KR101788236B1 - 무병원성 및 고면역원성 인플루엔자 바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 무병원성 및 고면역원성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 상기 바이러스 제조용 조성물, 상기 바이러스 제조방법, 상기 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신, 및 상기 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

무병원성 및 고면역원성 인플루엔자 바이러스 {AVIRULENT AND HIGHLY IMMUNOGENIC INFLUENZA VIRUS}
본 발명은 무병원성 및 고면역원성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 상기 바이러스 제조용 조성물, 상기 바이러스 제조방법, 상기 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신, 및 상기 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M1, M2), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2 (polymerase subunit A, B1 & B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.
조류 인플루엔자 바이러스는 닭에 대한 병원성에 따라 저병원성 조류 인플루엔자와 고병원성 조류 인플루엔자로 분류되는데 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스로는 H5와 H7 아형의 바이러스가 알려져 있으며 이들 바이러스의 고병원성은 HA 단백질의 cleavage site의 반복되는 염기성 단백질 때문인 것으로 알려져 있다. 즉 HA 단백질의 활성화를 위해 단백분해효소에 의해 HA1과 HA2로 절단되어야 하는데 cleavage site에 염기성 아미노산이 반복되는 경우 모든 장기에 분포하는 퓨린 유사 내인성 단백분해효소(furin-like endogenous protease)에 의해 HA 단백질이 활성화 되므로 바이러스 증식이 일어나며 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 트립신(trypsin)과 같은 외인성 단백분해효소에 의해서만 활성화 되므로 호흡기나 소화기에서만 활성화되어 국소감염만 일어나게 된다.
이러한 고병원성 조류인플루엔자 바이러스는 가금의 급성 폐사 뿐 아니라 인체 감염 시 사망에 이르는 치명적인 바이러스로, 특히 돼지에서의 적응과정 없이 조류에서 사람으로 직접 감염되어 발생한 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 1997년 H5N1으로 인해 홍콩에서 18명의 사람이 감염되어 그 중 6명이 사망하고 이후 2003년 말 아시아에서 시작되어 유럽과 아프리카로 확산 되었으며, 2003년부터 2011년 10월 10일 현재까지 WHO에 보고된 확진 된 사람 감염예는 총 566 명으로 그중 332명이 사망하여 58.7%의 사망률을 보이고 있고, 이집트, 인도네시아, 캄보디아에서는 처음 발생한 이후로 매년 감염사례가 보고되고 있어 전 세계적으로 공포의 대상이 되고 있다(WHO/GIP). 특히 중국에서 발생한 저병원성 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 사람의 사망 사례는 가금의 급성 폐사라는 전조 없이 사람에 치명적인 조류인플루엔자 바이러스가 전염될 수 있음을 의미하므로 포유류 병원성 저병원성 조류인플루엔자바이러스에 대한 대비가 필요하다.
과거 인체 A형 인플루엔자 백신은 계태아 증식성이 탁월한 재배열 주를 포르말린으로 불활성화 하여 HA와 NA만을 정제한 단위 백신으로, 항원 생산성 향상을 위해 최신 유행하는 인체 인플루엔자 바이러스와 발육란 증식성이 탁월한 것으로 알려진 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)을 혼합 감염시켜 제조되었다.
최근에는, 역 유전학 기술을 사용하여 계태아 증식성이 탁월하며 특성이 잘 알려진 PR8 바이러스나 A/WSN/33(H1N1) 바이러스나 저온 적응시켜 약독화 시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스 등의 8개 게놈을 바이러스 게놈 전사벡터에 클로닝하고, PA, PB1, PB2, NP 코딩 부분을 발현하는 벡터에 클로닝 하여 12개 플라스미드(특허 제0908757호)를 293T 등의 세포주에 형질주입(transfection)하여 원하는 바이러스를 작출하거나 벡터의 한 방향으로 바이러스 게놈 전사가 일어나고, 다른 방향으로는 mRNA가 만들어지는 8개의 플라스미드를 trnasfection (특허 제0862758호)시켜 재조합 바이러스를 작출하고 있으며, 통상적으로 HA와 NA 유전자는 최근 유행하는 바이러스로부터 PCR 법으로 증폭하여 역 유전학 벡터에 클로닝하고, PR8의 나머지 유전자 6개와 함께 transfection 하여 백신주를 작출하며 바이러스를 불활화하여 사독백신을 제조하고 있다.
또한, H5N1 바이러스의 위협에 대처하기 위한 백신주 개발은 고병원성 H5N1 바이러스의 병원성을 약화시키고, 계태아나 세포주에서의 증식성을 증가시키는 방향으로 이루어졌다. 초기에는 야외에서 분리된 저병원성 H5N1 바이러스를 그대로 사독백신으로 개발하는 연구가 이루어졌으나 낮은 바이러스 역가와 잠재적인 위험성으로 역 유전학 기술을 사용하여 고병원성 H5N1 바이러스의 병원성과 관련된 HA 단백질 cleavage site의 아미노산 서열을 저병원성 바이러스의 서열로 치환한 H5N1 바이러스의 HA 및 NA와 계태아나 세포주에서 증식성이 좋고, 병원성이 낮은 바이러스의 나머지 내부유전자를 갖도록 재조합 백신주를 개발하고 있다.
