KR102556305B1

KR102556305B1 - Y280 계열에 속하는 저병원성 h9n2 조류 인플루엔자 바이러스를 이용한 h9n2형 유전자 재조합 저병원성 조류 인플루엔자 a 바이러스, 이의 제조 방법 및 백신 조성물

Info

Publication number: KR102556305B1
Application number: KR1020210044292A
Authority: KR
Inventors: 강현미; 강용명; 조현규; 이명헌; 김도영; 이광녕; 이은경; 사공민근; 허경범
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-04-05
Filing date: 2021-04-05
Publication date: 2023-07-19
Also published as: KR20220138290A

Abstract

본 발명은 Y280계열에 속하는 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 H9N2 혈청형 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 방어 효과를 나타내는 유전자 재조합 백신을 제조함으로써, 해외로부터 유입되거나 국내에서 발생하는 H9형 저병원성 조류인플루엔자 발생에 대비한 효과적인 방어효과를 통해 질병방제에 기여할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물에서 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 수용체-결합 부위의 인체친화성 유전자가 일반적인 저병원성 H9N2형 조류 인플루엔자 바이러스가 가지고 있는 HA의 유전자로 치환되어 인체 위해성이 낮을 뿐만 아니라, 닭에서 안전성과 방어능이 우수하다.

Description

Y280 계열에 속하는 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스를 이용한 H9N2형 유전자 재조합 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스, 이의 제조 방법 및 백신 조성물{H9N2 Strain Genetic Recombinant Low Pathogenic Avian Influenza A Virus, Manufacturing Method and Vaccine Composition Thereof Using H9N2 Avian Influenza Virus Belonging to Y280 Lineage}

본 발명은 H9N2 혈청형 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스를 예방하기 위하여 인체 감염 유전자를 포함하는 H9N2 혈청형 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스주를 이용하여 제조한 백신에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스(Influenza Virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A, B, C 형 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 다양한 종류의 가금과 야생조류와 더불어 사람, 말, 돼지, 기타 포유류에서도 감염이 확인되고 있다.

조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus, AIV)는 모두 A형에 속하는 바이러스로, 바이러스 외막에 있는 두 가지 단백질인 혈구응집소(Hemagglutinin; HA)와 뉴라미니다제(Neuraminidase; NA) 유전자에 따라 HA는 16종류, NA는 9종류로 나누어져 혈청형이 144종류(HA 16종, NA 9종)로 다양하며 다른 혈청형 간에 교차방어가 되지 않는 것이 특징이다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다.

저병원성 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스는 가금에서 호흡기 증상과 산란율 저하 등의 임상증상을 특징으로 하며, 일부 개체에서는 폐사를 일으키는 등 경제적 피해를 가져올 수 있다. 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스는 현재 전세계적으로 발생하고 있고, 북아메리카 계열 및 유라시안 계열로 분류될 수 있다. 그 중 유라시안 계열은 BJ94, G1, Y439, Y280계열 등으로 구별되며, BJ94는 주로 동남아시아, G1은 중동 및 북아프리카, Y439계열은 한국을 포함한 유럽 및 동남아시아에서 주로 유행 중이다. 예방백신 중 생(live) 바이러스 백신은 변이가 쉽게 되는 바이러스의 특성상 개발이 거의 불가능한 실정이며, 현재까지 개발된 백신은 크게 사독백신과 유전자 재조합 백신으로 구분할 수 있다.

보다 상세하게는, H9N2형은 1966년 미국의 칠면조에서 처음으로 분리되었고, 아시아의 경우 여러 국가에서 가금에 만연되어 H9N2형 백신이 우리나라를 포함하여 중국, 이란, 파키스탄, 요르단 등 중동 국가에서 주로 사용되고 있다. 닭유래 H9N2 바이러스의 돼지 및 인체감염 사례가 보고되었으며, 일부 H9N2 바이러스가 마우스에서 효율적으로 바이러스 재분리가 일어나며, 순응 단계 없이 마우스를 폐사시킬 수 있음이 확인되었다(Guo 등, 2000; Choi 등, 2004). 중국의 경우 1998년초부터 H9N2 백신을 사용하고 있으며, 대부분 불활화 오일백신으로 최소 20개 이상의 상업용 백신이 사용되고 있으며, 빈번하게 유행주로의 백신주 업데이트가 추진되고 있으나, 백신계군에서조차 지속적으로 H9N2가 발생하고 있는 것으로 보고되었다.

국내의 경우 H9N2형 조류 인플루엔자 바이러스는 1996년 H9N2가 분리된 이후 농가에 만연되어 경제적 피해가 커서 2007년부터 저병원성 H9N2형 사독 백신이 개발되어 사용되고 있었다. 최근에는 저병원성 H9N2형 바이러스는 전통시장에서만 분리되고 있으며, ‘15년 100건, ‘16년 149건이 발생하였으나 ‘17년부터 급감하였는데, 이는 ‘16/‘17 국내 HPAI(Highly Pathogenic Avian Influenza, 고병원성 조류 인플루엔자) 발생시 전통시장에서 생축거래 금지 등 방역정책 강화로 검출율이 낮아진 것으로 추정되었다.

그러나 현재 사용중인 백신주(Y439 계열, 01310)는 2001년 분리된 바이러스로서 최근 국내 유행주와 HA 유전자 상동성에서 10% 정도의 차이를 나타내어, 백신주와 유행주 간에 차이에 의한 효능에 검증이 필요하다. 더욱이, 2020년 6월 국내 전통시장에서 새로운 Y280 계열의 저병원성 H9N2 조류인플루엔자 바이러스가 분리되었고, 이후에 지속적으로 분리되고 있는 상황이며, 최근 새롭게 분리되는 Y280 계열 저병원성 H9N2 조류인플루엔자 바이러스는 현행 백신주(Y439 계열, 01310)와 약 20%의 HA 유전자 상동성의 차이가 있다. 이로 인해 Y280 계열의 저병원성 H9N2 조류인플루엔자 바이러스가 국내 가금농장에 유입될 경우 많은 경제적 피해가 예상되므로 이에 대한 백신주 개발이 시급하다.

공개특허 제10-2010-0047940호(공개일자 2010년 5월 11일)

본 발명자들은 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 신규한 유전자 재조합 백신을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 인체친화성 아미노산을 치환하여 약독화된 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgHS314 백신주)를 제조하고, 이의 높은 안정성, 면역성 및 백신 효능을 검증함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgHS314 백신주)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 H9 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 2020년 6월 국내에서 분리된 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주(A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2))를 이용하여 본 발명을 개발하였다.

2020년 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스주(원바이러스; A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2))에서 분리된 H9N2 혈청형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 이용하여 H9N2형에 높은 방어 능력을 나타내는 저병원성 Y280계열 HA 유전자를 포함하는 백신주를 선발하여 이를 이용한 백신을 제조함으로써 본 발명을 달성하였다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법을 제공한다:

(a) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 NA(neuraminidase) 유전자를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;

(b) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;

(c) 단계 (a) 및 (b)의 재조합 플라스미드를 패키징 세포(packaging cell)에 트랜스펙션(transfection)하는 단계; 및

(d) 패키징 세포의 배양 상층액으로부터 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 수득하는 단계.

본 명세서에서 용어 '조류 인플루엔자'는 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생하는 조류의 급성 전염병을 의미한다. 상기 조류 인플루엔자의 원인체는 인플루엔자 A 바이러스이다.

본 명세서에서 용어 ‘인플루엔자 A 바이러스’는 동물 및 인간에서 발생하는 통상 '독감(flu)'으로 불리는 고 전염성 호흡기 질환의 원인 바이러스로, 단일 가닥 음성 RNA 절편으로 이루어진 절편화된 지놈(genome)을 갖는 외피가 있는 RNA 바이러스를 의미한다.

본 명세서에서 용어 '유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스'는 유전자 재조합 기술을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 RNA 단편이 재조합된 바이러스를 의미한다. 예를 들어, 적어도 2개의 공여자 바이러스(H9N2 혈청형 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 및 H1N1 혈청형 저병원성 인플루엔자 A 바이러스)의 RNA 단편의 조합에 의해 생성되는 유전물질을 함유하는 바이러스이다.

본 명세서에서 용어 '고병원성 인플루엔자 A 바이러스(Highly Pathogenic Avian Influenza A virus, HPAI)'는 (i) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 6수 이상(75%) 폐사할 경우; (ii) 정맥내 병원성지수(intravenous pathogenicity, IVPI, 10수의 4-8주령 감수성 닭의 정맥내로 바이러스를 접종하고 10일 동안 24시간 간격으로 닭의 임상증상 및 폐사정도를 확인하고 호흡기 증상, 침울, 설사, 외피나 벼슬의 청색증, 두부의 부종, 신경증상의 경중을 점수로 기록하여 각 증상의 합에 증상 수치를 곱한 총합을 100으로 나눈 지수)가 1.2 이상인 경우; (iii) 닭에서 낮은 병원성인 H5 또는 H7형의 경우 HA 단백질 분절 부위의 아미노산 서열이 고병원성과 비슷하다고 판정되는 경우를 의미한다.

본 명세서에서 용어 '저병원성 인플루엔자 A 바이러스(Low Pathogenic Avian Influenza A Virus, LPAI)'는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스보다, (i) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 2수 이하(25%) 폐사할 경우; (ii) 정맥내 병원성 지수가 1.2 미만인 경우; (iii) 닭에서 낮은 병원성인 H5 또는 H7형의 경우 HA 단백질 분절 부위의 아미노산 서열이 고병원성과 상이하다고 판정되는 경우를 의미한다.

