a células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1.
En una realización preferente adicional, el dominio de adhesión a la membrana de la proteína expuesta sobre la superficie del paramixovirus nativo o una variante del mismo se suprime funcionalmente, por lo tanto, se suprime estructuralmente o está presente estructuralmente pero no cumple su función biológica. En una realización particularmente preferente, se suprime la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio de adhesión a la membrana. La supresión de la región de adhesión a la membrana sirve para el propósito de determinar que la proteína que induce la respuesta de células B anti-patógenas se secreta desde la célula en la que se ha introducido el sistema de expresión de la invención.
En una realización preferente adicional, la proteína paramixovirus que induce la respuesta de células B anti-patógenas comprende una señal de secreción, que dirige la proteína al retículo endoplasmático (ER). Por tanto, si está presente de forma natural en la proteína estructural o de superficie respectiva, es preferente que la señal de secreción se mantenga en una versión modificada de la proteína estructural o de superficie.
Es adicionalmente preferente que la proteína estructural y/o de superficie del paramixovirus nativo se selecciona del grupo que consiste en proteína de fusión (F) y cualquiera de las glicoproteínas de adhesión G, H, y HN.
Las glicoproteínas de adhesión se encuentran en todos los virus envueltos y median en la interacción inicial entre la envoltura viral y la membrana plasmática de la célula anfitriona a través de su unión a fracciones de carbohidratos o dominios de adhesión celular de proteínas u otras moléculas en la membrana plasmática de la célula anfitriona. De ese modo, las glicoproteínas de adhesión cierran la brecha entre el virus y la membrana de la célula anfitriona. Las glicoproteínas de adhesión designadas como “H” poseen actividad de hemaglutinina y se encuentran en morbilivirus y henipavirus, las glicoproteínas designadas como “HN poseen actividades de hemaglutinina y neuraminidasa y se encuentran en respirovirus, rubulavirus y avulavirus. Las glicoproteínas de adhesión se designan como “G” cuando no tienen ninguna de actividad de hemaglutinación ni neuraminidasa Las glicoproteínas de adhesión G se pueden encontrar en todos los miembros de Pneumovirinae.
La proteína de fusión “F” se encuentra en todos los virus con envoltura y media la fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática de la célula anfitriona. F es una glicoproteína de tipo I que reconoce los receptores presentes sobre la superficie celular de la célula anfitriona a la que se une. F consiste en un péptido de fusión adyacente al cual se localizan los dominios transmembrana, seguido de dos regiones de repetición heptada (HR), HR1 y HR2, respectivamente. Tras la inserción del péptido de fusión en la membrana plasmática de la célula anfitriona, la región HR1 forma una estructura helicoidal en espiral trimérica en cuyos surcos hidrófobos se pliegan las regiones HR2. De este modo, se forma una estructura en horquilla que acerca aún más la bicapa lipídica viral y la membrana plasmática celular y permite la formación de un poro de fusión y, consecutivamente, la fusión completa de ambas bicapas lipídicas que permiten que la cápside viral entre en el citoplasma de la célula anfitriona. Todas estas características son comunes en proteínas mediadoras de fusión de virus envueltos.
En una realización preferente del primer aspecto, F comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de F de un aislado de RSV o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes aislados de RSV, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, más preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma.
En realizaciones preferentes del primer aspecto, la proteína no estructural es una proteína interna conservada de paramixovirus adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el paramixovirus, que implica la activación de linfocito T específico de antígeno tal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg). De esta manera, preferentemente la célula T que incluye la proteína del paramixovirus no comprende una señal de secreción.
Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna se selecciona del grupo que consiste en nucleoproteína N, proteínas de Matriz M y M2, Fosfoproteína P, proteínas no estructurales NS1 y NS2, y la subunidad catalítica de la polimerasa (L).
La nucleoproteína N tiene varias funciones que incluyen la encapsidación del genoma de ARN en una nucleocápside resistente a ARNasa. N también interactúa con la proteína M durante el ensamble del virus e interactúa con la P-L polimerasa durante la transcripción y replicación del genoma.
La proteína de matriz M es la proteína más abundante en paramixovirus y se considera que es el organizador central de la morfología viral al interactuar con la cola citoplasmática de las proteínas de membrana integrales y la nucleocápside. M2 es una segunda proteína asociada a la membrana que no está glicosilada y se encuentra principalmente en pneumovirus.
La fosfoproteína P se une a las proteínas N y L y forma parte del complejo de polimerasa de ARN en todos los paramixovirus. La proteína L grande es la subunidad catalítica de la polimerasa de ARN dependiente de ARN.
La función de las proteínas no estructurales NS1 y NS2 aún no se ha identificado; sin embargo, hay indicios de que están involucrados en el ciclo de replicación viral.
En realizaciones preferentes, N comprende una secuencia de aminoácidos de N, de un aislado de RSV o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes aislados de RSV, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 y en la que M2 comprende una secuencia de aminoácidos de M2 de un aislado de RSV o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes aislados de RSV, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. Es adicionalmente preferente que N comprenda la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y M2 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.
En el contexto de la presente invención, la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido se ubica ya sea en el terminal N o C con respecto a la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. En una realización preferente, la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido.
En una realización más preferida N o M2 se ubicaron en el terminal C de F. En una realización particularmente preferente N se ubica en el terminal C de F.
También se divulga la fórmula X-Y o Y-X, en la que “X” representa F, G, H, o HN y “Y” representa N, M, M2, P, NS1, NS2, o Ly un “guión” representa un enlace de péptido. Las disposiciones divulgadas son las siguientes:: F-N, G-N, H-N, HN-N, F-M, G-M, H-M, HN-M, F-M2, G-M2, H-M2, HN-M2, F-P, G-P, H-P, HN-P, F-NS1, G-NS1, HNS1, HN-NS1, F-NS2, G-NS2, H-NS2, HN-NS2, F-L, G-L, H-L, HN-L, N-F, N-G, N-H, N-HN, M-F, M-G, M-H, M-HN, M2-F, M2-G, M2-H, M2-HN, P-F, P-G, P-H, P-HN, NS1-FF, NS1-G, NS1-H, NS1-HN, NS2-F, NS2-G, NS2-H, NS2-HN, L-F, L-G, L-H, o L-HN.
En realizaciones preferentes del primer aspecto, un polinucleótido que codifica un sitio de escisión se posiciona entre el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido.
Es preferente que este sitio de escisión es ya sea un sitio de autoescisión (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir sin que dicha escisión involucre cualquier molécula adicional o en la que se evita la formación del enlace de péptido en esta secuencia en el primer lugar) o un sitio de escisión de endopeptidasa (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir mediante una endopeptidasa, por ejemplo tripsina, pepsina, elastasa, trombina, colagenasa, furina, termolisina, endopeptidasa V8, catepsinas). Más preferentemente, el sitio de autoescisión es un sitio de escisión 2A seleccionado del grupo que consiste en un péptido 2A viral o péptido similar a 2A de Picornavirus, virus de insectos, Aphtoviridae, Rotaviruses y Trypanosoma, preferentemente en el que el sitio de escisión 2A es el péptido 2 A del virus de la fiebre aftosa.
En el contexto de la presente invención, el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal N con respecto a la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido y en el terminal C con respecto a la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. Alternativamente el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal C con respecto a la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido y en el terminal N con respecto a la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. Es particularmente preferente que el sitio de escisión se ubique en el terminal N con respecto a N y en el terminal C con respecto a F.
Se divulga la fórmula X-C-Y o Y-C-X, en la que “X” representa F, G, H, o HN y “Y” representa N, M, M2, P, NS1, NS2, o L, “C” representa un sitio de escisión, y un “guión” representa un enlace de péptido. Las disposiciones divulgadas son las siguientes:: F-C-N, G-C-N, H-C-N, HN-C-N, F-C-M, G-C-M, H-C-M, HN-C-M, F-C-M2, G-C-M2, H-C-M2, HN-C-M2, F-C-P, G-C-P, H-C-P, HN-C-P, F-C-NS1, G-C-NS1, H-C-NS1, HN-C-NS1, F-C-NS2, G-C-NS2, H-C-NS2, HN-C-NS2, F-C-L, G-C-L, H-C-L, HN-C-L, N-C-F, N-C-G, N-C-H, N-C-HN, M-C-F, M-C-G, M-C-H, M-C-HN, M2-C-F, M2-C-G, M2-C-H, M2-C-HN, P-C-F, P-C-G, P-C-H, P-C-HN, NS1-C-FF, NS1-C-G, NS1-C-H, NS1-C-HN, NS2-C-F, NS2-C-G, NS2-C-H, NS2-C-HN, L-C-F, L-C-G, L-C-H, o L-C-HN. Particularmente, es preferente F-C-N.
El sistema de expresión de la presente invención comprende adicionalmente un tercer polinucleótido que codifica una proteína interna y/o no estructural de un paramixovirus o una variante del mismo. Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna es de un paramixovirus, Pneumovirinae, Pneumovirus, específicamente virus sincitial respiratorio humano (RSV).
El primer y el segundo y el tercer polinucleótido comprendidos sobre el mismo vector se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína viral. Preferentemente, el primer y el segundo y el tercer polinucleótido comprendidos sobre el mismo vector forman un marco de lectura abierto.
Es adicionalmente preferente que la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido sea una proteína interna conservada adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el virus que implica la activación de linfocito T específico de antígeno tal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg).
Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna se selecciona del grupo que consiste en nucleoproteína N, proteínas de Matriz M y M2, Fosfoproteína P, proteínas no estructurales NS1 y NS2, y la subunidad catalítica de la polimerasa (L).
En realizaciones preferentes, N comprende una secuencia de aminoácidos de N, de un aislado de RSV o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes aislados de RSV, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 y en la que M2 comprende una secuencia de aminoácidos de M2 de un aislado de RSV o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes aislados de RSV, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. Es adicionalmente preferente que N comprenda la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y M2 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.
Es preferente que la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido difiera de la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido.
Las proteínas internas y/o no estructurales codificadas por el segundo y el tercer polinucleótido difieren entre si en que comprenden secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas virales. Por ejemplo, esto significa que la proteína interna y/o no estructural codificada por el segundo polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína N mientras que la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína M2 o viceversa.
La proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido se puede ubicar ya sea en el terminal N o C de la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. En una realización preferente del primer aspecto, la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido se ubica en el terminal C de la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. Más específicamente, N o M2 se puede ubicar el terminal N o C de N o M2, preferentemente N se ubica en el terminal C de M2.
En las realizaciones preferentes un polinucleótido que codifica un ligadorse posiciona entre el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido. Es preferente que el ligador sea un ligador flexible, preferentemente un ligador flexible que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.
En las realizaciones del primer aspecto, la proteína codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional, o la proteína codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional.
