KR20130132894A - 발현 시스템 - Google Patents

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알프레도 니코시아
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오카이로스 아게
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Abstract

단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이며, 여기에서 발현 시스템은 T 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명은 추가로, 상기 발현 시스템에 의해 암호화된 단백질 혼합물, 및 상기 발현 시스템 또는 단백질 혼합물을 포함하는 세포, 및 상기 발현 시스템 또는 단백질 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 발현 시스템, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 세포 및 약제학적 조성물은 감염의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명은 추가로, 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 구성되는 뉴클레오타이드 구조물에 관한 것이다.

Description

발현 시스템{EXPRESSION SYSTEMS}
본 발명은 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이며, 여기에서 발현 시스템은 T 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 발현 시스템에 의해 암호화된 단백질 혼합물, 및 상기 발현 시스템 또는 단백질 혼합물을 포함하는 세포 및 상기 발현 시스템 또는 단백질 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 발현 시스템, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 세포, 및 약제학적 조성물은 감염의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명은 추가로, 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화한 뉴클레오타이드 구조물 및 발현 시스템에 관한 것이다.
감염성 질환은 여전히 인류의 주된 맥락이다. 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 한가지 방법은 각각의 항원에 대한 적응성 면역 반응이 발생하도록 개체에게 항원성 물질을 투여하는 백신 접종에 의한 면역반응의 인공적 유도이다. 항원성 물질은 구조적으로 완전하지만 불활성화 (즉, 비-감염성)되거나, 매우 면역원성인 것으로 확인된 약독화되거나 (즉, 감소된 감염성을 가짐), 정제된 성분인 병원체 (예를 들어, 미생물 또는 바이러스)이다. 병원체에 대한 면역반응을 유도하기 위한 다른 접근법은 병원체의 면역원성 단백질 또는 펩타이드를 암호화한 하나 이상의 벡터를 포함하는 발현 시스템의 제공이다. 이러한 벡터는 네이키드 플라스미드 (naked plasmid) DNA의 형태일 수 있거나, 면역원성 단백질 또는 펩타이드는 예를 들어, 변형된 백시니아 바이러스 (예를 들어, 변형된 백시니아 안카라 (Modified Vaccinia Ankara); MVA)를 기초로 하는 바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터를 사용함으로써 송달된다. 이러한 발현 시스템은 환경적 조건에 대해서 낮은 민감성을 갖는 잘-특정화된 성분을 포함한다는 이점을 갖는다.
벡터를 기본으로 하는 발현 시스템을 개발하는 경우의 특별한 목적은 환자에 대한 이들 발현 시스템의 적용이 각각의 병원체에 의한 감염에 대해서 방어적인 면역반응을 유발하는 것이다. 그러나, 비록 병원체에 대한 면역원성 반응을 유도하더라도, 일부의 발현 시스템은 병원체에 의한 감염을 완전히 방어하는데 충분히 강력한 면역반응을 유발할 수 없다. 따라서, 병원체, 예를 들어, 바이러스와 같은 감염제에 대한 방어적 면역반응을 유도할 수 있는 발현 시스템에 대한 필요성이 여전하다.
바이러스
바이러스는 그 자신의 대사를 갖지 않고, 바이러스 단백질 발현 및 바이러스 복제를 수행하기 위해서 숙주의 세포 설비의 적어도 일부분을 사용하는 각각의 숙주 세포의 의무적 내부기생충의 그룹으로서 고려될 수 있다. 바이러스는 그들의 게놈을 구성하는 핵산의 타입 (DNA/RNA), 가닥 (strandedness) (단일-가닥 (ss) 또는 이중-가닥 (ds)), 센스 (음성 센스 또는 양성 센스), 및 그들의 복제 (발티모어 (Baltimore) 분류)를 기초로 하여 분류될 수 있다. 따라서, 바이러스는 일반적으로 DNA 및 RNA 바이러스로 분류된다. 바이러스는 게놈이 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산인 단일-가닥 (ss) 또는 이중-가닥 (ds) DNA 또는 RNA 바이러스로 더 분류될 수 있다. 일부의 바이러스는 부분적으로 이중-가닥되고, 부분적으로 단일-가닥된 게놈을 갖는다 (예를 들어, 헤파드나바이러스 (hepadnaviruses)). 게놈 및/또는 병원체의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 및/또는 병원체의 예방 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의 배향 또는 "센스"에 있어서, 병원체는 바이러스의 바이러스 수명 주기, 특히 ssRNA 바이러스 또는 ssDNA 바이러스의 수명 주기에 있어서 중요한 역할을 한다. 양성 센스 ssRNA (+) 게놈은 세포 mRNA와 동일한 배향을 가지며, 바이러스 단백질로 직접 번역될 수 있다. 음성 센스 단일-가닥 RNA 게놈 (ssRNA (-))을 갖는 바이러스의 수명 주기에 있어서, 게놈 서열은 숙주 세포에 의해서 바이러스 단백질로 번역될 수 있는 양성 센스 mRNA로 전사되는 것이 필요하다. 양성-센스 및 음성-센스 둘 다를 함유하는 단일-가닥 게놈은 "암비센스 (ambisense)"라 불린다 (예를 들어, ssRNA (+/-), ssDNA(+/-)).
바이러스의 게놈은 매우 클 수 있지만 (예를 들어, DNA 바이러스의 경우에), 특히 작은 RNA 바이러스는 매우 효율적인 방식으로 그들의 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질 및 펩타이드)을 발현하는 진화적으로 개발된 전략을 갖는다. 이들 전략 중의 하나는 단일 단백질 및/또는 펩타이드로 동시-번역 또는 번역 후 처리된, 바이러스 게놈에 의해 암호화된 하나 이상의 다단백질의 발현이다. 이 전략은 예를 들어, 양성 센스 게놈을 갖는 일부의 이중-가닥 (ds) RNA 바이러스 또는 단일-가닥 (ss) RNA 바이러스에 의해서 적용된다. 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 레트로바이러스, 플라비바이러스, 라브도바이러스 및 알파바이러스와 같은 "외피 (enveloped) 바이러스"는 숙주 원형질막으로부터 유래하는 지질 이중층에 의해서 둘러싸인다 (1).
부착 당단백질은 모든 외피 바이러스에서 발견되며, 숙주 세포의 원형질막 상의 탄수화물 부분 또는 단백질 또는 다른 분자의 세포 부착 영역에 대한 그들의 연결을 통해서 바이러스 외피와 숙주 세포의 원형질막 사이의 초기 상호작용을 매개한다. 이에 의해서, 부착 당단백질은 바이러스와 숙주 세포의 막 사이의 갭 (gap)을 메운다. "H"로 지정된 부착 당단백질은 헤마글루티닌 활성을 가지며, "HN"으로 지정된 당단백질은 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 활성을 갖는다. 부착 당단백질은 이들이 헤마글루티닌 활성도 뉴라미니다제 활성도 갖지 않는 경우에 "G"로 지정된다.
파라믹소바이러스
파라믹소바이러스는 단일 가닥된 비-분절화 음성-센스 RNA를 포함하는 동물 바이러스의 패밀리이다. 파라믹소바이러스는 다수의 동물 및 인간 질병의 원인이 된다. 파라믹소바이러스의 RNA 게놈은 길이가 15-19 킬로 염기 (kb)이며, 6-10 개의 유전자를 암호화한다. 각각의 유전자는 시작 부위 및 말단에서, 유전자의 일부분으로 전사되는 전사 개시/정지 시그날을 함유한다. 유전자 서열은 전사 극성 (transcriptional polarity)으로 알려진 현상에 기인하여 파라믹소바이러스 전체에 걸쳐서 보존되는데, 여기에서는 게놈의 3' 말단에 가장 근접한 유전자가 5' 말단 쪽의 것보다 훨씬 더 풍부하게 전사된다. 각각의 유전자가 전사된 후에, RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 이것이 유전자간 서열과 만나는 경우에는 새로운 mRNA를 방출하도록 정지한다. RNA 폴리머라제가 정지되면, 이것이 RNA 게놈으로부터 해리할 가능성이 있다. 이것이 해리하면, 이것은 게놈의 길이를 계속해서 전사하기보다는 리더 (leader) 서열에서 게놈에 다시 들어가야 한다. 그 결과로, 추가의 하류 유전자가 리더 서열로부터 유래하며, 이들은 RNA 폴리머라제에 의해서 더 적게 전사될 것이다. 파라믹소바이러스의 유전자는 성공적인 감염에 필요한 단백질의 상대적 순서로 정렬된다. 보존된 유전자 서열은 뉴클레오캡시드 - 인단백질 - 매트릭스 - 융합 - 부착 - 대형 (폴리머라제)이다.
다수의 파라믹소바이러스 게놈은 소위 "6의 규칙 (Rule of Six)"에 따른다. 이 규칙에 따르면, 게놈의 총 길이는 거의 항상 6의 배수이다. 그러나, 호흡기 합포체 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus (RSV))를 포함한 서브-패밀리 뉴모비리나에 (Pneumovirinae)의 구성원은 이 규칙을 따르지 않는다.
호흡기 합포체 바이러스 ( RSV )
호흡기 합포체 바이러스 (RSV)로 지정된 외피 바이러스는 세계적으로 유아 및 소아에게서 바이러스성 하기도 질병 (LRTI)의 가장 중요한 원인이다 (2). 미국에서는, 70,000-126,000 명의 유아가 매년 RSV 폐렴 또는 기관지염으로 입원하며, 기관지염에 대한 입원율은 1980년 이래로 증가한 것으로 추정되었다 (3). 소아는 2세까지 감염되며, WHO는 RSV가 매년 약 6400만 명의 소아에게서 질병을 야기하고, 160,000 명의 사망을 야기하는 것으로 추정하였다. 산업화된 국가에서, RSV는 소아의 호흡기 질환으로 인한 입원의 적어도 50%에 대해 책임이 있으며, 소아에게서의 모든 RSV 감염의 6%까지는 입원을 야기한다 (4). RSV 감염은 지속적인 면역성을 유발하지 않아서 인간 숙주는 감염 및 재감염의 평생의 사이클을 경험한다. 이것은 전통적으로 소아과 병원체로 간주되지만, RSV는 또한 노인 및 면역-손상된 개체에게서 심각한 질병을 야기한다 (5). 노인에서의 RSV 질병의 부담은 계절성 인플루엔자의 경우에 필적하며, 성인에서의 RSV-관련된 질병의 경제적 충격은 일을 못한 일수에 관해서 인플루엔자의 경우보다 더 큰 것으로 추정된다 (6, 7). 모노클로날 항체 예방은 심각한 질병의 위험이 큰 유아에게서 50%까지 RSV 입원을 감소시키는데 효과적이다 (8). 그러나, 현재 효과적인 RSV 백신 또는 항바이러스 요법은 없다.
1960년대에 유아에게서 포르말린-불활성화된 (FI) RSV 백신의 비참한 효과는 백신 개발을 방해하였다. 백신은 RSV 감염으로부터 보호하는데 실패하였으며, 높은 역가의 유도, 열등한 중화, 저친화성 항체, CD8+ T 세포 프라이밍 (priming)의 결여 및 Th2-편향 면역반응의 유도에 기인하여 (10, 11, 및 12) 악화된 호흡기 질병을 유도하였다 (9). RSV가 적절한 적응성 T 세포 면역반응의 유도를 손상시킨다는 증거가 있다 (13).
따라서, 유아를 보호할 뿐만 아니라 노인에게서 면역성을 신장시키고, 유아에 대한 RSV 감염의 주된 공급원인 형제 및 성인에게서 RSV의 순환을 감소시키는데 효과적인 백신에 대한 분명한 필요성이 존재한다. 중화성 항체 반응, 및 RSV에 의해서 아직 감염되지 않은 개체 (유아)에게서 T 세포 반응을 프라이밍하거나, 기억 반응을 더 높은 레벨로 '재조정 (reset)'하는 것이 필요한 개체에게서 기존의 T 세포 반응을 신장시키기 위한 강력하고 광범한 T 세포 반응을 유도할 수 있는 RSV 백신이 특히 바람직하다.
오르토믹소바이러스
오르토믹소바이러스는 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 이사바이러스 (Isavirus) 및 토고토바이러스 (Thogotovirus)의 5 가지 속을 포함하는 RNA 바이러스의 패밀리이다. 여섯 번째 속은 최근에 기술되었다. 처음 3 개의 속은 조류, 인간 및 그 밖의 다른 포유동물을 포함한 척추동물 문에서 인플루엔자를 야기하는 바이러스를 함유한다. 인플루엔자 바이러스의 3 개의 속은 그들의 핵단백질 및 매트릭스 단백질에 있어서 항원적 차이를 갖는다. 인플루엔자바이러스 A는 인간, 그 밖의 다른 포유동물 및 조류를 감염시키며, 모든 인플루엔자 유행병을 야기한다. 인플루엔자바이러스 B는 인간 및 물개를 감염시킨다. 인플루엔자바이러스 C는 인간 및 돼지를 감염시킨다.
오르토믹소바이러스 패밀리의 바이러스는 선형의 음성-센스 단일 가닥 RNA의 6 내지 8 개의 분절을 함유한다. 전체 게놈 길이는 12000-15000 뉴클레오타이드 (nt)이다. 최대 분절은 2300-2500 nt이고; 두 번째로 큰 것은 2300-2500 nt이고; 세 번째는 2200-2300 nt이며; 네 번째는 1700-1800 nt이고; 다섯 번째로 큰 것은 1500-1600 nt이며; 여섯 번째로 큰 것은 1400-1500 nt이고; 일곱 번째는 1000-1100 nt이며; 여덟 번째는 800-900 nt이다. 게놈 서열은 말단 반복 서열을 가지며; 양 말단에서 반복된다. 5'-말단에서의 말단 반복부위는 길이가 12-13 뉴클레오타이드이다. 3'-말단의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 패밀리의 속에서, 대부분의 RNA (분절) 상에서, 또는 모든 RNA 종에서 동일하다. 3'-말단에서의 말단 반복부위는 길이가 9-11 뉴클레오타이드이다.
인플루엔자 바이러스는 가장 중요한 호흡기 병원체 중의 하나이다. 미국에서만도, 인플루엔자 감염은 매년 20,000-40,000 명의 사망 및 100,000 명 이상의 입원에 책임이 있다 (1). 유아, 노인, 및 손상된 심장, 폐 또는 면역 시스템을 갖는 개체는 유행성 감기 감염 후의 심각한 합병증의 큰 위험을 갖는다.
면역법은 질병을 예방하는데 가장 효과적인 수단임을 입증한다. 현재의 모든 인플루엔자 백신이 공유하는 공통적인 특징 중의 하나는 일차적으로, 주된 바이러스 외피 단백질인 헤마글루티닌 (HA)에 대해 향해지는 중화 항체의 유도를 표적화하는데 있다.
발명의 요약
본 발명은 첫 번째 관점에서 T 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템을 제공한다.
두 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템에 의해 암호화된 분리된 단백질 혼합물을 제공한다.
세 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템 및/또는 두 번째 관점의 단백질 혼합물을 함유하는 분리된 숙주 세포를 제공한다.
네 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템, 또는 두 번째 관점의 단백질 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
다섯 번째 관점에서, 본 발명은 의약에서, 특히 감염성 질환, 바람직하게는 바이러스성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 첫 번째 관점의 발현 시스템, 두 번째 관점의 단백질 혼합물, 세 번째 관점의 세포 및 네 번째 관점의 조성물을 제공한다.
여섯 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템, 두 번째 관점의 단백질 혼합물, 세 번째 관점의 세포 및 네 번째 관점의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 바이러스성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일곱 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템, 두 번째 관점의 단백질 혼합물, 세 번째 관점의 세포 및 네 번째 관점의 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다.
여덟 번째 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화한 뉴클레오타이드 구조물, 이들 뉴클레오타이드 구조물을 포함하는 발현 시스템, 및 상기 뉴클레오타이드 구조물 또는 발현 시스템에 의해 암호화된 단백질 또는 다단백질을 제공하며, 여기에서 HA0 절단 부위는 다염기성 서열을 갖는다.
아홉 번째 관점에서, 본 발명은 시험관내 및/또는 생체내에서 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 발현할 수 있는 발현 시스템을 구성하기 위한 다염기성 HA0 절단 부위의 용도를 제공한다.
열 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 발현 시스템에 의해 암호화된 분리된 단백질 혼합물을 제공한다.
열한 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질 및/또는 열 번째 관점의 단백질 혼합물을 함유하는 분리된 숙주 세포를 제공한다.
열두 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 또는 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
열세 번째 관점에서, 본 발명은 의약에서, 특히 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 열한 번째 관점의 세포 및 열두 번째 관점의 조성물을 제공한다.
열네 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 열한 번째 관점의 세포 및 열두 번째 관점의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
열다섯 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 열한 번째 관점의 세포 및 열두 번째 관점의 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다.
상기의 요약은 물론 본 발명의 모든 관점을 기술한 것은 아니다.
도 1은 RSV 백신 다단백질의 개략도이다. conF0 = F 단백질의 공통 서열, 2A = 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease virus)의 번역 절단 부위, conN = N 단백질의 공통 서열, conM2-1 = M2-1 단백질의 공통 서열.
도 2는 백신 항원 F0ΔTM-N-M2-1이 포유동물 세포에서 효율적으로 처리됨을 나타낸다. HeLa 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블럿 분석; nt: 감염되지 않은 Hela. RSV transf: F0ΔTM-N-M2-1에 의해서 형질감염된 HeLa 세포. RSV inf: RSV 스트레인 A에 의해서 감염된 Hep2 세포.
도 3은 분비된 F 단백질이 호모트라이머 (homotrimer)를 형성함을 나타낸다. 형질감염된 HeLa 세포로부터의 상등액의 웨스턴 블럿 분석; RSV: F0ΔTM-N-M2-1 형질감염됨, F0: F0ΔTM 형질감염됨, Ctrl: 빈 플라스미드 형질감염됨.
도 4는 백신 다단백질로부터 발현된 F 단백질이 F 단백질 단독인 경우보다 더 우수한 면역원임을 나타낸다. A. F0ΔTM 또는 F0ΔTM-N-M2-1에 의해서 면역화된 마우스로부터의 혈청의 다양한 희석액으로 프로브화된 PanAd3/ F0ΔTM-N-M2-1에 의해서 감염된 HeLa 세포로부터의 상등액의 웨스턴 블럿 분석. B. 패널 A 상의 웨스턴 블럿의 밀도측정 스캐닝 (densitometric scanning). 데이터는 단백질 밴드에 해당하는 면적의 상대적 강도로 표현된다.
도 5는 RSV 백신이 단일 근육내 주사에 의해 마우스에서 강력한 전신적 T 세포 면역성을 유도하였음을 나타낸다. RSV F 및 M 단백질로부터의 맵핑된 (mapped) 면역우성 펩타이드를 사용한 PanAd3/ F0ΔTM-N-M2-1 면역된 Balb/C 마우스의 비장세포의 IFNg-엘리스포트 (Elispot) 시험.
도 6은 인플루엔자 백신 다단백질의 개략도이다. NP = NP 단백질의 공통 서열, M1= M1 단백질의 공통 서열, 2A = 구제역 바이러스의 번역 절단 부위, H1p = H1N12009로부터의 HA 단백질의 공통 서열.
도 7은 형질감염된 HeLa 세포에서 H1p 발현의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. PVJ-H1p (레인 1) 및 PVJ-H1 (레인 2)에 의해서 형질감염 및 CTR에 의해서 형질감염되지 않은 (레인 3) HeLa 세포의 전체 용해물. 화살표는 절단되지 않은 (70kD) HA0 형태 및 절단된 (28 Kd) HA2에 해당하는 밴드를 나타낸다. 폴리클로날 항-HA 혈청은 HA2 단백질 단편 내의 에피토프를 인식한다. 이것은 H1p 단백질이 완전히 처리됨을 나타낸다.
도 8은 막-표시된 HA 단백질의 전세포 FACS 분석을 나타낸다. 히스토그램 (histograms)은 야생형 HA (우측 상단 패널) 및 H1 (우측 하단 패널)에 의해서 형질감염된 HeLa 세포의 중앙 형광분석 (median fluorescence analysis)을 나타낸다. 세포를 H1p에 대항하여 발생된 고도면역 (hyperimmune) 마우스 폴리클로날 혈청과 함께 배양한 다음에, 이차 항-마우스 항체 PE-컨주게이트와 함께 배양하였다. 좌측 상단 및 하단 패널에서는, 세포를 마우스 전-면역 혈청과 함께 배양하여 배경 형광 레벨을 설정하였다.
도 9는 H1p이 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있음을 나타낸다. 코팅된 재조합 HA 상에서의 ELISA 시험 (H1N1California 2009). 항체 역가는 H1 및 H1p에 의해서 면역된 동물로부터의 혈청 상에서 측정되었다. 역가는 혈청의 계열 희석에 의해서 계산되었으며, 배경보다 3 배 더 큰 OD 값을 제공하는 희석액을 나타낸다.
도 10은 MDCK 세포의 HA (H1N1Mexico2009) 위형(pseudotyped) 바이러스 감염이 H1p로 면역된 동물의 혈청에 의해서 더 강력하게 중화됨을 나타낸다. H1p 및 NPM1H1p로 면역된 동물의 혈청에 의한 코팅된 재조합 HA (H1N1California 2009) 상에서의 ELISA 시험의 결과.
도 11은 삼중 항원의 맥락에서 발현된 H1p이 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있음을 나타낸다. 코팅된 재조합 HA (H1N1California 2009) 상에서의 ELISA 시험. 항체 역가는 H1p 및 NPM1H1p로 면역된 동물로부터의 혈청 상에서 측정되었다. 역가는 혈청의 계열 희석에 의해서 계산되었으며, 배경보다 3 배 더 큰 OD 값을 제공하는 희석액을 나타낸다.
도 12는 형질감염된 HeLa 세포에서 NPM1H1p 항원 발현의 웨스턴 블럿 분석이 단백질이 완전히 처리되었음을 나타내는 것을 보여준다. pNEB-NPM1H1p (레인 1)로, 및 pNEB-NPM1 (레인 2)로 형질감염, 및 모의 형질감염된 (레인 3) HeLa 세포의 전체 용해물. 화살표는 융합 단백질 NPM1 (70kD)에 해당하는 밴드를 나타낸다. 모노클로날 항-NP 항체가 세포내 단백질을 검출하기 위해서 사용되었다.
도 13은 NPM1H1p의 처리로부터 유도된 H1p이 세포막 상에 표시되며, 정확하게 접혀짐을 나타낸다. 모의 형질감염되거나 (좌측 패널), NPM1H1p로 형질감염된 (우측 패널) HeLa 세포의 전세포 FACS 분석. 세포를 HA 줄기 부분 내의 배좌 에피토프 (conformational epitope)에 연결하는 마우스 mAb C179와 함께 배양한 다음에, 이차 항-마우스 항체 PE-컨주게이트와 함께 배양하였다.
이하에서 본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정한 방법, 프로토콜 및 시약들은 변화할 수 있기 때문에 이들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 구체예를 기술하기 위한 것이고, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술분야에서 통상의 기술을 갖는 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용된 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 명세서의 본문에는 전반을 통하여 몇 개의 문헌이 인용된다. 상기에서든 이하에서든 본 명세서에 인용된 각각의 문헌 (모든 특허, 특허출원, 과학 출판물, 제조자의 명세서, 설명서, GenBank 수탁번호 서열 제출서 등을 포함)은 그의 전체가 여기에서 참고로 포함된다. 여기에서는 어떤 것도 본 발명이 선행발명 때문에 이러한 기술내용 보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
본 명세서 및 이하의 특허청구범위 전체에 걸쳐서, 문맥이 다른 식으로 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다 (comprise)", 및 "포함한다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
약어 "F" 또는 "FO"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 파라믹소바이러스, 바람직하게는 RSV의 융합 단백질을 나타낸다.
약어 "G"는 파라믹소바이러스, 바람직하게는 뉴모비리나에, 더욱 바람직하게는 RSV의 당단백질을 나타낸다.
약어 "H"는 파라믹소바이러스, 바람직하게는 모빌리바이러스 (morbilli-viruses)의 헤마글루티닌 단백질을 나타낸다.
약어 "HN"은 파라믹소바이러스, 특히 레스피로바이러스 (Respirovirus), 아불라바이러스 (Avulavirus) 및 루불라바이러스 (Rubulavirus)의 헤마글루티닌-뉴라미니다제 단백질을 나타낸다.
약어 "N"은 파라믹소바이러스, 바람직하게는 RSV의 뉴클레오캡시드 단백질을 나타낸다.
약어 "M"은 파라믹소바이러스, 바람직하게는 RSV의 글리코실화된 매트릭스 단백질을 나타낸다.
파라믹소바이러스에 관하여, 약어 "M2" 또는 "M2-1"은 파라믹소바이러스, 바람직하게는 RSV의 비-글리코실화된 매트릭스 단백질을 나타낸다.
약어 "P"는 파라믹소바이러스, 바람직하게는 RSV의 인단백질을 나타낸다.
파라믹소바이러스에 관하여, 약어 "NS1" 및 "NS2"는 파라믹소바이러스, 바람직하게는 RSV의 비-구조 단백질 1 및 2를 나타낸다.
약어 "L"은 파라믹소바이러스, 바람직하게는 RSV의 폴리머라제의 촉매 아단위를 나타낸다.
약어 "HA"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 헤마글루티닌을 나타낸다.
약어 "HA0"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 헤마글루티닌 아단위 HA1 및 HA2의 전구체 단백질을 나타낸다.
약어 "H1p"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 변형된 헤마글루티닌을 나타낸다.
약어 "NA"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 뉴라미니다제를 나타낸다.
약어 "NP"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질을 나타낸다.
약어 "M1"은 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 매트릭스 단백질 1을 나타낸다.
오르토믹소바이러스에 관해서, 약어 "M2"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 매트릭스 단백질 M2를 나타낸다.
오르토믹소바이러스에 관해서, 약어 "NS1"은 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 비-구조 단백질 1을 나타낸다.
약어 "NS2/NEP"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 비-구조 단백질 2 (또한, NEP (nuclear export protein)로도 칭함)을 나타낸다.
약어 "PA"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 폴리머라제 아단위 단백질을 나타낸다.
약어 "PB1"은 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 폴리머라제 아단위 단백질을 나타낸다.
약어 "PB2"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 폴리머라제 아단위 단백질을 나타낸다.
약어 "PB1-F2" 또는 "PB1F2"는 오르토믹소바이러스, 바람직하게는 인플루엔자바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 PB1 유전자 분절 내의 대체 (alternate) 판독 프레임에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "발현 시스템"은 관심이 있는 하나 이상의 유전자 생성물을 생산하도록 디자인된 시스템을 나타낸다. 전형적으로, 이러한 시스템은 "인공적으로", 즉 시험관내 무-세포 시스템에서 또는 생체내 세포-기반 시스템에서 관심이 있는 유전자 생성물을 생산하는데 사용될 수 있는 유전자-기술적 방법에 의해서 디자인된다. 예를 들어, 천연의 바이러스와 같은 천연적으로 존재하는 발현 시스템은 본 발명의 발현 시스템에 포함되지 않는 것으로 이해된다.
용어 "관심이 있는 유전자 생성물"은 전형적으로 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질, 또는 이들의 분절, 에피토프 또는 단편과 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 거대분자를 나타낸다.
