KR20200001418A - 재조합 인플루엔자 a 바이러스 h5n1주 및 이를 포함하는 고병원성 인플루엔자 a 바이러스 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신 조성물은 24주까지 고역가(2⁷)를 유지하는 높은 항원성을 갖는 백신으로 년 2회 접종으로 바이러스 감염을 충분히 방어할 수 있는 이점을 제공한다.

Description

재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주 및 이를 포함하는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물{Recombinant Influenza A virus H5N1 strain and Vaccine Composition for Highly Pathogenic Influenza A virus comprising the same}

본 발명은 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주 및 이를 포함하는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다.

조류인플루엔자(Avian Influenza, AI)는 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의하여 발생하는 조류의 급성 전염병이다. 우리나라에서는 2003년 최초발생 이후 2014년부터는 매년 발생하는 추세로써 특히 2016년 11월부터 2017년 6월까지 2개 유형(H5N6, H5N8)의 HPAI가 총 419건이 발생(H5N6 343, H5N8 76)하여 3,800만여 마리를 살처분 하는 등 천문학적 직간접적 경비가 소요되어 사상 최대 규모의 피해를 초래한 바 있다. 이는 국내 양계산업뿐만 아니라 소비 위축으로 인한 관련 산업 전반에 이르기까지 막대한 영향을 미쳤다. 또한 우리나라와 지리적으로 가까운 동남아시아 지역에서 2004년부터 현재까지 HPAI(Highly Pathogenic Avian Influenza)가 지속적으로 발생하고 있으며 특히 태국과 베트남 등에서는 H5N1형의 HPAI에 의해 인체감염 사례도 지속적으로 나타나고 있어 우려가 되는 실정이다. HPAI는 조류인플루엔자 백신을 사용하고 있는 멕시코, 이탈리아 등을 제외한 우리나라 포함 대부분의 국가에서 감염동물의 살처분을 통한 근절정책을 원칙으로 하고 있다. 그러나 우리나라도 HPAI가 상시 발생할 경우 살처분 보상금 등 직간접적 경비, 인체 순환감염에의 우려 및 환경적 문제 등으로 인해 과거와 같이 살처분 정책만을 고집할 수 없게 된다. 따라서 HPAI의 근절 및 재발방지를 위해 노력하는 한편, 살처분만으로 통제할 수 없는 만일의 경우에 대비한 HPAI에 대하여 방어효과를 나타내는 백신주 개발 필요성이 제기되고 있다.

이러한 조류인플루엔자의 원인체(조류인플루엔자 바이러스)는 인플루엔자 A 바이러스이다. 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A Virus)는 오르소믹소 계통 (Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M1, M2), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2 (polymerase subunit A, B1 & B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다. 인플루엔자 A 바이러스는 다양한 종류의 가금과 야생조류와 더불어 사람, 말, 돼지, 기타 포유류에서도 감염이 확인되고 있다.

인플루엔자 A 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌 (Hemagglutinin: HA), 뉴라미니다제 (Neuraminidase: NA)의 종류에 따라 구분되며, 18 HA 아형(야생조류로부터 H1~H16, 박쥐로부터 H17, H18)과 11 NA 아형(야생조류로부터 N1~N9, 박쥐로부터 N10, N11)로 분류할 수 있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다.

대부분의 조류인플루엔자 바이러스가 사람에게 직접 감염되진 않지만, 때로 사람과 조류의 바이러스가 돼지에서 유전자 재조합되어 증폭된 후 사람에게 감염될 수 있는 새로운 항원형의 바이러스가 출현할 수 있는 것으로 알려져 왔다. 조류인플루엔자 바이러스의 다양한 혈청형 중 현재까지 발생한 고병원성 조류인플루엔자(HPAI)는 모두 H5 또는 H7 혈청형에 의한 것으로 나타났다. 1996년 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(HPAIV)인 A/Gs/Gd/1/1996(H5N1)가 중국의 거위농장에서 처음으로 분리되었다. 그 이후, H5 바이러스는 감염된 야생조류와 가금의 AI와 유전적 재조합에 의해 새로운 형태로 진화하였다. 그 예로 다양한 아형의 H5 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(HPAIV)가 야생조류에 의해 확산되면서 H5N2, H5N5, H5N6, H5N8 등으로 발견되었다.