En incluso realizaciones más preferentes de este aspecto, el primer polinucleótido se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el segundo polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido o se ubica entre la proteína codificada por el segundo polinucleótido y la proteína codificada por el primer polinucleótido; o la proteína codificada por el primer polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el segundo polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido o se ubica entre la proteína codificada por el segundo polinucleótido y la proteína codificada por el primer polinucleótido. En una realización preferente F se ubica en el terminal N con respecto a N y M2 se ubica en el terminal C con respecto a N.
Se divulgan la fórmula X-K-Y, Y-K-X, X-K-Y-Y, Y-Y-K-X, X-Y-K-Y, Y-K-Y-X, X-K-Y-K-Y, Y-K-Y-K-X, X-C-Y, YC- X, X-C-Y-Y, Y-Y-C-X, X-Y-C-Y, Y-C-Y-X, X-C-Y-C-Y, Y-C-Y-C-X, X-K-Y-C-Y, Y-C-Y-K-X, X-C-Y-K-Y, o Y-K-Y-C-X, en la que “X” representa F, G, H, o HN y “Y” representa N, M, M2, P, NS1, NS2, o L, “K” indica que uno o más ligadores de péptido están presentes en esta posición, “C” indica que uno o más sitios de escisión están presentes en esta posición y un “guión” representa un enlace de péptido. Las disposiciones preferentes son X-C-Y-K-Y. Las disposiciones divulgadas son las siguientes:: F-K-N, G-K-N, H-K-N, HN-K-N, F-K-M, G-K-M, H-K-M, HN-K-M, F-K-M2, G-K-M2, H-K-M2, HN-K-M2, F-K-P, G-K-P, HK-P, HN-K-P, F-K-NS1, G-K-NS1, H-K-NS1, HN-K-NS1, F-K-NS2, G-K-NS2, H-K-NS2, HN-K-NS2, F-K-L, G-K-L, H-KL, HN-K-L, N-K-F, N-K-G, N-K-H, N-K-HN, M-K-F, M-K-G, M-K-H, M-K-HN, M2-K-F, M2-K-G, M2-K-H, M2-K-HN, P-KF, P-K-G, P-K-H, P-K-HN, NS1-K-FF, NS1-K-G, NS1-K-H, NS1-K-HN, NS2-K-F, NS2-K-G, NS2-K-H, NS2-K-HN, L-KF, L-K-G, L-K-H, L-K-HN, F-C-N, G-C-N, H-C-N, HN-C-N, F-C-M, G-C-M, H-C-M, HN-C-M, F-CM2, G-C-M2, H-C-M2, HN-C-M2, F-C-P, G-C-P, H-C-P, HN-C-P, F-C-NS1, G-C-NS1, H-C-NS1, HN-C-NS1, F-C-NS2, G-C-NS2, H-C-NS2, HN-C-NS2, F-C-L, G-C-L, H-C-L, HN-C-L, N-C-F, N-C-G, N-C-H, N-C-HN, M-C-F, M-C-G, M-C-H, M-C-HN, M2-C-F, M2-C-G, M2-C-H, M2-C-HN, P-C-F, P-C-G, P-C-H, P-C-HN, NS1-C-FF, NS1-C-G, NS1-C-H, NS1-C-HN, NS2-C-F, NS2-C-G, NS2-C-H, NS2-C-HN, L-C-F, L-C-G, L-C-H, o L-C-HN, F-N-M, G-N-M, H-N-M, HN-N-M, F-N-M2, G-N-M2, H-N-M2, HN-N-M2, F-N-P, G-N-P, H-N-P, HN-N-P, F-N-NS1, G-N-NS1, H-N-NS1, HN-N-NS1, F-N-NS2, G-N-NS2, HN- NS2, HN-N-NS2, F-N-L, G-N-L, H-N-L, HN-N-L, F-M-N, G-M-N, H-M-N, HN-M-N, F-M P, G-M-P, H-M-P, HN-M-P, FM- NS1, G-M-NS1, H-M-NS1, HN-M-NS1, F-M-NS2, G-M-NS2, H-M-NS2, HN-M-NS2, F-M-L, G-M-L, H-M-L, HN-M-L, F-M2-N, G-M2-N, H-M2-N, HN-M2-N, F-M2-P, G-M2-P, H-M2-P, HN-M2-P, F-M2-NS1, G-M2-NS1, H-M2-NS1, HN-M2- NS1, F-M2-NS2, G-M2-NS2, H-M2-NS2, HN-M2-NS2, F-M2-L, G-M2-L, H-M2-L, HN-M2-L, F-P-N, G-P-N, H-P-N, HNP- N, F-P-M, G-P-M, H-P-M, HN-P-M, F-P-M2, G-P-M2, H-P-M2, HN-P-M2, F-P-NS1, G-P-NS1, H-P-NS1, HN-P-NS1, F-P-NS2, G-P-NS2, H-P-NS2, HN-P-NS2, F-P-L, G-P-L, H-P-L, HN-P-L, F-NS1-N, G-NS1-N, H-NS1-N, HN-NS1-N, FNS1- M, G-NS1-M, H-NS1-M, HN-NS1-M, F-NS1-M2, G-NS1-M2, H-NS1-M2, HN-NS1-M2, F-NS1-P, G-NS1-P, H-NS1- P, HN-NS1-P, F-NS1-NS2, G-NS1-NS2, H-NS1-NS2, HN-NS1-NS2, F-NS1-L, G-NS1-L, H-NS1-L, HN-NS1-L, F-NS2- N, G-NS2-N, H-NS2-N, HN-NS2-N, F-NS2-M, G-NS2-M, H-NS2-M, HN-NS2-M, F-NS2-M2, G-NS2-M2, H-NS2-M2, HNNS2- M2, F-NS2-P, G-NS2-P, H-NS2-P, HN-NS2-P, F-NS2-NS1, G-NS2-NS1, H-NS2-NS1, HN-NS2-NS1, F-NS2-L, GNS2- L, H-NS2-L, HN-NS2-L, F-L-N, G-L-N, H-L-N, HN-L-N, F-L-M2, G-L-M2, H-L-M2, HN-L-M2, F-L-P, G-L-P, H-L-P, HN-L-P, F-L-NS1, G-L-NS1, H-L-NS1, HN-L-NS1, F-L-NS2, G-L-NS2, H-L-NS2, HN-L-NS2, M-N-F, M-N-G, M-N-H, MN- HN, M2-N-F, M2-N-G, M2-N-H, M2-N-HN, P-N-F, P-N-G, P-N-H, P-N-HN, NS1-N-F, NS1-N-G, NS1-N-H, NS1-N-HN, NS2-N-F, NS2-N-G, NS2-N-H, NS2-N-HN, L-N-F, L-N-G, L-N-H, L-N-HN, N-M-F, N-M-G, N-M-H, N-M-HN, P-M-F, PM-G, P-M-H, P-M-HN, NS1-M-F, NS1-M-G, NS1-M-H, NS1-M-HN, NS2-M-F, NS2-M-G, NS2-M-H, NS2-M-HN, L-M-F, L-M-G, L-M-H, L-M-HN, N-M2-F, N-M2-G, N-M2-H, N-M2-HN, P-M2-F, P-M2-G, P-M2-H, P-M2-HN, NS1-M2-F, NS1-M2-G, NS1-M2-H, NS1-M2-HN, NS2-M2-F, NS2-M2-G, NS2-M2-H, NS2-M2-HN, L-M2-F, L-M2-G, L-M2-H, L-M2-HN, N-P-F, N-P-G, N-P-H, N-P-HN, M-P-F, M-P-G, M-P-H, M-P-HN, M2-P-F, M2-P-G, M2-P-H, M2-P-HN, NS1-P-F, NS1- P-G, NS1-P-H, NS1-P-HN, NS2-P-F, NS2-P-G, NS2-P-H, NS2-P-HN, L-P-F, L-P-G, L-P-H, L-P-HN, N-NS1-F, N-NS1- G, N-NS1-H, N-NS1-HN, M-NS1-F, M-NS1-G, M-NS1-H, M-NS1-HN, M2-NS1-F, M2-NS1-G, M2-NS1-H, M2-NS1-HN, P-NS1-F, P-NS1-G, P-NS1-H, P-NS1-HN, NS2-NS1-F, NS2-NS1-G, NS2-NS1-H, NS2-NS1-HN, L-NS1-F, L-NS1-G, LNS1- H, L-NS1-HN, N-NS2-F, N-NS2-G, N-NS2-H, N-NS2-HN, M-NS2-F, M-NS2-G, M-NS2-H, M-NS2-HN, M2-NS2-F, M2-NS2-G, M2-NS2-H, M2-NS2-HN, P-NS2-F, P-NS2-G, P-NS2-H, P-NS2-HN, NS1-NS2-F, NS1-NS2-G, NS1-NS2- H, NS1-NS2-HN, L-NS2-F, L-NS2-G, L-NS2-H, L-NS2-HN, N-L-F, N-L-G, N-L-H, N-L-HN, M-L-F, M-L-G, M-L-H, M-LHN, M2-L-F, M2-L-G, M2-L-H, M2-L-HN, P-L-F, P-L-G, P-L-H, P-L-HN, NS1-L-F, NS1-L-G, NS1-L-H, NS1-L-HN, NS2- L-F, NS2-L-G, NS2-L-H, NS2-L-HN, F-K-N-N, G-K-N-N, H-K-N-N, HN-K-N-N, F-K-N-M, G-K-N-M, H-K-N-M, HN-K-NM, F-K-N-M2, G-K-N-M2, H-K-N-M2, HN-K-N-M2, F-K-N-P, G-K-N-P, H-K-N-P, HN-K-N-P, F-K-N-NS1, G-K-N-NS1, HK- N-NS1, HN-K-N-NS1, F-K-N-NS2, G-K-N-NS2, H-K-N-NS2, HN-K-N-NS2, F-K-N-L, G-K-N-L, H-K-N-L, HN-K-N-L, FC- N-N, G-C-N-N, H-C-N-N, HN-C-N-N, F-C-N-M, G-C-N-M, H-C-N-M, HN-C-N-M, F-C-N-M2, G-C-N-M2, H-C-N-M2, HN-C-N-M2, F-C-N-P, G-C-N-P, H-C-N-P, HN-C-N-P, F-C-N-NS1, G-C-N-NS1, H-C-N-NS1, HN-C-N-NS1, F-C-N-NS2, G-C-N-NS2, H-C-N-NS2, HN-C-N-NS2, F-C-N-L, G-C-N-L, H-C-N-L, HN-C-N-L, F-K-M-M, G-K-M-M, H-K-M-M, HN-KM- M, F-K-M-M2, G-K-M-M2, H-K-M-M2, HN-K-M-M2, F-K-M-N, G-K-M-N, H-K-M-N, HN-K-M-N, F-K-M-P, G-K-M-P, HK- M-P, HN-K-M-P, F-K-M-NS1, G-K-M-NS1, H-K-M-NS1, HN-K-M-NS1, F-K-M-NS2, G-K-M-NS2, H-K-M-NS2, HN-KM- NS2, F-K-M-L, G-K-M-L, H-K-M-L, HN-K-M-L, F-K-M2-M, G-K-M2-M, H-K-M2-M, HN-K-M2-M, F-K-M2-N, G-K-M2- N, H-K-M2-N, HN-K-M2-N, F-K-M2-P, G-K-M2-P, H-K-M2-P, HN-K-M2-P, F-K-M2-NS1, G-K-M2-NS1, H-K-M2-NS1, HN-K-M2-NS1, F-K-M2-NS2, G-K-M2-NS2, H-K-M2-NS2, HN-K-M2-NS2, F-K-M2-L, G-K-M2-L, H-K-M2-L, HN-K-M2- L, F-K-P-N, G-K-P-N, H-K-P-N, HN-K-P-N, F-K-P-M, G-K-P-M, H-K-P-M, HN-K-P-M, F-K-P-M2, G-K-P-M2, H-K-P-M2, HN-K-P-M2, F-K-P-P, G-K-P-P, H-K-P-P, HN-K-P-P, F-K-P-NS1, G-K-P-NS1, H-K-P-NS1, HN-K-P-NS1, F-K-P-NS2, G-K-P-NS2, H-K-P-NS2, HN-K-P-NS2, F-K-P-L, G-K-P-L, H-K-P-L, HN-K-P-L, F-K-NS1-N, G-K-NS1-N, H-K-NS1-N, HN-K-NS1-N, F-K-NS1-M, G-K-NS1-M, H-K-NS1-M, HN-K-NS1-M, F-K-NS1-M2, G-K-NS1-M2, H-K-NS1-M2, HN-KNS1-M2, F-K-NS1-P, G-K-NS1-P, H-K-NS1-P, HN-K-NS1-P, F-K-NS1-NS1, G-K-NS1-NS1, H-K-NS1-NS1, HN-K-NS1- NS1, F-K-NS1-NS2, G-K-NS1-NS2, H-K-NS1-NS2, HN-K-NS1-NS2, F-K-NS1-L, G-K-NS1-L, H-K-NS1-L, HN-K-NS1- L, F-K-NS2-N, G-K-NS2-N, H-K-NS2-N, HN-K-NS2-N, F-K-NS2-M, G-K-NS2-M, H-K-NS2-M, HN-K-NS2-M, F-K-NS2- M2, G-K-NS2-M2, H-K-NS2-M2, HN-K-NS2-M2, F-K-NS2-P, G-K-NS2-P, H-K-NS2-P, HN-K-NS2-P, F-K-NS2-NS1, GK- NS2-NS1, H-K-NS2-NS1, HN-K-NS2-NS1, F-K-NS2-NS2, G-K-NS2-NS2, H-K-NS2-NS2, HN-K-NS2-NS2, F-K-NS2- L, G-K-NS2-L, H-K-NS2-L, HN-K-NS2-L, F-K-L-N, G-K-L-N, H-K-L-N, HN-K-L-N, F-K-L-M, G-K-L-M, H-K-L-M, HN-K-LM, F-K-L-M2, G-K-L-M2, H-K-L-M2, HN-K-L-M2, F-K-L-P, G-K-L-P, H-K-L-P, HN-K-L-P, F-K-L-NS1, G-K-L-NS1, H-KL- NS1, HN-K-L-NS1, F-K-L-NS2, G-K-L-NS2, H-K-L-NS2, 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M2-C-NS1-HN, P-C-NS1- F, P-C-NS1-G, P-C-NS1-H, P-C-NS1-HN, NS1-C-NS1-F, NS1-C-NS1-G, NS1-C-NS1-H, NS1-C-NS1-HN, NS2-C-NS1- F, NS2-C-NS1-G, NS2-C-NS1-H, NS2-C-NS1-HN, L-C-NS1-F, L-C-NS1-G, L-C-NS1-H, L-C-NS1-HN, N-C-NS2-F, NC- NS2-G, N-C-NS2-H, N-C-NS2-HN, M-C-NS2-F, M-C-NS2-G, M-C-NS2-H, M-C-NS2-HN, M2-C-NS2-F, M2-C-NS2- G, M2-C-NS2-H, M2-C-NS2-HN, P-C-NS2-F, P-C-NS2-G, P-C-NS2-H, P-C-NS2-HN, NS1-C-NS2-F, NS1-C-NS2-G, NS1-C-NS2-H, NS1-C-NS2-HN, NS2-C-NS2-F, NS2-C-NS2-G, NS2-C-NS2-H, NS2-C-NS2-HN, L-C-NS2-F, L-C-NS2- G, L-C-NS2-H, L-C-NS2-HN, N-C-L-F, N-C-L-G, N-C-L-H, N-C-L-HN, M-C-L-F, M-C-L-G, M-C-L2-H, M-C-L-HN, M2-CL- F, M2-C-L-G, M2-C-L-H, M2-C-L-HN, P-C-L-F, P-C-L-G, P-C-L-H, P-C-L-HN, NS1-C-L-F, NS1-C-L-G, NS1-C-L-H, NS1-C-L-HN, NS2-C-L-F, NS2-C-L-G, NS2-C-L-H, NS2-C-L-HN, L-C-L-F, L-C-L-G, L-C-L-H, L-C-L-HN, N-N-C-F, N-NC- G, N-N-C-H, N-N-C-HN, N-M-C-F, N-M-C-G, N-M-C-H, N-M-C-HN, N-M2-C-F, N-M2-C-G, N-M2-C-H, N-M2-C-HN, N-P-C-F, N-P-C-G, N-P-C-H, N-P-C-HN, N-NS1-C-F, N-NS1-C-G, N-NS1-C-H, N-NS1-C-HN, N-NS2-C-F, N-NS2-C-G, N-NS2-C-H, N-NS2-C-HN, N-L-C-F, N-L-C-G, N-L-C-H, N-L-C-HN, M-N-C-F, M-N-C-G, M-N-C-H, M-N-C-HN, M-M-CF, M-M-C-G, M-M-C-H, M-M-C-HN, M-M2-C-F, M-M2-C-G, M-M2-C-H, M-M2-C-HN, M-P-C-F, M-P-C-G, M-P-C-H, MP- C-HN, M-NS1-C-F, M-NS1-C-G, M-NS1-C-H, M-NS1-C-HN, M-NS2-C-F, M-NS2-C-G, M-NS2-C-H, M-NS2-C-HN, M-L-C-F, M-L-C-G, M-L-C-H, M-L-C-HN, M2-N-C-F, M2-N-C-G, M2-N-C-H, M2-N-C-HN, M2-M-C-F, M2-M-C-G, M2-MC- H, M2-M-C-HN, M2-M2-C-F, M2-M2-C-G, M2-M2-C-H, M2-M2-C-HN, M2-P-C-F, M2-P-C-G, M2-P-C-H, M2-P-C-HN, M2-NS1-C-F, M2-NS1-C-G, M2-NS1-C-H, M2-NS1-C-HN, M2-NS2-C-F, M2-NS2-C-G, M2-NS2-C-H, M2-NS2-C-HN, M2-L-C-F, M2-L-C-G, M2-L-C-H, M2-L-C-HN, P-N-C-F, P-N-C-G, P-N-C-H, P-N-C-HN, P-M-C-F, P-M-C-G, P-M-C-H, P-M-C-HN, P-M2-C-F, P-M2-C-G, P-M2-C-H, P-M2-C-HN, P-P-C-F, P-P-C-G, P-P-C-H, P-P-C-HN, P-NS1-C-F, P-NS1-C-G, P-NS1-C-H, P-NS1-C-HN, P-NS2-C-F, P-NS2-C-G, P-NS2-C-H, P-NS2-C-HN, P-L-C-F, P-L-C-G, P-L-C-H, P-LC-HN, NS1-N-C-F, NS1-N-C-G, NS1-N-C-H, NS1-N-C-HN, NS1-M-C-F, NS1-M-C-G, NS1-M-C-H, NS1-M-C-HN, NS1-M2-C-F, NS1-M2-C-G, NS1-M2-C-H, NS1-M2-C-HN, NS1-P-C-F, NS1-P-C-G, NS1-P-C-H, NS1-P-C-HN, NS1-NS1-CF, NS1-NS1-C-G, NS1-NS1-C-H, NS1-NS1-C-HN, NS1-NS2-C-F, NS1-NS2-C-G, NS1-NS2-C-H, NS1-NS2-C-HN, NS1- L-C-F, NS1-L-C-G, NS1-L-C-H, NS1-L-C-HN, NS2-N-C-F, NS2-N-C-G, NS2-N-C-H, NS2-N-C-HN, NS2-M-C-F, NS2- M-C-G, NS2-M-C-H, NS2-M-C-HN, NS2-M2-C-F, NS2-M2-C-G, NS2-M2-C-H, NS2-M2-C-HN, NS2-P-C-F, NS2-P-CG, NS2-P-C-H, NS2-P-C-HN, NS2-NS1-C-F, NS2-NS1-C-G, NS2-NS1-C-H, NS2-NS1-C-HN, NS2-NS2-C-F, NS2-NS2- C-G, NS2-NS2-C-H, NS2-NS2-C-HN, NS2-L-C-F, NS2-L-C-G, NS2-L-C-H, NS2-L-C-HN, L-N-C-F, L-N-C-G, L-N-C-H, L-N-C-HN, L-M-C-F, L-M-C-G, L-M-C-H, L-M-C-HN, L-M2-C-F, L-M2-C-G, L-M2-C-H, L-M2-C-HN, L-L-C-F, L-P-C-G, L-P-C-H, L-P-C-HN, L-NS1-C-F, L-NS1-C-G, L-NS1-C-H, L-NS1-C-HN, L-NS2-C-F, L-NS2-C-G, L-NS2-C-H, L-NS2-CHN, L-L-C-F, L-L-C-G, L-L-C-H, L-L-C-HN, N-C-N-K-F, N-C-N-K-G, N-C-N-K-H, N-C-N-K-HN, N-C-M-K-F, N-C-M-K-G, N-C-M-K-H, N-C-M-K-HN, N-C-M2-K-F, N-C-M2-K-G, N-C-M2-K-H, N-C-M2-K-HN, N-C-P-K-F, N-C-P-K-G, N-C-P-KH, N-C-P-K-HN, N-C-NS1-K-F, N-C-NS1-KG, N-C-NS1-K-H, N-C-NS1-K-HN, N-C-NS2-K-F, N-C-NS2-K-G, N-C-NS2-K-H, N-C-NS2-K-HN, N-C-L-K-F, N-C-L-K-G, N-C-L-K-H, N-C-L-K-HN, M-C-N-K-F, M-C-N-K-G, M-C-N-K-H, M-C-N-KHN, M-C-M-K-F, M-C-M-K-G, M-C-M-K-H, M-C-M-K-HN, M-C-M2-K-F, M-C-M2-K-G, M-C-M2-K-H, M-C-M2-K-HN, MC- P-K-F, M-C-P-K-G, M-C-P-K-H, M-C-P-K-HN, M-C-NS1-K-F, M-C-NS1-K-G, M-C-NS1-K-H, M-C-NS1-K-HN, M-CNS2- K-F, M-C-NS2-K-G, M-C-NS2-K-H, M-C-NS2-K-HN, M-C-L-K-F, M-C-L-K-G, M-C-L-K-H, M-C-L-K-HN, M2-C-NK- F, M2-C-N-K-G, M2-C-N-K-H, M2-C-N-K-HN, M2-C-M-K-F, M2-C-M-K-G, M2-C-M-K-H, M2-C-M-K-HN, M2-C-M2-KF, M2-C-M2-K-G, M2-C-M2-K-H, M2-C-M2-K-HN, M2-C-P-K-F, M2-C-P-K-G, M2-C-P-K-H, M2-C-P-K-HN, M2-C-NS1- K-F, M2-C-NS1-K-G, M2-C-NS1-K-H, M2-C-NS1-K-HN, M2-C-NS2-K-F, M2-C-NS2-K-G, M2-C-NS2-K-H, M2-C-NS2- K-HN, M2-C-L-K-F, M2-C-L-K-G, M2-C-L-K-H, M2-C-L-K-HN, P-C-N-K-F, P-C-N-K-G, P-C-N-K-H, P-C-N-K-HN, P-CM- K-F, P-C-M-K-G, P-C-M-K-H, P-C-M-K-HN, P-C-M2-K-F, P-C-M2-K-G, P-C-M2-K-H, P-C-M2-K-HN, P-C-P-K-F, PC- P-K-G, P-C-P-K-H, P-C-P-K-HN, P-C-NS1-K-F, P-C-NS1-K-G, P-C-NS1-K-H, P-C-NS1-K-HN, P-C-NS2-K-F, P-CNS2- K-G, P-C-NS2-K-H, P-C-NS2-K-HN, P-C-L-K-F, P-C-L-K-G, P-C-L-K-H, P-C-L-K-HN, NS1-C-N-K-F, NS1-C-N-KG, NS1-C-N-K-H, NS1-C-N-K-HN, NS1-C-M-K-F, NS1-C-M-K-G, NS1-C-M-K-H, NS1-C-M-K-HN, NS1-C-M2-K-F, NS1-C-M2-K-G, NS1-C-M2-K-H, NS1-C-M2-K-HN, NS1-C-P-K-F, NS1-C-P-K-G, NS1-C-P-K-H, NS1-C-P-K-HN, NS1-CNS1- K-F, NS1-C-NS1-K-G, NS1-C-NS1-K-H, NS1-C-NS1-K-HN, NS1-C-NS2-K-F, NS1-C-NS2-K-G, NS1-C-NS2-K-H, NS1-C-NS2-K-HN, NS1-C-L-K-F, NS1-C-L-K-G, NS1-C-L-K-H, NS1-C-L-K-HN, NS2-C-N-K-F, NS2-C-N-K-G, NS2-CN- K-H, NS2-C-N-K-HN, NS2-C-M-K-F, NS2-C-M-K-G, NS2-C-M-K-H, NS2-C-M-K-HN, NS2-C-M2-K-F, NS2-C-M2-KG, NS2-C-M2-K-H, NS2-C-M2-K-HN, NS2-C-P-K-F, NS2-C-P-K-G, NS2-C-P-K-H, NS2-C-P-K-HN, NS2-C-NS1-K-F, NS2-C-NS1-K-G, NS2-C-NS1-K-H, NS2-C-NS1-K-HN, NS2-C-NS2-K-F, NS2-C-NS2-K-G, NS2-C-NS2-K-H, NS2-CNS2- K-HN, NS2-C-L-K-F, NS2-C-L-K-G, NS2-C-L-K-H, NS2-C-L-K-HN, L-C-N-K-F, L-C-N-K-G, L-C-N-K-H, L-C-N-KHN, L-C-M-K-F, L-C-M-K-G, L-C-M-K-H, L-C-M-K-HN, L-C-M2-K-F, L-C-M2-K-G, L-C-M2-K-H, L-C-M2-K-HN, L-C-PK- F, L-C-P-K-G, L-C-P-K-H, L-C-P-K-HN, L-C-NS1-K-F, L-C-NS1-K-G, L-C-NS1-K-H, L-C-NS1-K-HN, L-C-NS2-K-F, LC- NS2-K-G, L-C-NS2-K-H, L-C-NS2-K-HN, L-C-L-K-F, L-C-L-K-G, L-C-L-K-H, o L-C-L-K-HN. Más preferentemente la disposición es F-C-N-K-M2.
