CN115003328A - 重组神经氨酸酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本文提供了包含流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其在茎结构域中具有半胱氨酸对氨基酸的替换或插入以产生更稳定的四聚体流感病毒神经氨酸酶。在具体的实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。在另一个方面，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺乏流感病毒神经氨酸酶茎、跨膜和胞质结构域。在另一个方面，本文提供了使用这种重组神经氨酸酶或其组合物对流感病毒免疫的方法。

Description

重组神经氨酸酶及其用途
相关申请
本发明申请主张2019年10月22日提交的美国临时专利申请No.62/924,511的权益，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
有关联邦政府资助的研究的声明
本发明是在国立卫生研究院提供的经费号HHSN272201400008C、AI097092-07、R01AI145870-01和75N93019C00051的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
序列表
本发明申请作为参考以其全部内容并入了作为文本文件与本发明申请一起提交的序列表，该序列表于2020年10月21日创建，名称为“06923-305-228_SEQ_LISTING.txt”，且大小为226,341字节。
1.简介
在一个方面，本文提供了包含流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其在茎结构域中具有半胱氨酸对氨基酸的替换或插入以产生更稳定的四聚体流感病毒神经氨酸酶。在具体的实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。在另一个方面，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺乏流感病毒神经氨酸酶茎、跨膜和胞质结构域。在另一个方面，本文提供了使用这种重组神经氨酸酶或其组合物对流感病毒免疫的方法。
2.背景技术
流感病毒是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的被膜RNA病毒(Palese andShaw(2007)Orthomyxoviridae:The Viruses and Their Replication,第5版,Fields’Virology,B.N.Fields,D.M.Knipe and P.M.Howley主编.Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,USA,第1647-1689页)。甲型流感病毒的天然宿主主要为禽类，但是甲型流感病毒(包括禽类来源的那些)也可以感染并在人类和其它动物宿主(蝙蝠、犬类、猪、马、海洋哺乳动物和鼬科动物)中引起疾病。例如，H5N1甲型禽流感病毒已在猪群中被发现，并还已将其宿主范围扩展至包括通常认为不易受甲型流感影响的猫、豹和虎(CIDRAP-Avian Influenza:Agricultural and Wildlife Considerations)。动物中流感病毒感染的发生可能潜在引发人类大流行性流感毒株。
甲型和乙型流感病毒是主要的人类病原体，其导致呼吸疾病，严重程度范围从亚临床感染至可以导致死亡的原发性病毒性肺炎不等。感染的临床效果随流感毒株的毒力和宿主的暴露、病史、年龄和免疫状态而变化。季节性流感所导致的累积发病率和死亡率由于相对高的发病率而显著。在正常季节，流感可以导致全球3百万-5百万的危重病例和高达500,000例的死亡(World Health Organization(2003)Influenza:Overview；2003年3月)。在美国，流感病毒每年感染约10-15％的人口(Glezen and Couch RB(1978)Interpandemicinfluenza in the Houston area,1974-76.N Engl J Med 298:587-592；Fox等人(1982)Influenza virus infections in Seattle families,1975-1979.II.Pattern ofinfection in invaded households and relation of age and prior antibody tooccurrence of infection and related illness.Am J Epidemiol 116:228-242)并与约30,000例死亡有关(Thompson WW等人(2003)Mortality Associated with Influenza andRespiratory Syncytial Virus in the United States.JAMA 289:179-186；Belshe(2007)Translational research on vaccines:influenza as an example.ClinPharmacol Ther 82:745-749)。
除了每年的流行外，流感病毒还是罕见大流行病的诱因。例如，甲型流感病毒可以导致如1918、1957、1968和2009年发生的那些大流行病。由于缺少针对主要病毒抗原血凝素(HA)的预形成免疫，大流行性流感可以在一年中影响超过50％的人口并经常导致比流行性感冒更严重的疾病。一个显著的例子是1918年的大流行病，其中估计有5千万-1亿人口死亡(Johnson and Mueller(2002)Updating the Accounts:Global Mortality of the 1918-1920“Spanish”Influenza Pandemic Bulletin of the History of Medicine 76:105-115)。自从20世纪90年代后期高致病性H5N1禽流感病毒的出现以来(Claas等人(1998)Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenzavirus.Lancet 351:472-7)，有担心认为其可能是下一代大流行性病毒。
季节性疫苗接种是目前对流感最有效的干预(Gross等人,Ann Intern Med,1995,123(7):第518-27页；Ogburn等人,J Reprod Med,2007,52(9):第753-6页；Jefferson等人,Lancet,2005.366(9492):第1165-74页；Beyer等人,Vaccine,2013,31(50):第6030-3页；Nichol等人,N Engl J Med,1995.333(14):第889-93页；Jefferson等人,Lancet,2005.365(9461):第773-80页)，但是在最近的2017-2018季，整体疫苗有效性仅为36％(Flannery等人,MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2018.67(6):第180-185页)。然而，当前疫苗接种方法依赖于实现流行株与包括在疫苗中的分离株之间的优良匹配。由于多种因素的组合，这种匹配通常难以获得。首先，流感病毒持续不断变化：每3-5年，主要的甲型流感病毒株被经历充分抗原性漂移以逃避现有抗体应答的变体替代。因此，必须每年基于世界卫生组织(WHO)合作中心的密切监管工作来选择要包括在疫苗制剂中的分离株。其次，为了给疫苗制造和销售留出足够时间，必须在流感季节开始之前约6个月选择株。通常，疫苗株选择委员会的预测是不准确的，从而导致疫苗接种效力显著降低。
流感病毒的神经氨酸酶(NA)是均聚四聚体II型跨膜蛋白(Fields S,Winter G,Brownlee GG.1981.Structure of the neuraminidase gene in human influenza virusA/PR/8/34.Nature 290:213-7；Ward CW,Elleman TC,Azad AA.1982.Amino acidsequence of the Pronase-released heads of neuraminidase subtype N2 from theAsian strain A/Tokyo/3/67of influenza virus.Biochem J 207:91-5)。NA的四聚体形式具有从粘液除去唾液酸的酶促功能，这对于预防病毒在呼吸道中的固定化以及释放来自感染的细胞的病毒子代是至关重要的(Palese P,Tobita K,Ueda M,CompansRW.1974.Characterization of temperature sensitive influenza virus mutantsdefective in neuraminidase.Virology61:397-410)。4条相同的单体多肽(每条约470个氨基酸)组装以形成四聚体NA(McAuley等人,2019,Frontiers in Microbiology 10:39)。4个单体分别具有4种不同的结构域：胞质尾、跨膜区、茎和催化性头部(同上)。NA的胞外域由NA的球状头部结构域和茎结构域组成。
靶向NA的酶促功能的抗病毒药物已显示减少病毒负荷(MosconaA.2005.Neuraminidase inhibitors for influenza.N Engl J Med 353:1363-73；Gubareva LV,Kaiser L,Hayden FG.2000.Influenza virus neuraminidaseinhibitors.Lancet 355:827-35)。由于NA具有保守表位，因为流感病毒NA也是优良的免疫靶标(Chen YQ,Wohlbold TJ,Zheng NY,Huang M,Huang Y,Neu KE,Lee J,Wan H,RojasKT,Kirkpatrick E,Henry C,Palm AE,Stamper CT,Lan LY,Topham DJ,Treanor J,Wrammert J,Ahmed R,Eichelberger MC,Georgiou G,Krammer F,WilsonPC.2018.Influenza Infection in Humans Induces Broadly Cross-Reactive andProtective Neuraminidase-Reactive Antibodies.Cell 173:417-429.e10；WohlboldTJ,Podolsky KA,Chromikova V,Kirkpatrick E,Falconieri V,Meade P,Amanat F,TanJ,tenOever BR,Tan GS,Subramaniam S,Palese P,Krammer F.2017.Broadly protectivemurine monoclonal antibodies against influenza B virus target highlyconserved neuraminidase epitopes.Nat Microbiol 2:1415-1424)。因此，抑制神经氨酸酶活性并结合至所述蛋白的抗体将可能具有保护性。的确，几项研究已表明神经氨酸酶抑制性(NAI)的NA-特异性抗体与动物和人两者中对流感病毒的保护相关(Jacobsen H,Rajendran M,Choi A,Sjursen H,Brokstad KA,Cox RJ,Palese P,Krammer F,Nachbagauer R.2017.Influenza Virus Hemagglutinin Stalk-Specific Antibodies inHuman Serum are a Surrogate Marker for In Vivo Protection in a Serum TransferMouse Challenge Model.MBio 8；Monto AS,Petrie JG,Cross RT,Johnson E,Liu M,Zhong W,Levine M,Katz JM,Ohmit SE.2015.Antibody to Influenza VirusNeuraminidase:An Independent Correlate of Protection.J Infect Dis 212:1191-9；Kilbourne ED,Johansson BE,Grajower B.1990.Independent and disparate evolutionin nature of influenza A virus hemagglutinin and neuraminidaseglycoproteins.Proc Natl Acad Sci U S A 87:786-90；Couch RB,Atmar RL,Franco LM,Quarles JM,Wells J,Arden N,Nino D,Belmont JW.2013.Antibody correlates andpredictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and theimportance of antibody to the neuraminidase.J Infect Dis 207:974-81；Walz L,Kays SK,Zimmer G,von Messling V.2018.Neuraminidase-Inhibiting Antibody TitersCorrelate with Protection from Heterologous Influenza Virus Strains of theSame Neuraminidase Subtype.J Virol 92)。抗NA抗体已显示在感染个体(Maier HE,Nachbagauer R,Kuan G,Ng S,Lopez R,Sanchez N,Stadlbauer D,Gresh L,Schiller A,Rajabhathor A,Ojeda S,GugliaAF,Amanat F,Balmaseda A,Krammer F,GordonA.2019.Pre-existing anti-neuraminidase antibodies are associated withshortened duration of influenza A(H1N1)pdm virus shedding and illness innaturally infected adults.Clin Infect Dis.)和豚鼠(McMahon M,KirkpatrickE,Stadlbauer D,Strohmeier S,Bouvier NM,Krammer F.2019.Mucosal Immunity againstNeuraminidase Prevents Influenza B Virus Transmission in Guinea Pigs.MBio 10)中减少病毒散发。然而，当前的灭活流感病毒疫苗(IIV)引起有限的NA-特异性抗体应答，而大部分免疫应答是针对HA的。这可能是由于在IIV的背景中，与HA相比，NA的免疫原性较低以及在疫苗生产期间缺少NA含量的标准化所造成的(Wohlbold TJ,Nachbagauer R,Xu H,Tan GS,Hirsh A,Brokstad KA,Cox RJ,Palese P,Krammer F.2015.Vaccination withAdjuvanted Recombinant Neuraminidase Induces Broad Heterologous,but NotHeterosubtypic,Cross-Protection against Influenza Virus Infection inMice.MBio 6；Krammer F,Fouchier RAM,Eichelberger MC,Webby RJ,Shaw-Saliba K,WanH,Wilson PC,Compans RW,Skountzou I,Monto AS.2018.NAction！How CanNeuraminidase-Based Immunity Contribute to Better Influenza Virus Vaccines？MBio 9)。尚不清楚不正确折叠的单体NA是否可以引起保护性抗体应答。但是据推测需要正确折叠的四聚体NA，因为已观察到抗-N1或N2滴度与疫苗中NA的酶促活性形式相关(Krammer F,Fouchier RAM,Eichelberger MC,Webby RJ,Shaw-Saliba K,Wan H,WilsonPC,Compans RW,Skountzou I,Monto AS.2018.NAction！How Can Neuraminidase-BasedImmunity Contribute to Better Influenza Virus Vaccines？MBio 9；Marcelin G,Sandbulte MR,Webby RJ.2012.Contribution of antibody production againstneuraminidase to the protection afforded by influenza vaccines.Rev Med Virol22:267-79)。
因此，仍需要预防和治疗流感病毒感染以及流感病毒疾病的疗法。
3.发明简述
在一个方面，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在所述胞外域的茎结构域中存在的一个、两个或更多个氨基酸残基处含有半胱氨酸对一个、两个或更多个氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48或50处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48或50的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48和50处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48和50的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。在某些实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N1或N2亚型。在其它实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域。在具体的实施方式中，所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基61处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基61的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一些实施方式中，所述突变流感病毒神经氨酸酶胞外域还包含N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处半胱氨酸对氨基酸的替换。在某些实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N1或N2亚型。在其它实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域。在具体的实施方式中，所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域和四聚体化结构域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。在某些实施方式中，所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。在某些实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N1或N2亚型。在其它实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N2亚型的氨基酸残基52处或者在对应于流感病毒A/香港/4801/2014的氨基酸残基52的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述胞外域来自甲型流感病毒N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。在某些实施方式中，所述突变胞外域还包含在N2亚型的氨基酸残基54处或者在对应于A/香港/4801/2014的氨基酸残基54的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N2亚型的氨基酸残基52处或者在对应于A/香港/4801/2014的氨基酸残基52的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述胞外域来自甲型流感病毒N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域。在具体的实施方式中，所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
在另一个方面，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺少流感病毒神经氨酸酶茎的全部或部分(例如，流感神经氨酸酶茎的25、30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸残基，或者流感神经氨酸酶茎的25-50、30-50、40-50、30-60、40-60或50-60个氨基酸残基)、跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方式中，所述四聚体化结构域包含副粘病毒蛋白四聚体化结构域。在具体的实施方式中，所述副粘病毒蛋白四聚体化结构域是副粘病毒磷蛋白(例如，尼帕病毒磷蛋白、亨得拉病毒磷蛋白、呼吸道合胞病毒磷蛋白、人副流感病毒(hPIV)磷蛋白、牛副流感病毒磷蛋白、腮腺炎病毒磷蛋白、松湾病毒磷蛋白、加纳病毒磷蛋白、新城疫病毒磷蛋白、犬瘟热病毒磷蛋白或者小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白)的四聚体化结构域。在另一个实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺少流感病毒神经氨酸酶茎的全部或部分(例如，流感神经氨酸酶茎的25、30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸残基，或者流感神经氨酸酶茎的25-50、30-50、40-50、30-60、40-60或50-60个氨基酸残基)、跨膜结构域和胞质结构域，并且其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。在某些实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N1或N2亚型。在其它实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
在另一个方面，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺乏流感病毒神经氨酸酶茎、跨膜和胞质结构域。在一个实施方式中，所述四聚体化结构域包含副粘病毒磷蛋白四聚体化结构域。在另一个实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和副粘病毒蛋白四聚体化结构域(例如，副粘病毒蛋白四聚体化结构域)，其中所述重组神经氨酸酶缺少流感病毒神经氨酸酶茎结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体的实施方式中，所述副粘病毒磷蛋白是尼帕病毒磷蛋白、亨得拉病毒磷蛋白、呼吸道合胞病毒磷蛋白、人副流感病毒(hPIV)磷蛋白、牛副流感病毒磷蛋白、腮腺炎病毒磷蛋白、松湾病毒磷蛋白、加纳病毒磷蛋白、新城疫病毒磷蛋白、犬瘟热病毒磷蛋白或者小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白。在另一个实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺少流感病毒神经氨酸酶茎结构域、跨膜结构域和胞质结构域，并且其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。在某些实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N1或N2亚型。在其它实施方式中，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
在某些实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶包含信号肽。在一些实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶包含组氨酸标签、Flag标签或其它纯化标签。在某些实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶包含切割位点，如(例如)下文第6节中所述。在一些实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶包含切割位点，如(例如)下文第6节中所述，和组氨酸标签、Flag标签或其它纯化标签。在具体的实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶是分离的。
在某些实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：27、56、58、60或者62所示的氨基酸序列的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，重组神经氨酸酶包含SEQ ID NO：27、56或58所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本文提供了包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列。在具体的实施方式中，核酸序列是分离的。
在某些实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：55、57、59或61所示的核苷酸序列的核酸序列。在具体的实施方式中，本文所提供的核酸序列包含含有SEQ ID NO：55或57所示的核苷酸序列的核酸序列。
在另一个方面，本文提供了包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述表达载体帮助重组神经氨酸酶在适合的基底中表达。
在某些实施方式中，本文提供了包含核酸序列的表达载体，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO：55、57、59或61所示的核苷酸序列。在具体的实施方式中，本文提供了包含核酸序列的表达载体，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO：55或57所示的核苷酸序列。
在另一个方面，本文提供了能够表达包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列的宿主细胞。在具体的实施方式中，本文提供了表达包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列的宿主细胞。
在另一个方面，本文提供了包含本文所描述的重组神经氨酸酶的重组流感病毒。在一个实施方式中，本文提供了包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列的基因节段，从而通过所述重组流感病毒感染的细胞表达所述重组神经氨酸酶。在另一个实施方式中，本文提供了包含神经氨酸酶的重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶包含突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述突变的胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。在另一个方面，本文提供了包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码神经氨酸酶的核苷酸序列的基因节段，从而通过感染的细胞表达所述神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶包含突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述突变的胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。在某些实施方式中，使本文所描述的重组流感病毒灭活。在具体的实施方式中，使本文所描述的重组流感病毒分裂。在其它实施方式中，本文所描述的重组流感病毒是活减毒流感病毒。在一些实施方式中，本文所描述的重组流感病毒是重组甲型流感病毒。在具体的实施方式中，本文所描述的重组流感病毒是H1或H3亚型。在其它实施方式中，本文所描述的重组流感病毒是乙型流感病毒。
在另一个方面，本文提供了包含本文所描述的神经氨酸酶的免疫原性组合物。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物还包括三价灭活流感疫苗(TIV)、四价灭活流感病毒疫苗(QIV)或者重组流感病毒疫苗。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含佐剂。
在另一个方面，本文提供了包含核酸序列的免疫原性组合物，所述核酸序列包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含佐剂。
在另一个方面，本文提供了包含本文所描述的重组流感病毒的免疫原性组合物。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含佐剂。
在另一个方面，本文提供了对流感病毒免疫的方法，其包括向受试者施用一个剂量的本文所描述的免疫原性组合物。在另一个方面，本文提供了对流感病毒引起免疫应答的方法，其包括向受试者施用一个剂量的本文所描述的免疫原性组合物。在一些实施方式中，作为加强向受试者施用另外剂量的免疫原性组合物。在具体的实施方式中，所述受试者是人。在另一个具体的实施方式中，将所述免疫原性组合物肌内施用至所述受试者。
3.1术语
如本文所使用的，术语“核酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。所述核酸可以是单链或双链的。在具体的实施方式中，所述核酸可以是自复制RNA。
当在得自天然来源，例如，细胞的多肽(包括抗体)的背景中使用时，如本文所使用的，术语“纯化的”和“分离的”是指基本不含来自天然来源的污染材料的多肽，例如，来自环境的矿物质、化学品和/或来自天然来源的细胞材料，如(但不限于)存在于细胞中的细胞碎片、细胞壁材料、膜、细胞器、大块核酸、碳水化合物、蛋白和/或脂质。因此，分离的多肽包括具有小于约30％、20％、10％、5％、2％或1％(按干重计)的细胞材料和/或污染材料的多肽的制剂。当在化学合成的多肽(包括抗体)的背景中使用时，如本文所使用的，术语“纯化的”和“分离的”是指基本不含化学前体或者参与多肽合成的其它化学品的多肽。在具体的实施方式中，重组流感病毒NA是化学合成的。在另一个具体的实施方式中，重组流感病毒NA是分离的。
如本文所使用的，术语“受试者”或者“患者”是可互换使用的以表示动物(例如，鸟、爬行动物和哺乳动物)。在具体的实施方式中，受试者是鸟。在另一个实施方式中，受试者是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些实施方式中，受试者是非人动物。在一些实施方式中，受试者是农畜或宠物。在另一个实施方式中，受试者是人。在另一个实施方式中，受试者是婴儿。在另一个实施方式中，受试者是儿童。在另一个实施方式中，受试者是成人。在另一个实施方式中，受试者是老人。在另一个实施方式中，受试者是人类早产儿。
如本文所使用的，术语“人类早产儿”是指在小于37周胎龄出生的人类婴儿。
如本文所使用的，术语“季节性流感病毒株”是指根据季节受试者群体所暴露的流感病毒株。在具体的实施方式中，术语季节性流感病毒株是指甲型流感病毒株。在具体的实施方式中，术语季节性流感病毒株是指属于H1或H3亚型(即目前在人受试者群体中持续的两种亚型)的流感病毒株。在其它实施方式中，术语季节性流感病毒株是指乙型流感病毒株。
术语“三级结构”和“四级结构”具有本领域技术人员所理解的含义。三级结构是指单一多肽链的立体结构。四级结构是指具有多个多肽链的多肽的三维结构。
如本文所使用的，在一些实施方式中，在病毒多肽的背景中短语“野生型”是指天然存在并且与天然存在的病毒有关的病毒多肽。
如本文所使用的，在一些实施方式中，在病毒的背景中短语“野生型”是指流行、天然循环并且产生疾病的典型爆发的病毒类型。在其它实施方式中，在病毒的背景中术语“野生型”是指亲代病毒。
4.附图说明
图1A-1C.融合至N1的麻疹病毒磷蛋白(MPP-N1)或者仙台病毒磷蛋白(SPP-N1)四聚体化结构域以及熔融至N1的来自拟南芥(Arabidopsis)四聚体化结构域的SEPPALLATA-样MADS结构域转录因子(SMDTF-N1)的还原性(图1A)、非还原性(图1B)和交联(图1C)SDS-PAGE。将VASP-N1用作阳性对照。当交联时，将MPP-N1、SPP-N1和VASP-N1维持为四聚体。
图2.具有融合至N1的麻疹病毒磷蛋白(MPP-N1)或者仙台病毒磷蛋白(SPP-N1)四聚体化结构域的构建体的NA活性。将VASP-N1用作阳性对照，并且是不相关的
图3.人NI活性抗体，包括泛-NA mAb 1G01，其在Ni-NTA板上在ELISA中识别MPP-1。
图4.融合至N1的麻疹病毒磷蛋白(MPP-N1)或者仙台病毒磷蛋白(SPP-N1)四聚体化结构域在小鼠模型中作为疫苗的保护效果。将VASP-N1用作阳性对照，并且将不相关的蛋白用作阴性对照。括号中的％表示存活率。
图5.NA-星形测定中不同的NA-茎半胱氨酸突变体的NA活性。将曲线下面积显示为活性的定量。
图6A-6B.灭活的纯化的PR8 H1N1病毒的NA含量。(图6A)通过免疫印迹检验表达WT、I48C、N50C、I48C_N50C、W61insertC或V62insertC NA的灭活的纯化的病毒的NA含量。(图6B)I48C与W61insertC的组合导致比其它突变体更多的四聚体和更少的三聚体NA含量。通过免疫印迹检验表达WT、I48C、I48C_N50C、I48C_W61insert C NA的灭活的纯化的病毒的NA含量。在10％SDS-PAGE上分离A和B中的病毒蛋白质。NR：非还原性；R：还原性
图7.PR8 N1和HK14 N2的氨基酸序列比对(N1，aa 1-102(SEQ ID NO：53)；N2，aa1-117(SEQ ID NO：54))以识别HK14 N2中半胱氨酸替换的相应残基。对N1(C49)和N2(C53)中的天然半胱氨酸加方框。
图8A-8B.灭活的纯化的HK14 H3N2病毒的NA含量和NA活性。(图8A)通过免疫印迹检验WT、L52C和L52C_E54C病毒的NA含量。在8％-16％SDS-PAGE上分离病毒蛋白质。(图8B)病毒制剂的NA活性。将NA-荧光神经氨酸酶活性测定用于测量5ng每种病毒的潜在NA活性。
图9A-9D.以下流感病毒的神经氨酸酶的比对：A/PR/8/34(N1 PR8；SEQ ID NO：29)、A/密歇根/45/15(N1_Mich15；SEQ ID NO：30)、A/WSN/33(N1_WSN；SEQ ID NO：31)、A/香港/4801/14(N2_HK14；SEQ ID NO：32)、A/鸡/孟加拉/19870/13(N2_ck；SEQ ID NO：33)、A/猪/密苏里/4296424/06A(N3_sw；SEQ ID NO：34)、A/蓝翅鸭/危地马拉/CIP049H113-74/13(N3_bwt；SEQ ID NO：35)、A/鸭/江西/22676/13(N3_duck；SEQ ID NO：36)、A/鸭/北海道/222/14(N4_duck；SEQ ID NO：37)、A/翻石鹬/特拉华/AI03-378/03(N4_rt；SEQ ID NO：38)、A/绿眉鸭/加利福尼亚/HS007B/15(N5_aw；SEQ ID NO：39)、A/迁徙鸭/江西/6847/03(N5_md；SEQ ID NO：40)、A/深圳/1/16(N6_Sz；SEQ ID NO：41)、A/里海海豹/俄罗斯/T1/12(N6_cs；SEQ ID NO：42)、A/鸡/荷兰/1/03(N7_cN；SEQ ID NO：43)、A/鸡/德国/R28/03(N7_cG；SEQ ID NO：44)、A/鸡/荷兰/14015531/14(N8_cN；SEQ ID NO：45)、A/鸡/老挝/A0573/07(N8_cL；SEQ ID NO：46)、A/安徽/2/13(N9_AH13；SEQ ID NO：47)、A/鸡/东莞/1143/14(N9_ck；SEQ ID NO：48)和B/马来西亚/2506/04(B_Mal；SEQ ID NO：49)。对于N1_PR8，以加粗和加下划线显示C49。
图10.该图显示了施用于雌性6-8周大的BALB/c小鼠的免疫规程。具体地，在小鼠模型中作为疫苗测试了重组N1-MPP(SEQ ID NO：27)。附图中的表列出了对于多个组所施用的抗原。组1以3周间隔接受了两次肌内3μg剂量的重组N1-MPP。组2接受了相同抗原，但是所述抗原与佐剂AddaVax混合(参见附图中使用小鼠的描述)。组3接受了混合至1μg剂量(基于H1 HA)的当前的季节性四价流感病毒疫苗(QIV，商标：Flucelvax)中的重组N1-MPP两次。基于混合NA和QIV可以赋予NA免疫亚显性的假定，组4在一条腿中接受了重组N1-MPP并且在第二条腿中接受了QIV。组5接受了两次QIV，而组6接受了作为阴性对照的不相关的重组蛋白。在初免后并且在加强后，对动物放血。加强后4周，用25×或400×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)对动物攻毒。
图11A-11C.图11A显示了测量来自根据图10对于组1至6的图例中所提供的规程免疫的小鼠的血清对重组N1-VASP的结合的ELISA结果，所述N1-VASP包含流感病毒A/密歇根/45/15NA的球状头部结构域和人VASP四聚体化结构域。图11B显示了测量来自根据图10对于组1至6的图例中所提供的规程免疫的小鼠的血清与重组H1的结合的ELISA结果。图11C显示了来自功能性神经氨酸酶抑制测定的结果。具体地，来自根据图10对于组1至6的图例中所提供的规程免疫的小鼠的血清抑制含有相匹配的N1 NA(流感病毒A/密歇根/45/15NA)、H7HA和PR8序列的H7N1重组病毒的神经氨酸酶功能的能力。
图12A-12B.图12A显示了如图10的图例中所述免疫的并且如图10的图例中所述使用25×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)攻毒的组1至6中的小鼠的体重减轻。图12B显示了如图10的图例中所述免疫的并且如图10的图例中所述使用25×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)攻毒的组1至6中的小鼠的存活。
图13A-13B.图13A显示了如图10的图例中所述免疫的并且如图10的图例中所述使用400×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)攻毒的组2、4、5和6中的小鼠的体重减轻。图12B显示了如图10的图例中所述免疫的并且如图10的图例中所述使用400×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)攻毒的组2、4、5和6中的小鼠的存活。
图14A-14E.重组N2-MPP(包含MPP四聚体化结构域和流感病毒A/堪萨斯/14/2017(H3N2)N2的球状头部结构域；SEQ ID NO：60)和重组B-MPP(包含MPP四聚体化结构域和流感病毒B/科罗拉多/06/2017NA的球状头部结构域；SEQ ID NO：62)。图14A显示了广泛反应性的抗-乙型流感病毒NA单克隆抗体对重组B-MPP的反应性。图14B显示了广泛反应性的抗-甲型流感病毒N2 NA单克隆抗体对重组N2-MPP的反应性。图14C显示了重组N1-MPP(SEQ IDNO：27)、重组N2-MPP(SEQ ID NO：60)和重组B-MPP(SEQ ID NO：62)在NA-星形测定中的NA活性。图14D显示了还原性SDS-PAGE中的重组N1-MPP(SEQ ID NO：27)、重组N2-MPP(SEQ IDNO：60)和重组B-MPP(SEQ ID NO：62)。图14E显示了交联SDS-PAGE中的重组N1-MPP(SEQ IDNO：27)、重组N2-MPP(SEQ ID NO：60)和重组B-MPP(SEQ ID NO：62)。
图15.本图提供了用于使用重组N1-MPP、重组N2-MPP或重组B-MPP使小鼠免疫的免疫方案。相对于3种重组NA蛋白(重组N1-MPP、重组N2-MPP和重组B-MPP)中每一种的研究，使3组小鼠免疫。以3周间隔，组1和2中的小鼠肌内接种两次3μg重组NA蛋白(重组N1-MPP、重组N2-MPP或者重组B-MPP，如所指明的)。对于一个组，始终施用无佐剂的重组NA，对于第二组，加入AddaVax佐剂。第三组作为阴性对照接受不相关的重组蛋白。加强后3周，用25×LD50的所指明的攻毒病毒对动物攻毒。
图16A-16D.图16A显示了如图15的图例中所述用N1-MPP接种的并且如图15的图例中所述使用25×LD50的A/新加坡/GP1908/2015(H1N1)攻毒的小鼠的体重减轻。图16B显示了如图15的图例中所述用N1-MPP接种的并且如图15的图例中所述使用25×LD50的A/新加坡/GP1908/2015(H1N1)攻毒的小鼠的存活。图16C显示了测量来自根据图15以及图15对于组1至3的图例中所提供的规程免疫的小鼠的血清对重组N1-VASP(其包含流感病毒A/密歇根/45/15NA的球状头部结构域和人VASP四聚体化结构域)的结合的ELISA结果。图16D指示了来自功能性神经氨酸酶抑制测定的结果。具体地，评价了来自如图15的图例中所述用N1-MPP接种的小鼠的血清抑制含有相匹配的N1 NA的H7N1重组病毒的神经氨酸酶功能的能力。
图17A-17C.图17A显示了如图15的图例中所述用N2-MPP接种的并且如图15的图例中所述使用25×LD50的A/瑞士/9715293/2013(H3N2，小鼠适应的)攻毒的小鼠的体重减轻。图17B显示了如图15的图例中所述用N2-MPP接种的并且如图15的图例中所述使用25×LD50的A/瑞士/9715293/2013(H3N2，小鼠适应的)攻毒的小鼠的存活。图17C显示了测量来自根据图15以及图15对于组1至3的图例所提供的规程免疫的小鼠的血清对重组N2-VASP(其包含流感病毒A/堪萨斯/14/2017NA的球状头部结构域和人VASP四聚体化结构域)的结合的ELISA结果。
图18A-18C.图18A显示了如图15的图例中所述用B-MPP接种的并且如图15的图例中所述使用25×LD50的B/纽约/PV01181/2018攻毒的小鼠的体重减轻。图18B显示了如图15的图例中所述用B-MPP接种的并且如图15的图例中所述使用25×LD50的B/纽约/PV01181/2018攻毒的小鼠的存活。图18C显示了测量来自根据图15以及图15对于组1至3的图例中所提供的规程免疫的小鼠的血清对重组B-VASP(其包含流感病毒B/科罗拉多/06/2017NA的球状头部结构域和人VASP四聚体化结构域)的结合的ELISA结果。
4.1序列信息
Figure GDA0003782813240000111
Figure GDA0003782813240000121
Figure GDA0003782813240000131
Figure GDA0003782813240000141
Figure GDA0003782813240000151
Figure GDA0003782813240000161
Figure GDA0003782813240000171
Figure GDA0003782813240000181
Figure GDA0003782813240000191
Figure GDA0003782813240000201
Figure GDA0003782813240000211
Figure GDA0003782813240000221
Figure GDA0003782813240000231
5.详细说明
在一个方面，本文提供了形成稳定四聚体并且具有免疫原性的重组神经氨酸酶。所述重组神经氨酸酶可以用于使受试者免除流感病毒。
5.1重组流感病毒神经氨酸酶
本文提供了重组流感病毒神经氨酸酶(NA)，其可以用作免疫原。在具体的实施方式中，重组神经氨酸酶具有下文6.1或6.2节中所述的神经氨酸酶的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，重组神经氨酸酶具有下文6.1节中所描述的神经氨酸酶的氨基酸序列，但无以下中的一个、两个或更多个：信号序列、组氨酸标签或切割位点。