발현 시스템에서 관심이 있는 유전자 생성물은 하나 이상의 핵산 분자에 의해 암호화된다. 핵산 분자는 뉴클레오타이드 모노머로부터 만들어진 폴리머성 거대분자로 이해된다. 뉴클레오타이드 모노머는 핵염기, 5탄당 (예를 들어, 리보즈 또는 2'-데옥시리보즈, 단 이들로 제한되지 않는다), 및 1 내지 3 개의 포스페이트 그룹으로 구성된다. 전형적으로, 폴리뉴클레오타이드는 개별적인 뉴클레오타이드 모노머 사이의 포스포디에스테르 결합을 통해서 형성된다. 본 발명과 관련하여, 핵산 분자는 리보핵산 (RNA) 및 데옥시리보핵산 (DNA)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 본 명세서에서 상호교환하여 사용된다.
무-세포 발현 시스템에서는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 시험관내 번역 반응을 위한 주형으로 사용된다. 세포-기반 발현 시스템에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터 상에 포함된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"는 세포 내로 도입될 수 있거나 그 안에 포함된 단백질 및/또는 핵산을 세포 내로 도입시킬 수 있는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 혼합물을 나타낸다. 본 발명과 관련하여, 도입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 관심이 있는 유전자는 벡터 또는 벡터들의 도입에 의해 세포 내에서 발현되는 것이 바람직하다. 적합한 벡터의 예로는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 인공 염색체가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
문구 "T 세포 반응의 유도"는 바이러스 특이적 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 생성 또는 재자극을 나타낸다. 본 발명의 발현 시스템은 폴리뉴클레오타이드에 의해서 발현된 바이러스 단백질에 존재하는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 에피토프에 대한 T 세포 매개된 적응성 반응을 유도하거나 재자극할 수 있다. 이러한 T 세포 반응은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서, 바람직하게는 전체 바이러스 단백질에 걸친 합성 펩타이드에 의한 T 세포의 생체외 재자극 및 증식 또는 인터페론-감마 생산의 분석에 의해서 측정될 수 있다.
문구 "B 세포 반응의 유도"는 클래스 IgG 또는 IgA의 면역글로불린을 생산하는 바이러스 특이적 B 세포의 생성 및 재자극을 나타낸다. 본 발명의 발현 시스템은 폴리뉴클레오타이드에 의해서 발현된 병원성, 예를 들어, 바이러스성 항원에 대해서 특이적인 항체를 생산하는 B 세포를 유도하거나 재자극할 수 있다. 이러한 B 세포 반응은 혈청 또는 점막 면역글로불린의 합성 항원을 사용한 ELISA (Enzyme Linked Immuno Stained Assay) 시험에 의해서 측정될 수 있다. 대안적으로, 유도된 항체 역가를 바이러스 중화 시험에 의해서 측정할 수 있다.
문구 "항-병원성 B 세포 반응의 유도"는 병원체에 의해서 야기된 질병이 발생하지 않고/않거나 증상이 경감되도록 각각의 병원체를 불활성화시키고, 제거하고, 차단하고/하거나 중화시키는 클래스 IgG 또는 IgA의 면역글로불린을 생산하는 바이러스 특이적 B 세포의 생성 또는 재자극을 나타낸다. 이것은 또한, 병원체에 대한 "보호성 면역 반응"이라 불린다. 본 발명의 발현 시스템은 폴리뉴클레오타이드에 의해서 발현된 병원성, 예를 들어, 바이러스성 항원에 대해서 특이적인 항체를 생산하는 B 세포를 유도하거나 재자극할 수 있다. 이러한 B 세포 반응은 혈청 또는 점막 면역글로불린의 합성 항원을 사용한 ELISA (Enzyme Linked Immuno Stained Assay) 시험에 의해서 측정될 수 있다. 대안적으로, 유도된 항체 역가를 바이러스 중화 시험에 의해서 측정할 수 있다.
문구 "면역 반응을 증진"시키는 것은 면역원, 바람직하게는 병원체, 더욱 바람직하게는 바이러스에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 보강 또는 강화를 나타낸다. 면역 반응의 증진은 본 명세서에 기술된 시험 및/또는 본 기술분야에서 잘 알려진 시험을 사용하여 본 발명의 발현 시스템에 의해서 유발된 면역 반응을 동일한 항원/면역원만을 발현하는 발현 시스템의 면역 반응과 비교함으로써 측정될 수 있다.
발현 시스템에서, 관심이 있는 유전자는 단일 폴리뉴클레오타이드에 의해서, 또는 몇 개의 개별적인 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화될 수 있다. 세포-기반 발현 시스템에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 단일 또는 몇 개의 개별적인 벡터 상에 포함될 수 있다. 이들 폴리뉴클레오타이드의 각각은 관심이 있는 유전자 생성물의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있다.
또한, 발현 시스템은 관심이 있는 유전자의 발현을 조절하는 "발현 조절 서열"을 포함할 수 있다. 전형적으로, 발현 조절 서열은 프로모터, 인핸서 (enhancers), 사일런서 (silencers), 인슐레이터 (insulators) 또는 리프레서 (repressors)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다.
따라서, 하나 이상의 관심이 있는 유전자 생성물에 대해 암호화한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 추가의 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 관심이 있는 유전자 생성물에 대해 암호화한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에서, 발현은 하나 이상의 발현 조절 서열에 의해서 함께 또는 독립적으로 조절될 수 있다. 더욱 특히, 벡터 상에 포함된 각각의 폴리뉴클레오타이드는 개별적인 발현 조절 서열에 의해서 조절될 수 있거나, 벡터 상의 모든 폴리뉴클레오타이드는 단일 발현 조절 서열에 의해서 조절될 수 있다. 단일 발현 조절 서열에 의해서 조절된 단일 벡터 상에 포함된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 개방 판독 프레임 (open reading frame)을 형성한다.
용어 "발현 시스템"은 또한, 폴리뉴클레오타이드의 전사, RNA 스플리싱 (splicing), 폴리펩타이드로의 번역, 및 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역 후에 변형을 포함한 관심이 있는 유전자의 발현을 포함한다.
용어 "개방 판독 프레임" (ORF)은 아미노산으로 번역될 수 있는 뉴클레오타이드의 서열을 나타낸다. 전형적으로, 이러한 ORF는 개시 코돈, 통상적으로 3 개의 뉴클레오타이드의 배수의 길이를 갖는 후속 부분을 함유하지만, 소정의 판독 프레임 내에 정지 코돈 (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA, 또는 UGA)을 함유하지 않는다. 전형적으로, ORF는 자연적으로 나타나거나, 인공적으로, 즉 유전자-기술적 방법에 의해서 구성된다. ORF는 단백질에 대해 암호화하며, 여기에서 이것이 번역될 수 있는 아미노산은 펩타이드-결합된 쇄를 형성한다.
용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본 명세서에서 상호교환하여 사용되며, 길이 또는 번역 후에 변형과는 무관하게 아미노산의 펩타이드-결합된 쇄를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "번역-후에(post-translational)"는 뉴클레오타이드 삼중체 (triplet)의 아미노산으로의 번역 및 서열 내의 선행 아미노산에 대한 펩타이드 결합의 형성 후에 나타나는 현상을 나타낸다. 이러한 번역-후에 현상은 전체 폴리펩타이드가 형성된 후에, 또는 이미 번역된 폴리펩타이드의 이들 부분 상에서의 번역 과정 중에 나타날 수 있다. 번역 후에 현상은 전형적으로 생성된 폴리펩타이드의 화학적 또는 구조적 특성을 변화시키거나 변형시킨다. 번역-후에 현상의 예로는 아미노산의 글리코실화 또는 포스포릴화, 또는 예를 들어, 엔도펩티다제에 의한 펩타이드 쇄의 절단과 같은 것이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "동시-번역(co-translational)"은 뉴클레오타이드 삼중체의 아미노산 쇄로의 번역 과정 중에 나타나는 현상을 나타낸다. 이들 현상은 전형적으로 생성된 아미노산 쇄의 화학적 또는 구조적 특성을 변화시키거나 변형시킨다. 동시-번역 현상의 예로는 번역 과정을 완전히 중지시킬 수 있거나, 펩타이드 결합 형성을 방해하여 2 개의 별개의 번역 생성물을 제공할 수 있는 현상이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "다단백질" 또는 "인공 다단백질"은 서로 자연적으로 연결되지 않는 2 개의 아미노산 쇄를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성되는 아미노산 쇄를 나타낸다. 다단백질은 하나 이상의 추가의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 각각의 아미노산 쇄는 바람직하게는 완전한 단백질, 즉 전체 ORF에 걸쳐 있는 것이거나, 그의 단편, 영역 또는 에피토프이다. 다단백질의 개별적인 부분들은 영구적으로 또는 일시적으로 서로에 연결될 수 있다. 영구적으로 연결된 다단백질의 부분들은 단일 ORF로부터 번역되며, 동시번역 또는 번역 후에 나중에 분리되지 않는다. 일시적으로 연결된 다단백질의 부분들은 또한, 단일 ORF로부터 유도될 수 있으며, 해독 과정 중의 분리에 기인하여 동시번역으로, 또는 예를 들어, 엔도펩티다제에 의한 펩타이드 쇄의 절단에 기인하여 번역-후에 분할된다. 추가로 또는 대안적으로, 다단백질의 부분들은 또한 2 개의 상이한 ORF로부터 유도될 수 있으며, 번역-후에 예를 들어, 공유결합을 통해서 연결된다.
본 발명에서 사용할 수 있는 단백질 또는 다단백질 (단백질 유도체, 단백질 변이체, 단백질 단편, 단백질 분절, 단백질 에피토프 및 단백질 영역)은 화학적 변형에 의해서 더 변형될 수 있다. 이것은 이러한 화학적으로 변형된 폴리펩타이드가 20 개의 천연적으로 존재하는 아미노산 이외의 다른 화학적 그룹을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 다른 화학적 그룹의 예로는 제한이 없이, 글리코실화된 아미노산 및 포스포릴화된 아미노산이 포함된다. 폴리펩타이드의 화학적 변형은 모 폴리펩타이드에 비해서 유익한 특성, 예를 들어, 증진된 안정성, 증가된 생물학적 반감기 또는 증가된 수용성 중의 하나 이상을 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 변이체에 적용할 수 있는 화학적 변형에는 제한이 없이 다음이 포함된다: PEG화, 비-글리코실화된 모 폴리펩타이드의 글리코실화, 또는 모 폴리펩타이드에 존재하는 글리코실화 패턴의 변형. 본 발명에서 사용할 수 있는 변이체에 적용할 수 있는 이러한 화학적 변형은 동시번역으로, 또는 번역-후에 나타날 수 있다.
용어 "분절"은 이 거대분자가 분할될 수 있는 거대분자 (예를 들어, 폴리펩타이드, 단백질 또는 다단백질)의 어떤 부분을 나타낸다. 거대분자는 하나 이상의 분절로 구성될 수 있다. 이러한 분절화는 거대분자 및/또는 개별적인 분절의 기능적 (예를 들어, 면역반응성 특징 또는 막 부착 기능을 가짐) 또는 구조적 (예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열, 또는 이차 또는 삼차 구조) 특성에 기인하여 존재할 수 있다. 본 발명과 관련하여, 용어 "분절"은 단백질 또는 다단백질의 일부분을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 분절은 단백질 또는 다단백질의 잔여 부분과는 관계없이 접히고/접히거나 작용하는 것이 특히 바람직하다
항원성 결정인자로 또한 공지되어 있는 "에피토프"는 면역 시스템에 의해서, 특히 항체, B 세포, 또는 T 세포에 의해서 인식되는 거대분자의 분절이다. 이러한 에피토프는 항체 또는 그의 항원-연결 단편에 결합할 수 있는 거대분자의 그 부분 또는 분절이다. 이와 관련해서, 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여, 용어 "에피토프"는 면역 시스템에 의해서 인식되는 단백질 또는 다단백질의 분절을 나타내는 것이 바람직하다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 구성되며, 통상적으로 특이적인 삼차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 배좌 및 비-배좌 에피토프는 전자에 대한 연결은 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "영역 (domain)"은 단백질 쇄의 잔여 부분과는 관계없이 진화, 작용 및/또는 존재할 수 있는 단백질 또는 다단백질 서열 또는 구조 (또는 상응하는 뉴클레오타이드 서열)의 분절을 나타낸다. 전형적으로, 단백질은 하나 또는 몇 개의 영역으로 구성되며, 이들은 각각 단백질 쇄의 잔여 부분과는 관계없이 접히고, 안정한 삼차원 구조이다. 이러한 영역은 전형적으로 단백질 내에서 독립적인 작용적 유니트 (예를 들어, 경막-영역, 면역글로불린-유사 영역, 또는 DNA-결합 영역)를 형성한다.
본 발명에서 사용되는 용어 단백질 또는 분절 "변이체"는 이것이 유도되는 폴리펩타이드 (또는 분절, 에피토프 또는 영역)와 비교하여 아미노산 서열에 있어서의 하나 이상의 변화가 상이한 폴리펩타이드 (또는 분절)로 이해되어야 한다. 단백질 변이체가 유도되는 폴리펩타이드는 또한 모 폴리펩타이드로서 알려져 있다. 마찬가지로, 분절 변이체가 유도되는 분절은 모 분절로 알려져 있다. 전형적으로, 변이체는 인공적으로, 바람직하게는 유전자-기술적 방법에 의해서 구성된다. 전형적으로, 모 폴리펩타이드는 야생형 단백질 또는 야생형 단백질 영역이다. 본 발명과 관련하여, 모 폴리펩타이드 (또는 모 분절)는 두 개 이상의 야생형 폴리펩타이드 (또는 야생형 분절)의 공통 서열인 것이 또한 바람직하다. 추가로, 본 발명에서 사용할 수 있는 변이체는 또한 모 폴리펩타이드의 동족체,오르토로그 (orthologs) 또는 파라로그 (paralogs)로부터, 또는 인공적으로 구성된 변이체로부터 유도될 수도 있으며, 단 변이체는 모 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 변화는 하나 또는 몇 개의 부위에서 나타날 수 있는 아미노산 교환, 삽입, 결실, N-말단 절단, 또는 C-말단 절단, 또는 이들 변화의 임의의 조합일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 사용할 수 있는 변이체는 아미노산 서열에 있어서 총수 200 개까지 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 개까지)의 변화 (즉, 교환, 삽입, 결실, N-말단 절단 및/또는 C-말단 절단)를 나타낸다. 아미노산 교환은 보존적이고/이거나 비-보존적일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 사용할 수 있는 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개까지의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 변화에 의해서 이것이 유도되는 단백질 또는 영역과 상이하다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명에서 사용되는 "변이체"는 이것이 유도되는 모 폴리펩타이드 또는 모 폴리뉴클레오타이드에 대한 특정한 정도의 서열 동일성에 의해 특정화될 수 있다. 더욱 정확하게, 본 발명과 관련하여 단백질 변이체는 그의 모 폴리펩타이드에 대해서 적어도 80% 서열 동일성을 나타낸다. 본 발명과 관련하여 폴리뉴클레오타이드 변이체는 그의 모 폴리뉴클레오타이드에 대해서 적어도 80% 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 단백질 변이체의 서열 동일성은 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 아미노산의 연속 스트레치 (continuous stretch)에 걸친 것이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드 변이체의 서열 동일성은 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 연속 스트레치에 걸친 것이다.
용어 "적어도 80% 서열 동일성"은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열 비교에 관하여 본 명세서 전체적으로 사용된다. 이 표현은 바람직하게는, 각각의 기준 폴리펩타이드에 대한, 또는 각각의 기준 폴리뉴클레오타이드에 대한 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 문제의 폴리펩타이드 및 기준 폴리펩타이드는 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 아미노산의 연속 스트레치에 걸쳐서, 또는 기준 폴리펩타이드의 전체 길이에 걸쳐서 지시된 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 문제의 폴리뉴클레오타이드 및 기준 폴리뉴클레오타이드는 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 연속 스트레치에 걸쳐서, 또는 기준 폴리펩타이드의 전체 길이에 걸쳐서 지시된 서열 동일성을 나타낸다.
변이체는 추가로 또는 대안적으로 N-말단 절단, C-말단 절단 또는 내부 결실 또는 이들의 모든 조합일 수 있는 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. N-말단 절단, C-말단 절단 및/또는 내부 결실을 포함하는 이러한 변이체는 본 발명과 관련하여 "결실 변이체" 또는 "단편"으로 칭한다. 용어 "결실 변이체" 및 "단편"은 본 발명에서 상호교환하여 사용된다. 단편은 천연적으로 존재할 수 있거나 (예를 들어, 스플리스 변이체), 이것은 인공적으로, 바람직하게는 유전자-기술적 방법에 의해서 구성될 수 있다. 바람직하게는, 단편 (또는 결실 변이체)은 그의 N-말단에서 및/또는 그의 C-말단에서 및/또는 내부적으로 모 폴리펩타이드, 바람직하게는 그의 N-말단, 그의 N- 및 C-말단, 또는 그의 C-말단과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개까지의 아미노산의 결실을 갖는다. 두 개의 서열이 비교되고, 비교 시에 서열 동일성 백분율이 계산될 기준 서열이 명시되지 않은 경우에, 서열 동일성은 다른 식으로 구체적으로 명시되지 않는 한, 비교되는 두 개의 서열 중의 더 긴 것을 기준으로 하여 계산되어야 한다. 기준 서열이 지시되면, 서열 동일성은 다른 식으로 구체적으로 명시되지 않는 한, SEQ ID에 의해서 지시된 기준 서열의 전체 길이를 기초로 하여 결정된다. 예를 들어, 서열번호 1에 따르는 단백질 F의 아미노산 서열과 비교되는 50 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 서열은 10.04% (50/498)의 최대 서열 동일성 백분율을 나타낼 수 있는 반면에, 249 개의 아미노산의 길이를 갖는 서열은 50.00% (249/498)의 최대 서열 동일성 백분율을 나타낼 수 있다.
뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 유사성, 즉 서열 동일성의 백분율은 서열 정렬을 통해서 결정될 수 있다. 이러한 정렬은 본 기술분야에서 공지된 몇 개의 알고리즘에 의해서, 바람직하게는 칼린 (Karlin)과 알츠슐 (Altschul)의 수학적 알고리즘 [Karlin & Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5877]에 의해서, hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/)에 의해서, 또는 예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/에서, 또는http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html에서, 또는 http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html에서 입수할 수 있는 CLUSTAL 알고리즘 [Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res . 22, 4673-80]에 의해서 수행될 수 있다. 사용된 바람직한 매개변수는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html에서 설정된 것과 같은 디폴트 (default) 매개변수이다. 서열 동일성 (서열 매칭)의 정도는 예를 들어, BLAST, BLAT 또는 BlastZ (또는 BlastX)를 사용하여 계산될 수 있다. 유사한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 통합된다. BLAST 폴리뉴클레오타이드 탐색은 BLASTN 프로그램 (스코어 = 100, 단어 길이 = 12)에 의해서 수행되어 F, N, 또는 M2-1을 암호화한 이들 핵산에 대해 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 수득한다. BLAST 단백질 탐색은 BLASTP 프로그램 (스코어 = 50, 단어 길이 = 3)에 의해 수행되어 F 폴리펩타이드, N 폴리펩타이드, 또는 M2-1 폴리펩타이드에 대해서 상동성인 아미노산 서열을 수득한다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해서는 갭드 (Gapped) BLAST가 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용된다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램이 이용되는 경우에는, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수가 사용된다. 서열 매칭 분석은 셔플-라간 (Shuffle-LAGAN) [Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62] 또는 마르코브 랜덤 필드 (Markov random fields)와 같이 정립된 상동성 맵핑 기술에 의해서 보완될 수 있다. 서열 동일성의 백분율이 본 출원에서 언급되는 경우에, 이들 백분율은 다른 식으로 구체적으로 명시되지 않는 한, 더 긴 서열의 전체 길이와 관련하여 계산된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 다른 식으로 나타내지 않는 한, WIPO 기준 ST.25에 따르는 표준 1- 또는 3-문자 코드에 따라 지정된 아미노산을 포함하는 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한다. 다른 식으로 나타내지 않는 한, 1- 또는 3 문자 코드는 천연적으로 존재하는 L-아미노산에 대한 것이며, 아미노산 서열은 각각의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체의 N-말단으로부터 C-말단의 방향으로 나타낸다.
"하이브리드화"가 또한 두 개의 핵산 서열 사이의 서열 동일성 또는 상동성의 척도로 사용될 수도 있다. 본 발명의 단백질을 암호화한 핵산 서열, 또는 이들 중의 어떤 것의 일부분이 표준 하이브리드화 기술에 따라 하이브리드화 프로브로 사용될 수 있다. 시험 공급원으로부터의 DNA 또는 RA에 대한 각각의 프로브의 하이브리드화는 시험 공급원 내에 각각 표적 DNA 또는 RNA가 존재함을 시사한다. 하이브리드화 조건은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1991]에서 찾을 수 있다. "중등도 (moderate) 하이브리드화 조건"은 30℃에서 2X 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트 (SSC) 중에서의 하이브리드화에 이은 50℃에서의 1X SSC, 0.1% SDS 중에서의 세척에 해당하는 것으로 정의된다. "높은 엄중 (highly stringent) 조건"은 45℃에서 6X 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트 (SSC) 중에서의 하이브리드화에 이은 65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS 중에서의 세척에 해당하는 것으로 정의된다.
추가로 또는 대안적으로, 결실 변이체는 상술한 바와 같은 각각의 아미노산의 구조적 결실에 기인하지 않고, 이들 아미노산이 억제되거나 그들의 생물학적 기능을 충족시킬 수 없는 것에 기인하여 나타날 수 있다. 전형적으로, 이러한 기능적 결실은 생성된 단백질의 화학적 특성에 있어서의 변화 (즉, 소수성 아미노산의 친수성 아미노산으로의 교환), 생성된 단백질의 번역-후에 변형에 있어서의 변화 (예를 들어, 번역 후에 절단 또는 글리코실화 패턴), 또는 이차 또는 삼차 단백질 구조에서의 변화와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 생성된 단백질의 기능적 특성을 변화시키는 아미노산 서열에 대한 삽입 또는 그 아미노산 서열에서의 교환에 기인하여 나타난다. 추가로 또는 대안적으로, 기능적 결실은 또한 전사 또는 전사-후 유전자 침묵 (예를 들어, siRNA를 통함), 또는 단백질 억제제 또는 억제성 항체와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 억제성 분자의 존재 또는 부재에 기인하여 나타날 수도 있다.
본 발명과 관련하여, 단백질 (또는 분절 또는 영역 또는 에피토프)이 "기능적으로 결실"되었다는 것은 상응하는 서열의 아미노산 또는 뉴클레오타이드가 결실되거나 존재하지만, 그들의 생물학적 기능을 충족시키지 않는 사실을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "공통 (consensus)"은 관련된 서열을 서로에 대해 비교하는 경우의 다수의 서열 정렬의 결과를 나타내는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이러한 공통 서열은 각각의 위치에서 가장 공통적으로 발견되는 아미노산 또는 뉴클레오타이드로 구성된다. 본 발명과 관련하여, 공통 서열을 수득하기 위한 서열 정렬에 사용된 서열은 세계적으로 다양한 상이한 질병 발발에서 분리된 다양한 바이러스 아형/혈청형 스트레인의 서열인 것이 바람직하다. 서열 정렬에 사용된 각각의 개별적인 서열은 특별한 바이러스 "분리체 (isolate)"의 서열로 불린다. 이러한 공통 서열을 수득하기 위한 수학적 방법의 더 상세한 설명은 실시예 항목에서 제공된다. 예를 들어, 단지 2 개의 분리체가 비교되었기 때문에, 소정의 위치에 대한 "공통 뉴클레오타이드" 또는 "공통 아미노산"이 결정될 수 없는 경우에는, 각각 하나의 분리체의 아미노산이 사용되는 것이 바람직하다. 생성된 단백질은 그의 각각의 B 세포 및/또는 T 세포 유도능에 관해서 평가된다.
본 발명과 관련하여 "펩타이드 링커" (또는 짧게 "링커")는 1 내지 100 개의 아미노산의 아미노산 서열을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따르는 펩타이드 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 아미노산의 최소 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따르는 펩타이드 링커는 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 또는 15 개의 아미노산 또는 그 미만의 최대 길이를 갖는다. 펩타이드 링커는 함께 연결된 2 개의 아미노산 단백질, 단편, 분절, 에피토프 및/또는 영역 사이에서 유연성을 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 가요성은 일반적으로, 아미노산이 작은 경우에 증가한다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 펩타이드 링커는 작은 아미노산, 특히 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 류신 및 이소류신의 증가된 함량을 갖는다. 바람직하게는, 펩타이드 링커의 아미노산의 20% 이상, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 그 이상이 작은 아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 링커의 아미노산은 글리신 및 세린으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 조합이 수학적으로 이치에 맞는다면 본 발명에 따르는 펩타이드 링커의 상기-언급된 바람직한 최소 및 최대 길이는 조합될 수 있다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 비-면역원성이며, 특히 바람직한 구체예에서, 펩타이드 링커는 인간에 대해서 비-면역원성이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "절단 부위"는 예를 들어, 서열이 부해 효소에 의해서 인식되고/되거나 분할될 수 있기 때문에 이 서열이 분할을 지시하는 경우의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 전형적으로, 폴리펩타이드 쇄는 아미노산을 연결시키는 하나 이상의 펩타이드 결합의 가수분해에 의해서 절단되며, 폴리뉴클레오타이드 쇄는 뉴클레오타이드들 사이의 하나 이상의 포스포디에스테르 결합의 가수분해에 의해서 절단된다. 펩타이드- 또는 포스포디에스테르-결합의 절단은 화학적 또는 효소적 절단으로부터 유래할 것이다. 효소적 절단은 이러한 절단이 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 타입 I, 타입 II, 타입 II, 타입 IV 또는 인공적 제한효소) 및 엔도- 또는 엑소-펩티다제 또는 -프로테아제 (예를 들어, 세린-프로테아제, 시스테인-프로테아제, 메탈로-프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제)를 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 단백분해 효소에 의해서 수득되는 것을 나타낸다. 전형적으로, 효소적 절단은 자가-절단에 기인하여 나타나거나, 독립적인 단백분해 효소에 의해서 수행된다. 단백질 또는 폴리펩타이드의 효소적 절단은 동시번역으로 또는 번역 후에 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 용어 "엔도펩티다제 절단 부위"는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열이 엔도펩티다제 (예를 들어, 트립신, 펩신, 엘라스타제, 트롬빈, 콜라게나제, 퓨린, 터몰리신, 엔도펩티다제 V8, 카텝신)에 의해서 절단되거나 절단될 수 있는 경우의 그 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 내의 절단 부위를 나타낸다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 다단백질은 오토프로테아제 (autoprotease), 즉 또한 프로테아제를 포함하는 동일한 단백질 분자에서 펩타이드 결합을 절단하는 프로테아제에 의해서 절단될 수 있다. 이러한 오토프로테아제의 예는 플라비바이러스 (flaviviruses)로부터의 NS2 프로테아제 또는 비르나바이러스 (birnaviruses)의 VP4 프로테아제이다.