En realizaciones preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección viral, particularmente preferentemente para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por paramixovirus, preferentemente una infección de RSV y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por paramixovirus, preferentemente una infección de RSV, y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección por paramixovirus, preferentemente una infección de RSV.
En realizaciones preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta inmunitaria de célula B contra una infección por paramixovirus, preferentemente una infección de RSV.
Divulgación adicional que no forma parte de la invención reivindicada
De acuerdo con el primer aspecto de esta divulgación adicional, el primer polinucleótido codifica una proteína viral de un ortomixovirus o variante del mismo que induce una reacción del sistema inmunitario (es decir respuesta inmunitaria) en un anfitrión que es mediado por células T, y el segundo polinucleótido codifica una proteína viral de un ortomixovirus o variante del mismo que induce una respuesta antipatogénica de células B contra el ortomixovirus. Es preferente que el ortomixovirus cuyas proteínas virales se codifican por el primer y segundo polinucleótido se selecciona del género de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Thogotovirus e Isavirus. En incluso realizaciones más preferentes, el ortomixovirus es virus de la Influenza A, preferentemente seleccionado de los subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7. De acuerdo con una realización preferente del primer aspecto, el segundo polinucleótido codifica una proteína viral de un ortomixovirus o variante del mismo que induce una respuesta antipatogénica de células B contra el ortomixovirus.
De acuerdo con realizaciones preferentes del primer aspecto el primer polinucleótido codifica una proteína viral de un ortomixovirus o variante del mismo que induce una reacción del sistema inmunitario (es decir respuesta inmunitaria) en un anfitrión que es mediado por células T. Una respuesta de células T implica la activación de linfocito T específico de antígeno tal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg). Se induce una respuesta de células T contra una proteína, si se procesan los péptidos de la proteína dentro de la célula y se presentan a células T sobre la superficie de la célula a través de la ruta MHC I o MHC II. De esta manera, en el contexto de la presente divulgación preferentemente aquellas proteínas virales o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta de células T que normalmente no se exponen sobre el exterior del virus, por ejemplo proteínas no estructurales o internas o partes de proteínas estructurales o de superficie no accesibles a células B sobre el exterior del virus.
De acuerdo con una realización preferente del primer aspecto, el segundo polinucleótido codifica una proteína viral de un ortomixovirus o variante del mismo que induce una respuesta antipatogénica de células B. Una respuesta de células B es una respuesta inmunitaria en base a la activación de linfocitos B, que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen pero no se limitan a células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1. De esta manera, en el contexto de la presente divulgación preferentemente aquellas proteínas virales o partes de las mismas se utilizan para inducir una respuesta de células B que se exponen sobre el exterior del virus, por ejemplo proteínas estructurales y/o de superficie o al menos aquellas partes de proteínas estructurales y/o de superficie accesibles a células B sobre el exterior del virus.
En una realización preferente del primer aspecto la proteína viral de un ortomixovirus, que induce una respuesta de células T es una proteína no estructural y/o interna de un ortomixovirus, y/o la proteína viral de un ortomixovirus, que induce una respuesta antipatogénica de células B es una proteína estructural y/o de superficie de un ortomixovirus.
Es preferente que la secuencia de aminoácidos de la proteína estructural (superficie) y/o no estructural y/o interna comprende segmentos consecutivos o una secuencia de consenso de uno o más diferentes aislados de ortomixovirus.
En realizaciones preferentes, la proteína estructural es una proteína expuesta sobre la superficie del ortomixovirus nativo o una variante del mismo. Es preferente que la proteína estructural y/o de superficie activa una respuesta inmunitaria independiente de células T tal como pero no limitado a una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo o una activación del sistema completo. En una realización particularmente preferente, la proteína estructural y/o de superficie induce una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo. Dicha respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo se basa en la activación de células B que producen y secretan anticuerpos específicos de antígeno. Las células B implicadas en dicha respuesta inmunitaria incluyen pero no se limitan a células B plasmáticas, células B de memoria y células B-1.
En una realización preferente adicional, se suprime funcionalmente el dominio de adhesión a la membrana de la proteína expuesta sobre la superficie del ortomixovirus nativo o variante del mismo, de esta manera, se suprime estructuralmente esté presente estructuralmente pero que no cumple su función biológica. En una realización particularmente preferente, se suprime la secuencia de aminoácidos que corresponde al dominio de adhesión a la membrana. La supresión de la región de adhesión de membrana tiene el propósito de determinar que la proteína que induce respuesta antipatogénica de células B se secreta de la célula en la que se ha introducido el sistema de expresión de la divulgación.
Es adicionalmente preferente que las proteínas de superficie virales del ortomixovirus nativo se selecciona del grupo que consiste en hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Es más preferente que la proteína de superficie viral d el ortomixovirus nativo es hemaglutinina (HA).
En una realización preferente del primer aspecto, HA comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de HA de un virus del aislado de influenza A o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes virus de los aislados de influenza A, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 20, más preferentemente de acuerdo con la SEQ ID No : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21 o una variante de una de estas secuencias.
En realizaciones preferentes del primer aspecto, la proteína no estructural es una proteína interna conservada de ortomixovirus adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el paramixovirus, que implica la activación de linfocito T específico de antígeno tal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg). De esta manera, preferentemente la célula T que incluye proteína del ortomixovirus no comprende una señal de secreción.
Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna se selecciona del grupo que consiste en nucleoproteína NP, proteínas de Matriz M1 y M2, proteínas no estructurales NS1 y NS2/NEP, y las polimerasas de ARN PA, PB1, PB2 y la proteína PB1-F2 (PB1F2).
La nucleoproteína NP es una proteína estructural que encapsida el ARN viral de cadena negativa. NP es uno de los principales determinantes de la especificidad de las especies.
La proteína M1 es una proteína de matriz del virus de influenza. Forma una capa dentro de la envoltura viral. La proteína M1 se une al ARN viral. También tiene múltiples funciones reguladoras, realizadas mediante la interacción con los componentes de la célula anfitriona. Los mecanismos regulados incluyen una función en la exportación de las ribonucleoproteínas virales del núcleo de la célula anfitriona, la inhibición de la transcripción viral y una función en el ensamble y gemación del virus. La proteína M1 forma una capa debajo de los parches de la membrana de la célula anfitriona que son ricos en hemaglutinina viral, neuraminidasa y proteínas transmembrana M2, y facilita la gemación de los virus maduros.
La proteína NS1 no estructural es creada por la proteína interna que codifica, ARN de cadena sencilla lineal de sentido negativo, segmento del gen NS y que también codifica la proteína de exportación nuclear o NEP, anteriormente conocida como la proteína NS2, que media la exportación de los vRNP. NS1 también se une a ARNcd. Como consecuencia de su unión al ARNcd, la proteína NS1 bloquea la activación de la proteína quinasa activada por ARNcd (PKR) in vitro. Esta quinasa fosforila la subunidad alfa del factor de inicio de la traducción eucariota 2 (elF-2 alfa), lo que conduce a una disminución en la velocidad de inicio de traducción. En ausencia de NS1, esta ruta se inhibe durante la respuesta antiviral para detener la traducción de todas las proteínas, deteniendo de esta manera la síntesis de proteínas virales; sin embargo, la proteína NS1 del virus de la influenza es un agente que elude las defensas del anfitrión para permitir que ocurra la transcripción del gen viral.
En realizaciones preferentes, HA comprende una secuencia de aminoácidos de HA de un virus del aislado de influenza A o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes virus de los aislados de influenza A, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 21, NP comprende una secuencia de aminoácidos de NP de un virus del aislado de influenza A o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes virus de los aislados de influenza A, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, y/o M1 comprende una secuencia de aminoácidos de M1 de un virus del aislado de influenza A o una secuencia consenso de aminoácidos de dos o más diferentes virus de los aislados de influenza A, preferentemente de acuerdo con la SEQ ID NO: 12. Es adicionalmente preferente que cuando NP comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 y M1 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12.
En el contexto de la presente divulgación, la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido se ubica ya sea en el terminal N o C con respecto a la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. En una realización preferente, la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido.
Más específicamente, HA o NA pueden ubicar el terminal N o C de NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2). En una realización preferente M1 se ubica en el terminal N de HA.
De acuerdo con lo anterior, las realizaciones de la presente divulgación tienen la fórmula X-Y o Y-X, en la que “X” representa HA o NA, preferentemente HA, y “Y” representa NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2), preferentemente NP o M1, y un “guión” representa un enlace de péptido. Las disposiciones preferentes son las siguientes: HA-NP, HA-M1, HA-M2, HA-NS1, HA-NS2/NEP, HA-PA, HA-PB1, HA-PB2, HA-PB1F2, NP-HA, M1-HA, M2-HA, NS1- HA, NS2/NEP-HA, PA-HA, PB1-HA, PB2-HA, PB1F2-HA, NA-NP, NA-M1, NA-M2, NA-NS1, NA-NS2/NEP, NA-PA, NAPB1, NA-PB2, NA-PB1F2, NP-NA, M1-NA, M2-NA, NS1-NA, NS2/NEP-NA, PA-NA, PB1-NA, PB2-NA o PB1F2-NA. Una disposición particularmente preferente es M1-HA.
Está dentro del alcance de la presente divulgación que cada proteína se pueda combinar con cualquier otra proteína.
En realizaciones preferentes del primer aspecto, un polinucleótido que codifica un sitio de escisión se posiciona entre el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido.
Es preferente que este sitio de escisión sea ya sea un sitio de autoescisión (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir sin que dicha escisión involucre cualquier molécula adicional o en el que se evite la formación del enlace de péptido en esta secuencia en el primer lugar) o un sitio de escisión de endopeptidasa (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir mediante una endopeptidasa, por ejemplo tripsina, pepsina, elastasa, trombina, colagenasa, furina, termolisina, endopeptidasa V8, catepsinas). Más preferentemente, el sitio de autoescisión es un sitio de escisión 2A seleccionado del grupo que consiste en un péptido 2A viral o péptido similar a 2A de Picornavirus, virus de insectos, Aphtoviridae, Rotaviruses y Trypanosoma, preferentemente en el que el sitio de escisión 2A es el péptido 2 A del virus de la fiebre aftosa. Alternativa o adicionalmente, la poliproteína de la presente divulgación se puede escindir mediante una autoproteasa, es decir una proteasa que escinde enlaces de péptidos en la misma molécula de proteína que también comprende la proteasa. Ejemplos de dichas autoproteasas son la proteasa N2 de flavivirus o la proteasa VP4 de birnavirus.
En el contexto de la presente divulgación, el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal N con respecto a la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido y en el terminal C con respecto a la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. Alternativamente el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal C con respecto a la proteína estructural y/o de superficie codificada por el primer polinucleótido y en el terminal N con respecto a la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. Más específicamente, el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal C o N con respecto a HA o NA y en el terminal C o N con respecto a NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2). En una realización preferente el sitio de escisión se ubica en el terminal C con respecto a NP M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2) y en el terminal N con respecto a HA o NA. Es particularmente preferente que el sitio de escisión se ubique en el terminal N con respecto a HA y en el terminal C con respecto a M1.
De acuerdo con lo anterior, las realizaciones de la presente divulgación tienen la fórmula X-C-Y o Y-C-X, en la que “X” representa HA o NA, preferentemente, HA y “Y” representa NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2), preferentemente NP o M1, “C” representa un sitio de escisión, y un “guión” representa un enlace de péptido.
Las disposiciones preferentes son las siguientes: HA-C-NP, HA-C-M1, HA-C-M2, HA-C-NS1, HA-C-NS2/NEP, HA-C-PA, HA-C-PB1, HA-C-PB2, HA-C-PB1F2, NP-CHA, M1-C-HA, M2-C-HA, NS1-C-HA, NS2/NEP-C-HA, PA-C-HA, PB1-C-HA, PB2-C-HA, PB1F2-C-HA, NA-C-NP, NAC- M1, NA-CM2, NA-C-NS1, NA-C-NS2/NEP, NA-C-PA, NA-C-PB1, NA-C-PB2, NA-C-PB1F2, NP-C-NA, M1-C-NA, M2- C-NA, NS1-C-NA, NS2/NEP-C-NA, PA-C-NA, PB1-C-NA, PB2-C-NA o PB1F2-C-NA. Una disposición particularmente preferente es M1-C-HA.
Está dentro del alcance de la presente divulgación que cada proteína se pueda combinar con cualquier otra proteína y que cualesquier dos proteínas se pueden o no conectar o ligar por un sitio de escisión.
En la realización preferente del primer aspecto, el sistema de expresión comprende adicionalmente un tercer polinucleótido que codifica una proteína no estructural y/o interna de un ortomixovirus o una variante del mismo. Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna es de un ortomixovirus seleccionado del género de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Thogotovirus e Isavirus. En incluso realizaciones más preferentes, el ortomixovirus es virus de la Influenza A, preferentemente seleccionado del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7n 7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
En las realizaciones preferentes el tercer polinucleótido está comprendido sobre un vector separado o sobre el mismo vector como el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido.
De acuerdo con lo anterior, el primer polinucleótido está comprendido sobre un vector y el segundo polinucleótido está comprendido sobre un segundo vector y el tercer polinucleótido está comprendido sobre un tercer vector. Alternativa o adicionalmente, el primer y el segundo polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector y el tercer polinucleótido está comprendido sobre un vector separado, o el primer y el tercer polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector y el segundo polinucleótido está comprendido sobre un vector separado, o el segundo y el tercer polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector y el primer polinucleótido está comprendido sobre un vector separado. Alternativa o adicionalmente, el primer y el segundo y el tercer polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector. Es preferente que el primer y el segundo y el tercer polinucleótido puedan estar comprendidos sobre el mismo vector. Es particularmente preferente que el primer y el segundo y el tercer polinucleótido comprendidos sobre el mismo vector se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína viral. Preferentemente, el primer y el segundo y el tercer polinucleótido comprendidos sobre el mismo vector forman un marco de lectura abierto.