본 명세서에서 용어 'H9N2형 조류 인플루엔자 A 바이러스'는 인플루엔자 A 바이러스의 표면 단백질인 HA 단백질의 항원 특성이 H9형이고, NA 단백질의 항원 특성이 N2형인 인플루엔자 A 바이러스를 의미한다.

본 발명의 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법을 단계별로 설명한다.

단계 (a): 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA 및 NA를 각각 포함하는 재조합 플라스미드의 제조

먼저, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H9N2형 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H9N2형 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 NA(neuraminidase)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.

본 명세서에서 용어 '뉴클레오타이드 서열'은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 '벡터'는 벡터의 전사에 제공되는 추가 단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 이와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커 등을 또한 포함한다. 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 pHW2000 벡터(Hoffmann E et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000 23;97(11):6108-13 참조)이다.

상기 단계 (a)의 재조합 플라스미드는 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 재조합 플라스미드는 HA를 포함하는 제1재조합 플라스미드 및 NA를 포함하는 제2재조합 플라스미드로 구성된다.

단계 (b): 저병원성 인플루엔자 A 바이러스의 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 포함하는 재조합 플라스미드의 제조

다음, 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.

상기 단계 (b)의 재조합 플라스미드는 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래의 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 PB2를 포함하는 제3재조합 플라스미드, PB1을 포함하는 제4재조합 플라스미드, PA를 포함하는 제5재조합 플라스미드, NP를 포함하는 제6재조합 플라스미드, M을 포함하는 제7재조합 플라스미드 및 NS를 포함하는 제8재조합 플라스미드로 구성된다.

단계 (c): 패키징 세포로의 트랜스펙션

다음, 상기 단계 (a) 및 (b)의 제1 내지 제8재조합 플라스미드를 패키징 세포에 트랜스펙션한다.

본 명세서에서 용어 '패키징 세포'는 비바이러스성 트랜스펙션 방법을 통해 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 패키징 세포는 트랜스펙션된 제1 내지 제8재조합 플라스미드로부터 발현된 HA, NA, PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질이 어셈블리(assembly)된 유전자 재조합의 H9N2형 인플루엔자 A 바이러스를 생산할 수 있다.

단계 (d): H9N2형 유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 수득

마지막으로, 상기 패키징 세포의 배양 상층액을 원심분리하여 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgHS314(H9N2))를 수득한다.

본 발명의 용어, rgHS314(H9N2)는 본 발명에 따른 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법으로 수득된 바이러스를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)이다.

조류 인플루엔자 바이러스의 명명법 [아형/기원숙주/분리지역/분리순번/분리년도(HA형, NA형)]에 따라, 상기 A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)는 인플루엔자 A 바이러스로 닭을 숙주로 하며, 대한민국에서 2020년에 분리된 바이러스로 H9 및 N2의 항원형을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Y280 계열에 속하는 A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)이다.

본 명세서에서 "Y280 계열"은 H9형 인플루엔자의 HA 유전자의 계통수적 특징(phylogenetic characterization) 및 서열 상동성에 기초하여 H9형 인플루엔자의 그룹을 분류하는 기준으로부터 WHO/OIE/FAO의 전문가 그룹에 의하여 정의된 계열 중 유라시안 계열에 속하는 계열을 의미한다(도 1 참조).

H9N2형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대해 현재 사용중인 기존 백신주(01310, 도 1에 붉은색으로 표기함)와 2018년까지 전통시장에서 분리된 H9N2형은 Y439계열이나, 2020년 전통시장에서 분리되고 최근까지 지속적으로 유행하고 있는 H9N2형은 Y280계열이다(도 1 참조).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 234번 내지 236번에 위치하는 아미노산 Leu-Met-Gly(LMG)이 Gln-Gln-Gly(QQG)으로 치환된 것이다.

서열번호 2의 234번 내지 236번에 LMG가 위치하고, LMG가 QQG로 치환된 결과, 서열번호 6의 234번 내지 236번에 QQG가 위치해 있다.

H3 넘버링(H3 numbering)은 HA의 아미노산 위치 번호를 H3형 기준으로 유전자 서열을 배치하여 넘버링을 시킨 것으로, 관련 문헌에서 주로 H3 넘버링으로 HA의 아미노산 위치 번호를 기재하는 등 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용된다. 구체적으로 H9에서 234번에 위치해 있는 류신(Leu)은 A/Aichi/2/1968(H3N2)를 기준으로 H3에서는 226번에 위치해 있고 일반적으로 L226으로 기재한다.

본 발명에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 234번 내지 236번에 위치하는 아미노산 Leu-Met-Gly(LMG)은 H3 넘버링을 기준으로 하는 경우, 226번 내지 228번에 위치한다. 본 발명의 청구범위에 기재된 HA의 234번 내지 236번 아미노산 위치 번호는 발명의 상세한 설명과 실시예에서는 H3 넘버링을 기준으로 한 HA의 226번 내지 228번 아미노산 위치 번호로 기술하였다.

본 발명의 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA 단백질의 226번 내지 228번에 인체친화성 아미노산인 Leu-Met-Gly이 있어 인체에 위해할 수 있으므로, 이에 대한 안전한 백신주를 개발하기 위해 상기 인체친화성 아미노산 Leu-Met-Gly(LMG)을 Gln-Gln-Gly(QQG)으로 치환한다.

인플루엔자 A 바이러스의 HA는 표면 당단백질로, 인플루엔자 A 바이러스가 세포 내로 도입되는 경우 세포 표면의 특이적 수용체와 상호작용을 하는 역할을 한다. 상기 HA는 HA1 및 HA2 서브유닛으로 구성되며, 상기 HA1의 수용체-결합 부위(receptor-binding site, RBS) 모티프가 세포 수용체 특이성에 중요한 역할을 하고, 바이러스의 숙주 범위를 결정한다. 상기 HA1의 RBS는 표적 세포 표면의 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, 시알산(sialic acid, SA))과 결합한다. 상기 HA에서 226번 위치 아미노산이 글루타민(Q226)인 경우 조류의 시알산 α2-3SA에 친화성이 있고, 226번 위치 아미노산이 류신(L226)인 경우 포유동물이나 사람의 시알산 α2-6SA에 친화성이 있다.

본 명세서에서 용어 '인체친화성 아미노산'또는 '인체 감염 아미노산'은 조류 인플루엔자 A 바이러스가 사람의 시알산 수용체에 높은 친화성을 나타내는 특성을 부여하는 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA의 아미노산을 의미하며, '인체친화성 유전자'는 이러한 인체친화성 아미노산을 인코딩하는 유전자를 의미한다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 인체친화성 아미노산은 HA의 226번에 위치하는 Leu(L226)이다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 인체친화성 아미노산은 HA의 226번 및 227번에 위치하는 Leu-Met(LM)이다.

본 발명은 또한 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA의 인체친화성 아미노산 226번 내지 228번 위치 LMG를 QQG로 치환하여 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 약독화한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 700번에서 705번에 위치하는 뉴클레오타이드 TTGATG가 CAACAA로 치환된 것이다.

서열번호 1의 700번에서 705번에 뉴클레오타이드 TTGATG가 위치하고, TTGATG가 CAACAA로 치환된 결과, 서열번호 5의 700번에서 705번에 뉴클레오타이드 CAACAA가 위치해 있다.

본 발명의 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 700번에서 705번에 인체친화성 유전자인 TTGATG가 있어 인체에 위해할 수 있으므로, 이에 대한 안전한 백신주를 개발하기 위해 상기 인체친화성 유전자 TTGATG를 CAACAA로 치환한다.

본 발명은 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA의 인체친화성 유전자 TTGATG를 CAACAA로 치환하여 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 약독화한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 저병원성 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34(H1N1)이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 7 내지 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것이다.

상기 저병원성 인플루엔자 A 바이러스의 서열번호 7 내지 12의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PB2를 포함하는 제3재조합 플라스미드, 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PB1을 포함하는 제4재조합 플라스미드, 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PA를 포함하는 제5재조합 플라스미드, 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NP를 포함하는 제6재조합 플라스미드, 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 M을 포함하는 제7재조합 플라스미드 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NS를 포함하는 제8재조합 플라스미드로 구성된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)의 패키징 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포이다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)의 패키징 세포는 293T 세포이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 H9N2형 유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법은 상기 단계 (d)의 배양 상층액을 특정병원체부재(SPF, specific pathogen free) 부화란에 접종하여 바이러스를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스주는 다음의 단계를 포함하는 제조방법으로 수득될 수 있다: A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)주로부터 인체친화성 아미노산을 치환한 HA 및 NA 유전자를 증폭하는 제1단계; 상기 1단계의 유전자를 재조합하여 형질전환하는 제2단계; 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/PR/8/34(H1N1) 주로부터 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 유전자를 증폭하는 제3단계; 상기 2단계 및 3단계에서 수득한 플라스미드를 293T cell에 트랜스펙션하는 제4단계; 및 상기 배양 상층액을 특정병원체부재(SPF, specific pathogen free) 부화란에 접종하는 제5단계.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는, H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다:

(i) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자;

(ii) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 NA(neuraminidase) 유전자; 및

(iii) 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 234번 내지 236번에 위치하는 아미노산 Leu-Met-Gly이 Gln-Gln-Gly으로 치환된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 700번에서 705번에 위치하는 뉴클레오타이드 TTGATG가 CAACAA로 치환된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자는 서열번호 7 내지 12의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 것이다.