대안적으로, 용어 "절단 부위"는 아미노산 또는 뉴클레오타이드들 사이의 각각의 펩타이드- 또는 포스포디에스테르-결합의 형성을 방지하는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 예를 들어, 결합 형성은 폴리펩타이드 또는 다단백질의 동시번역 자가-처리 (self-processing)에 기인하여 방지됨으로써 단일 개방 판독 프레임의 단일 번역 현상으로부터 유도되는 두 개의 불연속적인 번역 생성물을 제공할 수 있다. 전형적으로, 이러한 자가-처리는 번역 컴플렉스가 펩타이드 결합을 형성함이 없이 하나의 코돈으로부터 다음 것으로 이동하도록 유도하는 가정지-코돈 (pseudo stop-codon) 서열에 의해서 야기된 "리보좀 스킵 (ribosomal skip)"에 의해서 수행된다. 리보좀 스킵을 유도하는 서열의 예로는 피코르나바이러스 (Picornavirus), 곤충 바이러스, 아프토비리대 (Aphtoviridae), 로타바이러스 (Rotaviruses) 및 트리파노소마 (Trypanosoma)를 포함한 몇 개의 과의 바이러스에 의해서 사용되는 바이러스 2A 펩타이드 또는 2A-유사 펩타이드 (여기에서, 이들 둘은 모두 총괄적으로 "2A 펩타이드"로, 또는 상호교환적으로 "2A 부위" 또는 "2A 절단 부위"로 불린다)가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 가장 잘 알려진 것은 전형적으로 단일 ORF로부터 다수의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용되는 피코르나비리다에 (Picornaviridae) 과의 리노바이러스 및 구제역 바이러스의 2A 부위이다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 용어 "자가-절단 부위"는 서열이 어떤 추가의 분자를 수반하지 않고 절단되거나 절단될 수 있는 경우, 또는 서열 내의 펩타이드- 또는 포스포디에스테르-결합 형성이 우선 방지되는 (예를 들어, 상술한 바와 같은 동시번역 자가-처리를 통해서) 경우의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 내의 절단 부위를 나타낸다.
절단 부위는 전형적으로 몇 개의 아미노산을 포함하거나, 몇 개의 코돈에 의해 암호화되는 것으로 (예를 들어, "절단 부위"가 단백질로 번역되지 않지만 번역의 중단을 초래하는 경우에) 이해된다. 따라서, 절단 부위는 또한 펩타이드 링커의 목적으로 작용할 수도 있으며, 즉 두 개의 펩타이드를 입체적으로 분리시킬 수 있다. 따라서, 일부의 구체예에서 "절단 부위"는 펩타이드 링커이면서, 또한 상술한 절단 기능을 제공한다. 이 구체예에서, 절단 부위는 추가의 N- 및/또는 C-말단 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)를 수용하는 세포를 나타낸다. 이러한 숙주 세포는 원핵성 (예를 들어, 박테리아 세포) 또는 진핵성 세포 (예를 들어, 진균, 식물 또는 동물 세포)일 수 있다.
"약제학적으로 허용되는"은 동물, 더욱 특히는 인간에게서의 사용에 관해 연방 또는 주정부의 규제기관에 의해서 승인되거나, 미국 약전 또는 그 밖의 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "담체"는 치료학적 활성성분과 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클과 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 약물학적으로 불활성인 물질을 나타낸다. 이러한 약제학적 담체는 액체 또는 고체일 수 있다. 액체 담체는 물 중의 식염수 용액, 및 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일과 같은 멸균 액체를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로 사용될 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥 내로, 또는 분무기 (nebulizer)에 의해서 비내로 투여되는 경우에는, 식염수 용액이 바람직한 담체이다.
적합한 약제학적 부형제에는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 나트륨 클로라이드, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다.
적합한 약제학적 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin]에 기술되어 있다.
용어 "조성물"은 활성성분이 다른 담체가 있거나 없이 담체에 의해서 둘러싸임으로써 담체와 함께 존재하는 캡슐제를 제공하는 담체로서 캡슐화 물질을 사용한 활성 화합물의 제제를 포함하고자 하는 것이다.
용어 "보조제"는 조성물의 활성성분에 대한 면역 반응을 세포 또는 체액 레벨에서 증가시키거나, 자극하거나, 활성화시키거나, 강화시키거나 변조시키는 성분을 나타내며, 예를 들어, 면역학적 보조제는 실제 항원에 대한 면역 시스템의 반응을 자극하지만 그 자체가 면역학적 효과를 갖지는 않는다. 이러한 보조제의 예로는 무기 보조제 (예를 들어, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드와 같은 무기 금속 염류), 유기 보조제 (예를 들어, 사포닌 또는 스쿠알렌), 오일계 보조제 (예를 들어, 프로인드 (Freund) 완전 보조제 및 프로인드 불완전 보조제), 사이토킨 (예를 들어, IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, 및 INF-γ), 미립자 보조제 (예를 들어, 면역-자극성 컴플렉스 (ISCOMS), 리포좀 또는 생물분해성 미립구), 바이로좀 (virosomes), 박테리아 보조제 (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 또는 뮤라밀 펩타이드), 합성 보조제 (예를 들어, 비-이온성 블럭 코폴리머, 뮤라밀 펩타이드 유사체, 또는 합성 지질 A), 또는 합성 폴리뉴클레오타이드 보조제 (예를 들어, 폴리아르기닌 또는 폴리리신)가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "활성성분"은 생물학적으로 활성인, 즉 약제학적 유용성을 제공하는 약제학적 조성물 또는 제제 내의 물질을 나타낸다. 약제학적 조성물은 함께 또는 서로 독립적으로 작용할 수 있는 하나 이상의 활성성분을 포함할 수 있다.
활성성분은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 아미노 그룹에 의해서 형성된 것, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 유리 카복실 그룹에 의해서 형성된 것을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 "환자"는 본 발명에 기술된 종양 백신에 의한 치료에 의해 효과를 볼 수 있는 모든 포유동물, 파충류 또는 조류를 의미한다. 바람직하게는, "환자"는 실험 동물 (예를 들어, 마우스 또는 랫트), 가축 (예를 들어, 기니아피그, 토끼, 말, 당나귀, 소, 양, 염소, 돼지, 닭, 낙타, 고양이, 개, 바다 거북이, 남생이, 뱀 또는 도마뱀을 포함), 또는 참팬지, 난쟁이 침팬지 (bonobos), 고릴라 및 인간을 포함한 영장류로 구성된 그룹으로부터 선택된다. "환자"는 인간인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 질병 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 다음 중의 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다: (a) 장애의 중등도를 감소시키고; (b) 치료될 장애(들)의 특징적인 증상의 발생을 제한하거나 방지하고; (c) 치료될 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 억제하고; (d) 이전에 장애(들)를 가졌던 환자에게서 장애(들)의 재발을 제한하거나 방지하고; (e) 장애(들)에 대해 이미 증상을 나타냈던 환자에게서 증상의 재발을 제한하거나 방지한다.
본 발명에서 사용되는 질병 또는 장애를 "방지하다", "방지하는", "방지" 또는 "예방하다"는 환자에게서 이러한 질병 또는 장애가 일어나는 것을 방지하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "투여하는"은 생체내 투여뿐만 아니라 정맥 이식과 같은 생체외 조직에 대한 직접적인 투여를 포함한다.
"유효량"은 의도한 목적을 달성하는데 충분한 치료제의 양이다. 소정의 치료제의 유효량은 제제의 성질, 투여의 경로, 치료제를 수용하는 동물의 크기 및 종, 및 투여의 목적과 같은 인자들에 따라 달라질 것이다. 각각의 개별적인 증례에서 유효량은 본 기술분야에서 정립된 방법에 따라 숙련된 전문가에 의해서 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 구체예
본 발명은 이제 더 상세히 기술될 것이다. 이하의 구절들에서는 본 발명의 다양한 관점들이 더 상세하게 정의된다. 이렇게 정의된 각각의 관점은 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, 임의의 다른 관점 또는 관점들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 지시된 모든 특징은 바람직하거나 이로운 것으로 지시된 어떤 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 T 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제1 폴리뉴클레오타이드 및 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질을 암호화한 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템을 제공한다. 본 발명에 의해서 제공된 이점들 중의 하나는 T 세포 반응을 유도하는 단백질이 동시에 투여되면, 항병원성 B 세포 반응을 유도하는 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 대한 B 세포 반응이 증진될 수 있다는 사실이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "발현 시스템"은 바람직하게는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 이외에도 제1 및 2, 또는 이하에 개략적으로 기술된 바람직한 구체예에 포함될 수 있는 임의의 추가의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 전사 및 번역을 지시하는 요소를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이러한 요소에는 무-세포 또는 세포-기반 시스템, 바람직하게는 세포-기반 시스템에서 mRNA의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 요소가 포함된다. 폴리뉴클레오타이드가 번역가능한 RNAs로서 제공되는 또 다른 구체예에서, 발현 시스템은 T 세포 및 B 세포 유도성 단백질, 예를 들어, 폴리A-테일 (tail), IRES, 캡 (cap) 구조 등을 암호화한 RNA의 번역 및/또는 안정화에 필요한 요소를 포함하는 것으로 생각된다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제1 폴리뉴클레오타이드는 T세포에 의해서 매개된 숙주 내의 면역 시스템의 반응 (즉, 면역 반응)을 유도하는 단백질을 암호화한다. T 세포 반응은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 (helper) 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 (effector memory) T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반한다. 단백질의 펩타이드가 세포 내에서 처리되고, MHC I 또는 MHC II 경로를 통해서 세포의 표면 상의 T 세포에 제시되면, 단백질에 대한 T 세포 반응이 유도된다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 통상적으로 노출되지 않는 이들 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 비-구조 또는 내부 단백질, 또는 B-세포에 접근할 수 없는 바이러스의 구조 또는 내부 단백질의 일부분이 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다.
제2 폴리뉴클레오타이드는 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한다. B 세포 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 림프구의 활성화에 근거한 면역 반응이다. 이러한 면역 반응에 포함된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 바이러스의 외부에 노출되는 병원성, 예를 들어, 바이러스성 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 병원체 (바이러스)의 외부에서 B 세포에 접근할 수 있는 구조 단백질 또는 구조 단백질의 적어도 일부분이 B 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다.
본 발명의 첫 번째 관점의 구체예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 별개의 벡터 상에, 또는 동일한 벡터 상에 포함된다. 따라서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터 상에 포함될 수 있고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 벡터 상에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함될 수 있다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함되는 것이 바람직하다. 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 이들이 다단백질로 발현되도록 하는 방식으로 연결되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성한다.
제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 인공 다단백질로 발현되는 것이 바람직하다. 본 발명과 관련하여, 용어 "인공 다단백질"은 천연적으로 존재하지 않는, 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 다단백질에 관한 것이다. 따라서, 이 인공 다단백질에서 암호화한 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 바람직하게는, 그의 게놈이 본 발명의 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 (및 임의로, 제3 폴리뉴클레오타이드)에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 포함하는 다단백질을 암호화하지 않는 병원체로부터 유래된다. 바람직하게는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 다단백질을 암호화하지 않거나 각각의 폴리뉴클레오타이드가 상이한 순서 및/또는 서열을 갖는 다단백질을 암호화한 바이러스로부터 유래된다. 더욱 바람직하게는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 DNA 바이러스, 음성 센스 단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스로부터 선택된 바이러스로부터 유래된다. 추가로 바람직하게는, 바이러스는 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 외피 ssRNA(-) 바이러스로부터, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, T 세포 반응을 유도하는 단백질은 바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질이고/이거나, 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 단백질은 병원체, 바람직하게는 바이러스의 구조 및/또는 표면 단백질이며, 여기에서 바이러스는 바람직하게는 DNA 바이러스, 음성-스트랜드 RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 외피 ssRNA(-) 바이러스로부터, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
구조 (표면) 및/또는 비-구조 (내부) 단백질의 아미노산 서열은 하나 이상의 상이한 바이러스 분리체의 연속적 분절 또는 공통 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명과 관련하여, 용어 "분절"은 단백질 또는 다단백질의 일부분을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 분절은 영역, 에피토프 또는 그의 단편과 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 단백질의 잔여 부분과는 무관하게 접히고/접히거나 작용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명과 관련한 단백질 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교하여 하나 또는 몇 개의 부위에서 일어날 수 있는 아미노산 교환, 삽입, 결실, N-말단 절단, 또는 C-말단 절단, 또는 이들 변화의 임의의 조합과 같은 아미노산 서열에서의 변화에 있어서 차이가 있음으로써 변이체가 그의 모 폴리펩타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
바람직한 구체예에서, 구조 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 천연의 병원체, 예를 들어, 바이러스의 표면 상에 노출된 단백질 또는 펩타이드이다. 구조 및/또는 표면 단백질은 항체 매개된 면역 반응 또는 보체 시스템의 활성화와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) T-세포 독립적 면역 반응을 유발하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, 구조 및/또는 표면 단백질은 항체 매개된 면역 반응을 유도한다. 이러한 항체 매개된 면역 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 세포의 활성화를 기본으로 한다. 이러한 면역 반응에 수반된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제2 폴리뉴클레오타이드는 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. B 세포 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 림프구의 활성화에 근거한 면역 반응이다. 이러한 면역 반응에 수반된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 바이러스의 외부에 노출된 이들 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 구조 및/또는 표면 단백질 또는 바이러스의 외부에서 B-세포에 접근할 수 있는 구조 및/또는 표면 단백질의 적어도 그 부분이 B 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다. 항-병원성 B 세포 반응은 병원체에 의해서 야기된 질병이 발생하지 않고/않거나 증상이 경감되도록 각각의 병원체를 불활성화, 제거, 차단 및/또는 중화시키는 병원체에 대한 B 세포 반응이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 항-병원성 B 세포 반응은 병원성 유기체의 표면에 결합하고, 그들의 Fc 부분에 의해 보체 캐스케이드의 제1 성분을 유인하고, "전통적인" 보체 시스템의 활성화를 개시시키는 항체에 의해서 이루어진다. 이것은 2 가지 기전에 의한 병원체 제거를 제공한다. 첫째로, 항체 및 보체 분자의 연결은 옵소닌화 (opsonization)로 불리는 과정에서 식세포에 의한 섭취에 관해 병원체에 표식을 한다. 둘째로, 일부의 보체 시스템 성분은 항체를 도와주는 막 공격 컴플렉스 (membrane attack complex)를 형성하여 병원체를 직접 파괴시킨다. 대안적으로, 항-병원성 B 세포 반응은 병원체의 구조 단백질에 연결하여 세포 수용체에 대한 부착을 차단하는 항체에 의해서 이루어진다. 이 방법에서, 항체는 감염을 중화시킬 수 있다. 추가의 대안으로, 항-병원성 B 세포 반응은 병원체의 표면 단백질의 특수화된 부분으로서, 병원체가 숙주 세포 내로 진입하는데 필요한 융합 펩타이드에서 결합하는 항체에 의해서 이루어진다. 항체 결합은 단백질을 전-융합 상태에서 고정시키고, 감염을 차단하는 결과를 제공한다. 항-병원성인 B 세포 반응을 유도하는 단백질 또는 변이체의 능력은 본 기술분야에서 잘 알려진 시험 및/또는 검정방법을 적용함으로써 숙련된 전문가에 의해서 결정될 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서는, 천연 바이러스의 표면 상에 노출된 단백질 또는 그의 변이체의 막 부착 영역이 기능적으로 결실되고, 따라서 구조적으로 결실되거나, 구조적으로는 존재하지만 그의 생물학적 기능을 충족시키지 않는다. 특히 바람직한 구체예에서는, 막 부착 영역에 상응하는 아미노산 서열이 결실된다. 막 부착 영역의 결실은 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질이 본 발명의 발현 시스템이 도입된 세포로부터 분비되는 것을 확인할 목적에 도움이 된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질은 내형질세망 (ER)에 대해 단백질을 표적화하는 분비 시그날을 포함한다. 이러한 분비 시그날은 바람직하게는, 결실된 막 부착 영역과 관련하여 존재한다. 숙련된 전문가는 예를 들어, 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질의 N-말단에 첨가된 이종 분비 시그날로 사용될 수 있는 이러한 다양한 분비 시그날을 잘 알고 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어, 구조 및/또는 표면 바이러스 단백질의 대부분에 존재하는 천연적으로 존재하는 분비 시그날이 사용될 수 있다. 따라서, 각각의 단백질에 천연적으로 존재한다면, 분비 시그날은 구조 및/또는 표면 단백질의 변형된 형태에서 유지되는 것이 바람직하다.
첫 번째 관점의 구체예에서, 비-구조 단백질은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반하는 병원체, 바람직하게는 바이러스에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 적합한 보존된 내부 단백질이다. 따라서, 바람직하게는 병원체 (바이러스)의 T 세포 유도성 단백질은 분비 시그날을 포함하지 않는다.
본 발명과 관련하여, 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 N- 또는 C-말단적으로 위치한다. 바람직한 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
따라서, 본 발명의 구체예는 화학식 X-Y 또는 Y-X를 가지며, 여기에서 "X"는 T 세포 반응 유도성 단백질을 나타내며, "Y"는 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질을 나타내고, "대시 (dash)"는 펩타이드 결합을 나타낸다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 절단 부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 본 발명의 범주 내에서, 모든 단백질은 임의의 다른 단백질과 조합될 수 있으며, 임의의 두 개의 단백질은 절단 부위에 의해서 결합 또는 연결될 수 있거나 없다.
이 절단 부위는 자가-절단 부위 (즉, 이러한 절단이 임의의 추가의 분자를 수반함이 없이 서열이 절단되거나 절단될 수 있거나, 서열 내의 펩타이드-결합 형성이 우선 방지되는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위) 또는 엔도펩티다제 절단 부위 (즉, 서열이 엔도펩티다제, 예를 들어, 트립신, 펩신, 엘라스타제, 트롬빈, 콜라게나제, 퓨린, 터몰리신, 엔도펩티다제 V8, 카텝신에 의해서 절단되거나 절단될 수 있는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위)인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 자가-절단 부위는 피코르나바이러스, 곤충 바이러스, 아프토비리대, 로타바이러스 및 트리파노소마의 바이러스성 2A 펩타이드 또는 2A-유사 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 2A 절단 부위이며, 바람직하게는 여기에서 2A 절단 부위는 구제역 바이러스의 2A 펩타이드이다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 다단백질은 오토프로테아제, 즉 프로테아제를 또한 포함하는 동일한 단백질 분자 내의 펩타이드 결합을 절단하는 프로테아제에 의해서 절단될 수 있다. 이러한 오토프로테아제의 예는 플라비바이러스로부터의 NS2 프로테아제 또는 비르나바이러스의 VP4 프로테아제이다.
본 발명과 관련하여, 절단 부위는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 N-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 C-말단적으로 위치할 수 있다. 대안적으로, 절단 부위는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 C-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 N-말단적으로 위치할 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체예는 화학식 X-C-Y 또는 Y-C-X를 가지며, 여기에서 "X"는 T 세포 반응 유도성 단백질을 나타내며, "Y"는 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질을 나타내고, "C"는 절단 부위를 나타내며, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 추가로 병원체의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제3 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 T 세포 반응을 유도하는 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체이며, 바람직하게는 제3 폴리뉴클레오타이드는 T 세포 반응을 유도하는 비-구조 또는 내부 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체인 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체인 것이 바람직하다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체와 상이한 것이 바람직하다. 바람직하게는, 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 이들이 상이한 단백질의 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 서로 상이하다.
바람직한 구체예에서, 링커를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 제3 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 링커는 가요성 링커, 바람직하게는 서열번호 6 (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly)에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가요성 링커인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 제3 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드와 별개의 벡터 상에, 또는 동일한 벡터 상에 포함된다.
따라서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 제2 벡터 상에 포함되며, 제3 폴리뉴클레오타이드는 제3 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함되고, 제3 폴리뉴클레오타이드는 별도의 벡터 상에 포함되거나, 제1 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함되거나, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함되고, 제1 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함된다. 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함될 수 있는 것이 바람직하다. 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 이들이 다단백질로 발현되도록 하는 방식으로 연결되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성하고, 바람직하게는 다단백질로 발현된다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 및/또는 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 및/또는 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
이 관점의 더 더욱 바람직한 구체예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하고/하거나 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 사이에 위치하거나; 또는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하고/하거나 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 사이에 위치한다.
본 발명은 바람직한 구체예는 화학식 X-K-Y, Y-K-X, X-K-Y-Y, Y-Y-K-X, X-Y-K-Y, Y-K-Y-X, X-K-Y-K-Y, Y-K-Y-K-X, X-C-Y, Y-C-X, X-C-Y-Y, Y-Y-C-X, X-Y-C-Y, Y-C-Y-X, X-C-Y-C-Y, Y-C-Y-C-X, X-K-Y-C-Y, Y-C-Y-K-X, X-C-Y-K-Y, 또는 Y-K-Y-C-X를 가지며, 여기에서 "X"는 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 나타내고, "Y"는 T 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제1 폴리뉴클레오타이드를 나타내며, "K"는 하나 이상의 펩타이드 링커가 이 위치에 존재함으로 나타내고, "C"는 하나 이상의 절단 부위가 이 위치에 존재함을 나타내며, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다. 바람직한 배열은 Y-K-Y-C-X 또는 X-C-Y-K-Y이다.
또한, 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반하는 바이러스에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 적합한 보존된 내부 단백질인 것이 바람직하다.
본 발명의 범위 내에서, 모든 단백질은 임의의 다른 단백질과 조합될 수 있으며, 임의의 두 개의 단백질은 절단 부위 또는 링커 펩타이드에 의해서 결합 또는 연결될 수 있거나 없을 수 있다.
바람직한 구체예에서, 제1, 제2 및/또는 제3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 벡터들은 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 및 인공 염색체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명을 실행하는데 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바람직하게는 람다 파지 및 필라멘트상 파지 벡터, 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, 비-복제성 Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3 벡터 또는 복제-가능 Ad4 및 Ad7 벡터), 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, AAV 타입 5 및 타입 2), 알파바이러스 벡터 (예를 들어, 베네주엘라 말뇌염 바이러스 (Venezuelan equine encephalitis virus; VEE), 신드비스 (sindbis) 바이러스 (SIN), 셈리키 (semliki) 삼림열 바이러스 (SFV), 및 VEE-SIN 키메라), 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 레수스 (rhesus) 사이토메갈로바이러스 (RhCMV) (14)와 같은 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 벡터), 아레나 바이러스 벡터 (예를 들어, 림프구성 맥락뇌막염 바이러스 (LCMV) 벡터 (15)), 홍역 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (Ankara) (MVA), NYVAC (백시니아의 코펜하겐 (Copenhagen) 스트레인으로부터 유도됨), 및 아비폭스 (avipox) 바이러스: 카나리폭스 (ALVAC) 및 계두 (fowlpox) (FPV) 벡터), 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 바이러스-유사 입자, 및 박테리아 포자로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 벡터 ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 및 ChAd82는 WO 2005/071093에 상세히 기술되어 있다. 벡터 PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, 및 ChAd147은 WO 2010/086189에 기술되어 있다. 벡터는 MVA, ChAd63 및 PanAd3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 의약으로 사용하기 위한 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 감염의 예방 또는 치료에서 및/또는 감염의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서 사용하기 위한, 및/또는 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것 (여기에서, 감염은 바람직하게는 바이러스 감염이다)이고, 특히 바람직하게는 병원체의 예방 또는 치료에서 및/또는 병원체의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서 사용하기 위한, 및/또는 병원체를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기에서 병원체는 바람직하게는 바이러스이다. 바람직하게는, 발현 시스템은 바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료에서 및/또는 바이러스의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서 사용하기 위한, 및/또는 바이러스를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기에서 병원체는 DNA 바이러스, 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가로 바람직하게는, 발현 시스템은 예방 또는 치료에서 및/또는 바이러스의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서 사용하기 위한, 및/또는 음성 센스 단일-가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 더 더욱 바람직하게는, 발현 시스템은 예방 또는 치료에서 및/또는 바이러스의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서 사용하기 위한, 및/또는 외피 ssRNA(-) 바이러스, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 면역 반응을 증진시키는데 사용하기 위한 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 면역원, 바람직하게는 병원체, 더욱 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 바이러스에 대항하는 B 세포 면역 반응을 증진시키는데 사용하기 위한 것이다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제1 폴리뉴클레오타이드는 숙주 내에서 T 세포에 의해서 매개된 면역 시스템의 반응 (즉, 면역 반응)을 유도하는 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화하며, 제2 폴리뉴클레오타이드는 파라믹소바이러스에 대항하는 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. 그의 바이러스 단백질이 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 파라믹소바이러스는 뉴모비리나에 (Pneumovirinae), 파라믹소비리나에 (Paramyxovirinae), 페-데-랑 바이러스 (Fer-de-Lance-Virus), 나리바 (Nariva)-바이러스, 살렘 (Salem)-바이러스, 투파야 (Tupaia)-파라믹소바이러스, 베이롱 (Beilong)-바이러스, J-바이러스, 메낭글 (Menangle)-바이러스, 모스만 (Mossmann)-바이러스, 및 무라야마 (Murayama)-바이러스의 서브패밀리로부터 선택되는 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 뉴모비리나에는 뉴모바이러스 (Pneumovirus), 바람직하게는 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV, 칠면조 비기관염 (rinotracheitis) 바이러스, 및 메타뉴모바이러스 (Metapneumovirus), 바람직하게는 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV) 및 조류 메타뉴모바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 파라믹소비리나에는 레스피로바이러스 (Respirovirus), 바람직하게는 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3, 및 루불라바이러스 (Rubulavirus), 바람직하게는 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 첫 번째 관점의 구체예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 별도의 벡터 상에, 또는 동일한 벡터 상에 포함된다. 따라서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 하나의 벡터 상에 포함될 수 있고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 벡터 상에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함될 수 있다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함되는 것이 바람직하다. 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 이들이 다단백질로 발현되도록 하는 방식으로 연결되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성한다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제1 폴리뉴클레오타이드는 숙주 내에서 T 세포에 의해서 매개된 면역 시스템의 반응 (즉, 면역 반응)을 유도하는 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. T 세포 반응은 세포독성 T 세포 (CTLs), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반한다. 단백질의 펩타이드가 세포 내에서 처리되고, MHC I 또는 MHC II 경로를 통해서 세포의 표면 상의 T 세포에 제시되면 단백질에 대한 T 세포 반응이 유도된다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 통상적으로는 바이러스의 외부에 노출되지 않는 이들 바이러스 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 비 구조 또는 내부 단백질 또는 바이러스의 외부의 B-세포에 접근할 수 없는 구조 또는 표면 단백질의 일부분이 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다.
제2 폴리뉴클레오타이드는 파라믹소바이러스에 대한 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. B 세포 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 림프구의 활성화를 기본으로 하는 면역 반응이다. 이러한 면역 반응에 포함된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 바이러스의 외부에 노출되는 이들 바이러스 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 바이러스의 외부의 B-세포에 접근할 수 있는 구조 단백질 또는 구조 단백질의 적어도 일부분이 항-병원성 B 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제2 폴리뉴클레오타이드는 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. B 세포 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 림프구의 활성화를 기본으로 하는 면역 반응이다. 이러한 면역 반응에 포함된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 바이러스의 외부에 노출되는 이들 바이러스 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 바이러스의 외부의 B-세포에 접근할 수 있는 구조 및/또는 표면 단백질 또는 구조 및/또는 표면 단백질의 적어도 일부분이 항-병원성 B 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, T 세포 반응을 유도하는 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질은 파라믹소바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질이고/이거나, 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질은 파라믹소바이러스의 구조 및/또는 표면 단백질이다.