조류인플루엔자 예방백신 중 생(live) 바이러스 백신은 변이가 쉽게 되는 바이러스의 특성상 개발이 거의 불가능한 실정이며, 현재까지 개발된 백신은 크게 사독백신과 유전자재조합 백신으로 구분할 수 있다. 1999년도 이탈리아와 2003년 홍콩에서는 고병원성 조류인플루엔자 발생이 장기화되고 전국으로 확산되면서 조류인플루엔자 예방백신을 선택적 살처분 정책과 병행한 바 있으며, 현재 이탈리아와 홍콩에서는 조류인플루엔자 예방백신의 사용이 고병원성 조류인플루엔자를 방제하는데 효과적이었다는 긍정적인 평가를 받고 있다. 이탈리아 (혈청형 A/H7N1)(I.Capua et al. 2002)와 홍콩 (혈청형 A/H5N1)(Ellis TM. et al., 2006)에서 긍정적인 평가를 받은 백신은 모두 사독백신으로 HA형은 동일하나 NA형이 다른 이종 혈청형의 바이러스 (혈청형 A/H7N3, 혈청형 A/H5N2)로 사독백신을 제조하여 항체검사시 야외 감염과의 구별을 시도한 경우이다. 또한 현재 개발되어 있는 사독백신은 고병원성 조류인플루엔자 감염시 분변으로 배출되는 바이러스의 양을 줄여줄 수는 있지만 완벽하게 질병의 확산을 막지는 못하는 것으로 평가되고 있다.

현재까지 개발된 조류인플루엔자 백신을 여러 국가에서 사용하고 있다. 중국, 베트남, 멕시코, 이집트, 인도네시아 지역 등은 백신 정책을 실시하고 있다. 그러나 조류인플루엔자는 진술한 바와 같이 다양한 혈청형이 존재하며, 혈청형이 다르면 방어도 되지 않기 때문에 2003년 이후 아시아지역에서 유행하고 있는 혈청형에 높은 방어능을 보이면서 백신 제조과정 중 안전성이 높고, 방어능 및 효능이 우수한 고병원성 백신주를 이용한 백신 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 고병원성 조류인플루엔자 바이러스주(원바이러스; A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013)의 HA 유전자의 고병원성 유발 테트라펩타이드(-RRRK-)를 결실시켜 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 제조하고 이를 포함하는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1170113호 대한민국 등록특허 제10-1466326호

Webster RG et al., Microbiol Rev., 56(1), pp152-179 Medina et al., Nat. Rev. Microbiol.., 9, pp590-603 2011 Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000 Kim et al., Emerg. Microbes Infect., 3(e75), 2014 Gu M. et al., Emerg. Infect. Dis. 19, pp2021-2024, 2013 Capua I et al., Avian Pathol., 32, pp47-55, 2003 Capua I and Marangon S, Avian Pahol., 32, pp335-343, 2003 Swayne ED et al., Avian Pathol., 28, pp245-255, 1999

본 발명자들은 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 유전자재조합 백신을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 병원성을 부여하는 HA 내 테트라펩타이드를 결실시켜 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 제조하고 이의 높은 안정성, 면역성 및 백신 효능을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주의 제조방법을 제공한다:

(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA(hemagglutinin) 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 바이러스 H5N1 유래 NA(neuraminidase)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;

(b) 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;

(c) 단계 (a) 및 (b)의 재조합 플라스미드를 패키징 세포(packaging cell)에 트랜스펙션(transfection)하는 단계; 및

(d) 패키징 세포의 배양 상층액으로부터 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1을 수득하는 단계.

본 발명자들은 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 유전자재조합 백신을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 병원성을 부여하는 HA 내 테트라펩타이드(-RRRK-)를 결실시켜 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 제조하고 이의 높은 안정성, 면역성 및 백신 효능을 규명하였다.

본 명세서에서 용어 '조류 인플루엔자'는 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생하는 조류의 급성 전염병을 의미한다. 상기 조류 인플루엔자의 원인체는 인플루엔자 A 바이러스이다.

본 명세서에서 용어 ‘인플루엔자 A 바이러스’는 동물 및 인간에서 발생하는 통상 '독감 (flu)'으로 불리는 고 전염성 호흡기 질환의 원인 바이러스로, 단일 가닥 음성 RNA 절편으로 이루어진 절편화된 게놈을 갖는 외피가 있는 RNA 바이러스를 의미한다.

본 명세서에서 용어 '재조합 인플루엔자 A 바이러스'는 유전자 재조합 기술을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 RNA 단편이 재조합된 바이러스를 의미한다. 예를 들어, 적어도 2개의 공여자 바이러스(고병원성 인플루엔자 A 바이러스 및 저병원성 인플루엔자 A 바이러스)의 RNA 단편의 조합에 의해 생성되는 유전물질을 함유하는 바이러스이다.