Es adicionalmente preferente que la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido sea una proteína interna conservada adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el virus que implica la activación de linfocito T específico de antígeno tal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg).
Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna se selecciona del grupo que consiste en NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2), más preferentemente NP o M1.
Es preferente que la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido difiera de la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido.
Las proteínas internas y/o no estructurales codificadas por el segundo y el tercer polinucleótido difieren entre si en que comprenden secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas virales. Por ejemplo, esto significa que la proteína interna y/o no estructural codificada por el segundo polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína M1 mientras que la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína NP o viceversa.
La proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido se puede ubicar ya sea en el terminal N o C de la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido. En una realización preferente del primer aspecto, la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido se ubica en el terminal C de la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido.
En las realizaciones preferentes un polinucleótido que codifica un ligador se posiciona entre el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido. Es preferente que el ligador sea un ligador flexible, preferentemente un ligador flexible que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.
En las realizaciones del primer aspecto, la proteína codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional, o la proteína codificada por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional.
En incluso realizaciones más preferentes de este aspecto, el primer polinucleótido se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el segundo polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional se ubica en el terminal N con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido o se ubica entre la proteína codificada por el segundo polinucleótido y la proteína codificada por el primer polinucleótido; o la proteína codificada por el primer polinucleótido se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el segundo polinucleótido y/o la proteína del tercer polinucleótido opcional se ubica en el terminal C con respecto a la proteína codificada por el primer polinucleótido o se ubica entre la proteína codificada por el segundo polinucleótido y la proteína codificada por el primer polinucleótido. Más específicamente, HA, o NA se ubicaron en el terminal C o N con respecto a NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2).
En una realización preferente HA se ubica en el terminal C con respecto a M1 y NP se ubica en el terminal N con respecto a M1.
De acuerdo con lo anterior, realizaciones preferentes de la presente divulgación tienen la fórmula X-K-Y, Y-K-X, X-K-Y-Y, Y-YK- X, X-Y-K-Y, Y-K-Y-X, X-K-Y-K-Y, Y-K-Y-K-X, X-C-Y, Y-C-X, X-C-Y-Y, Y-Y-C-X, X-Y-C-Y, Y-C-Y-X, X-C-Y-C-Y, Y-CY- C-X, X-K-Y-C-Y, Y-C-Y-K-X, X-C-Y-K-Y, o Y-K-Y-C-X, en la que “X” representa HA, o NA, preferentemente HA, y “Y” representa NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2), preferentemente NP o M1, “K” indica que uno o más ligadores de péptido están presentes en esta posición, “C” indica que uno o más sitios de escisión están presentes en esta posición y un “guión” representa un enlace de péptido. Las disposiciones preferentes son Y-K-Y-C-X. Incluso las disposiciones más preferentes son las siguientes: hA-K-NP, NP-K-HA, HA-K-NP-NP, NP-NP-K-HA, HA-NP-K-NP, NP-K-NP-HA, HA-K-NP-K-NP, NP-K-NP-K-HA, HA-CNP, NP-C-HA, HA-C-NP-NP, NP-NP-C-HA, HA-NP-C-NP, NP-C-NP-HA, HA-C-NP-C-NP, NP-C-NP-C-HA, HA-K-NPC- NP, NP-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-NP, NP-K-NP-C-HA, HA-K-NP-M1, HA-K-M1-NP, NP-M1-K-HA, M1-NP-K-HA, HANP- K-M1, HA-M1-K-NP, NP-K-M1-HA, M1-K-NP-HA, HA-K-NP-K-Ml, HA-K-M1-K-NP, NP-K-M1-K-HA, M1-K-NP-K-HA, HA-C-NP-M1, HA-C-M1-NP, NP-M1-C-HA, M1-NP-C-HA, HA-NP-C-M1, HA-M1-C-NP, NP-C-M1-HA, M1-C-NP-HA, HA-C-NP-C-M1, HA-C-M1-C-NP, NP-C-M1-C-HA, M1-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-M1, HA-K-M1-C-NP, NP-C-M1-K-HA, M1-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-M1, HA-CM1-K-NP, NP-K-M1-C-HA, M1-K-NP-C-HA, HA-K-NP-M2, HA-K-M2-NP, NPM2-K-HA, M2-NP-K-HA, HA-NP-K-M2, HA-M2-K-NP, NP-K-M2-HA, M2-K-NP-HA, HA-K-NP-K-M2, HA-K-M2-K-NP, NP-K-M2-K-HA, M2-K-NP-K-HA, HA-C-NP-M2, HA-CM2-NP, NP-M2-C-HA, M2-NP-C-HA, HA-NP-C-M2, HA-M2-C-NP, NP-C-M2-HA, M2-C-NP-HA, HA-C-NP-C-M2, HA-C-M2-C-NP, NP-C-M2-C-HA, M2-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-M2, HAK- M2-C-NP, NP-C-M2-K-HA, M2-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-M2, HA-CM2-K-NP, NP-K-M2-C-HA, M2-K-NP-C-HA, HAK- NP-NS1, HA-K-NS1-NP, NP-NS1-K-HA, NS1-NP-K-HA, HA-NP-K-NS1, HA-NS1-K-NP, NP-K-NS1-HA, NS1-K-NPHA, HA-K-NP-K-NS1, HA-K-NS1-K-NP, NP-K-NS1-K-HA, NS1-K-NP-K-HA, HA-C-NP-NS1, HA-C-NS1-NP, NP-NS1- C-HA, NS1-NP-C-HA, HA-NP-C-NS1, HA-NS1-C-NP, NP-C-NS1-HA, NS1-C-NP-HA, HA-C-NP-C-NS1, HA-C-NS1-CNP, NP-C-NS1-C-HA, NS1-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-NS1, HA-K-NS1-C-NP, NP-C-NS1-K-HA, NS1-C-NP-K-HA, HAC- NP-K-NS1, HA-C-NS1-K-NP, NP-K-NS1-C-HA, NS1-K-NP-C-HA, HA-K-NP-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-NP, NPNS2/ NEP-K-HA, NS2/NEP-NP-K-HA, HA-NP-K-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-K-NP, NP-K-NS2/NEP-HA, NS2/NEP-K-NPHA, HA-K-NP-K-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-K-NP, NP-K-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-K-NP-K-HA, HA-C-NP-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-NP, NP-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-NP-C-HA, HA-NP-C-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-C-NP, NP-CNS2/ NEP-HA, NS2/NEP-C-NP-HA, HA-C-NP-C-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-C-NP, NP-C-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEPC- NP-C-HA, HA-K-NP-C-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-C-NP, NP-C-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-C-NP-K-HA, HA-C-NPK- NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-K-NP, NP-K-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-K-NP-C-HA, HA-K-NP-PA, HA-K-PA-NP, NPPA- K-HA, PA-NP-K-HA, HA-NP-K-PA, HA-PA-K-NP, NP-K-PA-HA, PA-K-NP-HA, HA-K-NP-K-PA, HA-K-PA-K-NP, NPK- PA-K-HA, PA-K-NP-K-HA, HA-C-NP-PA, HA-C-PA-NP, NP-PA-C-HA, PA-NP-C-HA, HA-NP-C-PA, HA-PA-C-NP, NPC- PA-HA, PA-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PA, HA-C-PA-C-NP, NP-C-PA-C-HA, PA-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-PA, HA-K-PAC- NP, NP-C-PA-K-HA, PA-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PA, HA-C-PA-K-NP, NP-K-PA-C-HA, PA-K-NP-C-HA, HA-K-NPPB1, HA-K-PB1-NP, NP-PB1-K-HA, PB1-NP-K-HA, HA-NP-K-PB1, HA-PB1-K-NP, NP-K-PB1-HA, PB1-K-NP-HA, HAK- NP-K-PB1, HA-K-PB1-K-NP, NP-K-PB1-K-HA, PB1-K-NP-K-HA, HA-C-NP-PB1, HA-C-PB1-NP, NP-PB1-C-HA, PB1-NP-C-HA, HA-NP-C-PB1, HA-PB1-C-NP, NP-C-PB 1-HA, PB1-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PB1, HA-C-PB1-C-NP, NP-CPB1- C­ HA, PB1-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-PB1, HA-K-PB1-C-NP, NP-C-PB1-K-HA, PB1-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PB1, HA-C-PB1-K-NP, NP-K-PB1-C-HA, PB1-K-NP-C-HA, HA-K-NP-PB2, HA-K-PB2-NP, NP-PB2-K-HA, PB2-NP-K-HA, HA-NP-K-PB2, HA-PB2-K-NP, NP-K-PB2-HA, PB2-K-NP-HA, HA-K-NP-K-PB2, HA-K-PB2-K-NP, NP-K-PB2-K-HA, PB2-K-NP-K-HA, HA-C-NP-PB2, HA-C-PB2-NP, NP-PB2-C-HA, PB2-NP-C-HA, HA-NP-C-PB2, HA-PB2-C-NP, NP-CPB2-HA, PB2-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PB2, HA-C-PB2-C-NP, NP-C-PB2-C-HA, PB2-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-PB2, HAK-PB2-C-NP, NP-C-PB2-K-HA, PB2-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PB2, HA-C-PB2-K-NP, NP-K-PB2-C-HA, PB2-K-NP-CHA, HA-K-NP-PB1F2, HA-K-PB1F2-NP, NP-PB1F2-K-HA, PB1F2-NP-K-HA, HA-NP-K-PB1F2, HA-PB1F2-K-NP, NPK-PB1F2-HA, PB1F2-K-NP-HA, HA-K-NP-K-PB1F2, HA-K-PB1F2-K-NP, NP-K-PB1F2-K-HA, PB1F2-K-NP-K-HA, HAC-NP-PB1F2, HA-C-PB1F2-NP, NP-PB1F2-C-HA, PB1F2-NP-C-HA, HA-NP-C-PB1F2, HA-PB1F2-C-NP, NP-CPB1F2-HA, PB1F2-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PBIF2, HA-C-PB1F2-C-NP, NP-C-PB1F2-C-HA, PB1F2-C-NP-C-HA, HAK- NP-C-PB1F2, HA-K-PB1F2-C-NP, NP-C-PB1F2-K-HA, PB1F2-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PB1F2, HA-C-PB1F2-K-NP, NP-K-PB1F2-C-HA, PB1F2-K-NP-C-HA, HA-K-M1, Ml-K-HA, HA-K-M1-M1, M1-M1-K-HA, HA-M1-K-M1, M1-K-M1-HA, HA-K-M1-K-M1, M1-K-M1 -K-HA, HA-C-M1, M1-C-HA, HA-C-M1-M1, M1-M1-C-HA, HA-M1-C-M1, M1-C-M1-HA, HAEP 2 658573 B1 C-M1-C-M1, M1-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-M1, M1-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-M1, V11-K-V1-C-HA, HA-K-M 1-M2, HAK-M2-M1, M1-M2-K-HA, M2-M1-K-HA, HA-M1-K-M2, HAM2-K-M1, M1-K-M2-HA, M2-K-M1-HA, HA-K-M1 -K-M2, HAK-M2-K-M1, M1-K-M2-K-HA, M2-K-M1-K-HA, HA-C-M1-M2, HA-C-M2-M1, M1-M2-C-HA, M2-M1-C-HA, HA-M1-C-M2, HA-M2-C-M1, M1-C-M2-HA, M2-C-M1-HA, HA-C-M1-C-M2, HA-C-M2-C-M1, M1-C-M2-C-HA, M2-C-M1-C-HA, HA-KM1- C-M2, HA-K-M2-CM1, M1-C-M2-K-HA, M2-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-M2, HA-C-M2-K-M1, M1-K-M2-C-HA, M2-KM1-C-HA, HA-K-M1-NS1, HA-K-NS1-M1, M1-NS1-K-HA, NS1-M1-K-HA, HA-M1-K-NS1, HA-NS1-K-M1, M1-K-NS1- HA, NS1-K-M1-HA, HA-K-M 1-K-NS1, HA-K-NS1-K-M1, M1-K-NS1-K-HA, NS1-K-M1-K-HA, HA-C-M1 -NS1, HA-C-NS1-M1, M1-NS1-C-HA, NS1-M1-C-HA, HA-M1-C-NS1, HA-NS1-C-M1, M1-C-NS1-HA, NS1-C-M1-HA, HA-C-M1-C-NS1, HA-C-NS1-C-M1, M1-C-NS1-C-HA, NS1-CM1-C-HA, HA-K-M1-C-NS1, HA-K-NS1-C-M1, M1-C-NS1-K-HA, NS1-CM1- K-HA, HA-C-M1-K-NS1, HA-C-NS1-K-M1, M1-K-NS1-C-HA, NS1-K-M1-C-HA, HA-K-M1-NS2/NEP, HA-KNS2/ NEP-M1, M1-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-M1-K-HA, HA-M1-K-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-K-M1, M1-K-NS2/NEP-HA, NS2/NEP-K-M1 -HA, HA-K-M1-K-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-K-M1, M1-K-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-K-M1-K-HA, HAC-M1-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-M1, M1-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-M1 -C-HA, HA-M1-C-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-CM1, M1-C-NS2/NEP-HA, NS2/NEP-C-M1 -HA, HA-C-M1-C-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-C-M1, M1-C-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-CM1-C-HA, HA-K-M1-C-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-C-M1, M1-C-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-C-M1 -K-HA, HA-C-M1-K-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-K-M1, M1-K-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-K-M1-C-HA, HA-K-M1-PA, HA-K-PAM1, M1 -PA-K-HA, PA-M1-K-HA, HA-M1-K-PA, HA-PA-K-M1, M1-K-PA-HA, PA-K-M1 -HA, HA-K-M 1-K-PA, HA-K-PAK-M1, M1-K-PA-K-HA, PA-K-M1-K-HA, HA-C-M1-PA, HA-C-PA-M1, M1-PA-C-HA, PA-M1-C-HA, HA-M1-C-PA, HAPA-C-M1, M1-C-PA-HA, PA-CM1-HA, HA-C-M1-C-PA, HA-C-PA-C-M1, M-C-PA-C-HA, PA-C-M1-C-HA, HA-K-Ml-CPA, HA-K-PA-C-M1, M1-C-PA-K-HA, PA-C-M1 -K-HA, HA-C-M1 -K-PA, HA-C-PA-K-M1, M1-K-PA-C-HA, PA-K-M1-CHA, HA-K-M1-PB1, HA-K-PB1-M1, M1-PB1-K-HA, PB1-M1-K-HA, HA-M1-K-PB1, HA-PB1-K-M1, M1-K-PB1-HA, PB1- K-M1-HA, HA-K-M 1-K-PB1, HA-K-PB1-K-M1, M1-K-PB1-K-HA, PB1-K-M1-K-HA, HA-CM1-PB1, HA-C-PB1-M1, M1- PB1-C-HA, PB1-M1-C-HA, HA-M1-C-PB1, HA-PB1-CM1, M1-C-PB1-HA, PB1-C-M1-HA, HA-C-M1-C-PB1, HA-C-PB1- C-M1, M1-C-PB1-C-HA, PB1-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-PB1, HA-K-PB1-C-M1, M1-C-PB1-K-HA, PB1-CM1-K-HA, HAC- M1-K-PB1, HA-C-PB1-K-M1, M1-K-PB1-C-HA, PB1-K-M1-C-HA, HA-K-M1-PB2, HA-K-PB2-M1, M1-PB2-K-HA, PB2- M1-K-HA, HA-M1-K-PB2, HA-PB2-K-M1, M1-K-PB2-HA, PB2-K-M1-HA, HA-K-M1-K-PB2, HA-K-PB2-K-M1, M1-K-PB2- K-HA, PB2-K-M1-K-HA, HA-C-M1-PB2, HA-C-PB2-M1, M1-PB2-C-HA, PB2-M1-C-HA, HA-M1-C-PB2, HA-PB2-C-M1, M1-C-PB2-HA, PB2-C-M1-HA, HA-C-M1-C-PB2, HA-C-PB2-C-M1, M1-C-PB2-C-HA, PB2-C-M1-C-HA, HA-K-M1-CPB2, HA-K-PB2-C-M1, M1-C-PB2-K-HA, PB2-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-PB2, HA-C-PB2-K-M1, M1-K-PB2-C-HA, PB2- 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PB1F2-C-NS1-K-NA, NAC- NS1-K-PB1F2, NA-C-PB1F2-K-NS1, NS1-K-PB1F2-C-NA, PB 1 F2-K-NS1 -C-NA, NA-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-NA, NA-K-NS2/NEP-NS2/NEP, NS2/NEP-NS2/NEP-K-NA, NA-NS2/NEP-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-NS2/NEP-NA, NA-KNS2/ NEP-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-NA, NA-C-NS2/NEP-NS2/NEP, NS2/NEP-NS2/NEP-C-NA, NA-NS2/NEP-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-NS2/NEP-NA, NA-C-NS2/NEP-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP-KNS2/ NEP, NS2/NEP-K-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-PA, NA-K-PA-NS2/NEP, NS2/NEP-PA-K-NA, PA-NS2/NEPK- NA, NA-NS2/NEP-K-PA, NA-PA-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PA-NA, PA-K-NS2/NEP-NA, NA-K-NS2/NEP-K-PA, NAK- PA-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PA-K-NA, PA-K-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP-PA, NA-C-PA-NS2/NEP, NS2/NEPPA- C-NA, PA-NS2/NEP-C-NA, NA-NS2/NEP-C-PA, NA-PA-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PA-NA, PA-C-NS2/NEP-NA, NAC- NS2/NEP-C-PA, NA-C-PA-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PA-C-NA, PA-C-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-C-PA, NAK- PA-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PA-K-NA, PA-C-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP-K-PA, NA-C-PA-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PA-C-NA, PA-K-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-PB1, NA-K-PB1-NS2/NEP, NS2/NEP-PB1-K-NA, PB1- NS2/NEP-K-NA, NA-NS2/NEP-K-PB1, NA-PB1-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB1-NA, PB1-K-NS2/NEP-NA, NA-KNS2/ NEP-K-PB1, NA-K-PB1-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB1-K-NA, PB1-K-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP-PB1, NAC- PB1-NS2/NEP, NS2/NEP-PB1-C-NA, PB1-NS2/NEP-C-NA, NA-NS2/NEP-C-PB1, NA-PB1-C-NS2/NEP, NS2/NEPC- PB1-NA, PB1-C-NS2/NEP-NA, NA-C-NS2/NEP-C-PB1, NA-C-PB1-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PB1-C-NA, PB1-CNS2/ NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-C-PB1, NA-K-PB1-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PB1-K-NA, PB1-C-NS2/NEP-K-NA, NAC- NS2/NEP-K-PB1, NA-C-PB1-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB1-C-NA, PB1-K-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-PB2, NA-K-PB2-NS2/NEP, NS2/NEP-PB2-K-NA, PB2-NS2/NEP-K-NA, NA-NS2/NEP-K-PB2, NA-PB2-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB2-NA, PB2-K-NS2/NEP-NA, NA-K-NS2/NEP-K-PB2, NA-K-PB2-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB2-K-NA, PB2-K-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP-PB2, NA-C-PB2-NS2/NEP, NS2/NEP-PB2-C-NA, PB2-NS2/NEP-C-NA, NANS2/ NEP-C-PB2, NA-PB2-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PB2-NA, PB2-C-NS2/NEP-NA, NA-C-NS2/NEP-C-PB2, NA-CPB2- C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PB2-C-NA, PB2-C-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-C-PB2, NA-K-PB2-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PB2-K-NA, PB2-C-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP-K-PB2, NA-C-PB2-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB2-CNA, PB2-K-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-PB1F2, NA-K-PB1F2-NS2/NEP, NS2/NEP-PB1F2-K-NA, PB1F2- NS2/NEP-K-NA, NA-NS2/NEP-K-PB1F2, NA-PB1F2-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB1F2-NA, PB1F2-K-NS2/NEP-NA, NA-K-NS2/NEP-K-PB1F2, NA-K-PB1F2-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB1F2-K-NA, PB1F2-K-NS2/NEP-K-NA, NA-CNS2/ NEP-PB1F2, NA-C-PB1F2-NS2/NEP, NS2/NEP-PB1F2-C-NA, PB1F2-NS2/NEP-C-NA, NA-NS2/NEP-C-PB1F2, NA-PB1F2-C-NS2/NEP, NS2/NEP-C-PB1F2-NA, PB1F2-C-NS2/NEP-NA, NA-C-NS2/NEP-C-PB1F2, NA-C-PB1 F2-CNS2/ NEP, NS2/NEP-C-PB1F2-C-NA, PB1F2-C-NS2/NEP-C-NA, NA-K-NS2/NEP-C-PB1F2, NA-K-PB1F2-CNS2/ NEP, NS2/NEP-C-PB1F2-K-NA, PB1F2-C-NS2/NEP-K-NA, NA-C-NS2/NEP-K-PB1F2, NA-C-PB1F2-K-NS2/NEP, NS2/NEP-K-PB1F2-C-NA, PB1F2-K-NS2/NEP-C-NA, NA-K-PA, PA-K-NA, NA-K-PA-PA, PA-PA-K-NA, NA-PA-K-PA, PA-K-PA-NA, NA-K-PA-K-PA, PA-K-PA-K-NA, NA-C-PA, PA-C-NA, NA-C-PA-PA, PA-PA-C-NA, NA-PA-C-PA, PA-CPA- NA, NA-C-PA-C-PA, PA-C-PA-C-NA, NA-K-PA-C-PA, PA-C-PA-K-NA, NA-C-PA-K-PA, PA-K-PA-C-NA, NA-K-PAPB1, NA-K-PB1-PA, PA-PB1-K-NA, PB1-PA-K-NA, NA-PA-K-PB1, NA-PB1-K-PA, PA-K-PB1-NA, PB1-K-PA-NA, NAK- PA-K-PB1, NA-K-PB1-K-PA, PA-K-PB1-K-NA, PB1-K-PA-K-NA, NA-C-PA-PB1, NA-C-PB1-PA, PA-PB1-C-NA, PB1-PA-C-NA, NA-PA-C-PB1, NA-PB1-C-PA, PA-C-PB1-NA, PB1-C-PA-NA, NA-C-PA-C-PB1, NA-C-PB1-C-PA, PACPB1- C-NA, PB1-C-PA-C-NA, NA-K-PA-C-PB1, NA-K-PB1-C-PA, PA-C-PB1-K-NA, PB1-C-PA-K-NA, NA-C-PA-K-PB1, NA-C-PB1-K-PA, PA-K-PB1-C-NA, PB1-K-PA-C-NA, NA-K-PA-PB2, NA-K-PB2-PA, PA-PB2-K-NA, PB2-PA-K-NA, NAPA- K-PB2, NA-PB2-K-PA, PA-K-PB2-NA, PB2-K-PA-NA, NA-K-PA-K-PB2, NA-K-PB2-K-PA, PA-K-PB2-K-NA, PB2-KPA- K-NA, NA-C-PA-PB2, NA-C-PB2-PA, PA-PB2-C-NA, PB2-PA-C-NA, NA-PA-C-PB2, NA-PB2-C-PA, PA-C-PB2-NA, PB2-C-PA-NA, NA-C-PA-C-PB2, NA-C-PB2-C-PA, PA-C-PB2-C-NA, PB2-C-PA-C-NA, NA-K-PA-C-PB2, NA-K-PB2-CEP 2658 573 B1 PA, PA-C-PB2-K-NA, PB2-C-PA-K-NA, NA-C-PA-K-PB2, NA-C-PB2-K-PA, PA-K-PB2-C-NA, PB2-K-PA-C-NA, NA-KPA- PB1F2, NA-K-PB1F2-PA, PA-PB1F2-K-NA, PB1F2-PA-K-NA, NA-PA-K-PB1F2, NA-PB1F2-K-PA, PA-K-PB1F2- NA, PB1F2-K-PA-NA, NA-K-PA-K-PB1F2, NA-K-PB1F2-K-PA, PA-K-PB1F2-K-NA, PB1F2-K-PA-K-NA, NA-C-PAPB1F2, NA-C-PB1F2-PA, PA-PB1F2-C-NA, PB1F2-PA-C-NA, NA-PA-C-PB1F2, NA-PB1F2-C-PA, PA-C-PB1F2-NA, PB1F2-C-PA-NA, NA-C-PA-C-PB1F2, NA-C-PB1F2-C-PA, PA-C-PB1F2-C-NA, PB1F2-C-PA-C-NA, NA-K-PA-CPB1F2, NA-K-PB1F2-C-PA, PA-C-PB1F2-K-NA, PB1F2-C-PA-K-NA, NA-C-PA-K-PB1F2, NA-C-PB1F2-K-PA, PA-KPB1F2- C-NA, PB1F2-K-PA-C-NA, NA-K-PB1, PB1-K-NA, NA-K-PB1-PB1, PB1-PB1-K-NA, NA-PB1-K-PB1, PB1-KPB1- NA, NA-K-PB1-K-PB1, PB1-K-PB1-K-NA, NA-C-PB1, PB1-C-NA, NA-C-PB1-PB1, PB1-PB1-C-NA, NA-PB1-CPB1, PB1-C-PB1-NA, NA-C-PB1-C-PB1, PB1-C-PB1-C-NA, NA-K-PB1-C-PB1, PB1-C-PB1-K-NA, NA-C-PB1-K-PB1, PB1-K-PB1-C-NA, NA-K-PB1-PB2, NA-K-PB2-PB1, PB1-PB2-K-NA, PB2-PB1-K-NA, 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PB2, PB2-PB2-K-NA, NA-PB2-K-PB2, PB2-K-PB2-NA, NA-K-PB2-K-PB2, PB2-K-PB2-K-NA, NA-C-PB2, PB2-C-NA, NA-C-PB2-PB2, PB2-PB2-C-NA, NA-PB2-C-PB2, PB2-C-PB2-NA, NA-C-PB2-C-PB2, PB2-C-PB2-C-NA, NA-K-PB2- C-PB2, PB2-C-PB2-K-NA, NA-C-PB2-K-PB2, PB2-K-PB2-C-NA, NA-K-PB2-PB1F2, NA-K-PB1F2-PB2, PB2-PB1F2- K-NA, PB1F2-PB2-K-NA, NA-PB2-K-PB1F2, NA-PB1F2-K-PB2, PB2-K-PB1F2-NA, PB1F2-K-PB2-NA, NA-K-PB2-KPB1F2, NA-K-PB1F2-K-PB2, PB2-K-PB1F2-K-NA, PB1F2-K-PB2-K-NA, NA-C-PB2-PB1F2, NA-C-PB1F2-PB2, PB2- PB1F2-C-NA, PBIF2-PB2-C-NA, NA-PB2-C-PB1F2, NA-PB1F2-C-PB2, PB2-C-PB1F2-NA, PB1F2-C-PB2-NA, NA-CPB2- C-PB1F2, NA-C-PB1F2-C-PB2, PB2-C-PB1F2-C-NA, PB1F2-C-PB2-C-NA, NA-K-PB2-C-PB1F2, NA-K-PB1F2- C-PB2, PB2-C-PB1F2-K-NA, PB1F2-C-PB2-K-NA, NA-C-PB2-K-PB1F2, NA-C-PB1F2-K-PB2, PB2-K-PB1F2-C-NA, PB1F2-K-PB2-C-NA, NA-K-PB1F2, PB1F2-K-NA, NA-K-PB1F2-PB1F2, PB1F2-PB1F2-K-NA, NA-PB1F2-K-PB1F2, PB1F2-K-PB1F2-NA, NA-K-PB1F2-K-PB1F2, PB1F2-K-PB1F2-K-NA, NA-C-PB1F2, PB1F2-C-NA, NA-C-PB1F2- PB1F2, PB1F2-PB1F2-C-NA, NA-PB1F2-C-PB1F2, PB1F2-C-PB1F2-NA, NA-C-PB1F2-C-PB1F2, PB1F2-C-PB1F2- C-NA, NA-K-PB1F2-C-PB1F2, PB1F2-C-PB1F2-K-NA, NA-C-PB1F2-K-PB1 F2 o PB1F2-K-PB1F2-C-NA. Aún más preferentemente, la disposición es NP-K-M1-C-HA.
Está dentro del alcance de la presente divulgación que cada proteína se pueda combinar con cualquier otra proteína y que cualquier dos proteínas se puedan o no conectar o ligar por ya sea un sitio de escisión o un ligador de péptido.
En realizaciones preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección viral, particularmente preferentemente para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por ortomixovirus, preferentemente una infección por el virus de la influenza, más preferentemente una infección por el virus de la influenza A, y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por ortomixovirus, preferentemente una infección por el virus de la influenza, más preferentemente una infección por el virus de la influenza A, y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección por ortomixovirus, preferentemente una infección por el virus de la influenza, más preferentemente una infección por el virus de la influenza A, preferentemente una infección por el virus de la influenza, más preferentemente una infección por el virus de la influenza A.
En realizaciones preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta inmunitaria de célula B a infección por ortomixovirus, preferentemente una infección por el virus de la influenza, más preferentemente una infección por el virus de la influenza A.
En una realización preferente de este aspecto, HA se define de acuerdo con el octavo aspecto.
Es particularmente preferente que la poliproteína viral codificada por el primer, el segundo y el tercer polinucleótido has un aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 13 o una variante del mismo y/o se codifica por un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 14 o una variante de la misma. Preferentemente, la proteína de triple antígeno codificada NP-M1-H1p se procesa en una proteína de fusión NP-M1 citoplasmática y una proteína que atraviesa la membrana H1p mediante la secuencia 2A.
En realizaciones preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por ortomixovirus, preferentemente una infección por el virus de la influenza A.
En realizaciones más preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta inmunitaria de célula B contra a un ortomixovirus proteína, preferentemente un virus de la influenza A proteína.
En realizaciones preferentes, el vector o vectores que comprenden el primer, y el segundo y/o el tercer polinucleótido se selecciona/n del grupo que consiste en plásmido, cósmido, fago, virus, y cromosoma artificial. Más preferentemente, un vector adecuado para practicar la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en vectores de plásmido, vectores de cósmido, vectores de fago, preferentemente vectores de fago lambda y fago filamentoso, vectores virales, vectores de adenovirus (por ejemplo, vectores Ad5 no replicable, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd 73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, y PanAd3 o vectores Ad4 y Ad7 con capacidad de replicación), vectores de virus adenoasociado (AAV) (por ejemplo, AAV tipo 5 y tipo 2), vectores de alfavirus (por ejemplo, virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus sindbis (SIN), virus del bosque semliki (SFV), y quimeras VEE-SIN), vectores de virus del herpes (por ejemplo vectores derivados de citomegalovirus, como citomegalovirus rhesus (RhCMV) (14)), vectores de virus arena (por ejemplo vectores del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (15)), vectores del virus del sarampión, vectores de virus de viruela (por ejemplo, virus vaccinia, virus vaccinia Ankara modificada (MVA), NYVAC (derivado de la cepa de Copenhague de vaccinia), y vectores de avipox: vectores de viruela del canario (ALVAC) y viruela aviar (FPV)), vectores de virus de la estomatitis vesicular, retrovirus, lentivirus, partículas como virus, y esporas bacterianas. Los vectores ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se describen en detalle en el documento WO 2005/071093. Los vectores PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, y ChAd147 se describen en detalle en el documento WO 2010/086189. Es particularmente preferente que el vector se seleccione del grupo que consiste en MVA, ChAd63 y PanAd3.
Aspectos adicionales de la invención reivindicada
En realizaciones preferentes, el sistema de expresión es para su uso en medicina. En realizaciones más preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección viral, particularmente preferentemente para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección de RSV.
En un segundo aspecto, se divulga una mezcla de proteína aislada codificada por el sistema de expresión del primer aspecto. Preferentemente, la mezcla de proteína aislada contiene, esencialmente contiene o comprende una o más de las proteínas virales codificadas por el sistema de expresión del primer aspecto.
En realizaciones preferentes, la mezcla de proteína aislada es para su uso en medicina. En realizaciones particularmente preferidas, la mezcla de proteína aislada es para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección viral, particularmente preferentemente para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección de RSV. También se divulga la profilaxis o tratamiento de infección por influenza A.
En un tercer aspecto, se divulga una célula anfitriona aislada que contiene el sistema de expresión del primer aspecto y/o la mezcla de proteína de la divulgación. Se entiende que dicha célula anfitriona incluye pero no se limita a células procariotas (por ejemplo, una célula bacteriana) o eucariotas (por ejemplo, una célula fúngica, vegetal o animal).
En realizaciones preferentes, la célula anfitriona es para su uso en medicina. En realizaciones particularmente preferidas, la célula anfitriona es para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección viral, particularmente preferentemente para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección de RSV. También se divulga la profilaxis o tratamiento de infección por influenza A.
También se divulga una composición que comprende el sistema de expresión del primer aspecto o la mezcla de proteína y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica.
La composición contiene preferentemente una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación se debe adaptar al modo de administración.
Las composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos.
Para preparar composiciones farmacéuticas, los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos.
Las composiciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, grageas, sellos, supositorios y gránulos dispersables. Un excipiente sólido puede ser una o más sustancias, que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes desintegradores de comprimidos o un material encapsulante. En polvos, el excipiente es preferentemente un sólido finamente dividido. En los comprimidos, el ingrediente activo se mezcla con el portador que tiene las propiedades aglutinantes necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los excipientes adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Para preparar supositorios, en primer lugar se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao, y el componente activo se dispersa homogéneamente en la misma, agitando. La mezcla homogénea fundida se vierte luego en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y de ese modo solidifica. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, sellos y grajeas se pueden utilizar como formas de dosificación sólidas adecuadas para la administración oral.