구조 (표면) 및/또는 비-구조 (내부) 단백질의 아미노산 서열은 하나 이상의 상이한 파라믹소바이러스 분리체의 공통 서열 또는 연속적 분절을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 구조 단백질은 천연 파라믹소바이러스의 표면 상에 노출된 단백질 또는 그의 변이체이다. 구조 단백질은 항체 매개된 면역 반응 또는 보체 시스템의 활성화와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) T-세포 독립적 면역 반응을 유발하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, 구조 및/또는 표면 단백질은 항체 매개된 면역 반응을 유도한다. 이러한 항체 매개된 면역 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 세포의 활성화를 기본으로 한다. 이러한 면역 반응에 수반된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
추가의 바람직한 구체예에서, 천연 파라믹소바이러스의 표면 상에 노출된 단백질 또는 그의 변이체의 막 부착 영역은 기능적으로 결실되며, 따라서 구조적으로 결실되거나, 구조적으로는 존재하지만 그의 생물학적 기능을 충족하지 않는다. 특히 바람직한 구체예에서는, 막 부착 영역에 상응하는 아미노산 서열이 결실된다. 막 부착 부분의 결실은 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질이 본 발명의 발현 시스템이 도입된 세포로부터 분비되는 것을 확인할 목적에 도움이 된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 항-병원성 B 세포 반응 유도성 파라믹소바이러스 단백질은 내형질세망 (ER)에 대해 단백질을 표적화하는 분비 시그날을 포함한다. 따라서, 각각의 구조 또는 표면 단백질에 천연적으로 존재한다면, 분비 시그날은 구조 또는 표면 단백질의 변형된 형태에서 유지되는 것이 바람직하다.
천연 파라믹소바이러스의 구조 및/또는 표면 단백질은 융합 단백질 (F) 및 부착 당단백질 G, H, 및 HN 중의 어느 하나로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
부착 당단백질은 모든 외피 바이러스에서 발견되며, 숙주 세포의 원형질막 상의 탄수화물 부분 또는 단백질 또는 다른 분자의 세포 부착영역에 대한 그들의 연결을 통해서 바이러스 외피와 숙주 세포의 원형질막 사이의 초기 상호작용을 매개한다. 이에 의해서, 부착 당단백질은 바이러스와 숙주 세포의 막 사이의 갭을 메운다. "H"로 지정된 부착 당단백질은 헤마글루티닌 활성을 가지며, 모르빌리바이러스 (morbilliviruses) 및 헤니파바이러스 (henipa-viruses)에서 발견되고, "HN"으로 지정된 당단백질은 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 활성을 갖고, 레스피로바이러스 (respiroviruses), 루불라바이러스 (rubulaviruses) 및 아불라바이러스 (avulaviruses)에서 발견된다. 부착 당단백질은 이들이 헤마글루티닌 활성도 뉴라미니다제 활성도 갖지 않는 경우에 "G"로 지정된다. G 부착 당단백질은 뉴모비리나에의 모든 구성원에서 발견될 수 있다.
융합 단백질 "F"는 모든 외피 바이러스에서 발견되며, 바이러스 외피와 숙주 세포의 원형질막의 융합을 매개한다. F는 이것이 연결하는 숙주 세포의 세포 표면 상에 존재하는 수용체를 인식하는 타입 I 당단백질이다. F는 경막 영역이 그에 인접하여 위치하는 융합 펩타이드에 이어서 각각 두 개의 헵타드 (heptad) 반복 (HR) 부분 HR1 및 HR2로 구성된다. 융합 펩타이드를 숙주 세포의 원형질막 내에 삽입하면, HR1 부분은 트라이머성 코일드 코일 구조 (trimeric coiled coil structure)를 형성하며, 그의 소수성 그루브 내에 HR2 부분은 다시 접힌다. 이에 의해서, 바이러스 지질 이중층 및 세포 원형질막을 함께 더 가깝게 끌어당기며, 융합 공극의 형성 및 연속적으로, 바이러스 캡시드 (capsid)가 숙주 세포의 세포질 내로 들어갈 수 있도록 하는 지질 이중층 둘 다의 완전한 융합을 허용하는 헤어핀 구조가 형성된다. 이들 특징은 모두 외피 바이러스의 융합-매개성 단백질에서 공통적이다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, F는 바람직하게는 서열번호 1에 따르는, 더욱 바람직하게는 서열번호 2 또는 그의 변이체에 따르는, 하나의 RSV 분리체의 F의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성된다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 비-구조 단백질은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반하는, 파라믹소바이러스에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 적합한 파라믹소바이러스의 보존된 내부 단백질이다. 따라서, 바람직하게는 파라믹소바이러스의 T 세포 유도성 단백질은 분비 시그날을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 비-구조 및/또는 내부 단백질은 핵단백질 N, 매트릭스 단백질 M 및 M2, 인단백질 P, 비 구조 단백질 NS1 및 NS2, 및 폴리머라제의 촉매 아단위 (L)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
핵단백질 N은 RNA 게놈의 RNAase-저항성 뉴클레오캡시드 내로의 캡시드화 (encapsidation)를 포함하는 몇 가지 기능을 제공한다. N은 또한, 바이러스 조립 중에 M 단백질과 상호작용하며, 게놈의 전사 및 복제 중에 P-L 폴리머라제와 상호작용한다.
매트릭스 단백질 M은 파라믹소바이러스에서 가장 풍부한 단백질이며, 내재 막 단백질의 세포질성 테일 및 뉴클레오캐시드와 상호작용함으로써 바이러스 형태학의 중추 조직자인 것으로 생각된다. M2는 글리코실화되지 않고, 주로 뉴모바이러스에서 발견되는 제2 막-화합된 단백질이다.
인단백질 P는 N 및 L 단백질에 연결하며, 모든 파라믹소바이러스에서 RNA 폴리머라제 컴플렉스의 일부분을 형성한다. 큰 단백질 L은 RNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 아단위이다.
비-구조 단백질 NS1 및 NS2의 기능은 아직 확인되지 않았으며; 그러나, 이들이 바이러스 복제 사이클에 포함된다는 지적이 있다.
바람직한 구체예에서, N은 바람직하게는 서열번호 3에 따르는, 하나의 RSV 분리체 N의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 M2는 바람직하게는 서열번호 5에 따르는, 하나의 RSV 분리체 M2의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함한다. 또한, N은 서열번호 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, M2는 서열번호 5에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명과 관련하여, 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질에 관해서 N- 또는 C-말단적으로 위치한다. 바람직한 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
더욱 구체적으로, N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L은 F, G, H, 또는 HN의 N- 또는 C-말단적으로 위치할 수 있다. 바람직하게는 N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L은 F, G, H, 또는 HN의 C-말단적으로 위치할 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, N 또는 M2는 F의 C-말단적으로 위치한다. 특히 바람직한 구체예에서, N은 F의 C-말단적으로 위치한다.
따라서, 본 발명의 구체예는 화학식 X-Y 또는 Y-X를 가지며, 여기에서 "X"는 F, G, H, 또는 HN을 나타내고, "Y"는 N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L을 나타내며, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다. 바람직한 배열은 다음과 같다:
F-N, G-N, H-N, HN-N, F-M, G-M, H-M, HN-M, F-M2, G-M2, H-M2, HN-M2, F-P, G-P, H-P, HN-P, F-NS1, G-NS1, H-NS1, HN-NS1, F-NS2, G-NS2, H-NS2, HN-NS2, F-L, G-L, H-L, HN-L, N-F, N-G, N-H, N-HN, M-F, M-G, M-H, M-HN, M2-F, M2-G, M2-H, M2-HN, P-F, P-G, P-H, P-HN, NS1-FF, NS1-G, NS1-H, NS1-HN, NS2-F, NS2-G, NS2-H, NS2-HN, L-F, L-G, L-H, 또는 L-HN.
본 발명의 범주 내에서 모든 단백질은 임의의 다른 단백질과 조합될 수 있다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 절단 부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드의 사이에 위치한다.
이 절단 부위는 자가-절단 부위 (즉, 이러한 절단이 임의의 추가의 분자를 수반함이 없이 서열이 절단되거나 절단될 수 있거나, 서열 내의 펩타이드-결합 형성이 우선 방지되는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위) 또는 엔도펩티다제 절단 부위 (즉, 서열이 엔도펩티다제, 예를 들어, 트립신, 펩신, 엘라스타제, 트롬빈, 콜라게나제, 퓨린, 터몰리신, 엔도펩티다제 V8, 카텝신에 의해서 절단되거나 절단될 수 있는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위)인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 자가-절단 부위는 피코르나바이러스, 곤충 바이러스, 아프토비리대, 로타바이러스 및 트리파노소마의 바이러스성 2A 펩타이드 또는 2A-유사 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 2A 절단 부위이며, 바람직하게는 여기에서 2A 절단 부위는 구제역 바이러스의 2A 펩타이드이다.
본 발명과 관련하여, 절단 부위는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질에 관해서 N-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치할 수 있다. 대안적으로, 절단 부위는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질에 관해서 C-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치할 수 있다. 더욱 구체적으로, 절단 부위는 F, G, H, 또는 HN에 관해서 C- 또는 N-말단적으로, 및 N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L에 관해서 C- 또는 N-말단적으로 위치할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 절단 부위는 N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L에 관해서 N-말단적으로, 및 F, G, H, 또는 HN에 관해서 C-말단적으로 위치한다. 절단 부위는 N에 관해서 N-말단적으로, 및 F에 관해서 C-말단적으로 위치하는 것이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명의 구체예는 화학식 X-C-Y 또는 Y-C-X를 가지며, 여기에서 "X"는 F, G, H, 또는 HN를 나타내고, "Y"는 N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L을 나타내며, "C"는 절단 부위를 나타내고, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다. 바람직한 배열은 다음과 같다:
F-C-N, G-C-N, H-C-N, HN-C-N, F-C-M, G-C-M, H-C-M, HN-C-M, F-C-M2, G-C-M2, H-C-M2, HN-C-M2, F-C-P, G-C-P, H-C-P, HN-C-P, F-C-NS1, G-C-NS1, H-C-NS1, HN-C-NS1, F-C-NS2, G-C-NS2, H-C-NS2, HN-C-NS2, F-C-L, G-C-L, H-C-L, HN-C-L, N-C-F, N-C-G, N-C-H, N-C-HN, M-C-F, M-C-G, M-C-H, M-C-HN, M2-C-F, M2-C-G, M2-C-H, M2-C-HN, P-C-F, P-C-G, P-C-H, P-C-HN, NS1-C-FF, NS1-C-G, NS1-C-H, NS1-C-HN, NS2-C-F, NS2-C-G, NS2-C-H, NS2-C-HN, L-C-F, L-C-G, L-C-H, 또는 L-C-HN. 특히 바람직한 것은 F-C-N이다.
본 발명의 범주 내에서, 모든 단백질은 임의의 다른 단백질과 조합될 수 있으며, 어떤 두 개의 단백질은 절단 부위에 의해서 결합 또는 연결될 수 있거나 없다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 파라믹소바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한 제3 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다. 바람직하게는, 비-구조 및/또는 내부 단백질은 뉴모비리나에, 파라믹소비리나에, 페-데-랑 바이러스, 나리바-바이러스, 살렘-바이러스, 투파야-파라믹소바이러스, 베이롱-바이러스, J-바이러스, 메낭글-바이러스, 모스만-바이러스, 및 무라야마-바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된 파라믹소바이러스의 것이며, 더욱 바람직하게는 뉴모비리나에는 뉴모바이러스, 바람직하게는 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV, 칠면조 비기관염 바이러스, 및 메타뉴모바이러스, 바람직하게는 인간 메타뉴모바이러스, 조류 메타뉴모바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 파라믹소비리나에는 레스피로바이러스, 바람직하게는 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3, 및 루불라바이러스, 바람직하게는 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 제3 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드와 별도의 또는 동일한 벡터 상에 포함된다.
따라서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 제2 벡터 상에 포함되며, 제3 폴리뉴클레오타이드는 제3 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함되고, 제3 폴리뉴클레오타이드는 별도의 벡터 상에 포함되거나, 제1 및 제3 폴리뉴클레오타이드와 동일한 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함되거나, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드와 동일한 벡터 상에 포함되고, 제1 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함된다. 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함될 수 있는 것이 바람직하다. 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 이들이 바이러스 다단백질로 발현되도록 하는 방식으로 연결되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성한다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반하는, 바이러스에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 적합한 보존된 내부 단백질인 것이 또한 바람직하다.
바람직하게는, 비-구조 및/또는 내부 단백질은 핵단백질 N, 매트릭스 단백질 M 및 M2, 인단백질 P, 비 구조 단백질 NS1 및 NS2, 및 폴리머라제의 촉매 아단위 (L)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, N은 바람직하게는 서열번호 3에 따르는, 하나의 RSV 분리체 N의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 M2는 바람직하게는 서열번호 5에 따르는, 하나의 RSV 분리체 M2의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 여기에서 N은 서열번호 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, M2는 서열번호 5에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질과 상이한 것이 바람직하다.
제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 이들이 상이한 바이러스 단백질의 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 서로 상이하다. 예를 들어, 이것은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질이 N 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 반면에 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 M2 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그 반대인 것을 의미한다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질의 N- 또는 C-말단적으로 위치할 수 있다. 첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질의 C-말단적으로 위치한다. 더욱 구체적으로, N 또는 M2는 N 또는 M2의 N- 또는 C-말단적으로 위치할 수 있으며, 바람직하게는 N은 M2의 C-말단적으로 위치한다.
바람직한 구체예에서, 링커를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 제3 폴리뉴클레오타이드의 사이에 위치한다. 링커는 가요성 링커, 바람직하게는 서열번호 6에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가요성 링커인 것이 바람직하다.
첫 번째 관점의 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 및/또는 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 및/또는 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
이 관점의 더 더욱 바람직한 구체예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하고/하거나, 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 사이에 위치하거나; 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하고/하거나, 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 사이에 위치한다. 더욱 구체적으로, F, G, H, 또는 HN은 N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L에 관해서 C- 또는 N-말단적으로 위치하고, N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L은 N 또는 M2에 관해서 C- 또는 N-말단적으로 위치한다. 바람직한 구체예에서, F는 N에 관해서 N-말단적으로 위치하며, M2는 N에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 화학식 X-K-Y, Y-K-X, X-K-Y-Y, Y-Y-K-X, X-Y-K-Y, Y-K-Y-X, X-K-Y-K-Y, Y-K-Y-K-X, X-C-Y, Y-C-X, X-C-Y-Y, Y-Y-C-X, X-Y-C-Y, Y-C-Y-X, X-C-Y-C-Y, Y-C-Y-C-X, X-K-Y-C-Y, Y-C-Y-K-X, X-C-Y-K-Y, 또는 Y-K-Y-C-X를 가지며, 여기에서 "X"는 F, G, H, 또는 HN를 나타내고, "Y"는 N, M, M2, P, NS1, NS2, 또는 L을 나타내며, "K"는 하나 이상의 펩타이드 링커가 이 위치에 존재함을 나타내고, "C"는 하나 이상의 절단 부위가 이 위치에 존재함을 나타내며, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다. 바람직한 배열은 X-C-Y-K-Y이다. 더 더욱 바람직한 배열은 다음과 같다:
F-K-N, G-K-N, H-K-N, HN-K-N, F-K-M, G-K-M, H-K-M, HN-K-M, F-K-M2, G-K-M2, H-K-M2, HN-K-M2, F-K-P, G-K-P, H-K-P, HN-K-P, F-K-NS1, G-K-NS1, H-K-NS1, HN-K-NS1, F-K-NS2, G-K-NS2, H-K-NS2, HN-K-NS2, F-K-L, G-K-L, H-K-L, HN-K-L, N-K-F, N-K-G, N-K-H, N-K-HN, M-K-F, M-K-G, M-K-H, M-K-HN, M2-K-F, M2-K-G, M2-K-H, M2-K-HN, P-K-F, P-K-G, P-K-H, P-K-HN, NS1-K-FF, NS1-K-G, NS1-K-H, NS1-K-HN, NS2-K-F, NS2-K-G, NS2-K-H, NS2-K-HN, L-K-F, L-K-G, L-K-H, L-K-HN, F-C-N, G-C-N, H-C-N, HN-C-N, F-C-M, G-C-M, H-C-M, HN-C-M, F-C-M2, G-C-M2, H-C-M2, HN-C-M2, F-C-P, G-C-P, H-C-P, HN-C-P, F-C-NS1, G-C-NS1, H-C-NS1, HN-C-NS1, F-C-NS2, G-C-NS2, H-C-NS2, HN-C-NS2, F-C-L, G-C-L, H-C-L, HN-C-L, N-C-F, N-C-G, N-C-H, N-C-HN, M-C-F, M-C-G, M-C-H, M-C-HN, M2-C-F, M2-C-G, M2-C-H, M2-C-HN, P-C-F, P-C-G, P-C-H, P-C-HN, NS1-C-FF, NS1-C-G, NS1-C-H, NS1-C-HN, NS2-C-F, NS2-C-G, NS2-C-H, NS2-C-HN, L-C-F, L-C-G, L-C-H, or L-C-HN, F-N-M, G-N-M, H-N-M, HN-N-M, F-N-M2, G-N-M2, H-N-M2, HN-N-M2, F-N-P, G-N-P, H-N-P, HN-N-P, F-N-NS1, G-N-NS1, H-N-NS1, HN-N-NS1, F-N-NS2, G-N-NS2, H-N-NS2, HN-N-NS2, F-N-L, G-N-L, H-N-L, HN-N-L, F-M-N, G-M-N, H-M-N, HN-M-N, F-M-P, G-M-P, H-M-P, HN-M-P, F-M-NS1, G-M-NS1, H-M-NS1, HN-M-NS1, F-M-NS2, G-M-NS2, H-M-NS2, HN-M-NS2, F-M-L, G-M-L, H-M-L, HN-M-L, F-M2-N, G-M2-N, H-M2-N, HN-M2-N, F-M2-P, G-M2-P, H-M2-P, HN-M2-P, F-M2-NS1, G-M2-NS1, H-M2-NS1, HN-M2-NS1, F-M2-NS2, G-M2-NS2, H-M2-NS2, HN-M2-NS2, F-M2-L, G-M2-L, H-M2-L, HN-M2-L, F-P-N, G-P-N, H-P-N, HN-P-N, F-P-M, G-P-M, H-P-M, HN-P-M, F-P-M2, G-P-M2, H-P-M2, HN-P-M2, F-P-NS1, G-P-NS1, H-P-NS1, HN-P-NS1, F-P-NS2, G-P-NS2, H-P-NS2, HN-P-NS2, F-P-L, G-P-L, H-P-L, HN-P-L, F-NS1-N, G-NS1-N, H-NS1-N, HN-NS1-N, F-NS1-M, G-NS1-M, H-NS1-M, HN-NS1-M, F-NS1-M2, G-NS1-M2, H-NS1-M2, HN-NS1-M2, F-NS1-P, G-NS1-P, H-NS1-P, HN-NS1-P, F-NS1-NS2, G-NS1-NS2, H-NS1-NS2, HN-NS1-NS2, F-NS1-L, G-NS1-L, H-NS1-L, HN-NS1-L, F-NS2-N, G-NS2-N, H-NS2-N, HN-NS2-N, F-NS2-M, G-NS2-M, H-NS2-M, HN-NS2-M, F-NS2-M2, G-NS2-M2, H-NS2-M2, HN-NS2-M2, F-NS2-P, G-NS2-P, H-NS2-P, HN-NS2-P, F-NS2-NS1, G-NS2-NS1, H-NS2-NS1, HN-NS2-NS1, F-NS2-L, G-NS2-L, H-NS2-L, HN-NS2-L, F-L-N, G-L-N, H-L-N, HN-L-N, F-L-M2, G-L-M2, H-L-M2, HN-L-M2, F-L-P, G-L-P, H-L-P, HN-L-P, F-L-NS1, G-L-NS1, H-L-NS1, HN-L-NS1, F-L-NS2, G-L-NS2, H-L-NS2, HN-L-NS2, M-N-F, M-N-G, M-N-H, M-N-HN, M2-N-F, M2-N-G, M2-N-H, M2-N-HN, P-N-F, P-N-G, P-N-H, P-N-HN, NS1-N-F, NS1-N-G, NS1-N-H, NS1-N-HN, NS2-N-F, NS2-N-G, NS2-N-H, NS2-N-HN, L-N-F, L-N-G, L-N-H, L-N-HN, N-M-F, N-M-G, N-M-H, N-M-HN, P-M-F, P-M-G, P-M-H, P-M-HN, NS1-M-F, NS1-M-G, NS1-M-H, NS1-M-HN, NS2-M-F, NS2-M-G, NS2-M-H, NS2-M-HN, L-M-F, L-M-G, L-M-H, L-M-HN, N-M2-F, N-M2-G, N-M2-H, N-M2-HN, P-M2-F, P-M2-G, P-M2-H, P-M2-HN, NS1-M2-F, NS1-M2-G, NS1-M2-H, NS1-M2-HN, NS2-M2-F, NS2-M2-G, NS2-M2-H, NS2-M2-HN, L-M2-F, L-M2-G, L-M2-H, L-M2-HN, N-P-F, N-P-G, N-P-H, N-P-HN, M-P-F, M-P-G, M-P-H, M-P-HN, M2-P-F, M2-P-G, M2-P-H, M2-P-HN, NS1-P-F, NS1-P-G, NS1-P-H, NS1-P-HN, NS2-P-F, NS2-P-G, NS2-P-H, NS2-P-HN, L-P-F, L-P-G, L-P-H, L-P-HN, N-NS1-F, N-NS1-G, N-NS1-H, N-NS1-HN, M-NS1-F, M-NS1-G, M-NS1-H, M-NS1-HN, M2-NS1-F, M2-NS1-G, M2-NS1-H, M2-NS1-HN, P-NS1-F, P-NS1-G, P-NS1-H, P-NS1-HN, NS2-NS1-F, NS2-NS1-G, NS2-NS1-H, NS2-NS1-HN, L-NS1-F, L-NS1-G, L-NS1-H, L-NS1-HN, N-NS2-F, N-NS2-G, N-NS2-H, N-NS2-HN, M-NS2-F, M-NS2-G, M-NS2-H, M-NS2-HN, M2-NS2-F, M2-NS2-G, M2-NS2-H, M2-NS2-HN, P-NS2-F, P-NS2-G, P-NS2-H, P-NS2-HN, NS1-NS2-F, NS1-NS2-G, NS1-NS2-H, NS1-NS2-HN, L-NS2-F, L-NS2-G, L-NS2-H, L-NS2-HN, N-L-F, N-L-G, N-L-H, N-L-HN, M-L-F, M-L-G, M-L-H, M-L-HN, M2-L-F, M2-L-G, M2-L-H, M2-L-HN, P-L-F, P-L-G, P-L-H, P-L-HN, NS1-L-F, NS1-L-G, NS1-L-H, NS1-L-HN, NS2-L-F, NS2-L-G, NS2-L-H, NS2-L-HN, F-K-N-N, G-K-N-N, H-K-N-N, HN-K-N-N, F-K-N-M, G-K-N-M, H-K-N-M, HN-K-N-M, F-K-N-M2, G-K-N-M2, H-K-N-M2, HN-K-N-M2, F-K-N-P, G-K-N-P, H-K-N-P, HN-K-N-P, F-K-N-NS1, G-K-N-NS1, H-K-N-NS1, HN-K-N-NS1, F-K-N-NS2, G-K-N-NS2, H-K-N-NS2, HN-K-N-NS2, F-K-N-L, G-K-N-L, H-K-N-L, HN-K-N-L, F-C-N-N, G-C-N-N, H-C-N-N, HN-C-N-N, F-C-N-M, G-C-N-M, H-C-N-M, HN-C-N-M, F-C-N-M2, G-C-N-M2, H-C-N-M2, HN-C-N-M2, F-C-N-P, G-C-N-P, H-C-N-P, HN-C-N-P, F-C-N-NS1, G-C-N-NS1, H-C-N-NS1, HN-C-N-NS1, F-C-N-NS2, G-C-N-NS2, H-C-N-NS2, HN-C-N-NS2, F-C-N-L, G-C-N-L, H-C-N-L, HN-C-N-L, F-K-M-M, G-K-M-M, H-K-M-M, HN-K-M-M, F-K-M-M2, G-K-M-M2, H-K-M-M2, HN-K-M-M2, F-K-M-N, G-K-M-N, H-K-M-N, HN-K-M-N, F-K-M-P, G-K-M-P, H-K-M-P, HN-K-M-P, F-K-M-NS1, G-K-M-NS1, H-K-M-NS1, HN-K-M-NS1, F-K-M-NS2, G-K-M-NS2, H-K-M-NS2, HN-K-M-NS2, F-K-M-L, G-K-M-L, H-K-M-L, HN-K-M-L, F-K-M2-M, G-K-M2-M, H-K-M2-M, HN-K-M2-M, F-K-M2-N, G-K-M2-N, H-K-M2-N, HN-K-M2-N, F-K-M2-P, G-K-M2-P, H-K-M2-P, HN-K-M2-P, F-K-M2-NS1, G-K-M2-NS1, H-K-M2-NS1, HN-K-M2-NS1, F-K-M2-NS2, G-K-M2-NS2, H-K-M2-NS2, HN-K-M2-NS2, F-K-M2-L, G-K-M2-L, H-K-M2-L, HN-K-M2-L, F-K-P-N, G-K-P-N, H-K-P-N, HN-K-P-N, F-K-P-M, G-K-P-M, H-K-P-M, HN-K-P-M, F-K-P-M2, G-K-P-M2, H-K-P-M2, HN-K-P-M2, F-K-P-P, G-K-P-P, H-K-P-P, HN-K-P-P, F-K-P-NS1, G-K-P-NS1, H-K-P-NS1, HN-K-P-NS1, F-K-P-NS2, G-K-P-NS2, H-K-P-NS2, HN-K-P-NS2, F-K-P-L, G-K-P-L, H-K-P-L, HN-K-P-L, F-K-NS1-N, G-K-NS1-N, H-K-NS1-N, HN-K-NS1-N, F-K-NS1-M, G-K-NS1-M, H-K-NS1-M, HN-K-NS1-M, F-K-NS1-M2, G-K-NS1-M2, H-K-NS1-M2, HN-K-NS1-M2, F-K-NS1-P, G-K-NS1-P, H-K-NS1-P, HN-K-NS1-P, F-K-NS1-NS1, G-K-NS1-NS1, H-K-NS1-NS1, HN-K-NS1-NS1, F-K-NS1-NS2, G-K-NS1-NS2, H-K-NS1-NS2, HN-K-NS1-NS2, F-K-NS1-L, G-K-NS1-L, H-K-NS1-L, HN-K-NS1-L, F-K-NS2-N, G-K-NS2-N, H-K-NS2-N, HN-K-NS2-N, F-K-NS2-M, G-K-NS2-M, H-K-NS2-M, HN-K-NS2-M, F-K-NS2-M2, G-K-NS2-M2, H-K-NS2-M2, HN-K-NS2-M2, F-K-NS2-P, G-K-NS2-P, H-K-NS2-P, HN-K-NS2-P, F-K-NS2-NS1, G-K-NS2-NS1, H-K-NS2-NS1, HN-K-NS2-NS1, F-K-NS2-NS2, G-K-NS2-NS2, H-K-NS2-NS2, HN-K-NS2-NS2, F-K-NS2-L, G-K-NS2-L, H-K-NS2-L, HN-K-NS2-L, F-K-L-N, G-K-L-N, H-K-L-N, HN-K-L-N, F-K-L-M, G-K-L-M, H-K-L-M, HN-K-L-M, F-K-L-M2, G-K-L-M2, H-K-L-M2, HN-K-L-M2, F-K-L-P, G-K-L-P, H-K-L-P, HN-K-L-P, F-K-L-NS1, G-K-L-NS1, H-K-L-NS1, HN-K-L-NS1, F-K-L-NS2, G-K-L-NS2, H-K-L-NS2, HN-K-L-NS2, F-K-L-L, G-K-L-L, H-K-L-L, HN-K-L-L, F-N-K-N, G-N-K-N, H-N-K-N, HN-N-K-N, F-N-K-M, G-N-K-M, H-N-K-M, HN-N-K-M, F-N-K-M2, G-N-K-M2, H-N-K-M2, HN-N-K-M2, F-N-K-P, G-N-K-P, H-N-K-P, HN-N-K-P, F-N-K-NS1, G-N-K-NS1, H-N-K-NS1, HN-N-K-NS1, F-N-K-NS2, G-N-K-NS2, H-N-K-NS2, HN-N-K-NS2, F-N-K-L, G-N-K-L, H-N-K-L, HN-N-K-L, F-M-K-N, G-M-K-N, H-M-K-N, HN-M-K-N, F-M-K-M, G-M-K-M, H-M-K-M, HN-M-K-M, F-M-K-M2, G-M-K-M2, H-M-K-M2, HN-M-K-M2, F-M-K-P, G-M-K-P, H-M-K-P HN-M-K-P, F-M-K-NS1, G-M-K-NS1, H-M-K-NS1, HN-M-K-NS1, F-M-K-NS2, G-M-K-NS2, H-M-K-NS2, HN-M-K-NS2, F-M-K-L, G-M-K-L, H-M-K-L, HN-M-K-L, F-M2-K-N, G-M2-K-N, H-M2-K-N, HN-M2-K-N, F-M2-K-M, G-M2-K-M, H-M2-K-M, HN-M2-K-M, F-M2-K-M2, G-M2-K-M2, H-M2-K-M2, HN-M2-K-M2, F-M2-K-P, G-M2-K-P, H-M2-K-P HN-M2-K-P, F-M2-K-NS1, G-M2-K-NS1, H-M2-K-NS1, HN-M2-K-NS1, F-M2-K-NS2, G-M2-K-NS2, H-M2-K-NS2, HN-M2-K-NS2, F-M2-K-L, G-M2-K-L, H-M2-K-L, HN-M2-K-L, F-P-K-N, G-P-K-N, H-P-K-N, HN-P-K-N, F-P-K-M, G-P-K-M, H-P-K-M, HN-P-K-M, F-P-K-M2, G-P-K-M2, H-P-K-M2; HN-P-K-M2, F-P-K-P, G-P-K-P, 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P-C-M2-K-G, P-C-M2-K-H, P-C-M2-K-HN, P-C-P-K-F, P-C-P-K-G, P-C-P-K-H, P-C-P-K-HN, P-C-NS1-K-F, P-C-NS1-K-G, P-C-NS1-K-H, P-C-NS1-K-HN, P-C-NS2-K-F, P-C-NS2-K-G, P-C-NS2-K-H, P-C-NS2-K-HN, P-C-L-K-F, P-C-L-K-G, P-C-L-K-H, P-C-L-K-HN, NS1-C-N-K-F, NS1-C-N-K-G, NS1-C-N-K-H, NS1-C-N-K-HN, NS1-C-M-K-F, NS1-C-M-K-G, NS1-C-M-K-H, NS1-C-M-K-HN, NS1-C-M2-K-F, NS1-C-M2-K-G, NS1-C-M2-K-H, NS1-C-M2-K-HN, NS1-C-P-K-F, NS1-C-P-K-G, NS1-C-P-K-H, NS1-C-P-K-HN, NS1-C-NS1-K-F, NS1-C-NS1-K-G, NS1-C-NS1-K-H, NS1-C-NS1-K-HN, NS1-C-NS2-K-F, NS1-C-NS2-K-G, NS1-C-NS2-K-H, NS1-C-NS2-K-HN, NS1-C-L-K-F, NS1-C-L-K-G, NS1-C-L-K-H, NS1-C-L-K-HN, NS2-C-N-K-F, NS2-C-N-K-G, NS2-C-N-K-H, NS2-C-N-K-HN, NS2-C-M-K-F, NS2-C-M-K-G, NS2-C-M-K-H, NS2-C-M-K-HN, NS2-C-M2-K-F, NS2-C-M2-K-G, NS2-C-M2-K-H, NS2-C-M2-K-HN, NS2-C-P-K-F, NS2-C-P-K-G, NS2-C-P-K-H, NS2-C-P-K-HN, NS2-C-NS1-K-F, NS2-C-NS1-K-G, NS2-C-NS1-K-H, NS2-C-NS1-K-HN, NS2-C-NS2-K-F, NS2-C-NS2-K-G, NS2-C-NS2-K-H, NS2-C-NS2-K-HN, NS2-C-L-K-F, NS2-C-L-K-G, NS2-C-L-K-H, NS2-C-L-K-HN, L-C-N-K-F, L-C-N-K-G, L-C-N-K-H, L-C-N-K-HN, L-C-M-K-F, L-C-M-K-G, L-C-M-K-H, L-C-M-K-HN, L-C-M2-K-F, L-C-M2-K-G, L-C-M2-K-H, L-C-M2-K-HN, L-C-P-K-F, L-C-P-K-G, L-C-P-K-H, L-C-P-K-HN, L-C-NS1-K-F, L-C-NS1-K-G, L-C-NS1-K-H, L-C-NS1-K-HN, L-C-NS2-K-F, L-C-NS2-K-G, L-C-NS2-K-H, L-C-NS2-K-HN, L-C-L-K-F, L-C-L-K-G, L-C-L-K-H, 또는 L-C-L-K-HN. 가장 바람직하게는, 배열은 F-C-N-K-M2이다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이며, 특히 바람직하게는 파라믹소바이러스 감염, 바람직하게는 RSV 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이고/이거나, 파라믹소바이러스 감염, 바람직하게는 RSV 감염의 예방 또는 치료에 사용하는 의약을 제조하는데 사용하기 위한 것이고/이거나, 파라믹소바이러스 감염, 바람직하게는 RSV 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 면역 반응, 바람직하게는 파라믹소바이러스 감염, 바람직하게는 RSV 감염에 대한 B 세포 면역 반응을 증진시키는데 사용하기 위한 것이다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제1 폴리뉴클레오타이드는 숙주에서 T 세포에 의해서 매개된 면역 시스템의 반응 (즉, 면역 반응)을 유도하는 오르토믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화하고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 오르토믹소바이러스에 대한 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 오르토믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. 그의 바이러스 단백질이 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 오르토믹소바이러스는 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 토고토바이러스 및 이사바이러스의 속으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 오르토믹소바이러스는 바람직하게는 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7로부터 선택된 인플루엔자바이러스 A이다. 첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제2 폴리뉴클레오타이드는 오르토믹소바이러스에 대한 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 오르토믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제1 폴리뉴클레오타이드는 숙주에서 T 세포에 의해서 매개된 면역 시스템의 반응 (즉, 면역 반응)을 유도하는 오르토믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. T 세포 반응은 세포독성 T 세포 (CTLs), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반한다. 단백질의 펩타이드가 세포 내에서 처리되고, MHC I 또는 MHC II 경로를 통해서 세포의 표면 상의 T 세포에 제시되면, 단백질에 대한 T 세포 반응이 유도된다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 통상적으로 바이러스의 외부에 노출되지 않는 이들 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 비-구조 또는 내부 단백질, 또는 바이러스의 외부의 B-세포에 접근할 수 없는 구조 또는 표면 단백질의 일부분이 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제2 폴리뉴클레오타이드는 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 오르토믹소바이러스의 바이러스 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. B 세포 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 림프구의 활성화에 근거한 면역 반응이다. 이러한 면역 반응에 포함된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 바이러스의 외부에 노출되는 바이러스성 단백질 또는 그의 일부분, 예를 들어, 구조 및/또는 표면 단백질 또는 바이러스의 외부에서 B 세포에 접근할 수 있는 구조 및/또는 표면 단백질의 적어도 일부분이 B 세포 반응을 유도하기 위해서 사용된다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, T 세포 반응을 유도하는 오르토믹소바이러스의 바이러스 단백질은 오르토믹소바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질이고/이거나, 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 오르토믹소바이러스의 바이러스 단백질은 오르토믹소바이러스의 구조 및/또는 표면 단백질이다.