본 명세서에서 용어 '고병원성 인플루엔자 A 바이러스'는 (ⅰ) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 6수 이상(75%) 폐사할 경우; (ⅱ) 정맥내 병원성지수(intravenous pathogenicity, IVPI, 10수의 4-8주령 감수성 닭의 정맥내로 바이러스를 접종하고 10일 동안 24시간 간격으로 닭의 임상증상 및 폐사정도를 확인하고 호흡기증상, 침울, 설사, 외피나 벼슬의 청색증, 두부의 부종, 신경증상의 경중을 점수로 기록하여 각 증상의 합에 증상수치를 곱한 총합을 100으로 나눈 지수)가 1.2 이상인 경우; (ⅲ) 닭에서 낮은 병원성인 H5 또는 H7형의 경우 HA 단백질 분절부위의 아미노산 서열이 고병원성과 비슷하다고 판정되는 경우를 의미한다.

본 명세서에서 용어 '저병원성 인플루엔자 A 바이러스'는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스보다, (ⅰ) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 2수 이하(25%) 폐사할 경우; (ⅱ) 정맥내 병원성지수가 1.2 미만인 경우; (ⅲ) 닭에서 낮은 병원성인 H5 또는 H7형의 경우 HA 단백질 분절부위의 아미노산 서열이 고병원성과 상이하다고 판정되는 경우를 의미한다.

본 명세서에서 용어 '인플루엔자 A 바이러스 H5N1'은 인플루엔자 A 바이러스의 표면 단백질인 HA 단백질의 항원 특성이 H5형이고, NA 단백질의 항원 특성이 N1형인 인플루엔자 A 바이러스를 의미한다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 주의 제조방법을 단계별로 설명한다.

단계(a): 고병원성 인플루엔자 A 바이러스의 HA 및 NA를 각각 포함하는 재조합 플라스미드의 제조

먼저, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA(hemagglutinin) 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 바이러스 H5N1 유래 NA(neuraminidase)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.

본 명세서에서 용어 '뉴클레오타이드 서열'은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

상기 단계(a)의 재조합 플라스미드는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1는 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)이다.

인플루엔자 바이러스의 명명법[아형/기원숙주/분리지역/분리순번/분리년도(HA형, NA형)]에 따라, 상기 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)는 인플루엔자 A 바이러스이며 닭으로부터 베트남에서 분리된 2013년에 NCVD(the National Centre for Veterinary Diagnostics)에 의해 435번째로 분리된 바이러스로 H5 및 N1의 항원형을 갖는 것을 의미한다.

상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA는 고병원성 유발 유전자가 결실된 HA이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래의 HA는 HA를 구성하는 HA1의 카르복시 말단 부위에 위치하는 Arg-Arg-Arg-Lys가 결실된 HA이다.

인플루엔자 A 바이러스의 HA는 표면 당단백질로, 인플루엔자 A 바이러스가 세포 내로 도입되는 경우 세포 표면의 특이적 수용체와 상호작용을 하는 역할을 한다. 상기 HA는 HA1 및 HA2로 서브유닛으로 구성되며, 상기 HA1의 카르복실 말단 부위에 인플루엔자 A 바이러스의 고병원성을 유발하는 아미노산 서열(Arg-Arg-Arg-Lys-Lys, RRRKK)이 존재한다.

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 HA1 부위의 고병원성 유발 부위를 결실시켜 고병원성 인플루엔자 A 바이러스를 약독화(attenuation)한다.

상기 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 NA는 인플루엔자 A 바이러스 표면 당단백질로, 감염된 세포로부터 증식된 바이러스가 유리되어 새로운 세포를 감염시킬 수 있도록 숙주세포의 수용체와 바이러스 입자간의 결합을 끊어주는 역할을 한다.

상기 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA를 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.

본 명세서에서 용어 '벡터'는 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커 등을 또한 포함한다. 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터는 v2pHW 벡터이다.

상기 v2pHW 벡터 (대한민국 등록특허 제10-1323582호)는 pHW2000 벡터 (Hoffmann E et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000 23;97(11):6108-13)의 인간 PolⅠ 프로모터를 Vero 세포(원숭이 유래) 유래의 PolⅠ 프로모터로 치환한 벡터이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 플라스미드는 HA를 포함하는 제1재조합 플라스미드 및 NA를 포함하는 제2재조합 플라스미드로 구성된다.

단계(b): 저병원성 인플루엔자 A 바이러스의 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 포함하는 재조합 플라스미드의 제조

다음, 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.

상기 단계(b)의 재조합 플라스미드는 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 저병원성 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34(H1N1)이다.