본 발명의 H9N2형 유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스는 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 H9N2형 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법에 의해 제조되므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는, H9 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공한다:

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 H9 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Y280 계열 HA 유전자를 포함한다.

본 명세서에서 용어 '백신 조성물'은 대상(subject)의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미한다. 상기 백신 조성물은 대상(subject)에게 세포성 면역 반응, 예를 들어 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte) 또는 체액성 면역 반응, 예를 들어 항체에 의해 유발되는 향상된 전신적 또는 국소적 면역 반응을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물의 대상은 조류, 사람, 개, 말, 돼지, 고양이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 백신 조성물은 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자 A 바이러스의 동물 예방용 백신이다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 백신 조성물의 대상은 닭, 오리, 메추라기, 칠면조, 거위를 포함하는 가금류 및 야생조류이다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgHS314(H9N2))를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "약제학적 유효량"은 바이러스에 의해 유발되는 질병 또는 병리학적 증상에 대한 예방, 경감 또는 치료적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명인 백신 조성물은 기타 구성성분, 예컨대 안정화제, 부형제, 기타 약학적 허용 화합물 또는 임의의 기타 항원 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 백신은 냉동 건조된 제제 또는 현탁액의 형태로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 백신 생성 분야에 일반적인 것들이다.

본 발명의 백신 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상(subject)의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있다. 한편, 본 발명의 백신 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명인 백신 조성물의 투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종, 에어로졸 분무, 경구 또는 비강내 용도일 수 있다. 음용수 또는 식용 펠렛으로 투여하는 것도 가능하다.

본 발명의 백신 조성물은 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 비경구 투여될 수 있다. 본 발명의 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여방식을 의미한다. 본 발명의 백신의 비경구 투여는 바람직한 순도하에 약제학적으로 허용가능한 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 것을 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하여야 한다.

본 발명의 백신의 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용할 수 있다. 상기 제형은 주사용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 백신 조성물은 이종 항원 및 사이토카인과 같은 면역 조절 분자를 동일한 재조합체내에서 발현시켜 단일 백신으로 전달할 수도 있으며, 상이한 외래 유전자 또는 면역증강제를 보유하는 2 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 "칵테일"로서 투여할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 면역증강제를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어, "면역증강제(adjuvant, 어쥬번트)"는 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질(예컨대, alum, 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, LPS, poly IC, poly AU 등)을 의미한다. 본 발명의 면역증강제에는 alum, 완전 프로인트 어쥬번트(Complete Freund's Adjuvant), 불완전 프로인트 어쥬번트, LPS, poly IC, poly AU, 리포펙틴(Lipofectin), 피로탁시(lipotaxi), CaPO4, DEAE 덱스트란, 폴리브렌(Polybrene), 사포닌, 알루미늄 히드록시드와 같은 무기질, 젤, 리소레시틴, 플루로릭 폴리올스(pluronic polyols), 플리음이온(polyanions), 펩티드 (peptides), 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 표면활성물질, 디니트로페놀이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물 내 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화 된 것이다.

상기 불활화는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스에 포르말린, 자외선, 열, BEI (Bianry Ethyleneimine), 베타-프로피오락톤(Beta-Propiolactone) 등의 처리로 달성될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 상기 불활화 된 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스에 추가로 오일 어쥬번트를 첨가해 혼합하여 불활화 오일백신 또는 사독백신으로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 H9N2 혈청형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스주를 이용한 사독백신이다.

상기 사독백신의 제조방법은 본 발명에 따른 약독화된 재조합 H9N2형 혈청형 바이러스주인 rgHS314(H9N2)주(기탁기관: KVCC 기탁번호: VR210004)를 특정병원체부재(SPF) 부화란에 12시간 내지 72시간 또는 50시간 내지 60시간 배양하여 요막강액을 수득하는 제1단계; 및 제1단계에서 수득한 요막강액에 0.01% 내지 0.1% 포르말린(formalin)을 첨가한 후 0℃ 내지 10℃에서, 바람직하게는 4℃에서, 6시간 내지 24시간, 바람직하게는 12시간 처리하여 불활화시키는 제2단계를 포함한다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 사독백신의 제조방법의 제1단계는 rgHS314(H9N2)주를 특정병원체부재 부화란에 48시간 배양하여 요막강액을 수득하는 단계이다. 본 발명의 구체적인 다른 일 구현예에 있어서, 상기 사독백신의 제조방법의 제2단계는 제1단계에서 수득한 요막강액에 0.01% 포르말린을 첨가한 후 4℃에서 12시간 불활화시키는 단계이다.

본 발명의 백신 조성물은 H9 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 Y280 계열에 속하는 H9 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 H9N2 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 Y280 계열에 속하는 H9N2 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다. 본 명세서의 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다.

본 발명의 H9 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.

서열에 대한 간단한 설명

서열번호 1은 A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)의 HA의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 2는 A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)의 HA의 아미노산 서열이다.

서열번호 3은 A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)의 NA의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 4는 A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)의 NA의 아미노산 서열이다.

서열번호 5는 rgHS314(H9N2)의 HA의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 6은 rgHS314(H9N2)의 HA의 아미노산 서열이다.

서열번호 7은 A/PR/8/34(H1N1)의 PB2의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 8은 A/PR/8/34(H1N1)의 PB1의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 9는 A/PR/8/34(H1N1)의 PA의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 10은 A/PR/8/34(H1N1)의 NP의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 11은 A/PR/8/34(H1N1)의 M의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 12는 A/PR/8/34(H1N1)의 NS의 뉴클레오타이드 서열이다.

서열번호 13 내지 30은 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조를 위해 사용된 HA, NA, PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 유전자에 대한 프라이머 서열이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다.

(c) 본 발명은 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 Y280 계열에 속하는 H9 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명의 백신 조성물을 이용하는 경우, H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 방어 효과가 우수하고, 해외로부터 유입되거나 국내에서 발생하는 H9형 저병원성 조류인플루엔자 발생에 대비한 효과적인 방어효과를 통해 질병방제에 기여할 수 있으며, 상기 백신 조성물에서 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 수용체-결합 부위의 인체친화성 유전자가 일반적인 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스가 가지고 있는 HA의 유전자로 치환되어 인체 위해성이 낮을 뿐만 아니라, 닭에서 안전성과 방어능이 우수하다.

도 1은 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA(hemagglutinin)에 대한 유전자 트리를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예

실시예 1. LBM314/H9N2 바이러스 분리 동정 방법

'20.6.23. 일자에 AI 상시예찰의 일환으로 전통시장 가금류 및 포유류 검사과정에서 대한민국 전남 화순 소재의 전통시장에서 사육 중인 토종닭의 인후두 및 분변을 시료로 채취하였다. 유전자 검사(rRT-PCR)를 통하여 조류 인플루엔자 바이러스의 M(matrix protein) 유전자를 확인하고 종란 접종을 통하여 바이러스를 증식하였다. 10일령 SPF 종란에 접종하여 37℃, 60~72시간 배양 후 SPF 종란의 요막액으로부터 바이러스를 분리하였다. 상기 유전자 검사를 통하여 Y280계열에 속하는 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2))를 확인하였다.

하기 표 1에 정리한 바와 같이, A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2) 인플루엔자 바이러스의 HA(hemagglutinin)의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 나타내었고, 이의 HA의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다. 또한, A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2) 인플루엔자 바이러스의 NA(Neuraminidase)의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 3과 서열번호 4에 나타내었다.

바이러스주	유전자	구분	서열번호
A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)	HA	핵산	1
A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)	HA	아미노산	2
A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)	NA	핵산	3
A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2)	NA	아미노산	4

실시예 2. 백신 제조

2-1. 저병원성주의 HA 인체 감염 유전자(H9) 치환

저병원성 H9N2형 조류 인플루엔자는 HA 단백질 226~228 위치(H3 넘버링 기준)에 인체 친화성 유전자(LMG: TTGATGGGA)가 있어 인체에 위해할 수 있다. 이에 본 발명자들은 보다 안전한 백신주를 개발하기 위해 HA 단백질 226~228 위치의 인체 친화성 유전자 LMG를 QQG로 치환한 백신주를 개발하였다.

A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2) 인플루엔자 바이러스로부터 RNA extraction kit(iNtRON, 한국)를 사용하여 RNA를 추출하였다. HA 부분의 인체친화성 유전자 TTG(L226)를 제거하기 위해 하기 표 2에 나타낸 중첩되는 프라이머들(overlapping primers)을 사용하여 2개의 분절을 증폭한 후 이 두 개의 분절을 이용하여 PCR을 통해 HA 유전자를 증폭(PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 4분/35회)하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다.

이름	염기서열	서열번호
HA1F	TCCG AAG TTG GGG GGG ATG GAG GCA GTA	13
Sub HA F	TCA ACG GTC AAC AAG GAA GAA TTA ATT ATT ATT G	14
Sub HA R	TAA TTC TTC CTT GTT GAC CGT TGA CAA GAG	15
HA R	GGGC CGC CGG GTT ATT TTA TAT ACA AATGTTGC	16

2-2. 저병원성 H9N2주의 유전자 NA(N2) 증폭

상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 cDNA를 만든 후, NA (N2)를 하기 표 3에 나타낸 말단의 프라이머들을 이용하여 PCR을 통해 증폭(PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 2분/35회)하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다.