구조 (표면) 및/또는 비-구조 및/또는 내부 단백질의 아미노산 서열은 하나 이상의 상이한 오르토믹소바이러스 분리체의 공통 서열 또는 연속적 분절을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 구조 단백질은 천연 오르토믹소바이러스의 표면 상에 노출된 단백질 또는 그의 변이체이다. 구조 및/또는 표면 단백질은 항체 매개된 면역 반응 또는 보체 시스템의 활성화와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) T-세포 독립적 면역 반응을 유발하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, 구조 및/또는 표면 단백질은 항체 매개된 면역 반응을 유도한다. 이러한 항체 매개된 면역 반응은 항원 특이적 항체를 생산 및 분비하는 B 세포의 활성화를 기본으로 한다. 이러한 면역 반응에 수반된 B 세포에는 형질 B 세포, 기억 B 세포 및 B-1 세포가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
추가의 바람직한 구체예에서, 천연 오르토믹소바이러스의 표면 상에 노출된 단백질 또는 그의 변이체의 막 부착 영역은 기능적으로 결실되며, 따라서 구조적으로 결실되거나, 구조적으로는 존재하지만 그의 생물학적 기능을 충족하지 않는다. 특히 바람직한 구체예에서는, 막 부착 영역에 상응하는 아미노산 서열이 결실된다. 막 부착 부분의 결실은 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질이 본 발명의 발현 시스템이 도입된 세포로부터 분비되는 것을 확인할 목적에 도움이 된다.
또한, 천연 오르토믹소바이러스의 바이러스 표면 단백질은 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 천연 오르토믹소바이러스의 바이러스 표면 단백질은 헤마글루티닌 (HA)인 것이 더욱 바람직하다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, HA는 바람직하게는 서열번호 8 또는 서열번호 20에 따르는, 더욱 바람직하게는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 21 또는 이들 서열 중의 하나의 변이체에 따르는, 하나의 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 HA의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 인플루엔자 A 바이러스의 공통 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들을 포함하거나, 이들로 구성된다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 비-구조 단백질은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다)항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반하는, 파라믹소바이러스에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 적합한 오르토믹소바이러스의 보존된 내부 단백질이다. 따라서, 바람직하게는 오르토믹소바이러스의 T 세포 유도성 단백질은 분비 시그날을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 비-구조 및/또는 내부 단백질은 핵단백질 NP, 매트릭스 단백질 M1 및 M2, 비 구조 단백질 NS1 및 NS2/NEP, 및 RNA 폴리머라제 PA, PB1, PB2 및 단백질 PB1-F2 (PB1F2)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
핵단백질 NP는 음성 스트랜드 바이러스 RNA를 캡시드화하는 구조 단백질이다. NP는 종 특이성의 주된 결정인자 중의 하나이다.
단백질 M1은 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질이다. 이것은 바이러스 외피 내부의 코트 (coat)를 형성한다. M1 단백질은 바이러스 RNA에 결합한다. 이것은 또한, 숙주 세포의 성분과의 상호작용에 의해서 수행된 다수의 조절 기능을 갖는다. 조절된 기전에는 숙주 세포 핵으로부터 리보핵단백질의 수출에서의 역할, 바이러스 전사의 억제, 및 바이러스 조립 및 버딩 (budding)에서의 역할이 포함된다. M1 단백질은 바이러스 헤마글루티닌, 뉴라미니다제 및 M2 경막 단백질이 풍부한 숙주 세포 막의 패치 (patch) 하에서 층을 형성하며, 성숙 바이러스의 버딩(budding)을 촉진시킨다.
비-구조 NS1 단백질은 선형 음성-센스 단일 가닥 RNA, NS 유전자 분절을 암호화하며, 또한 이전에는 N2 단백질로 불린 vRNP의 수출을 매개하는 핵 수출 단백질 또는 NEP를 암호화한 내부 단백질에 의해서 생성된다. NS1은 또한 dsRNA에 결합한다. dsRNA에 대한 그의 결합의 결과로, NS1 단백질은 시험관내에서 dsRNA-활성화된 단백질 키나제 (PKR)의 활성화를 차단한다. 이 키나제는 진핵성 번역 개시 인자 2의 알파 아단위 (elF-2 알파)를 포스포릴화시킴으로써 번역의 개시율에 있어서의 감소를 초래한다. NS1의 부재 하에서, 이 경로는 항바이러스 반응 중에 억제되어 모든 단백질 번역을 정지시키고 - 따라서, 바이러스 단백질의 합성을 중지시키는데; 그러나, 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질은 숙주 방어기전을 우회하여 바이러스 유전자 전사가 일어나도록 하는 제제이다.
바람직한 구체예에서, HA는 바람직하게는 서열번호 9 또는 서열번호 21에 따르는, 하나의 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 HA의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하고, NP는 바람직하게는 서열번호 11에 따르는, 하나의 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 NP의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하며/하거나, M1은 바람직하게는 서열번호 12에 따르는, 하나의 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 M1의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함한다. 또한, NP가 서열번호 11에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, M1이 서열번호 12에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명과 관련하여, 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질에 관해서 N- 또는 C-말단적으로 위치한다. 바람직한 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
더욱 구체적으로, HA 또는 NA는 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2)의 N- 또는 C-말단적으로 위치할 수 있다. 바람직한 구체예에서, M1은 HA의 N-말단적으로 위치한다.
따라서, 본 발명의 구체예는 화학식 X-Y 또는 Y-X를 가지며, 여기에서 "X"는 HA 또는 NA, 바람직하게는 HA를 나타내며, "Y"는 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2), 바람직하게는 NP 또는 M1을 나타내고, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다. 바람직한 구체예는 다음과 같다:
HA-NP, HA-M1, HA-M2, HA-NS1, HA-NS2/NEP, HA-PA, HA-PB1, HA-PB2, HA-PB1F2, NP-HA, M1-HA, M2-HA, NS1-HA, NS2/NEP-HA, PA-HA, PB1-HA, PB2-HA, PB1F2-HA, NA-NP, NA-M1, NA-M2, NA-NS1, NA-NS2/NEP, NA-PA, NA-PB1, NA-PB2, NA-PB1F2, NP-NA, M1-NA, M2-NA, NS1-NA, NS2/NEP-NA, PA-NA, PB1-NA, PB2-NA 또는 PB1F2-NA. 특히 바람직한 배열은 M1-HA이다.
본 발명의 범주 내에서, 모든 단백질은 임의의 다른 단백질과 조합될 수 있다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 절단 부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한다.
이 절단 부위는 자가-절단 부위 (즉, 이러한 절단이 임의의 추가의 분자를 수반함이 없이 서열이 절단되거나 절단될 수 있거나, 서열 내의 펩타이드-결합 형성이 우선 방지되는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위) 또는 엔도펩티다제 절단 부위 (즉, 서열이 엔도펩티다제, 예를 들어, 트립신, 펩신, 엘라스타제, 트롬빈, 콜라게나제, 퓨린, 터몰리신, 엔도펩티다제 V8, 카텝신에 의해서 절단되거나 절단될 수 있는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위)인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 자가-절단 부위는 피코르나바이러스, 곤충 바이러스, 아프토비리대, 로타바이러스 및 트리파노소마의 바이러스성 2A 펩타이드 또는 2A-유사 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 2A 절단 부위이며, 바람직하게는 여기에서 2A 절단 부위는 구제역 바이러스의 2A 펩타이드이다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 다단백질은 오토프로테아제, 즉 프로테아제를 또한 포함하는 동일한 단백질 분자 내의 펩타이드 결합을 절단하는 프로테아제에 의해서 절단될 수 있다. 이러한 오토프로테아제의 예는 플라비바이러스로부터의 NS2 프로테아제 또는 비르나바이러스의 VP4 프로테아제이다.
본 발명과 관련하여, 절단 부위는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질에 관해서 N-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치할 수 있다. 대안적으로, 절단 부위는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 구조 및/또는 표면 단백질에 관해서 C-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치할 수 있다. 더욱 구체적으로, 절단 부위는 HA 또는 NA에 관해서 C- 또는 N-말단적으로, 및 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2)에 관해서 C- 또는 N-말단적으로 위치할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 절단 부위는 NP, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2)에 관해서 C-말단적으로, 및 HA 또는 NA에 관해서 N-말단적으로 위치한다. 절단 부위는 HA에 관해서 N-말단적으로, 및 M1에 관해서 C-말단적으로 위치하는 것이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명의 구체예는 화학식 X-C-Y 또는 Y-C-X를 가지며, 여기에서 "X"는 HA 또는 NA, 바람직하게는 HA를 나타내고, "Y"는 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2), 바람직하게는 NP 또는 M1을 나타내며, "C"는 절단 부위를 나타내고, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다.
바람직한 배열은 다음과 같다:
HA-C-NP, HA-C-M1, HA-C-M2, HA-C-NS1, HA-C-NS2/NEP, HA-C-PA, HA-C-PB1, HA-C-PB2, HA-C-PB1F2, NP-C-HA, M1-C-HA, M2-C-HA, NS1-C-HA, NS2/NEP-C-HA, PA-C-HA, PB1-C-HA, PB2-C-HA, PB1F2-C-HA, NA-C-NP, NA-C-M1, NA-C-M2, NA-C-NS1, NA-C-NS2/NEP, NA-C-PA, NA-C-PB1, NA-C-PB2, NA-C-PB1F2, NP-C-NA, M1-C-NA, M2-C-NA, NS1-C-NA, NS2/NEP-C-NA, PA-C-NA, PB1-C-NA, PB2-C-NA 또는 PB1F2-C-NA. 특히 바람직한 배열은 M1-C-HA이다.
본 발명의 범주 내에서, 모든 단백질은 임의의 다른 단백질과 조합될 수 있으며, 임의의 두 개의 단백질은 절단 부위에 의해서 결합 또는 연결될 수 있거나 없다.
첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 추가로 오르토믹소바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한 제3 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다. 바람직하게는, 비-구조 및/또는 내부 단백질은 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 토고토바이러스 및 이사바이러스의 속으로부터 선택되는 오르토믹소바이러스의 것이다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 오르토믹소바이러스는 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7로부터 선택된 인플루엔자바이러스 A, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1이다.
바람직한 구체예에서, 제3 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드와 별도의 또는 동일한 벡터 상에 포함된다.
따라서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 제2 벡터 상에 포함되며, 제3 폴리뉴클레오타이드는 제3 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함되고, 제3 폴리뉴클레오타이드는 별도의 벡터 상에 포함되거나, 제1 및 제3 폴리뉴클레오타이드와 동일한 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함되거나, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드와 동일한 벡터 상에 포함되고, 제1 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함된다. 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함될 수 있는 것이 바람직하다. 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 이들이 바이러스 다단백질로 발현되도록 하는 방식으로 연결되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 동일한 벡터 상에 포함된 제1 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성한다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반하는, 바이러스에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 적합한 보존된 내부 단백질인 것이 또한 바람직하다.
바람직하게는, 비-구조 및/또는 내부 단백질은 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2), 더욱 바람직하게는 NP 또는 M1으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질과 상이한 것이 바람직하다.
제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 이들이 상이한 바이러스 단백질의 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 서로 상이하다. 예를 들어, 이것은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질이 M1 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 반면에 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 NP 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그 반대인 것을 의미한다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질의 N- 또는 C-말단적으로 위치할 수 있다. 첫 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질의 C-말단적으로 위치한다.
바람직한 구체예에서, 링커를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 제3 폴리뉴클레오타이드의 사이에 위치한다. 링커는 가요성 링커, 바람직하게는 서열번호 6에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가요성 링커인 것이 바람직하다.
첫 번째 관점의 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 및/또는 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 및/또는 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
이 관점의 더 더욱 바람직한 구체예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하고/하거나, 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 사이에 위치하거나; 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하고/하거나, 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질은 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 사이에 위치한다. 더욱 구체적으로, HA 또는 NA는 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2)에 관해서 C- 또는 N-말단적으로 위치한다.