상기 저병원성 인플루엔자 A 바이러스의 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 플라스미드는 PB2를 포함하는 제3재조합 플라스미드, PB1을 포함하는 제4재조합 플라스미드, PA를 포함하는 제5재조합 플라스미드, NP를 포함하는 제6재조합 플라스미드, M을 포함하는 제7재조합 플라스미드 및 NS를 포함하는 제8재조합 플라스미드로 구성된다.

단계(c): 패키징 세포로의 트랜스펙션

다음, 상기 단계 (a) 및 (b)의 제1 내지 제8재조합 플라스미드를 패키징 세포에 트랜스펙션한다.

본 명세서에서 용어 '패키징 세포'는 비바이러스성 트랜스펙션 방법을 통해 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 패키징 세포는 트랜스펙션된 제1 내지 제8재조합 플라스미드로부터 발현된 HA, NA, PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질이 어셈블리(assembly)된 유전자 재조합의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1을 생산할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 패키징 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 패키징 세포는 293T 세포이다.

단계(d): 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 수득

마지막으로, 상기 패키징 세포의 배양 상층액으로부터 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 수득한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA(hemagglutinin); (ⅱ) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 바이러스 H5N1 유래 NA(neuraminidase); 및 (iii) 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)의, 8개 negative-sense ssRNA의 게놈을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주[rgKA435(H5N1)]를 제공한다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주는 앞서 기재된 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주의 제조방법의 내용과 거의 동일하므로, 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA(hemagglutinin); (ⅱ) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 바이러스 H5N1 유래 NA(neuraminidase); 및 (iii) 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)의, 8개 negative-sense ssRNA의 게놈을 포함하는, 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 주를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 백신 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 '백신 조성물'은 대상(subject)의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미한다. 상기 백신 조성물은 대상(subject)에게 세포성 면역 반응, 예를 들어 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte) 또는 체액성 면역 반응, 예를 들어 항체에 의해 유발되는 향상된 전신적 또는 국소적 면역 반응을 제공한다. 상기 백신 조성물의 대상은 조류, 사람, 개, 말, 돼지, 고양이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주를 포함한다. 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "약제학적 유효량"은 바이러스에 의해 유발되는 질병 또는 병리학적 증상에 대한 예방, 경감 또는 치료적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명인 백신 조성물은 기타 구성성분, 예컨대 안정화제, 부형제, 기타 약학적 허용 화합물 또는 임의의 기타 항원 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 백신은 냉동 건조된 제제 또는 현탁액의 형태로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 백신 생성 분야에 일반적인 것들이다.

본 발명인 백신 조성물의 투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종, 에어로졸 분무, 경구 또는 비강내 용도일 수 있다. 음용수 또는 식용 펠렛으로 투여하는 것도 가능하다. 본 발명의 백신 조성물은 이종 항원 및 사이토카인과 같은 면역 조절 분자를 동일한 재조합체내에서 발현시켜 단일 백신으로 전달할 수도 있으며, 상이한 외래 유전자 또는 면역증강제를 보유하는 2 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 "칵테일"로서 투여할 수 있다. 본 명세서의 용어, "면역증강제(adjuvant)"는 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질(예컨대, alum, 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, LPS, poly IC, poly AU 등)을 의미한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 백신 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 백신 조성물은 24주까지 고역가(2⁷)를 유지하는 높은 항원성을 갖는 백신으로 년 2회 접종으로 바이러스 감염을 충분히 방어할 수 있는 이점을 제공한다.

특히 본 발명의 재조합 인플루엔자 A 바이러스주는 국내에서 아직 발병하거나, 개발된 바 없는 베트남에서 분리된 바이러스로부터 개발된 약독화 백신주로서, 향후 국내 유입가능성이 매우 높은 베트남 유래의 고병원성 인플루엔자 바이러스에 대한 방어가 가능하다. 또한, 본 발명의 백신주는 국내 가금용 HPAI 항원뱅크 구축의 일환으로서 개발된 것으로서, 국내 가금질병 방역에 있어서 매우 중요한 역할을 할 수 있다.

도 1은 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)(좌측) 및 rgKA435(H5N1) 백신주(우측)을 접종한 계태아의 접종 72시간 후 이미지를 나타낸다.
도 2는 rgKA435(H5N1) 백신주를 접종(vaccination) 또는 접종하지 않은 SPF 닭의 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)의 공격접종 후 14일 동안의 생존 백분율을 나타낸다.
도 3은 rgKA435(H5N1) 백신주 접종 후 24주 동안의 HI 역가를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예

실시예 1. H5N1형 약독화 재조합 백신 제조

1-1. 고병원성 H5N1주의 HA 유전자(H5) 제거

A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1) 인플루엔자 바이러스를 RNA extration kit (iNtRON, 한국)를 사용하여 RNA를 추출한다. HA 부분의 분절부위의 고병원성 유전자 (RRRKK)를 제거하기 위해 하기 표 1에 나타낸 중첩되는 프라이머들(overlapping primers)을 사용하여 2개의 분절(HA1 및 HA2)을 Onestep RT(reverse transcription)-PCR kit(Qiagen, USA)를 사용하여 증폭(PCR 조건 : 50℃ 30분, 95℃ 15분, 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 1분/ 35회)한 후 이 두 개의 분절을 이용하여 PCR을 통해 HA 유전자를 증폭 (PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 4분/ 35회)하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다.