이름	염기서열	서열번호
N2-1F	TCCG AAG TTG GGG GGG AGCAAAAGCAGGAG	17
N2-1413R	GGGC CGC CGG GTT ATT AGTAGAAACAAGGAGT	18

2-3. 저병원성 H9N2주의 벡터 클로닝

상기 실시예 2-1 및 2-2에서 PCR를 이용하여 증폭한 유전자 HA 및 NA를 pHW2000 vector에 In-Fusion HD Cloning kit(Takara, 미국)로 접합시킨 후 대장균(E. coli, stella competent cells)을 이용하여 형질전환 시킨 다음, LB broth(바이오 사이언스, 한국)를 이용하여 37℃ 회전배양기(shaking incubator)에 18시간 배양증폭한 후 Plasmid DNA purification Kit(iNtRON, 한국)로 정제하여 HA 및 NA 유전자를 얻었다.

2-4. A/PR/8/34(H1N1) 주의 클로닝

A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스(ATCC, 미국)에서 상기 실시예 2-1 내지 2-3과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 PB2, PB1, PA, NP, M, NS 유전자들을 하기 표 4에 나타낸 특정 프라이머들을 이용하여 PCR을 통해 증폭(PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 4분/35회)한 후, pHW2000 vector에 In-Fusion HD Cloning kit(Takara, 미국)로 접합시킨 다음, 대장균(E. coli, stella competent cells)을 이용하여 형질전환한 후 LB broth(바이오사이언스, 한국)를 이용하여 37℃ 회전배양기(shaking incubator)에 18시간 배양증폭한 다음 Plasmid DNA purification Kit(iNtRON, 한국)로 정제하여 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 유전자를 얻었다.

이름	염기서열	서열번호
Phw-PB2-1F	TCCG AAG TTG GGG GGG AGCGAAAGCAGGTC	19
Phw-PB2-2341R	GGGC CGC CGG GTT ATT AGTAGAAACAAGGTCG	20
Phw-PB1-1F	TCCG AAG TTG GGG GGG AGCGAAAGCAGGCA	21
Phw-PB1-2341R	GGGC CGC CGG GTT ATT AGTAGAAACAAGGCAT	22
Phw-PA-1F	TCCG AAG TTG GGG GGG AGCGAAAGCAGGTA	23
Phw-PA-2233R	GGGC CGC CGG GTT ATT AGTAGAAACAAGGTAC	24
Phw-NP-1F	TCCG AAG TTG GGG GGG AGCAAAAGCAGGGT	25
Phw-NP-1565R	GGGC CGC CGG GTT ATT AGTAGAAACAAGGGTA	26
Phw-M-1F	TCCG AAG TTG GGG GGG AGCAAAAGCAGGTA	27
Phw-M-1027R	GGGC CGC CGG GTT ATT AGTAGAAACAAGGTAG	28
Phw-NS-1F	TCCG AAG TTG GGG GGG AGCAAAAGCAGGGT	29
Phw-NS-890R	GGGC CGC CGG GTT ATT AGTAGAAACAAGGGTG	30

하기 표 5에 정리한 바와 같이, 위에서 얻은 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7 내지 서열번호 12에 각각 나타내었다.

바이러스주	유전자	구분	서열번호
A/PR/8/34(H1N1)	PB2	핵산	7
A/PR/8/34(H1N1)	PB1	핵산	8
A/PR/8/34(H1N1)	PA	핵산	9
A/PR/8/34(H1N1)	NP	핵산	10
A/PR/8/34(H1N1)	M	핵산	11
A/PR/8/34(H1N1)	NS	핵산	12

2-5. 약독화 재조합 H9N2 혈청형 바이러스주 제조

293T 세포를 37℃, 5% CO₂에 배양 후 상기 실시예 2-3 및 2-4에서 수득한 플라스미드(plasmid) 각각을 0.5 ul씩 리포펙타민 LTX and Plus Reagent(Lipofectamin LTX and Plus Reagent, Invitrogen, 미국)로 접종(transfection)하였다. 접종 48시간 후 상층액을 10일령된 특정병원체부재(SPF, specific pathogen free) 부화란에 접종하여 약독화된 재조합 H9N2 혈청형 바이러스 주(이하 rgHS314(H9N2)로 명명함)를 수득하였다.

하기 표 6에 정리한 바와 같이, rgHS314(H9N2)의 HA의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 5 및 6에 나타내었다.

바이러스주	유전자	구분	서열번호
rgHS314(H9N2)	HA	핵산	5
rgHS314(H9N2)	HA	아미노산	6

실시예 3. 사독백신의 제조방법

상기 실시예 2에서 수득한 rgHS314(H9N2)주(기탁기관: Korea Veterinary Culture Collection, KVCC, 기탁일: 2021년 1월 26일, 기탁번호: VR2100004)를 100개의 10일령의 SPF 부화란에 접종 후 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 48시간 배양된 부화란을 4℃에서 6시간 냉장한 후 요막강액을 수득하였다. 수득한 요막강액을 1/10로 농축한 후 농축한 바이러스를 0.01% 포르말린(formalin)으로 4℃에서 12시간 불활화 시켰다.

실험예

실험예 1. rgHS314(H9N2)의 HA의 인체친화성 아미노산 유전자 존재 치환 여부 검증

상기 실시예 2에서 수득한 rgHS314(H9N2)의 HA 유전자 치환 여부를 검증하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

1-1. 유전자 분석에 의한 검증

rgHS314(H9N2) 백신주로부터 상기 실시예 2-1의 실험방법에 HA 유전자를 PCR로 증폭하여 pHW2000벡터에 클로닝한 후, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit((주)바이오닉스, 한국)를 이용한 Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer로 염기서열을 얻은 다음, CLC 프로그램(미국)을 이용하여 인체 친화성 유전자 제거를 확인하였다.

실험 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 rgHS314 백신주 HA의 유전자 LMG가 QQG로 치환되었음을 확인할 수 있었다.

바이러스주	구분	염기서열
A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2) HA	핵산	5'-GTCAACGGTTTGATGGGAAGAATT-3'
A/chicken/Korea/LBM314/2020(H9N2) HA	아미노산	N-말단-VNGLMGRI-C-말단
rgHS314(H9N2) HA	핵산	5'-GTCAACGGTCAACAAGGAAGAATT-3'
rgHS314(H9N2) HA	아미노산	N-말단-VNGQQGRI-C-말단

실험예 2. rgHS314 백신주의 안전성 및 면역성 검증

상기 실시예 3에서 수득한 백신의 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 안전성 및 면역성을 확인하기 위하여 SPF 닭을 사용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

2-1. 백신주의 안전성 실험

SPF 닭을 실제 목적동물로 사용하기 위해 개발된 백신이므로 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자 백신 효능 검정에 사용하였다. 10수의 6주령 SPF 닭의 이두근(biceps muscle)에 1 ml(500 ul/dose: 항원과 부형제가 섞여있는 양) rgHS314(H9N2) 조류 인플루엔자 백신 항원을 접종 2주 후 혈청을 수득하여 항체역가를 혈구응집억제반응(HI, hemagglutination inhibition)에 의해 검증하였다. 대조군으로 사용한 10마리의 SPF 닭은 생리식염수를 접종하여 효능 비교하였다.

실험 결과, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 백신을 접종 받은 10마리의 SPF 닭 모두는 혈구응집억제(HI) 역가가 2⁷ 이상을 나타냈으며, 사망, 체중 감소 등의 특별한 임상증상을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

No.	백신접종 개체		대조군
No.	HI 역가	폐사/접종수	HI 역가	폐사/접종수
1	12	0/10	<1	0/10
2	12		<1
3	10		<1
4	12		<1
5	11		<1
6	11		<1
7	12		<1
8	12		<1
9	12		<1
10	11		<1

실험예 3. rgHS314(H9N2) 조류 인플루엔자 백신주의 효능 검증

상기 실시예 3에서 수득한 rgHS314(H9N2) 백신 항원의 효능을 검증하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

3-1. H9N2 공격접종

10마리의 6주령의 SPF 닭에 오른쪽 다리의 이두근에 0.5 ml씩 rgHS314(H9N2) 조류 인플루엔자 백신 항원을 접종 3주 후 백신을 접종하지 않은 10마리의 대조군과 함께 10⁶ Egg Infectious dose(EID₅₀)을 코로 공격 접종하여 14일간 생존 및 임상증상 여부를 판정하였다.

실험 결과, 공격접종된 백신군과 비백신대조군 모두 14일간 생존하며 폐사는 일어나지 않았으나 비백신대조군에서 3일과 5일차에 설사 등의 임상증상이 관찰되었다.

3-2. 조직학적 바이러스 역가 검증

상기 실험예 3-1의 실험방법에 따라 10⁶ Egg Infectious dose(EID₅₀)를 코로 접종 후 1, 3, 5, 7일째(dpi, days post-immunization)에 실험군 및 대조군으로부터 면봉을 이용하여 스왑(swab)을 실시하여 바이러스 역가(log₁₀EID₅₀/0.1ml)를 측정하였다. 결과는 표 9에 나타내었다.