在某些实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶保留了野生型流感病毒神经氨酸酶的一种、两种或更多种或全部功能。在具体的实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶切割唾液酸。本领域技术人员已知的测定可以用于评价重组神经氨酸酶切割唾液酸的能力。
本领域技术人员将理解可以根据本领域技术人员已知的且认为适合的任何技术来制备本文所提供的重组神经氨酸酶，包括本文所描述的技术。在某些实施方式中，分离了本文所描述的重组神经氨酸酶。
5.1.1具有突变胞外域的重组流感病毒神经氨酸酶
在具体的方面，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含在胞外域的茎结构域中的一个、两个或更多个氨基酸残基处具有半胱氨酸对一个、两个或更多个氨基酸的替换的流感神经氨酸酶胞外域。在一个实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和在茎结构域中的一个、两个或更多个氨基酸残基处具有半胱氨酸对一个、两个或更多个氨基酸的替换的茎结构域。在另一个实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和茎结构域，所述结构域在流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域的第一半胱氨酸和流感病毒神经氨酸酶的跨膜之间的区域中的一个、两个或更多个氨基酸残基处具有半胱氨酸对一个、两个或更多个氨基酸的替换。那些氨基酸残基可以包括N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的一个、两个或更多个或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的一个、两个或更多个的氨基酸残基。作为另外一种选择，那些氨基酸残基可以包括N2亚型的氨基酸残基52和54之一或两者或者对应于流感病毒A/香港/5738/2014的氨基酸残基52和54之一或两者的氨基酸残基。不受任何理论束缚，导致流感病毒神经氨酸酶的茎结构域中的一种或多种其它半胱氨酸的一种或多种氨基酸替换导致形成了提高蛋白稳定性的二硫键。
本领域技术人员将认识到可以根据(例如)晶体结构和/或通过使用结构预测软件(例如，丹麦技术大学(DTU)生物序列分析中心(Center for Biological SequenceAnalysis,Technical University of Denmark DTU)的网址或者Pymol)结合蛋白比对来确定流感病毒神经氨酸酶的结构域的示意图。在具体的实施方式中，流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域的第一个半胱氨酸对应于图9A-9D中通过加粗并加下划线和星号所表示的氨基酸残基。
可以使用本领域技术人员已知的技术鉴别对应于另一种流感病毒NA中的特定氨基酸残基(例如，流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和/或81或者流感病毒A/香港//4801/2014的氨基酸残基52和/或54)的流感病毒NA的茎结构域中的氨基酸残基。在具体的实施方式中，通过比较流感病毒NA的氨基酸序列和/或结构信息(例如，晶体结构)鉴别了对应于特定氨基酸残基(例如，流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和/或81或者流感病毒A/香港//4801/2014的氨基酸残基52和/或54)的流感病毒NA的茎结构域中的氨基酸残基。在具体的实施方式中，流感病毒的NA的氨基酸序列的比对(例如，使用ClustalOmega)以及NA的结构相似性评价使得本领域技术人员能够选择对应于茎结构域中特定氨基酸残基(例如，流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和/或81或者流感病毒A/香港//4801/2014的氨基酸残基52和/或54)的流感病毒NA中的氨基酸残基。参见，例如，图9A-9D中的序列比对。在某些实施方式中，技术人员可能想要避免用半胱氨酸替换影响NA结构的流感病毒NA茎结构域中的氨基酸残基，因为这种氨基酸替换可能影响NA的折叠。在其它实施方式中，流感病毒神经氨酸酶的茎结构域中的任何氨基酸残基可以被半胱氨酸替换。
在一个方面，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78或81处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N1亚型的氨基酸残基50处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基50的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N1亚型的氨基酸残基61处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基61的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N1亚型的氨基酸残基76处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基76的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N1亚型的氨基酸残基81处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基81的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，除了本文所描述的氨基酸残基替换外，所述突变胞外域包含对应于野生型流感病毒胞外域的氨基酸残基。
在另一个方面，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的两个、三个或更多个处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81的两个、三个或更多个的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组流感病毒，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48和50处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48和50的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，除了本文所描述的氨基酸残基替换外，所述突变胞外域包含对应于野生型流感病毒神经氨酸酶胞外域的氨基酸残基。
在另一个方面，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81处或者对应于流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基48的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基50处或者对应于流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基50的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基61处或者对应于流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基61的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基76处或者对应于流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基76的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基81处或者对应于流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶的氨基酸残基81的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，除了本文所描述的氨基酸残基替换外，所述突变胞外域包含对应于野生型流感病毒A/密歇根/45/2015神经氨酸酶胞外域的氨基酸残基。
在另一个方面，本文提供了包含突变甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N2亚型的氨基酸残基52或54处或者对应于流感病毒A/香港/5738/2014的氨基酸残基52或54的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，本文提供了包含突变胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含对应于A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基61、76、78和/或81的流感病毒A/香港/5738/2014神经氨酸酶的氨基酸残基的一个、两个或更多个处的氨基酸替换。在具体的实施方式中，本文提供了包含突变甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N2亚型的氨基酸残基52处或者对应于流感病毒A/香港/5738/2014的氨基酸残基52的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含突变甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N2亚型的氨基酸残基54处或者对应于流感病毒A/香港/5738/2014的氨基酸残基54的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含突变甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含N2亚型的氨基酸残基52和54处或者对应于流感病毒A/香港/5738/2014的氨基酸残基52和54的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，除了本文所描述的氨基酸残基替换外，所述突变胞外域包含对应于野生型流感病毒神经氨酸酶胞外域的氨基酸残基。
在另一个方面，本文提供了包含流感神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，所述流感神经氨酸酶胞外域在所述胞外域的茎结构域中的一个、两个或更多个氨基酸残基处具有一个、两个或更多个半胱氨酸插入。在一个实施方式中，本文提供了包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和茎结构域的重组神经氨酸酶，其在所述茎结构域中的一个、两个或更多个氨基酸残基处具有一个、两个或更多个半胱氨酸插入。在另一个实施方式中，本文提供了包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和茎结构域的重组神经氨酸酶，其在流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域的第一半胱氨酸和流感病毒神经氨酸酶的跨膜之间的区域中的一个、两个或更多个氨基酸残基处具有一个、两个或更多个半胱氨酸对氨基酸的替换。那些插入可以发生在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的一个、两个或更多个的氨基酸残基处。在具体的实施方式中，除了本文所描述的一个或多个半胱氨酸插入外，所述突变胞外域包含对应于野生型流感病毒神经氨酸酶胞外域的氨基酸残基。
在一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78或81处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处包含半胱氨酸插入。在一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域在N1亚型的氨基酸残基61处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基61的氨基酸残基处包含半胱氨酸插入。在具体的实施方式中，除了本文所描述的一个或多个半胱氨酸插入外，所述突变胞外域包含对应于野生型流感病毒神经氨酸酶胞外域的氨基酸残基。
可以使用本领域技术人员已知的技术鉴别流感病毒NA茎结构域中插入半胱氨酸的位置。在具体的实施方式中，通过比较流感病毒NA的氨基酸序列和/或结构信息(例如，晶体结构)鉴别了流感病毒NA的茎结构域中插入半胱氨酸的位置。在具体的实施方式中，流感病毒的NA的氨基酸序列的比对(例如，使用ClustalOmega)以及NA的结构相似性评价使得本领域技术人员能够选择插入半胱氨酸的位置。
在另一个方面，本文提供了包含流感神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，所述流感神经氨酸酶胞外域在所述胞外域的茎结构域中的特定氨基酸残基处具有一个、两个或更多个半胱氨酸插入并且在所述胞外域的茎结构域中的特定氨基酸残基处具有一个、两个或更多个半胱氨酸对氨基酸的替换。在一个实施方式中，本文提供了包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和茎结构域的重组神经氨酸酶，其在所述茎结构域中的特定氨基酸残基处具有一个、两个或更多个半胱氨酸插入并且在胞外域的茎结构域中的特定氨基酸残基处具有一个、两个或更多个半胱氨酸对氨基酸的替换。那些插入、氨基酸替换或两者可以发生在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的一个、两个或更多个的氨基酸残基处。在一个实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含(1)在N1亚型的氨基酸残基61处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基61的氨基酸残基处的半胱氨酸插入；和(2)在N1亚型的氨基酸残基48处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，除了本文所描述的一个或多个半胱氨酸插入和本文所描述的氨基酸残基替换外，所述突变胞外域包含对应于野生型流感病毒胞外域的氨基酸残基。
在具体的实施方式中，突变流感病毒胞外域基于，来自或来源于甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如(例如)N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域。在一些实施方式中，突变流感病毒胞外域基于，来自或来源于N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10或N11胞外域。在某些实施方式中，突变流感病毒胞外域基于，来自或来源于与本文所描述的或本领域中已知的甲型流感病毒神经氨酸酶的胞外域具有70％、75％、80％或85％同一性的甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一些实施方式中，突变流感病毒胞外域基于，来自或来源于与本文所描述的或本领域中已知的甲型流感病毒神经氨酸酶的胞外域具有90％、95％或98％同一性的甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在其它实施方式中，突变流感病毒胞外域基于，来自或来源于乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在某些实施方式中，突变流感病毒胞外域基于，来自或来源于与本文所描述的或本领域中已知的乙型流感病毒神经氨酸酶的胞外域具有70％、75％、80％或85％同一性的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一些实施方式中，突变流感病毒胞外域基于，来自或来源于与本文所描述的或本领域中已知的乙型流感病毒神经氨酸酶的胞外域具有90％、95％或98％同一性的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。本领域技术人员已知的技术可以用于确定两条氨基酸序列之间或者两条核苷酸序列之间的同一性百分比。通常，为了确定两条氨基酸序列或者两条核酸序列的同一性百分比，出于最优比较目的比对序列(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以用于与第二氨基酸或核酸序列的最优比对)。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置处是同一的。两条序列之间的同一性百分比是序列共有相同位置数的函数(即同一性％＝相同重叠位置数/总位置数×100％)。在一个实施方式中，两条序列长度相同。在某些实施方式中，对整个氨基酸序列或核苷酸序列长度确定同一性百分比。还可以使用数学算法实现两条序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比的确定。用于两条序列比较的数学算法的非限制性实例是Karlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268的算法，并且如Karlin and Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877中所改良的算法。将这种算法引入了Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序。可以通过设置为(例如)得分＝100，字长(wordlength)＝12的NBLAST核苷酸程序参数进行BLAST核苷酸搜索以获得与本文所描述的核酸分子相同的核苷酸序列。可以通过设置为(例如)得分50，字长(wordlength)＝3的XBLAST程序参数进行BLAST蛋白搜索以获得与本文所描述的蛋白分子相同的蛋白序列。出于比较的目的，为了获得空位比对(gapped alignments)，可以如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389 3402中所述使用Gapped BLAST。作为另外一种选择，PSI BLAST可以用于实施迭代搜索，其检测了分子之间较远的关系(同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数(参见，例如，万维网ncbi.nlm.nih.gov上的国家生物技术信息中心(NCBI))。用于序列比较的数学算法的另一种非限制性实例是Myers and Miller,1988,CABIOS 4:1117的算法。将该算法引入作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)中。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。在允许或不允许空位的情况下，可以使用类似于以上所描述的那些的技术确定两条序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比中，通常仅对完全匹配计数。
在一些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶还包括流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域、胞质结构域或两者。在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶包含本文所描述的突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域和流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述跨膜结构域、胞质结构域或两者基于、来自或来源于甲型流感病毒神经氨酸酶，如(例如)N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。在一些实施方式中，所述跨膜结构域、胞质结构域或两者基于、来自或来源于N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10或N11。在某些实施方式中，所述跨膜结构域、胞质结构域或两者基于、来自或来源于与本文所描述的或者本领域中已知的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者具有70％、75％、80％或85％的同一性的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在一些实施方式中，所述跨膜结构域、胞质结构域或两者基于、来自或来源于与本文所描述的或者本领域中已知的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者具有90％、95％或98％的同一性的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述跨膜结构域、胞质结构域或两者基于、来自或来源于乙型流感病毒神经氨酸酶。在一些实施方式中，所述跨膜结构域、胞质结构域或两者基于、来自或来源于与本文所描述的或者本领域中已知的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者具有70％、75％、80％或85％的同一性的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述跨膜结构域、胞质结构域或两者基于、来自或来源于与本文所描述的或者本领域中已知的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者具有70％、75％、80％或85％的同一性的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶还包括流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域、胞质结构域或两者，其基于、来自或来源于与所述突变的胞外域相同的流感病毒神经氨酸酶。在另一个实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶还包括流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域、胞质结构域或两者，其基于、来自或来源于与所述突变的胞外域相同的流感病毒神经氨酸酶亚型。
在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶是可溶的。在其它实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶不是可溶的。
在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶包含四聚体化结构域。在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶包含本文所描述的突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域和四聚体化结构域。在一些实施方式中，所述四聚体化结构域包含来自GCN4亮氨酸拉链、细菌四臂四聚体化结构域或者人血管扩张刺激磷蛋白(VASP)四聚体化结构域的四聚体化结构域。在某些实施方式中，所述四聚体化结构域包含来自下列的四聚体化结构域：来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SEPPALLATA-样MADS结构域转录因子(SMDTF)、来自野油菜黄单胞菌(Xhantomonas campestris)的PiLZ结构或者胎生网尾线虫(Dictyocaulusviviparus)ACE四聚体化结构域。在其它实施方式中，所述四聚体化结构域包含来自下列的四聚体化结构域：副粘病毒磷蛋白(例如，尼帕病毒磷蛋白、亨得拉病毒磷蛋白、呼吸道合胞病毒磷蛋白、人副流感病毒(hPIV)磷蛋白、牛副流感病毒磷蛋白、腮腺炎病毒磷蛋白、松湾病毒磷蛋白、加纳病毒磷蛋白、新城疫病毒磷蛋白、犬瘟热病毒磷蛋白或者小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白。在具体的实施方式中，所述四聚体化结构域是来自麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域的四聚体化结构域。在另一个具体的实施方式中，所述四聚体化结构域包含SEQ ID NO：1、2、3、4或5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，已修饰了所使用的四聚体化。例如，已通过(例如)向表位(例如，免疫显性表位)添加N-联接的聚糖使四聚体化结构域，如以上所指出的那些免疫沉默。可以通过向所述结构域添加N-连接的糖基化位点(例如，Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa是任何氨基酸或者Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa是除Pro之外的任何氨基酸)来减弱四聚体化结构域的表位(例如，免疫显性表位)，如以上所指出的那些。在某些实施方式中，将一个、两个或更多个非天然存在的糖基化位点引入所述四聚体化结构域。可以选择所述非天然存在的糖基化位点的位置，从而它们覆盖了所述四聚体化结构域的免疫显性表位。所述N-联接的聚糖的存在可以使所覆盖的表位免疫惰性。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78或81处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在其它实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的两个、三个或更多个或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的两个、三个或更多个的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在某些实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其在N1亚型的氨基酸残基48和50或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48和50的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA亚型相同的流感病毒NA亚型的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在具体的实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的两个、三个或更多个的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA谱系相同的流感病毒NA谱系的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其在对应于流感病毒A/香港/5738/2014神经氨酸酶的氨基酸残基52或54的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在一些实施方式中，本文提供了包含突变甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其在对应于流感病毒A/香港/5738/2014神经氨酸酶的氨基酸残基52或54的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA亚型相同的流感病毒NA亚型的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含在对应于流感病毒A/香港/5738/2014神经氨酸酶的氨基酸残基52或54的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一些实施方式中，本文提供了包含突变乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含在对应于流感病毒A/香港/5738/2014神经氨酸酶的氨基酸残基52和54的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA谱系相同的流感病毒NA谱系的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78或81或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入。在其它实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的两个、三个或更多个或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的两个、三个或更多个的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA亚型相同的流感病毒NA亚型的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在其它实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81中的两个、三个或更多个的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入的乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA谱系相同的流感病毒NA谱系的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其(1)在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78或81或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入，和(2)在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78或81或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在其它实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其(1)在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的1、2、3或更多个或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的1、2、3或更多个的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入；和(2)在N1亚型的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的1、2、3或更多个或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的1、2、3或更多个的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在具体的实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含甲型流感病毒神经氨酸酶胞外域，如，例如，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型胞外域，其(1)在N1亚型的氨基酸残基61或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基61的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入，和(2)在N1亚型的氨基酸残基48或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA亚型相同的流感病毒NA亚型的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的甲型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域，其(1)在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入，和(2)在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78或81的氨基酸残基处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在其它实施方式中，本文提供了包含突变流感病毒胞外域的重组神经氨酸酶，所述胞外域包含乙型流感病毒神经氨酸酶胞外域，其(1)在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的1、2、3或更多个的氨基酸残基处具有半胱氨酸的插入，和(2)在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934神经氨酸酶的氨基酸残基48、50、61、76、78和81中的1、2、3或更多个的氨基酸残基中的1、2、3或更多个处具有半胱氨酸对氨基酸的替换。在一些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含来自与所述流感病毒胞外域的NA谱系相同的流感病毒NA谱系的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包括来自与所述胞外域相同的乙型流感病毒神经氨酸酶的跨膜结构域、胞质结构域或两者。在其它实施方式中，所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域，如本文所述。
在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是人流感病毒神经氨酸酶。人流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是猪流感病毒神经氨酸酶。猪流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是马流感病毒神经氨酸酶。马流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是禽流感病毒神经氨酸酶。禽流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是海豹流感病毒神经氨酸酶。海豹流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。具体的甲型流感病毒神经氨酸酶的实例包括本文所描述的甲型流感病毒株的神经氨酸酶。在具体的实施方式中，甲型流感病毒神经氨酸酶是流感A/布里斯班/02/2018(H1N1)pdm09-样病毒神经氨酸酶、流感A/堪萨斯/14/2017(H3N2)-样病毒神经氨酸酶、流感A/布里斯班/02/2018(H1N1)pdm09-样病毒神经氨酸酶或者流感A/南澳大利亚/34/2019(H3N2)-样病毒神经氨酸酶。
在某些实施方式中，乙型流感病毒神经氨酸酶是人乙型流感病毒神经氨酸酶。人乙型流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，乙型流感病毒神经氨酸酶是海豹乙型流感病毒神经氨酸酶。海豹乙型流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。具体的乙型流感病毒神经氨酸酶的实例包括流感B/山形/16/88-系谱病毒或者流感病毒B/维多利亚/2/87-系谱病毒的神经氨酸酶。在具体的实施方式中，乙型流感病毒神经氨酸酶是流感B/科罗拉多/06/2017-样病毒(B/维多利亚/2/87系谱)神经氨酸酶、流感B/普吉岛/3073/2013-样病毒(B/山形/16/88系谱)神经氨酸酶、流感B/华盛顿/02/2019-样(B/维多利亚系谱)病毒神经氨酸酶或者流感B/普吉岛/3073/2013-样(B/山形系谱)病毒神经氨酸酶。
GenBankTM登录号No.AAA43397.1提供了人流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.ABG23658.1(GI：108946273)、GenBankTM登录号No.NP_040981.1(GI：8486128)、GenBankTM登录号No.AAA43412.1(GI：324508)、GenBankTM登录号No.ABE97720.1(GI：93008579)、GenBankTM登录号No.ABE97719.1(GI：93008577)和GenBankTM登录号No.ABE97718.1(GI：93008575)提供了人流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.CRI06477.1提供了猪流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.AAQ90293.1提供了马流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.AEX30531.1(GI：371449652)、GenBankTM登录号No.AEX30532.1(GI：371449654)、GenBankTM登录号No.AIA62041.1(GI：641454926)、GenBankTM登录号No.AII30325.1(GI：670605039)、GenBankTM登录号No.AGO18161.1(GI：513130855)和GenBankTM登录号No.AAS89005.1(GI：46360357)提供了禽流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。流感病毒基因的序列还可见于流感研究数据库(Influenza ResearchDatabase)。例如，流感病毒神经氨酸酶序列可见于流感研究数据库中登记号No.FJ66084和登录号No.KF90392下的序列。
在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11、13或14所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶具有SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、22或23所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶具有SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、22或23所示的氨基酸序列且不具有以下中的一个、两个或全部：信号肽、六组氨酸标签和凝血酶切割位点。
在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶还包含一个或多个多肽结构域。有用的多肽结构域包括有助于多肽部分的纯化、折叠和切割的结构域。例如，组氨酸标签(His-His-His-His-His-His)(SEQ ID NO：50)、FLAG表位或者其它纯化标签可以帮助本文所提供的神经氨酸酶多肽的纯化。在一些实施方式中，组氨酸标签具有序列(His)n，其中n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或以上。切割位点可以用于帮助多肽部分的切割，例如，纯化标签的切割。有用的切割位点包括凝血酶切割位点，例如，具有序列LVPRGSP(SEQ ID NO：51)的序列。在具体的实施方式中，所述切割位点包含SLVPRGSPSR(SEQ ID NO：63)所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述切割位点是烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶识别的切割位点(例如，氨基酸序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)(SEQ ID NO：52))。
在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶存在于以下形式中的1、2、3或全部中：单体、二聚体、三聚体或四聚体。在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶是如通过本领域中已知的或者本文所描述的技术所评价的四聚体。
在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶能够形成类似于天然流感神经氨酸酶的立体结构的立体结构。可以基于本领域技术人员认为适合的任何技术评价结构相似性。例如，重组神经氨酸酶与识别天然流感神经氨酸酶的中和抗体或抗血清的反应，例如，在非变性条件下的反应可以指示结构相似性。有用的中和抗体或抗血清描述于(例如)Shoji等人,Hum.Vaccines,2011,7:199-204、Wan等人,J.Virol.2013,87:9290-9300、Doyle等人Antivir.Res.2013,100:567-574、Doyle等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.2013,441:226-229和Wohlbold等人,2017,Nat..Microbiol.2(10):1415-1424，以上文献的内容以其全部内容作为参考并入本文。在某些实施方式中，所述抗体或抗血清是与通过神经氨酸酶的三级或四级结构所形成的非邻接表位(即在一级序列中非邻接)反应的抗体或抗血清。
当设计重组神经氨酸酶时，应小心以维持所得蛋白的稳定性。在这方面，建议维持能够形成二硫键的半胱氨酸残基，因为它们有助于神经氨酸酶蛋白的稳定性。对于能够形成二硫键的流感病毒神经氨酸酶半胱氨酸残基的非限制性实例，参见，例如，Basler等人,1999,Journal of Virology,73(10):8095-8103。可以使用本领域中已知的技术评价本文所描述的重组神经氨酸酶的稳定性，如神经氨酸酶分子对Ca2+的敏感性，如(例如)Bakerand Gandhi,1976,Archives of Virology,52:7-18中所述。可以通过本文所描述的(例如，下文第6节中所描述的)任何方法评价重组神经氨酸酶的稳定性。
5.1.2具有四聚体化结构域的重组神经氨酸酶
在一个方面，本文提供了包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺乏流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。在具体的实施方式中，所述重组神经氨酸酶不具有任何跨膜结构域。在某些实施方式中，所述重组神经氨酸酶包括与所述球状头部结构域相同的流感病毒神经氨酸酶的茎结构域或其片段。所述流感病毒神经氨酸酶的茎结构域的片段可以由所述流感病毒神经氨酸酶的茎结构域的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基组成或者包含它们。作为另外一种选择，所述流感病毒神经氨酸酶的茎结构域的片段可以由所述流感病毒神经氨酸酶的茎结构域的2至5、5至10、5至15、10至15、5至20、10至20、15至20、20至30、20至40、25至30、25至40、25至45、25至50、30至40或者40至50个氨基酸残基组成或包含它们。在具体的实施方式中，所述重组神经氨酸酶不包括流感病毒神经氨酸酶的茎结构域。
本领域技术人员将认识到可以根据(例如)晶体结构和/或通过使用结构预测软件(例如，丹麦技术大学(DTU)生物序列分析中心(Center for Biological SequenceAnalysis,Technical University of Denmark DTU)的网址或者Pymol)结合蛋白比对来确定流感病毒神经氨酸酶的结构域的示意图。在具体的实施方式中，流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域的第一个半胱氨酸对应于图9A-9D中通过加粗并加下划线和星号所表示的氨基酸残基。