프라이머명	염기서열(5’->3’)	서열번호
HA1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGG	9
H26-H5R	CCTCTTGTTTCTCTTTGAGGACTATTTCTGAGCCC	10
H26-H5F	CTCAAAGAGAAACAAGAGGACTATTTGGAGCTATA	11
NS-890R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTG	12

1-2. 고병원성 H5N1주의 유전자 NA(N1) 증폭

상기 실시예 1-1와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 cDNA를 만든 후, NA (N1)를 하기 표 2에 나타낸 프라이머들을 이용하여 N1의 전체 서열(full sequence)을 PCR을 통해 증폭 (PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 2분/ 35회) 하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다.

프라이머명	염기서열(5'->3')	서열번호
N1-1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGAG	13
N1-1413R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGAGT	14

1-3. 고병원성 인플루엔자 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1) 주의 벡터 클로닝

상기 실시예 1-1 및 1-2에서 PCR를 이용하여 증폭한 유전자 HA 및 NA를 v2pHW vector(KCDC)에 In-Fusion HD Cloning kit (Takara, 미국)로 접합시킨 후, 대장균 (Escherichia coli, stella competent cells)를 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환 대장균을 LB broth (바이오 사이언스, 한국)를 이용하여 37℃ 회전배양기(shaking incubator)에 18시간 동안 배양하였다. 형질전환 대장균의 배양물로부터 Plasmid DNA purification Kit (iNtRON, 한국)를 이용하여 플라스미드를 정제하여 HA 및 NA 유전자를 얻었다.

1-4. 저병원성 인프루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 주의 벡터 클로닝

A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스 (ATCC VR-95, 미국)에서 상기 실시예 1-1 내지 1-3와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 PB2, PB1, PA, NP, M, NS 유전자들을 하기 표 3에 나타난 특정 프라이머들을 이용하여 PCR을 통해 증폭(PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 4분/ 35회)한 후, v2pHW vector(대한민국 등록특허 제10-1323582호)에 In-Fusion HD Cloning kit (Takara, 미국)로 접합시켰다. 접합된 v2pHW vector를 대장균 (E. coli, stella competent cells)에 형질전환한 후, LB broth (바이오사이언스, 한국)를 이용하여 37℃ 회전배양기 (shaking incubator)에 18시간 배양하였다. 형질전환 대장균의 배양물로부터 Plasmid DNA purification Kit (iNtRON, 한국)를 이용하여 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 유전자를 얻었다.

프라이머명	염기서열(5'->3')	서열번호
Phw-PB2-1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGTC	15
Phw-PB2-2341R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTCG	16
Phw-PB1-1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGCA	17
Phw-PB1-2341R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGCAT	18
Phw-PA-1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGTA	19
Phw-PA-2233R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTAC	20
Phw-NP-1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGT	21
Phw-NP-1565R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTA	22
Phw-M-1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGTA	23
Phw-M-1027R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTAG	24
Phw-NS-1F	TCCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGT	25
Phw-NS-890R	GGGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTG	26

1-5. 약독화 재조합 H5N1 혈청형 바이러스주 제조

293T 세포(ATCC CRL-3216)를 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 DMEM(1x), 10% FBS, 1% Anti-Anti(Antibiotic-Antimycotic, 100x) 로 배양하였다. 상기 실시예 1-3 및 1-4에서 수득한 각각의 플라스미드(plasmid) 0.5 μl를 리포펙타민 LTX and Plus Reagent (Lipofectamin LTX and Plus Reagent, Invitrogen, 미국)를 이용하여 293T 세포에 트랜스펙션하였다. 48시간 후, 상층액을 10일령 된 특정병원체부재 (SPF, specific pathogen free) 부화란에 접종(10^5.0 EID₅₀/0.1ml) 하여 약독화 된 재조합 H5N1 혈청형 바이러스 주(이하, rgKA435(H5N1)로 명명함)를 제조하여 수득하였다(기탁기관: Animal and Plant Quarantine Agency, 기탁일 2017년 12월 1일).