실험 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이 rgHS314(H9N2) 백신 항원을 접종 받은 실험군은 인후두(Oropharyngeal, OP) 스왑 샘플에서 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스가 검출되지 않았던 반면에, 대조군은 인후두(OP) 스왑 샘플에서 높은 역가의 바이러스가 검출되었음을 확인할 수 있었다.

vaccine	challenge	1dpi		3dpi		5dpi		7dpi
vaccine	challenge	OP	CL	OP	CL	OP	CL	OP	CL
백신	Y280	0/8(-)**	0/8(-)	0/8(-)*	0/8(-)	0/8(-)	0/8(-)	0/8(-)	0/8(-)
비백신 대조군	Y280	7/8(3.6)	0/8(-)	5/8(1.6)	0/8(-)	2/8(1.5)	1/8(1.5)	0/8(-)	1/8(1.5)

dpi: days post-immunization; OP: 인후두(Oropharyngeal); CL: 총배설강(cloacal). 바이러스 배출 마리수/생존 마리수(바이러스 역가, log₁₀EID₅₀/0.1ml), *p value < 0.05, **p value < 0.01 통계학적으로 유의한 차이가 있음.

또한 5일째에 부검을 통해 기관(Trachea), 폐(Lung), 맹장편도(Cecal Tonsil), 신장(Kidney), 비장(Spleen) 등의 실질장기에서 바이러스 역가를 측정하였다. 실험 결과는 표 10에 나타내었다.

표 10에 나타낸 바와 같이, 백신군은 맹장편도에서 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스가 검출되지 않았던 반면에, 비백신대조군은 맹장편도에서 바이러스가 검출되었음을 확인할 수 있었다.

Vaccine	challenge	Trachea	Lung	Cecal Tonsil	Kidney	Spleen
백신	Y280	0/8(-)	0/8(-)	0/8(-)*	0/8(-)	0/8(-)
비백신대조군	Y280	3/8(1.5)	2/8(1.4)	4/8(1.7)	2/8(2.4)	0/8(-)

바이러스 배출 마리수/생존 마리수(바이러스 역가, log₁₀EID₅₀/0.1ml), *p value < 0.05, **p value < 0.01 통계학적으로 유의한 차이가 있음.

3-3. 기존 백신(01310)과 rgHS314 백신후보주 간의 효능 비교

도 1에 붉은색 사각형으로 표기한 기존 백신주(01310)와 2018년까지 전통시장에서 분리된 H9N2형 인플루엔자 바이러스는 Y439 계열이나, 2020년 전통시장에서 분리되고 최근까지 지속적으로 유행하고 있는 H9N2형 인플루엔자 바이러스는 Y280계열이다.

H9N2형 Y439 계열인 기존 백신(01310)과 H9N2형 Y280 계열인 본 발명의 신규한 백신후보주(rgHS314)의 효능을 비교하기 위해, 상기 실험예 3-1 및 3-2의 실험방법에 따라 10⁶ EID₅₀ 공격 접종 후 5일째(5dpi)에 각 백신군 및 비백신대조군의 기관(Trachea, Tra), 폐(Lung), 맹장편도(Cecal Tonsil, CT), 신장(Kidney, Kid), 비장(Spleen, SPL)의 실질장기에서 바이러스 역가(log₁₀EID₅₀/0.1ml)를 측정하였다. 결과는 하기 표 11에 나타내었다. 각 장기별로 생존 마리수에 대한 바이러스 배출(virus shedding) 마리수를 바이러스 배출 마리수/생존 마리수로 표기하고, 바이러스 역가를 괄호안에 표기하였다.

Group	No. of chicken	Challenge (titer)	Virus replication (EID ₅₀ /0.1ml) at 5dpi
Group	No. of chicken	Challenge (titer)	Tra	Lung	CT	Kid	SPL
기존백신 (01310)	8	Y280 (6.0)	2/8 (2.8)	0/8^*	2/8 (1.4)	0/8	0/8
Control	5		2/5 (2.0)	3/5 (1.4)	2/5 (1.6)	0/5	1/5 (1.2)
신규백신후보주(rgHS314)	8		0/8	0/8	0/8^*	0/8	0/8
Control	8		3/8 (1.5)	2/8 (1.4)	4/8 (1.7)	2/8 (2.4)	0/8