La composición en forma líquida incluye soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, agua, soluciones salinas, dextrosa acuosa, soluciones de glicerol o soluciones de agua/propilenglicol. Una solución salina es un portador preferente cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa o intranasal mediante un nebulizador. Para la inyección parenteral, las preparaciones líquidas se pueden formular en solución en, por ejemplo, una solución de polietilenglicol acuosa.
En una realización particularmente preferente de este aspecto, la composición farmacéutica está en forma de solución, suspensión o emulsión y se administra por vía intranasal mediante un nebulizador.
Preferentemente, la composición farmacéutica está en forma de dosificación unitaria. En tal forma, la composición se puede subdividir en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una composición empacada, el empaque contiene cantidades discretas de la composición, tales como comprimidos empacados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, un vial de inyección, un comprimido, un sello o una grajea en sí misma, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empacada.
La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.
Adicionalmente, dicha composición también puede comprender otra sustancia farmacológicamente activa tal como, pero sin limitarse a, adyuvantes y/o ingredientes activos adicionales.
Ejemplos de dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes inorgánicos, adyuvantes orgánicos, adyuvantes basados en aceite, citocinas, adyuvantes en partículas, virosomas, adyuvantes bacterianos, adyuvantes sintéticos o adyuvantes polinucleótidos sintéticos.
Los ingredientes activos adicionales incluyen, pero no se limitan a, otros compuestos o composiciones de vacuna. Preferentemente, el ingrediente activo adicional es otra vacuna viral, más preferentemente una vacuna contra un virus de ADN, un virus de ARN de cadena sencilla de sentido negativo (ARNcs (-)) o un virus de ARN ambisentido. Más preferente, el virus se selecciona de virus de ARN de cadena sencilla negativo (ARNcs (-)). Aún más preferente, el virus se selecciona de virus de ARNcs (-) envueltos, más preferentemente del grupo que consiste en paramixovirus y ortomixovirus. Preferentemente, el ingrediente activo adicional es una vacuna contra paramixovirus, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en Pneumovirinae, Paramyxovirinae, Virus Fer-de-Lance, Virus Nariva, Virus Salem, Paramixovirus Tupaia, Virus Beilong, Virus J , Virus de Menangle, virus de Mossmann y virus de Murayama. Particularmente es preferente que el Pneumovirinae se seleccione del grupo que consiste en Pneumovirus, (por ejemplo, virus sincitial respiratorio humano (RSV), virus de la neumonía murina, r Sv bovino, RSV ovino, RSV caprino) y Metapneumovirus, (por ejemplo, metapneumovirus humano, metapneumovirus aviar). Es particularmente preferente que los paramyxovirinae se seleccionen del grupo que consiste en Respirovirus (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 1 y 3), y Rubulavirus, (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 2 y 4). Alternativa o adicionalmente, el ingrediente activo adicional es preferentemente otra vacuna viral contra un ortomixovirus, más preferentemente seleccionado del género de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Thogotovirus e Isavirus. En incluso realizaciones más preferentes, el ortomixovirus es virus de la Influenza A, preferentemente seleccionado del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
En un aspecto adicional la divulgación proporciona un sistema de expresión como se define en el primer aspecto, la mezcla de proteína aislada, la célula anfitriona aislada o la composición como se divulga en la presente memoria, para el uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad viral provocada por un paramixovirus, Pneumovirus, (específicamente virus sincitial respiratorio humano (RSV). También se divulgan virus de la neumonía murina, RSV bovino, RSV ovino, RSV caprino) y Metapneumovirus, (por ejemplo metapneumovirus humano, metaneumovirus aviar). En la divulgación adicional, los paramyxovirinae se seleccionan del grupo que consiste en Respirovirus (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 1 y 3), y Rubulavirus, (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 2 y 4). Como se divulga alternativa o adicionalmente, la enfermedad viral preferentemente es provocada por un ortomixovirus, seleccionado del género de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Thogotovirus e Isavirus. En incluso realizaciones más preferentes, el ortomixovirus es virus de la Influenza A, preferentemente seleccionado del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
También se divulga un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad viral que comprende la administración de cantidades eficaces del sistema de expresión del primer aspecto, la mezcla de proteína aislada, la célula anfitriona aislada o la composición como se divulga en la presente memoria para el uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad viral.
En las realizaciones preferentes de este aspecto de la divulgación, la enfermedad viral es provocada por un virus de ADN, un virus de a Rn de cadena sencilla (ARNcs (-)) de sentido negativo o un virus de ARN ambisentido. Más preferente, el virus se selecciona de virus de ARN de cadena sencilla negativo (ARNcs (-)). Incluso más preferente, el virus se selecciona de virus (ARNcs(-) envuelto, más preferentemente del grupo que consiste en paramixovirus y ortomixovirus. El paramixovirus se selecciona preferentemente del grupo que consiste en Pneumovirinae, Paramyxovirinae, Virus Fer-de-Lance, Virus Nariva, Virus Salem, Paramixovirus Tupaia, Virus Beilong, Virus J, Virus Menangle, Virus Mossmann, y Virus Murayama. Incluso más preferentemente, los Pneumovirinae se seleccionan del grupo que consiste en Pneumovirus, (por ejemplo virus sincitial respiratorio humano (RSV), virus de la neumonía murina, RSV bovino, RSV ovino, RSV caprino) y Metapneumovirus, (por ejemplo metapneumovirus humano, metaneumovirus aviar). Incluso más preferentemente, los paramyxovirinae se seleccionan del grupo que consiste en Respirovirus (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 1 y 3), y Rubulavirus, (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 2 y 4). Alternativa o adicionalmente, la enfermedad viral preferentemente es provocada por un ortomixovirus, más preferentemente seleccionada del género de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Thogotovirus e Isavirus. En incluso realizaciones más preferentes, el ortomixovirus es virus de la Influenza A, preferentemente seleccionado del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
También se divulga un procedimiento de mejora de una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno que comprende la administración del sistema de expresión del primer aspecto, la mezcla de proteína, la célula y la composición como se divulga en la presente memoria.
En las realizaciones preferentes de este aspecto de la divulgación, el inmunógeno es un patógeno, más preferente el inmunógeno es un virus. Preferentemente, el virus se selecciona del grupo que consiste en un virus de ADN, un virus de ARN de cadena sencilla (ARNcs (-)) de sentido negativo o un virus de ARN ambisentido. Más preferente, el virus se selecciona de virus de ARN de cadena sencilla negativo (ARNcs (-)). Incluso más preferente, el virus se selecciona de virus (ARNcs(-) envuelto, más preferentemente del grupo que consiste en paramixovirus y ortomixovirus. El paramixovirus preferentemente se selecciona del grupo que consiste en Pneumovirinae, Paramyxovirinae, Virus Ferde-Lance, Virus Nariva, Virus Salem, Paramixovirus Tupaia, Virus Beilong, Virus J, Virus Menangle, Virus Mossmann, y Virus Murayama. Incluso más preferentemente, los Pneumovirinae se seleccionan del grupo que consiste en Pneumovirus, (por ejemplo virus sincitial respiratorio humano (RSV), virus de la neumonía murina, r Sv bovino, RSV ovino, RSV caprino) y Metapneumovirus, (por ejemplo metapneumovirus humano, metaneumovirus aviar). También se divulga que los paramyxovirinae se seleccionan del grupo que consiste en Respirovirus (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 1 y 3), y Rubulavirus, (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 2 y 4). Alternativa o adicionalmente, la enfermedad viral preferentemente es provocada por un ortomixovirus, más preferentemente seleccionado del género de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Thogotovirus e Isavirus. En incluso realizaciones más preferentes, el ortomixovirus es virus de la Influenza A, preferentemente seleccionado del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
Divulgación adicional que no forma parte de la invención
También se divulgan construcciones de nucleótidos que codifican la hemaglutinina de la influenza (HA), un sistema de expresión que comprende estas construcciones de nucleótidos, y proteínas o poliproteínas codificadas por las construcciones de nucleótidos, en las que el sitio de escisión HA0 tiene una secuencia multibásica.
La construcción de ácido nucleico de este aspecto comprende, esencialmente consiste o consiste en un polinucleótido que codifica una hemaglutinina de influenza modificada (HA), en la que el sitio de escisión HA0 se modifica al introducir uno o más aminoácidos básicos. Preferentemente, en la HA modificada, el sitio de escisión HA0 del gen de HA consenso se sustituyó con el sitio de escisión multibásico de H5N1 que se escinde mediante proteasas ubicuas para obtener una HA completamente procesada (H1p).
La hemaglutinina (HA) de la influenza es una proteína que pertenece al grupo de hemaglutininas virales que se encuentran sobre la superficie de los virus de la influenza. Es una glicoproteína antigénica que se encarga de unir el virus a la célula que está siendo infectada. Las proteínas HA como la hemaglutinina de la influenza se unen a las células con ácido siálico sobre las membranas, tales como las células del tracto respiratorio superior o los eritrocitos. Hay al menos 16 antígenos HA diferentes. Estos serotipos o subtipos se denominan H1 a H16.
La HA tiene dos funciones:
1. Reconocimiento de células objetivo mediante la unión a receptores que contienen ácido siálico.
2. Mediación de la entrada del genoma viral en las células objetivo al provocar la fusión de la membrana endosomal del anfitrión con la membrana viral (envoltura). En detalle, HA se une al ácido siálico monosacárido que está presente sobre la superficie de sus células objetivo. Luego, la membrana celular envuelve al virus y la porción de la membrana que envuelve al virus forma un endosoma. Luego, el endosoma se acidifica y se transforma en un lisosoma. Tan pronto como el pH dentro del endosoma desciende a aproximadamente 6,0, la estructura plegada original de la molécula de HA se vuelve inestable, lo que hace que se despliegue parcialmente, liberando una porción hidrófoba de su cadena de péptidos. Este péptido de fusión actúa insertando en la membrana endosomal. Luego, el resto de la molécula de HA se repliega en una nueva estructura y provoca la fusión de la membrana viral con la membrana endosomal de tal manera que el contenido del virus, incluido su genoma de ARN, se libera en el citoplasma de la célula.
Para adquirir su potencial de fusión de membrana, HA0 se debe escindir en HA1 y HA2 mediante proteasas de la célula anfitriona. La escisión se produce en una secuencia ligadora que conecta las subunidades HA1 y HA2, que se encuentra en un bucle parcialmente expuesto a la superficie. El sitio de escisión H0 de la influenza HA se encuentra en aproximadamente aa 340 en el subtipo H1N1 (aa 339 a 344 de la SEQ ID NO: 8), el subtipo H5N1 (aa 337 a 346 de la SEQ ID NO: 10) y H3N2 (aa 340 a 350 de la SEQ ID NO: 20). El experto en la técnica puede determinar la posición del sitio de escisión H0 en otros subtipos de HA del virus de la influenza al realizar alineaciones de secuencias y analizar la homología de las secuencias mediante procedimientos bien conocidos en este campo técnico. La HA del virus de la influenza A de subtipo H1N1 y H3N2 requiere la escisión por las proteasas de la célula anfitriona para pasar a un estado de fusión competente. La activación proteolítica de los virus de la influenza puede ocurrir en el aparato de Golgi o en la membrana plasmática de las células infectadas, así como en el espacio extracelular y en las vesículas de las células objetivo, por lo que la naturaleza del sitio de escisión y las respectivas proteasas activadoras tienen importantes implicaciones para la propiedades biológicas del virus de la influenza así como para la intervención terapéutica. Se demostró que HA del subtipo H5N1 alberga varios residuos de arginina y lisina en el sitio de escisión, una secuencia consenso R-X-R/K-R es indispensable para una escisión eficaz. Además, se obtuvo evidencia de que la escisión de HA podría ocurrir en la red trans-Golgi (TGN). Se ha demostrado que estos virus son activados por furina.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 es una secuencia consenso derivada de la alineación de 829 secuencias del subtipo H1N1 anotado en la Base de Datos de Recursos del Virus de la Influenza NCBI, que circula en todo el mundo desde abril a septiembre de 2009. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 es idéntica a la SEQ ID NO: 8 con la excepción de que el sitio de escisión de la proteasa H0 natural se ha sustituido por un sitio multibásico derivado de H5N1. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 es un consenso derivado de la alineación de 259 secuencias del subtipo H5N1 anotado en la Base de Datos de Recursos del Virus de la Influenza NCBI, que infecta a seres humanos en todo el mundo desde 1990 a 2009. La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 es la secuencia de HA del virus de la influenza A subtipo H3N2, cepa A/Wellington/01/2004 (H3N2). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 se basa en la SEQ ID NO: 20 en la que el sitio de escisión de la proteasa H0 natural se ha sustituido por un sitio multibásico derivado de H5N1
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 es una secuencia consenso NP que se diseñó sobre la base de la alineación de las diferentes secuencias consenso del subtipo de influenza. Adicionalmente, la secuencia NP de la SEQ ID NO: 11 carece de la señal de localización nuclear que reside en los aa 6-8 (TRK a AAA) para aumentar la expresión citoplásmica.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 es una secuencia consenso M1 que se derivó por alineación de diferentes secuencias consenso que se alinearon y se eligió el aminoácido más común en cada posición.
En una realización preferente de este aspecto, la construcción de ácido nucleico y/o el sistema de expresión que comprende esta construcción de ácido nucleico, comprende elementos para dirigir la transcripción y traducción de1HA y las proteínas adicionales opcionales codificadas por la construcción de ácido nucleico y/o el sistema de expresión, que se puede incluir en las realizaciones preferentes que se describen a continuación. Dichos elementos incluían elementos promotores y potenciadores para dirigir la transcripción de ARNm en un sistema sin células o basado en células, preferentemente un sistema basado en células. En otra realización, en la que los polinucleótidos se proporcionan como ARN traducibles, se prevé que el sistema de expresión comprenda aquellos elementos que son necesarios para la traducción y/o estabilización de ARN que codifican la HA y/o la proteína o proteínas inductoras de células T, por ejemplo, cola poliA, IRES, estructuras cap, etc.
En una realización preferente de este aspecto, la construcción de ácido nucleico codifica una proteína de HA, péptido o variante del mismo que comprende un sitio de escisión H0 modificado, en el que la HA se selecciona del grupo de subtipos de HA que consisten en H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16o una variante de la misma o una secuencia de consenso de la misma, o una variante de la misma o una secuencia de consenso de uno o más de los subtipos de HA seleccionados del grupo de subtipos de HA que consisten en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16. Preferentemente, los subtipos de HA se seleccionan del grupo que consiste en H1, H2, H3, H7, H9, H10, o una variante de los mismos o una secuencia de consenso de la misma, o una variante de la misma o una secuencia de consenso de uno o más de los subtipos de HA seleccionados del grupo de subtipos de HA que consisten en H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10. Más preferente, la proteína de HA, péptido o variante del mismo que comprende un sitio de escisión H0 modificado, es una HA del subtipo H1 o una variante de la misma.
Aún más preferente, el polinucleótido que codifica la HA de la construcción de nucleótido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9.
En una realización preferente de este aspecto, la construcción de ácido nucleico codifica una proteína de HA, péptido o variante del mismo, en la que el sitio de escisión H0 se modifica al sustituir al menos un aminoácido no básico por un aminoácido básico y/o al introducir al menos un aminoácido básico en la secuencia del sitio de escisión H0. Preferentemente, el aminoácido básico se selecciona del grupo que consiste en arginina (Arg; R), lisina (Lys; K) e histidina (His, H). Más preferentemente, el aminoácido básico se selecciona del grupo que consiste en arginina (Arg; R) y lisina (Lys; K).
Preferentemente, el sitio de escisión comprende una secuencia de 6 a 12 aminoácidos, más preferentemente 10-12 aminoácidos.
Preferentemente, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o 100 % de los aminoácidos del polipéptido que forman el sitio de escisión H0 son aminoácidos básicos.
Preferentemente, el sitio de escisión HA0 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en PQRERRRKKR (SEQ ID NO: 15), PQRESRRKKR (SEQ ID NO: 16), PQGERRRKKR (SEQ ID NO: 17), PLRERRRKR (SEQ ID NO: 18) y PQRETR (SEQ ID NO: 19). Aún más preferente, el sitio de escisión HA0 tiene la secuencia PQRERRRKKR (SEQ ID NO: 15).
En la Tabla 1, las secuencias del sitio de escisión H0 de la cepa H1N1 y las secuencias del sitio de escisión H0 de la cepa HSN1 se comparan en su contexto respectivo de la cadena de aminoácidos de HA. En la primera línea, se indica la secuencia consenso del sitio de escisión polibásico H0 del subtipo H5N1 altamente patogénico. En la segunda línea, se indica la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión H0 de la HA de la cepa de tipo silvestre H1N1. En la tercera línea, la secuencia diseñada por ingeniería genética del sitio de escisión polibásico en la proteína H1p, que reemplaza la secuencia natural.