실시예 2. 사독백신의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 rgKA435(H5N1)주 (기탁기관: Korea Veterinary Culture Collection, KVCC, 기탁일: 2017년 11월 29일, 기탁번호: VR1700107)를 10일령의 SPF 부화란 100개에 접종한 후 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 48시간 동안 배양된 부화란을 4℃에서 6시간 냉장 보관한 후, 요수(allantoic fluid, 10^8.5 EID₅₀/0.1ml)를 수득하였다. 수득한 요수를 1/10로 농축한 후, 농축된 바이러스를 0.01% 포르말린(formalin)으로 4℃에서 12시간 동안 불활화 시켰다.

실험예

실험예1. rgKA435(H5N1)의 HA 분절부위의 고병원성 유전자 제거 여부 검증

상기 실시예 1에서 수득한 rgKA435(H5N1)의 HA 유전자 제거 여부를 검증하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

1-1. 유전자 분석에 의한 검증

고병원성 H5N1 조류인플루엔자바이러스는 HA 단백질 분절부위에 고병원성 유전자 (RRRKK: AGA AGA AGA AAA AAG)가 있어 가금에서 치명적인 질병을 유발하므로, 상기 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스의 백신을 개발하기 위해서는 HA 단백질 분절부위에 RRRKK가 제거된 약독화된 백신주를 개발하여야 한다.

rgKA435(H5N1) 백신주로부터 상기 실시예 1-1의 실험방법에 HA 유전자를 PCR로 증폭하여 vpHW2000 벡터에 클로닝하고, Briddye Terminaor v3.1 Cycle Sequencing Kit((주)바이오닉스, 한국) 및 Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 구하였다. CLC Main workbench(미국)을 이용하여 고병원성 유전자 제거 여부를 확인하였다.

실험결과, 하기 표 4에 나타난 바와 같이 rgKA435 백신주의 고병원성 유전자인 RRRK가 제거되었음을 확인할 수 있었다.

바이러스주	염기서열
A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)	AGAAATAGTCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAGAGGA
rg_KA435(H5N1)	AGAAATAGTCCTCAAAGAGAG------------AGAGGA

1-2. 10일령의 부화란에 접종하여 고병원성 여부 검증

고병원성 유전자 RRRK를 가지고 있는 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)를 10일령의 부화란에 접종하면 계태아가 사망함으로써 등불로 검란 시 혈관이 보이지 않는다.

A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1) 및 상기 실시예 1에서 수득한 상기 약독화된 rgKA435(H5N1) 백신주를 10일령의 부화란에 접종하여 72시간 후에 등불을 이용하여 계태아의 상태를 검란하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)를 접종한 부화란은 계태아의 혈관이 거의 보이지 않은 반면, 약독화된 rgKA435(H5N1) 백신주를 접종한 부화란은 계태아가 죽지 않아 선명한 혈관을 확인할 수 있었다.

실험예 2. rgKA435 (H5N1) 재조합 백신주의 안전성 및 면역성 검증

상기 실시예 2에서 수득한 재조합 백신의 안전성 및 H5N1 혈청형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 면역성을 확인하기 위하여 SPF 닭을 사용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

SPF 닭은 실제 목적동물로 사용하기 위해 개발된 백신이므로 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 백신 효능 검정에 사용하였다. 10수의 6주령 SPF 닭의 이두근(biceps muscle)에 rgKA435(H5N1) 조류인플루엔자 백신 항원 1 ml(500 μl/dose, 10^9.0 EID₅₀/0.1ml)을 접종하였다. 접종 2주 후에 혈청을 수득하여 항체역가를 혈구응집억제반응(HI, hemagglutination inhibition)에 의해 검증하였다. 대조군으로 사용한 10마리의 SPF 닭은 생리식염수를 접종하여 효능 비교하였다.

그 결과, 백신을 접종 받은 10마리의 SPF닭 모두는 혈구응집억제역가(HI) 역가가 2⁷ 이상을 나타냈으며, 사망, 체중 감소 등의 특별한 임상증상을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다(표 5).

No.	백신접종 개체		대조군
	HI titer (log2)	폐사수/접종수	HI titer (log2)	폐사수/접종수
1	7	0/10	<1	0/10
2	8		<1
3	7		<1
4	9		<1
5	7		<1
6	8		<1
7	9		<1
8	10		<1
9	7		<1
10	9		<1

실험예 3. rgKA435(H5N1) 조류인플루엔자 사독 백신주의 방어 효능 검증

상기 실시예 2에서 수득한 rgKA435(H5N1) 사독 백신주(백신 항원)의 방어 효능을 검증하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

3-1. H5N1 공격접종

10마리의 6주령의 SPF 닭의 오른쪽 다리 이두근에 rgKA435(H5N1) 조류인플루엔자 백신 항원을 500 μl씩 접종(10^9.0 EID₅₀/0.1ml) 하였다. 접종 3주 후, 백신을 접종하지 않은 10마리의 대조군과 함께 고병원성 인플루엔자인 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1) 바이러스 10⁶ Egg Infectious dose(EID₅₀)을 코로 공격 접종하여 14일 동안 생존 여부를 판정하였다.