在具体的实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺乏流感病毒神经氨酸酶茎、跨膜和胞质结构域。在具体的实施方式中，所述重组神经氨酸酶不包括任何跨膜。在某些实施方式中，所述四聚体化结构域包含来自下列的四聚体化结构域：来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SEPPALLATA-样MADS结构域转录因子(SMDTF)、来自野油菜黄单胞菌(Xhantomonas campestris)的PiLZ结构或者胎生网尾线虫(Dictyocaulusviviparus)ACE四聚体化结构域。在其它实施方式中，所述四聚体化结构域包含来自下列的四聚体化结构域：副粘病毒磷蛋白(例如，尼帕病毒磷蛋白、亨得拉病毒磷蛋白、呼吸道合胞病毒磷蛋白、人副流感病毒(hPIV)磷蛋白、牛副流感病毒磷蛋白、腮腺炎病毒磷蛋白、松湾病毒磷蛋白、加纳病毒磷蛋白、新城疫病毒磷蛋白、犬瘟热病毒磷蛋白或者小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白。在某些实施方式中，所述四聚体化结构域不是GCN4亮氨酸拉链、细菌四臂四聚体化结构域或者人血管扩张刺激磷蛋白(VASP)四聚体化结构域。在具体的实施方式中，所述四聚体化结构域是来自麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域的四聚体化结构域。在另一个具体的实施方式中，所述四聚体化结构域包含SEQ IDNO：1、2、3、4或5所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文提供了重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺少流感病毒神经氨酸酶茎结构域、跨膜结构域和胞质结构域，并且其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。在具体的实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：24、25、26、27或28所示的氨基酸序列或者由其组成的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：24、25、26、27或28所示的氨基酸序列或由其组成且无信号序列、组氨酸标签或两者的重组神经氨酸酶。
在另一个实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：27、56、58、60或62所示的氨基酸序列或者由其组成的重组神经氨酸酶。在另一个实施方式中，本文提供了包含SEQ IDNO：27、56、58、60或62所示的氨基酸序列或由其组成且无信号序列、组氨酸标签或两者的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：27、56或58所示的氨基酸序列或者由其组成的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含SEQID NO：27所示的氨基酸序列或由其组成且无以下中的一个、两个或全部：信号序列、组氨酸标签或凝血酶切割位点的重组神经氨酸酶。在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶包含通过SEQ ID NO：55、57、59或61中所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是人流感病毒神经氨酸酶。人流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是猪流感病毒神经氨酸酶。猪流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是马流感病毒神经氨酸酶。马流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是禽流感病毒神经氨酸酶。禽流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是海豹流感病毒神经氨酸酶。海豹流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。
在一些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是甲型流感病毒神经氨酸酶。在具体的实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。具体的甲型流感病毒神经氨酸酶的实例包括本文所描述的甲型流感病毒株的神经氨酸酶。在具体的实施方式中，甲型流感病毒神经氨酸酶是流感A/布里斯班/02/2018(H1N1)pdm09-样病毒神经氨酸酶、流感A/堪萨斯/14/2017(H3N2)-样病毒神经氨酸酶、流感A/布里斯班/02/2018(H1N1)pdm09-样病毒神经氨酸酶或者流感A/南澳大利亚/34/2019(H3N2)-样病毒神经氨酸酶。
在一些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶是乙型流感病毒神经氨酸酶。在某些实施方式中，乙型流感病毒神经氨酸酶是人乙型流感病毒神经氨酸酶。人乙型流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。在某些实施方式中，乙型流感病毒神经氨酸酶是海豹乙型流感病毒神经氨酸酶。海豹乙型流感病毒神经氨酸酶在本领域中是已知的。具体的乙型流感病毒神经氨酸酶的实例包括流感B/山形/16/88-系谱病毒或者流感病毒B/维多利亚/2/87-系谱病毒的神经氨酸酶。在具体的实施方式中，乙型流感病毒神经氨酸酶是流感B/科罗拉多/06/2017-样病毒(B/维多利亚/2/87系谱)神经氨酸酶、流感B/普吉岛/3073/2013-样病毒(B/山形/16/88系谱)神经氨酸酶、流感B/华盛顿/02/2019-样(B/维多利亚系谱)病毒神经氨酸酶或者流感B/普吉岛/3073/2013-样(B/山形系谱)病毒神经氨酸酶。
GenBankTM登录号No.AAA43397.1提供了人流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.ABG23658.1(GI：108946273)、GenBankTM登录号No.NP_040981.1(GI：8486128)、GenBankTM登录号No.AAA43412.1(GI：324508)、GenBankTM登录号No.ABE97720.1(GI：93008579)、GenBankTM登录号No.ABE97719.1(GI：93008577)和GenBankTM登录号No.ABE97718.1(GI：93008575)提供了人流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.CRI06477.1提供了猪流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.AAQ90293.1提供了马流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号No.AEX30531.1(GI：371449652)、GenBankTM登录号No.AEX30532.1(GI：371449654)、GenBankTM登录号No.AIA62041.1(GI：641454926)、GenBankTM登录号No.AII30325.1(GI：670605039)、GenBankTM登录号No.AGO18161.1(GI：513130855)和GenBankTM登录号No.AAS89005.1(GI：46360357)提供了禽流感病毒神经氨酸酶的示例性氨基酸序列。流感病毒基因的序列还可见于流感研究数据库(Influenza ResearchDatabase)。例如，流感病毒神经氨酸酶序列可见于流感研究数据库中登记号No.FJ66084和登录号No.KF90392下的序列。
在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域对本文所描述的(例如，SEQ ID NO：64或66)或者本领域中已知的甲型流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域具有70％、75％、80％或85％的同一性。在一些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域对本文所描述的(例如，SEQ ID NO：64或66)或者本领域中已知的甲型流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域具有90％、95％或98％的同一性。在某些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域对本文所描述的(例如，SEQ ID NO：65)或者本领域中已知的乙型流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域具有70％、75％、80％或85％的同一性。在一些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域对本文所描述的(例如，SEQ ID NO：65)或者本领域中已知的乙型流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域具有90％、95％或98％的同一性。在一些实施方式中，流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域包含SEQ ID NO：64、65或66所示的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶还包含一个或多个多肽结构域。有用的多肽结构域包括有助于多肽部分的纯化、折叠和切割的结构域。例如，组氨酸标签(His-His-His-His-His-His)(SEQ ID NO：50)、FLAG表位或者其它纯化标签可以帮助本文所提供的神经氨酸酶多肽的纯化。在一些实施方式中，组氨酸标签具有序列(His)n，其中n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或以上。切割位点可以用于帮助多肽部分的切割，例如，纯化标签的切割。有用的切割位点包括凝血酶切割位点，例如，具有序列LVPRGSP(SEQ ID NO：51)的序列。在具体的实施方式中，所述切割位点包含氨基酸序列SLVPRGSPSR(SEQ ID NO：63)。在某些实施方式中，所述切割位点是烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶识别的切割位点(例如，氨基酸序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)(SEQ IDNO：52))。在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶不包括切割位点。在一些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶包含信号肽和标签(例如，组氨酸标签)。在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶包含信号肽、标签(例如，组氨酸标签)和切割位点(例如，本文所描述的切割位点)。
在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶按顺序包括信号肽、组氨酸标签或其它纯化标签、四聚体化结构域(例如，MPP或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种四聚体化结构域)、切割位点(例如，SEQ ID NO：63或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种切割位点)和流感病毒NA的球状头部结构域。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶按顺序包括信号肽、组氨酸标签或其它纯化标签、四聚体化结构域(例如，MPP或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种四聚体化结构域)和流感病毒NA的球状头部结构域。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶按顺序包括信号肽、四聚体化结构域(例如，MPP或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种四聚体化结构域)和流感病毒NA的球状头部结构域。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶以下文中第6节所述的顺序包含以下组分：信号肽、组氨酸标签或其它纯化标签、四聚体化结构域(例如，MPP或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种四聚体化结构域)、切割位点(例如，SEQ ID NO：63或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种切割位点)和流感病毒NA的球状头部结构域。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶以下文中第6节所述的顺序包含以下组分：信号肽、组氨酸标签或其它纯化标签、四聚体化结构域(例如，MPP或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种四聚体化结构域)和流感病毒NA的球状头部结构域。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的重组神经氨酸酶以下文中第6节所述的顺序包含以下组分：信号肽、四聚体化结构域(例如，MPP或者本文所描述的或本领域技术人员已知的另一种四聚体化结构域)和流感病毒NA的球状头部结构域。
在某些实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶存在于以下形式中的1、2、3或全部中：单体、二聚体、三聚体或四聚体。在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶是如通过本领域中已知的或者本文所描述的技术所评价的四聚体。
在具体的实施方式中，本文所提供的重组神经氨酸酶能够形成类似于天然流感神经氨酸酶的立体结构的立体结构。可以基于本领域技术人员认为适合的任何技术评价结构相似性。例如，重组神经氨酸酶与识别天然流感神经氨酸酶的中和抗体或抗血清的反应，例如，在非变性条件下的反应可以指示结构相似性。有用的中和抗体或抗血清描述于(例如)Shoji等人,Hum.Vaccines,2011,7:199-204、Wan等人,J.Virol.2013,87:9290-9300、Doyle等人Antivir.Res.2013,100:567-574、Doyle等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.2013,441:226-229和Wohlbold等人,2017,Nat..Microbiol.2(10):1415-1424，以上文献的内容以其全部内容作为参考并入本文。在某些实施方式中，所述抗体或抗血清是与通过神经氨酸酶的三级或四级结构所形成的非邻接表位(即在一级序列中非邻接)反应的抗体或抗血清。
当设计重组神经氨酸酶时，应小心以维持所得蛋白的稳定性。在这方面，建议维持能够形成二硫键的半胱氨酸残基，因为它们有助于神经氨酸酶蛋白的稳定性。对于能够形成二硫键的流感病毒神经氨酸酶半胱氨酸残基的非限制性实例，参见，例如，Basler等人,1999,Journal of Virology,73(10):8095-8103。可以使用本领域中已知的技术评价本文所描述的重组神经氨酸酶的稳定性，如神经氨酸酶分子对Ca2+的敏感性，如(例如)Bakerand Gandhi,1976,Archives of Virology,52:7-18中所述。可以通过本文所描述的(例如，下文第6节中所描述的)任何方法评价重组神经氨酸酶的稳定性。
5.2核酸序列
本文提供了编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列。由于遗传密码的简并度，本文涵盖了编码本文所描述的重组神经氨酸酶的任何核酸序列。在具体的实施方式中，本文提供了包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列(具有或不具有信号肽)。在某些实施方式中，编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列包含编码信号肽(例如，来自与工程化以表达重组神经氨酸酶多肽的流感病毒相同的流感病毒的NA的信号肽/膜锚点)的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核酸序列还包含流感病毒NA的5'非编码区和3'非编码区(例如，来自与工程化以表达重组神经氨酸酶的流感病毒相同的流感病毒的NA的5'非编码区和3'非编码区)。在某些实施方式中，所述核酸序列还包含流感病毒NA基因节段的包装信号。在某些实施方式中，所述核酸序列还包含除了流感病毒NA基因节段以外的流感病毒基因节段的包装信号，如以下中所描述的，例如，国际专利申请公开No.WO 2011/014645；Gao&Palese 2009,PNAS 106:15891-15896；美国专利No.8,828,406，以上每篇文献以其全部内容并入本文。在一些实施方式中，本文所提供的核酸序列是密码子优化的。
在某些实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：55、57、59或61中所示的核苷酸序列的核酸序列。在具体的实施方式中，本文提供了包含SEQ ID NO：55或57中所示的核苷酸序列的核酸序列。
本文还提供了能够杂交至编码重组神经氨酸酶的核酸的核酸序列。在一些实施方式中，本文提供了能够杂交至SEQ ID NO：55、57、60或61中所示的核苷酸序列的核酸序列。在某些实施方式中，本文提供了能够杂交至编码重组神经氨酸酶的核酸序列片段的核酸序列。在一些实施方式中，本文提供了能够杂交至SEQ ID NO：55、57、60或61所示的片段(例如，包含250、300、350、400、450、500、550、600或更多个核苷酸，或者300至600，400至600或者500至700个核苷酸或由其组成)的核酸序列。在其它实施方式中，本文提供了能够杂交至编码重组神经氨酸酶的核酸序列全长的核酸序列。核酸杂交条件的一般参数描述于Sambrook等人,Molecular Cloning-ALaboratory Manual(第2版),1-3卷,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,2卷,Current Protocols Publishing,New York(1994)。可以在高严格性条件、中等严格性条件或低严格性条件下实施杂交。本领域技术人员将理解低、中等和高严格性条件依据相互作用的多个因素而定并且还取决于所讨论的核酸。例如，高严格性条件可以包括核酸5℃熔融温度内的温度、低盐浓度(例如，小于250mM)和高共溶剂浓度(例如，1-20％的共溶剂，例如，DMSO)。另一方面，低严格性条件可以包括低于核酸熔融温度超过10℃的温度、高盐浓度(例如，大于1000mM)和不存在共溶剂。
在一些实施方式中，分离了包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列。在某些实施方式中，“分离的”核酸序列是指与存在于所述核酸的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。换言之，所述分离的核酸序列可以包含在自然界中与它无关的异源核酸。在其它实施方式中，“分离的”核酸序列，如cDNA或RNA序列，当通过重组技术产生时可以基本不含其它细胞材料或者培养基，或者当化学合成时，可以基本不含化学前体或其它化学品。术语“基本不含细胞材料”包括核酸序列的制剂，其中所述核酸序列与从中分离或重组产生所述核酸序列的细胞的细胞组分分离。因此，基本不含细胞材料的核酸序列包括具有小于约30％、20％、10％或5％(按干重)的其它核酸的核酸序列的制剂。术语“基本不含培养基”包括其中培养基占小于约50％、20％、10％或5％的所述制剂的体积的核酸序列的制剂。术语“基本不含化学前体或其它化学品”包括其中所述核酸序列与参与核酸序列合成的化学前体或其它化学品分离的制剂。在具体的实施方式中，除所关心的核酸序列以外，所述核酸序列的这些制剂具有小于约50％、30％、20％、10％、5％(按干重计)的化学前体或化合物。
5.3重组神经氨酸酶的表达
本文提供了载体，包括表达载体，其含有包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶(NA)的核苷酸序列的核酸序列。在具体的实施方式中，所述载体是能够指导编码重组神经氨酸酶的核酸序列的表达的表达载体。表达载体的非限制性实例包括(但不限于)质粒和病毒载体，如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒、水泡性口膜炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、牛痘(例如，修饰的安卡拉痘苗病毒)、腺病毒相关病毒和杆状病毒。本领域技术人员已知的技术可以用于将这些病毒载体工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶。表达载体还可以无限制地包括转基因动物和非哺乳动物细胞/组织，例如，已工程化以实施哺乳动物N-联接的糖基化作用的哺乳动物细胞/组织。
在一些实施方式中，本文提供了编码重组神经氨酸酶的组分(例如，茎结构域和球状头部结构域或者任一种结构域的部分)的表达载体。这些载体可以用于在一个或多个宿主细胞中表达所述组分并且可以使用本领域技术人员已知的技术将所述组分分离并通过接头缀合在一起。
表达载体含有包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列并且处于适合于所述核酸序列在宿主细胞中的表达的形式的核酸序列。在具体的实施方式中，表达载体包括一个或多个调控序列，所述调控序列是基于用于表达的宿主细胞进行选择的，其可操作性地连接至要表达的核酸序列。在表达载体内，“可操作性地连接的”旨在表示将所关心的核酸序列以允许所述核酸序列表达的方式(例如，在体外转录/翻译系统中或者当将所述载体引入宿主细胞时，在宿主细胞中)连接至调控序列。调控序列包括启动子、增强子及其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列包括指导核酸序列在多种宿主细胞类型中组成型表达的那些，指导所述核酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些(例如，组织-特异性调控序列)和指导核酸通过特定试剂刺激表达的那些(例如，诱导型调控序列)。本领域技术人员将理解表达载体的设计可以取决于以下因素，如要转化的宿主细胞和选择、所期望的蛋白表达水平等。术语“宿主细胞”旨在包括用核酸序列转化或转染的特定受试者细胞和该细胞的子代或潜在子代。由于可能在核酸序列向宿主细胞基因组的成功产生或整合中发生的突变或环境影响，这种细胞的子代可以与用所述核酸序列转化或转染的亲代细胞不相同。在具体的实施方式中，所述宿主细胞是细胞系。本文提供了可以用于表达核酸序列的宿主细胞的实例(例如，酵母、禽、昆虫、植物和/或哺乳动物细胞)。
可以使用原核(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体，参见，例如，Treanor等人,2007,JAMA,297(14):1577-1582，以其全部内容作为参考并入本文)、酵母细胞、植物细胞、藻类、禽或哺乳动物细胞)设计用于表达本文所描述的重组神经氨酸酶的表达载体。酵母宿主细胞的实例包括(但不限于)粟酒酵母(S.pombe)和酿酒酵母(S.cerevisiae)以及下文中的实例。禽细胞的实例包括(但不限于)EB66细胞。哺乳动物宿主细胞的实例包括(但不限于)A549细胞、Crucell Per.C6细胞、Vero细胞、CHO细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或WI38细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是骨髓瘤细胞，例如，NS0细胞、45.6TG1.7细胞、AF-2克隆9B5细胞、AF-2克隆9B5细胞、J558L细胞、MOPC 315细胞、MPC-11细胞、NCI-H929细胞、NP细胞、NS0/1细胞、P3 NS1 Ag4细胞、P3/NS1/1-Ag4-1细胞、P3U1细胞、P3X63Ag8细胞、P3X63Ag8.653细胞、P3X63Ag8U.1细胞、RPMI 8226细胞、Sp20-Ag14细胞、U266B1细胞、X63AG8.653细胞、Y3.Ag.1.2.3细胞和YO细胞。昆虫细胞的非限制性实例包括Sf9、Sf21、粉纹夜蛾(trichoplusia ni)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)。在具体的实施方式中，将哺乳动物细胞培养系统(例如，中国仓鼠卵巢或幼仓鼠肾细胞)用于表达重组神经氨酸酶。在另一个实施方式中，将植物细胞培养系统用于表达重组神经氨酸酶。对于植物细胞和使用植物细胞培养系统生产蛋白的方法，参见，例如，美国专利No.7,504,560；6,770,799；6,551,820；6,136,320；6,034,298；5,914,935；5,612,487；和5,484,719以及美国专利申请公开No.2009/0208477、2009/0082548、2009/0053762、2008/0038232、2007/0275014和2006/0204487。在具体的实施方式中，不使用植物细胞培养系统表达重组神经氨酸酶。可以分离包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列的宿主细胞，即所述细胞位于受试者体外。在某些实施方式中，将所述细胞工程化以表达编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列。在具体实施方式中，将所述细胞工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，所述宿主细胞是来自细胞系的细胞。
在某些实施方式中，本文提供了包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列的宿主细胞。在一些实施方式中，本文提供了工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶的宿主细胞。宿主细胞包括本文所描述的那些细胞，包括细胞系。
可以通过常规转化或转染技术将表达载体引入宿主细胞。这些技术包括(但不限于)磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染和电穿孔。适合于转化或转染宿主细胞的方法可见于Sambrook等人,1989,Molecular Cloning-ALaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Press,New York和其它实验室手册。在某些实施方式中，用含有编码重组神经氨酸酶的核酸序列的表达载体瞬时转染宿主细胞。在其它实施方式中，用含有编码重组神经氨酸酶的核酸序列的表达载体稳定转染宿主细胞。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知基于所使用的表达载体和转染技术，仅小部分细胞可以将外源DNA整合到它们的基因组中。为了识别和选择这些整合子(integrant)，通常将编码可选择标志物(例如，抗生素的抗药性)的核酸与所关心的核酸一起引入宿主细胞。可选择标志物的实例包括赋予对药物，如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的耐受性的那些。可以通过药物选择识别用所引入的核酸序列稳定转染的细胞(例如，引入可选择标志物基因的细胞将存活，而其它细胞将死亡)。
作为使用宿主细胞的重组神经氨酸酶的重组表达的替代，可以使用(例如)T7启动子调控序列和T7聚合酶体外转录和转化含有编码重组神经氨酸酶的核酸序列的表达载体。在具体的实施方式中，耦合的转录/翻译系统，如Promega TNT
Figure GDA0003782813240000411
或者包含转录和翻译所必需的组分的细胞裂解液或细胞提取物可以用于产生重组神经氨酸酶。
一旦已产生重组神经氨酸酶，则可以通过本领域中已知的用于蛋白分离或纯化的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和，具体地通过对特异性抗原的亲和力，通过蛋白A和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或者通过用于蛋白分离或纯化的任何其它标准技术进行分离和纯化。
因此，本文提供了用于生产重组神经氨酸酶的方法。在一个实施方式中，所述方法包括在适合的培养基中培养含有包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列的宿主细胞，从而产生了重组神经氨酸酶。在一些实施方式中，所述方法还包括将所述重组神经氨酸酶与培养基或宿主细胞分离。
本文还提供了用于产生包含本文所描述的重组神经氨酸酶的病毒(例如，流感病毒(参见下文第5.4节)或非流感病毒载体(例如，杆状病毒))的方法，其包括在允许病毒生长至允许它们根据本文所述的方法使用的滴度的任何基底中增殖所述病毒。在一个实施方式中，所述基底允许病毒生长至与对于相应野生型病毒所确定的那些相当的滴度。在具体的实施方式中，将病毒在含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖。在具体的实施方式中，将病毒在8-天大、9-天大、8-10-天大、10-天大、11-天大、10-12-天大或者12-天大的含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖。在一些实施方式中，将病毒在干扰素(IFN)-缺陷型含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖。在一些实施方式中，将病毒在干扰素(IFN)表达受损的含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖。在某些实施方式中，将病毒在本领域中已知的MDCK细胞、Vero细胞、293T细胞或其它细胞系中增殖。对于细胞系的实例，参见，例如，以上第5.3节。在某些实施方式中，将病毒在来源于含胚卵的细胞中增殖。在某些实施方式中，将病毒在含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖，然后在本领域中已知的MDCK细胞、Vero细胞、293T细胞或其它细胞系中增殖。
5.4流感病毒
在一个方面，本文提供了含有本文所描述的重组神经氨酸酶(NA)的流感病毒。在具体的实施方式中，重组产生所述流感病毒。在具体的实施方式中，将重组神经氨酸酶引入流感病毒的病毒颗粒。所述流感病毒可以缀合至将所述病毒靶向特定细胞类型，如免疫细胞的部分。在一些实施方式中，将流感病毒的病毒颗粒引入它们或者表达除重组神经氨酸酶之外的异源多肽。所述异源多肽可以是具有免疫增强活性的多肽，或者将流感病毒靶向特定细胞类型的多肽，如结合至特定细胞类型上的抗原的抗体或者结合特定细胞类型上的特定受体的配体。
可以使用本领域技术人员已知的技术，如反向遗传学和无辅助质粒拯救，通过在病毒颗粒的生产期间反式提供重组神经氨酸酶来产生含有重组神经氨酸酶的流感病毒。作为另外一种选择，亲代流感病毒的复制包含在对病毒感染敏感的细胞中工程化以表达重组神经氨酸酶的基因组。在某些实施方式中，反式提供神经氨酸酶功能以产生子代流感病毒。
在另一个方面，本文提供了包含工程化以表达重组神经氨酸酶的基因组的流感病毒。在具体的实施方式中，将亲代流感病毒的基因组工程化以编码重组神经氨酸酶，其通过子代流感病毒表达。在另一个具体的实施方式中，将亲代流感病毒的基因组工程化以编码重组神经氨酸酶，其表达并引入子代流感病毒的病毒颗粒。因此，由亲代流感病毒的复制所产生的子代流感病毒含有重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，亲代流感病毒是甲型流感病毒。在其它具体的实施方式中，亲代流感病毒是乙型流感病毒。
在一些实施方式中，亲代流感病毒的病毒颗粒向它们引入了异源多肽。在某些实施方式中，将亲代流感病毒的基因组工程化以编码异源多肽和重组神经氨酸酶，其通过子代流感病毒表达。在具体的实施方式中，将重组神经氨酸酶、异源多肽或两者引入子代流感病毒的病毒颗粒。
由于甲型和乙型流感病毒的基因组由八(8)条单链负义节段组成，因此可以使用本领域技术人员已知的重组节段和技术，如反向遗传学和无辅助质粒拯救，将亲代流感病毒的基因组工程化以表达重组神经氨酸酶(和任何其它多肽，如异源多肽)。在一个实施方式中，本文提供了重组节段，其包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列以及vRNA的正确复制、转录和包装所需的3'和5'掺入信号(Fujii等人,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:2002-2007；Zheng,等人,1996,Virology 217:242-251,国际专利公开No.WO2011/014645，以上所有文献以其全部内容作为参考并入本文)。在具体的实施方式中，重组节段使用来自与亲代流感病毒不同或相同类型、亚型/系谱或株的流感病毒节段的3'和5'非编码和/或非翻译序列。在一些实施方式中，所述重组节段包含流感病毒NA的3'非编码区、流感病毒NA的未翻译区和流感病毒NA的5'非编码区。在具体的实施方式中，所述重组节段包含来自与流感病毒主链相同类型、系谱或株的包装信号，如流感病毒的NA节段的5'和3'非编码区。例如，如果将重组神经氨酸酶工程化以从甲型流感病毒表达，则编码重组神经氨酸酶(NA)的核苷酸序列包含所述甲型流感病毒的NA节段的5'和3'非编码区。在某些实施方式中，编码重组神经氨酸酶的重组节段可以替换亲代流感病毒的NA节段。
在一些实施方式中，NA基因节段编码重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，流感病毒NA基因节段和至少一种其它流感病毒基因节段包含能够使所述流感病毒NA基因节段和至少一种其它基因节段在重组流感病毒复制期间一起分离的包装信号(参见，Gao&Palese 2009、PNAS 106:15891 15896；美国专利No.8,828,406；和国际专利申请公开No.WO11/014645，每篇文献以其全部内容作为参考并入本文)。
在一些实施方式中，使用双顺反子的重组节段，亲代流感病毒的基因组可以工程化以表达重组神经氨酸酶。双顺反子技术允许通过使用内部核糖体进入位点(IRES)序列将多种蛋白的编码序列工程改造成单一mRNA。IRES序列指导核糖体向RNA分子的内部招募并且允许以不依赖于帽(cap)的方式进行下游翻译。简要地，将一个蛋白的编码区插入第二个蛋白的开放阅读框(ORF)。通过正确表达和/或功能所必需的IRES和任何未翻译的信号序列侧接所述插入。所述插入不可破坏第二个蛋白的ORF、多腺苷酸化或转录启动子(参见，例如García-Sastre等人,1994,J.Virol.68:6254-6261和García-Sastre等人,1994Dev.Biol.Stand.82:237-246，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文)。还参见，例如，美国专利No.6,887,699、美国专利No.6,001,634、美国专利No.5,854,037和美国专利No.5,820,871，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。根据本发明，可以使用本领域中已知的或者本文所描述的任何IRES(例如，BiP基因的IRES，GenBank数据库条目HUMGRP78的核苷酸372至592；或者脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES，GenBank数据库条目CQ867238的核苷酸1430-2115)。因此，在某些实施方式中，将亲代流感病毒工程化以包含表达重组神经氨酸酶和另一种多肽的双顺反子RNA节段，如通过亲代流感病毒所表达的基因。在一些实施方式中，所述亲代流感病毒基因是NA基因。
本领域技术人员已知的技术可以用于产生含有重组神经氨酸酶的流感病毒和包含工程化以表达重组神经氨酸酶的基因组的流感病毒。例如，反向遗传学技术可以用于产生这种流感病毒。简要地，反向遗传学技术一般包括含有负链病毒RNA的非编码区的合成重组病毒RNA的制备，该非编码区对于病毒聚合酶的识别和对于产生成熟病毒粒子所需的包装信号均是必不可少的。重组RNA是从重组DNA模板合成的并通过纯化的病毒聚合酶复合物体外重构以形成重组核糖核蛋白(RNP)，其可以用于转染细胞。如果在合成RNA体外或体内转录期间存在病毒聚合酶蛋白，则将实现更有效的转染。合成的重组RNP可以被拯救成为感染性病毒颗粒。上述技术描述于1992年11月24日授权的美国专利No.5,166,057；1998年12月29日授权的美国专利No.5,854,037；1996年2月20日公开的欧洲专利公开EP 0702085A1；美国专利申请序列号No.09/152,845；1997年4月3日公开的国际专利公开PCT WO 97/12032；1996年11月7日公开的WO 96/34625；欧洲专利公开EP A780475；1999年1月21日公开的WO99/02657；1998年11月26日公开的WO 98/53078；1998年1月22日公开的WO 98/02530；1999年4月1日公开的WO 99/15672；1998年4月2日公开的WO 98/13501；1997年2月20日公开的WO 97/06270；和1997年6月25日公开的EPO 780 475A1，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。
作为另外一种选择，无辅助质粒技术可以用于产生含有重组神经氨酸酶的流感病毒和包含工程化以表达重组神经氨酸酶的基因组的流感病毒。简要地，使用包括独特限制性位点的引物，使用PCR扩增病毒节段的全长cDNA，所述限制性位点允许PCR产物向质粒载体的插入(Flandorfer等人,2003,J.Virol.77:9116-9123；Nakaya等人,2001,J.Virol.75:11868-11873；以上两篇文献均以其全部内容作为参考并入本文)。设计质粒载体，从而表达准确的负(vRNA意义)转录本。例如，可以设计质粒载体以将PCR产物定位在截短的人RNA聚合酶I启动子和肝炎δ病毒核糖酶序列之间，从而从聚合酶I启动子产生准确的负(vRNA意义)转录本。可以将包含每个病毒节段的分离的质粒载体以及包含必需的病毒蛋白的表达载体转染到细胞中，从而导致产生重组病毒颗粒。在另一个实例中，可以使用从中表达编码必需的病毒蛋白的病毒基因组RNA和mRNA两者的质粒载体。对于无辅助质粒技术的详细说明，参见，例如，国际专利公开No.WO 01/04333；美国专利No.6,951,754、7,384,774、6,649,372和7,312,064；Fodor等人,1999,J.Virol.73:9679-9682；Quinlivan等人,2005,J.Virol.79:8431-8439；Hoffmann等人,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6108-6113；和Neumann等人,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9345-9350，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。在具体的实施方式中，将类似于第6节中所述的方法用于构建本文所描述的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，将类似于第6节中所述的方法用于构建含有并表达重组神经氨酸酶的流感病毒。在具体的实施方式中，将类似于第6节中所述的方法用于构建和增殖重组神经氨酸酶。
在一些实施方式中，使用与其它7个流感病毒基因的质粒在哺乳动物细胞系，如HEK293T细胞中共转染的表达重组神经氨酸酶的DNA质粒，通过反向遗传学产生重组流感病毒。在具体的实施方式中，重组流感病毒在鸡胚中复制且相对于不具有本文所述的重组神经氨酸酶的流感病毒无明显缺点。例如，本文所描述的重组流感病毒在特定细胞系中复制至与相应野生型流感病毒相当的滴度。
本文所描述的流感病毒可以在允许病毒生长至允许它们根据本文所述的方法使用的滴度的任何基底中增殖。因此，在某些实施方式中，本文提供了产生本文所描述的病毒的方法，其包括将所述病毒在基底中增殖。在一个实施方式中，所述基底允许病毒生长至与对于相应野生型病毒所确定的那些相当的滴度。在某些实施方式中，所述基底是与流感病毒生物学相关的基底。在具体的实施方式中，借助于(例如)NS1基因中的突变减毒的流感病毒可以在IFN-缺陷型基底中增殖。例如，适合的IFN-缺陷型基底可以是其产生干扰素或对干扰素起反应的能力有缺陷的基底，或者是其中IFN-缺陷型基底可以用于可以需要干扰素-缺陷型生长环境的多种病毒的生长的基底。参见，例如，2003年6月3日授权的美国专利No.6,573,079、2005年2月8日授权的6,852,522和2009年2月24日授权的7,494,808，以上每篇专利的全部内容以其全部作为参考并入本文。在具体的实施方式中，将病毒在含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖。在具体的实施方式中，将病毒在8-天大、9-天大、8-10-天大、10-天大、11-天大、10-12-天大或者12-天大的含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖。在一些实施方式中，将病毒在IFN-缺陷型含胚卵(例如，鸡蛋)中增殖。在某些实施方式中，将病毒在本领域中已知的MDCK细胞、Vero细胞、293T细胞或其它细胞系中增殖。对于细胞系的实例，参见，例如，以上第5.3节。在某些实施方式中，将病毒在来源于含胚卵的细胞中增殖。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法分离和纯化本文所描述的流感病毒。在一个实施方式中，从细胞培养物除去病毒并与细胞组分分离，通常通过熟知的澄清程序，例如，如梯度离心和柱色谱法进行，并且可以根据需要使用本领域技术人员熟知的程序，例如，空斑测定进一步纯化。
在某些实施方式中，用于如本文所述的用途的流感病毒或流感病毒多肽、基因或基因组节段得自或来源于甲型流感病毒。在某些实施方式中，用于如本文所述的用途的流感病毒或流感病毒多肽、基因或基因组节段得自或来源于单一甲型流感病毒亚型/系谱或株。在其它实施方式中，用于如本文所述的用途的流感病毒或流感病毒多肽、基因或基因组节段得自或来源于两种或更多种甲型流感病毒亚型或株。在具体的实施方式中，甲型流感病毒是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18亚型的流感病毒。在具体的实施方式中，甲型流感病毒是H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18亚型的流感病毒。在具体的实施方式中，甲型流感病毒是H1或H3亚型的流感病毒。在具体的实施方式中，甲型流感病毒是H5、H7、H9或H10亚型的流感病毒。
甲型流感病毒的非限制性实例包括亚型H10N4、亚型H10N5、亚型H10N8、亚型、H14N5、亚型H10N7、亚型H10N8、亚型H10N9、亚型H11N1、亚型H11N13、亚型H11N2、亚型H11N4、亚型H11N6、亚型H11N8、亚型H11N9、亚型H12N1、亚型H12N4、亚型H12N5、亚型H12N8、亚型H13N2、亚型H13N3、亚型H13N6、亚型H13N7、亚型H14N5、亚型H14N6、亚型H15N8、亚型H15N9、亚型H16N3、亚型H1N1、亚型H1N2、亚型H1N3、亚型H1N6、亚型H1N9、亚型H2N1、亚型H2N2、亚型H2N3、亚型H2N5、亚型H2N7、亚型H2N8、亚型H2N9、亚型H3N1、亚型H3N2、亚型H3N3、亚型H3N4、亚型H3N5、亚型H3N6、亚型H3N8、亚型H3N9、亚型H4N1、亚型H4N2、亚型H4N3、亚型H4N4、亚型H4N5、亚型H4N6、亚型H4N8、亚型H4N9、亚型H5N1、亚型H5N2、亚型H5N3、亚型H5N4、亚型H5N6、亚型H5N7、亚型H5N8、亚型H5N9、亚型H6N1、亚型H6N2、亚型H6N3、亚型H6N4、亚型H6N5、亚型H6N6、亚型H6N7、亚型H6N8、亚型H6N9、亚型H7N1、亚型H7N2、亚型H7N3、亚型H7N4、亚型H7N5、亚型H7N7、亚型H7N8、亚型H7N9、亚型H8N4、亚型H8N5、亚型H9N1、亚型H9N2、亚型H9N3、亚型H9N5、亚型H9N6、亚型H9N7、亚型H9N8和亚型H9N9。