Tabla 1
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En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, la construcción de ácido nucleico es parte de un sistema de expresión que codifica la HA modificada y un segundo polinucleótido. En este sistema de expresión el polinucleótido que codifica la HA modificada y el segundo polinucleótido están comprendidos en vectores separados o sobre el mismo vector. De acuerdo con lo anterior, el polinucleótido que codifica la HA modificada puede estar comprendido sobre un vector y el segundo polinucleótido puede estar comprendido sobre un segundo vector. Alternativa o adicionalmente, el polinucleótido que codifica la HA modificada y el segundo polinucleótido puede estar comprendido sobre el mismo vector. Es preferente que el polinucleótido que codifica la HA modificada y el segundo polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector. Es particularmente preferente que el polinucleótido que codifica la HA modificada y el segundo polinucleótido comprendido sobre el mismo vector se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína. Preferentemente, el polinucleótido que codifica la HA modificada y el segundo polinucleótido forman un marco de lectura abierto.
Es preferente que el polinucleótido que codifica la HA modificada y el segundo polinucleótido se expresen como una poliproteína artificial. En el contexto de la presente divulgación el término “poliproteína artificial” se dirige a poliproteínas que no son de origen natural, por ejemplo que se generan al utilizar técnicas de ADN recombinante. De acuerdo con lo anterior, las proteínas, péptidos o variantes de los mismos codificados en esta poliproteína artificial se derivan preferentemente de patógenos cuyo genoma no codifica una poliproteína que comprende las proteínas, péptidos o variantes codificadas por el polinucleótido que codifica la HA modificada y segundo polinucleótido. Preferentemente, el polinucleótido que codifica la HA modificada y el segundo polinucleótido ambos se derivan de virus de la influenza A.
En realizaciones preferentes esta divulgación, el segundo polinucleótido codifica una proteína o variante de la misa, que induce una respuesta de células T, y que es, preferentemente, una proteína no estructural y/o interna del virus de la influenza A. Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna codificada por el segundo polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o PB1-F2 (PB1F2).
Es preferente que la secuencia de aminoácidos de la HA modificada y/o la proteína no estructural (interna) codificada por el segundo polinucleótido comprende segmentos consecutivos o una secuencia de consenso de uno o más diferentes aislados de virus.
En el contexto de esta divulgación es preferente que el término “segmento” se refiera a una parte de una proteína o poliproteína. Es particularmente preferente que dicho segmento se pliegue y y/o funcione independientemente del resto de la proteína o poliproteína tal como pero no limitado a un dominio, un epítopo o un fragmento del mismo. Se entiende que una variante de proteína en el contexto de la presente divulgación difiere en comparación con su polipéptido original en cambios en la secuencia de aminoácidos tales como intercambios de aminoácidos, inserciones, supresiones, truncamientos de terminal N, o truncamientos de terminal C, o cualquier combinación de estos cambios, que pueden ocurrir en uno o varios sitios por lo cual la variante exhibe al menos 80 % de identidad de secuencia con su polipéptido original.
En una realización preferente adicional, se suprime funcionalmente un dominio de adhesión a la membrana de la HA modificada o una variante de la misma, de esta manera, ya se suprimido estructuralmente o presente estructuralmente presente pero que no cumple su función biológica. En una realización particularmente preferente, se suprime la secuencia de aminoácidos que corresponde al dominio de adhesión a la membrana. La supresión de la región de adhesión de membrana tiene el propósito de determinar que la proteína que induce respuesta antipatogénica de células B se secrete de la célula en la que se ha introducido el sistema de expresión.
En una realización preferente adicional de este aspecto la HA modificada comprende una señal de secreción, que dirige la proteína al retículo endoplasmático (ER). Dichas señales de secreción están presentes preferentemente en el contexto de un dominio de adhesión a la membrana suprimido. El experto es muy consciente de varias de dichas señales de secreción, que se pueden utilizar como señales de secreción heterólogas, por ejemplo agregadas al el terminal N de la HA modificada. Alternativa o adicionalmente se puede utilizar una señal de secreción de origen natural, que, por ejemplo, está presente en la mayoría de proteínas virales estructurales y/o de superficie. De esta manera, si está presente naturalmente en la proteína respectiva, es preferente que la señal de secreción se mantenga en una versión modificada de la proteína estructural y/o de superficie.
En la divulgación adicional de este aspecto, la proteína no estructural es una proteína interna conservada adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el patógeno que implica la activación de linfocito T específico de antígeno tal como pero no limitado a células T citotóxicas (CTLs), células T auxiliares (células Th), células T de memoria central (células TCM), células T de memoria efectora (células TEM), y células T reguladoras (células Treg). De esta manera, preferentemente la célula T que incluye proteína del patógeno no comprende una señal de secreción.
En el contexto de la presente divulgación, la HA modificada o variante de la misma se ubica ya sea en el terminal N o C con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido. En una realización preferente, la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido se ubica en el terminal N con respecto a la HA modificada o variante de la misma.
En divulgación adicional de este aspecto, un polinucleótido que codifica un sitio de escisión se posiciona entre la HA modificada o variante de la misma y el segundo polinucleótido. Cualquiera de las dos proteínas se puedan o no conectar o ligar por un sitio de escisión.
Es preferente que este sitio de escisión sea ya sea un sitio de autoescisión (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir sin que dicha escisión involucre cualquier molécula adicional o en el que se evita la formación del enlace de péptido en esta secuencia en el primer lugar) o un sitio de escisión de endopeptidasa (es decir un sitio de escisión dentro de la secuencia de aminoácidos en la que esta secuencia se escinde o se puede escindir mediante una endopeptidasa, por ejemplo tripsina, pepsina, elastasa, trombina, colagenasa, furina, termolisina, endopeptidasa V8, catepsinas). Más preferentemente, el sitio de autoescisión es un sitio de escisión 2A seleccionado del grupo que consiste en un péptido 2A viral o péptido similar a 2A de Picornavirus, virus de insectos, Aphtoviridae, Rotaviruses y Trypanosoma, preferentemente en el que el sitio de escisión 2A es el péptido 2 A del virus de la fiebre aftosa. Alternativa o adicionalmente, la poliproteína se puede escindir mediante una autoproteasa, es decir una proteasa que escinde enlaces de péptidos en la misma molécula de proteína que también comprende la proteasa. Ejemplos de dichas autoproteasas son la proteasa N2 de flavivirus o la proteasa VP4 de birnavirus
En el contexto de la presente divulgación, el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal N con respecto a la HA modificada o variante de la misma y en el terminal C con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido. Alternativamente el sitio de escisión se puede posicionar en el terminal C con respecto a la HA modificada o variante de la misma y en el terminal N con respecto a la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido.
En la realización preferida de este aspecto, el sistema de expresión comprende adicionalmente un tercer polinucleótido que codifica una proteína, péptido o una variante de la misma de un patógeno.
Es preferente que la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el tercer polinucleótido difiera de la HA modificada o variante de la misma o de la proteína, péptido o variante del mismo codificado por el segundo polinucleótido. Preferentemente, las proteínas, péptidos o variantes de los mismos codificados por el primer, segundo y el tercer polinucleótido difieren entre si en que comprenden secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas.
En las realizaciones preferentes de este aspecto, el tercer polinucleótido codifica una proteína o variante de la misma, que induce una respuesta de células T, y que es, preferentemente, una proteína no estructural y/o interna de virus de la influenza A. Preferentemente, la proteína no estructural y/o interna codificada por el tercer polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 o p B1-F2 (PB1F2).
En las realizaciones preferentes un polinucleótido que codifica un ligador se posiciona entre el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido. Es preferente que el ligador sea un ligador flexible, preferentemente un ligador flexible que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly).
En las realizaciones preferentes el tercer polinucleótido está comprendido sobre un vector separado o sobre el mismo vector como el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma y/o el segundo polinucleótido.
De acuerdo con lo anterior, el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma está comprendido sobre un vector y el segundo polinucleótido está comprendido sobre un segundo vector y el tercer polinucleótido está comprendido sobre un tercer vector. Alternativa o adicionalmente, el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma y el segundo polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector y el tercer polinucleótido está comprendido sobre un vector separado, o el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma y el tercer polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector y el segundo polinucleótido está comprendido sobre un vector separado, o el segundo y el tercer polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector y el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma está comprendido sobre un vector separado. Alternativa o adicionalmente, el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma y el segundo y el tercer polinucleótido están comprendidos sobre el mismo vector. Es preferente que el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma y el segundo y el tercer polinucleótido puedan estar comprendidos sobre el mismo vector. Es particularmente preferente que el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma y el segundo y el tercer polinucleótido comprendidos sobre el mismo vector se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína. Preferentemente, el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma y el segundo y el tercer polinucleótido comprendidos sobre el mismo vector forman un marco de lectura abierto.
En las realizaciones preferentes de este aspecto, el vector o vectores que comprenden el polinucleótido que codifica la HA modificada o variante de la misma, y el segundo y/o el tercer polinucleótido se selecciona/n del grupo que consiste en plásmido, cósmido, fago, virus, y cromosoma artificial. Más preferentemente, un vector adecuado para practicar la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en vectores de plásmido, vectores de cósmido, vectores de fago, preferentemente vectores de fago lambda y fago filamentoso, vectores virales, vectores de adenovirus (por ejemplo, vectores Ad5 no replicable, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd 73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, y PanAd3 o vectores Ad4 y Ad7 con capacidad de replicación), vectores de virus adenoasociado (AAV) (por ejemplo, AAV tipo 5 y tipo 2), vectores de alfavirus (por ejemplo, virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus sindbis (SIN), virus del bosque semliki (SFV), y quimeras VEE-SIN), vectores de virus del herpes (por ejemplo vectores derivados de citomegalovirus, como citomegalovirus rhesus (RhCMV) (14)), vectores de virus arena (por ejemplo vectores del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (15)), vectores del virus del sarampión, vectores de virus de viruela (por ejemplo, virus vaccinia, virus vaccinia Ankara modificada (MVA), NYVAC (derivado de la cepa de Copenhague de vaccinia), y vectores de avipox: vectores de viruela del canario (ALVAC) y viruela aviar (FPV)), vectores de virus de la estomatitis vesicular, retrovirus, lentivirus, partículas como virus, y esporas bacterianas. Los vectores ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAdl6, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se describen en detalle en el documento WO 2005/071093. Los vectores PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, y ChAd147 se describen en detalle en el documento WO 2010/086189. Es particularmente preferente que el vector se seleccione del grupo que consiste en MVA, ChAd63 y PanAd3.
En las realizaciones preferentes de este aspecto, la construcción de nucleótido o el sistema de expresión o el vector o vectores que comprenden el polinucleótido de la construcción de nucleótido o el sistema de expresión puede abarcar las “secuencias de control de expresión” que regulan la expresión del gen de interés. Normalmente, secuencias de control de expresión son polipéptidos o polinucleótidos tales como pero no limitados a promotores, potenciadores, silenciadores, aislantes o represores.
En realizaciones preferentes, la construcción de ácido nucleico y/o el sistema de expresión es para su uso en medicina. En realizaciones más preferentes, la construcción de ácido nucleicos, el sistema de expresión o las proteínas de este aspecto son para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A.
En las realizaciones preferentes el sistema de expresión es para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria. En realizaciones más preferentes, el sistema de expresión es para su uso en la potenciación de una respuesta antipatogénica inmunitaria de célula B contra una infección por el virus de la influenza A, más preferentemente un virus de la influenza A.
También se divulga el uso del sitio de escisión HA0 multibásico como se definió anteriormente para construir una construcción de ácido nucleico o un sistemas de expresión capaz de expresar la hemaglutinina de influenza modificada (HA) del octavo aspecto in vitro y/o in vivo. Adicionalmente, este aspecto proporciona la mezcla de proteína aislada, la proteína y/o poliproteína codificada por la construcción de ácido nucleico o sistema de expresión construido de acuerdo con este aspecto.
También se divulga una mezcla de proteína aislada codificada por el sistema de expresión. Preferentemente, la mezcla de proteína aislada contiene, esencialmente contiene o comprende una o más de las proteínas o poliproteínas codificadas por la construcción de ácido nucleico o el sistema de expresión. En realizaciones preferentes, la mezcla de proteína aislada es para su uso en medicina. En realizaciones particularmente preferidas, la mezcla de proteína aislada es para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección viral, particularmente preferentemente para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A.
También se divulga una célula anfitriona aislada que contiene las construcciones de nucleótidos, el sistema de expresión o las proteínas o poliproteínas y/o la mezcla de proteína como se divulga. Se entiende que dicha célula anfitriona incluye pero no se limita a células procariotas (por ejemplo, una célula bacteriana) o eucariotas (por ejemplo, una célula fúngica, vegetal o animal). En las realizaciones preferentes de este aspecto, la célula anfitriona es para su uso en medicina. En realizaciones particularmente preferidas, la célula anfitriona es para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A y/o en la fabricación de medicamentos para su uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A y/o para su uso en procedimientos de profilaxis o tratamiento de una infección por el virus de la influenza A.
También se divulga una composición que comprende las construcciones de nucleótidos, el sistema de expresión o las proteínas o poliproteínas, o la mezcla de proteína como se divulga, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica.
La composición contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación se debe adaptar al modo de administración.
Las composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos.
Para preparar composiciones farmacéuticas, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos.
Las composiciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, grajeas, sellos, supositorios y gránulos dispersables. Un excipiente sólido puede ser una o más sustancias, que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes desintegradores de comprimidos o un material encapsulante. En polvos, el excipiente es preferentemente un sólido finamente dividido. En los comprimidos, el ingrediente activo se mezcla con el portador que tiene las propiedades aglutinantes necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los excipientes adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Para preparar supositorios, en primer lugar se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao, y el componente activo se dispersa homogéneamente en la misma, mediante agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte luego en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y de ese modo solidifica. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, sellos y grajeas se pueden utilizar como formas de dosificación sólidas adecuadas para la administración oral.
La composición en forma líquida incluye soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, agua, soluciones salinas, dextrosa acuosa, soluciones de glicerol o soluciones de agua/propilenglicol. Una solución salina es un portador preferente cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa o intranasal mediante un nebulizador. Para la inyección parenteral, las preparaciones líquidas se pueden formular en solución en, por ejemplo, una solución de polietilenglicol acuosa.
En una divulgación particularmente preferente de este aspecto, la composición farmacéutica está en forma de solución, suspensión o emulsión y se administra por vía intranasal mediante un nebulizador.
Preferentemente, la composición farmacéutica está en forma de dosificación unitaria. En dicha forma, la composición se puede subdividir en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una composición empacada, el empaque contiene cantidades discretas de la composición, tales como comprimidos empacados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, un vial de inyección, un comprimido, un sello o una grajea en sí misma, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empacada.
La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.
Adicionalmente, dicha composición también puede comprender otra sustancia farmacológicamente activa tal como, pero sin limitarse a, adyuvantes y/o ingredientes activos adicionales.
Adyuvantes en el contexto de la presente divulgación incluyen pero no se limitan a Ejemplos de dichos adyuvantes incluyen pero no se limitan a adyuvantes inorgánicos, adyuvantes orgánicos, adyuvantes a base de aceite, citocinas, adyuvantes en partículas, virosomas, adyuvantes bacterianos, adyuvantes sintéticos o adyuvantes de polinucleótidos sintéticos.