바람직한 구체예에서, HA는 M1에 관해서 C-말단적으로 위치하며, NP는 M1에 관해서 N-말단적으로 위치한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 화학식 X-K-Y, Y-K-X, X-K-Y-Y, Y-Y-K-X, X-Y-K-Y, Y-K-Y-X, X-K-Y-K-Y, Y-K-Y-K-X, X-C-Y, Y-C-X, X-C-Y-Y, Y-Y-C-X, X-Y-C-Y, Y-C-Y-X, X-C-Y-C-Y, Y-C-Y-C-X, X-K-Y-C-Y, Y-C-Y-K-X, X-C-Y-K-Y, 또는 Y-K-Y-C-X를 가지며, 여기에서 "X"는 HA 또는 NA, 바람직하게는 HA를 나타내고, "Y"는 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2), 바람직하게는 NP 또는 M1을 나타내며, "K"는 하나 이상의 펩타이드 링커가 이 위치에 존재함을 나타내고, "C"는 하나 이상의 절단 부위가 이 위치에 존재함을 나타내며, "대시"는 펩타이드 결합을 나타낸다. 바람직한 배열은 Y-K-Y-C-X이다. 더 더욱 바람직한 배열은 다음과 같다:
HA-K-NP, NP-K-HA, HA-K-NP-NP, NP-NP-K-HA, HA-NP-K-NP, NP-K-NP-HA, HA-K-NP-K-NP, NP-K-NP-K-HA, HA-C-NP, NP-C-HA, HA-C-NP-NP, NP-NP-C-HA, HA-NP-C-NP, NP-C-NP-HA, HA-C-NP-C-NP, NP-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-NP, NP-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-NP, NP-K-NP-C-HA, HA-K-NP-M1, HA-K-M1-NP, NP-M1-K-HA, M1-NP-K-HA, HA-NP-K-M1, HA-M1-K-NP, NP-K-M1-HA, M1-K-NP-HA, HA-K-NP-K-M1, HA-K-M1-K-NP, NP-K-M1-K-HA, M1-K-NP-K-HA, HA-C-NP-M1, HA-C-M1-NP, NP-M1-C-HA, M1-NP-C-HA, HA-NP-C-M1, HA-M1-C-NP, NP-C-M1-HA, M1-C-NP-HA, HA-C-NP-C-M1, HA-C-M1-C-NP, NP-C-M1-C-HA, M1-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-M1, HA-K-M1-C-NP, NP-C-M1-K-HA, M1-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-M1, HA-C-M1-K-NP, NP-K-M1-C-HA, M1-K-NP-C-HA, HA-K-NP-M2, HA-K-M2-NP, NP-M2-K-HA, M2-NP-K-HA, HA-NP-K-M2, HA-M2-K-NP, NP-K-M2-HA, M2-K-NP-HA, HA-K-NP-K-M2, HA-K-M2-K-NP, NP-K-M2-K-HA, M2-K-NP-K-HA, HA-C-NP-M2, HA-C-M2-NP, NP-M2-C-HA, M2-NP-C-HA, HA-NP-C-M2, HA-M2-C-NP, NP-C-M2-HA, M2-C-NP-HA, HA-C-NP-C-M2, HA-C-M2-C-NP, NP-C-M2-C-HA, M2-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-M2, HA-K-M2-C-NP, NP-C-M2-K-HA, M2-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-M2, HA-C-M2-K-NP, NP-K-M2-C-HA, M2-K-NP-C-HA, HA-K-NP-NS1, HA-K-NS1-NP, NP-NS1-K-HA, NS1-NP-K-HA, HA-NP-K-NS1, HA-NS1-K-NP, NP-K-NS1-HA, NS1-K-NP-HA, HA-K-NP-K-NS1, HA-K-NS1-K-NP, NP-K-NS1-K-HA, NS1-K-NP-K-HA, HA-C-NP-NS1, HA-C-NS1-NP, NP-NS1-C-HA, NS1-NP-C-HA, HA-NP-C-NS1, HA-NS1-C-NP, NP-C-NS1-HA, NS1-C-NP-HA, HA-C-NP-C-NS1, HA-C-NS1-C-NP, NP-C-NS1-C-HA, NS1-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-NS1, HA-K-NS1-C-NP, NP-C-NS1-K-HA, NS1-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-NS1, HA-C-NS1-K-NP, NP-K-NS1-C-HA, NS1-K-NP-C-HA, HA-K-NP-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-NP, NP-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-NP-K-HA, HA-NP-K-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-K-NP, NP-K-NS2/NEP-HA, NS2/NEP-K-NP-HA, HA-K-NP-K-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-K-NP, NP-K-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-K-NP-K-HA, HA-C-NP-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-NP, NP-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-NP-C-HA, HA-NP-C-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-C-NP, NP-C-NS2/NEP-HA, NS2/NEP-C-NP-HA, HA-C-NP-C-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-C-NP, NP-C-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-C-NP, NP-C-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-K-NP, NP-K-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-K-NP-C-HA, HA-K-NP-PA, HA-K-PA-NP, NP-PA-K-HA, PA-NP-K-HA, HA-NP-K-PA, HA-PA-K-NP, NP-K-PA-HA, PA-K-NP-HA, HA-K-NP-K-PA, HA-K-PA-K-NP, NP-K-PA-K-HA, PA-K-NP-K-HA, HA-C-NP-PA, HA-C-PA-NP, NP-PA-C-HA, PA-NP-C-HA, HA-NP-C-PA, HA-PA-C-NP, NP-C-PA-HA, PA-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PA, HA-C-PA-C-NP, NP-C-PA-C-HA, PA-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-PA, HA-K-PA-C-NP, NP-C-PA-K-HA, PA-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PA, HA-C-PA-K-NP, NP-K-PA-C-HA, PA-K-NP-C-HA, HA-K-NP-PB1, HA-K-PB1-NP, NP-PB1-K-HA, PB1-NP-K-HA, HA-NP-K-PB1, HA-PB1-K-NP, NP-K-PB1-HA, PB1-K-NP-HA, HA-K-NP-K-PB1, HA-K-PB1-K-NP, NP-K-PB1-K-HA, PB1-K-NP-K-HA, HA-C-NP-PB1, HA-C-PB1-NP, NP-PB1-C-HA, PB1-NP-C-HA, HA-NP-C-PB1, HA-PB1-C-NP, NP-C-PB1-HA, PB1-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PB1, HA-C-PB1-C-NP, NP-C-PB1-C-HA, PB1-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-PB1, HA-K-PB1-C-NP, NP-C-PB1-K-HA, PB1-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PB1, HA-C-PB1-K-NP, NP-K-PB1-C-HA, PB1-K-NP-C-HA, HA-K-NP-PB2, HA-K-PB2-NP, NP-PB2-K-HA, PB2-NP-K-HA, HA-NP-K-PB2, HA-PB2-K-NP, NP-K-PB2-HA, PB2-K-NP-HA, HA-K-NP-K-PB2, HA-K-PB2-K-NP, NP-K-PB2-K-HA, PB2-K-NP-K-HA, HA-C-NP-PB2, HA-C-PB2-NP, NP-PB2-C-HA, PB2-NP-C-HA, HA-NP-C-PB2, HA-PB2-C-NP, NP-C-PB2-HA, PB2-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PB2, HA-C-PB2-C-NP, NP-C-PB2-C-HA, PB2-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-PB2, HA-K-PB2-C-NP, NP-C-PB2-K-HA, PB2-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PB2, HA-C-PB2-K-NP, NP-K-PB2-C-HA, PB2-K-NP-C-HA, HA-K-NP-PB1F2, HA-K-PB1F2-NP, NP-PB1F2-K-HA, PB1F2-NP-K-HA, HA-NP-K-PB1F2, HA-PB1F2-K-NP, NP-K-PB1F2-HA, PB1F2-K-NP-HA, HA-K-NP-K-PB1F2, HA-K-PB1F2-K-NP, NP-K-PB1F2-K-HA, PB1F2-K-NP-K-HA, HA-C-NP-PB1F2, HA-C-PB1F2-NP, NP-PB1F2-C-HA, PB1F2-NP-C-HA, HA-NP-C-PB1F2, HA-PB1F2-C-NP, NP-C-PB1F2-HA, PB1F2-C-NP-HA, HA-C-NP-C-PB1F2, HA-C-PB1F2-C-NP, NP-C-PB1F2-C-HA, PB1F2-C-NP-C-HA, HA-K-NP-C-PB1F2, HA-K-PB1F2-C-NP, NP-C-PB1F2-K-HA, PB1F2-C-NP-K-HA, HA-C-NP-K-PB1F2, HA-C-PB1F2-K-NP, NP-K-PB1F2-C-HA, PB1F2-K-NP-C-HA, HA-K-M1, M1-K-HA, HA-K-M1-M1, M1-M1-K-HA, HA-M1-K-M1, M1-K-M1-HA, HA-K-M1-K-M1, M1-K-M1-K-HA, HA-C-M1, M1-C-HA, HA-C-M1-M1, M1-M1-C-HA, HA-M1-C-M1, M1-C-M1-HA, HA-C-M1-C-M1, M1-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-M1, M1-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-M1, M1-K-M1-C-HA, HA-K-M1-M2, HA-K-M2-M1, M1-M2-K-HA, M2-M1-K-HA, HA-M1-K-M2, HA-M2-K-M1, M1-K-M2-HA, M2-K-M1-HA, HA-K-M1-K-M2, HA-K-M2-K-M1, M1-K-M2-K-HA, M2-K-M1-K-HA, HA-C-M1-M2, HA-C-M2-M1, M1-M2-C-HA, M2-M1-C-HA, HA-M1-C-M2, HA-M2-C-M1, M1-C-M2-HA, M2-C-M1-HA, HA-C-M1-C-M2, HA-C-M2-C-M1, M1-C-M2-C-HA, M2-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-M2, HA-K-M2-C-M1, M1-C-M2-K-HA, M2-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-M2, HA-C-M2-K-M1, M1-K-M2-C-HA, M2-K-M1-C-HA, HA-K-M1-NS1, HA-K-NS1-M1, M1-NS1-K-HA, NS1-M1-K-HA, HA-M1-K-NS1, HA-NS1-K-M1, M1-K-NS1-HA, NS1-K-M1-HA, HA-K-M1-K-NS1, HA-K-NS1-K-M1, M1-K-NS1-K-HA, NS1-K-M1-K-HA, HA-C-M1-NS1, HA-C-NS1-M1, M1-NS1-C-HA, NS1-M1-C-HA, HA-M1-C-NS1, HA-NS1-C-M1, M1-C-NS1-HA, NS1-C-M1-HA, HA-C-M1-C-NS1, HA-C-NS1-C-M1, M1-C-NS1-C-HA, NS1-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-NS1, HA-K-NS1-C-M1, M1-C-NS1-K-HA, NS1-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-NS1, HA-C-NS1-K-M1, M1-K-NS1-C-HA, NS1-K-M1-C-HA, HA-K-M1-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-M1, M1-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-M1-K-HA, HA-M1-K-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-K-M1, M1-K-NS2/NEP-HA, NS2/NEP-K-M1-HA, HA-K-M1-K-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-K-M1, M1-K-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-K-M1-K-HA, HA-C-M1-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-M1, M1-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-M1-C-HA, HA-M1-C-NS2/NEP, HA-NS2/NEP-C-M1, M1-C-NS2/NEP-HA, NS2/NEP-C-M1-HA, HA-C-M1-C-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-C-M1, M1-C-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-NS2/NEP, HA-K-NS2/NEP-C-M1, M1-C-NS2/NEP-K-HA, NS2/NEP-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-NS2/NEP, HA-C-NS2/NEP-K-M1, M1-K-NS2/NEP-C-HA, NS2/NEP-K-M1-C-HA, HA-K-M1-PA, HA-K-PA-M1, M1-PA-K-HA, PA-M1-K-HA, HA-M1-K-PA, HA-PA-K-M1, M1-K-PA-HA, PA-K-M1-HA, HA-K-M1-K-PA, HA-K-PA-K-M1, M1-K-PA-K-HA, PA-K-M1-K-HA, HA-C-M1-PA, HA-C-PA-M1, M1-PA-C-HA, PA-M1-C-HA, HA-M1-C-PA, HA-PA-C-M1, M1-C-PA-HA, PA-C-M1-HA, HA-C-M1-C-PA, HA-C-PA-C-M1, M1-C-PA-C-HA, PA-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-PA, HA-K-PA-C-M1, M1-C-PA-K-HA, PA-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-PA, HA-C-PA-K-M1, M1-K-PA-C-HA, PA-K-M1-C-HA, HA-K-M1-PB1, HA-K-PB1-M1, M1-PB1-K-HA, PB1-M1-K-HA, HA-M1-K-PB1, HA-PB1-K-M1, M1-K-PB1-HA, PB1-K-M1-HA, HA-K-M1-K-PB1, HA-K-PB1-K-M1, M1-K-PB1-K-HA, PB1-K-M1-K-HA, HA-C-M1-PB1, HA-C-PB1-M1, M1-PB1-C-HA, PB1-M1-C-HA, HA-M1-C-PB1, HA-PB1-C-M1, M1-C-PB1-HA, PB1-C-M1-HA, HA-C-M1-C-PB1, HA-C-PB1-C-M1, M1-C-PB1-C-HA, PB1-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-PB1, HA-K-PB1-C-M1, M1-C-PB1-K-HA, PB1-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-PB1, HA-C-PB1-K-M1, M1-K-PB1-C-HA, PB1-K-M1-C-HA, HA-K-M1-PB2, HA-K-PB2-M1, M1-PB2-K-HA, PB2-M1-K-HA, HA-M1-K-PB2, HA-PB2-K-M1, M1-K-PB2-HA, PB2-K-M1-HA, HA-K-M1-K-PB2, HA-K-PB2-K-M1, M1-K-PB2-K-HA, PB2-K-M1-K-HA, HA-C-M1-PB2, HA-C-PB2-M1, M1-PB2-C-HA, PB2-M1-C-HA, HA-M1-C-PB2, HA-PB2-C-M1, M1-C-PB2-HA, PB2-C-M1-HA, HA-C-M1-C-PB2, HA-C-PB2-C-M1, M1-C-PB2-C-HA, PB2-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-PB2, HA-K-PB2-C-M1, M1-C-PB2-K-HA, PB2-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-PB2, HA-C-PB2-K-M1, M1-K-PB2-C-HA, PB2-K-M1-C-HA, HA-K-M1-PB1F2, HA-K-PB1F2-M1, M1-PB1F2-K-HA, PB1F2-M1-K-HA, HA-M1-K-PB1F2, HA-PB1F2-K-M1, M1-K-PB1F2-HA, PB1F2-K-M1-HA, HA-K-M1-K-PB1F2, HA-K-PB1F2-K-M1, M1-K-PB1F2-K-HA, PB1F2-K-M1-K-HA, HA-C-M1-PB1F2, HA-C-PB1F2-M1, M1-PB1F2-C-HA, PB1F2-M1-C-HA, HA-M1-C-PB1F2, HA-PB1F2-C-M1, M1-C-PB1F2-HA, PB1F2-C-M1-HA, HA-C-M1-C-PB1F2, HA-C-PB1F2-C-M1, M1-C-PB1F2-C-HA, PB1F2-C-M1-C-HA, HA-K-M1-C-PB1F2, HA-K-PB1F2-C-M1, M1-C-PB1F2-K-HA, PB1F2-C-M1-K-HA, HA-C-M1-K-PB1F2, HA-C-PB1F2-K-M1, M1-K-PB1F2-C-HA, PB1F2-K-M1-C-HA, HA-K-M2, M2-K-HA, HA-K-M2-M2, M2-M2-K-HA, HA-M2-K-M2, M2-K-M2-HA, HA-K-M2-K-M2, M2-K-M2-K-HA, HA-C-M2, M2-C-HA, HA-C-M2-M2, M2-M2-C-HA, HA-M2-C-M2, M2-C-M2-HA, HA-C-M2-C-M2, M2-C-M2-C-HA, HA-K-M2-C-M2, M2-C-M2-K-HA, HA-C-M2-K-M2, M2-K-M2-C-HA, HA-K-M2-NS1, HA-K-NS1-M2, M2-NS1-K-HA, NS1-M2-K-HA, HA-M2-K-NS1, HA-NS1-K-M2, M2-K-NS1-HA, NS1-K-M2-HA, HA-K-M2-K-NS1, HA-K-NS1-K-M2, M2-K-NS1-K-HA, NS1-K-M2-K-HA, HA-C-M2-NS1, HA-C-NS1-M2, M2-NS1-C-HA, NS1-M2-C-HA, HA-M2-C-NS1, HA-NS1-C-M2, M2-C-NS1-HA, NS1-C-M2-HA, HA-C-M2-C-NS1, 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PB2-K-PA-C-NA, NA-K-PA-PB1F2, NA-K-PB1F2-PA, PA-PB1F2-K-NA, PB1F2-PA-K-NA, NA-PA-K-PB1F2, NA-PB1F2-K-PA, PA-K-PB1F2-NA, PB1F2-K-PA-NA, NA-K-PA-K-PB1F2, NA-K-PB1F2-K-PA, PA-K-PB1F2-K-NA, PB1F2-K-PA-K-NA, NA-C-PA-PB1F2, NA-C-PB1F2-PA, PA-PB1F2-C-NA, PB1F2-PA-C-NA, NA-PA-C-PB1F2, NA-PB1F2-C-PA, PA-C-PB1F2-NA, PB1F2-C-PA-NA, NA-C-PA-C-PB1F2, NA-C-PB1F2-C-PA, PA-C-PB1F2-C-NA, PB1F2-C-PA-C-NA, NA-K-PA-C-PB1F2, NA-K-PB1F2-C-PA, PA-C-PB1F2-K-NA, PB1F2-C-PA-K-NA, NA-C-PA-K-PB1F2, NA-C-PB1F2-K-PA, PA-K-PB1F2-C-NA, PB1F2-K-PA-C-NA, NA-K-PB1, PB1-K-NA, NA-K-PB1-PB1, PB1-PB1-K-NA, NA-PB1-K-PB1, PB1-K-PB1-NA, NA-K-PB1-K-PB1, PB1-K-PB1-K-NA, NA-C-PB1, PB1-C-NA, NA-C-PB1-PB1, PB1-PB1-C-NA, NA-PB1-C-PB1, PB1-C-PB1-NA, NA-C-PB1-C-PB1, PB1-C-PB1-C-NA, NA-K-PB1-C-PB1, PB1-C-PB1-K-NA, NA-C-PB1-K-PB1, PB1-K-PB1-C-NA, NA-K-PB1-PB2, NA-K-PB2-PB1, PB1-PB2-K-NA, PB2-PB1-K-NA, NA-PB1-K-PB2, NA-PB2-K-PB1, PB1-K-PB2-NA, PB2-K-PB1-NA, NA-K-PB1-K-PB2, NA-K-PB2-K-PB1, PB1-K-PB2-K-NA, PB2-K-PB1-K-NA, NA-C-PB1-PB2, NA-C-PB2-PB1, PB1-PB2-C-NA, PB2-PB1-C-NA, NA-PB1-C-PB2, NA-PB2-C-PB1, PB1-C-PB2-NA, PB2-C-PB1-NA, NA-C-PB1-C-PB2, NA-C-PB2-C-PB1, PB1-C-PB2-C-NA, PB2-C-PB1-C-NA, NA-K-PB1-C-PB2, NA-K-PB2-C-PB1, PB1-C-PB2-K-NA, PB2-C-PB1-K-NA, NA-C-PB1-K-PB2, NA-C-PB2-K-PB1, PB1-K-PB2-C-NA, PB2-K-PB1-C-NA, NA-K-PB1-PB1F2, NA-K-PB1F2-PB1, PB1-PB1F2-K-NA, PB1F2-PB1-K-NA, NA-PB1-K-PB1F2, NA-PB1F2-K-PB1, PB1-K-PB1F2-NA, PB1F2-K-PB1-NA, NA-K-PB1-K-PB1F2, NA-K-PB1F2-K-PB1, PB1-K-PB1F2-K-NA, PB1F2-K-PB1-K-NA, NA-C-PB1-PB1F2, NA-C-PB1F2-PB1, PB1-PB1F2-C-NA, PB1F2-PB1-C-NA, NA-PB1-C-PB1F2, NA-PB1F2-C-PB1, PB1-C-PB1F2-NA, PB1F2-C-PB1-NA, NA-C-PB1-C-PB1F2, NA-C-PB1F2-C-PB1, PB1-C-PB1F2-C-NA, PB1F2-C-PB1-C-NA, NA-K-PB1-C-PB1F2, NA-K-PB1F2-C-PB1, PB1-C-PB1F2-K-NA, PB1F2-C-PB1-K-NA, NA-C-PB1-K-PB1F2, NA-C-PB1F2-K-PB1, PB1-K-PB1F2-C-NA, PB1F2-K-PB1-C-NA, NA-K-PB2, PB2-K-NA, NA-K-PB2-PB2, PB2-PB2-K-NA, NA-PB2-K-PB2, PB2-K-PB2-NA, NA-K-PB2-K-PB2, PB2-K-PB2-K-NA, NA-C-PB2, PB2-C-NA, NA-C-PB2-PB2, PB2-PB2-C-NA, 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또는 PB1F2-K-PB1F2-C-NA. 가장 바람직하게는, 배열은 NP-K-M1-C-HA이다.
본 발명의 범주 내에서, 모든 단백질은 임의의 다른 단백질과 조합될 수 있으며, 임의의 두 개의 단백질은 절단 부위 또는 링커 펩타이드에 의해서 결합 또는 연결될 수 있거나 없다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이며, 특히 바람직하게는 오르토믹소바이러스 감염, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이고/이거나, 오르토믹소바이러스 감염, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하는 의약을 제조하는데 사용하기 위한 것이고/이거나, 오르토믹소바이러스 감염, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 면역 반응, 바람직하게는 오르토믹소바이러스 감염, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 B 세포 면역 반응을 증진시키는데 사용하기 위한 것이다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, HA는 여덟 번째 관점에 따라 정의된다.
제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 바이러스 단백질은 서열번호 13에 따르는 아미노산 또는 그의 변이체를 갖고/갖거나, 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 변이체에 의해 암호화되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 암호화된 삼중 항원 단백질 NP-M1-H1p은 2A 서열에 의해서 세포질성 NP-M1 융합 단백질 및 막 스패닝 (spanning) H1p 단백질로 가공된다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 오르토믹소바이러스 감염, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
더욱 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 면역 반응, 바람직하게는 오르토믹소바이러스 단백질, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 단백질에 대한 B 세포 면역 반응을 증진시키는데 사용하기 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 제1, 제2 및/또는 제3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 벡터들은 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 및 인공 염색체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명을 실행하는데 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바람직하게는 람다 파지 및 필라멘트상 파지 벡터, 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, 비-복제성 Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3 벡터 또는 복제-가능 Ad4 및 Ad7 벡터), 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, AAV 타입 5 및 타입 2), 알파바이러스 벡터 (예를 들어, 베네주엘라 말뇌염 바이러스 (VEE), 신드비스 바이러스 (SIN), 셈리키 삼림열 바이러스 (SFV), 및 VEE-SIN 키메라), 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 레수스 사이토메갈로바이러스 (RhCMV) (14)와 같은 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 벡터), 아레나 바이러스 벡터 (예를 들어, 림프구성 맥락뇌막염 바이러스 (LCMV) 벡터 (15)), 홍역 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA), NYVAC (백시니아의 코펜하겐 스트레인으로부터 유도됨), 및 아비폭스 바이러스: 카나리폭스 (ALVAC) 및 계두 (FPV) 벡터), 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 바이러스-유사 입자, 및 박테리아 포자로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 벡터 ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 및 ChAd82는 WO 2005/071093에 상세히 기술되어 있다. 벡터 PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, 및 ChAd147은 WO 2010/086189에 기술되어 있다. 벡터는 MVA, ChAd63 및 PanAd3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 의약에서 사용하기 위한 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 특히 바람직하게는 RSV 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
두 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템에 의해 암호화된 분리된 단백질 혼합물을 제공한다. 바람직하게는, 분리된 단백질 혼합물은 첫 번째 관점의 발현 시스템에 의해 암호화된 하나 이상의 바이러스 단백질을 함유하거나, 본질적으로 함유하거나, 포함한다.
바람직한 구체예에서, 분리된 단백질 혼합물은 의약에서 사용하기 위한 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 분리된 단백질 혼합물은 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이며, 특히 바람직하게는 RSV 감염의 예방 또는 치료, 또는 인플루엔자 A 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
세 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템 및/또는 두 번째 관점의 단백질 혼합물을 함유하는 분리된 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 원핵세포 (예를 들어, 박테리아 세포) 또는 진핵세포 (예를 들어, 진균, 식물 또는 동물 세포)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 의약에서 사용하기 위한 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이며, 특히 바람직하게는 RSV 감염의 예방 또는 치료에 또는 인플루엔자 A 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
네 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템 또는 두 번째 관점의 단백질 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 약제학적 조성물이다.
네 번째 관점의 조성물은 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위하여 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태인 치료학적 유효량의 화합물을 함유한다. 제형은 투여의 방식과 부합하여야 한다.
조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 환제, 캡슐제, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세라이드와 같은 담체와 함께 좌제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 고체 또는 액체일 수 있다.
고체 형태 조성물에는 분말, 정제, 환제, 캡슐제, 로젠지 (lozenges), 카세제 (cachets), 좌제 및 분산성 과립이 포함된다. 고체 부형제는 또한 희석제, 방향제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제, 또는 캡슐화 물질로 작용할 수도 있는 하나 이상의 물질일 수 있다. 분말에서, 부형제는 바람직하게는 본 발명의 미분된 억제제와의 혼합물로 존재하는 미분된 고체이다. 정제에서, 활성성분은 필요한 결합 특성을 갖는 담체와 적합한 비율로 혼합시키고, 원하는 형상 및 크기로 압축시킨다. 적합한 부형제는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토즈, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이다. 좌제를 제조하기 위해서는, 지방산 글리세라이드의 혼합물 또는 코코아 버터와 같은 저융점 왁스를 우선 용융시키고, 활성성분을 교반함으로써 그 안에 균질하게 분산시킨다. 그 후, 용융된 균질 혼합물을 편리한 크기의 주형에 붓고, 냉각시킴으로써 고체화시킨다. 정제, 분말, 캡슐제, 환제, 카세제, 및 로젠지가 경구 투여에 적합한 고체 투약형으로 사용될 수 있다.
액체 형태 조성물에는 예를 들어, 물, 식염수 용액, 수성 덱스트로즈, 글리세롤 용액 또는 물/프로필렌 글리콜 용액 중의 용액, 현탁액 및 에멀전이 포함된다. 약제학적 조성물이 정맥내로, 또는 분무기에 의해서 비내로 투여되는 경우에는 식염수 용액이 바람직한 담체이다. 비경구 주사의 경우에, 액체 제제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 수용액 중의 용액으로 제형화될 수 있다.
이 관점의 특히 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀전의 형태이며, 분무기에 의해서 비내로 투여된다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 단위 투약형이다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성성분을 함유하는 단위 용량으로 세분될 수 있다. 단위 투약형은 포장된 조성물일 수 있으며, 포장은 패킷화된 정제, 캡슐제, 및 바이알 또는 앰플 중의 분말과 같은 조성물의 분리량을 함유한다. 또한, 단위 투약형은 캡슐제, 주사용 바이알, 정제, 카세제, 또는 로젠지 그 자체일 수 있거나, 이것은 포장된 형태로 이들 중의 어떤 것의 적절한 수일 수 있다.
필요한 경우에, 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다.
더구나, 이러한 조성물은 또한 보조제 및/또는 추가의 활성성분과 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 다른 약물학적 활성물질을 포함할 수도 있다.
본 발명과 관련한 보조제의 예로는 무기 보조제, 유기 보조제, 오일계 보조제, 사이토킨, 미립상 보조제, 바이로좀, 박테리아 보조제, 합성 보조제, 또는 합성 폴리뉴클레오타이드 보조제가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
추가의 활성성분에는 다른 백신 화합물 또는 조성물이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 추가의 활성성분은 또 다른 바이러스 백신, 더욱 바람직하게는 DNA 바이러스, 음성 센스 단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스에 대한 백신이다. 추가로 바람직하게는, 바이러스는 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 외피 ssRNA(-) 바이러스로부터, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 추가의 활성성분은 바람직하게는 뉴모비리나에, 파라믹소비리나에, 페-데-랑 바이러스, 나리바-바이러스, 살렘-바이러스, 투파야-파라믹소바이러스, 베이롱-바이러스, J-바이러스, 메낭글-바이러스, 모스만-바이러스, 및 무라야마-바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된 파라믹소바이러스에 대한 백신이다. 뉴모비리나에는 뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV), 및 메타뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 메타뉴모바이러스, 조류 메타뉴모바이러스)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다. 파라믹소비리나에는 레스피로바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3), 및 루불라바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다. 대안적으로 또는 추가로, 추가의 활성성분은 바람직하게는 오르토믹소바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 토고토바이러스 및 이사바이러스의 속으로부터 선택된 오르토믹소바이러스에 대한 또 다른 바이러스 백신이다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 오르토믹소바이러스는 인플루엔자바이러스 A, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7으로부터 선택된 인플루엔자바이러스 A, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1이다.
다섯 번째 관점에서, 본 발명은 바이러스 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 첫 번째 관점의 발현 시스템, 두 번째 관점의 분리된 단백질 혼합물, 세 번째 관점의 분리된 숙주 세포 또는 네 번째 관점의 조성물을 제공한다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 바이러스 질환은 DNA 바이러스, 음성 센스 단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스에 의해서 야기된다. 추가로 바람직하게는, 바이러스는 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 외피 ssRNA(-) 바이러스로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 파라믹소바이러스는 바람직하게는 뉴모비리나에, 파라믹소비리나에, 페-데-랑 바이러스, 나리바-바이러스, 살렘-바이러스, 투파야-파라믹소바이러스, 베이롱-바이러스, J-바이러스, 메낭글-바이러스, 모스만-바이러스, 및 무라야마-바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 뉴모비리나에는 뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV), 및 메타뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 메타뉴모바이러스, 조류 메타뉴모바이러스)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 파라믹소비리나에는 레스피로바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3), 및 루불라바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 대안적으로 또는 추가로, 바이러스 질환은 바람직하게는 오르토믹소바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 토고토바이러스 및 이사바이러스의 속으로부터 선택된 오르토믹소바이러스에 의해서 야기된다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 오르토믹소바이러스는 인플루엔자바이러스 A, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7으로부터 선택된 인플루엔자바이러스 A, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1이다.
여섯 번째 관점에서, 본 발명은 바이러스 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 첫 번째 관점의 발현 시스템, 두 번째 관점의 분리된 단백질 혼합물, 세 번째 관점의 분리된 숙주 세포 또는 네 번째 관점의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 바이러스 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 바이러스 질환은 DNA 바이러스, 음성 센스 단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스에 의해서 야기된다. 추가로 바람직하게는, 바이러스는 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 외피 ssRNA(-) 바이러스로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 파라믹소바이러스는 바람직하게는 뉴모비리나에, 파라믹소비리나에, 페-데-랑 바이러스, 나리바-바이러스, 살렘-바이러스, 투파야-파라믹소바이러스, 베이롱-바이러스, J-바이러스, 메낭글-바이러스, 모스만-바이러스, 및 무라야마-바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 뉴모비리나에는 뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV), 및 메타뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 메타뉴모바이러스, 조류 메타뉴모바이러스)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 파라믹소비리나에는 레스피로바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3), 및 루불라바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 대안적으로 또는 추가로, 바이러스 질환은 바람직하게는 오르토믹소바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 토고토바이러스 및 이사바이러스의 속으로부터 선택된 오르토믹소바이러스에 의해서 야기된다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 오르토믹소바이러스는 인플루엔자바이러스 A, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7으로부터 선택된 인플루엔자바이러스 A, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1이다.
일곱 번째 관점에서, 본 발명은 첫 번째 관점의 발현 시스템, 두 번째 관점의 단백질 혼합물, 세 번째 관점의 세포 및 네 번째 관점의 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 면역원에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 면역원은 병원체이며, 더욱 바람직하게는 면역원은 바이러스이다. 바람직하게는, 바이러스는 DNA 바이러스, 음성 센스 단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가로 바람직하게는, 바이러스는 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 외피 ssRNA(-) 바이러스로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 파라믹소바이러스는 바람직하게는 뉴모비리나에, 파라믹소비리나에, 페-데-랑 바이러스, 나리바-바이러스, 살렘-바이러스, 투파야-파라믹소바이러스, 베이롱-바이러스, J-바이러스, 메낭글-바이러스, 모스만-바이러스, 및 무라야마-바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 뉴모비리나에는 뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV), 및 메타뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 메타뉴모바이러스, 조류 메타뉴모바이러스)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 파라믹소비리나에는 레스피로바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3), 및 루불라바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 대안적으로 또는 추가로, 바이러스 질환은 바람직하게는 오르토믹소바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 토고토바이러스 및 이사바이러스의 속으로부터 선택된 오르토믹소바이러스에 의해서 야기된다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 오르토믹소바이러스는 인플루엔자바이러스 A, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7으로부터 선택된 인플루엔자바이러스 A, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1이다.
여덟 번째 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화한 뉴클레오타이드 구조물, 이들 뉴클레오타이드 구조물을 포함하는 발현 시스템, 및 상기 뉴클레오타이드 구조물에 의해 암호화된 단백질 또는 다단백질을 제공하며, 여기에서 HA0 절단 부위는 다염기성 서열을 갖는다.
이 관점의 핵산 구조물은 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 그들로 본질적으로 구성되거나, 구성되며, 여기에서 HA0 절단 부위는 하나 이상의 염기성 아미노산을 도입시킴으로써 변형된다. 바람직하게는, 변형된 HA에서 공통 HA 유전자의 HA0 절단 부위는 편재하는 프로테아제에 의해서 절단되어 완전히 처리된 HA (Hlp)를 수득하는 H5N1의 다염기성 절단 부위에 의해서 치환되었다.
인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)은 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 바이러스 헤마글루티닌의 그룹에 속하는 단백질이다. 이것은 바이러스를 감염될 세포에 결합시키는데 책임이 있는 항원성 당단백질이다. 인플루엔자 헤마글루티닌과 같은 HA 단백질은 막 상의 시알산에 의해 상기도의 세포 또는 적혈구와 같은 세포에 연결한다. 여기에는 적어도 16 개의 상이한 HA 항원이 있다. 이들 혈청형 또는 아형은 H1 내지 H16으로 명명된다.
HA는 하기 두 가지 기능을 갖는다:
1. 시알산-함유 수용체에 대한 연결에 의한 표적 세포의 인식.