3-2. 바이러스 배출 역가 검증

상기 실험에 3-1의 실험방법에 따라 10⁶ Egg Infectious dose(EID50)를 코로 접종 후 3, 5, 7, 10 및 14일째에 실험군 및 대조군으로부터 면봉을 이용하여 인후두부 및 총배설강에서 스왑을 실시하여 공격접종 후 배출되는 바이러스 역가(log₁₀TCID₅₀/0.1 ml)를 측정하였다.

군	스왑부위	바이러스 배출 마리수/생존 마리수. (바이러스 역가, log10TCID50/0.1 ml, 평균±표준편차)					생존수/총수
		3일후	5일후	7일후	10일후	14일후
백신접종	인후두	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	10/10
	총배설강	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10
대조군	인후두	1/1 (2.3)	폐사	폐사	폐사	폐사	0/10
	총배설강	1/1 (4.3)	폐사	폐사	폐사	폐사

그 결과, rgKA435(H5N1) 백신 항원(사독 백신)을 접종 받은 실험군은 인후두 및 총배설강 스왑 샘플에서 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스가 검출되지 않은 반면에, 백신 항원을 접종하지 않은 대조군은 인후두 및 총배설강 스왑샘플에서 높은 역가의 바이러스가 검출되었음을 확인할 수 있었다(표 6).

따라서, 본 발명의 rgKA435(H5N1) 사독 백신은 H5N1형의 고병원성 인플루엔자 바이러스에 대하여 우수한 방어능을 나타냄을 확인하였다.

3-3. 백신주의 면역원성 검증

SPF 닭은 실제 목적동물로 사용하기 위해 개발된 백신이므로 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 백신 효능 검정에 사용하였다. 10수의 6주령 SPF 닭의 이두근(biceps muscle)에 rgKA435(H5N1) 조류인플루엔자 백신 항원 1 ml(500 μl/dose, (10^9.0 EID₅₀/0.1ml) 을 접종하였다. 접종 24주 동안 혈청을 수득하여 항체역가 변화를 혈구응집억제반응(HI, hemagglutination inhibition)에 의해 검증하였다.

국제수역사무국(world organization for animal health, OIE)는 가금에서 HI 역가 2⁷ 이상이면, 폐사방어는 물론 바이러스 배출도 감소로 기준을 설정하고 있다. 도 4의 실험결과와 같이, 항체는 백신 접종 후 24주까지 2⁷ 이상의 고역가가 유지됨을 확인하였다(표 7 및 도 3). 표 7의 'wpv'는 'weeks post vaccination'을 의미한다.

-	4 wpv	8 wpv	12 wpv	16 wpv	20 wpv	24 wpv
역가	9.5±1.7	10.3±1.5	9.5±2.1	8.5±1.5	8.0±2.1	8.0±2.3