甲型流感病毒株的具体实例包括(但不限于)：A/维多利亚/361/2011(H3N2)；A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)；A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)；A/珀斯/16/2009(H3N2)；A/布里斯班/59/2007(H1N1)；A/布里斯班/10/2007(H3N2)；A/sw/爱荷华/15/30(H1N1)；A/WSN/33(H1N1)；A/eq/布拉格/1/56(H7N7)；A/PR/8/34；A/野鸭/波茨坦/178-4/83(H2N2)；A/银鸥/DE/712/88(H16N3)；A/sw/香港/168/1993(H1N1)；A/野鸭/阿尔伯塔/211/98(H1N1)；A/滨鸟/特拉华/168/06(H16N3)；A/sw/荷兰/25/80(H1N1)；A/sw/德国/2/81(H1N1)；A/sw/汉诺威/1/81(H1N1)；A/sw/波茨坦/1/81(H1N1)；A/sw/波茨坦/15/81(H1N1)；A/sw/波茨坦/268/81(H1N1)；A/sw/菲尼斯太尔/2899/82(H1N1)；A/sw/波茨坦/35/82(H3N2)；A/sw/阿摩尔滨海省/3633/84(H3N2)；A/sw/根特/1/84(H3N2)；A/sw/荷兰/12/85(H1N1)；A/sw/卡伦钦/2/87(H3N2)；A/sw/什未林/103/89(H1N1)；A/土耳其/德国/3/91(H1N1)；A/sw/德国/8533/91(H1N1)；A/sw/比利时/220/92(H3N2)；A/sw/根特/V230/92(H1N1)；A/sw/莱比锡/145/92(H3N2)；A/sw/Re220/92hp(H3N2)；A/sw/巴库姆/909/93(H3N2)；A/sw/石勒苏益格-荷尔斯泰因/1/93(H1N1)；A/sw/苏格兰/419440/94(H1N2)；A/sw/巴库姆/5/95(H1N1)；A/sw/贝斯特/5C/96(H1N1)；A/sw/英格兰/17394/96(H1N2)；A/sw/耶拿/5/96(H3N2)；A/sw/圣乌登罗德/7C/96(H3N2)；A/sw/洛纳/1/97(H3N2)；A/sw/阿摩尔滨海省/790/97(H1N2)；A/sw/巴库姆/1362/98(H3N2)；A/sw/意大利/1521/98(H1N2)；A/sw/意大利/1553-2/98(H3N2)；A/sw/意大利/1566/98(H1N1)；A/sw/意大利/1589/98(H1N1)；A/sw/巴库姆/8602/99(H3N2)；A/sw/阿摩尔滨海省/604/99(H1N2)；A/sw/阿摩尔滨海省/1482/99(H1N1)；A/sw/根特/7625/99(H1N2)；A/香港/1774/99(H3N2)；A/sw/香港/5190/99(H3N2)；A/sw/香港/5200/99(H3N2)；A/sw/香港/5212/99(H3N2)；A/sw/伊勒-维莱讷省/1455/99(H1N1)；A/sw/意大利/1654-1/99(H1N2)；A/sw/意大利/2034/99(H1N1)；A/sw/意大利/2064/99(H1N2)；A/sw/柏林/1578/00(H3N2)；A/sw/巴库姆/1832/00(H1N2)；A/sw/巴库姆/1833/00(H1N2)；A/sw/阿摩尔滨海省/800/00(H1N2)；A/sw/香港/7982/00(H3N2)；A/sw/意大利/1081/00(H1N2)；A/sw/贝尔齐希/2/01(H1N1)；A/sw/贝尔齐希/54/01(H3N2)；A/sw/香港/9296/01(H3N2)；A/sw/香港/9745/01(H3N2)；A/sw/西班牙/33601/01(H3N2)；A/sw/香港/1144/02(H3N2)；A/sw/香港/1197/02(H3N2)；A/sw/西班牙/39139/02(H3N2)；A/sw/西班牙/42386/02(H3N2)；A/瑞士/8808/2002(H1N1)；A/sw/巴库姆/1769/03(H3N2)；A/sw/比森多夫/IDT1864/03(H3N2)；A/sw/埃伦/IDT2570/03(H1N2)；A/sw/格舍尔/IDT2702/03(H1N2)；A/sw/哈塞吕内/2617/03hp(H1N1)；A/sw/勒宁根/IDT2530/03(H1N2)；A/sw/IVD/IDT2674/03(H1N2)；A/sw/诺德基兴/IDT1993/03(H3N2)；A/sw/诺德瓦尔德/IDT2197/03(H1N2)；A/sw/诺尔登/IDT2308/03(H1N2)；A/sw/西班牙/50047/03(H1N1)；A/sw/西班牙/51915/03(H1N1)；A/sw/费希塔/2623/03(H1N1)；A/sw/菲斯贝克/IDT2869/03(H1N2)；A/sw/瓦尔特斯多夫/IDT2527/03(H1N2)；A/sw/达默/IDT2890/04(H3N2)；A/sw/格尔德恩/IDT2888/04(H1N1)；A/sw/Granstedt/IDT3475/04(H1N2)；A/sw/格雷温/IDT2889/04(H1N1)；A/sw/古登斯贝格/IDT2930/04(H1N2)；A/sw/古登斯贝格/IDT2931/04(H1N2)；A/sw/洛纳/IDT3357/04(H3N2)；A/sw/诺斯诺普/IDT3685/04(H1N2)；A/sw/塞森/IDT3055/04(H3N2)；A/sw/西班牙/53207/04(H1N1)；A/sw/西班牙/54008/04(H3N2)；A/sw/施托尔策瑙/IDT3296/04(H1N2)；A/sw/韦德尔/IDT2965/04(H1N1)；A/sw/巴德格里斯巴赫/IDT4191/05(H3N2)；A/sw/克洛彭堡/IDT4777/05(H1N2)；A/sw/德特林根/IDT3780/05(H1N2)；A/sw/德特林根/IDT4735/05(H1N2)；A/sw/埃格尔哈姆/IDT5250/05(H3N2)；A/sw/Harkenblek/IDT4097/05(H3N2)；A/sw/Hertzen/IDT4317/05(H3N2)；A/sw/Krogel/IDT4192/05(H1N1)；A/sw/拉尔/IDT3893/05(H1N1)；A/sw/拉尔/IDT4126/05(H3N2)；A/sw/梅尔岑/IDT4114/05(H3N2)；A/sw/Muesleringen-S./IDT4263/05(H3N2)；A/sw/奥斯特霍芬/IDT4004/05(H3N2)；A/sw/Sprenge/IDT3805/05(H1N2)；A/sw/施塔特洛恩/IDT3853/05(H1N2)；A/sw/Voglarn/IDT4096/05(H1N1)；A/sw/Wohlerst/IDT4093/05(H1N1)；A/sw/巴德格里斯巴赫/IDT5604/06(H1N1)；A/sw/黑茨拉克/IDT5335/06(H3N2)；A/sw/黑茨拉克/IDT5336/06(H3N2)；A/sw/黑茨拉克/IDT5337/06(H3N2)；和A/野猪/德国/R169/2006(H3N2)。在具体的实施方式中，甲型流感病毒是流感A/布里斯班/02/2018(H1N1)pdm09-样病毒、流感A/堪萨斯/14/2017(H3N2)-样病毒、流感A/布里斯班/02/2018(H1N1)pdm09-样病毒或者流感A/南澳大利亚/34/2019(H3N2)-样病毒。
甲型流感病毒株的其它具体实例包括(但不限于)：A/多伦多/3141/2009(H1N1)；A/雷根斯堡/D6/2009(H1N1)；A/拜恩/62/2009(H1N1)；A/拜恩/62/2009(H1N1)；A/勃兰登堡/19/2009(H1N1)；A/勃兰登堡/20/2009(H1N1)；A/联邦区/2611/2009(H1N1)；A/马托格罗索/2329/2009(H1N1)；A/圣保罗/1454/2009(H1N1)；A/圣保罗/2233/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/37/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/41/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/45/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-1/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-14/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-2/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-21/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-22/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-23/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-24/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-25/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-3/2009(H1N1)；A/猪/阿尔伯塔/OTH-33-7/2009(H1N1)；A/北京/502/2009(H1N1)；A/佛罗伦萨/10/2009(H1N1)；A/香港/2369/2009(H1N1)；A/意大利/85/2009(H1N1)；A/圣多明哥/572N/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/385/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/386/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/387/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/390/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/394/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/397/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/398/2009(H1N1)；A/加泰罗尼亚(Catalonia)/399/2009(H1N1)；A/圣保罗/2303/2009(H1N1)；A/秋田/1/2009(H1N1)；A/卡斯特罗/JXP/2009(H1N1)；A/福岛/1/2009(H1N1)；A/以色列/276/2009(H1N1)；A/以色列/277/2009(H1N1)；A/以色列/70/2009(H1N1)；A/岩手/1/2009(H1N1)；A/岩手/2/2009(H1N1)；A/鹿儿岛/1/2009(H1N1)；A/大阪/180/2009(H1N1)；A/蒙特港/Bio87/2009(H1N1)；A/圣保罗/2303/2009(H1N1)；A/札幌/1/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/30/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/31/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/32/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/33/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/34/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/35/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/36/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/38/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/39/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/40/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/42/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/43/2009(H1N1)；A/斯德哥尔摩/44/2009(H1N1)；A/宇都宫/2/2009(H1N1)；A/WRAIR/0573N/2009(H1N1)；和A/浙江/DTID-ZJU01/2009(H1N1)。
在某些实施方式中，用于如本文所述的用途的流感病毒或流感病毒多肽、基因或基因组节段得自或来源于乙型流感病毒。在某些实施方式中，用于如本文所述的用途的流感病毒或流感病毒多肽、基因或基因组节段得自或来源于单一乙型流感病毒亚型/系谱或株。在其它实施方式中，用于如本文所述的用途的流感病毒或流感病毒多肽、基因或基因组节段得自或来源于两种或更多种乙型流感病毒亚型或株。
乙型流感病毒的非限制性实例包括爱知/5/88株、B/布里斯班/60/2008株；秋田/27/2001、秋田/5/2001株、阿拉斯加/16/2000株、阿拉斯加/1777/2005株、阿根廷/69/2001株、亚利桑那/146/2005株、亚利桑那/148/2005株、曼谷/163/90株、曼谷/34/99株、曼谷/460/03株、曼谷/54/99株、巴塞罗那/215/03株、北京/15/84株、北京/184/93株、北京/243/97株、北京/43/75株、北京/5/76株、北京/76/98株、比利时/WV106/2002株、比利时/WV107/2002株、比利时/WV109/2002株、比利时/WV114/2002株、比利时/WV122/2002株、波恩/43株、巴西/952/2001株、布加勒斯特/795/03株、布宜诺斯艾利斯/161/00)株、布宜诺斯艾利斯/9/95株、布宜诺斯艾利斯/SW16/97株、布宜诺斯艾利斯/VL518/99株、加拿大/464/2001株、加拿大/464/2002株、查科/366/00株、查科/R113/00株、济州/303/03株、千叶/447/98株、重庆/3/2000株、临床分离株SA1泰国/2002、临床分离株SA10泰国/2002、临床分离株SA100菲律宾/2002、临床分离株SA101菲律宾/2002、临床分离株SA110菲律宾/2002)、临床分离株SA112菲律宾/2002、临床分离株SA113菲律宾/2002、临床分离株SA114菲律宾/2002、临床分离株SA2泰国/2002、临床分离株SA20泰国/2002、临床分离株SA38菲律宾/2002、临床分离株SA39泰国/2002、临床分离株SA99菲律宾/2002、CNIC/27/2001株、科罗拉多/2597/2004株、科尔多瓦/VA418/99株、捷克斯洛伐克/16/89株、捷克斯洛伐克/69/90株、大邱/10/97株、大邱/45/97株、大邱/47/97株、大邱/9/97株、B/Du/4/78株、B/德班/39/98株、德班/43/98株、德班/44/98株、B/德班/52/98株、德班/55/98株、德班/56/98株、英格兰/1716/2005株、英格兰/2054/2005)株、英格兰/23/04株、芬兰/154/2002株、芬兰/159/2002株、芬兰/160/2002株、芬兰/161/2002株、芬兰/162/03株、芬兰/162/2002株、芬兰/162/91株、芬兰/164/2003株、芬兰/172/91株、芬兰/173/2003株、芬兰/176/2003株、芬兰/184/91株、芬兰/188/2003株、芬兰/190/2003株、芬兰/220/2003株、芬兰/WV5/2002株、福建/36/82株、日内瓦/5079/03株、热那亚/11/02株、热那亚/2/02株、热那亚/21/02株、热那亚/54/02株、热那亚/55/02株、广东/05/94株、广东/08/93株、广东/5/94株、广东/55/89株、广东/8/93株、广州/7/97株、广州/86/92株、广州/87/92株、京畿道/592/2005株、汉诺威/2/90株、哈尔滨/07/94株、夏威夷/10/2001株、夏威夷/1990/2004株、夏威夷/38/2001株、夏威夷/9/2001株、河北/19/94株、河北/3/94)株、河南/22/97株、广岛/23/2001株、香港/110/99株、香港/1115/2002株、香港/112/2001株、香港/123/2001株、香港/1351/2002株、香港/1434/2002株、香港/147/99株、香港/156/99株、香港/157/99株、香港/22/2001株、香港/22/89株、香港/336/2001株、香港/666/2001株、香港/9/89株、休斯顿/1/91株、休斯顿/1/96株、休斯顿/2/96株、湖南/4/72株、茨城/2/85株、仁川/297/2005株、印度/3/89株、印度/77276/2001株、以色列/95/03株、以色列/WV187/2002株、日本/1224/2005株、江苏/10/03株、约翰尼斯堡/1/99株、约翰尼斯堡/96/01株、门真/1076/99株、门真/122/99株、鹿儿岛/15/94株、堪萨斯/22992/99株、哈尔科夫/224/91株、神户/1/2002株、株、高知/193/99株、拉齐奥/1/02株、李/40株、列宁格勒/129/91株、里斯本/2/90)株、洛杉矶/1/02株、卢萨卡/270/99株、里昂/1271/96株、马来西亚/83077/2001株、马普托/1/99株、马德普拉塔/595/99株、马里兰/1/01株、孟斐斯/1/01株、孟斐斯/12/97-MA株、密歇根/22572/99株、三重/1/93株、米兰/1/01株、明斯克/318/90株、莫斯科/3/03株、名古屋/20/99株、南昌/1/00株、那什维尔/107/93株、那什维尔/45/91株、内布拉斯加/2/01株、荷兰/801/90株、荷兰/429/98株、纽约/1/2002株、NIB/48/90株、宁夏/45/83株、挪威/1/84株、阿曼/16299/2001株、大阪/1059/97株、大阪/983/97-V2株、奥斯陆/1329/2002株、奥斯陆/1846/2002株、巴拿马/45/90株、巴黎/329/90株、帕尔马/23/02株、珀斯/211/2001株、秘鲁/1364/2004株、菲律宾/5072/2001株、釜山/270/99株、魁北克/173/98株、魁北克/465/98株、魁北克/7/01株、罗马/1/03株、萨迦/S172/99株、首尔/13/95株、首尔/37/91株、山东/7/97株、上海/361/2002)株、志贺/T30/98株、四川/379/99株、新加坡/222/79株、西班牙/WV27/2002株、斯德哥尔摩/10/90株、瑞士/5441/90株、台湾/0409/00株、台湾/0722/02株、台湾/97271/2001株、德黑兰/80/02株、东京/6/98株、的里雅斯特/28/02株、乌兰乌德/4/02株、英国/34304/99株、USSR/100/83株、维多利亚/103/89株、维也纳/1/99株、武汉/356/2000株、WV194/2002株、Xuanwu/23/82株、山形/1311/2003株、山形/K500/2001株、阿拉斯加/12/96株、GA/86株、长崎/1/87株、东京/942/96株、B/威斯康星/1/2010和罗契斯特/02/2001株。在具体的实施方式中，乙型流感病毒是流感B/科罗拉多/06/2017-样病毒(B/维多利亚/2/87系谱)、流感B/普吉岛/3073/2013-样病毒(B/山形/16/88系谱)、流感B/华盛顿/02/2019-样(B/维多利亚系谱)病毒或者流感B/普吉岛/3073/2013-样(B/山形系谱)病毒。
流感病毒的其它实例可见于本发明申请的其它处，如(例如)以下第6节中。在具体的实施方式中，可以使用季节性流感病毒株。
在某些实施方式中，本文所提供的流感病毒具有减毒表型。在具体的实施方式中，减毒流感病毒基于甲型流感病毒。在具体的实施方式中，减毒流感病毒包含、编码或者包含并编码重组神经氨酸酶并且具有甲型流感病毒主链。在一些实施方式中，减毒流感病毒基于乙型流感病毒。在具体的实施方式中，减毒流感病毒包含、编码或者包含并编码重组神经氨酸酶并且具有乙型流感病毒主链。
在具体的实施方式中，期望流感病毒减毒，从而病毒至少部分保持感染性且可以体内复制，但仅产生低滴度，从而导致非病原性的亚临床感染水平。这些减毒病毒特别适合于本文所描述的实施方式，其中向受试者施用所述病毒或其免疫原性组合物以引起免疫应答。可以根据本领域中已知的任何方法实现流感病毒的减毒，如(例如)选择通过化学诱变产生的病毒突变体、通过基因工程的基因组突变、选择含有具有减毒功能的节段的重组病毒(例如，截短的NS1蛋白(参见，例如，Hai等人,2008,Journal of Virology 82(21):10580-10590，该文献以其全部内容作为参考并入本文)或NS1缺失(参见，例如，Wressnigg等人,2009,Vaccine 27:2851-2857，该文献以其全部内容作为参考并入本文)或者选择条件性病毒突变体(例如，冷-适应病毒，参见，例如，Alexandrova等人,1990,Vaccine,8:61-64，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。作为另外一种选择，天然存在的减毒流感病毒可以用作流感病毒载体的流感病毒主链。
在具体的实施方式中，将甲型流感病毒A/波多黎各/8/34株用作主链以表达本文所描述的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，甲型流感病毒A/波多黎各/8/34株的病毒颗粒含有本文所描述的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，将甲型流感病毒A/波多黎各/8/34株用于表达本文所描述的重组神经氨酸酶并且A/波多黎各/8/34株的病毒颗粒含有重组神经氨酸酶。
在具体的实施方式中，将缺少NS1蛋白的甲型流感病毒(例如，delNS1病毒，如(例如)美国专利No.6,468,544；Garcia-Sastre等人,1998,Virology 252:324；或
Figure GDA0003782813240000502
等人,2013,Vaccine 31:6194中所述)用作主链以表达本文所描述的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，缺少NS1蛋白的流感病毒的病毒颗粒(例如，delNS1病毒，如(例如)美国专利No.6,468,544；Garcia-Sastre等人,1998,Virology 252:324；或者
Figure GDA0003782813240000501
等人,2013,Vaccine 31:6194中所述)含有本文所描述的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，将缺少NS1蛋白的流感病毒(例如，delNS1病毒，如(例如)美国专利No.6,468,544；Garcia-Sastre等人,1998,Virology 252:324；或者
Figure GDA0003782813240000503
等人,2013,Vaccine 31:6194中所述)用于表达本文所描述的重组神经氨酸酶并且这种病毒的病毒颗粒含有重组神经氨酸酶。
在具体的实施方式中，将冷-适应甲型流感病毒株用作主链以表达本文所描述的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，冷-适应株的病毒颗粒含有本文所描述的重组神经氨酸酶。在另一个具体的实施方式中，将冷-适应甲型流感病毒用于表达本文所描述的重组神经氨酸酶并且冷-适应流感病毒的病毒颗粒含有重组神经氨酸酶。在一个实施方式中，冷-适应甲型流感病毒是A/安阿伯/6/60。在另一个实施方式中，冷-适应甲型流感病毒是A/列宁格勒/134/17/57。在另一个实施方式中，将季节性流感病毒株用作主链以表达本文所描述的重组神经氨酸酶。
在某些实施方式中，包含本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒具有包含野生型流感病毒NA的流感病毒的功能中的1种、2种或更多种。野生型流感病毒NA的功能的非限制性实例包括唾液酸的切割。在具体的实施方式中，包含本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒切割唾液酸。本领域技术人员已知的测定可以用于评价重组神经氨酸酶切割唾液酸的能力。
5.5组合物
在一个方面，本文提供了包含本文所描述的重组神经氨酸酶的组合物。可以将包含本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒引入组合物。在具体的实施方式中，将本文(例如，5.4或6节中)所描述的流感病毒引入组合物。在具体的实施方式中，组合物是药物组合物，如免疫原性组合物(例如，疫苗制剂)。本文所提供的药物组合物可以处于允许所述组合物向受试者施用的任何形式。在具体的实施方式中，所述药物组合物适合于兽医施用和/或人施用。所述组合物可以在预防流感病毒疾病的方法中使用。所述组合物可以在引起对流感病毒的免疫应答的方法中使用。所述组合物可以在对流感病毒免疫的方法中使用。
在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含重本文所描述的组神经氨酸酶和任选地佐剂。在另一个具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的本文所描述的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的佐剂(例如，本文所描述的佐剂)和本文所描述的重组神经氨酸酶。
在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含核酸序列，其包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列，或者载体(例如，表达载体)，其包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列，和任选地佐剂。在另一个具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的核酸序列，其包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列，或者载体(例如，表达载体)，其包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列。在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的佐剂(例如，本文所描述的佐剂)和核酸序列，其包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列，或者载体(例如，表达载体)，其包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含在脂质颗粒、纳米颗粒或脂质体颗粒中包含或与之结合的本文所描述的核酸序列或载体。
在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含含有本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒和任选地佐剂。在另一个具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的包含本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒。在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的佐剂(例如，本文所描述的佐剂)和包含本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒。
在另一个具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的流感病毒(例如，季节性流感病毒株)和本文所描述的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药物可用的载体混合的佐剂(例如，本文所描述的佐剂)、流感病毒(例如，季节性流感病毒株)和本文所描述的重组神经氨酸酶。所述流感病毒可以是活减毒病毒或灭活病毒。另外，所述组合物可以包含不止一种流感病毒(所述流感病毒是活减毒病毒或灭活病毒)和不止一种本文所描述的重组神经氨酸酶。所述流感病毒组合物可以三价或四价的。在一些实施方式中，所述组合物还包含佐剂。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了补充有本文所描述的重组神经氨酸酶的三价灭活流感病毒疫苗。在另一个具体的实施方式中，本文提供了补充有本文所描述的重组神经氨酸酶的四价灭活流感病毒疫苗。在另一个具体的实施方式中，本文提供了补充有本文所描述的重组神经氨酸酶的活减毒流感病毒疫苗。在一些实施方式中，所述组合物还包含佐剂。
在具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含含有本文所描述的重组神经氨酸酶的活病毒(例如，活减毒病毒)和任选地佐剂。在另一个具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含含有本文所描述的重组神经氨酸酶的灭活病毒和任选地佐剂。在另一个具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列和任选地佐剂。在另一个具体的实施方式中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列的载体和任选地佐剂。
在具体的实施方式中，本文提供了包含结合至流感病毒神经氨酸酶的抗体的组合物，它是使用本文所描述的重组神经氨酸酶或流感病毒所产生的。
在某些实施方式中，除了使用本文所描述的重组神经氨酸酶的疗法外，药物组合物(例如，免疫原性组合物)可以包含一种或多种其它疗法。在一些实施方式中，除了使用包含本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒的疗法外，药物组合物(例如，免疫原性组合物)可以包含一种或多种其它疗法。在某些实施方式中，除了使用包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列或者包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列的载体的疗法外，药物组合物(例如，免疫原性组合物)可以包含一种或多种其它疗法。
如本文所使用的，术语“药物可用的”是指联邦或州政府管理机构批准的，或者美国药典或其它通常承认的药典中所列的在动物，并且更具体地在人中使用的。术语“载体”是指药物组合物与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，具体地用于可注射溶液。适合的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。适合的药物载体的实例描述于E.W.Martin主编的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。制剂应适合施用形式。
在具体的实施方式中，将药物组合物配制以适合于受试者的预定施用途径。例如，所述药物组合物可以配制以适合于肠胃外、口服、皮内、透皮、结肠直肠、腹膜内和直肠施用。在具体的实施方式中，可以将所述药物组合物配制用于静脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、透皮或肺部施用。在具体的实施方式中，所述药物组合物可以配制用于肌内施用。在另一个具体的实施方式中，所述药物组合物可以配制用于皮下施用。在另一个具体的实施方式中，所述药物组合物可以配制用于鼻内施用。
在具体的实施方式中，本文所描述的免疫原性组合物是一价制剂。在其它实施方式中，本文所描述的免疫原性组合物是多价制剂。在一个实例中，多价制剂包含不止一种包含本文所描述的重组神经氨酸酶的流感病毒。
在某些实施方式中，本文所描述的免疫原性组合物包含不止一种本文所描述的重组神经氨酸酶。例如，免疫原性组合物可以包含2、3或4种本文所描述的重组神经氨酸酶(例如，重组N1和重组乙型流感病毒NA)。
本文所描述的免疫原性组合物可以用于使受试者对流感病毒免疫。本文所描述的免疫原性组合物还可以用于在受试者中预防流感病毒疾病。在具体的实施方式中，可以在本文所描述的方法中使用本文所描述的免疫原性组合物。
在某些实施方式中，本文所描述的药物组合物(例如，免疫原性组合物)还包含用于使病毒灭活的一种或多种组分，例如，福尔马林或甲醛或去污剂，如脱氧胆酸钠、辛苯昔醇9(Triton X-100)和辛苯昔醇10。在其它实施方式中，本文所描述的药物组合物不包含用于使病毒灭活的任何组分。
在某些实施方式中，本文所描述的药物组合物(例如，免疫原性组合物)还包含一种或多种缓冲液，例如，磷酸盐缓冲液和蔗糖磷酸谷氨酸缓冲液。在其它实施方式中，本文所描述的药物组合物不包含缓冲液。
本文所描述的药物组合物(例如，免疫原性组合物)可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
可以在使用前储存本文所描述的药物组合物(例如，免疫原性组合物)，例如，可以冷冻储存所述药物组合物(例如，在约-20℃或在约-70℃)；在制冷条件下储存(例如，在约4℃)；或者在室温下储存(参见作为国际专利公开No.WO 07/110776公开的国际专利申请No.PCT/IB2007/001149，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文，对于在不制冷条件下储存包含流感疫苗的组合物的方法)。
在具体的实施方式中，免疫原性组合物是包含佐剂(例如，以下5.5.3节中所描述的佐剂)和重组神经氨酸酶(NA)的灭活疫苗。所述灭活疫苗可以是完整的病毒灭活疫苗或者裂解病毒颗粒疫苗。用于生产这些疫苗的技术是本领域技术人员所知的。在具体的实施方式中，免疫原性组合物包含用于通过肌内途径疫苗接种的福尔马林-灭活的完整病毒颗粒。
5.5.1活病毒疫苗
在一个实施方式中，本文提供了包含含有本文所描述的重组神经氨酸酶的活病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在另一个实施方式中，本文提供了包含工程化以编码本文所描述的重组神经氨酸酶的活病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)，所述重组神经氨酸酶通过施用所述组合物的受试者中所产生的子代病毒表达。在具体的实施方式中，所述重组神经氨酸酶是膜-结合的。在其它具体的实施方式中，所述重组神经氨酸酶不是膜-结合的，即它是可溶的。在具体的实施方式中，所述活病毒是流感病毒，如5.4节所述。在一些实施方式中，所述活病毒是减毒的。在具体的实施方式中，所述活病毒是活减毒流感病毒。
在具体的实施方式中，在它在本文所描述的免疫原性组合物中使用前，将含有重组神经氨酸酶的活病毒在鸡胚中增殖。在另一个具体的实施方式中，在它在本文所描述的免疫原性组合物中使用前，未将含有重组神经氨酸酶的活病毒在鸡胚中增殖。在另一个具体的实施方式中，在它在本文所描述的免疫原性组合物中使用前，将含有重组神经氨酸酶的活病毒在哺乳动物细胞，例如，永生人细胞中增殖(参见，例如，作为国际专利公开WO 07/045674公开的国际专利申请No.PCT/EP2006/067566，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文)或者在狗肾细胞，如MDCK细胞中增殖(参见，例如，作为国际专利公开WO 08/032219公开的国际专利申请No.PCT/IB2007/003536，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文)。
用于向受试者施用的包含活病毒的免疫原性组合物可以是优选的，因为病毒在受试者中的增殖可以导致在天然感染中发生的类似种类和幅度的延长刺激，并因此赋予显著、持久的免疫性。
5.5.2灭活病毒疫苗
在一个实施方式中，本文提供了包含含有重组神经氨酸酶的灭活病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在具体的实施方式中，所述重组神经氨酸酶是膜-结合的。在具体的实施方式中，所述灭活病毒是流感病毒，如在5.4或6节中所述。在某些实施方式中，所述灭活病毒免疫原性组合物包含一种或多种佐剂。
本领域技术人员已知的技术可以用于使含有重组神经氨酸酶的病毒灭活。常用方法使用福尔马林、加热或去污剂进行灭活。参见，例如，美国专利No.6,635,246，该专利以其全部内容作为参考并入本文。其它方法包括美国专利No.5,891,705；5,106,619和4,693,981中所述的那些，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。
在具体的实施方式中，本文所描述的免疫原性组合物是裂解疫苗。用于生产裂解病毒疫苗的技术是本领域技术人员已知的。通过非限制性实例，可以使用去污剂破坏的灭活颗粒制备流感病毒裂解疫苗。可以适合于根据本文所述的方法的用途的裂解病毒疫苗的一个实例是fluzone
Figure GDA0003782813240000541
，它是用于肌内使用的流感病毒疫苗(区带纯化的，亚病毒颗粒)，其配制为从在鸡胚中增殖的流感病毒制备的无菌混悬液。收获含病毒流体并用甲醛灭活。使用连续流离心，在线性蔗糖密度梯度溶液中浓缩和纯化流感病毒。然后，使用非离子表面活性剂辛苯昔醇-9(Triton
Figure GDA0003782813240000542
X-100-Union Carbide,Co.的注册商标)化学破坏病毒，从而产生“裂解病毒”。然后，通过化学方式进一步纯化裂解病毒并在磷酸钠-缓冲的等渗氯化钠溶液中混悬。
在具体的实施方式中，在它灭活并后续在本文所描述的免疫原性组合物中使用之前，将含有重组神经氨酸酶的灭活病毒在鸡胚中增殖。在另一个具体的实施方式中，在它灭活并后续在本文所描述的免疫原性组合物中使用之前，未将含有重组神经氨酸酶的灭活病毒在鸡胚中增殖。在另一个具体的实施方式中，在它灭活并后续在本文所描述的免疫原性组合物中使用之前，将含有重组神经氨酸酶的灭活病毒在哺乳动物细胞，例如，永生人细胞中增殖(参见，例如，作为国际专利公开No.WO 07/045674公开的国际专利申请No.PCT/EP2006/067566，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文)或者在狗肾细胞，如MDCK细胞中增殖(参见，例如，作为国际专利公开No.WO08/032219公开的国际专利申请No.PCT/IB2007/003536，该专利以其全部内容作为参考并入本文)，在其灭活并在本文所描述的免疫原性组合物中后续使用前。
5.5.3佐剂
在某些实施方式中，本文所述的组合物包含佐剂，或者与佐剂组合施用。用于与本文所述的组合物组合施用的佐剂可以在所述组合物的施用之前，同时或之后施用。在一些实施方式中，所述佐剂增强或加强对流感病毒的免疫应答并且不产生过敏症或其它不良反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，其包括(例如)淋巴细胞招募、B和/或T细胞的刺激和巨噬细胞的刺激。
在某些实施方式中，佐剂增强了对重组神经氨酸酶的固有反应且不会在多肽中导致影响反应的定性形式的构象变化。佐剂的具体实例包括(但不限于)铝盐(明矾)(如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱-O-酰化单磷酰酯A(MPL)(参见GB 2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、咪唑并吡啶化合物(参见作为国际专利公开No.WO2007/109812公开的国际专利申请No.PCT/US2007/064857)、咪唑喹喔啉化合物(参见作为国际专利公开No.WO2007/109813公开的国际专利申请No.PCT/US2007/064858)和皂苷，如QS21(参见Kensil等人,在Vaccine Design:The Subunit and AdjuvantApproach(Powell&Newman主编,Plenum Press,NY,1995)中；美国专利No.5,057,540)。在一些实施方式中，所述佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是水包油乳化液(如角鲨烯或花生油)，其任选地与免疫刺激剂组合，如单磷酰酯A(参见Stoute等人,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))。另一种佐剂是CpG(Bioworld Today,Nov.15,1998)。这些佐剂可以与或可以不与其它具体免疫刺激剂，如MPL或3-DMP、QS21、聚合或单体氨基酸，如聚谷氨酸或聚赖氨酸或者其它免疫增强剂一起使用。佐剂可以是AddaVax。另一种佐剂是下文6.1或6.2节中所描述的一种佐剂。
5.6预防和治疗性使用
在一个方面，本文提供了使用本文所描述的重组神经氨酸酶或其组合物在受试者中引起免疫应答的方法。在具体的实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本文所描述的免疫原性组合物。
在另一个方面，本文提供了使用包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列或其组合物在受试者中引起免疫应答的方法。在具体的实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列的组合物。在另一个具体的实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列的载体的组合物。
在另一个方面，本文提供了使用含有本文所描述的重组神经氨酸酶，工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒或者本文所述的组合物在受试者中引起免疫应答的方法。在具体的实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的含有本文所描述的重组神经氨酸酶，工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒或其免疫原性组合物。
在具体的实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的活病毒疫苗。在具体的实施方式中，所述活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一个实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的灭活病毒疫苗。在另一个实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的裂解病毒疫苗。
在另一个方面，本文提供了使用本文所描述的重组神经氨酸酶或其组合物在受试者中使其对流感病毒免疫的方法。在具体的实施方式中，对流感病毒免疫的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本文所描述的免疫原性组合物。
在一个方面，本文提供了使用包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列或其组合物在受试者中使其对流感病毒免疫的方法。在一个具体的实施方式中，在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列的组合物。在另一个具体的实施方式中，在受试者中使其对流感病毒免疫的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的包含含有编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核酸序列的载体(例如，表达载体)的组合物。
在另一个方面，本文提供了使用含有本文所描述的重组神经氨酸酶，工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒或者本文所述的组合物在受试者中使其对流感病毒免疫的方法。在具体的实施方式中，对流感病毒免疫的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的含有本文所描述的重组神经氨酸酶，工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒或其免疫原性组合物。
在具体的实施方式中，对流感病毒免疫的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的活病毒疫苗。在具体的实施方式中，所述活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一个实施方式中，对流感病毒免疫的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的灭活病毒疫苗。在另一个实施方式中，在受试者中使其对流感病毒免疫的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的裂解病毒疫苗。