2. 숙주 엔도좀 막과 바이러스 막 (외피)의 융합을 야기함으로써 바이러스 게놈의 표적 세포 내로의 진입을 매개함. 상세하게는, HA는 그의 표적 세포의 표면에 존재하는 모노사카라이드 시알산에 연결한다. 그 후, 세포막은 바이러스를 삼키고, 바이러스를 봉입한 막의 부분은 엔도좀을 형성한다. 그 후, 엔도좀은 산성화되고, 이것은 라이소좀 (lysosome)으로 변형된다. 엔도좀 내의 pH가 약 6.0으로 떨어지자마자, HA 분자의 원래의 접힌 구조는 불안정하게 되어 이것이 부분적으로 펼쳐지도록 하고, 그의 펩타이드 쇄의 소수성 부분을 방출한다. 이 융합 펩타이드는 엔도좀 막 내로의 삽입물로 작용한다. 그 후, HA 분자의 잔여 부분은 새로운 구조로 다시 접히고, 그의 RNA 게놈을 포함한 바이러스의 내용물이 세포의 세포질 내로 방출되도록 바이러스 막과 엔도좀 막의 융합을 야기한다.
그의 막 융합 가능성을 획득하기 위해서, HA0는 반드시 숙주 세포 프로테아제에 의해서 HA1 및 HA2로 절단되어야 한다. 절단은 부분적으로 표면 노출된 루프 (loop) 상에 위치하는 HA1 및 HA2 아단위를 결합하는 링커 서열에서 일어난다. 인플루엔자 HA의 H0 절단 부위는 H1N1 아형 (서열번호 8의 aa 339 내지 344), H5N1 아형 (서열번호 10의 aa 337 내지 346) 및 H3N2 (서열번호 20의 aa 340 내지 350) 내의 약 aa 340에 위치한다. 인플루엔자 바이러스 HA의 다른 아형에서의 H0 절단 부위의 위치는 서열 정렬을 수행하고, 본 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해 서열 상동성을 분석함으로써 숙련된 전문가에 의해서 결정될 수 있다. 아형 H1N1 및 H3N2의 인플루엔자 A 바이러스 HA는 융합-적합 상태로 이행하기 위해서 숙주 세포 프로테아제에 의한 절단을 필요로 한다. 인플루엔자 바이러스의 단백분해적 활성화는 골지체 (Golgi apparatus)에서, 또는 감염된 세포의 원형질막에서뿐만 아니라 세포외 공간에서 및 표적 세포 소포체에서 일어날 수 있으며, 따라서 절단 부위의 성질 및 각각의 화성화 프로테아제는 인플루엔자 바이러스의 생물학적 특성뿐만 아니라 치료학적 개입에 중요한 연관성을 갖는다. 아형 H5N1의 HA는 절단 부위에서 몇 개의 아르기닌 및 리신 잔기를 수용하는 것으로 나타났으며, 여기에서 R-X-R/K-R 공통 서열은 효율적인 절단에 꼭 필요한 것이다. 또한, HA의 절단이 트랜스-골지 네트워크 (trans-Golgi network; TGN)에서 나타날 수 있다는 증거를 수득하였다. 이들 바이러스는 퓨린에 의해서 활성화되는 것으로 입증되었다.
서열번호 8의 아미노산 서열은 2009년 4월부터 9월까지에 세계적으로 유포된 것으로, NCBI 인플루엔자 바이러스 리소스 데이터베이스 (Resource Database)에서 주석을 단 H1N1 아형의 829 서열의 정렬로부터 유래된 공통 서열이다. 서열번호 9의 아미노산 서열은 천연 H0 프로테아제 절단 부위가 H5N1로부터의 다염기성 부위로 치환된 것을 제외하고는 서열번호 8과 동일하다. 서열번호 10의 아미노산 서열은 1990년부터 2009년까지 세계적으로 인간을 감염시킨 것으로, NCBI 인플루엔자 바이러스 리소스 데이터베이스에서 주석을 단 H5N1 아형의 259 서열의 정렬로부터 유래된 공통 서열이다. 서열번호 20의 아미노산 서열은 인플루엔자 A 바이러스 아형 H3N2, 스트레인 A/Wellington/01/2004(H3N2)의 HA의 서열이다. 서열번호 21의 아미노산 서열은 서열번호 20을 기초로 하며, 여기에서 천연 H0 프로테아제 절단 부위는 H5N1로부터 유래된 다염기성 부위에 의해서 치환되었다.
서열번호 11의 아미노산 서열은 다양한 인플루엔자 아형 공통 서열의 정렬을 기초로 하여 디자인된 NP 공통 서열이다. 또한, 서열번호 11의 NP 서열은 세포질 발현을 증가시키기 위해서 aa 6 내지 8 (TRK 내지 AAA)에 있는 핵 국재화 시그날 (Nuclear Localization Signal)이 결여되어 있다.
서열번호 12의 아미노산 서열은 정렬하여 각 위치에서 가장 공통적인 아미노산을 선택하는 다양한 공통 서열의 정렬에 의해서 유래된 M1 공통 서열이다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 핵산 구조물 및/또는 이 핵산 구조물을 포함하는 발현 시스템은 HA의 전사 및 번역을 지시하는 요소, 및 이하에 개략적으로 기술된 바람직한 구체예에 포함될 수 있는, 핵산 구조물 및/또는 발현 시스템에 의해 암호화된 임의의 추가의 단백질을 포함한다. 이러한 요소에는 무세포 또는 세포-기반 시스템, 바람직하게는 세포-기반 시스템에서 mRNA의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 요소가 포함된다. 폴리뉴클레오타이드가 번역가능한 RNAs로 제공되는 또 다른 구체예에서, 발현 시스템은 HA 및/또는 T 세포 유도성 단백질(들), 예를 들어, 폴리A-테일, IRES, 캡 구조 등을 암호화한 RNAs의 번역 및/또는 안정화에 필요한 이들 요소를 포함하는 것으로 생각된다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 핵산 구조물은 변형된 HO 절단 부위를 포함하는 HA 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화하며, 여기에서 HA는 H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 그의 변이체 또는 그의 공통 서열로 구성된 HA 아형의 그룹, 또는 그의 변이체 또는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16으로 구성된 HA 아형의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 HA 아형의 공통 서열로부터 선택된다. 바람직하게는, HA 아형은 H1, H2, H3, H7, H9, H10, 또는 그의 변이체 또는 그의 공통 서열, 또는 H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10으로 구성된 HA 아형의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 HA 아형의 변이체 또는 공통 서열로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 HO 절단 부위를 포함하는 HA 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 아형 H1 또는 그의 변이체로부터의 HA이다. 가장 바람직하게는, 뉴클레오타이드 구조물의 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9의 서열을 갖는다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 핵산 구조물은 HA 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화하며, 여기에서 H0 절단 부위는 적어도 하나의 비-염기성 아미노산을 염기성 아미노산에 의해 치환시키고/시키거나 적어도 하나의 염기성 아미노산을 HO 절단 부위의 서열에 도입시킴으로써 변형된다. 바람직하게는, 염기성 아미노산은 아르기닌 (Arg; R), 리신 (Lys; K) 및 히스티딘 (His, H)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 염기성 아미노산은 아르기닌 (Arg; R) 및 리신 (Lys; K)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 절단 부위는 6 내지 12 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10 내지 12 개의 아미노산의 서열을 포함한다.
바람직하게는, HO 절단 부위를 형성하는 폴리펩타이드의 아미노산의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%는 염기성 아미노산이다.
바람직하게는, HA0 절단 부위는 PQRERRRKKR (서열번호 15), PQRESRRKKR (서열번호 16), PQGERRRKKR (서열번호 17), PLRERRRKR (서열번호 18) 및 PQRETR (서열번호 19)로 구성된 그룹으로 선택된 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, HA0 절단 부위는 서열 PQRERRRKKR (서열번호 15)을 갖는다.
하기 표 1에서는, H1N1 스트레인의 HO 절단 부위의 서열 및 H5N1 스트레인의 HO 절단 부위의 서열을 HA 아미노산 쇄의 그들의 각각의 맥락에서 비교한다. 첫 번째 라인에는, 매우 병원성인 H5N1 아형의 HO 다염기성 절단 부위의 공통 서열이 표시된다. 두 번째 라인에는, H1N1 야생형 스트레인의 HA의 HO 절단 부위의 아미노산 서열이 표시된다. 세 번째 라인에는, 천연 서열을 대체하는 Hlp 단백질 내의 다염기성 절단 부위의 조작된 서열을 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
본 발명의 여덟 번째 관점의 구체예에서, 핵산 구조물은 변형된 HA 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 암호화한 발현 시스템의 일부분이다. 이 발현 시스템에서, 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 별도의 벡터 또는 동일한 벡터 상에 포함된다. 따라서, 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터 상에 포함될 수 있고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 벡터 상에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함될 수 있다. 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함되는 것이 바람직하다. 동일한 벡터 상에 포함된 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 이들이 다단백질로 발현되도록 하는 방식으로 연결되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성한다.
변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 인공 다단백질로 발현되는 것이 바람직하다. 본 발명과 관련하여, 용어 "인공 다단백질"은 천연적으로 존재하지 않는, 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용함으로써 생성된 다단백질을 대상으로 한다. 따라서, 이 인공 다단백질에서 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 바람직하게는, 그의 게놈이 본 발명의 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 포함하는 다단백질을 암호화하지 않는 병원체로부터 유래된다. 바람직하게는, 변형된 HA를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 둘 다 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래된다.
여덟 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 T 세포 반응을 유도하며, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질인 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. 바람직하게는, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
변형된 HA 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 (내부) 단백질의 아미노산 서열은 하나 이상의 상이한 바이러스 분리체의 연속적 분절 또는 공통 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명과 관련하여, 용어 "분절"은 단백질 또는 다단백질의 일부분을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 분절은 그의 영역, 에피토프 또는 단편과 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 단백질 또는 다단백질의 잔여 부분과는 독립적으로 접히고/접히거나 작용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명과 관련하여 단백질 변이체는 그의 모 폴리펩타이드와 비교하여, 하나 또는 몇 개의 부위에서 일어남으로써 변이체가 그의 모 폴리펩타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 나타낼 수 있는 아미노산 교환, 삽입, 결실, N-말단 절단, 또는 C-말단 절단, 또는 이들 변화의 모든 조합과 같은 아미노산 서열에서의 변화에 있어서 상이한 것으로 이해된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 변형된 HA 또는 그의 변이체의 막 부착 영역은 기능적으로 결실되는데, 따라서 구조적으로 결실되거나 구조적으로 존재하지만 그의 생물학적 기능을 충족시키지 않는다. 특히 바람직한 구체예에서는, 막 부착 영역에 상응하는 아미노산 서열이 결실된다. 막 부착 부분의 결실은 본 발명의 발현 시스템이 도입된 세포로부터 항-병원성 B 세포 반응 유도성 단백질이 분비되는지를 확인할 목적에 도움을 준다.
이 관점의 추가의 바람직한 구체예에서, 변형된 HA는 내형질세망 (ER)에 대해 단백질을 표적화하는 분비 시그날을 포함한다. 이러한 분비 시그날은 바람직하게는, 결실된 막 부착 영역과 관련하여 존재한다. 숙련된 전문가는 예를 들어, 변형된 HA의 N-말단에 첨가된 이종 분비 시그날로 사용될 수 있는 이러한 다양한 분비 시그날을 잘 알고 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어, 구조 및/또는 표면 바이러스 단백질의 대부분에 존재하는 천연적으로 존재하는 분비 시그날이 사용될 수 있다. 따라서, 각각의 단백질에 천연적으로 존재한다면, 분비 시그날은 구조 및/또는 표면 단백질의 변형된 형태에서 유지되는 것이 바람직하다.
여덟 번째 관점의 구체예에서, 비-구조 단백질은 세포독성 T 세포 (CTL), T 헬퍼 세포 (TH 세포), 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 작동자 기억 T 세포 (TEM 세포), 및 조절성 T 세포 (Treg 세포)와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 항원-특이적 T 림프구의 활성화를 수반하는 병원체에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 적합한 보존된 내부 단백질이다. 따라서, 바람직하게는 병원체의 T 세포 유도성 단백질은 분비 시그날을 포함하지 않는다.
본 발명과 관련하여, 변형된 HA 또는 그의 변이체는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 N- 또는 C-말단적으로 위치한다. 바람직한 구체예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 변형된 HA 또는 그의 변이체에 관해서 C-말단적으로 위치한다.
여덟 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 절단 부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 변형된 HA 또는 그의 변이체와 제2 폴리뉴클레오타이드의 사이에 위치한다. 본 발명의 범주 내에서는, 임의의 두 개의 단백질은 절단 부위에 의해서 결합 또는 연결될 수 있거나 없을 수 있다.
이 절단 부위는 자가-절단 부위 (즉, 이러한 절단이 임의의 추가의 분자를 수반함이 없이 서열이 절단되거나 절단될 수 있거나, 서열 내의 펩타이드-결합 형성이 우선 방지되는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위) 또는 엔도펩티다제 절단 부위 (즉, 서열이 엔도펩티다제, 예를 들어, 트립신, 펩신, 엘라스타제, 트롬빈, 콜라게나제, 퓨린, 터몰리신, 엔도펩티다제 V8, 카텝신에 의해서 절단되거나 절단될 수 있는 경우의 아미노산 서열 내의 절단 부위)인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 자가-절단 부위는 피코르나바이러스, 곤충 바이러스, 아프토비리대, 로타바이러스 및 트리파노소마의 바이러스성 2A 펩타이드 또는 2A-유사 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 2A 절단 부위이며, 바람직하게는 여기에서 2A 절단 부위는 구제역 바이러스의 2A 펩타이드이다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 다단백질은 오토프로테아제, 즉 프로테아제를 또한 포함하는 동일한 단백질 분자 내의 펩타이드 결합을 절단하는 프로테아제에 의해서 절단될 수 있다. 이러한 오토프로테아제의 예는 플라비바이러스로부터의 NS2 프로테아제 또는 비르나바이러스의 VP4 프로테아제이다.
본 발명과 관련하여, 절단 부위는 변형된 HA 또는 그의 변이체에 관해서 N-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 C-말단적으로 위치할 수 있다. 대안적으로, 절단 부위는 변형된 HA 또는 그의 변이체에 관해서 C-말단적으로, 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체에 관해서 N-말단적으로 위치할 수 있다.
여덟 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 추가로 병원체의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제3 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 변형된 HA 또는 그의 변이체와, 또는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체와 상이한 것이 바람직하다. 바람직하게는, 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체는 이들이 상이한 단백질의 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 서로 상이하다.
여덟 번째 관점의 바람직한 구체예에서, 제3 폴리뉴클레오타이드는 T 세포 반응을 유도하며, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질인 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한다. 바람직하게는, 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 비-구조 및/또는 내부 단백질은 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 또는 PB1-F2 (PB1F2)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 링커를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 제3 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 링커는 가요성 링커, 바람직하게는 서열번호 6 (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly)에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가요성 링커인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 제3 폴리뉴클레오타이드는 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드와 별도의, 또는 동일한 벡터 상에 포함된다.
따라서, 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 제2 벡터 상에 포함되며, 제3 폴리뉴클레오타이드는 제3 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함되고, 제3 폴리뉴클레오타이드는 별도의 벡터 상에 포함되거나, 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함되고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함되거나, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함되고, 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 상에 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 포함된다. 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 상에 포함될 수 있는 것이 바람직하다. 동일한 벡터 상에 포함된 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 이들이 다단백질로 발현되도록 하는 방식으로 연결되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 동일한 벡터 상에 포함된 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성한다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 변형된 HA 또는 그의 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 제2 및/또는 제3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 벡터들은 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 및 인공 염색체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명을 실행하는데 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바람직하게는 람다 파지 및 필라멘트상 파지 벡터, 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, 비-복제성 Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3 벡터 또는 복제-가능 Ad4 및 Ad7 벡터), 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, AAV 타입 5 및 타입 2), 알파바이러스 벡터 (예를 들어, 베네주엘라 말뇌염 바이러스 (VEE), 신드비스 바이러스 (SIN), 셈리키 삼림열 바이러스 (SFV), 및 VEE-SIN 키메라), 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 레수스 사이토메갈로바이러스 (RhCMV) (14)와 같은 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 벡터), 아레나 바이러스 벡터 (예를 들어, e.g. 림프구성 맥락뇌막염 바이러스 (LCMV) 벡터 (15)), 홍역 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA), NYVAC (백시니아의 코펜하겐 스트레인으로부터 유도됨), 및 아비폭스 바이러스: 카나리폭스 (ALVAC) 및 계두 (FPV) 벡터), 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 바이러스-유사 입자, 및 박테리아 포자로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 벡터 ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 및 ChAd82는 WO 2005/071093에 상세히 기술되어 있다. 벡터 PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, 및 ChAd147은 WO 2010/086189에 기술되어 있다. 벡터는 MVA, ChAd63 및 PanAd3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 뉴클레오타이드 구조물 또는 발현 시스템, 또는 뉴클레오타이드 구조물의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 시스템을 포함하는 벡터 또는 벡터들은 관심이 있는 유전자의 발현을 조절하는 "발현 조절 서열"을 포함할 수 있다. 또한, 발현 시스템은 관심이 있는 유전자의 발현을 조절하는 "발현 조절 서열"을 포함할 수 있다. 전형적으로, 발현 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터 또는 리프레서와 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다.
이 관점의 특히 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 오르토믹소바이러스로부터의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스로부터의 단백질, 펩타이드 또는 변이체를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템을 겨냥한 본 발명의 첫 번째 관점의 구체예에 따라 정의된다.
바람직한 구체예에서, 여덟 번째 관점의 핵산 구조물 및/또는 발현 시스템은 의약에서 사용하기 위한 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 이 관점의 핵산 구조물, 발현 시스템 또는 단백질은 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에서 사용하기 위해서 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서, 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 면역 반응을 증진시키는데 사용하기 위한 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 인플루엔자 A 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 본 발명의 첫 번째 관점에서 정의된 바와 같은 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항-병원성 B 세포 면역 반응을 증진시키는데 사용하기 위한 것이다.
아홉 번째 관점에서, 본 발명은 시험관내 및/또는 생체내에서 여덟 번째 관점의 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 발현할 수 있는 발현 시스템 또는 핵산 구조물을 구성하기 위한, 여덟 번째 관점에서 정의된 바와 같은 다염기성 HAO 절단 부위의 용도를 제공한다. 더구나, 이 관점은 이 관점에 따라 구성된 발현 시스템 또는 핵산 구조물에 의해 암호화된 분리된 단백질 혼합물, 단백질 및/또는 다단백질을 제공한다.
열 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 발현 시스템에 의해 암호화된 분리된 단백질 혼합물을 제공한다. 바람직하게는, 분리된 단백질 혼합물은 여덟 번째 관점의 발현 시스템 또는 핵산 구조물에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질 또는 다단백질을 함유하거나, 본질적으로 함유하거나, 포함한다. 바람직한 구체예에서, 분리된 단백질 혼합물은 의약에서 사용하기 위한 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 분리된 단백질 혼합물은 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 특히 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
열한 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질 및/또는 열 번째 관점의 단백질 혼합물을 함유하는 분리된 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 원핵성 (예를 들어, 박테리아 세포) 또는 진핵성 세포 (예를 들어, 진균, 식물 또는 동물 세포)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 이 관점의 바람직한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 의약에서 사용하기 위한 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하는 의약의 제조에서 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
열두 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 또는 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 약제학적 조성물이다.
열두 번째 관점의 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태인 화합물의 치료학적 유효량을 함유한다. 제형은 투여의 방식에 적합하여야 한다.
조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 환제, 캡슐제, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세라이드와 같은 담체와 함께 좌제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 고체 또는 액체일 수 있다.
고체 형태 조성물에는 분말, 정제, 환제, 캡슐제, 로젠지, 카세제, 좌제 및 분산성 과립이 포함된다. 고체 부형제는 또한 희석제, 방향제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제, 또는 캡슐화 물질로 작용할 수도 있는 하나 이상의 물질일 수 있다. 분말에서, 부형제는 바람직하게는 본 발명의 미분된 억제제와의 혼합물로 존재하는 미분된 고체이다. 정제에서, 활성성분은 필요한 결합 특성을 갖는 담체와 적합한 비율로 혼합시키고, 원하는 형상 및 크기로 압축시킨다. 적합한 부형제는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토즈, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이다. 좌제를 제조하기 위해서는, 지방산 글리세라이드의 혼합물 또는 코코아 버터와 같은 저융점 왁스를 우선 용융시키고, 활성성분을 교반함으로써 그 안에 균질하게 분산시킨다. 그 후, 용융된 균질 혼합물을 편리한 크기의 주형에 붓고, 냉각시킴으로써 고화시킨다. 정제, 분말, 캡슐제, 환제, 카세제, 및 로젠지가 경구 투여에 적합한 고체 투약형으로 사용될 수 있다.
액체 형태 조성물에는 예를 들어, 물, 식염수 용액, 수성 덱스트로즈, 글리세롤 용액 또는 물/프로필렌 글리콜 용액 중의 용액, 현탁액 및 에멀전이 포함된다. 약제학적 조성물이 정맥내로, 또는 분무기에 의해서 비내로 투여되는 경우에는 식염수 용액이 바람직한 담체이다. 비경구 주사의 경우에, 액체 제제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 수용액 중의 용액으로 제형화될 수 있다.
이 관점의 특히 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀전의 형태이며, 분무기에 의해서 비내로 투여된다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 단위 투약형이다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성성분을 함유하는 단위 용량으로 세분될 수 있다. 단위 투약형은 포장된 조성물일 수 있으며, 포장은 패킷화된 정제, 캡슐제, 및 바이알 또는 앰플 중의 분말과 같은 조성물의 분리량을 함유한다. 또한, 단위 투약형은 캡슐제, 주사용 바이알, 정제, 카세제, 또는 로젠지 그 자체일 수 있거나, 이것은 포장된 형태로 이들 중의 어떤 것의 적절한 수일 수 있다.
필요한 경우에, 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다.
더구나, 이러한 조성물은 또한 보조제 및/또는 추가의 활성성분과 같은 (단, 이들로 제한되지 않는다) 다른 약물학적 활성물질을 포함할 수도 있다.
본 발명과 관련한 보조제의 예로는 무기 보조제, 유기 보조제, 오일계 보조제, 사이토킨, 미립상 보조제, 바이로좀, 박테리아 보조제, 합성 보조제, 또는 합성 폴리뉴클레오타이드 보조제가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
추가의 활성성분에는 다른 백신 화합물 또는 조성물이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 추가의 활성성분은 또 다른 바이러스 백신, 더욱 바람직하게는 DNA 바이러스, 음성 센스 단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스에 대한 백신이다. 추가로 바람직하게는, 바이러스는 음성-단일 가닥 (ssRNA(-)) RNA 바이러스로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이러스는 외피 ssRNA(-) 바이러스로부터, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 추가의 활성성분은 바람직하게는 뉴모비리나에, 파라믹소비리나에, 페-데-랑 바이러스, 나리바-바이러스, 살렘-바이러스, 투파야-파라믹소바이러스, 베이롱-바이러스, J-바이러스, 메낭글-바이러스, 모스만-바이러스, 및 무라야마-바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된 파라믹소바이러스에 대한 백신이다. 뉴모비리나에는 뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV), 및 메타뉴모바이러스 (예를 들어, 인간 메타뉴모바이러스, 조류 메타뉴모바이러스)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다. 파라믹소비리나에는 레스피로바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3), 및 루불라바이러스 (예를 들어, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다. 대안적으로 또는 추가로, 추가의 활성성분은 바람직하게는 오르토믹소바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 토고토바이러스 및 이사바이러스의 속으로부터 선택된 오르토믹소바이러스에 대한 또 다른 바이러스 백신이다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 오르토믹소바이러스는 인플루엔자바이러스 A, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7으로부터 선택된 인플루엔자바이러스 A, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1이다.
열세 번째 관점에서, 본 발명은 의약에서, 특히 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 열한 번째 관점의 세포, 및 열두 번째 관점의 조성물을 제공한다. 인플루엔자 A 바이러스는 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1으로부터 선택된다.
열네 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 열한 번째 관점의 세포, 및 열두 번째 관점의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 인플루엔자 A 바이러스는 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1으로부터 선택된다.
열다섯 번째 관점에서, 본 발명은 여덟 번째 관점의 뉴클레오타이드 구조물, 발현 시스템 또는 단백질 또는 다단백질, 열 번째 관점의 단백질 혼합물, 열한 번째 관점의 세포, 및 열두 번째 관점의 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 이 관점의 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 인플루엔자 A 바이러스에 대한 면역 반응을 증진시킨다. 인플루엔자 A 바이러스는 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1으로부터 선택된다.
이하의 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이며, 어떤 식으로든 첨부된 특허청구범위에 의해서 나타낸 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지는 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 최적화된 RSV 항원을 암호화한 DNA 의 디자인 및 합성
공통 백신
분리체-기본 백신 디자인에 대한 몇 가지의 컴퓨터 대체방법이 존재한다. 한 가지 접근법은 가장 최근의 공통 조상 (most recent common ancestor (MRCA)) 서열의 복원이다 (9). 분석의 이 타입에서, 조상의 상태는 과거에 존재했던 실제 서열의 추정치이다 (즉, 이것은 재건된 역사로부터 직접적으로 유래한다). 또 다른 타입의 컴퓨터 분석은 COT (center of the tree) 접근법이다. COT 접근법은 뿌리가 없는 계통발생 (unrooted phylogeny) 상의 점을 확인하는데, 여기에서 그 점으로부터 계통발생 상의 각각의 팁 (tip)까지의 평균 진화거리 (average evolutionary distance)는 최소화된다. 이 접근법의 지지자들은 COT가 계통발생 상의 점이기 때문에, 추정된 COT 서열은 추정된 조상 서열과 동일한 이점을 가질 것이라고 말한다 [참조: 예를 들어, 미국 출원 제2005/0137387 A1호]. 그러나, 이 COT 접근법은 인플루엔자 서열 데이터베이스와 같은 크고 이종인 데이터 세트에 대한 이것의 실행을 감소시켜 기술에 의한 실용성이 없도록 충분히 복잡하다. 전반적으로, MRCA 및 COT 접근법은 복잡한 인플루엔자 서열 데이터베이스에 대한 적용에는 비실용적이다.
컴퓨터 분석의 세 번째 타입은 공통 서열 접근법이다. 공통 서열은 각각의 위치에서 가장 통상적으로 관찰되는 아미노산으로 구성되기 때문에, 이것은 바이러스의 가장-적합한 상태를 나타내는 것 같다. 따라서, 공통 서열과는 다른 서열을 선택함에 의한 면역 반응의 효과적인 회피는 복제의 관점에서 덜 적합한 바이러스를 제공할 수 있다. 공통 서열 접근법은 엄격하게 샘플링된 하위혈통 (sublineages)에게 유리하며, 분리물 (outliers)은 중요시하지 않는다. 그러해서, 본 발명에서 이용된 접근법들은 다른 타입의 컴퓨터 분석보다 훨씬 더 간단하다. 더구나, 이들 접근법은 RSV에 대한 전체 데이터 세트를 사용할 수 있다. 공통 서열의 한가지 이점은 이것이 백신 스트레인과 동시대의 분리체 사이의 유전적 차이를 최소화함으로써 다양성의 정도를 절반까지 효과적으로 감소시키고, 따라서 이것은 교차-반응성 반응에 대한 증진된 잠재력을 가질 수 있다는 점이다.
백신 디자인
본 발명의 백신 항원을 디자인하기 위해서, RSV의 F0-, N-, 및 M2-1- 단백질의 단백질 서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) RSV 리소스 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 검색하였다. 단백질 서열은 다양한 RSV 아형 A 스트레인들로부터 선택하였다.