Ingredientes activos adicionales incluyen pero no se limitan a otros compuestos o composiciones de vacuna. Preferentemente, el ingrediente activo adicional es otra vacuna viral, más preferentemente una vacuna contra un virus de ADN, un virus de ARN de cadena sencilla (ARNcs (-)) de sentido negativo o un virus de ARN ambisentido. Más preferente, el virus se selecciona de virus de ARN de cadena sencilla (ARNcs (-)) negativo. Incluso más preferente, el virus se selecciona de virus (ARNcs(-) envuelto, más preferentemente del grupo que consiste en paramixovirus y ortomixovirus. Preferentemente, el ingrediente activo adicional es una vacuna contra paramixovirus, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en Pneumovirinae, Paramixovirinae, Virus Fer-de-Lance, Virus Nariva, Virus Salem, Paramixovirus Tupaia, Virus Beilong, Virus J, Virus Menangle, Virus Mossmann, y Virus Murayama. Es particularmente preferente que los Pneumovirinae se seleccionen del grupo que consiste en Pneumovirus, (por ejemplo virus sincitial respiratorio humano (RSV), virus de la neumonía murina, RSV bovino, RSV ovino, RSV caprino) y Metapneumovirus, (por ejemplo metapneumovirus humano, metaneumovirus aviar). Es particularmente preferente que los paramyxovirinae se seleccionen del grupo que consiste en Respirovirus (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 1 y 3), y Rubulavirus, (por ejemplo virus de la parainfluenza humana 2 y 4). Alternativa o adicionalmente, el ingrediente activo adicional es preferentemente otra vacuna viral contra un ortomixovirus, más preferentemente seleccionado del género de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus de la Influenza C, Thogotovirus e Isavirus. En incluso realizaciones más preferentes, el ortomixovirus es virus de la Influenza A, preferentemente seleccionado del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
También se divulgan las construcciones de nucleótidos, el sistema de expresión o las proteínas o poliproteínas, la mezcla de proteína, la célula y la composición como se divulgó anteriormente, para el uso en medicina en particular en el tratamiento o prevención de infecciones por virus de la influenza A. El virus de la influenza A preferentemente se selecciona del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
También se divulgan un procedimiento de tratamiento o prevención de infecciones por virus de la influenza A que comprende la administración de una cantidad eficaz de las construcciones de nucleótidos, el sistema de expresión o las proteínas o poliproteínas, la mezcla de proteína, la célula y la composición divulgada anteriormente. El virus de la influenza A preferentemente se selecciona del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
También se divulga un procedimiento de mejora de una respuesta inmunitaria que comprende la administración de las construcciones de nucleótidos o el sistema de expresión o las proteínas o poliproteínas, la mezcla de proteína, la célula y la composición como se divulgó anteriormente. En una realización preferente de este aspecto, el procedimiento mejora una respuesta inmunitaria contra virus de la influenza A. El virus de la influenza A preferentemente se selecciona del virus de la influenza A subtipos H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, más preferentemente el virus de la influenza A subtipo H1N1.
Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos de la presente invención y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención como se indica en las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera.
Ejemplos ilustrativos de la invención
Ejemplo 1: Diseño y síntesis de ADN que codifica antígeno de RSV optimizado
Vacuna de consenso
Existen varias alternativas computacionales para el diseño de vacunas en base a aislados. Un enfoque es la reconstrucción de la secuencia del ancestro común más reciente (MRCA) (9). En este tipo de análisis, el estado ancestral es una estimación de la secuencia real que existió en el pasado (es decir, proviene directamente de la historia reconstruida). Otro tipo de análisis computacional es el enfoque del centro del árbol (COT). El enfoque COT identifica un punto en la filogenia desarraigada, en el que se minimiza la distancia evolutiva promedio desde ese punto hasta cada punta de la filogenia. Los defensores de este enfoque afirman que debido a que el COT es un punto en la filogenia, la secuencia COT estimada tendrá las mismas ventajas que la secuencia ancestral estimada. Véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos 2005/0137387 A1. Sin embargo, este enfoque COT es lo suficientemente complejo que reducirlo a la práctica para un conjunto de datos grande y heterólogo, como la base de datos de secuencias de Influenza, no es práctico con la tecnología. En general, los enfoques de MRCA y COT no son prácticos para su aplicación a la compleja base de datos de secuencias de influenza.
Un tercer tipo de análisis computacional es el enfoque de secuencia de consenso. Debido a que la secuencia de consenso está compuesta por el aminoácido que se observa con mayor frecuencia en cada posición, probablemente representa el estado más adecuado del virus. Por tanto, la evasión eficaz de la respuesta inmunitaria mediante la selección de una secuencia divergente del consenso puede resultar en un virus menos apto desde un punto de vista replicativo. El enfoque de la secuencia de consenso favorece los sublinajes muy muestreados y minimiza los valores atípicos. Como tal, los enfoques utilizados en la presente memoria son mucho más sencillos que los otros tipos de análisis computacionales. Adicionalmente, estos enfoques pueden utilizar todo el conjunto de datos para RSV. Una ventaja de la secuencia de consenso es que minimiza las diferencias genéticas entre las cepas de vacuna y los aislados contemporáneos, reduciendo efectivamente el alcance de la diversidad a la mitad y, por lo tanto, puede tener un mayor potencial para provocar respuestas de reactividad cruzada.
Diseño de vacuna
Para diseñar el antígeno de la vacuna de la presente invención, se recuperaron secuencias de proteínas de las proteínas F0-, N- y M2-1- del RSV de la base de datos de Fuente r Sv del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Las secuencias de proteínas se eligieron de diferentes cepas de subtipo A de RSV.
Se derivó una secuencia consenso F0 por alineación de todas las secuencias no idénticas de la proteína F utilizando MUSCLE versión 3.6 y aplicando la regla de la mayoría. La secuencia de consenso F0 de la vacuna se diseñó sobre la base del alineamiento de las diferentes secuencias de RSV. La similitud de secuencia de la secuencia F0 consenso de la vacuna se midió mediante el análisis BLAST, que significa Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica y está disponible públicamente a través del NCBI. La similitud promedio más alta de la secuencia consenso, calculada en comparación con todas las secuencias de RSV en la base de datos, fue del 100 % con respecto a la cepa A2 del virus sincitial respiratorio humano.
Adicionalmente, la secuencia F0 de la vacuna carece de la región de transmembrana que reside en los aminoácidos 525 a 574 para permitir la secreción de F0ATM.
Finalmente, se optimizó el codón de la secuencia F0ATM de la vacuna para la expresión en células eucariotas.
La secuencia de consenso N de la vacuna se derivó por alineación de todas las secuencias no idénticas de la proteína N utilizando MUSCLE versión 3.6 y aplicando la regla de la mayoría. El análisis BLAST de la secuencia consenso de N encontró la mejor alineación con la cepa A2 del virus sincitial respiratorio humano. A continuación, se optimizó el codón de la secuencia N de la vacuna para la expresión en células eucariotas.
Se derivó una secuencia consenso M2-1 por alineación de todas las secuencias no idénticas de la proteína M2-1 utilizando MUSCLE versión 3.6 y aplicando la regla de la mayoría. El análisis BLAST de la secuencia consenso M2-1 encontró la mejor alineación con la cepa A2 del virus sincitial respiratorio humano. Por último, se optimizó el codón de la secuencia de la vacuna M2-1 para expresión en células eucariotas.
La secuencia F0ATM y la secuencia N de las vacunas estaban espaciadas por la secuencia de escisión 2A del virus de la Fiebre Aftosa. La secuencia N de las vacunas y la secuencia M2-1 se separaron mediante un ligador flexible (GGGSGGG; SEQ ID NO: 6).
Finalmente, los genes virales optimizados por codones se clonaron como el marco de lectura abierto único F0ATM-N-M2-1. En la Fig. 1 se proporciona un diagrama esquemático de la composición del antígeno.
Generación de plásmidos de ADN que codifican F0ATM y F0ATM-N-M2-1
Las secuencias Consensus F0ATM, N y M2-1 se optimizaron para la expresión en mamíferos, que incluye la adición de una secuencia de Kozak y la optimización de codones. La secuencia de ADN que codifica la vacuna de múltiples antígenos se sintetizó químicamente y luego se subclonó mediante enzimas de restricción adecuadas EcoRV y NotI en el vector lanzadera pVJTetOCMV bajo el control del promotor de CMV.
Generación de la vacuna contra el RSV vectorizada por virus PanAd3
Se generó una vacuna de RSV de vector viral PanAd3/F0ATM-N-M2-1 que contiene una poliproteína de 809 aa que codifica las proteínas consenso F0ATM, N y M2-1 fusionadas por un ligador flexible.
El adenovirus de bonobo tipo 3 (PanAd3) es una nueva cepa de adenovirus con seroprevalencia mejorada y se ha descrito previamente.
La clonación de F0ATM-N-M2-1 a partir del vector plásmido pVJTetOCMV/F0ATM-N-M2-1 en el vector PanAd3 pre-Adeno se realizó al cortar las secuencias de antígeno flanqueadas por regiones homólogas y recombinación enzimática in vitro.
Análisis de la expresión de antígenos en células de mamíferos.
Para controlar que la combinación única de antígenos virales se expresara eficazmente y se procesara correctamente en células de mamífero, se transfectaron células Hela con 10 pg de plásmido de ADN que codifica el antígeno F0ATM-N-M2-1. Las células se cultivaron durante 36 horas antes de que se recogiera el sobrenadante y se prepararan los lisados celulares. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a filtros de nylon. Se usó un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb8) generado contra la proteína viral M (obsequio de la Dra. Geraldine Taylor) para revelar las proteínas expresadas.
Como se muestra en las Fig. 2 y 3, la proteína vírica fusionada N-M2-1 se libera muy eficazmente de la poliproteína por el sitio de escisión 2A y se reconoce como una banda principal por mAb8. Muy pocos precursores de alto peso molecular están presentes en estado estacionario en las células. Como control se utilizaron lisados de células Hep2 infectadas con la cepa A de RSV.
La SDS-PAGE no reductora y el análisis de transferencia Western del medio de cultivo celular mostraron que la proteína F eliminada de la región de transmembrana se secreta en el sobrenadante (ver Fig. 3, columna RSV). El peso molecular de la proteína F en el sobrenadante es consistente con la proteína F homotrimérica, que es su configuración nativa.
Ejemplo 2: Inmunogenicidad de la vacuna en ratones
Anticuerpos anti-F mediante inmunización con ADN
Se utilizaron plásmidos de ADN que codifican F0ATM-N-M2-1 o F0ATM solos para inmunizar ratones mediante inyección de plásmido de ADN y electroporación (GET) con un régimen de cebado y refuerzo a las tres semanas después del cebado. Se recogieron sueros de ratones inmunizados dos semanas después de la dosis de refuerzo y se combinaron.
Los sobrenadantes de células Hela infectadas con PanAd3/F0ATM-N-M2-1 a MOI 250 se separaron sobre SDS-PAGE no reductor, se transfirieron a filtros de nailon y se sondaron con diferentes diluciones de sueros de ratones inmunizados con F0ATM o F0ATM- N-M2-1.
Como se muestra en la Fig. 4A y B, los títulos de anticuerpos generados por la proteína F expresada en el contexto del antígeno de la vacuna son al menos 30 veces mayores que los provocados por la proteína F sola. Por tanto, el antígeno F0ATM-N-M2-1 tiene propiedades inmunogénicas superiores para inducir respuestas de células B en ratones.
Respuesta de células T
Se evaluó en ratones la potencia inmunológica del vector adenoviral de chimpancé PanAd3 que lleva el antígeno de la vacuna contra RSV F0ATM-N-M2-1.
Se inmunizaron grupos de ratones Balb/C mediante inyección intramuscular en el cuádriceps con una dosis creciente de PanAd3/F0ATM-N-M2-1. 4 semanas después de la vacunación, se sacrificaron los ratones y los esplenocitos se sometieron a ensayo IPNY-Elispot utilizando péptidos inmunodominantes mapeados de las proteínas F y M del RSV (péptido GWYTSVITIELSNIKE (F aa 51-66), péptido KYKNAVTEL (F aa 85-93) y péptido SYIGSINNI (M aa 282-290)). Como se muestra en la Fig. 5, se observó una potente respuesta de células T contra epítopos inmunodominantes Balb/C conocidos contra proteínas F y M de RSV.
Ejemplos que no forman parte de la invención reivindicada
Ejemplo 3: Inducción de anticuerpos neutralizantes por H1p
La nueva proteína H1p quimérica diseñada para contener el sitio de escisión HA0 multibásico de H5N1 se expresa eficazmente y se escinde completamente en células HeLa transfectadas. La proteína equivalente con el sitio de escisión de tipo silvestre, H1, no se escinde en las células HeLa, como se muestra en la Fig. 7.
Para controlar que la proteína H1p quimérica se muestre correctamente sobre la membrana celular, se ha realizado un ensayo de unión de FACS de célula completa utilizando un suero policlonal anti-HA para revelar la proteína transfectada sobre la superficie celular. Como se muestra en la Figura 8, H1p se expone en la membrana celular de manera tan eficiente como la correspondiente proteína de HA de tipo silvestre.
Para medir la potencia inmunológica de H1p, se inmunizaron ratones Balb/C con vectores de ADN plasmídico que codifican la H1p modificada y la H1 no modificada (PVJ-H1p y PVJ-H1, respectivamente). Los sueros de animales inmunizados se analizaron mediante ELISA en proteína de HA recombinante purificada (H1N1 Califomia2009). Los títulos de anti-HA provocados por la proteína H1p modificada fueron sorprendentemente más altos que los provocados por la HA que lleva el sitio de escisión de la proteasa de tipo silvestre (Fig. 9).
Para confirmar y ampliar estos resultados, se probó la capacidad de los sueros de animales inmunizados con H1 y H1p para neutralizar la infección de vectores retrovirales pseudotipados con la proteína Flu HA en un ensayo basado en cultivo celular. Los pseudoviriones son infecciosos para un solo ciclo de infección en el que expresan el gen indicador luciferasa. La Fig. 10 muestra la capacidad de neutralización del suero en un ensayo de infección por partículas de virus pseudotipadas de HA (H1N1Mexico2009) en células MDCK. El resultado confirma que los anticuerpos provocados por H1p tienen una mayor actividad neutralizante que aquellos inducidos por la proteína H1.
Ejemplo 4: Título de anticuerpos potenciado por una poliproteína que comprende NP, M1 y H1p
La comparación directa de la potencia inmunológica de H1p y NPM1H1p reveló que la proteína de HA expresada en el contexto del antígeno triple induce un título de anticuerpos más alto que la HA sola. La Fig. 11 muestra los resultados de un ensayo ELISA en el que se recubrió HA recombinante (H1N1 California 2009) sobre el fondo de una placa de 96 pocillos. Se colocaron en la placa diluciones seriadas de sueros de animales inmunizados con H1p y NPM1H1p y se reveló la IgG unida con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón. Como ya se ha observado para el antígeno RSV, la coexpresión de antígenos internos (NP y M1) con el antígeno de superficie expuesta (HA) mejora la respuesta humoral dirigida a esta última proteína.
Ejemplo 5: Procesamiento del nuevo antígeno FLU compuesto por NP, M1 y H1p
Para controlar la expresión y el procesamiento de las proteínas del antígeno de la vacuna, se han transfectado células HeLa con un plásmido de expresión que contiene NPM1H1p bajo el control del promotor de CMV. Las células se recolectaron 48 horas después de la transfección. La mitad de las células se lisaron para el análisis de transferencia Western (Fig. 12) y la mitad se incubó con un anticuerpo C179 disponible comercialmente (Okuno Y, JVI 1994), que se une a la región madre de la proteína de HA (Fig. 13) y se analizó mediante FACS. El análisis de transferencia Western del lisado celular total muestra una banda única de 70 kDa que corresponde a la proteína de fusión NPM1 (Fig. 12). Esto indica que el antígeno se procesa completa y correctamente fuera del sitio de escisión 2A. La Fig. 13 muestra que la proteína H1p liberada se muestra luego sobre la membrana celular y se pliega correctamente, según se detecta mediante el uso de un anticuerpo C179 dependiente de la conformación que se une a la región madre de HA. De acuerdo con lo anterior, el nuevo antígeno FLU compuesto por NP, M1 y H1p se procesa correctamente y la proteína de HA liberada se muestra sobre la superficie celular y es reconocida por un anticuerpo conformacional. Referencias
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un sistema de expresión que comprende un vector viral de adenovirus que comprende polinucleótidos que codifican proteínas de pneumovirus, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el sistema de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, un segundo polinucleótido que codifica al menos una proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, y un tercer polinucleótido que codifica una proteína o péptido que induce una respuesta de células T, en la que:
el pneumovirus es virus sincitial respiratorio humano (RSV);
la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el primer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV seleccionada del grupo que consiste en proteínas de Matriz M y M2;
la proteína o péptido que induce una respuesta antipatogénica de células B, codificada por el segundo polinucleótido, es una proteína estructural y/o de superficie de RSV que es la proteína de fusión (F);
la proteína o péptido que induce una respuesta de células T, codificada por el tercer polinucleótido, es una proteína no estructural y/o interna de RSV que es la nucleoproteína N; y
en la que el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido se ligan de tal manera que se expresan como una poliproteína artificial.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que un polinucleótido que codifica un sitio de escisión se posiciona entre el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido.
3. La composición de la reivindicación 2, en la que el sitio de escisión es un sitio de autoescisión o un sitio de escisión de endopeptidasa, en el que el sitio de autoescisión se selecciona del grupo que consiste en un péptido 2A viral o péptido similar a 2A de Picornavirus, virus de insectos, Aphtoviridae, Rotaviruses y Trypanosoma.
4. La composición de la reivindicación 3 en la que el sitio de escisión 2A es el péptido 2A del virus de la fiebre aftosa.
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que un polinucleótido que codifica un ligador, tal como un ligador flexible, se posiciona entre el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido.
6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la poliproteína codificada por el primer, el segundo y el tercer polinucleótido tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 7.
7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el vector viral se selecciona del grupo que consiste en PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd 73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82.
8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un ingrediente activo adicional, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en un adyuvante y un ingrediente activo.
9. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.
10. La composición, para el uso de la reivindicación 9, en la que la enfermedad es una enfermedad provocada por infección de RSV.
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