在另一个方面，本文提供了对流感病毒免疫的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的免疫原性组合物(例如，在以上5.5节中)和向所述受试者施用本文所描述的佐剂。在一个实施方式中，本文提供了在受试者中使其对流感病毒免疫的方法，其包括与本文所描述的佐剂组合向所述受试者施用本文所描述的免疫原性组合物(例如，在以上5.5节中)。可以与本文所描述的佐剂的施用同时，在它之前(例如，之前小于5分钟、小于10分钟、小于15分钟、小于30分钟、小于45分钟、小于60分钟、小于1.5小时或者小于2小时)或者在它之后(例如，之后小于5分钟、小于10分钟、小于15分钟、小于30分钟、小于45分钟、小于60分钟、小于1.5小时或者小于2小时)向所述受试者施用免疫原性组合物。在具体的实施方式中，通过相同施用途径施用本文所描述的免疫原性组合物和佐剂。在其它实施方式中，通过不同施用途径施用所述免疫原性组合物和所述佐剂。在具体的实施方式中，所述免疫原性组合物包含含有本文所描述的重组NA的灭活流感病毒。在另一个具体的实施方式中，所述免疫原性组合物包含裂解流感病毒，其中所述裂解流感病毒包含本文所描述的重组NA。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物不包含佐剂。
在另一个实施方式中，本文提供了免疫方案，其包括使用本文所描述的免疫原性组合物(例如，疫苗)的第一免疫(例如，初免)，以及之后使用免疫原性组合物(例如，疫苗)的1、2或更多次额外免疫(例如，加强)。在一个实施方式中，免疫方案包括使用本文所描述的免疫原性组合物(例如，疫苗)的第一免疫(例如，初免)，以及之后使用免疫原性组合物(例如，疫苗)的一次额外免疫(例如，加强)。在具体的实施方式中，在第一免疫中使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)与在1、2或更多次额外免疫中使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)的类型相同。例如，如果在第一免疫中所使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)是灭活流感病毒疫苗制剂，则用于1、2或更多次额外免疫的免疫原性组合物(例如，疫苗)可以是相同类型的疫苗制剂，即灭活流感病毒疫苗制剂。在其它具体的实施方式中，在第一免疫中使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)与在1、2或更多次额外免疫中使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)的类型不同。例如，如果在第一免疫中所使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)是活流感病毒疫苗制剂，则在1、2或更多次额外免疫中使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)是另一种类型的疫苗制剂，如灭活流感病毒。在另一个实例中，如果在第一免疫中所使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)是活减毒流感病毒疫苗制剂，则在1、2或更多次额外免疫中使用的免疫原性组合物(例如，疫苗)是另一种类型的疫苗制剂，如灭活流感病毒。在某些实施方式中，改变在所述额外免疫中所使用的疫苗制剂。例如，如果将活减毒流感病毒疫苗制剂用于一种额外免疫，则一种或多种额外免疫可以使用不同的疫苗制剂，如灭活疫苗制剂。在具体的实施方式中，将活流感病毒疫苗制剂施用于受试者，然后施用灭活疫苗制剂(例如，裂解病毒疫苗或亚单位疫苗)。在具体的实施方式中，免疫方案类似于下文第6节中所述的方案(例如，下文实施例1或3)。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法，可以向受试者施用一个、两个或更多个剂量的本文所描述的免疫原性组合物。
在具体的实施方式中，根据本文所描述的方法，在流感季节之前、期间或之后使受试者免疫。在具体的实施方式中，美国的流感季节可以为从第一年的九月或十月至次年的三月或四月。
在一些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于预防由甲型流感病毒的1、2或更多个亚型所引起的流感病毒疾病是有效的。在一些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于预防由流感病毒的1、2、3或更多个株所引起的流感病毒疾病是有效的。在某些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于预防由属于一个NA组而不是另一个NA组的流感病毒亚型所引起的流感病毒疾病是有效的。在一些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于预防由相同亚型的甲型流感病毒内的一个或多个株所引起的流感病毒疾病是有效的。在某些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于预防由相同亚型的甲型流感病毒内的1、2、3或更多个株所引起的流感病毒疾病是有效的。
在一些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于减少由流感病毒疾病/感染所产生的症状数目是有效的。在某些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于减少由流感病毒疾病/感染所产生的一种或多种症状的持续时间是有效的。流感病毒疾病/感染的症状包括(但不限于)身体疼痛(特别是关节和喉)、发烧、恶心、头疼、眼睛发炎、疲劳、喉咙痛、眼睛或皮肤发红和腹痛。
在一些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于减少患有流感病毒疾病/感染的受试者的住院治疗是有效的。在一些实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答对于减少患有流感病毒疾病/感染的受试者的住院治疗的持续时间是有效的。
在具体的实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答引起NA-特异性抗体(例如，IgG)。在另一个具体的实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答引起了具有ADCC活性的抗体，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的技术所评价的。在另一个具体的实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答引起了具有神经氨酸酶抑制活性的抗体，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的技术所评价的。在另一个具体的实施方式中，通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的免疫应答引起了具有下列活性的抗体：(1)ADCC活性，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的；和(2)神经氨酸酶抑制活性，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的技术所评价的。
在另一个方面，本文提供了使用本文所描述的免疫原性组合物预防受试者中流感病毒疾病的方法。在具体的实施方式中，预防受试者中流感病毒疾病的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的重组神经氨酸酶。在具体的实施方式中，预防受试者中流感病毒疾病的方法包括向对其有需要的受试者施用包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列或者包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体。在具体的实施方式中，预防受试者中流感病毒疾病的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的活病毒疫苗、灭活病毒疫苗或裂解病毒疫苗。在具体的实施方式中，预防受试者中流感病毒疾病的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的活病毒疫苗。在具体的实施方式中，所述活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一个实施方式中，预防受试者中流感病毒疾病的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的灭活病毒疫苗。在另一个实施方式中，预防受试者中流感病毒疾病的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的裂解病毒疫苗。在另一个实施方式中，预防受试者中流感病毒疾病的方法包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的免疫原性组合物。
在另一个方面，本文提供了在受试者中预防流感病毒疾病或者治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法，其包括向受试者施用抗-流感病毒NA抗体，其中使用本文所描述的免疫原性组合物产生所述抗-流感病毒NA抗体。例如，可以将本文所描述的免疫原性组合物施用于非人受试者(例如，表达或能够表达人抗体的非人受试者)以产生抗-流感病毒NA抗体。在具体的实施方式中，本文提供了预防人受试者中流感病毒疾病的方法，其包括向所述受试者施用人或人源化抗-流感病毒NA抗体，其中使用本文所描述的免疫原性组合物产生所述抗-流感病毒NA抗体。
在某些实施方式中，在本文所提供的受试者(例如，人或非人动物)中预防流感病毒疾病或者治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法导致所述受试者中流感病毒的复制的减少，如通过本领域技术人员已知的和本文所描述的体内和体外测定所测量的。在一些实施方式中，流感病毒的复制减少了约1log或以上、约2log或以上、约3log或以上、约4log或以上、约5log或以上、约6log或以上、约7log或以上、约8log或以上、约9log或以上、约10log或以上，1至3log、1至5log、1至8log、1至9log、2至10log、2至5log、2至7log、2log至8log、2至9log、2至10log、3至5log、3至7log、3至8log、3至9log、4至6log、4至8log、4至9log、5至6log、5至7log、5至8log、5至9log、6至7log、6至8log、6至9log、7至8log、7至9log或者8至9log。在具体的实施方式中，在本文所提供的受试者(例如，人或非人动物)中预防流感病毒疾病或者治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法导致受试者中所检测的流感病毒的滴度降低。在具体的实施方式中，在受试者中预防流感病毒疾病或者治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法导致以下中的1个、2个或更多个：(1)感染/疾病症状数目减少，(2)感染/疾病的症状的严重程度降低，(3)感染/疾病的时间缩短，(4)感染/疾病所造成的住院治疗或并发症减少，(5)受试者的住院治疗时间缩短，(6)与流感病毒感染/疾病有关的器官衰竭减少和(7)受试者的存活提高。在具体的实施方式中，在受试者中预防流感病毒疾病或者治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法抑制流感病毒疾病或其一种或多种症状的出现或发病。
在某些实施方式中，本文提供了用于产生抗体的方法，其包括施用含有、工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒或者可以向受试者(例如，非人受试者)施用本文所述的组合物。在一些实施方式中，可以向受试者(例如，非人受试者)施用含有、工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒或本文所述的组合物，并且可以分离抗体。可以克隆分离的抗体。所述抗体可以是人源化和/或优化的。在一些实施方式中，产生杂交瘤，所述杂交瘤产生所关心的具体抗体。在某些实施方式中，施用本文所描述的重组神经氨酸酶或本文所述的组合物的非人受试者能够产生人抗体。用于分离、克隆、人源化、优化和用于产生杂交瘤的技术是本领域技术人员已知的。在具体的实施方式中，可以在测定(例如，本文所描述的测定)以及在受试者(例如，人受试者)的被动免疫中使用通过本文所描述的方法产生的抗体。因此，在某些实施方式中，本文提供了用于治疗流感病毒感染或预防流感病毒疾病的方法，其包括施用通过本文所描述的方法产生的抗体。
在另一个方面，本文所描述的重组神经氨酸酶可以在测定，如免疫测定中用于评价抗流感病毒神经氨酸酶的抗体。
5.6.1组合疗法
在多个实施方式中，可以与一种或多种其它疗法(例如，抗病毒剂、抗菌剂或免疫调节疗法)组合向受试者施用(1)本文所描述的重组神经氨酸酶，(2)包含编码本文所描述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列，(3)包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体，或者(4)含有、工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒。在一些实施方式中，可以与一种或多种疗法(例如，抗病毒剂、抗菌剂或免疫调节疗法)组合向受试者施用本文所描述的药物组合物(例如，免疫原性组合物)。所述一种或多种其它疗法可以在预防流感病毒疾病中是有益的，或者可以改善与流感病毒疾病有关的症状或病况。在一些实施方式中，所述一种或多种其它疗法是止痛药、退烧药物治疗或者减轻或帮助呼吸的疗法。在某些实施方式中，间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时或者间隔96小时至120小时施用所述疗法。在具体的实施方式中，在相同患者访问内施用两种或更多种疗法。
5.6.2患者群体
在某些实施方式中，可以将重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物施用于未治疗过的受试者，即未患有由流感病毒感染所引起的疾病或者尚未或目前未感染流感病毒感染的受试者。在一个实施方式中，可以将重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物施用于处于获得流感病毒感染的风险的未治疗过的受试者。
在另一个实施方式中，向未患有由特异性流感病毒所引起的疾病或者尚未且未感染重组神经氨酸酶对它引起免疫应答的特异性流感病毒的受试者施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物。
在另一个实施方式中，还可以向感染或已感染流感病毒或者重组神经氨酸酶对它引起免疫应答的另一种流感病毒类型、亚型/谱系或株的受试者施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物。
在某些实施方式中，将重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物施用于已诊断患有流感病毒感染的患者。在一些实施方式中，在出现症状或症状变严重之前(例如，在患者需要住院治疗之前)，将重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物施用于感染流感病毒的患者。
在一些实施方式中，施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的受试者是动物。在某些实施方式中，所述动物是鸟。在某些实施方式中，所述动物是狗。在某些实施方式中，所述动物是猫。在某些实施方式中，所述动物是马。在某些实施方式中，所述动物是牛。在某些实施方式中，所述动物是哺乳动物，例如，马、猪、小鼠或灵长类动物，优选地人。
在具体的实施方式中，施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的受试者是婴儿。如本文所使用的，术语“婴儿”是指新生儿至1岁大的人。
在具体的实施方式中，施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的受试者是儿童。如本文所使用的，术语“儿童”是指1岁至18岁的人。
在具体的实施方式中，施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的受试者是成年人。如本文所使用的，术语“成年人”是指18岁或以上的人。
在具体的实施方式中，施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的受试者是老年人。如本文所使用的，术语“老年人”是指65岁或以上的人。
在一些实施方式中，将施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的人受试者是患流感病毒感染或由流感病毒感染所造成的疾病的风险升高的任何个体(例如，免疫受损或免疫缺陷个体)。
在一些实施方式中，将施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的人受试者是与患流感病毒感染或由流感病毒感染所造成的疾病的风险升高的个体(例如，免疫受损或免疫抑制个体)密切接触的任何个体。
在一些实施方式中，将施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的人受试者是受提高对流感病毒感染或者由流感病毒感染所造成的并发症或疾病的敏感度的任何病况的影响的个体。在其它实施方式中，向其中流感病毒感染具有提高另一种病况(个体受所述另一种病况的影响或者他们处于患所述另一种病况的风险)的并发症的潜力的受试者施用重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物。
5.6.3递送途径
可以通过多种途径将重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物递送至受试者。这些包括(但不限于)鼻内、肺部、气管内、口服、皮内、肌内、腹膜内、透皮、静脉内、结膜和皮下途径以及本文所描述的其它途径。在一些实施方式中，将组合物配制用于局部施用，例如，用于应用至皮肤。在具体的实施方式中，所述施用途径是鼻施用，例如，作为鼻喷雾剂的一部分。在某些实施方式中，将组合物配制用于肌内施用。在一些实施方式中，将组合物配制用于皮下施用。在活病毒疫苗的具体实施方式中，将疫苗配制用于通过除注射以外的途径施用。
在一个实施方式中，鼻内施用活减毒流感病毒疫苗。在另一个实施方式中，肌内施用灭活流感病毒疫苗(例如，灭活的完整病毒疫苗或裂解流感病毒疫苗)。
5.6.4剂量
将在流感病毒疾病的预防中有效的重组神经氨酸酶；包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列；包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体(例如，表达载体)；含有或工程化以表达本文所描述的重组神经氨酸酶或两者的流感病毒；或本文所述的组合物的量将取决于疾病性质，并且可以通过标准临床技术确定。
将在制剂中使用的准确剂量还将取决于施用途径和由它所引起的感染或疾病的严重性，并且应根据开业医生的判断和每位受试者的情况决定。例如，有效剂量还可以基于施用方式、目标位点、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康)、患者是人还是动物、所施用的其它药物治疗和治疗是预防性的还是治疗性的来改变。通常，所述患者是人，但是还可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。最优地，滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
在向受试者施用疗法的背景中，如本文所使用的，术语“有效量”是指可以具有预防效果、治疗效果或者预防和治疗效果两者的疗法的量。在某些实施方式中，在向受试者施用疗法的背景中的“有效量”是指足以实现以下效果中的一个、两个、三个、四个或更多个的疗法的量：(i)降低或改善流感病毒感染、与之有关的疾病或症状的严重程度；(ii)缩短流感病毒感染、与之有关的疾病或症状的持续时间；(iii)预防流感病毒感染、与之有关的疾病或症状的发展；(iv)引起流感病毒感染、与之有关的疾病或症状消退；(v)预防流感病毒感染、与之有关的疾病或症状的出现或发病；(vi)预防流感病毒感染、与之有关的疾病或症状的复发；(vii)减少或预防流感病毒从一种细胞向另一种细胞、一种组织向另一种组织或者一种器官向另一种器官的传播；(viii)预防或减少流感病毒从一个受试者向另一个受试者的传播；(ix)缩短与流感病毒感染有关的器官衰竭；(x)减少受试者的住院治疗；(xi)减少住院治疗长度；(xii)提高患有流感病毒感染或与之有关的疾病的受试者的存活；(xiii)消除流感病毒感染或与之有关的疾病；(xiv)抑制或减少流感病毒复制；(xv)抑制或减少流感病毒向宿主细胞的进入；(xvi)抑制或减少流感病毒基因组的复制；(xvii)抑制或减少流感病毒蛋白的合成；(xviii)抑制或减少流感病毒颗粒的组装；(xix)抑制或减少流感病毒颗粒从宿主细胞的释放；(xx)降低流感病毒滴度；和/或(xxi)提高或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
在某些实施方式中，所述有效量不导致完全保护避免流感病毒疾病，但是与患有流感病毒感染的未治疗的受试者相比，导致流感病毒滴度降低或流感病毒数减少。在某些实施方式中，所述有效量导致相对于患有流感病毒感染的未治疗的受试者，流感病毒滴度降低0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或以上。在一些实施方式中，所述有效量导致相对于患有流感病毒感染的未治疗的受试者流感病毒的滴度降低约1log或以上、约2log或以上、约3log或以上、约4log或以上、约5log或以上、约6log或以上、约7log或以上、约8log或以上、约9log或以上、约10log或以上，1至3log、1至5log、1至8log、1至9log、2至10log、2至5log、2至7log、2log至8log、2至9log、2至10log、3至5log、3至7log、3至8log、3至9log、4至6log、4至8log、4至9log、5至6log、5至7log、5至8log、5至9log、6至7log、6至8log、6至9log、7至8log、7至9log或者8至9log。流感病毒的滴度、数或总负荷的降低的益处包括(但不限于)感染症状不太严重，感染症状较少且与感染有关的疾病长度缩短。
在某些实施方式中，疗法(例如，其组合物)的有效量导致相对于免疫前来自所述受试者的血液样品中的抗-流感病毒NA滴度，来自施用所述有效量的受试者的血液样品中的抗-流感病毒NA滴度在免疫后高0.5倍至10倍、0.5倍至4倍、0.5倍至3倍、0.5倍至2倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。在某些实施方式中，疗法(例如，其组合物)的有效量导致相对于免疫前来自所述受试者的血液样品中的抗-流感病毒NA茎滴度(stalk titer)，来自施用所述有效量的受试者的血液样品中的抗-流感病毒NA茎滴度在免疫后高0.5倍至10倍、0.5倍至4倍、0.5倍至3倍、0.5倍至2倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。
在某些实施方式中，本文所描述的流感病毒的剂量可以为104空斑形成单位(PFU)至108PFU。在一些实施方式中，重组神经氨酸酶的剂量可以含有5至15μg本文所描述的重组神经氨酸酶。在某些实施方式中，配制灭活疫苗从而它含有5至15μg的本文所描述的血球凝集素(HA)多肽。在一些实施方式中，本文所描述的核酸序列或载体的剂量可以含有25微克至1毫克的核酸序列或载体。
5.7生物测定
本文还提供了可以用于鉴定重组NA和含有、表达这些突变流感病毒NA多肽或两者的病毒的生物测定。还参见第6节。在具体的实施方式中，第6节中所描述的测定用于鉴定重组NA或者含有、表达这种重组NA或两者的病毒。在另一个具体的实施方式中，在第6节中所描述的测定用于鉴定通过本文所描述的免疫原性组合物所引起的抗体的神经氨酸酶抑制活性。在另一个具体的实施方式中，使用第6节中所描述的1、2或更多个测定评价本文所描述的免疫原性组合物的免疫原性或有效性。
5.7.1用于测试重组神经氨酸酶活性的测定
可以使用本领域中已知的任何测定实施用于测试本文所公开的重组神经氨酸酶的表达的测定。例如，免疫测定，如免疫印迹可以用于评价重组神经氨酸酶的表达。使用本领域中熟知的方法，重组神经氨酸酶向病毒载体掺入的测定可以包括使如本文所描述的病毒生长、通过经由蔗糖垫的离心纯化病毒颗粒，和通过免疫测定，如免疫印迹对重组神经氨酸酶表达的后续分析。
在另一个实施方式中，使用本领域中已知的任何方法，如(例如)NMR、X射线晶体学方法或二级结构预测法，例如，圆二色性，通过确定重组神经氨酸酶的结构或构象，测定本文所公开的重组神经氨酸酶的正确折叠。
在另一个实施方式中，使用本领域中已知的或者本文所描述的(例如，下文第6节中)技术，测试了本文所公开的重组神经氨酸酶形成四聚体的能力。在另一个实施方式中，使用本领域技术人员已知的或本文所描述的(例如，下文第6节)技术，评价了本文所公开的重组神经氨酸酶或者含有或表达本文所公开的重组神经氨酸酶的病毒的流感病毒神经氨酸酶活性。
5.8试剂盒
在一个方面，本文提供了用于在受试者中对流感病毒免疫的药物包或试剂盒，其包含填充了本文所描述的药物组合物(例如，本文所描述的免疫原性组合物)的一种或多种成分，如流感病毒(例如，活减毒流感病毒或灭活病毒)，或者重组神经氨酸酶，或者包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列，或者包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体的一个或多个容器。任选的，与这种容器相关的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的注意事项，所述注意事项反映了所述制造、使用或销售机构批准用于人施用。
可以根据本文所描述的方法使用本文所涵盖的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含处于一个或多个容器中的本文所描述的重组神经氨酸酶(如上文5.1节或者第6节中所述)。在另一个实施方式中，试剂盒包含处于一个或多个容器中的本文所描述的含有重组神经氨酸酶的流感病毒(如上文5.4节或者第6节中所述)。在另一个实施方式中，试剂盒包含处于一个或多个容器中的包含编码重组神经氨酸酶的核苷酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，试剂盒包含处于一个或多个容器中的包含编码重组神经氨酸酶的核酸序列的载体。在另一个实施方式中，试剂盒包含处于一个或多个容器中的本文所描述的一种或多种免疫原性组合物。在某些实施方式中，试剂盒包含本文所描述的疫苗，例如，灭活流感病毒疫苗或者活流感病毒疫苗，其中所述疫苗包含本文所描述的重组神经氨酸酶和任选地，本文所描述的佐剂(例如，在第5.5.3节或第6节中)。
在某些实施方式中，本文所描述的试剂盒包含：(a)包含本文所描述的免疫原性组合物(例如，在第5.5节或第6节中所述)的第一容器；和(b)包含本文所描述的佐剂(例如，在第5.5.3节中所述)的第二容器。在具体的实施方式中，所述免疫原性组合物是灭活的完整病毒疫苗。在具体的实施方式中，所述免疫原性组合物是裂解病毒疫苗。在具体的实施方式中，所述免疫原性组合物是活减毒病毒疫苗。
在某些实施方式中，本文所描述的试剂盒包含：(a)包含含有本文所描述的重组神经氨酸酶的免疫原性组合物的第一容器；和(b)包含灭活三价流感病毒疫苗、灭活四价流感病毒疫苗或活减毒流感病毒疫苗的第二容器。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含佐剂。
6.实施例1：天然四聚体化结构域和半胱氨酸突变体的使用以生产四聚体重组神经氨酸酶-基疫苗候选
6.1.1简介
三价和四价灭活流感病毒疫苗(TIV、QIV)引起了靶向病毒血球凝集素(HA)免疫显性头部结构域的窄、株特异性免疫应答。当前的疫苗对于引起对流感病毒NA的免疫应答无效(1,2)。在TIV和QIV中缺少NA免疫原性的原因尚未完全理解，但是3种主要因素可能具有贡献：1)疫苗中NA的低/非-标准化的量(1)、2)由于疫苗生产过程期间的变性，TIV和QIV中的NA可能未正确显示出保守构象表位，和3)NA对于HA是免疫亚显性的(immunosubdominant)，特别是当物理连接至HA时(例如，通过疏水性HA和NA跨膜结构域)(3,4)。这种问题的潜在解决方案是用正确折叠的、稳定的四聚体重组蛋白补充当前的TIV或QIV(或者重组流感疫苗-RIV4)(参见参考文献(5)的图5)。存在两种产生重组NA的方式：i)全长NA的重组表达，以及随后的膜提取，和ii)NA的可溶性形式的表达，以及随后从细胞上清液的纯化。不幸地，细胞中全长NA的重组表达以及随后的膜提取(6)导致相对低的得率并且NA的高变茎可能导致随时间的不稳定性。仅头部结构域的表达(其容纳了保护性表位)是优良替代。然而，如果仅表达NA头部，则不形成四聚体，并且所产生的抗原是非保护性的。为了形成稳定的、官能性的和正确折叠的四聚体，四聚体化结构域需要连接至NA头部结构域。在过去，这已进行了尝试并获得了不同程度的成功。迄今为止，已使用了GCN4亮氨酸拉链、细菌四臂四聚体化结构域和人血管扩张刺激磷蛋白(VASP)四聚体化结构域，后者在疫苗研究中提供了优良的结果(1)。然而，GNC4亮氨酸拉链构建体不能很好地表达并且对人蛋白具有同源性，并且VASP结构域来源于人蛋白，从而引起了对于自体免疫的担心。照此，这些构建体可以与GMP生产和人临床试验不相容。
本实施例描述了包含流感病毒神经氨酸酶的球状头部结构域和四聚体化的稳定的、免疫原性重组神经氨酸酶的产生。本实施例显示用这种稳定的、免疫原性重组神经氨酸酶疫苗接种赋予了对于严格的10×LD50攻毒的完全保护。
另外，本实施例描述了半胱氨酸突变体的构建以形成无三聚化结构域的天然三聚体。当NA与其茎结构域一起表达时，它通过两个单体之间的二硫桥键形成二聚体。当NA天然锚定在脂膜中时，这然后导致了四聚体形成(12)。然而，当作为重组蛋白(无跨膜结构域)表达NA时，情况并非如此。在这种情况下，仅形成了二聚体。通过其它半胱氨酸中的突变，可以形成另外的二硫键，其然后可以连接两个二聚体以形成四聚体。
6.1.2材料和方法
重组神经氨酸酶构建体的设计和产生
通过将各自密码子优化的四聚体化结构域克隆到pFastBacDual表达载体中，产生了麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域(MPP)(7)、仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域(SPP)(8)、从来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SEPPALLATA-样MADS结构域转录因子(SMDTF)获得的四聚体化结构域(9)、来自野油菜黄单胞菌(Xhantomonascampestris)的PiLZ结构(10)和胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparus)ACE四聚体化结构域(11)N1融合蛋白。所述载体含有N末端信号肽序列、六组氨酸纯化标签和凝血酶切割位点。然后，将A/密歇根/45/15N1的球状头部结构域直接插入到所述四聚体化结构域之后。
使用了以下序列：
斜体且加粗：信号肽和组氨酸标签
加下划线且加粗：各自的四聚体化结构域
加粗：N1 NA
双下划线且加粗：凝血酶切割位点加两个氨基酸残基
>SMDTF-N1(SEQ ID NO：24)
Figure GDA0003782813240000651
>SPP-N1(SEQ ID NO：25)
Figure GDA0003782813240000652
>PiLZ-N1(SEQ ID NO：26)
Figure GDA0003782813240000653
Figure GDA0003782813240000661
>MPP-N1(SEQ ID NO：27)
Figure GDA0003782813240000662
>ACE-N1(SEQ ID NO：28)
Figure GDA0003782813240000663
将N1半胱氨酸突变体克隆到无四聚体化结构域的表达载体pFastBacDual中，所述N1半胱氨酸突变体在N1茎结构域中的不同位置含有半胱氨酸。然而，所述载体仍含有N末端信号肽、六组氨酸纯化标签以及凝血酶切割位点。构建体N1.2含有一部分茎结构域，其包括位置49处的关键半胱氨酸(C49，N1编号)，其对于形成稳定二聚体/四具体是必不可少的。构建体N1.3在C49具有突变，其将半胱氨酸切换至丙氨酸，从而导致产生了单体蛋白。除了C49，构建体N1.4(T48C)、N1.5(N50C)、N1.6(T48C+N50C)、N1.7(A76C)、N1.8(Q78C)、N1.9(V81C)和N1.11(W61C)在N1茎结构域中的不同位置含有半胱氨酸键。构建体N1.10用作四聚体对照，因为它含有VASP四聚体化结构域(1)。
使用了以下序列：
加下划线：信号肽、六组氨酸标签和凝血酶切割位点
斜体：NA茎
加粗：引入的突变
N1.2(SEQ ID NO：15)
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N1.3(C49A–单体)(SEQ ID NO：16)
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N1.4(T48C)(SEQ ID NO：17)
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N1.5(N50C)(SEQ ID NO：18)
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N1.6(T48C+N50C)(SEQ ID NO：19)
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N1.7(A76C)(SEQ ID NO：20)
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N1.8(Q78C)(SEQ ID NO：21)
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N1.9(V81C)(SEQ ID NO：22)
MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADPHHHHHHSLV 50PRGSPSRIETCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVCSVKLAGN 100SSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGA 150LLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDGI 200NWLTIGISGPDSGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSC 250FTIMTDGPSDGQASYKIFRIEKGKIIKSVEMKAPNYHYEECSCYPDSSEI 300TCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQMGYICSGVFGDNPRPNDKTGSCGPV350SSNGANGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSISSRKGFEMIWDPNGWTGTDNKFS 400IKQDIVGINEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPEENTIWT 450SGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK*
N1.11(W61C)(SEQ ID NO：23)
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在克隆到pFastBacDual表达载体后，按照所建立的规程，将所述构建体转化到感受态大肠杆菌(E.coli)DH10 bacs中并且将分离的DNA用于转染Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))昆虫细胞(13)。然后，使用3％TNM-FH培养基(GeminiBioproducts；3％胎牛血清(Gibco))，将所获得的杆状病毒在Sf9细胞中传代以达到高滴度。在将病毒传代三次后，将所得储液用于感染HighFive细胞以表达重组神经氨酸酶。使用补充有10％L-谷氨酰胺(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的ExpressFive培养基(Gibco)，将所述细胞在27℃，无CO2的情况下感染3天。然后，通过离心从所述细胞分离含有各自可溶性神经氨酸酶的细胞上清液，并且通过使用建立的规程(13,14)纯化蛋白。将蛋白在-80℃储存直至进一步使用。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
为了实施还原性SDS-PAGE，将1ug重组蛋白与含有10％β-巯基乙醇(BME)的4×Laemmli样品缓冲液(Biorad)混合。将样品在98℃加热10分钟，然后加载到SDS梯度凝胶上(4-20％Mini-
Figure GDA0003782813240000681
TGXTM预制蛋白凝胶，Biorad)。将凝胶在200V运行30分钟，然后在RT下振荡的情况下，用考马斯亮蓝快速染色溶液染色1h。除去染色溶液并通过使用蒸馏水使凝胶脱色。
为了实施非还原性SDS-Page，将样品与4×Laemmli样品缓冲液混合，然后以与上述相同的方式进行处理。为了交联重组蛋白，使用BS3交联剂(Sigma-Aldrich)(13)。为此，如生产商手册所述，将蛋白与交联剂混合。然后，以与上述相同的方式处理样品。
NA-星形测定
为了确定不同的重组N1构建体的潜在神经氨酸酶活性，实施了NA-星形测定(Thermo Fisher)。将重组蛋白在所提供的测定缓冲液中稀释至10μg的起始浓度，然后1:2连续稀释。将板在室温下培育15分钟。添加底物，并将板在37℃避光30分钟。后来，将所提供的增强溶液加入孔中，并基于发光活性，使用Synergy Hybrid Reader(BioTek)立即读板。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
为了确定重组N1构建体对一组人神经氨酸酶抗体的结合活性，实施了ELISA。为了确保蛋白正确折叠以及各自表位的完全可接近性，使用Ni-NTA板(Qiagen)进行测定。因此，在4℃用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的50μl/孔的2μg/ml重组蛋白涂覆板过夜。第二天，除去涂覆溶液并在RT下用100μl/孔的3％牛奶/PBS-0.01％吐温(PBST)封闭板1h。除去封闭溶液，并以30ug/ml的起始浓度在1％牛奶/PBST中制备第一抗体稀释液。进行1:3连续稀释并将抗体在RT下在板上培育2h。然后，用PBST清洗板3×，然后在RT下与抗-人IgG第二HRP标记抗体(1:3000，在1％milk/PBST中)培育1h。清洗板，并在RT下添加100μl/孔的o-苯二胺(OPD)显影液10min。通过添加50/孔的3M HCL溶液终止反应，并使用Synergy HybridReader(BioTek)在OD 490nm下读板。
小鼠疫苗接种和攻毒研究
在6-8周大的雌性BALB/c小鼠中测试了重组神经氨酸酶疫苗候选的保护效力(n＝5只每组)。用1:1添加AddaVax(InvivoGen)佐剂的3ug各自重组蛋白(在50μlPBS中)肌肉内接种小鼠。作为阴性对照，将不相关的血球凝集素蛋白(来自B/马来西亚/2506/04)施用于所述组之一，并且作为阳性对照包括含有VASP四聚体化结构域的N1蛋白，其已在体内攻毒研究中显示出保护性。以3周间隔对小鼠接种两次。第二次接种后4周，用25×mLD50(鼠科半致死量)的A/新加坡/GP1908/2015(IVR-180)对小鼠攻毒。在14天内，监测存活及体重减轻。人道地将失去超过25％的它们的初始体重的小鼠安乐死。
6.1.3结果
新型四聚体化结构域
首先，表达并纯化了所述构建体中的3种以及阳性对照(VASP-N1)。当在还原性和非还原性SDS-PAGE上分析时，MPP-N1和SMDTF-N1(例如，具有从来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的SEPPALLATA-样MADS结构域转录因子获得的亮氨酸拉链的N1(9))显示无降解，而SPP-N1显示出轻微降解(图1A和1B)。第二，对所述构建体测试了四聚体的形成。对于MPP-N1和SPP-N1(和阳性对照)观察到了这种情况，其中当交联并在SDS-PAGE上运行时，MPP-N1再次显示无降解或第二条带(图1C)。在该测定中，MPP-N1的表现与VASP-N1相同。此外，成功的构建体必须具有类似于具有已知和功能性四聚体化结构域的N1四聚体(作为对照的VASP-N1)的NA活性。SPP-N1和MPP-N1构建体两者显示出类似的NA活性。尽管MPP-N1的NA活性稍小于SPP-N1和VASP-N1的活性，但它仍是稳健的(图2)。
最终，对于通过人神经氨酸酶抑制活性的N1单克隆抗体的识别，测试了MPP-N1，其属于这种情况(图3)。SPP-N1和MPP-N1两者均进一步进行动物中的效力测试。
在简单的初免-增强方案中，以3-周间隔，向小鼠肌内施用两次3μg的NA(使用AddaVax作为佐剂)。当用10倍半致死剂量的同源病毒对动物攻毒时，两种构建体对于体重减轻和死亡率提供了与VASP-N1构建体相当的完全保护(图4)。3μg剂量/小鼠的原理基于当在小鼠中使用灭活疫苗时，1μg HA的典型剂量。在人中，RIV4中重组HA的剂量比QIV中高三倍，因此选择了重组NA的三倍更高的剂量。
半胱氨酸突变体
表达并测试了方法部分中所述的不同的半胱氨酸突变体。将NA-星形测定中的神经氨酸酶活性用作四聚体形成的代表。将单体(N1.3)、二聚体(N1.2)和VASP-稳定的四聚体(N1.10)用作对照。一种构建体N1.6(T48C+N50C)显示出与四聚体相当的活性(图5)。
6.1.4讨论
筛选均融合至A/密歇根/45/15N1(H1N1)N1(H1N1)的头部结构域的天然四聚体化结构域，包括麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域(MPP)(7)、仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域(SPP)(8)、从来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SEPPALLATA-样MADS结构域转录因子(SMDTF)获得的四聚体化结构域(9)、来自野油菜黄单胞菌(Xhantomonas campestris)的PiLZ结构(10)和胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparus)ACE四聚体化结构域(11)。基于表达、四聚体化、稳定性和免疫原性，对这些构建体进行鉴定。
总之，已鉴别了具有来自麻疹和仙台病毒磷蛋白的四聚体化结构域的两种新型构建体，其支持功能性NA四聚体的形成。这些构建体还在流感病毒攻毒的小鼠模型中提供了作为疫苗的保护。在小鼠模型中，用MPP四聚体化结构域构建体接种赋予了对于严格的10×mLD50攻毒的完全保护。
此外，已鉴别了具有与通过VASP四聚体化结构域稳定的相应重组NA相当的NA活性的神经氨酸酶茎半胱氨酸双重突变体。这种突变体的强活性表明它形成了四聚体并且还可以作为疫苗提供体内保护。
将两种类型的构建体与六组氨酸标签一起表达以辅助纯化，但是可以表达无该标签的构建体形式。无标签蛋白更难以纯化，但是更适合于人临床试验。
6.1.5在实施例1和发明背景中引用的参考文献
1.Wohlbold TJ,Nachbagauer R,Xu H,Tan GS,Hirsh A,Brokstad KA,Cox RJ,Palese P,Krammer F.2015.Vaccination with Adjuvanted Recombinant NeuraminidaseInduces Broad Heterologous,but Not Heterosubtypic,Cross-Protection againstInfluenza Virus Infection in Mice.MBio 6.