F0 공통 서열은 MUSCLE 버전 3.6을 사용하고, 다수결 원칙을 적용하여 F-단백질의 모든 비-동일 서열들을 정렬함으로써 유도하였다. 백신의 FO 공통 서열은 다양한 RSV 서열의 정렬을 기초로 하여 디자인하였다. 백신 공통 FO 서열의 서열 유사성은 기본적인 국소적 정렬 탐색 도구 (Basic Local Alignment Search Tool)를 의미하며 NCBI로부터 공개적으로 이용할 수 있는 BLAST 분석을 수행하여 측정되었다. 데이터베이스에 있는 모든 RSV 서열과 비교한 공통 서열의 최고 평균 유사성은 인간 호흡기 합포체 바이러스 A2 스트레인에 관해서 100%였다.
또한, 백신의 F0 서열은 FOΔTM의 분비를 가능하게 하도록 아미노산 525 내지 574에 존재하는 경막 부분을 결여하였다.
마지막으로, 백신의 F0ΔTM 서열은 진핵세포에서의 발현을 위해서 코돈-최적화하였다.
백신의 N 공통 서열은 MUSCLE 버전 3.6을 사용하고, 다수결 원칙을 적용하여 N-단백질의 모든 비-동일 서열들을 정렬함으로써 유도하였다. N 공통 서열의 BLAST 분석은 인간 호흡기 합포체 바이러스 A2 스트레인과의 최상의 정렬을 발견하였다. 그 후, 백신의 N 서열은 진핵세포에서의 발현을 위해서 코돈-최적화하였다.
M2-1 공통 서열은 MUSCLE 버전 3.6을 사용하고, 다수결 원칙을 적용하여 M2-1-단백질의 모든 비-동일 서열들을 정렬함으로써 유도하였다. M2-1 공통 서열의 BLAST 분석은 인간 호흡기 합포체 바이러스 A2 스트레인과의 최상의 정렬을 발견하였다. 마지막으로, 백신 M2-1 서열은 진핵세포에서의 발현을 위해서 코돈-최적화하였다.
백신 F0ΔTM 서열 및 N 서열은 구제역 바이러스의 절단 서열 2A에 의해서 간격을 두고 있다. 백신 N 서열 및 M2-1 서열은 가요성 링커 (GGGSGGG; 서열번호 6)만큼 분리되어 있다.
마지막으로, 코돈-최적화된 바이러스 유전자는 단일 개방 판독 프레임 F0ΔTM-N-M2-1로 클로닝되었다. 항원 조성의 개략도는 도 1에 제시된다.
F0Δ TM 및 F0Δ TM -N- M2 -1을 암호화한 DNA 플라스미드의 생성
공통 F0ΔTM, N 및 M2-1 서열은 코작 (Kozak) 서열의 부가 및 코돈 최적화를 포함하여, 포유동물 발현을 위해서 최적화하였다. 다중-항원 (multi-antigen) 백신을 암호화한 DNA 서열을 화학적으로 합성한 다음에, 적합한 제한효소 EcoRV 및 NotI에 의해 CMV 프로모터의 조절 하에서 pVJTetOCMV 셔틀 벡터 (shuttle vector) 내에 서브-클로닝하였다.
PanAd3 바이러스-벡터화 RSV 백신의 생성
가요성 링커에 의해서 융합된 공통 F0ΔTM, N 및 M2-1 단백질을 암호화한 809 aa 다단백질을 함유하는 바이러스-벡터화 RSV 백신을 생성시켰다.
보노보 (Bonobo) 아데노바이러스 타입 3 (PanAd3)은 개선된 혈청유병률 (seroprevalence)을 갖는 신규의 아데노바이러스이며, 이전에 기술되었다.
플라스미드 벡터 pVJTetOCMV/F0DTM-N-M2-1로부터 F0ΔTM-N-M2-1의 PanAd3 프리-아데노 벡터 (pre-Adeno vector) 내로의 클로닝은 상동성 부분이 측면에 있는 항원 서열을 절단하고, 효소적 시험관내 재조합에 의해서 수행되었다.
포유동물 세포 내에서 항원 발현의 분석
바이러스 항원의 독특한 조합이 효율적으로 발현되고, 포유동물 세포 내에서 정확하게 처리되는 것을 조절하기 위해서, HeLa 세포를 F0ΔTM-N-M2-1 항원을 암호화한 10 ㎍의 DNA 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 36 시간 동안 배양한 후에, 상등액을 수거하여, 세포 용해물을 제조하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, 나일론 필터 상에 블럿팅하였다. M 바이러스 단백질 (Dr. Geraldine Taylor로부터 증여)에 대해서 발생된 마우스 모노클로날 항체 (mAb8)를 사용하여 발현된 단백질을 밝혀내었다.
도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 융합된 바이러스 단백질 N-M2-1은 2A 절단 부위에 의해서 다단백질로부터 매우 효율적으로 방출되며, mAb8에 의해서 주요 밴드로 인식된다. 극히 소수의 고분자량 전구체가 세포 내에 정상-상태로 존재한다. RSV 스트레인 A로 감염된 Hep2-세포의 용해물이 대조군으로 사용되었다.
세포 배양 배지의 비-환원성 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석은 경막 부분이 결실된 F-단백질이 상등액 내로 분비된 것을 나타내었다 (참조: 도 3, 레인 RSV). 상등액 내의 F-단백질의 분자량은 그의 천연 배열인 호모트라이머 F-단백질과 일치한다.
실시예 2: 마우스에서 백신 면역원성
DNA 면역법에 의한 항-F 항체
F0ΔTM-N-M2-1 또는 F0ΔTM 단독을 암호화한 DNA 플라스미드를 사용하여 프라이밍 (priming) 및 프라이밍 후 3 주일째의 부스팅 (boosting)의 레지멘으로 DNA 플라스미드 주사 및 전기천공 (GET)에 의해 마우스를 면역시켰다. 면역된 마우스의 혈청을 부스팅시킨지 3 주일 후에 수거하여, 풀링하였다.
MOI 250에서 PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1로 감염된 HeLa 세포로부터의 상등액을 비-환원성 SDS-PAGE 상에서 분리시키고, 나일론 필터 상에 블럿팅하고, F0ΔTM 또는 F0ΔTM-N-M2-1로 면역시킨 마우스로부터의 혈청의 다양한 희석액으로 조사하였다.
도 4A 및 B에 나타낸 바와 같이, 백신 항원과 관련하여 발현된 F-단백질에 의해서 발생된 항체 역가는 단지 F-단백질 만에 의해서 유발된 것보다 적어도 30 배 더 크다. 따라서, F0ΔTM-N-M2-1 항원은 마우스에서 B-세포 반응을 유도하는데 탁월한 면역원 특성을 갖는다.
T 세포 반응
RSV 백신 항원 F0ΔTM-N-M2-1을 갖는 침팬지 아데노바이러스 벡터 PanAd3의 면역학적 효능을 마우스에서 평가하였다.
Balb/C 마우스의 그룹을 증가 용량의 PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1로 사두근에서 근육내 주사함으로써 면역시켰다. 백신 접종한 지 4 주일 후에 마우스를 희생시키고, 비장세포를 RSV F- 및 M-단백질 (펩타이드 GWYTSVITIELSNIKE (F aa 51-66), 펩타이드 KYKNAVTEL (F aa 85-93) 및 펩타이드 SYIGSINNI (M aa 282-290))로부터의 맵핑된 면역우성 펩타이드를 사용한 IFNγ-엘리스포트 (Elispot) 시험에 적용하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 강력한 T 세포 반응이 RSV F 및 M 단백질에 대한 공지의 Balb/C 면역우성 에피토프에 대해서 관찰되었다.
실시예 3: H1p 에 의한 중화 항체의 유도
H5N1로부터의 다염기성 HAO 절단 부위를 함유하도록 조작된 신규의 키메릭 H1p 단백질을 효율적으로 발현시키고, 형질감염된 HeLa 세포에서 완전히 절단시켰다. 야생형 절단 부위 H1을 갖는 동등한 단백질은 도 7에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포에서 절단되지 않는다.
키메릭 H1p 단백질이 세포막 상에서 정확하게 표시되는 것을 조절하기 위해서, 전세포 FACS 연결시험을 폴리클로날 항-HA 혈청을 사용하여 수행하여 세포 표면 상의 형질감염된 단백질을 밝혀내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, H1p는 상응하는 야생형 HA 단백질처럼 효율적으로 세포막 상에 노출된다.
H1p의 면역학적 효능을 측정하기 위해서, Balb/C 마우스를 변형된 H1p 및 비변형된 H1을 암호화한 플라스미드 DNA 벡터 (각각, PVJ-H1p 및 PVJ-H1)로 면역시켰다. 면역된 동물로부터의 혈청을 정제된 재조합 HA 단백질 상에서 ELISA에 의해 분석하였다 (H1N1California2009). 조작된 H1p 단백질에 의해서 유발된 항-HA 역가는 놀랍게도 야생형 프로테아제 절단 부위를 갖는 HA에 의해서 유발된 것보다 더 컸다 (도 9).
이들 결과를 확인하고 확대시키기 위해서, H1 및 H1p 면역된 동물로부터의 혈청을 세포 배양 기본 시험에서 유행성 감기 (Flu) HA 단백질에 의한 위형의 레트로바이러스 벡터의 감염을 중화시키는 그들의 능력에 대해서 시험하였다. 슈도비리온 (pseudovirions)은 이들이 리포터 유전자 루시퍼라제를 발현한다는 점에서 감염의 단일 사이클에 대해서 감염성이다. 도 10은 MDCK 세포 상에서의 HA (H1N1Mexico2009) 위형 바이러스 입자 감염시험에서의 혈청 중화능을 나타낸다. 그 결과는 H1p에 의해서 유발된 항체가 H1 단백질에 의해서 유도된 것보다 더 큰 중화 활성을 가짐을 확인한다.
실시예 4: NP , M1 및 H1p 를 포함하는 다단백질에 의한 증진된 항체 역가
H1p 및 NPM1H1p의 면역학적 효능의 대접전 비교 (head-to-head comparison)는 삼중 항원과 관련하여 발현된 HA 단백질이 HA 단독인 경우보다 더 큰 항체 역가를 유도하는 것을 밝혀내었다. 도 11은 ELISA 시험의 결과를 나타내며, 여기에서 재조합 HA (H1N1California 2009)는 96 웰 플레이트의 바닥에 코팅하였다. H1p 및 NPM1H1p로 면역된 동물의 혈청의 계열 희석액을 플레이트 상에 놓고, 항-마우스 IgG 이차 항체에 의해서 연결된 IgG를 밝혀내었다. RSV 항원에 대해서 이미 관찰된 바와 같이, 내부 항원 (NP 및 M1)과 표면 노출된 항원 (HA)의 공동-발현은 후자의 단백질에 대한 체액성 반응을 개선시킨다.
실시예 5: NP , M1 및 H1p 로 구성된 신규의 FLU 항원의 처리
백신 항원 단백질의 발현 및 처리를 조절하기 위해서, HeLa 세포를 CMV 프로모터의 조절 하에서 NPM1H1p를 함유하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염시킨 지 48 시간 후에 세포를 수확하였다. 세포의 절반을 웨스턴 블럿 분석을 위해서 용해시키고 (도 12), 절반은 HA 단백질의 줄기 부분을 결합시키는 상업적으로 이용가능한 항체 C179 [Okuno Y, JVI 1994]와 함께 배양하고 (도 13), FACS에 의해서 분석하였다. 전체 세포 용해물의 웨스턴 블럿 분석은 NPM1 융합 단백질에 해당하는 독특한 70 kDa 밴드를 나타낸다 (도 12). 이것은 항원이 2A 절단 부위 밖에서 완전히 정확하게 처리됨을 시사한다. 도 13은, HA 줄기 부분에 연결하는 배좌-의존적 항체 C179의 사용에 의해서 검출되는 바와 같이, 방출된 H1p 단백질이 그 후에 세포막 상에 표시되고, 정확하게 접히는 것을 나타낸다. 따라서, NP, M1 및 H1p으로 구성된 신규의 FLU 항원은 정확하게 처리되고, 방출된 단백질은 세포 표면 상에 표시되며 배좌 항체에 의해서 인식된다.
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서열 목록 - 무료 텍스트 정보
서열번호 1 F 단백질 최소 서열
서열번호 2 F0ΔTM
서열번호 3 N 단백질 최소 서열
서열번호 4 RSV의 N 단백질
서열번호 5 RSV의 M2-1 단백질
서열번호 6 펩타이드 링커
서열번호 7 F0ΔTM-N-M2-1
서열번호 8 HA 아형 H1 공통 서열
서열번호 9 HA 아형 H1 공통 서열 변형된 H0 절단 부위
서열번호 10 HA 아형 H5 공통 서열
서열번호 11 NP 공통 서열
서열번호 12 M1 공통 서열
서열번호 13 NP-M1-HA (아미노산 서열)
서열번호 14 NP-M1-HA (핵산 서열)
서열번호 15 H0 절단 부위 서열
서열번호 16 H0 절단 부위 서열
서열번호 17 H0 절단 부위 서열
서열번호 18 H0 절단 부위 서열
서열번호 19 H0 절단 부위 서열
서열번호 20 HA 아형 H3 스트레인 A/웰링턴/01/2004(H3N2)
서열번호 21 HA 아형 H3 스트레인 A/웰링턴/01/2004(H3N2) 변형된 H0 절단 부위
<110> Okairos AG <120> Expression Systems <130> IPA130484 <150> PCT/EP2010/007995 <151> 2010-12-30 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Respiratory Syncytial Virus <220> <221> F protein minimal sequence <222> (1)..(360) <400> 1 Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu 20 25 30 Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu 35 40 45 Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val 50 55 60 Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu 65 70 75 80 Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu 85 90 95 Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn 100 105 110 Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln 115 120 125 Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val 130 135 140 Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu 145 150 155 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strain A/Wellington/01/2004(H3N2) <222> (1)..(566) <400> 20 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 35 40 45 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 50 55 60 Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys 65 70 75 80 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95 Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 100 105 110 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140 Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn 145 150 155 160 Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys 165 170 175 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys 180 185 190 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro 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Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser 485 490 495 Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540 Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 545 550 555 560 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565 <210> 21 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> HA subtype H3 strain A/Wellington/01/2004(H3N2) modified H0 cleavage site <222> (1)..(566) <400> 21 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 35 40 45 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 50 55 60 Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys 65 70 75 80 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95 Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 100 105 110 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140 Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn 145 150 155 160 Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys 165 170 175 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys 180 185 190 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Asn Asp Gln Ile 195 200 205 Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220 Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Val Arg 225 230 235 240 Asp Val Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 245 250 255 Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285 Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 290 295 300 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335 Arg Asn Val Ile Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400 Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser 485 490 495 Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540 Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 545 550 555 560 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565

Claims (65)

  1. T 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체를 암호화한 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템으로서, 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드가, 이들이 인공 다단백질로 발현되도록 연결된 것인 발현 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 단편이 동시번역으로 또는 번역 후에 분리되는 것인 발현 시스템.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 절단 부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드가 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치하는 것인 발현 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 절단 부위가 자가-절단 부위 또는 엔도펩티다제 절단 부위인 것인 발현 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 자가-절단 부위가 피코르나바이러스, 곤충 바이러스, 아프토비리대, 로타바이러스 및 트리파노소마의 바이러스성 2A 펩타이드 또는 2A-유사 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 2A 절단 부위이며, 바람직하게는 여기에서 2A 절단 부위가 구제역 바이러스의 2A 펩타이드인 것인 발현 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 바람직하게는 T 세포 반응을 유도하는 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한 제3 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 발현 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 제3 폴리뉴클레오타이드가 별도의 벡터 또는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드와 동일한 벡터 상에 포함되는 것인 발현 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드, 제2 폴리뉴클레오타이드 및 제3 폴리뉴클레오타이드가, 이들이 인공 다단백질로 발현되도록 연결되는 것인 발현 시스템.
  10. 제7항 내지 제9항 중의 어느 하나에 있어서, 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질이 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 상이한 것인 발현 시스템.
  11. 제7항 내지 제10항 중의 어느 하나에 있어서, 링커를 암호화한 폴리뉴클레오타이드가 제2 폴리뉴클레오타이드와 제3 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치하는 것인 발현 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 링커가 가요성 링커, 바람직하게는 서열번호 6에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가요성 링커인 것인 발현 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질이 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하고/하거나, 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질이 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 N-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 사이에 위치하거나,
    제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질이 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하고/하거나, 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드의 단백질이 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질에 관해서 C-말단적으로 위치하거나, 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질과 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 사이에 위치하는 것인 발현 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 하나에 있어서, 벡터 또는 벡터들이 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바람직하게는 람다 파지 및 필라멘트상 파지 벡터, 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터, 알파바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 아레나 바이러스 벡터, 홍역 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 바이러스-유사 입자, 및 박테리아 포자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 바이러스 벡터가 PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd 73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 및 ChAd82로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  16. 제14항에 있어서, 바이러스 벡터가 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 벡터, 바람직하게는 레수스 사이토메갈로바이러스 (RhCMV) 벡터 및 아레나 바이러스 벡터, 바람직하게는 림프구성 맥락뇌막염 바이러스 (LCMV) 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드 중의 적어도 하나 또는 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드가 병원체로부터 유래된 단백질, 펩타이드 또는 그의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 병원체가 바이러스인 것인 발현 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 하나에 있어서, T 세포 반응을 유도하는 단백질이 바이러스의 비-구조 및/또는 내부 단백질이고/이거나, 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 단백질이 바이러스의 구조 및/또는 표면 단백질인 것인 발현 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 구조 및/또는 표면 단백질 및/또는 비-구조 및/또는 내부 단백질의 아미노산 서열이 하나 이상의 상이한 바이러스 분리체의 연속적 분절 또는 공통 서열을 포함하는 것인 발현 시스템.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 구조 및/또는 표면 단백질이 천연 바이러스의 표면 상에 노출된 단백질인 것인 발현 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 천연 바이러스의 표면 상에 노출된 단백질의 막 부착 영역이 기능적으로 결실된 것인 발현 시스템.
  23. 제18항 내지 제22항 중의 어느 하나에 있어서, 바이러스가 DNA 바이러스, 음성 센스 단일 가닥 RNA 바이러스 또는 암비센스(ambisense) RNA 바이러스, 바람직하게는 음성 센스 단일 가닥 RNA 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  24. 제18항 내지 제23 중의 어느 하나에 있어서, 바이러스가 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 제23항 또는 제24항에 정의된 바와 같은 바이러스로부터의 비-구조 및/또는 내부 단백질 또는 그의 변이체를 암호화한 제3 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 발현 시스템.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 파라믹소바이러스가 뉴모비리나에, 파라믹소비리나에, 페-데-랑 바이러스, 나리바-바이러스, 살렘-바이러스, 투파야-파라믹소바이러스, 베이롱-바이러스, J-바이러스, 메낭글-바이러스, 모스만-바이러스, 및 무라야마-바이러스의 서브패밀리로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 뉴모비리나에가 뉴모바이러스, 바람직하게는 인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 쥐 폐렴 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV, 칠면조 비기관염 바이러스 및 메타뉴모바이러스, 바람직하게는 인간 메타뉴모바이러스 조류 메타뉴모바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  28. 제26항에 있어서, 파라믹소비리나에가 레스피로바이러스, 바람직하게는 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3, 및 루불라바이러스, 바람직하게는 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  29. 제21항에 있어서, 천연 바이러스의 표면 상에 노출된 단백질이 융합 단백질 (F), 및 부착 당단백질 G, H, 및 HN 중의 어느 하나로 구성된 파라믹소바이러스 단백질의 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  30. 제29항에 있어서, F가 바람직하게는 서열번호 1에 따르는, 하나의 RSV 분리체의 F의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하는 것인 발현 시스템.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, F가 서열번호 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 것인 발현 시스템.
  32. 제19항 내지 제31항 중의 어느 하나에 있어서, 비-구조 및/또는 내부 단백질이 핵단백질 N, 매트릭스 단백질 M 및 M2, 인단백질 P, 비-구조 단백질 NS1 및 NS2, 및 폴리머라제의 촉매 아단위 (L)로 구성된 파라믹소바이러스 단백질의 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  33. 제32항에 있어서, N이 바람직하게는 서열번호 3에 따르는, 하나의 RSV 분리체 N의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하고, M2가 바람직하게는 서열번호 5에 따르는, 하나의 RSV 분리체 M2의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하는 발현 시스템.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, N이 서열번호 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, M2가 서열번호 5에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 것인 발현 시스템.
  35. 제2항 내지 제34항 중의 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 및 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 다단백질이 서열번호 7에 따르는 아미노산을 갖는 것인 발현 시스템.
  36. 제24항 또는 제25항에 있어서, 오르토믹소바이러스가 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 토고토바이러스, 이사바이러스 및 분류되지 않은 오르토믹소비리대로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스가 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2, H10N7, 바람직하게는 H1N1로 구성된 그룹으로부터 선택된 아형인 것인 발현 시스템.
  38. 제21항에 있어서, 천연 바이러스의 표면 상에 노출된 단백질이 HA 및 NA, 바람직하게는 HA로 구성된 오르토믹소바이러스 단백질의 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  39. 제38항에 있어서, HA가 하나의 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 HA의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 공통 아미노산 서열을 포함하고, 여기에서 HA의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 9, 서열번호 21 및 이들 서열의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, HA가 PQRERRRKKR (서열번호 15), PQRESRRKKR (서열번호 16), PQGERRRKKR (서열번호 17), PLRERRRKR (서열번호 18) 및 PQRETR (서열번호 19), 바람직하게는 PQRERRRKKR (서열번호 15)로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 발현 시스템.
  41. 제19항 내지 제25항 및 제36항 내지 제40항 중의 어느 하나에 있어서, 비-구조 및/또는 내부 단백질(들)이 NP, M1, M2, NS1, NS2/NEP, PA, PB1, PB2 및 PB1-F2 (PB1F2), 바람직하게는 NP 및 M1으로 구성된 오르토믹소바이러스 단백질의 그룹으로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
  42. 제41항에 있어서, NP가 바람직하게는 서열번호 11에 따르는, 하나의 인플루엔자 A 바이러스 분리체 또는 아형의 NP의 아미노산 서열, 또는 두 개 이상의 상이한 인플루엔자 A 바이러스 분리체 또는 아형의 공통 아미노산 서열을 포함하고, M1이 바람직하게는 서열번호 12에 따르는, 인플루엔자 A 바이러스 분리체 또는 아형의 M1의 아미노산 서열, 또는 두 개 이상의 상이한 인플루엔자 A 바이러스 분리체 또는 아형의 공통 아미노산 서열을 포함하는 발현 것인 시스템.
  43. 제2항 내지 제25항 및 제36항 내지 제42항 중의 어느 하나에 있어서, 제1, 제2 및 임의의 제3 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 다단백질이 서열번호 13 또는 그의 변이체에 따르는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 서열번호 14 또는 그의 변이체에 따르는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 것인 발현 시스템.
  44. 제1항 내지 제43항의 발현 시스템에 의해 암호화된 분리된 단백질 혼합물.
  45. 제1항 내지 제43항 중의 어느 하나에 따르는 발현 시스템 및/또는 제44항의 단백질 혼합물을 함유하는 분리된 숙주 세포.
  46. 제1항 내지 제43항 중의 어느 하나에 따르는 발현 시스템 및/또는 제44항의 단백질 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 바람직하게는 보조제 및 활성성분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 추가의 활성성분을 포함하는 조성물.
  48. 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제43항 중의 어느 하나에 따르는 발현 시스템 및/또는 제44항의 단백질 혼합물, 제45항에 따르는 분리된 세포, 또는 제46항 또는 제47항에 따르는 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 질환이 감염성 질환, 바람직하게는 바이러스 감염성 질환인 것인 용도를 위한 제1항 내지 제43항 중의 어느 하나에 따르는 발현 시스템 및/또는 제44항의 단백질 혼합물, 제45항에 따르는 분리된 세포, 또는 제46항 또는 제47항에 따르는 조성물.
  50. 제46항 또는 제47항에 있어서, 질환이 제23항, 제24항, 제26항 내지 제28항, 제36항 및 제37항에서 정의된 바와 같은 병원체에 의해서 야기되는 용도를 위한 발현 시스템, 분리된 단백질 혼합물, 분리된 세포 또는 조성물.
  51. 유효량의 제1항 내지 제43항 중의 어느 하나에 따르는 발현 시스템 및/또는 제44항의 단백질 혼합물, 제45항에 따르는 분리된 세포, 또는 제46항 또는 제47항에 따르는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 바이러스성 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 질환이 제23항, 제24항, 제26항 내지 제28항, 제36항 및 제37항에서 정의된 바와 같은 병원체에 의해서 야기되는 것인 방법.
  53. 항-병원성 B 세포 반응을 유도하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질에 대한 B-세포 반응을 유도하거나 증진시키는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제43항 중의 어느 하나에 따르는 발현 시스템 및/또는 제44항의 단백질 혼합물, 제45항에 따르는 분리된 세포, 또는 제46항 또는 제47항에 따르는 조성물.
  54. HAO 절단 부위가 하나 이상의 염기성 아미노산을 도입시킴으로써 변형된, 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 구성된 핵산 구조물.
  55. 제54항에 있어서, HA가 H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 그의 변이체 또는 그의 공통 서열로 구성된 HA 아형, 또는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16으로 구성된 HA 아형의 그룹으로 선택된 하나 이상의 HA 아형의 변이체 또는 공통 서열, 바람직하게는 HA 아형 H1 또는 그의 변이체 또는 그의 공통 서열의 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산 구조물.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, HA0 절단 부위가 적어도 20%의 염기성 아미노산, 바람직하게는 적어도 50%의 염기성 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 70%의 염기성 아미노산을 포함하도록 변형된 것인 핵산 구조물.
  57. 제54항 내지 제56항 중의 어느 하나에 있어서, HA0 절단 부위가 PQRERRRKKR (서열번호 15), PQRESRRKKR (서열번호 16), PQGERRRKKR (서열번호 17), PLRERRRKR (서열번호 18) 및 PQRETR (서열번호 19)로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 가지며, 바람직하게는 HA0 절단 부위가 서열 PQRERRRKKR (서열번호 15)을 갖는 것인 핵산 구조물.
  58. 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 제54항 내지 제57항 중의 어느 하나에서 정의된 바와 같은 핵산 구조물을 포함하는 것으로서, 인플루엔자 HA 단백질을 암호화한 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 바람직하게는 제1항 내지 제25항 중의 어느 하나에 따라 정의되는 발현 시스템.
  59. 제58항의 발현 시스템에 의해 암호화된 분리된 단백질 혼합물.
  60. 제58항에 따르는 발현 시스템 및/또는 제59항에 따르는 단백질 혼합물을 함유하는 분리된 숙주 세포.
  61. 제58항에 따르는 발현 시스템 및/또는 제59항에 따르는 단백질 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 것인 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 바람직하게는 보조제 및 활성성분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 추가의 활성성분을 포함하는 것인 조성물.
  63. 질환, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제58항에 따르는 발현 시스템 및/또는 제59항의 단백질 혼합물, 제60항에 따르는 분리된 세포, 또는 제61항 또는 제62항에 따르는 조성물.
  64. 유효량의 제58항에 따르는 발현 시스템 및/또는 제59항의 단백질 혼합물, 제60항에 따르는 분리된 세포, 또는 제61항 또는 제62항에 따르는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 바이러스성 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  65. 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 B-세포 면역 반응을 유도하거나 증진시키는데 사용하기 위한, 제58항에 따르는 발현 시스템 및/또는 제59항의 단백질 혼합물, 제60항에 따르는 분리된 세포, 또는 제61항 또는 제62항에 따르는 조성물.
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