LPAI H9N2 백신 효능평가의 경우 맹장편도(CT)에서 비백신대조군(Control) 대비 80% 억제시 백신의 효능이 인정된다. 실험 결과, 상기 표 11에 나타낸 바와 같이 기존 백신(01310주)은 CT에서 비백신대조군 대비 바이러스 분리 억제 효과가 인정되지 않으나, 현재 개발된 본 발명의 신규 백신후보주(rgHS314)는 비백신대조군 대비 통계학적으로 유의한 바이러스 분리 억제(* P value < 0.05) 효과가 인정된다. 기타 다른 기관(trachea, Tra) 장기에서도 현행 백신은 비백신대조군 대비 바이러스 분리 억제 효과가 미인정된다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> H9N2 Strain Genetic Recombinant Low Pathogenic Avian Influenza A Virus, Manufacturing Method and Vaccine Composition Thereof Using H9N2 Avian Influenza Virus Belonging to Y280 Lineage <130> PN210057 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1683 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 1 atggaggcag tatcactaat aactatacta gtagtggcaa cagtaagcaa tgcagataag 60 atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acggaaactg tggacacact aacagaaaac 120 aatgtccctg taacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180 gcaacaagct tgggacaccc tcttattcta gacacctgca ccattgaagg gctaatttat 240 ggcaatcctt cttgtgatcc attgctggga ggaaaagaat ggtcctatat cgtcgagagg 300 ccatcagccg ttaacggatt atgttatccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaaga 360 ttacttttta gttcttctag gtcttatcaa aggatccaga tctttccaga cacaatctgg 420 aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgctcggatt cattctacag aagcatgaga 480 tggttgactc aaaagaacaa cgcttaccct acccaagatg ctcaatacac aaataatcaa 540 ggaaagaaca ttcttttcat gtggggtata aatcatccac ccactgatgc tgcgcagaca 600 aatctgtaca ccagaactga cacaacaaca agtgtggcaa cagaggaaat gaatagggtc 660 tttaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattaattat 720 tattggtcgg tattgaaacc gggccaaacg ctgcggataa aatctgatgg gaatctaata 780 gctccatggt atggacacat cctttcagga gagagccacg gaagaatcct aaagactgac 840 ttaaaaatgg gtagctgcac agtgcagtgt caaacagaga aaggtggctt aaacacaaca 900 ttgcccttcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcaaagta cattggcgta 960 aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag cagaggacta 1020 ttcggggcca tagcaggatt tatagaggga ggttggtcag gactggttgc tggttggtat 1080 gggttccaac attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ttccacccaa 1140 aaggcagttg ataaaataac atccaaagtg aataatatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200 tatgaaatca ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta ggcttaacat gatcaatgat 1260 aaggttgatg atcaaatcca agatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctc 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgaacatgac gctaatgtga acaatctata taataaagtg 1380 aagagggcgt tgggttccaa tgcagtggaa gatgggagag gatgtttcga gctataccac 1440 aaatgtgata accattgcat ggagacaatt cggaatggga cctacaacag gaggaagtat 1500 caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagaa 1560 acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620 tttgctgcct ttttgttctg ggccatgtcc aacgggtcct gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 2 <211> 560 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Met Glu Ala Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Val Val Ala Thr Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Pro Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn 100 105 110 Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Leu Leu Phe Ser Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr 130 135 140 Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg 145 150 155 160 Trp Leu Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Gln Asp Ala Gln Tyr 165 170 175 Thr Asn Asn Gln Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His 180 185 190 Pro Pro Thr Asp Ala Ala Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr 195 200 205 Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Met Asn Arg Val Phe Lys Pro Leu 210 215 220 Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asn Tyr 225 230 235 240 Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp 245 250 255 Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser 260 265 270 His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Met Gly Ser Cys Thr Val 275 280 285 Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln 290 295 300 Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Val 305 310 315 320 Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser 325 330 335 Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp 340 345 350 Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln 355 360 365 Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Val Asp 370 375 380 Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln 385 390 395 400 Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn 405 410 415 Met Ile Asn Asp Lys Val Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr 420 425 430 Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu 435 440 445 His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu 450 455 460 Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Arg Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His 465 470 475 480 Lys Cys Asp Asn His Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn 485 490 495 Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu 500 505 510 Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr 515 520 525 Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Ile Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe 530 535 540 Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 545 550 555 560 <210> 3 <211> 1401 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 3 atgaatccaa atcagaagat aacagcaatt ggctctgttt ctctaatcat tgcgataata 60 tgtctcctca tgcaaattgc catcttaaca acgactatga cattacattt cgggcagaaa 120 gaatgcagta acccatcgaa taatcaggtg gtgccatgtg aaccgatcat aatagagagg 180 aacacagtgc atttgaatag cactaccata gagagggaaa tttgtcctaa ggtagcagaa 240 tataaaaatt ggttaaaacc acaatgccta attacagggt tcgccccttt ctcaaaggac 300 aactcaatta ggctctctgc aagtggggat gtctgggtaa caagagaacc ttatgtctca 360 tgcagtccag acaaatgtta tcaatttgca cttgggcagg gaaccaccct gaagaacaag 420 cactcaaatg gcactacacg cgatagaacc ccttacagaa ctcttttaat gaatgaatta 480 ggtgtcccgt ttcatttagg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtctag ttcaagctgt 540 tatgatggga aagcatggtt acacgtttgt gttactgggg atgatcaaaa tgctactgct 600 agtatcatct atgatgggat gctcgttgac agtattggat catggtccaa aaacatcctc 660 agaactcagg agtcagaatg tgtttgcatc aatggaactt gtgcagtggt aatgactgat 720 ggaagtgcat caggagttgc cgacactaga gtattattca taagagaagg gaaaattgta 780 aatattagac cgttgtcagg aagtgctcag cacgttgagg aatgctcctg ttatccccga 840 tatcctgaaa ttagatgtgt ttgcagagac aattggaagg gctccaatag gcccattgta 900 tatataaata tggctgatta tagcattgaa tccagttatg tgtgctcggg acttgttggc 960 gacacaccaa gaaatgatga tagctccagc agcagcaact gcagagaccc taataacgaa 1020 agaggggccc caggagtgaa agggtgggct tttgacgacg ggaatgatgt ttggatggga 1080 cggacaatca aaaatggttc gcgctcaggt tatgagactt ttagggtcat aaatggttgg 1140 actgtggcta attcaaagtc acagataaat aggcaagtca tagttgacag tgacgactgg 1200 tctgggtatt ccggcatctt ctctgttgag ggcagagaat gcatcaacag gtgtttttat 1260 gtggagttga taagagggag accacaggaa cccagagtgt ggtggacatc aaatagcatc 1320 attgtattct gtggaacctc aggtacatat ggaacaggct catggcctga tggagcgaat 1380 atcaacttca tgtcaatata a 1401 <210> 4 <211> 466 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Ile Ala Ile Ile Cys Leu Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Thr Thr Thr 20 25 30 Met Thr Leu His Phe Gly Gln Lys Glu Cys Ser Asn Pro Ser Asn Asn 35 40 45 Gln Val Val Pro Cys Glu Pro Ile Ile Ile Glu Arg Asn Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Ser Thr Thr Ile Glu Arg Glu Ile Cys Pro Lys Val Ala Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Asn Trp Leu Lys Pro Gln Cys Leu Ile Thr Gly Phe Ala Pro 85 90 95 Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Ser Gly Asp Val Trp 100 105 110 Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Ser Pro Asp Lys Cys Tyr Gln 115 120 125 Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Asn Lys His Ser Asn Gly 130 135 140 Thr Thr Arg Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu 145 150 155 160 Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala Trp Ser 165 170 175 Ser Ser Ser Cys Tyr Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val Cys Val Thr 180 185 190 Gly Asp Asp Gln Asn Ala Thr Ala Ser Ile Ile Tyr Asp Gly Met Leu 195 200 205 Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Lys Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu 210 215 220 Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Ala Val Val Met Thr Asp 225 230 235 240 Gly Ser Ala Ser Gly Val Ala Asp Thr Arg Val Leu Phe Ile Arg Glu 245 250 255 Gly Lys Ile Val Asn Ile Arg Pro Leu Ser Gly Ser Ala Gln His Val 260 265 270 Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Glu Ile Arg Cys Val Cys 275 280 285 Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Tyr Ile Asn Met 290 295 300 Ala Asp Tyr Ser Ile Glu Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu Val Gly 305 310 315 320 Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys Arg Asp 325 330 335 Pro Asn Asn Glu Arg Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala Phe Asp 340 345 350 Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Lys Asn Gly Ser Arg 355 360 365 Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Arg Val Ile Asn Gly Trp Thr Val Ala Asn 370 375 380 Ser Lys Ser Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Ser Asp Asp Trp 385 390 395 400 Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Arg Glu Cys Ile Asn 405 410 415 Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Gln Glu Pro Arg 420 425 430 Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Phe Cys Gly Thr Ser Gly 435 440 445 Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn Phe Met 450 455 460 Ser Ile 465 <210> 5 <211> 1683 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rgHS314 HA nt <400> 5 atggaggcag tatcactaat aactatacta gtagtggcaa cagtaagcaa tgcagataag 60 atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acggaaactg tggacacact aacagaaaac 120 aatgtccctg taacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180 gcaacaagct tgggacaccc tcttattcta gacacctgca ccattgaagg gctaatttat 240 ggcaatcctt cttgtgatcc attgctggga ggaaaagaat ggtcctatat cgtcgagagg 300 ccatcagccg ttaacggatt atgttatccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaaga 360 ttacttttta gttcttctag gtcttatcaa aggatccaga tctttccaga cacaatctgg 420 aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgctcggatt cattctacag aagcatgaga 480 tggttgactc aaaagaacaa cgcttaccct acccaagatg ctcaatacac aaataatcaa 540 ggaaagaaca ttcttttcat gtggggtata aatcatccac ccactgatgc tgcgcagaca 600 aatctgtaca ccagaactga cacaacaaca agtgtggcaa cagaggaaat gaatagggtc 660 tttaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtc aacaaggaag aattaattat 720 tattggtcgg tattgaaacc gggccaaacg ctgcggataa aatctgatgg gaatctaata 780 gctccatggt atggacacat cctttcagga gagagccacg gaagaatcct aaagactgac 840 ttaaaaatgg gtagctgcac agtgcagtgt caaacagaga aaggtggctt aaacacaaca 900 ttgcccttcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcaaagta cattggcgta 960 aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag cagaggacta 1020 ttcggggcca tagcaggatt tatagaggga ggttggtcag gactggttgc tggttggtat 1080 gggttccaac attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ttccacccaa 1140 aaggcagttg ataaaataac atccaaagtg aataatatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200 tatgaaatca ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta ggcttaacat gatcaatgat 1260 aaggttgatg atcaaatcca agatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctc 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgaacatgac gctaatgtga acaatctata taataaagtg 1380 aagagggcgt tgggttccaa tgcagtggaa gatgggagag gatgtttcga gctataccac 1440 aaatgtgata accattgcat ggagacaatt cggaatggga cctacaacag gaggaagtat 1500 caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagaa 1560 acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620 tttgctgcct ttttgttctg ggccatgtcc aacgggtcct gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 6 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rgHS314 HA aa <400> 6 Met Glu Ala Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Val Val Ala Thr Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Pro Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn 100 105 110 Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Leu Leu Phe Ser Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr 130 135 140 Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg 145 150 155 160 Trp Leu Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Gln Asp Ala Gln Tyr 165 170 175 Thr Asn Asn Gln Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His 180 185 190 Pro Pro Thr Asp Ala Ala Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr 195 200 205 Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Met Asn Arg Val Phe Lys Pro Leu 210 215 220 Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg Ile Asn Tyr 225 230 235 240 Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp 245 250 255 Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser 260 265 270 His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Met Gly Ser Cys Thr Val 275 280 285 Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln 290 295 300 Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Val 305 310 315 320 Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser 325 330 335 Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp 340 345 350 Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln 355 360 365 Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Val Asp 370 375 380 Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln 385 390 395 400 Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn 405 410 415 Met Ile Asn Asp Lys Val Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr 420 425 430 Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu 435 440 445 His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu 450 455 460 Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Arg Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His 465 470 475 480 Lys Cys Asp Asn His Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn 485 490 495 Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu 500 505 510 Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr 515 520 525 Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Ile Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe 530 535 540 Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 545 550 555 560 <210> 7 <211> 2313 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 