2.Krammer F,Fouchier RAM,Eichelberger MC,Webby RJ,Shaw-Saliba K,WanH,Wilson PC,Compans RW,Skountzou I,Monto AS.2018.NAction！How CanNeuraminidase-Based Immunity Contribute to Better Influenza Virus Vaccines？MBio 9.
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10.Li TN,Chin KH,Fung KM,Yang MT,Wang AH,Chou SH.2011.A noveltetrameric PilZ domain structure from xanthomonads.PLoS One 6:e22036.
11.Matthews JB,Lazari O,Davidson AJ,Warren S,Selkirk ME.2006.Atryptophan amphiphilic tetramerization domain-containing acetylcholinesterasefrom the bovine lungworm,Dictyocaulus viviparus.Parasitology 133:381-7.
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6.2实施例2：通过将另外的半胱氨酸引入至NA的茎结构域来稳定甲型流感病毒的神经氨酸酶(NA)四聚体
本实施例证实了其中通过半胱氨酸替换或插入将另外的二硫键引入至病毒NA的茎区来工程化以表达重组神经氨酸酶的重组流感病毒的产生。本实施例证实当在SDS-PAGE上分离病毒蛋白时，半胱氨酸的引入似乎在一定条件下稳定了灭活的纯化的A/波多黎各/08/1934(PR8)H1N1病毒的四聚体神经氨酸酶。该观察结果还对于更临床相关的A/香港/4801/2014(HK14)H3N2株有效。
6.2.1材料和方法
质粒
为了将另外的半胱氨酸引入到NA的茎区，对于A/波多黎各/08/1934使用pDZ N1质粒或者对于A/香港/4801/2014株使用pDZ N2质粒作为模板，通过PCR诱变实施了氨基酸替换或插入。将修饰的NA基因节段克隆到线性化载体中，它是通过pDZ双义(ambisense)质粒的SapI限制性内切酶(New England Biolabs,Inc.)消化所产生的(1)。实施In-Fusion克隆(Takara Bio,Kusatsu,Shiga Prefecture Japan)。将重组产物转化至大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞(Thermo Fisher Scientific)并使用QIAprep SpinMiniprep kit(Qiagen)纯化质粒。通过从先前已描述的pRS PR8 7节段质粒缺失NA盒，产生了用于拯救重组流感病毒的pRS PR8 6节段质粒(2)。简要地，根据生产商的规程，使用NotI(New England Biolabs,Inc.)消化pRS PR8 7节段以特异性除去NA盒，使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs,Inc.)重新连接线性化质粒并转化至MAX Efficiency Stbl2感受态细胞(Invitrogen)。使用QIAprep spin miniprep试剂盒(Qiagen)从后续集落纯化质粒。
序列
野生型(WT)和突变体PR8 N1或者HK14 N2的氨基酸序列如下所示。这些序列包括信号肽。氨基酸替换加粗并加下划线表示。氨基酸插入加粗、斜体并加下划线表示。PR8 N1中的C49和HK14 N2中的C53加双下划线且以斜体表示。
>PR8 N1 WT(SEQ ID NO：6)
Figure GDA0003782813240000721
>PR8 N1 I48C(SEQ ID NO：7)
Figure GDA0003782813240000722
>PR8 N1 N50C(SEQ ID NO：8)
Figure GDA0003782813240000723
>PR8 N1 61insertC(SEQ ID NO：9)
Figure GDA0003782813240000724
Figure GDA0003782813240000731
>PR8 N1 I48C_N50C(SEQ ID NO：10)
Figure GDA0003782813240000732
>PR8 N1 I48C_61insertC(SEQ ID NO：11)
Figure GDA0003782813240000733
>HK14 N2 WT(SEQ ID NO：12)
Figure GDA0003782813240000734
>HK14 N2 L52C(SEQ ID NO：13)
Figure GDA0003782813240000735
>HK14 N2 L52C_E54C(SEQ ID NO：14)
Figure GDA0003782813240000736
Figure GDA0003782813240000741
细胞
将人胚肾293T(HEK 293T)细胞在37℃，5％CO2下维持在含有10％(vol/vol)胎牛血清(FBS)和100单位/mL青霉素/链霉素(PS；Gibco)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM；Gibco)中。将Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞在37℃，5％CO2下，在补充有10％(vol/vol)FBS、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、0.15％(w/vol)碳酸氢钠(Corning)、20mM 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(HEPES,Gibco)和100单位/mL PS的最低必需培养基(MEM；Gibco)中生长。
组流感病毒的拯救
使用TransIT LT1转染试剂(Mirus Bio)，用2.1μg pRS PR8 6节段、0.7μg pDZHA和0.7μg修饰的pDZ NA转染聚D赖氨酸(Sigma-Aldrich)涂覆的HEK 293T细胞的6-孔板的每个孔。将转染的细胞在37℃培育。转染后48小时，一起收集上清液与刮下来的细胞并通过几次注射器冲程简单均质化。将200微升的细胞和上清液混合物注入8-天大的鸡胚(CharlesRiver)的尿囊腔。将注入的卵在33℃培育3天，然后在4℃冷却过夜。随后收集尿囊液并通过低速离心澄清。使用0.5％火鸡红细胞实施HA测定以检查来自澄清的尿囊液的拯救的病毒的存在。将HA阳性尿囊液样品用于斑块-纯化MDCK细胞上的病毒。挑选在MDCK细胞上生长的斑块并在PBS中再混悬并在10-天大的鸡胚中再次进一步扩增。使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)从含有斑块-纯化的病毒的尿囊液提取RNA。使用SuperScriptTM III One-Step RT-PCR系统，使用PlatinumTM Taq DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)和NA特异性引物，实施一步RT-PCR以扩增NA节段的DNA。将DNA凝胶-纯化并通过Sanger测序(Genewiz)进行测序。还在PR8主链(6个基因组节段，除了HA和NA来自PR8外)中拯救了所有H3N2病毒。
流感病毒的灭活和纯化
将流感病毒在37℃在10-天大的鸡胚中生长2天，然后在4℃冷却过夜。收集尿囊液，并通过低速离心澄清。在4℃，在振荡下用0.03％的无甲醇甲醛使澄清的尿囊液中的病毒灭活72h。然后，通过在4℃，使用Beckman SW28转子(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)，在Beckman L7-65超速离心机中以25,000rpm离心2h，通过NTE缓冲液(100mM NaCl、10mMTris-HCl、1mM EDTA，pH 7.4)中的30％的蔗糖层使病毒成粒。在PBS(pH 7.4)中收集颗粒，并使用二辛可宁酸(BCA)测定(Thermo Fisher Scientific)定量蛋白质含量。
免疫印迹
通过与2×NovexTM Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Thermo Fisher Scientific)混合，使灭活的纯化病毒制剂裂解。对于还原条件，包括10×NuPAGETM样品还原剂(ThermoFisher Scientific)。将10μl的总体积中的2微克还原或非还原病毒制剂煮沸5min以使蛋白变性并在10％或8％-16％聚丙烯酰胺凝胶(Bio-rad Laboratories)上在存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下在变形条件下分离。NovexTM Sharp预染蛋白标准品(3.5-260kDa，Thermo Fisher Scientific)或者Color预染蛋白标准品，宽范围标准品(10-250kDa，NewEngland Biolabs,inc.)用作蛋白尺寸标志物。然后，将分离的病毒蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用含有5％(wt/vol)奶粉的PBS封闭膜1h并用含有0.01％(vol/vol)吐温20(PBST)的PBS清洗三次。第一抗体是小鼠抗-N1单克隆抗体4A5(3)(1μg/ml)或者在豚鼠中产生的抗-N2多克隆血清(内部产生；1：2,000稀释)。将第一抗体在含有1％(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释并在4℃，在膜上培育过夜。根据生产商的建议，用PBST清洗膜三次并与在含有1％(wt/vol)BSA的PBS中1:3,000稀释的第二辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(抗-小鼠[GE Healthcare]或者抗-豚鼠[Thermofisher Fisher])培育1h。在用PBST清洗3次后，将显影液(Pierce ECL Western blotting substrate；Thermo FisherScientific)加入至膜，随后将其在ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad Laboratories)中显像。
NA-荧光流感神经氨酸酶测定
为了测量不同突变体病毒的潜在神经氨酸酶活性，实施了荧光-基NA活性测定。将病毒在PBS中稀释至2ng/μl，从而导致25μl PBS中有5ng。将25微升测定缓冲液(33.3mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)和4mM CaCl2，pH 6.5)加入至黑色96-孔板的每个孔中。将25μlPBS中的5纳克病毒加入至每个孔中，重复三次。在测定缓冲液中以200uM的浓度制备2'-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰神经氨酸(MUNANA)(Sigma-Aldrich)底物。将50微升底物加入至每个孔中并在37℃避光培育1小时。通过添加100μl终止溶液(0.1甘氨酸在20％乙醇中的溶液，pH 10.7)终止反应。使用Synergy Hybrid Reader(BioTek)，在激发波长365nm和发射波长465nm读板以测量荧光信号。
6.2.2结果
另外的半胱氨酸向N1神经氨酸酶的茎区中的引入
先前描述茎区中的天然半胱氨酸促进流感病毒NA蛋白的二聚体和四聚体形成以及它们的酶活力(4,5)。IIV的生产方法包括可能的苛刻物理和化学处理(6)，其可能对于NA结构是潜在不利的。为了进一步稳定NA四聚体，通过氨基酸替换或插入将另外的半胱氨酸(二硫键)引入茎区，因为这种方法已显示当在哺乳动物细胞中过表达时，它有利于NA的四聚体形成(5)。作为原理研究的证据，首先基于我们的转座子诱变研究(未公开数据)，在PR8N1中进行诱变，其包括I48C、N50C和I48C_N50C氨基酸替换以及在W61和V62之后的半胱氨酸插入。拯救了重组PR8半胱氨酸突变体病毒并在鸡胚中扩增。使用0.03％甲醛使病毒灭活并通过30％蔗糖层纯化。为了使病毒制剂中NA含量显象，将2μg每种病毒在非还原(NR)或还原(R)条件下在SDS-PAGE上分离。使用N1-特异性小鼠单克隆抗体4A5实施免疫印迹(3)(图6A)。根据非还原条件下蛋白的尺寸，突变体I48C、N50C和I48C_N50C病毒显示出更多的NA三聚体和四聚体形式。突变体W61insertC和V62insertC病毒显示出与WT病毒类似的寡聚类型，它们中大部分是二聚体。为了进一步避免NA的三聚体形式，将I48C与W61insertC结合以产生I48C_W61insertC突变体。似乎I48C_W61insertC突变体具有更多稳定的NA四聚体，但是具有较少NA三聚体(图6B)。
另外的半胱氨酸向N2神经氨酸酶的茎区中的引入
为了向另一种流感病毒亚型和向比PR8更临床相关的株应用相同方法，实施了PR8N1与HK14 N2蛋白的氨基酸序列比对(图7)。HK14 N2还具有对应于PR8 N1的I49C的天然半胱氨酸(C53)。进行了类似的诱变以产生与N1 I48C和I48C_N50C等价的N2突变体。通过氨基酸序列比对，将这些突变体定义为L52C和L52C_E54C(图7)。
在PR8主链(除了HA和NA外，6个节段来自PR8)中拯救了WT和突变体H3N2病毒。使用对于PR8所述的相同方法，使这些病毒灭活并纯化。另外，将病毒制剂在非还原性(NR)和还原性(R)SDS-PAGE上分离，然后使用抗HK14 N2重组蛋白的豚鼠抗血清进行免疫印迹以检测NA含量(图8A)。L52C和L52C_E54C两者显示出比WT病毒更多的四聚体含量。
为了测量H3N2突变体病毒的潜在NA活性，使用了荧光-基NA活性测定。由于所使用的酶标仪对于荧光信号具有饱和限度，因此将病毒在PBS中稀释至2ng/μl，从而导致对NA活性测试了5ng病毒。L52C突变体显示出比WT病毒更高的荧光信号，而不是L52C_E54C突变体(图8B)。然而，这仅在甲醛灭活且通过30％蔗糖纯化的背景中，其可能不必需是NA四聚体破裂的条件。将尽可能接近于工业生产程序来处理病毒制剂以识别在最终IIV产物中具有最高酶活力的H1N1和H3N2半胱氨酸突变体。
6.2.3讨论
识别了在甲醛灭活的纯化病毒制剂中稳定N1和N2两者的四聚体形式的NA茎区中的突变。那些突变体包括N1 I48C、N1 N50C、N1 I48C_N50C和N1I48C_W61insertC；N2 L52C和N2 L52_E54C。H3N2 L52C NA突变体似乎在荧光-基NA活性测定中显示出更高的NA活性。
6.2.4实施例2中引用的参考文献
1.Martinez-Sobrido L,Garcia-Sastre A.2010.Generation of recombinantinfluenza virus from plasmid DNA.J Vis Exp doi:10.3791/2057.
2.Fulton BO,Sun W,Heaton NS,Palese P.2018.The Influenza B VirusHemagglutinin Head Domain Is Less Tolerant to Transposon Mutagenesis thanThat of the Influenza A Virus.J Virol 92.
3.Wohlbold TJ,Nachbagauer R,Xu H,Tan GS,Hirsh A,Brokstad KA,Cox RJ,Palese P,Krammer F.2015.Vaccination with adjuvanted recombinant neuraminidaseinduces broad heterologous,but not heterosubtypic,cross-protection againstinfluenza virus infection in mice.MBio 6:e02556.
4.Basler CF,Garcia-Sastre A,Palese P.1999.Mutation of neuraminidasecysteine residues yields temperature-sensitive influenza viruses.J Virol 73:8095-103.
5.da Silva DV,Nordholm J,Madjo U,Pfeiffer A,Daniels R.2013.Assemblyof subtype 1influenza neuraminidase is driven by both the transmembrane andhead domains.JBiol Chem 288:644-53.
6.Kon TC,Onu A,Berbecila L,Lupulescu E,Ghiorgisor A,Kersten GF,CuiYQ,Amorij JP,Van der Pol L.2016.Influenza Vaccine Manufacturing:Effect ofInactivation,Splitting and Site of Manufacturing.Comparison of InfluenzaVaccine Production Processes.PLoS One 11:e0150700.
6.3实施例3：重组神经氨酸酶-基构建体
本实施例证实了重组NA蛋白在鼠科模型中引起对流感病毒攻毒具有保护性的免疫应答的能力，所示重组NA蛋白包含流感病毒NA的球状头部结构域和麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域。
重组NA蛋白。实施例1中描述了N1-MPP。使用修饰的pFastBacDual表达载体表达重组N2-MPP蛋白，其包含流感病毒A/堪萨斯/14/2017的球状头部结构域和MPP四聚体化结构域。类似地，使用pFastBacDual表达载体表达重组B-MPP蛋白，其包含流感病毒B/科罗拉多/06/2017的球状头部结构域和MPP四聚体化结构域。以下提供了重组N2-MPP和B-MPP蛋白的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO：27中提供了N1-MPP的氨基酸序列。
Figure GDA0003782813240000771
Figure GDA0003782813240000781
Figure GDA0003782813240000791
小鼠疫苗接种和攻毒研究。在6-8周大的雌性BALB/c小鼠或DBA2小鼠中测试了重组神经氨酸酶蛋白的保护效力(n＝5只每组)。将BALB/c小鼠用于H1N1和乙型流感病毒实验并且将DBA2小鼠用于H3N2实验。用3μg所指明的重组NA蛋白(在50μl PBS中)肌肉内接种小鼠。对于用具有AddaVax(InvivoGen)佐剂的重组NA蛋白接种的小鼠，使用了1:1比例的重组NA蛋白和AddaVax。作为阴性对照，将不相关的蛋白施用于所述组之一，并且每当使用阳性对照时，作为阳性对照包括了含有VASP四聚体化结构域的匹配所指明的重组NA蛋白的球状头部的NA蛋白。以3周间隔对小鼠接种两次。在第二次接种后3或4周，用所指明的剂量的所指明的病毒对小鼠攻毒。在一些天内，监测存活及体重减轻。人道地将失去超过25％的它们的初始体重的小鼠安乐死。
SDS-PAGE。一般地，如实施例1所述实施SDS-PAGE。
ELISA。使用所指明的重组蛋白，如实施例1所述一般地实施ELISA。
NA-星形测定。一般地，如实施例1所述实施NA-星形测定。
NA抑制测定。对于NI测定，使用类似于对NA测定所使用的方法的方法，涂覆微量滴定96-孔板(Immulon 4HBX；Thermo Fisher Scientific)。第二天，以1:10的起始浓度，在单独的96-孔板中以1:2依次稀释RDE-处理的人血清样品。所有孔中稀释的血清样品的最终体积为75μl。在PBS中将病毒储液稀释至所确定的EC90浓度。在将病毒(75μl/孔)加入至血清板后，将所述板在室温下培育1.5h。封闭胎球蛋白-涂覆的板，然后在类似于对NA测定所使用的那些条件的条件下清洗。将100-μl体积的病毒/血清混合物转移到清洗的胎球蛋白-涂覆的板上，然后将其在37℃培育2h。用PBS-T清洗板四次，并添加在PBS中稀释至5μg/ml的PNA-HRP(Sigma)(100μl/孔)。对于剩余的NI测定步骤，按照NA测定规程进行。通过将人血清样品的原始吸光值减去背景吸光值确定人血清样品反应性。将所得的值除以来自仅病毒对照孔的平均值，然后乘以因数100以计算NA活性。通过用100％减去NA活性确定NI百分比。使用GraphPad Prism 7，将百分比NI进行非线性回归拟合以确定血清样品的50％抑制浓度(IC50)。参见网址mbio.asm.org/content/8/2/e02281-16.long。
图11A显示了测量来自根据图10以及图10对于组1至6的图例所提供的规程免疫的小鼠的血清与重组N1-VASP的结合的ELISA结果。当以无佐剂、使用佐剂或使用QIV但在不同的腿中施用时，重组N1-MPP蛋白对NA引起优良的免疫应答。如果在与QIV相同的腿中施用，则似乎减弱了抗-NA免疫应答。对于QIV中对H1的应答的情况不是这样。图11B显示了测量来自根据图10以及图10对于组1至6的图例所提供的规程免疫的小鼠的血清与重组H1的结合的ELISA结果。来自接种N1-MPP的小鼠的血清不结合至重组H1。图11C显示评价了来自根据图10以及图10对于组1至6的图例所提供的规程免疫的小鼠的血清抑制含有相匹配的N1 NA的H7N1重组病毒的神经氨酸酶功能的能力。重组N1-MPP诱导了能够抑制神经氨酸酶活性的抗体。
图12A和图12B显示在用25×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)攻毒后，所有用N1-MPP免疫的小鼠分别保护避免体重减轻并具有提高的存活。
图13A和图13B显示在用400×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)攻毒后，所有用N1-MPP免疫的小鼠分别保护避免严重体重减轻并具有提高的存活。
图14A显示了广泛反应性的抗-乙型流感病毒NA单克隆抗体对重组B-MPP的反应性。图14B显示了广泛反应性的抗-甲型流感病毒N2 NA单克隆抗体对重组N2-MPP的反应性。图14C显示了重组N1-MPP(SEQ ID NO：27)、重组N2-MPP(SEQ ID NO：60)和重组B-MPP(SEQID NO：62)在NA-星形测定中的NA活性。重组NA蛋白的NA活性指示蛋白正确折叠。图14D显示了还原性SDS-PAGE中的重组N1-MPP(SEQ ID NO：27)、重组N2-MPP(SEQ ID NO：60)和重组B-MPP(SEQ ID NO：62)。图14E显示了交联SDS-PAGE中的重组N1-MPP(SEQ ID NO：27)、重组N2-MPP(SEQ ID NO：60)和重组B-MPP(SEQ ID NO：62)，其指示了四聚体形成。
图16A和图16B显示在用25×LD50的A/新加坡/GP1908/2015IVR-180(H1N1)攻毒后，所有用N1-MPP免疫的小鼠分别保护避免体重减轻并具有提高的存活。
图16C显示了测量来自根据图15以及图15对于组1至3的图例所提供的规程免疫的小鼠的血清对重组N1-VASP(其包含流感病毒A/密歇根/45/15NA的球状头部结构域和人VASP四聚体化结构域)的结合的ELISA结果。来自N1-MPP接种的小鼠的血清能够结合至N1-VASP。
图16D指示了来自功能性神经氨酸酶抑制测定的结果。来自如图15和图15的图例所述的N1-MPP接种的小鼠的血清能够抑制含有相匹配的N1 NA的H7N1重组病毒的神经氨酸酶功能。
图17A和图17B显示在用25×LD50的A/瑞士/9715293/2013(H3N2，小鼠适应的)攻毒后，所有用N2-MPP免疫的小鼠分别保护避免体重减轻并显示出提高的存活。
图17C显示了测量来自根据图15以及图15对于组1至3的图例所提供的规程免疫的小鼠的血清对重组N2-VASP(其包含流感病毒A/堪萨斯/14/2017NA的球状头部结构域和人VASP四聚体化结构域)的结合的ELISA结果。
图18A和图18B显示在用25×LD50的B/纽约/PV01181/2018攻毒后，所有用B-MPP免疫的小鼠分别保护避免体重减轻并显示出提高的存活。
图18C显示了测量来自根据图15以及图15对于组1至3的图例所提供的规程免疫的小鼠的血清对重组B-VASP(其包含流感病毒B/科罗拉多/06/2017NA的球状头部结构域和人VASP四聚体化结构域)的结合的ELISA结果。
本实施例中所述的结果证实重组N1-MPP蛋白、重组N2-MPP和重组B-MPP构象正确并且在小鼠模型中引起了对用相同亚型的病毒攻毒具有保护性的免疫应答。
7.实施方式
1.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48和50处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48和50的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。
2.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基61处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基61的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。
3.根据实施方式2所述的重组神经氨酸酶，其中所述突变流感病毒神经氨酸酶胞外域还包含N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处半胱氨酸对氨基酸的替换。
4.根据实施方式1至3中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N1或N2亚型。
5.根据实施方式1至3中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
6.根据实施方式1至5中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。
7.根据实施方式1至5中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域。
8.根据实施方式7所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
9.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域和四聚体化结构域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。
10.根据实施方式9所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
11.包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和副粘病毒蛋白的四聚体化结构域的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶缺少流感病毒神经氨酸酶茎结构域、跨膜结构域和胞质结构域。
12.根据实施方式11所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域是副粘病毒磷蛋白的四聚体化结构域。
13.根据实施方式12所述的重组神经氨酸酶，其中所述副粘病毒磷蛋白是尼帕病毒磷蛋白、亨得拉病毒磷蛋白、呼吸道合胞病毒磷蛋白、人副流感病毒(hPIV)磷蛋白、牛副流感病毒磷蛋白、腮腺炎病毒磷蛋白、松湾病毒磷蛋白、加纳病毒磷蛋白、新城疫病毒磷蛋白、犬瘟热病毒磷蛋白或者小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白。
14.根据实施方式12所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域是麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
15.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N2亚型的氨基酸残基52处或者在对应于流感病毒A/香港/4801/2014的氨基酸残基52的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述胞外域来自甲型流感病毒N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
16.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N2亚型的氨基酸残基54处或者在对应于A/香港/4801/2014的氨基酸残基54的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述胞外域来自甲型流感病毒N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
17.根据实施方式15所述的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域还包含在N2亚型的氨基酸残基54处或者在对应于A/香港/4801/2014的氨基酸残基54的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。
18.根据实施方式15至17中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域和胞质结构域。
19.根据实施方式15至17中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶还包含四聚体化结构域。
20.根据实施方式19所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
21.根据实施方式1至20中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶包含信号肽。
22.根据实施方式1至21中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含组氨酸标签、Flag标签或其它纯化标签。
23.重组神经氨酸酶，其包含SEQ ID NO：27、56、58、60或62中所示的氨基酸序列。
24.核酸序列，其包含编码根据实施方式1至23中任一项所述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列。
25.核酸序列，其包含SEQ ID NO：55、57、59或61所示的核苷酸序列。
26.表达载体，其包含根据实施方式24或25所述的核酸序列。
27.宿主细胞，其能够表达根据实施方式24或25所述的核酸序列。
28.重组流感病毒，其包含根据实施方式1至8或者15至20中任一项所述的神经氨酸酶。
29.包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码根据实施方式1至8或者15至20中任一项所述的重组神经氨酸酶的核酸序列的基因节段，从而通过所述重组流感病毒感染的细胞表达所述重组神经氨酸酶。
30.包含神经氨酸酶的重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶包含突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述突变胞外域包含流感病毒神经氨酸酶胞外域，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域在N1亚型的氨基酸残基48或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换。
31.包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码神经氨酸酶的核苷酸序列的基因节段的基因组，从而通过感染的细胞表达所述神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶包含突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述突变胞外域包含流感病毒神经氨酸酶胞外域，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域在N1亚型的氨基酸残基48处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换。
32.重组流感病毒，其包含根据实施方式9至14中任一项所述的重组神经氨酸酶。
33.包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码根据实施方式9至14中任一项所述的重组神经氨酸酶的核酸序列的基因节段，从而通过所述重组流感病毒感染的细胞表达所述重组神经氨酸酶。
34.根据实施方式28、30或32所述的重组流感病毒，其中使所述重组流感病毒灭活。
35.根据实施方式28、30或32所述的重组流感病毒，其中使所述重组流感病毒分裂。
36.根据实施方式28至35中任一项所述的重组流感病毒，其中所述重组流感病毒是重组甲型流感病毒。
37.根据实施方式28至33中任一项所述的重组流感病毒，其中所述重组流感病毒是活减毒流感病毒。
38.根据实施方式37所述的重组流感病毒，其中所述重组甲型流感病毒是H1或H3亚型。
39.免疫原性组合物，其包含根据实施方式1至23中任一项所述的重组神经氨酸酶。
40.根据实施方式39所述的免疫原性组合物，其中所述组合物还包括三价灭活流感疫苗(TIV)、四价灭活流感病毒疫苗(QIV)或者重组流感病毒疫苗。
41.免疫原性组合物，其包含根据实施方式28至38中任一项所述的重组流感病毒。
42.根据实施方式39至41中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物还包括佐剂。
43.对流感病毒免疫的方法，其包括向受试者施用一个剂量的根据实施方式39至42中任一项所述的免疫原性组合物。
44.对流感病毒引起免疫应答的方法，其包括向受试者施用一个剂量的根据实施方式39至42中任一项所述的免疫原性组合物。
45.预防流感病毒疾病的方法，其包括向受试者施用一个剂量的根据实施方式39至42中任一项所述的免疫原性组合物。
46.根据实施方式43至45中任一项所述的方法，其中作为加强向受试者施用另外剂量的免疫原性组合物。
47.根据实施方式43至46中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
48.根据实施方式43至47中任一项所述的方法，其中向所述受试者肌内施用所述免疫原性组合物。
上述内容不应受限于本文所述的具体实施方式的范围。的确，除了本文所描述的那些之外，根据以上描述和附图，本文所提供的抗体和方法的多种修改以及它们的等价形式将对于本领域技术人员变得显而易见。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。
本文所引用的所有参考文献以好象每个单个专利公开或专利或专利申请具体且单独表明出于所有目的以其全部作为参考并入的相同程度以其全部内容并且出于所有目的作为参考并入本文。
序列表
<110> 西奈山伊坎医学院 (ICAHN SCHOOL OF MEDICINE AT MOUNT SINAI)
<120> 重组神经氨酸酶及其用途 (RECOMBINANT NEURAMINIDASE AND USES THEREOF)
<130> 6923-305-228
<140>
<141>
<150> US 62/924,511
<151> 2019-10-22
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 从来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的SEPPALLATA-样MADS结构域转录因子（SMDTF）获得的四聚体化结构域 (Tetramerization domain from SEPPALLATA-like MADSdomain transcription factor from Arabidopsis thaliana (SMDTF))
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85
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域（SPP）(Sendai virus phosphoproteintetramerization domain (SPP))
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Glu Asn Thr Ser Ser Met Lys Glu Met Ala Thr Leu Leu Thr Ser Leu
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Gly Val Ile Gln Ser Ala Gln Glu Phe Glu Ser Ser Arg Asp Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Phe Ala Arg Arg Ala Leu Lys Ser Ala Asn Tyr Ala Glu Met
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Thr Phe Asn Val Cys Gly Leu Ile Leu Ser Ala Glu Lys Ser Ser Ala
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Glu Ser Phe Arg Asp Ile Tyr Lys Arg Phe Ser Glu Tyr Gln Lys Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自野油菜黄单胞菌（Xhantomonas campestris）的PiLZ结构(PiLZ structurefrom Xhantomonas campestris)
<400> 3
Leu Leu Val Gln Arg Met Asp Ala Lys Leu Asp Leu Ile Leu Ala Leu
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Ile Gly Arg Leu Val Arg Gln Ser
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域（MPP）(Measles virus phosphoproteintetramerization domain (MPP))
<400> 4
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Thr Ala Leu Ala Lys Ile His Glu Asp Asn Gln Lys Ile Ile Ser Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胎生网尾线虫（Dictyocaulus viviparus）ACE四聚体化结构域(Dictyocaulusviviparus ACE tetramerization domain)
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Ala Val Ala Asp Val Gly Asp Pro Phe Leu Leu Trp Lys Gln Gln Met
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<213> 人工序列
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Gly Pro Val Tyr Val Asp Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr
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<212> PRT
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Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
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Met Ser Cys Pro Val Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe
145 150 155 160
Glu Ser Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp
165 170 175
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Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Glu Thr Ile Lys Ser Trp Arg Lys Lys
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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325 330 335
Tyr Arg Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser His Ser
340 345 350
Ser Arg His Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu
355 360 365
Thr Asp Ser Lys Phe Ser Val Arg Gln Asp Val Val Ala Met Thr Asp
370 375 380
Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly
385 390 395 400
Leu Asp Cys Met Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg
405 410 415
Pro Lys Glu Lys Thr Ile Trp Thr Ser Ala Ser Ser Ile Ser Phe Cys
420 425 430
Gly Val Asn Ser Asp Thr Val Asp Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu
435 440 445
Leu Pro Phe Ser Ile Asp Lys
450 455
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<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HK14 N2野生型(HK14 N2 Wild-type)
<400> 12
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305 310 315 320
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325 330 335
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<213> 人工序列
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Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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465
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.2
<400> 15
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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340 345 350
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Lys
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<211> 481
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<213> 人工序列
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100 105 110
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130 135 140
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Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.4 (T48C)
<400> 17
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Lys
<210> 18
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.5 (N50C)
<400> 18
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145 150 155 160
Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly
165 170 175
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180 185 190
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys
260 265 270
Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr
275 280 285
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys
290 295 300
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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465 470 475 480
Lys
<210> 19
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.6 (T48C+N50C)
<400> 19
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
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100 105 110
Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
115 120 125
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe
130 135 140
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly
165 170 175
Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
180 185 190
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
195 200 205
Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
210 215 220
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
225 230 235 240
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp
245 250 255
Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys
260 265 270
Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr
275 280 285
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys
290 295 300
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
325 330 335
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser
340 345 350
Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
355 360 365
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu
370 375 380
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser
385 390 395 400
Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
405 410 415
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro
420 425 430
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu Glu Asn Thr Ile
435 440 445
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
450 455 460
Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
465 470 475 480
Lys
<210> 20
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.7 (A76C)
<400> 20
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg Ile Glu Thr Cys Asn Gln Ser
50 55 60
Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln Thr Tyr Val Asn
65 70 75 80
Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Cys Gly Gln Ser Val Val Ser Val Lys
85 90 95
Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly Trp Ala Ile Tyr
100 105 110
Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
115 120 125
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe
130 135 140
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly
165 170 175
Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
180 185 190
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
195 200 205
Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
210 215 220
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
225 230 235 240
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp
245 250 255
Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys
260 265 270
Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr
275 280 285
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys
290 295 300
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
325 330 335
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser
340 345 350
Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
355 360 365
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu
370 375 380
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser
385 390 395 400
Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
405 410 415
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro
420 425 430
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu Glu Asn Thr Ile
435 440 445
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
450 455 460
Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
465 470 475 480
Lys
<210> 21
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.8 (Q78C)
<400> 21
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg Ile Glu Thr Cys Asn Gln Ser
50 55 60
Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln Thr Tyr Val Asn
65 70 75 80
Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Cys Ser Val Val Ser Val Lys
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100 105 110
Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
115 120 125
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe
130 135 140
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly
165 170 175
Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
180 185 190
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
195 200 205
Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
210 215 220
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
225 230 235 240
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp
245 250 255
Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys
260 265 270
Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr
275 280 285
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys
290 295 300
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
325 330 335
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser
340 345 350
Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
355 360 365
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu
370 375 380
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
465 470 475 480
Lys
<210> 22
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.9 (V81C)
<400> 22
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
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Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg Ile Glu Thr Cys Asn Gln Ser
50 55 60
Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln Thr Tyr Val Asn
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145 150 155 160
Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly
165 170 175
Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
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Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
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Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp
245 250 255
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Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr
275 280 285
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290 295 300
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
325 330 335
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser
340 345 350
Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
465 470 475 480
Lys
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<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1.11 (W61C)
<400> 23
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg Ile Glu Thr Cys Asn Gln Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Lys
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Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
115 120 125
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe
130 135 140
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly
165 170 175
Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
180 185 190
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195 200 205
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Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
225 230 235 240
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp
245 250 255
Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys
260 265 270
Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr
275 280 285
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys
290 295 300
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
325 330 335
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser
340 345 350
Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
355 360 365
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu
370 375 380
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser
385 390 395 400
Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
405 410 415
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420 425 430
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu Glu Asn Thr Ile
435 440 445
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
450 455 460
Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
465 470 475 480
Lys
<210> 24
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SMDTF-N1
<400> 24
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Val
35 40 45
Glu Leu Ser Ser Gln Gln Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Glu Arg Tyr Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Ser Thr Lys Glu Leu Glu Ser Leu Glu Arg Gln Leu Asp Ser Ser
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100 105 110
Lys Glu Arg Met Leu Thr Glu Thr Asn Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
115 120 125
Ala Asp Gly Tyr Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg Ser Val
130 135 140
Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly Trp Ala Ile
145 150 155 160
Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe
165 170 175
Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr
180 185 190
Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly
195 200 205
Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile
210 215 220
Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp
225 230 235 240
Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile
245 250 255
Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile
260 265 270
Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln
275 280 285
Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr
290 295 300
Asp Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu
305 310 315 320
Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His
325 330 335
Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val
340 345 350
Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn
355 360 365
Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly
370 375 380
Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser
385 390 395 400
Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn
405 410 415
Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe
420 425 430
Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe
435 440 445
Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser
450 455 460
Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg
465 470 475 480
Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu Glu Asn Thr
485 490 495
Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp
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Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile
515 520 525
Asp Lys
530
<210> 25
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SPP-N1
<400> 25
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Glu
35 40 45
Asn Thr Ser Ser Met Lys Glu Met Ala Thr Leu Leu Thr Ser Leu Gly
50 55 60
Val Ile Gln Ser Ala Gln Glu Phe Glu Ser Ser Arg Asp Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Val Phe Ala Arg Arg Ala Leu Lys Ser Ala Asn Tyr Ala Glu Met Thr
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Phe Asn Val Cys Gly Leu Ile Leu Ser Ala Glu Lys Ser Ser Ala Arg
100 105 110
Lys Val Asp Glu Asn Lys Gln Leu Leu Lys Ile Gln Glu Ser Val Glu
115 120 125
Ser Phe Arg Asp Ile Tyr Lys Arg Phe Ser Glu Tyr Gln Lys Glu Gln
130 135 140
Asn Ser Leu Leu Met Ser Asn Leu Ser Thr Leu His Ile Ile Thr Asp
145 150 155 160
Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg Ser Val Lys Leu Ala Gly
165 170 175
Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp
180 185 190
Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu
195 200 205
Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr
210 215 220
Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp
225 230 235 240
Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro
245 250 255
Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala
260 265 270
Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp
275 280 285
Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr
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Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys
355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile
435 440 445
Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp
450 455 460
Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser Ile Lys Gln
465 470 475 480
Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val
485 490 495
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530 535 540
Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp Lys
545 550 555
<210> 26
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PiLZ-N1
<400> 26
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Leu
35 40 45
Leu Val Gln Arg Met Asp Ala Lys Leu Asp Leu Ile Leu Ala Leu Ile
50 55 60
Gly Arg Leu Val Arg Gln Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser
65 70 75 80
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100 105 110
Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr
180 185 190
Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225 230 235 240
Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe
245 250 255
Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro
260 265 270
Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile
275 280 285
Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg
355 360 365
Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
370 375 380
Asn Lys Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu
420 425 430
Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Phe Thr Ile Asp Lys
465
<210> 27
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MPP-N1
<400> 27
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Gly
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Asp His Tyr Asp Asp Glu Leu Phe Ser Asp Val Gln Asp Ile Lys Thr
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Ile Asn Arg Gln Asn Ile Ser Ile Ser Thr Leu Glu Gly His Leu Ser
100 105 110
Ser Ile Met Ile Ala Ile Pro Gly Leu Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
115 120 125
Pro Ser Arg Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val
130 135 140
Ser Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser
145 150 155 160
Lys Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro
165 170 175
Leu Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp
180 185 190
Lys His Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu
195 200 205
Met Ser Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe
210 215 220
Glu Ser Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp
225 230 235 240
Leu Thr Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu
245 250 255
Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn
260 265 270
Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys
275 280 285
Phe Thr Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys
290 295 300
Ile Phe Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys
305 310 315 320
Ala Pro Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser
325 330 335
Glu Ile Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro
340 345 350
Trp Val Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys
355 360 365
Ser Gly Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser
370 375 380
Cys Gly Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser
385 390 395 400
Phe Lys Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser
405 410 415
Ser Arg Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly
420 425 430
Thr Asp Asn Lys Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu
435 440 445
Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly
450 455 460
Leu Asp Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg
465 470 475 480
Pro Glu Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys
485 490 495
Gly Val Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu
500 505 510
Leu Pro Phe Thr Ile Asp Lys
515
<210> 28
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ACE-N1
<400> 28
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Ala
35 40 45
Val Ala Asp Val Gly Asp Pro Phe Leu Leu Trp Lys Gln Gln Met Asp
50 55 60
Lys Trp Gln Asn Glu Tyr Ile Thr Asp Trp Gln Tyr His Phe Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Lys Lys Tyr Gln Thr Tyr Arg His Leu Asp Ser Asp Ser Cys Ser
85 90 95
Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg Ser Val Lys Leu
100 105 110
Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly Trp Ala Ile Tyr Ser
115 120 125
Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val Ile
130 135 140
Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe Phe
145 150 155 160
Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr Ile
165 170 175
Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly Glu
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Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser Ala
195 200 205
Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser Gly
210 215 220
Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr
225 230 235 240
Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser
245 250 255
Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp Gly
260 265 270
Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys Gly
275 280 285
Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr Glu
290 295 300
Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys Arg
305 310 315 320
Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln Asn
325 330 335
Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp Asn
340 345 350
Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser Asn
355 360 365
Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly Val
370 375 380
Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu Met
385 390 395 400
Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser Ile
405 410 415
Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser
420 425 430
Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro Cys
435 440 445
Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu Glu Asn Thr Ile Trp
450 455 460
Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr Val
465 470 475 480
Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp Lys
485 490 495
<210> 29
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1 PR8
<400> 29
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Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
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Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
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Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys
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Thr Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Leu Ala Ser Tyr Lys Ile
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Pro Phe Ser Ile Asp Lys
450
<210> 30
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 30
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Ile Gly Met Ala Asn Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
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Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
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305 310 315 320
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325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
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465
<210> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1_WSN
<400> 31
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Val Gly Ile Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
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Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
115 120 125
Ser Arg Gly Thr Phe Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Ala Leu Met Ser
130 135 140
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Asn Arg Ile Ile Thr Glu Thr Ile Lys Ser Trp Arg Lys Asn Ile Leu
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Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Thr Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
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Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Leu Ala Ser Tyr Lys Ile Phe
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Asn Ser His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Thr Gly Lys Val
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Ser Phe Asp Gln Asn Leu Asp Tyr Lys Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
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Pro Val Ser Ala Asp Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Lys
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Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Asp Ser Ser Arg
340 345 350
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355 360 365
Ser Arg Phe Ser Met Arg Gln Asp Val Val Ala Ile Thr Asn Arg Ser
370 375 380
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Asn Ser Asp Thr Val Asp Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
435 440 445
Phe Thr Ile Asp Lys
450
<210> 32
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N2_HK14
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (148)..(148)
<223> X 在公共数据库中未知(X is unknown in public database)
<400> 32
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85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys
115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His
130 135 140
Ser Asn Asn Xaa Val Arg Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met
145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile
165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn
195 200 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser Val Val Ser Trp Ser Lys Asp Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ile Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe
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Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala
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275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp
290 295 300
Ile Asn Ile Lys Asp His Ser Ile Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
305 310 315 320
Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ser His
325 330 335
Cys Leu Asp Pro Asn Asn Glu Glu Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp
340 345 350
Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Asn Glu
355 360 365
Thr Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Glu Gly Trp Ser
370 375 380
Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln Thr Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Arg
385 390 395 400
Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser
405 410 415
Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Glu
420 425 430
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450 455 460
Asn Leu Met Pro Ile
465
<210> 33
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N2_ck
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (356)..(356)
<223> X 在公共数据库中未知(X is unknown in public database)
<400> 33
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Thr
1 5 10 15
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
Gly Met Leu Thr Asp Ser Ile Val Ser Trp Ser Lys Asn Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Met Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe
245 250 255
Ile Arg Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Glu Val Arg
275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Leu Tyr
290 295 300
Ile Asn Met Ala Asp Tyr Asn Ile Asp Ser Asn Tyr Val Cys Ser Gly
305 310 315 320
Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Ser Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn
325 330 335
Cys Arg Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Gly Pro Gly Val Lys Gly Trp
340 345 350
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355 360 365
Asp Ser Arg Ala Gly Tyr Glu Thr Phe Arg Val Val Asp Gly Trp Thr
370 375 380
Val Ala Asn Ser Lys Ser Gln Thr Asn Arg Gln Val Ile Val Glu Ser
385 390 395 400
Asp Asn Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Thr
405 410 415
Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Gln
420 425 430
Glu Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Phe Cys Gly
435 440 445
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450 455 460
Asn Phe Met Ser Ile
465
<210> 34
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N3_sw
<400> 34
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Val Val Asn Thr Thr
1 5 10 15
Leu Ser Thr Ile Ala Leu Leu Ile Gly Val Gly Asn Leu Ile Phe Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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115 120 125
Cys Trp Ser Phe Ala Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Gly Thr Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Ser Leu Ile Arg
145 150 155 160
Phe Pro Ile Gly Thr Ala Pro Val Leu Gly Asn Tyr Lys Glu Ile Cys
165 170 175
Ile Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys Phe Asp Gly Lys Glu Trp Met His
180 185 190
Val Cys Met Thr Gly Asn Asp Asn Asp Ala Ser Ala Gln Ile Ile Tyr
195 200 205
Gly Gly Arg Met Thr Asp Ser Ile Lys Ser Trp Arg Lys Asp Ile Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Gln Cys Ile Asp Gly Thr Cys Val Val
225 230 235 240
Ala Val Thr Asp Gly Pro Ala Ala Asn Ser Ala Asp Tyr Arg Val Tyr
245 250 255
Trp Ile Arg Glu Gly Lys Ile Ile Lys Tyr Glu Asn Val Pro Lys Thr
260 265 270
Lys Ile Gln His Leu Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Val Asp Ile Asp Val
275 280 285
Tyr Cys Ile Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Trp Met
290 295 300
Arg Ile Asn Asn Glu Thr Ile Leu Glu Thr Gly Tyr Val Cys Ser Lys
305 310 315 320
Phe His Ser Asp Thr Pro Arg Pro Ala Asp Pro Ser Thr Met Ser Cys
325 330 335
Asp Ser Pro Ser Asn Val Asn Gly Gly Pro Gly Val Lys Gly Phe Gly
340 345 350
Phe Lys Ala Gly Asp Asp Val Trp Leu Gly Arg Thr Val Ser Thr Ser
355 360 365
Gly Arg Ser Gly Phe Glu Ile Ile Lys Val Thr Glu Gly Trp Ile Asn
370 375 380
Ser Pro Asn His Val Lys Ser Ile Thr Gln Thr Leu Val Ser Asn Asn
385 390 395 400
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405 410 415
Phe Gln Pro Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Asn Lys
420 425 430
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435 440 445
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Gly Phe Met Pro Lys
465
<210> 35
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N3_bwt
<400> 35
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1 5 10 15
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Thr Cys Thr Thr Ile Asn Gln Asn Asn Thr Thr Val Val Glu Asn Thr
50 55 60
Tyr Val Asn Asn Thr Thr Ile Ile Thr Lys Gly Thr Asp Leu Lys Thr
65 70 75 80
Pro Ser Tyr Leu Leu Leu Asn Lys Ser Leu Cys Asn Val Glu Gly Trp
85 90 95
Val Val Ile Ala Lys Asp Asn Ala Val Arg Phe Gly Glu Ser Glu Gln
100 105 110
Ile Ile Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Thr Gly Cys
115 120 125
Lys Met Tyr Ala Leu His Gln Gly Thr Thr Ile Arg Asn Lys His Ser
130 135 140
Asn Gly Thr Ile His Asp Arg Thr Ala Phe Arg Gly Leu Ile Ser Thr
145 150 155 160
Pro Leu Gly Thr Pro Pro Thr Val Ser Asn Ser Asp Phe Met Cys Val
165 170 175
Gly Trp Ser Ser Thr Thr Cys His Asp Gly Ile Ala Arg Met Thr Ile
180 185 190
Cys Ile Gln Gly Asn Asn Asp Asn Ala Thr Ala Thr Val Tyr Tyr Asn
195 200 205
Arg Arg Leu Thr Thr Thr Ile Lys Thr Trp Ala Arg Asn Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys His Asn Gly Thr Cys Ala Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Ser Gln Ala Tyr Thr Lys Val Met Tyr
245 250 255
Phe His Lys Gly Leu Val Val Lys Glu Glu Glu Leu Arg Gly Ser Ala
260 265 270
Arg His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly His Asn Gln Lys Val Thr
275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Gln Gly Ala Asn Arg Pro Ile Ile Glu
290 295 300
Ile Asp Met Asn Thr Leu Glu His Thr Ser Arg Tyr Val Cys Thr Gly
305 310 315 320
Ile Leu Thr Asp Thr Ser Arg Pro Gly Asp Lys Ser Ser Gly Asp Cys
325 330 335
Ser Asn Pro Ile Thr Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Phe
340 345 350
Gly Phe Leu Asn Gly Asp Asn Thr Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Pro
355 360 365
Arg Ser Arg Ser Gly Phe Glu Met Leu Lys Ile Pro Asn Ala Gly Thr
370 375 380
Asp Pro Asn Ser Arg Ile Ala Glu Arg Gln Glu Ile Val Asp Asn Asn
385 390 395 400
Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Ile Asp Tyr Trp Asn Asp Asn
405 410 415
Ser Glu Cys Tyr Asn Pro Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg
420 425 430
Pro Glu Glu Ala Lys Tyr Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Leu Ile Ala
435 440 445
Leu Cys Gly Ser Pro Phe Pro Val Gly Pro Gly Ser Phe Pro Asp Gly
450 455 460
Ala Gln Ile Gln Tyr Phe Ser
465 470
<210> 44
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N7_cG
<400> 44
Met Asn Pro Asn Gln Lys Leu Phe Ala Leu Ser Gly Val Ala Ile Ala
1 5 10 15
Leu Ser Val Leu Asn Leu Leu Ile Gly Ile Ser Asn Val Gly Leu Asn
20 25 30
Val Ser Leu His Leu Lys Glu Lys Gly Pro Lys Gln Glu Glu Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Thr Thr Ile Asn Gln Asn Asn Thr Thr Val Val Glu Asn Thr
50 55 60
Tyr Val Asn Asn Thr Thr Ile Ile Thr Lys Gly Thr Asp Leu Lys Thr
65 70 75 80
Pro Ser Tyr Leu Leu Leu Asn Lys Ser Leu Cys Asn Val Glu Gly Trp
85 90 95
Val Val Ile Ala Lys Asp Asn Ala Val Arg Phe Gly Glu Ser Glu Gln
100 105 110
Ile Ile Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Thr Gly Cys
115 120 125
Lys Met Tyr Ala Leu His Gln Gly Thr Thr Ile Arg Asn Lys His Ser
130 135 140
Asn Gly Thr Ile His Asp Arg Thr Ala Phe Arg Gly Leu Ile Ser Thr
145 150 155 160
Pro Leu Gly Thr Pro Pro Thr Val Ser Asn Ser Asp Phe Met Cys Val
165 170 175
Gly Trp Ser Ser Thr Thr Cys His Asp Gly Ile Ala Arg Met Thr Ile
180 185 190
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195 200 205
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Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys His Asn Gly Thr Cys Ala Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Ser Gln Ala Tyr Thr Lys Val Met Tyr
245 250 255
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260 265 270
Arg His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly His Asn Gln Lys Val Thr
275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Gln Gly Ala Asn Arg Pro Ile Ile Glu
290 295 300
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305 310 315 320
Ile Leu Thr Asp Thr Ser Arg Pro Gly Asp Lys Ser Ser Gly Asp Cys
325 330 335
Ser Asn Pro Ile Thr Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Phe
340 345 350
Gly Phe Leu Asn Gly Asp Asn Thr Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Pro
355 360 365
Arg Ser Arg Ser Gly Phe Glu Met Leu Lys Ile Pro Asn Ala Gly Thr
370 375 380
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385 390 395 400
Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Ile Asp Tyr Trp Asn Asp Asn
405 410 415
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420 425 430
Pro Glu Glu Ala Lys Tyr Val Trp Trp Ala Ser Asn Ser Leu Ile Ala
435 440 445
Leu Cys Gly Ser Pro Phe Pro Val Gly Ser Gly Ser Phe Pro Asp Gly
450 455 460
Ala Gln Ile Gln Tyr Phe Ser
465 470
<210> 45
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N8_cN
<400> 45
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Val Thr Ile Gly Ser Ile Ser Leu Gly
1 5 10 15
Leu Val Val Phe Asn Val Leu Leu His Ala Val Ser Ile Ile Leu Thr
20 25 30
Val Leu Ala Leu Gly Lys Ser Glu Asn Asn Gly Ile Cys Asn Gly Thr
35 40 45
Val Val Arg Glu Tyr Asn Glu Thr Val Arg Ile Glu Lys Val Thr Gln
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Tyr Ile Asn Asn Thr Glu Pro Ile Cys Asp Val Lys Gly Phe Ala
85 90 95
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100 105 110
Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Val Glu Cys Arg
115 120 125
Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn
130 135 140
Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Phe Arg Thr Leu Met Ser Val Glu
145 150 155 160
Val Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ala Val Ala
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Pro Thr Asp Val Val Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg Thr
210 215 220
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225 230 235 240
Thr Asp Gly Pro Ala Asn Arg Gln Ala Gln Tyr Arg Ile Tyr Lys Ala
245 250 255
Asn Gln Gly Lys Ile Ile Gly Arg Thr Asp Val Ser Phe Ser Gly Gly
260 265 270
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275 280 285
Val Cys Arg Asp Asn Trp Thr Gly Thr Asn Arg Pro Val Leu Ile Ile
290 295 300
Ser Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Leu Pro
305 310 315 320
Ser Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Thr Gln Phe Ala Gly Ser Cys Thr
325 330 335
Ser Pro Met Gly Asn Gln Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg
340 345 350
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355 360 365
Ser Gly Phe Glu Ile Ile Arg Ile Lys Asn Gly Trp Thr Gln Thr Ser
370 375 380
Lys Glu Gln Ile Arg Arg Gln Val Val Val Asp Asn Ser Asn Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Val Glu Leu Ser Gly Arg Glu
405 410 415
Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Arg Pro Glu
420 425 430
Glu Arg Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly Val
435 440 445
Asp Tyr Glu Ile Ala Asp Trp Ser Trp His Asp Gly Ala Ile Leu Pro
450 455 460
Phe Asp Ile Asp Lys Thr
465 470
<210> 46
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N8_cL
<400> 46
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Leu Val Val Leu Asn Ile Leu Leu His Ile Val Ser Ile Thr Val Thr
20 25 30
Val Leu Val Leu Pro Arg Asn Gly Asn Asn Gly Ser Cys Asn Glu Thr
35 40 45
Val Ile Arg Glu Tyr Asn Glu Thr Val Arg Val Glu Lys Val Thr Gln
50 55 60
Trp His Asn Thr Asn Val Ile Glu Tyr Ile Glu Arg Pro Glu Asn Asp
65 70 75 80
His Phe Met Asn Asn Thr Glu Ala Leu Cys Asp Ala Lys Gly Phe Ala
85 90 95
Pro Phe Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Ile Gly Ser Arg Gly His Val
100 105 110
Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Thr Glu Cys Arg
115 120 125
Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn
130 135 140
Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Val Glu
145 150 155 160
Ile Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ala Val Ala
165 170 175
Trp Ser Ala Thr Ala Cys His Asp Gly Lys Lys Trp Met Thr Ile Gly
180 185 190
Val Thr Gly Pro Asp Ala Lys Ala Val Ala Val Val His Tyr Gly Gly
195 200 205
Ile Pro Thr Asp Val Ile Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Ser Cys Thr Cys Ile Gln Gly Glu Cys Phe Trp Val Met
225 230 235 240
Thr Asp Gly Pro Ala Asn Arg Gln Ala Gln Tyr Arg Ala Phe Lys Ala
245 250 255
Lys Gln Gly Lys Ile Val Gly Gln Ala Glu Ile Ser Phe Asn Gly Gly
260 265 270
His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asn Glu Gly Lys Val Glu Cys
275 280 285
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290 295 300
Ser Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Ile Pro
305 310 315 320
Ser Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Ser Gln Phe Thr Gly Ser Cys Thr
325 330 335
Ser Pro Met Gly Asn Gln Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg
340 345 350
Gln Gly Ser Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser Arg
355 360 365
Ser Gly Phe Glu Ile Leu Lys Val Arg Asn Gly Trp Val Gln Asn Ser
370 375 380
Lys Glu Gln Ile Lys Arg Gln Val Val Val Asp Asn Leu Asn Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Val Glu Leu Thr Lys Arg Asn
405 410 415
Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Lys Pro Glu
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Glu Lys Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly Val
435 440 445
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450 455 460
Phe Asp Ile Asp Lys Met
465 470
<210> 47
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N9_AH13
<400> 47
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Leu Cys Thr Ser Ala Thr Ala Ile Ile
1 5 10 15
Ile Gly Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Ile Ala Asn Leu Gly Leu Asn
20 25 30
Ile Gly Leu His Leu Lys Pro Gly Cys Asn Cys Ser His Ser Gln Pro
35 40 45
Glu Thr Thr Asn Thr Ser Gln Thr Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Asn Glu
50 55 60
Thr Asn Ile Thr Asn Ile Gln Met Glu Glu Arg Thr Ser Arg Asn Phe
65 70 75 80
Asn Asn Leu Thr Lys Gly Leu Cys Thr Ile Asn Ser Trp His Ile Tyr
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Gly Lys Asp Asn Ala Val Arg Ile Gly Glu Ser Ser Asp Val Leu Val
100 105 110
Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Glu Cys Arg Phe Tyr
115 120 125
Ala Leu Ser Gln Gly Thr Thr Ile Arg Gly Lys His Ser Asn Gly Thr
130 135 140
Ile His Asp Arg Ser Gln Tyr Arg Ala Leu Ile Ser Trp Pro Leu Ser
145 150 155 160
Ser Pro Pro Thr Val Tyr Asn Ser Arg Val Glu Cys Ile Gly Trp Ser
165 170 175
Ser Thr Ser Cys His Asp Gly Lys Ser Arg Met Ser Ile Cys Ile Ser
180 185 190
Gly Pro Asn Asn Asn Ala Ser Ala Val Val Trp Tyr Asn Arg Arg Pro
195 200 205
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210 215 220
Ser Glu Cys Val Cys His Asn Gly Val Cys Pro Val Val Phe Thr Asp
225 230 235 240
Gly Ser Ala Thr Gly Pro Ala Asp Thr Arg Ile Tyr Tyr Phe Lys Glu
245 250 255
Gly Lys Ile Leu Lys Trp Glu Ser Leu Thr Gly Thr Ala Lys His Ile
260 265 270
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly Glu Arg Thr Gly Ile Thr Cys Thr Cys
275 280 285
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290 295 300
Val Ala Met Thr His Thr Ser Gln Tyr Ile Cys Ser Pro Val Leu Thr
305 310 315 320
Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ile Gly Lys Cys Asn Asp Pro
325 330 335
Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Leu Asp
340 345 350
Gly Ala Asn Thr Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Thr Ala Ser Arg Ser
355 360 365
Gly Tyr Glu Met Leu Lys Val Pro Asn Ala Leu Thr Asp Asp Arg Ser
370 375 380
Lys Pro Ile Gln Gly Gln Thr Ile Val Leu Asn Ala Asp Trp Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Ser Gly Ser Phe Met Asp Tyr Trp Ala Glu Gly Asp Cys Tyr Arg
405 410 415
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420 425 430
Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Ser Met Cys Ser Ser Thr Glu
435 440 445
Phe Leu Gly Gln Trp Asn Trp Pro Asp Gly Ala Lys Ile Glu Tyr Phe
450 455 460
Leu
465
<210> 48
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N9_ck
<400> 48
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Leu Cys Thr Ser Ala Thr Ala Ile Ile
1 5 10 15
Ile Gly Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Ile Ala Asn Leu Gly Leu Asn
20 25 30
Ile Gly Leu His Leu Lys Pro Gly Cys Asn Cys Ser His Ser Gln Pro
35 40 45
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50 55 60
Thr Asn Ile Thr Asn Ile Gln Met Glu Glu Arg Thr Ser Lys Asn Phe
65 70 75 80
Asn Asn Leu Thr Lys Gly Leu Cys Thr Ile Asn Ser Trp His Ile Tyr
85 90 95
Gly Lys Asp Asn Ala Val Arg Ile Gly Glu Ser Ser Asp Val Leu Val
100 105 110
Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Glu Cys Arg Phe Tyr
115 120 125
Ala Leu Ser Gln Gly Thr Thr Ile Arg Gly Lys His Ser Asn Gly Thr
130 135 140
Ile His Asp Arg Ser Gln Tyr Arg Ala Leu Ile Ser Trp Pro Leu Ser
145 150 155 160
Ser Pro Pro Thr Val Tyr Asn Ser Arg Val Glu Cys Ile Gly Trp Ser
165 170 175
Ser Thr Ser Cys His Asp Gly Lys Ser Arg Met Ser Ile Cys Ile Ser
180 185 190
Gly Pro Asn Asn Asn Ala Ser Ala Val Val Trp Tyr Asn Arg Arg Pro
195 200 205
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210 215 220
Ser Glu Cys Val Cys His Asn Gly Val Cys Pro Val Val Phe Thr Asp
225 230 235 240
Gly Ser Ala Thr Gly Pro Ala Asp Thr Arg Ile Tyr Tyr Phe Lys Glu
245 250 255
Gly Lys Ile Leu Lys Trp Glu Ser Leu Thr Gly Thr Ala Lys His Ile
260 265 270
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly Glu Arg Thr Gly Ile Thr Cys Thr Cys
275 280 285
Arg Asp Asn Trp Gln Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Gln Ile Asp Pro
290 295 300
Val Ala Met Thr His Thr Ser Gln Tyr Ile Cys Ser Pro Val Leu Thr
305 310 315 320
Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ile Gly Lys Cys Asn Asp Pro
325 330 335
Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Leu Asp
340 345 350
Gly Ala Asn Thr Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Thr Ala Ser Arg Ser
355 360 365
Gly Tyr Glu Met Leu Lys Val Pro Asn Ala Leu Thr Asp Asp Arg Ser
370 375 380
Lys Pro Ile Gln Gly Gln Thr Ile Val Leu Asn Ala Asp Trp Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Ser Gly Ser Phe Met Asp Tyr Trp Ala Lys Gly Asp Cys Tyr Arg
405 410 415
Ala Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Asp Lys
420 425 430
Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Ser Met Cys Ser Ser Thr Glu
435 440 445
Phe Leu Gly Gln Trp Asn Trp Pro Asp Gly Ala Lys Ile Glu Tyr Phe
450 455 460
Leu
465
<210> 49
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B_Mal
<400> 49
Met Leu Pro Ser Thr Ile Gln Thr Leu Thr Leu Phe Leu Thr Ser Gly
1 5 10 15
Gly Val Leu Leu Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Leu Pro
20 25 30
Tyr Ser Asp Ile Leu Leu Lys Phe Pro Ser Thr Glu Ile Thr Ala Pro
35 40 45
Thr Met Pro Leu Asp Cys Ala Asn Ala Ser Asn Val Gln Ala Val Asn
50 55 60
Arg Ser Ala Thr Lys Gly Val Thr Leu Leu Leu Pro Glu Pro Glu Trp
65 70 75 80
Thr Tyr Pro Arg Leu Ser Cys Pro Gly Ser Thr Phe Gln Lys Ala Leu
85 90 95
Leu Ile Ser Pro His Arg Phe Gly Glu Thr Lys Gly Asn Ser Ala Pro
100 105 110
Leu Ile Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ala Cys Gly Pro Lys Glu Cys Lys
115 120 125
His Phe Ala Leu Thr His Tyr Ala Ala Gln Pro Gly Gly Tyr Tyr Asn
130 135 140
Gly Thr Arg Gly Asp Arg Asn Lys Leu Arg His Leu Ile Ser Val Lys
145 150 155 160