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Recombinant Influenza A virus H5N1 strain and Vaccine Composition for Highly Pathogenic Influenza A virus comprising the same <130> PN180122 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1763 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 1 agcaaaagca ggggttcatt ctgtcaaaat ggagaaaata gttcttctct ttgcaacaat 60 cagccttgtc aaaagcgatc atatttgcat tggttatcat gcaaataact cgacagagca 120 ggttgacaca ataatggaaa agaacgttac tgttacacat gcccaagaca tactggaaaa 180 gacacacaac gggaagctct gcgatctaaa tggagtgaag cctctgattt taaaagattg 240 tagtgtagca ggatggctcc tcggaaatcc attgtgtgac gaattcacca atgtgccaga 300 atggtcttac atagtagaga aggccaatcc agccaatgac ctctgttacc cagggaattt 360 caacgattat gaagaattga aacacctatt gagcaggata aaccattttg agaaaataca 420 gatcatcccc aaagattctt ggtcagatca tgaagcctca ttgggggtga gcgcagcatg 480 ttcataccag ggaaattcct ccttcttcag aaatgtggtg tggcttatca aaaaggacaa 540 tgcataccca acaataaaga aaggctacaa taataccaac cgagaagatc tcttgatact 600 gtgggggatc caccatccta atgatgaggc agagcagaca aggctctacc aaaatccaac 660 tacctatatt tccattggga cttcaacact aaaccagaga ttggtaccaa aaatagccac 720 tagatccaaa ataaacggac aaagcggcag gatagatttc ttctggacaa ttttaaaacc 780 gaatgacgca atccacttcg agagtaatgg aaatttcatt gctccagaat atgcatacaa 840 aattgtcaag aagggagact ccacaatcat gagaagtgaa gtggaatatg gtaactgcaa 900 caccaggtgt cagactccaa taggagcgat aaactctagt atgccattcc acaacataca 960 tcctctcacc atcggagaat gtcccaaata tgtgaaatca aacaaattag tccttgcaac 1020 tgggctcaga aatagtcctc aaagagaaga ggactgtttg gagctatagc tggttttata 1080 gagggaggat ggcagggaat ggtagatggt tggtttgttt gtctccgcga ccaagagcag 1140 gggagtggtt acgctgcaga caaagaatct actcaaaagg cgatagacgg agtcaccaat 1200 aaggtcaatt cgatcattga caaaatgaac acccagtttg aggctgtagg aagggaattt 1260 aataacttag agaggagaat agaaaattta aacaagaaga tggaagacgg attcctagat 1320 gtctggactt ataatgctga acttctggtt ctcatggaga atgagagaac tctagacttc 1380 catgattcaa atgtcaagaa cctttacgat aaggtccgac tacagcttaa ggataatgca 1440 aaagagctgg gaaacggttg tttcgagttc tatcacaaat gtaataatga atgtatggaa 1500 agtgtaagaa acgggacgta tgactacccg cattatgcag aagaagcaag attaaaaaga 1560 gaggaaataa gtggagtaaa actggaatca ataggaatct accaaatact gtcaatttat 1620 tcaacagtgg cgagttccct agtgctggca atcatgatgg ctggtctatc tttatggatg 1680 tgttccaacg ggtcgttaca gtgcagaatt tgcatttaag tttgtgaatt cagattgtag 1740 ttaaaaacac ccttgtttct act 1763 <210> 2 <211> 1320 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 2 ggatcaatct gtatggtaat tggaataatt agcttgatgt tacagattgg gaacataata 60 tcaatatggg tcagtcattc aattcaaaca gggaatcaac accaaactga accaatcaga 120 aatactaatt ttcttaatga gaacgctgta gcttcagtaa cattagctgg caattcatct 180 ctttgcccca ttaaaggatg ggctgtacac agtaaagaca acagtataag gattgggtcc 240 aagggggatg tgtttgtaat tagagagccg ttcatatcat gctcccatct ggaatgcaga 300 actttctttt tgactcaggg agctttactg aatgacaagc actccaatgg gactgtcaaa 360 gataggagcc ctcacagaac gctaatgagt tgccctatag gtgaggctcc ctccccatat 420 aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtcg gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg 480 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tccgaagttg ggggggagca aaagcagggt 30 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-NP-1565R <400> 22 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggg ta 32 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-M-1F <400> 23 tccgaagttg ggggggagca aaagcaggta 30 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-M-1027R <400> 24 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggt ag 32 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-NS-1F <400> 25 tccgaagttg ggggggagca aaagcagggt 30 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-NS-890R <400> 26 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggg tg 32

Claims (8)

1. 다음의 단계를 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주의 제조방법:
   (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA(hemagglutinin) 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 바이러스 H5N1 유래 NA(neuraminidase)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
   (b) 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
   (c) 단계 (a) 및 (b)의 재조합 플라스미드를 패키징 세포(packaging cell)에 트랜스펙션(transfection)하는 단계; 및
   (d) 패키징 세포의 배양 상층액으로부터 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 수득하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계(a)의 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1는 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계(a)의 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA는 상기 HA를 구성하는 HA1의 카르복시 말단 부위에 위치하는 Arg-Arg-Arg-Lys가 결실된 HA인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 저병원성 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34(H1N1)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 패키징 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. (ⅰ) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA(hemagglutinin);
   (ⅱ) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 바이러스 H5N1 유래 NA(neuraminidase); 및
   (iii) 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)의,
   8개 negative-sense ssRNA의 게놈을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA는 상기 HA를 구성하는 HA1의 카르복시 말단 부위에 위치하는 Arg-Arg-Arg-Lys가 결실된 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1주.
   
8. (ⅰ) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유래 HA(hemagglutinin);
   (ⅱ) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고병원성 바이러스 H5N1 유래 NA(neuraminidase); 및
   (iii) 서열번호 3 내지 8의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)의 8개 negative-sense ssRNA의 게놈을 포함하는,
   재조합 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 주를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 백신 조성물.

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