7 tcaattatat tcaatatgga aagaataaaa gaactaagaa atctaatgtc gcagtctcgc 60 acccgcgaga tactcacaaa aaccaccgtg gaccatatgg ccataatcaa gaagtacaca 120 tcaggaagac aggagaagaa cccagcactt aggatgaaat ggatgatggc aatgaaatat 180 ccaattacag cagacaagag gataacggaa atgattcctg agagaaatga gcaaggacaa 240 actttatgga gtaaaatgaa tgatgccgga tcagaccgag tgatggtatc accactggct 300 gtgacatggt ggaataggaa tggaccaata acaaatacag ttcattatcc aaaaatctac 360 aaaacttatt ttgaaagagt cgaaaggcta aagcatggaa cctttggccc tgtccatttt 420 agaaaccaag tcaaaatacg tcggagagtt gacataaatc ctggtcatgc agatctcagt 480 gccaaggagg cacaggatgt aatcatggaa gttgttttcc ctaacgaagt gggagccagg 540 atactaacat cggaatcgca actaacgata accaaagaga agaaagaaga actccaggat 600 tgcaaaattt ctcctttgat ggttgcatac atgttggaga gagaactggt ccgcaaaacg 660 agattcctcc cagtggctgg tggaacaagc agtgtgtaca ttgaagtgtt gcatttgact 720 caaggaacat gctgggaaca gatgtatact ccaggagggg aagtgaggaa tgatgatgtt 780 gatcaaagct tgattattgc tgctaggaac atagtgagaa gagctgcagt atcagcagat 840 ccactagcat ctttattgga gatgtgccac agcacacaga ttggtggaat taggatggta 900 gacatcctta ggcagaaccc aacagaagag caagccgtgg atatatgcaa ggctgcaatg 960 ggactgagaa ttagctcatc cttcagtttt ggtggattca catttaagag aacaagcgga 1020 tcatcagtca agagagagga agaggtgctt acgggcaatc ttcaaacatt gaagataaga 1080 gtgcatgagg gatatgaaga gttcacaatg gttgggagaa gagcaacagc catactcaga 1140 aaagcaacca ggagattgat tcagctgata gtgagtggga gagacgaaca gtcgattgcc 1200 gaagcaataa ttgtggccat ggtattttca caagaggatt gtatgataaa agcagtcaga 1260 ggtgatctga atttcgtcaa tagggcgaat cagcgattga atcctatgca tcaactttta 1320 agacattttc agaaggatgc gaaagtgctt tttcaaaatt ggggagttga acctatcgac 1380 aatgtgatgg gaatgattgg gatattgccc gacatgactc caagcatcga gatgtcaatg 1440 agaggagtga gaatcagcaa aatgggtgta gatgagtact ccagcacgga gagggtagtg 1500 gtgagcattg accgtttttt gagaatccgg gaccaacgag gaaatgtact actgtctccc 1560 gaggaggtca gtgaaacaca gggaacagag aaactgacaa taacttactc atcgtcaatg 1620 atgtgggaga ttaatggtcc tgaatcagtg ttggtcaata cctatcaatg gatcatcaga 1680 aactgggaaa ctgttaaaat tcagtggtcc cagaacccta caatgctata caataaaatg 1740 gaatttgaac catttcagtc tttagtacct aaggccatta gaggccaata cagtgggttt 1800 gtaagaactc tgttccaaca aatgagggat gtgcttggga catttgatac cgcacagata 1860 ataaaacttc ttcccttcgc agccgctcca ccaaagcaaa gtagaatgca gttctcctca 1920 tttactgtga atgtgagggg atcaggaatg agaatacttg taaggggcaa ttctcctgta 1980 ttcaactata acaaggccac gaagagactc acagttctcg gaaaggatgc tggcacttta 2040 actgaagacc cagatgaagg cacagctgga gtggagtccg ctgttctgag gggattcctc 2100 attctgggca aagaggacaa gagatatggg ccagcactaa gcatcaatga actgagcaac 2160 cttgcgaaag gagagaaggc taatgtgcta attgggcaag gagacgtggt gttggtaatg 2220 aaacggaaac gggactctag catacttact gacagccaga cagcgaccaa aagaattcgg 2280 atggccatca attagtgtcg aatagtttaa aaa 2313 <210> 8 <211> 2313 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 8 gcaaaccatt tgaatggatg tcaatccgac cttacttttc ttaaaagtgc cagcacaaaa 60 tgctataagc acaactttcc cttatactgg agaccctcct tacagccatg ggacaggaac 120 aggatacacc atggatactg tcaacaggac acatcagtac tcagaaaagg gaagatggac 180 aacaaacacc gaaactggag caccgcaact caacccgatt gatgggccac tgccagaaga 240 caatgaacca agtggttatg cccaaacaga ttgtgtattg gaggcgatgg ctttccttga 300 ggaatcccat cctggtattt ttgaaaactc gtgtattgaa acgatggagg ttgttcagca 360 aacacgagta gacaagctga cacaaggccg acagacctat gactggactc taaatagaaa 420 ccaacctgct gcaacagcat tggccaacac aatagaagtg ttcagatcaa atggcctcac 480 ggccaatgag tctggaaggc tcatagactt ccttaaggat gtaatggagt caatgaacaa 540 agaagaaatg gggatcacaa ctcattttca gagaaagaga cgggtgagag acaatatgac 600 taagaaaatg ataacacaga gaacaatggg taaaaagaag cagagattga acaaaaggag 660 ttatctaatt agagcattga ccctgaacac aatgaccaaa gatgctgaga gagggaagct 720 aaaacggaga gcaattgcaa ccccagggat gcaaataagg gggtttgtat actttgttga 780 gacactggca aggagtatat gtgagaaact tgaacaatca gggttgccag ttggaggcaa 840 tgagaagaaa gcaaagttgg caaatgttgt aaggaagatg atgaccaatt ctcaggacac 900 cgaactttct ttcaccatca ctggagataa caccaaatgg aacgaaaatc agaatcctcg 960 gatgtttttg gccatgatca catatatgac cagaaatcag cccgaatggt tcagaaatgt 1020 tctaagtatt gctccaataa tgttctcaaa caaaatggcg agactgggaa aagggtatat 1080 gtttgagagc aagagtatga aacttagaac tcaaatacct gcagaaatgc tagcaagcat 1140 cgatttgaaa tatttcaatg attcaacaag aaagaagatt gaaaaaatcc gatcgctctt 1200 aatagagggg actgcatcat tgagccctgg aatgatgatg ggcatgttca atatgttaag 1260 cactgtatta ggcgtctcca tcctgaatct tggacaaaag agatacacca agactactta 1320 ctggtgggat ggtcttcaat cctctgacga ttttgctctg attgtgaatg cacccaatca 1380 tgaagggatt caagccggag tcgacaggtt ttatcgaacc tgtaagctac ttggaatcaa 1440 tatgagcaag aaaaagtctt acataaacag aacaggtaca tttgaattca caagtttttt 1500 ctatcgttat gggtttgttg ccaatttcag catggagctt cccagttttg gggtgtctgg 1560 gatcaacgag tcagcggaca tgagtattgg agttactgtc atcaaaaaca atatgataaa 1620 caatgatctt ggtccagcaa cagctcaaat ggcccttcag ttgttcatca aagattacag 1680 gtacacgtac cgatgccata gaggtgacac acaaatacaa acccgaagat catttgaaat 1740 aaagaaactg tgggagcaaa cccgttccaa agctggactg ctggtctccg acggaggccc 1800 aaatttatac aacattagaa atctccacat tcctgaagtc tgcctaaaat gggaattgat 1860 ggatgaggat taccaggggc gtttatgcaa cccactgaac ccatttgtca gccataaaga 1920 aattgaatca atgaacaatg cagtgatgat gccagcacat ggtccagcca aaaacatgga 1980 gtatgatgct gttgcaacaa cacactcctg gatccccaaa agaaatcgat ccatcttgaa 2040 tacaagtcaa agaggagtac ttgaggatga acaaatgtac caaaggtgct gcaatttatt 2100 tgaaaaattc ttccccagca gttcatacag aagaccagtc gggatatcca gtatggtgga 2160 ggctatggtt tccagagccc gaattgatgc acggattgat ttcgaatctg gaaggataaa 2220 gaaagaagag ttcactgaga tcatgaagat ctgttccacc attgaagagc tcagacggca 2280 aaaatagtga atttagcttg tccttcatga aaa 2313 <210> 9 <211> 2206 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 9 gtactgatcc aaaatggaag attttgtgcg acaatgcttc aatccgatga ttgtcgagct 60 tgcggaaaaa acaatgaaag agtatgggga ggacctgaaa atcgaaacaa acaaatttgc 120 agcaatatgc actcacttgg aagtatgctt catgtattca gattttcact tcatcaatga 180 gcaaggcgag tcaataatcg tagaacttgg tgatccaaat gcacttttga agcacagatt 240 tgaaataatc gagggaagag atcgcacaat ggcctggaca gtagtaaaca gtatttgcaa 300 cactacaggg gctgagaaac caaagtttct accagatttg tatgattaca aggagaatag 360 attcatcgaa attggagtaa caaggagaga agttcacata tactatctgg aaaaggccaa 420 taaaattaaa tctgagaaaa cacacatcca cattttctcg ttcactgggg aagaaatggc 480 cacaaaggca gactacactc tcgatgaaga aagcagggct aggatcaaaa ccagactatt 540 caccataaga caagaaatgg ccagcagagg cctctgggat tcctttcgtc agtccgagag 600 aggagaagag acaattgaag aaaggtttga aatcacagga acaatgcgca agcttgccga 660 ccaaagtctc ccgccgaact tctccagcct tgaaaatttt agagcctatg tggatggatt 720 cgaaccgaac ggctacattg agggcaagct gtctcaaatg tccaaagaag taaatgctag 780 aattgaacct tttttgaaaa caacaccacg accacttaga cttccgaatg ggcctccctg 840 ttctcagcgg tccaaattcc tgctgatgga tgccttaaaa ttaagcattg aggacccaag 900 tcatgaagga gagggaatac cgctatatga tgcaatcaaa tgcatgagaa cattctttgg 960 atggaaggaa cccaatgttg ttaaaccaca cgaaaaggga ataaatccaa attatcttct 1020 gtcatggaag caagtactgg cagaactgca ggacattgag aatgaggaga aaattccaaa 1080 gactaaaaat atgaagaaaa caagtcagct aaagtgggca cttggtgaga acatggcacc 1140 agaaaaggta gactttgacg actgtaaaga tgtaggtgat ttgaagcaat atgatagtga 1200 tgaaccagaa ttgaggtcgc ttgcaagttg gattcagaat gagtttaaca aggcatgcga 1260 actgacagat tcaagctgga tagagctcga tgagattgga gaagatgtgg ctccaattga 1320 acacattgca agcatgagaa ggaattattt cacatcagag gtgtctcact gcagagccac 1380 agaatacata atgaaggggg tgtacatcaa tactgccttg cttaatgcat cttgtgcagc 1440 aatggatgat ttccaattaa ttccaatgat aagcaagtgt agaactaagg agggaaggcg 1500 aaagaccaac ttgtatggtt tcatcataaa aggaagatcc cacttaagga atgacaccga 1560 cgtggtaaac tttgtgagca tggagttttc tctcactgac ccaagacttg aaccacataa 1620 atgggagaag tactgtgttc ttgagatagg agatatgctt ataagaagtg ccataggcca 1680 ggtttcaagg cccatgttct tgtatgtgag aacaaatgga acctcaaaaa ttaaaatgaa 1740 atggggaatg gagatgaggc gttgcctcct ccagtcactt caacaaattg agagtatgat 1800 tgaagctgag tcctctgtca aagagaaaga catgaccaaa gagttctttg agaacaaatc 1860 agaaacatgg cccattggag agtcccccaa aggagtggag gaaagttcca ttgggaaggt 1920 ctgcaggact ttattagcaa agtcggtatt caacagcttg tatgcatctc cacaactaga 1980 aggattttca gctgaatcaa gaaaactgct tcttatcgtt caggctctta gggacaacct 2040 tgaacctggg acctttgatc ttggggggct atatgaagca attgaggagt gcctgattaa 2100 tgatccctgg gttttgctta atgcttcttg gttcaactcc ttccttacac atgcattgag 2160 ttagttgtgg cagtgctact atttgctatc catactgtcc aaaaaa 2206 <210> 10 <211> 1537 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 10 tagataatca ctcactgagt gacatcaaaa tcatggcgtc tcaaggcacc aaacgatctt 60 acgaacagat ggagactgat ggagaacgcc agaatgccac tgaaatcaga gcatccgtcg 120 gaaaaatgat tggtggaatt ggacgattct acatccaaat gtgcaccgaa ctcaaactca 180 gtgattatga gggacggttg atccaaaaca gcttaacaat agagagaatg gtgctctctg 240 cttttgacga aaggagaaat aaataccttg aagaacatcc cagtgcgggg aaagatccta 300 agaaaactgg aggacctata tacaggagag taaacggaaa gtggatgaga gaactcatcc 360 tttatgacaa agaagaaata aggcgaatct ggcgccaagc taataatggt gacgatgcaa 420 cggctggtct gactcacatg atgatctggc attccaattt gaatgatgca acttatcaga 480 ggacaagagc tcttgttcgc accggaatgg atcccaggat gtgctctctg atgcaaggtt 540 caactctccc taggaggtct ggagccgcag gtgctgcagt caaaggagtt ggaacaatgg 600 tgatggaatt ggtcagaatg atcaaacgtg ggatcaatga tcggaacttc tggaggggtg 660 agaatggacg aaaaacaaga attgcttatg aaagaatgtg caacattctc aaagggaaat 720 ttcaaactgc tgcacaaaaa gcaatgatgg atcaagtgag agagagccgg aacccaggga 780 atgctgagtt cgaagatctc acttttctag cacggtctgc actcatattg agagggtcgg 840 ttgctcacaa gtcctgcctg cctgcctgtg tgtatggacc tgccgtagcc agtgggtacg 900 actttgaaag ggagggatac tctctagtcg gaatagaccc tttcagactg cttcaaaaca 960 gccaagtgta cagcctaatc agaccaaatg agaatccagc acacaagagt caactggtgt 1020 ggatggcatg ccattctgcc gcatttgaag atctaagagt attaagcttc atcaaaggga 1080 cgaaggtgct cccaagaggg aagctttcca ctagaggagt tcaaattgct tccaatgaaa 1140 atatggagac tatggaatca agtacacttg aactgagaag caggtactgg gccataagga 1200 ccagaagtgg aggaaacacc aatcaacaga gggcatctgc gggccaaatc agcatacaac 1260 ctacgttctc agtacagaga aatctccctt ttgacagaac aaccattatg gcagcattca 1320 atgggaatac agaggggaga acatctgaca tgaggaccga aatcataagg atgatggaaa 1380 gtgcaagacc agaagatgtg tctttccagg ggcggggagt cttcgagctc tcggacgaaa 1440 aggcagcgag cccgatcgtg ccttcctttg acatgagtaa tgaaggatct tatttcttcg 1500 gagacaatgc agaggagtac gacaattaaa gaaaaat 1537 <210> 11 <211> 1000 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 11 gtagatattg aaagatgagt cttctaaccg aggtcgaaac gtacgtactc tctatcatcc 60 cgtcaggccc cctcaaagcc gagatcgcac agagacttga agatgtcttt gcagggaaga 120 acaccgatct tgaggttctc atggaatggc taaagacaag accaatcctg tcacctctga 180 ctaaggggat tttaggattt gtgttcacgc tcaccgtgcc cagtgagcga ggactgcagc 240 gtagacgctt tgtccaaaat gcccttaatg ggaacgggga tccaaataac atggacaaag 300 cagttaaact gtataggaag ctcaagaggg agataacatt ccatggggcc aaagaaatct 360 cactcagtta ttctgctggt gcacttgcca gttgtatggg cctcatatac aacaggatgg 420 gggctgtgac cactgaagtg gcatttggcc tggtatgtgc aacctgtgaa cagattgctg 480 actcccagca tcggtctcat aggcaaatgg tgrcaacaac caatccacta atcagacatg 540 agaacagaat ggttttagcc agcactacag ctaaggctat ggagcaaatg gctggatcga 600 gtgagcaagc agcagaggcc atggaggttg ctattcgggc taggcaaatg gtgcaggcaa 660 tgagaaccat tgggactcat cctagctcca gtgctggtct gaaaaatgat cttcttgaaa 720 atttgcaggc ctatcagaaa cgaatggggg tgcagatgca acggttcaag tgatcctctc 780 attattgcct caartatcat tgggatcttg cacttgayat tgtggattct tgatcgtctt 840 tttttcaaat gcatttaccg tctctttaaa tacggtttga aaagagggcc ttctacggaa 900 ggagtgccaa agtctatgag ggaagaatat caaaaggaac agcagagtgc tgtggatgct 960 gacgatggtc attttgtcag catagagctg gagtaaaaaa 1000 <210> 12 <211> 861 <212> RNA <213> Influenza A virus <400> 12 tgacaaaaac ataatggatc caaacactgt gtcaagcttt caggtagatt gctttctttg 60 gcatgtccgc aaacgagttg cagaccaaga actaggtgat gccccattcc ttgatcggct 120 tcgccgagat cagaaatccc taagaggaag gggcagtact ctcggtctgg acatcaagac 180 agccacacgt gctggaaagc agatagtgga gcggattctg aaagaagaat ccgatgaggc 240 acttaaaatg accatggcct ctgtacctgc gtcgcgttac ctaactgaca tgactcttga 300 ggaaatgtca agggactggt ccatgctcat acccaagcag aaagtggcag gccctctttg 360 tatcagaatg gaccaggcga tcatggataa gaacatcata ctgaaagcga acttcagtgt 420 gatttttgac cggctggaga ctctaatatt gctaagggct ttcaccgaag agggagcaat 480 tgttggcgaa atttcaccat tgccttctct tccaggacat actgctgagg atgtcaaaaa 540 tgcagttgga gtcctcatcg gaggacttga atggaatgat aacacagttc gagtctctga 600 aactctacag agattcgctt ggagaagcag taatgagaat gggagacctc cactcactcc 660 aaaacagaaa cgagaaatgg cgggaacaat taggtcagaa gtttgaagaa ataagatggt 720 tgattgaaga agtgagacac aaactgaaga taacagagaa tagttttgag caaataacat 780 ttatgcaagc cttacatcta ttgcttgaag tggagcaaga gataagaact ttctcgtttc 840 agcttattta gtactaaaaa a 861 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA1F <400> 13 tccgaagttg ggggggatgg aggcagta 28 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub HA F <400> 14 tcaacggtca acaaggaaga attaattatt attg 34 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub HA R <400> 15 taattcttcc ttgttgaccg ttgacaagag 30 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA R <400> 16 gggccgccgg gttattttat atacaaatgt tgc 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2-1F <400> 17 tccgaagttg ggggggagca aaagcaggag 30 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2-1413R <400> 18 gggccgccgg gttattagta gaaacaagga gt 32 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-PB2-1F <400> 19 tccgaagttg ggggggagcg aaagcaggtc 30 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-PB2-2341R <400> 20 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggt cg 32 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-PB1-1F <400> 21 tccgaagttg ggggggagcg aaagcaggca 30 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-PB1-2341R <400> 22 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggc at 32 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-PA-1F <400> 23 tccgaagttg ggggggagcg aaagcaggta 30 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-PA-2233R <400> 24 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggt ac 32 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-NP-1F <400> 25 tccgaagttg ggggggagca aaagcagggt 30 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-NP-1565R <400> 26 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggg ta 32 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-M-1F <400> 27 tccgaagttg ggggggagca aaagcaggta 30 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-M-1027R <400> 28 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggt ag 32 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-NS-1F <400> 29 tccgaagttg ggggggagca aaagcagggt 30 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phw-NS-890R <400> 30 gggccgccgg gttattagta gaaacaaggg tg 32