Leu Gly Lys Ile Pro Thr Val Glu Asn Ser Ile Phe His Met Ala Ala
165 170 175
Trp Ser Gly Ser Ala Cys His Asp Gly Lys Glu Trp Thr Tyr Ile Gly
180 185 190
Val Asp Gly Pro Asp Asn Asn Ala Leu Leu Lys Ile Lys Tyr Gly Glu
195 200 205
Ala Tyr Thr Asp Thr Tyr His Ser Tyr Ala Asn Asn Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Ala Cys Asn Cys Ile Gly Gly Asn Cys Tyr Leu Met Ile
225 230 235 240
Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Val Ser Glu Cys Arg Phe Leu Lys Ile
245 250 255
Arg Glu Gly Arg Ile Ile Lys Glu Ile Phe Pro Thr Gly Arg Ile Lys
260 265 270
His Thr Glu Glu Cys Thr Cys Gly Phe Ala Ser Asn Lys Thr Ile Glu
275 280 285
Cys Ala Cys Arg Asp Asn Ser Tyr Thr Ala Lys Arg Pro Phe Val Lys
290 295 300
Leu Asn Val Glu Thr Asp Thr Ala Glu Ile Arg Leu Met Cys Thr Glu
305 310 315 320
Thr Tyr Leu Asp Thr Pro Arg Pro Asp Asp Gly Ser Ile Thr Gly Pro
325 330 335
Cys Glu Ser Asn Gly Asp Lys Gly Ser Gly Gly Ile Lys Gly Gly Phe
340 345 350
Val His Gln Arg Met Ala Ser Lys Ile Gly Arg Trp Tyr Ser Arg Thr
355 360 365
Met Ser Lys Thr Lys Arg Met Gly Met Gly Leu Tyr Val Lys Tyr Asp
370 375 380
Gly Asp Pro Trp Ala Asp Ser Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Val Met
385 390 395 400
Val Ser Met Glu Glu Pro Gly Trp Tyr Ser Phe Gly Phe Glu Ile Lys
405 410 415
Asp Lys Lys Cys Asp Val Pro Cys Ile Gly Ile Glu Met Val His Asp
420 425 430
Gly Gly Lys Glu Thr Trp His Ser Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Cys Leu
435 440 445
Met Gly Ser Gly Gln Leu Leu Trp Asp Thr Val Thr Gly Val Asn Met
450 455 460
Ala Leu
465
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组氨酸标签(His tag)
<400> 50
His His His His His His
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点(Cleavage site)
<400> 51
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点(Cleavage site)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X is G or S
<400> 52
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Xaa
1 5
<210> 53
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR8 N1 (aa 1-102)
<400> 53
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp
50 55 60
Thr Thr Ser Val Ile Leu Thr Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg
65 70 75 80
Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys
85 90 95
Gly Asp Val Phe Val Ile
100
<210> 54
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HK14 N2 (aa 1-117)
<400> 54
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ile Cys Phe Phe Met Gln Ile Ala Ile Leu Ile Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn
35 40 45
Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu
50 55 60
Ile Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
Pro Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gly Ile Thr Gly
85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp Ile Trp Val Thr
115
<210> 55
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N1-MPP（具有组氨酸标签）(N1-MPP (with his tag))
<400> 55
atgctgctcg tcaaccaatc ccaccagggc ttcaacaagg aacacacttc taagatggtc 60
tccgctatcg tgctctacgt gctgctcgct gccgctgccc actcagcttt cgctgccgac 120
ccacaccacc accaccacca cggcgatcac tacgacgacg aactgttctc cgacgtgcag 180
gacatcaaga ccgctctggc taagatccac gaggacaacc agaagatcat ctccaagctg 240
gaatccctgc tgctgctgaa gggcgaagtc gagtccatca agaagcagat caaccgccag 300
aacatctcca tctccacctt ggagggtcac ctgtcctcca tcatgatcgc tatccctggc 360
ctgggcggcg gctccgtgaa attagcgggc aattcctctc tctgccctgt tagtggatgg 420
gctatataca gtaaagacaa cagtgtaaga atcggttcca agggggatgt gtttgtcata 480
agggaaccat tcatatcatg ctctcccttg gaatgcagaa ccttcttctt gactcaaggg 540
gccttgctaa atgacaaaca ttccaatgga accattaaag acaggagccc ataccgaacc 600
ctaatgagct gtcctattgg tgaagttccc tctccataca actcaagatt tgagtcagtc 660
gcttggtcag caagtgcttg tcatgatggc atcaattggc taacaattgg aatttctggc 720
ccagacagtg gggcagtggc tgtgttaaag tacaatggca taataacaga cactatcaag 780
agttggagga acaatatatt gagaacacaa gagtctgaat gtgcatgtgt aaatggttct 840
tgctttacca taatgaccga tggaccaagt gatggacagg cctcatacaa aatcttcaga 900
atagaaaagg gaaagataat caaatcagtc gaaatgaaag cccctaatta tcactatgag 960
gaatgctcct gttaccctga ttctagtgaa atcacatgtg tgtgcaggga taactggcat 1020
ggctcgaatc gaccgtgggt gtctttcaac cagaatctgg aatatcagat gggatacata 1080
tgcagtgggg ttttcggaga caatccacgc cctaatgata agacaggcag ttgtggtcca 1140
gtatcgtcta atggagcaaa tggagtaaaa ggattttcat tcaaatacgg caatggtgtt 1200
tggataggga gaactaaaag cattagttca agaaaaggtt ttgagatgat ttgggatccg 1260
aatggatgga ctgggactga caataaattc tcaataaagc aagatatcgt aggaataaat 1320
gagtggtcag ggtatagcgg gagttttgtt cagcatccag aactaacagg gctggattgt 1380
ataagacctt gcttctgggt tgaactaata agagggcgac ccgaagagaa cacaatctgg 1440
actagcggga gcagcatatc cttttgtggt gtaaacagtg acactgtggg ttggtcttgg 1500
ccagacggtg ctgagttgcc atttaccatt gacaagtaa 1539
<210> 56
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1-MPP（具有组氨酸标签）(N1-MPP (with his tag))
<400> 56
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Gly
35 40 45
Asp His Tyr Asp Asp Glu Leu Phe Ser Asp Val Gln Asp Ile Lys Thr
50 55 60
Ala Leu Ala Lys Ile His Glu Asp Asn Gln Lys Ile Ile Ser Lys Leu
65 70 75 80
Glu Ser Leu Leu Leu Leu Lys Gly Glu Val Glu Ser Ile Lys Lys Gln
85 90 95
Ile Asn Arg Gln Asn Ile Ser Ile Ser Thr Leu Glu Gly His Leu Ser
100 105 110
Ser Ile Met Ile Ala Ile Pro Gly Leu Gly Gly Gly Ser Val Lys Leu
115 120 125
Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly Trp Ala Ile Tyr Ser
130 135 140
Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val Ile
145 150 155 160
Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe Phe
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr Ile
180 185 190
Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly Glu
195 200 205
Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser Ala
210 215 220
Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser Gly
225 230 235 240
Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr
245 250 255
Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser
260 265 270
Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp Gly
275 280 285
Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys Gly
290 295 300
Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr Glu
305 310 315 320
Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys Arg
325 330 335
Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln Asn
340 345 350
Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp Asn
355 360 365
Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser Asn
370 375 380
Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly Val
385 390 395 400
Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu Met
405 410 415
Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser Ile
420 425 430
Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser
435 440 445
Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro Cys
450 455 460
Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu Glu Asn Thr Ile Trp
465 470 475 480
Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr Val
485 490 495
Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp Lys
500 505 510
<210> 57
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N1-MPP（具有组氨酸标签）(N1-MPP (no his tag))
<400> 57
atgctgctcg tcaaccaatc ccaccagggc ttcaacaagg aacacacttc taagatggtc 60
tccgctatcg tgctctacgt gctgctcgct gccgctgccc actcagcttt cgctgccgac 120
ccaggcgatc actacgacga cgaactgttc tccgacgtgc aggacatcaa gaccgctctg 180
gctaagatcc acgaggacaa ccagaagatc atctccaagc tggaatccct gctgctgctg 240
aagggcgaag tcgagtccat caagaagcag atcaaccgcc agaacatctc catctccacc 300
ttggagggtc acctgtcctc catcatgatc gctatccctg gcctgggcgg cggctccgtg 360
aaattagcgg gcaattcctc tctctgccct gttagtggat gggctatata cagtaaagac 420
aacagtgtaa gaatcggttc caagggggat gtgtttgtca taagggaacc attcatatca 480
tgctctccct tggaatgcag aaccttcttc ttgactcaag gggccttgct aaatgacaaa 540
cattccaatg gaaccattaa agacaggagc ccataccgaa ccctaatgag ctgtcctatt 600
ggtgaagttc cctctccata caactcaaga tttgagtcag tcgcttggtc agcaagtgct 660
tgtcatgatg gcatcaattg gctaacaatt ggaatttctg gcccagacag tggggcagtg 720
gctgtgttaa agtacaatgg cataataaca gacactatca agagttggag gaacaatata 780
ttgagaacac aagagtctga atgtgcatgt gtaaatggtt cttgctttac cataatgacc 840
gatggaccaa gtgatggaca ggcctcatac aaaatcttca gaatagaaaa gggaaagata 900
atcaaatcag tcgaaatgaa agcccctaat tatcactatg aggaatgctc ctgttaccct 960
gattctagtg aaatcacatg tgtgtgcagg gataactggc atggctcgaa tcgaccgtgg 1020
gtgtctttca accagaatct ggaatatcag atgggataca tatgcagtgg ggttttcgga 1080
gacaatccac gccctaatga taagacaggc agttgtggtc cagtatcgtc taatggagca 1140
aatggagtaa aaggattttc attcaaatac ggcaatggtg tttggatagg gagaactaaa 1200
agcattagtt caagaaaagg ttttgagatg atttgggatc cgaatggatg gactgggact 1260
gacaataaat tctcaataaa gcaagatatc gtaggaataa atgagtggtc agggtatagc 1320
gggagttttg ttcagcatcc agaactaaca gggctggatt gtataagacc ttgcttctgg 1380
gttgaactaa taagagggcg acccgaagag aacacaatct ggactagcgg gagcagcata 1440
tccttttgtg gtgtaaacag tgacactgtg ggttggtctt ggccagacgg tgctgagttg 1500
ccatttacca ttgacaagta a 1521
<210> 58
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N1-MPP（无组氨酸标签）N1-MPP (no his tag)
<400> 58
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro Gly Asp His Tyr Asp Asp Glu
35 40 45
Leu Phe Ser Asp Val Gln Asp Ile Lys Thr Ala Leu Ala Lys Ile His
50 55 60
Glu Asp Asn Gln Lys Ile Ile Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu Leu Leu
65 70 75 80
Lys Gly Glu Val Glu Ser Ile Lys Lys Gln Ile Asn Arg Gln Asn Ile
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Ser Ile Ser Thr Leu Glu Gly His Leu Ser Ser Ile Met Ile Ala Ile
100 105 110
Pro Gly Leu Gly Gly Gly Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu
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Cys Pro Val Ser Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg
130 135 140
Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser
145 150 155 160
Cys Ser Pro Leu Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr
180 185 190
Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn
195 200 205
Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly
210 215 220
Ile Asn Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val
225 230 235 240
Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp
245 250 255
Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn
260 265 270
Gly Ser Cys Phe Thr Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala
275 280 285
Ser Tyr Lys Ile Phe Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val
290 295 300
Glu Met Lys Ala Pro Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro
305 310 315 320
Asp Ser Ser Glu Ile Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser
325 330 335
Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly
340 345 350
Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys
355 360 365
Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys
370 375 380
Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys
385 390 395 400
Ser Ile Ser Ser Arg Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly
405 410 415
Trp Thr Gly Thr Asp Asn Lys Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly
420 425 430
Ile Asn Glu Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu
435 440 445
Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile
450 455 460
Arg Gly Arg Pro Glu Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile
465 470 475 480
Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp
485 490 495
Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp Lys
500 505
<210> 59
<211> 1575
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N2-MPP
<400> 59
atgctgctcg tcaaccaatc ccaccagggc ttcaacaagg aacacacttc taagatggtc 60
tccgctatcg tgctctacgt gctgctcgct gccgctgccc actcagcttt cgctgccgac 120
ccacaccacc accaccacca cggcgatcac tacgacgacg aactgttctc cgacgtgcag 180
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gaatccctgc tgctgctgaa gggcgaagtc gagtccatca agaagcagat caaccgccag 300
aacatctcca tctccacctt ggagggtcac ctgtcctcca tcatgatcgc tatccctggc 360
ctgtctctcg tgcccagggg atcaccttct agaatatgcc ccaaaccagc agaatacaga 420
aattggtcaa aaccgcaatg tggcattaca ggatttgcac ctttctctaa ggacaattcg 480
attaggcttt ccgctggtgg ggacatctgg gtgacaagag aaccttatgt gtcatgcgat 540
cctgacaagt gttatcaatt tgcccttgga cagggaacaa caataaacaa cgtgcattca 600
aataacacag cacgtgatag gacccctcat cggactctat tgatgaatga gttgggtgtt 660
cctttccatc tggggaccaa gcaagtgtgc atagcatggt ccagctcaag ttgtcacgat 720
ggaaaagcat ggctgcatgt ttgtataacg ggggatgata aaaatgcaac tgctagtttc 780
atttacaatg ggaggcttgt agatagtgtt gtttcatggt ccaaagatat tctcaggacc 840
caggagtcag aatgcgtttg tatcaatgga acttgtacag tagtaatgac tgatggaaat 900
gctacaggaa aagctgatac taaaatatta ttcattgagg aggggaaaat cgttcatact 960
agcaaattgt caggaagtgc tcagcatgtc gaagagtgct cttgctatcc tcgataccct 1020
ggtgtcagat gtgtctgcag agacaactgg aaaggatcca accggcccat cgtagatata 1080
aacataaagg atcatagcat tgtttccagt tatgtgtgtt caggacttgt tggagacaca 1140
cccagaaaaa ccgacagctc cagcagcagc cattgcttga atcctaacaa tgaaaaaggt 1200
ggtcatggag tgaaaggctg ggcctttgat gatggaaatg acgtgtggat ggggagaaca 1260
atcaacgaga cgtcacgctt agggtatgaa accttcaaag tcgttgaagg ctggtccaac 1320
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ctcatgcata tataa 1575
<210> 60
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N2-MPP
<400> 60
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Gly
35 40 45
Asp His Tyr Asp Asp Glu Leu Phe Ser Asp Val Gln Asp Ile Lys Thr
50 55 60
Ala Leu Ala Lys Ile His Glu Asp Asn Gln Lys Ile Ile Ser Lys Leu
65 70 75 80
Glu Ser Leu Leu Leu Leu Lys Gly Glu Val Glu Ser Ile Lys Lys Gln
85 90 95
Ile Asn Arg Gln Asn Ile Ser Ile Ser Thr Leu Glu Gly His Leu Ser
100 105 110
Ser Ile Met Ile Ala Ile Pro Gly Leu Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
115 120 125
Pro Ser Arg Ile Cys Pro Lys Pro Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys
130 135 140
Pro Gln Cys Gly Ile Thr Gly Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser
145 150 155 160
Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr
165 170 175
Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly
180 185 190
Thr Thr Ile Asn Asn Val His Ser Asn Asn Thr Ala Arg Asp Arg Thr
195 200 205
Pro His Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu
210 215 220
Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp
225 230 235 240
Gly Lys Ala Trp Leu His Val Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala
245 250 255
Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn Gly Arg Leu Val Asp Ser Val Val Ser
260 265 270
Trp Ser Lys Asp Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile
275 280 285
Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met Thr Asp Gly Asn Ala Thr Gly Lys
290 295 300
Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr
325 330 335
Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly
340 345 350
Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp Ile Asn Ile Lys Asp His Ser Ile Val
355 360 365
Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Thr
370 375 380
Asp Ser Ser Ser Ser Ser His Cys Leu Asn Pro Asn Asn Glu Lys Gly
385 390 395 400
Gly His Gly Val Lys Gly Trp Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp
405 410 415
Met Gly Arg Thr Ile Asn Glu Thr Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe
420 425 430
Lys Val Val Glu Gly Trp Ser Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln Ile Asn
435 440 445
Arg Gln Val Ile Val Asp Arg Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile
450 455 460
Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu
465 470 475 480
Leu Ile Arg Gly Arg Lys Glu Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn
485 490 495
Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser
500 505 510
Trp Pro Asp Gly Ala Asp Leu Asn Leu Met His Ile
515 520
<210> 61
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B-MPP
<400> 61
atgctgctcg tcaaccaatc ccaccagggc ttcaacaagg aacacacttc taagatggtc 60
tccgctatcg tgctctacgt gctgctcgct gccgctgccc actcagcttt cgctgccgac 120
ccacaccacc accaccacca cggcgatcac tacgacgacg aactgttctc cgacgtgcag 180
gacatcaaga ccgctctggc taagatccac gaggacaacc agaagatcat ctccaagctg 240
gaatccctgc tgctgctgaa gggcgaagtc gagtccatca agaagcagat caaccgccag 300
aacatctcca tctccacctt ggagggtcac ctgtcctcca tcatgatcgc tatccctggc 360
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agattcggag aaaccaaagg aaactcagct cccttgataa taagggaacc ttttgttgct 540
tgtggaccaa atgaatgcaa acactttgct ttaacccatt atgcagccca accaggggga 600
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ggcaaaatcc caacagtaga gaactccatt ttccacatgg cagcatggag cgggtccgcg 720
tgccatgatg gtaaggaatg gacatatatc ggagttgatg gccctgacaa taatgcattg 780
ctcaaagtaa aatatggaga agcatatact gacacatacc attcctatgc aaacaacatc 840
ctaagaacac aagaaagtgc ctgcaattgc atcgggggaa attgttatct aatgataact 900
gatggctcag cttcaggtgt tagtgaatgc agatttctta agattcgaga gggccgaata 960
ataaaagaaa tatttccaac aggaagagta aaacacactg aggaatgcac atgcggattt 1020
gccagcaata aaaccataga atgtgcctgt agagacaaca ggtacacagc aaaaagacct 1080
tttgtcaaat taaacgtgga gactgataca gcagaaataa ggttgatgtg cacagatacc 1140
tatttggaca cccccagacc aaatgatgga agcataacag gcccttgtga atctgatggg 1200
gacaaaggga gtggaggcat caagggagga tttgttcatc aaagaatgaa atccaagatt 1260
ggaaggtggt actctcgaac gatgtctcaa actgaaagga tggggatggg actgtatgtc 1320
aagtatggtg gagacccatg ggctgacagt gatgccctag cttttagtgg agtaatggtt 1380
tcaatgaaag aacctggttg gtattccttt ggcttcgaaa taaaagataa gaaatgcgat 1440
gtcccctgta ttgggataga gatggtacat gatggtggaa aagagacttg gcactcagca 1500
gcaacagcca tttactgttt aatgggctca ggacagctgc tgtgggacac tgtcacaggt 1560
gttgacatgg ctctgtaa 1578
<210> 62
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B-MPP
<400> 62
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro His His His His His His Gly
35 40 45
Asp His Tyr Asp Asp Glu Leu Phe Ser Asp Val Gln Asp Ile Lys Thr
50 55 60
Ala Leu Ala Lys Ile His Glu Asp Asn Gln Lys Ile Ile Ser Lys Leu
65 70 75 80
Glu Ser Leu Leu Leu Leu Lys Gly Glu Val Glu Ser Ile Lys Lys Gln
85 90 95
Ile Asn Arg Gln Asn Ile Ser Ile Ser Thr Leu Glu Gly His Leu Ser
100 105 110
Ser Ile Met Ile Ala Ile Pro Gly Leu Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
115 120 125
Pro Ser Arg Leu Leu Leu Pro Glu Pro Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Pro Gly Ser Thr Phe Gln Lys Ala Leu Leu Ile Ser Pro His
145 150 155 160
Arg Phe Gly Glu Thr Lys Gly Asn Ser Ala Pro Leu Ile Ile Arg Glu
165 170 175
Pro Phe Val Ala Cys Gly Pro Asn Glu Cys Lys His Phe Ala Leu Thr
180 185 190
His Tyr Ala Ala Gln Pro Gly Gly Tyr Tyr Asn Gly Thr Arg Gly Asp
195 200 205
Arg Asn Lys Leu Arg His Leu Ile Ser Val Lys Leu Gly Lys Ile Pro
210 215 220
Thr Val Glu Asn Ser Ile Phe His Met Ala Ala Trp Ser Gly Ser Ala
225 230 235 240
Cys His Asp Gly Lys Glu Trp Thr Tyr Ile Gly Val Asp Gly Pro Asp
245 250 255
Asn Asn Ala Leu Leu Lys Val Lys Tyr Gly Glu Ala Tyr Thr Asp Thr
260 265 270
Tyr His Ser Tyr Ala Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Ala Cys
275 280 285
Asn Cys Ile Gly Gly Asn Cys Tyr Leu Met Ile Thr Asp Gly Ser Ala
290 295 300
Ser Gly Val Ser Glu Cys Arg Phe Leu Lys Ile Arg Glu Gly Arg Ile
305 310 315 320
Ile Lys Glu Ile Phe Pro Thr Gly Arg Val Lys His Thr Glu Glu Cys
325 330 335
Thr Cys Gly Phe Ala Ser Asn Lys Thr Ile Glu Cys Ala Cys Arg Asp
340 345 350
Asn Arg Tyr Thr Ala Lys Arg Pro Phe Val Lys Leu Asn Val Glu Thr
355 360 365
Asp Thr Ala Glu Ile Arg Leu Met Cys Thr Asp Thr Tyr Leu Asp Thr
370 375 380
Pro Arg Pro Asn Asp Gly Ser Ile Thr Gly Pro Cys Glu Ser Asp Gly
385 390 395 400
Asp Lys Gly Ser Gly Gly Ile Lys Gly Gly Phe Val His Gln Arg Met
405 410 415
Lys Ser Lys Ile Gly Arg Trp Tyr Ser Arg Thr Met Ser Gln Thr Glu
420 425 430
Arg Met Gly Met Gly Leu Tyr Val Lys Tyr Gly Gly Asp Pro Trp Ala
435 440 445
Asp Ser Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Val Met Val Ser Met Lys Glu
450 455 460
Pro Gly Trp Tyr Ser Phe Gly Phe Glu Ile Lys Asp Lys Lys Cys Asp
465 470 475 480
Val Pro Cys Ile Gly Ile Glu Met Val His Asp Gly Gly Lys Glu Thr
485 490 495
Trp His Ser Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Cys Leu Met Gly Ser Gly Gln
500 505 510
Leu Leu Trp Asp Thr Val Thr Gly Val Asp Met Ala Leu
515 520 525
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点(Cleavage site)
<400> 63
Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ser Arg
1 5 10
<210> 64
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒A/堪萨斯/14/2017的NA的球状头部结构域(Globular head domainof NA of influenza virus A/Kansas/14/2017)
<400> 64
Ile Cys Pro Lys Pro Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ile Thr Gly Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu
20 25 30
Ser Ala Gly Gly Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys
35 40 45
Asp Pro Asp Lys Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Ile
50 55 60
Asn Asn Val His Ser Asn Asn Thr Ala Arg Asp Arg Thr Pro His Arg
65 70 75 80
Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys
85 90 95
Gln Val Cys Ile Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala
100 105 110
Trp Leu His Val Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser
115 120 125
Phe Ile Tyr Asn Gly Arg Leu Val Asp Ser Val Val Ser Trp Ser Lys
130 135 140
Asp Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr
145 150 155 160
Cys Thr Val Val Met Thr Asp Gly Asn Ala Thr Gly Lys Ala Asp Thr
165 170 175
Lys Ile Leu Phe Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr Ser Lys Leu
180 185 190
Ser Gly Ser Ala Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr
195 200 205
Pro Gly Val Arg Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg
210 215 220
Pro Ile Val Asp Ile Asn Ile Lys Asp His Ser Ile Val Ser Ser Tyr
225 230 235 240
Val Cys Ser Gly Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Thr Asp Ser Ser
245 250 255
Ser Ser Ser His Cys Leu Asn Pro Asn Asn Glu Lys Gly Gly His Gly
260 265 270
Val Lys Gly Trp Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg
275 280 285
Thr Ile Asn Glu Thr Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Val
290 295 300
Glu Gly Trp Ser Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln Ile Asn Arg Gln Val
305 310 315 320
Ile Val Asp Arg Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val
325 330 335
Glu Gly Lys Ser Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg
340 345 350
Gly Arg Lys Glu Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val
355 360 365
Val Phe Cys Gly Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp
370 375 380
Gly Ala Asp Leu Asn Leu Met His Ile
385 390
<210> 65
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒B/科罗拉多/06/2017的NA的球状头部结构域(Globular head domainof NA of influenza virus B/Colorado/06/2017)
<400> 65
Leu Leu Leu Pro Glu Pro Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Leu Ser Cys Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Phe Gln Lys Ala Leu Leu Ile Ser Pro His Arg Phe Gly
20 25 30
Glu Thr Lys Gly Asn Ser Ala Pro Leu Ile Ile Arg Glu Pro Phe Val
35 40 45
Ala Cys Gly Pro Asn Glu Cys Lys His Phe Ala Leu Thr His Tyr Ala
50 55 60
Ala Gln Pro Gly Gly Tyr Tyr Asn Gly Thr Arg Gly Asp Arg Asn Lys
65 70 75 80
Leu Arg His Leu Ile Ser Val Lys Leu Gly Lys Ile Pro Thr Val Glu
85 90 95
Asn Ser Ile Phe His Met Ala Ala Trp Ser Gly Ser Ala Cys His Asp
100 105 110
Gly Lys Glu Trp Thr Tyr Ile Gly Val Asp Gly Pro Asp Asn Asn Ala
115 120 125
Leu Leu Lys Val Lys Tyr Gly Glu Ala Tyr Thr Asp Thr Tyr His Ser
130 135 140
Tyr Ala Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Ala Cys Asn Cys Ile
145 150 155 160
Gly Gly Asn Cys Tyr Leu Met Ile Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Val
165 170 175
Ser Glu Cys Arg Phe Leu Lys Ile Arg Glu Gly Arg Ile Ile Lys Glu
180 185 190
Ile Phe Pro Thr Gly Arg Val Lys His Thr Glu Glu Cys Thr Cys Gly
195 200 205
Phe Ala Ser Asn Lys Thr Ile Glu Cys Ala Cys Arg Asp Asn Arg Tyr
210 215 220
Thr Ala Lys Arg Pro Phe Val Lys Leu Asn Val Glu Thr Asp Thr Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Leu Met Cys Thr Asp Thr Tyr Leu Asp Thr Pro Arg Pro
245 250 255
Asn Asp Gly Ser Ile Thr Gly Pro Cys Glu Ser Asp Gly Asp Lys Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Ile Lys Gly Gly Phe Val His Gln Arg Met Lys Ser Lys
275 280 285
Ile Gly Arg Trp Tyr Ser Arg Thr Met Ser Gln Thr Glu Arg Met Gly
290 295 300
Met Gly Leu Tyr Val Lys Tyr Gly Gly Asp Pro Trp Ala Asp Ser Asp
305 310 315 320
Ala Leu Ala Phe Ser Gly Val Met Val Ser Met Lys Glu Pro Gly Trp
325 330 335
Tyr Ser Phe Gly Phe Glu Ile Lys Asp Lys Lys Cys Asp Val Pro Cys
340 345 350
Ile Gly Ile Glu Met Val His Asp Gly Gly Lys Glu Thr Trp His Ser
355 360 365
Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Cys Leu Met Gly Ser Gly Gln Leu Leu Trp
370 375 380
Asp Thr Val Thr Gly Val Asp Met Ala Leu
385 390
<210> 66
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒A/密歇根/45/15的NA的球状头部结构域(Globular head domain ofNA of influenza virus A/Michigan/45/15)
<400> 66
Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly Trp
1 5 10 15
Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp
20 25 30
Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu Cys
35 40 45
Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser
50 55 60
Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys
65 70 75 80
Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val
85 90 95
Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr Ile
100 105 110
Gly Ile Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn
115 120 125
Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg
130 135 140
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ile
145 150 155 160
Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Arg
165 170 175
Ile Glu Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro Asn
180 185 190
Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile Thr
195 200 205
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser
210 215 220
Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val
225 230 235 240
Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Pro
245 250 255
Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr
260 265 270
Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg Lys
275 280 285
Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn
290 295 300
Lys Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser Gly
305 310 315 320
Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys
325 330 335
Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu Glu
340 345 350
Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn
355 360 365
Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe
370 375 380
Thr Ile Asp Lys
385

Claims (55)

1.重组神经氨酸酶，其包含流感病毒神经氨酸酶球状头部结构域和四聚体化结构域，其中所述重组神经氨酸酶缺少流感病毒神经氨酸酶茎结构域、跨膜结构域和胞质结构域，并且其中所述四聚体化结构域包含副粘病毒磷蛋白四聚体化结构域。
2.根据权利要求1所述的重组神经氨酸酶，其中所述副粘病毒磷蛋白是尼帕病毒磷蛋白、亨得拉病毒磷蛋白、呼吸道合胞病毒磷蛋白、人副流感病毒(hPIV)磷蛋白、牛副流感病毒磷蛋白、腮腺炎病毒磷蛋白、松湾病毒磷蛋白、加纳病毒磷蛋白、新城疫病毒磷蛋白、犬瘟热病毒磷蛋白或者小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白。
3.根据权利要求1所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
4.根据权利要求3所述的重组神经氨酸酶，其中所述麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的重组神经氨酸酶，其中所述仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含切割位点。
7.根据权利要求6所述的重组神经氨酸酶，其中所述切割位点包含SEQ ID NO：51或63所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含信号肽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含纯化标签。
10.根据权利要求9所述的重组神经氨酸酶，其中所述纯化标签是组氨酸标签或flag标签。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶球状头部是亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型的球状头部或者乙型流感病毒神经氨酸酶球状头部。
12.重组神经氨酸酶，其包含SEQ ID NO：56、58、27、60或62中所示的氨基酸序列。
13.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48和50处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48和50的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。
14.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基61处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基61的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。
15.根据权利要求14所述的重组神经氨酸酶，其中所述突变流感病毒神经氨酸酶胞外域还包含N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处半胱氨酸对氨基酸的替换。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N1或N2亚型。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述流感病毒神经氨酸酶胞外域具有N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜和胞质结构域。
19.根据权利要求13至17中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含四聚体化结构域。
20.根据权利要求19所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
21.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域和四聚体化结构域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/08/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。
22.根据权利要求21所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
23.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N2亚型的氨基酸残基52处或者在对应于流感病毒A/香港/4801/2014的氨基酸残基52的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述胞外域来自甲型流感病毒N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
24.包含突变流感病毒神经氨酸酶胞外域的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域包含在N2亚型的氨基酸残基54处或者在对应于A/香港/4801/2014的氨基酸残基54的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述胞外域来自甲型流感病毒N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9亚型。
25.根据权利要求23所述的重组神经氨酸酶，其中所述突变胞外域还包含在N2亚型的氨基酸残基54处或者在对应于A/香港/4801/2014的氨基酸残基54的氨基酸残基处的半胱氨酸对氨基酸的替换。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶还包含流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域和胞质结构域。
27.根据权利要求23至25中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶还包含四聚体化结构域。
28.根据权利要求27所述的重组神经氨酸酶，其中所述四聚体化结构域包含麻疹病毒磷蛋白四聚体化结构域或者仙台病毒磷蛋白四聚体化结构域。
29.根据权利要求13至28中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶包含信号肽。
30.根据权利要求13至29中任一项所述的重组神经氨酸酶，其中所述重组神经氨酸酶还包含组氨酸标签、Flag标签或其它纯化标签。
31.核酸序列，其包含编码根据权利要求1至30中任一项所述的重组神经氨酸酶的核苷酸序列。
32.核酸序列，其包含SEQ ID NO：55、57、59或61所示的核苷酸序列。
33.表达载体，其包含根据权利要求31或32所述的核酸序列。
34.宿主细胞，其能够表达根据权利要求31或32所述的核酸序列。
35.重组流感病毒，其包含根据权利要求13至30中任一项所述的神经氨酸酶。
36.包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码根据权利要求13至30中任一项所述的重组神经氨酸酶的核酸序列的基因节段，从而通过所述重组流感病毒感染的细胞表达所述重组神经氨酸酶。
37.重组流感病毒，其包含神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶包含突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述突变胞外域包含在N1亚型的氨基酸残基48处或者对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换的流感病毒神经氨酸酶胞外域。
38.包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码神经氨酸酶的核苷酸序列的基因节段的基因组，从而通过感染的细胞表达所述神经氨酸酶，其中所述神经氨酸酶包含突变的流感病毒神经氨酸酶胞外域，其中所述突变胞外域包含流感病毒神经氨酸酶胞外域，所述流感病毒神经氨酸酶胞外域在N1亚型的氨基酸残基48处或者在对应于流感病毒A/波多黎各/8/1934的氨基酸残基48的氨基酸残基处包含半胱氨酸对氨基酸的替换。
39.重组流感病毒，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的重组神经氨酸酶。
40.包含基因组的重组流感病毒，其中所述基因组包含含有编码根据权利要求1至12中任一项所述的重组神经氨酸酶的核酸序列的基因节段，从而通过所述重组流感病毒感染的细胞表达所述重组神经氨酸酶。
41.根据权利要求35、37或39所述的重组流感病毒，其中使所述重组流感病毒灭活。
42.根据权利要求35、37或39所述的重组流感病毒，其中使所述重组流感病毒分裂。
43.根据权利要求35至42中任一项所述的重组流感病毒，其中所述重组流感病毒是重组甲型流感病毒。
44.根据权利要求35至40中任一项所述的重组流感病毒，其中所述重组流感病毒是活减毒流感病毒。
45.根据权利要求43所述的重组流感病毒，其中所述重组甲型流感病毒是H1或H3亚型。
46.免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至30中任一项所述的重组神经氨酸酶。
47.根据权利要求46所述的免疫原性组合物，其中所述组合物还包括三价灭活流感疫苗(TIV)、四价灭活流感病毒疫苗(QIV)或者重组流感病毒疫苗。
48.免疫原性组合物，其包含根据权利要求35至45中任一项所述的重组流感病毒。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物还包括佐剂。
50.对流感病毒免疫的方法，其包括向受试者施用一个剂量的根据权利要求46至49中任一项所述的免疫原性组合物。
51.对流感病毒引起免疫应答的方法，其包括向受试者施用一个剂量的根据权利要求46至49中任一项所述的免疫原性组合物。
52.预防流感病毒疾病的方法，其包括向受试者施用一个剂量的根据权利要求46至49中任一项所述的免疫原性组合物。
53.根据权利要求46至52中任一项所述的方法，其中作为加强向受试者施用另外剂量的免疫原性组合物。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中向所述受试者肌内施用所述免疫原性组合物。
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