Claims

다음의 단계를 포함하는 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법:
(a) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 HA(hemagglutinin) 유전자 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 NA(neuraminidase) 유전자를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
(b) 서열번호 7 내지 12의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b)의 재조합 플라스미드를 패키징 세포(packaging cell)에 트랜스펙션(transfection)하는 단계; 및
(d) 패키징 세포의 배양 상층액으로부터 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 수득하는 단계.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 HA의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 234번 내지 236번에 위치하는 아미노산 Leu-Met-Gly이 Gln-Gln-Gly으로 치환된 것인, H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 700번에서 705번에 위치하는 뉴클레오타이드 TTGATG가 CAACAA로 치환된 것인, H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 패키징 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분리된 세포인 것인, H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는, H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스:
(i) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 HA(hemagglutinin) 유전자;
(ii) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 NA(neuraminidase) 유전자; 및
(iii) 서열번호 7 내지 12의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자.
제 8 항에 있어서, 상기 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 HA의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 234번 내지 236번에 위치하는 아미노산 Leu-Met-Gly이 Gln-Gln-Gly으로 치환된 것인, H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스.
제 8 항에 있어서, 상기 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 700번에서 705번에 위치하는 뉴클레오타이드 TTGATG가 CAACAA로 치환된 것인, H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스.
삭제
하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는, Y280계열 H9N2 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물:
(i) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 HA(hemagglutinin) 유전자;
(ii) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 Y280계열 H9N2형 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/chicken/Korea/LBM314/2020 유래 NA(neuraminidase) 유전자; 및
(iii) 서열번호 7 내지 12의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자.
삭제
삭제
제 12 항에 있어서, 상기 백신 조성물 내 Y280계열 H9N2형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화 된 것인, 백신 조성물.