PR8 바이러스는 마우스에 대한 병원성이 잔존하고 있어 역 유전학 기법으로 작출한 바이러스는 생독백신으로 사용할 수 없는데, PR8 바이러스의 backbone을 사용하지만 NS1 유전자를 결손 시킨 후, NS1 유전자가 없어도 바이러스 증식이 가능한 vero 세포에서 증식시키거나 (Virology 1998, 252:324-330; PLoS one 2009,4(6):e5984], A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)(KBNP-0028), 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 NS 게놈분절로 PR8 바이러스의 NS 게놈분절을 교체하여 재조합 PR8 바이러스를 약독화시키거나 (특허 제1426407호), A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(01310) 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 PB2 게놈분절로 PR8의 PB2 게놈분절을 교체하여 재조합 PR8 바이러스를 약독화시키거나 (특허 제 1423695호),저온에서 적응시켜 병원성을 감소시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스의 6개 유전자를 사용하거나(Virology 2003, 306:18-24; Journal of Virology 2010, 84:44-51) 저온 적응시킨 A/turkey/OH/313053/04(H3N2) 바이러스의 PB1 유전자에 HA 유전자 유래의 염기서열을 삽입하여 약독화 시키고 있다 (Journal of Virology 2011, 85:456-459).
생독백신은 낮은 역가의 바이러스를 접종해도 생체에서 증식하며 면역을 형성시킬 수 있지만, 저온 적응주를 기반으로 제작된 백신주의 생산성이 PR8 대비 현저히 낮은 단점이 있다. 따라서 사독백신의 경우 마우스에 대한 병원성은 잔존하더라도 기존 PR8 바이러스 내부 유전자를 치환하거나 백신 바이러스의 HA 및 NA의 아미노산에 돌연변이를 주어 계태아에서의 증식성을 개선하거나(Vaccine 2010, 28:8008-8014; Vaccine 2011, 29:5153-5162; Vaccine 2011, 29:8032-8041), 계태아 병원성을 줄인 바이러스 제작 기술 개발이 이루어졌다(Archives of Virology 2011, 156:557-563).
저증식성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스인 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/2010 (H5N1)(이하 SNU50-5-E2)를 발육란(계태아)에서 18회 계대하여 고증식성 H5N1 바이러스인 SNU50-5-E20이 확립되었고, SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20의 전체 게놈 서열을 비교하여, 계태아에서의 증식성과 관련된 HA 아미노산 서열과 NA 아미노산 서열이 동정되었고, PR8 바이러스 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 SNU50-5-E20의 HA 및 NA를 갖는 발육란 고증식성 재조합 바이러스(rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)가 개발되어 있다 (특허 제 1361773호; 특허 제 1361774호).
이에, 본 발명자들은 SNU50-5-E20 바이러스의 HA 및 NA 단백질을 포함하는 발육란 고증식성 재조합 바이러스(rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA))의 마우스 병원성을 확인하였고, rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)의 PR8 바이러스 유래 NS 게놈 분절을 0028 바이러스 유래 NS 게놈분절로 치환한 재조합 바이러스(HN(E20)-NS(0028))을 제작하여 마우스 무병원성을 확인하였으며, 생독백신으로써의 효능을 알아보기 위해 상기 재조합 바이러스(HN(E20)-NS(0028))를 접종하고 2주 후에 모바이러스인 50-5-E20를 공격접종하고, 3주 후에 고병원성 H5N1, A/mandarin duck/Korea/K10-483/2010(H5N1)(K10-483)을 공격접종한 결과 대조군 대비 유의적인 방어효능을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일례는 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 혈구응집 단백질(hemagglutinin; 이하, HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 뉴라미니다제 (neuraminidase, 이하, NA) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(nonstructural protein; 이하, NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(이하, PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B2(이하, PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(이하, PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(이하, NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 매트릭스 단백질(이하, M) 코딩 폴리뉴클레오타이드;를 포함하는 발육란 고증식성 및 무병원성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 HA 단백질 및 NA 단백질; 저병원성 조류인플루엔자의 NS 단백질; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의, 중합효소 B1(PB1), 중합효소 B2(PB2), 중합효소 A(PA), 뉴클레오캡시드(NP) 및 매트릭스 단백질(M);을 포함하는 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 저병원성 조류인플루엔자의 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;를 포함하는 형질전환용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일례는 상기 형질전환용 조성물로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조방법을 제공한다.
본 발명은 무병원성 및 고면역원성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 상기 바이러스 제조용 조성물, 상기 바이러스 제조방법, 상기 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신, 및 상기 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일례는 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 혈구응집 단백질(hemagglutinin; 이하, HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 뉴라미니다제 (neuraminidase, 이하, NA) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(nonstructural protein; 이하, NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(이하, PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B2(이하, PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(이하, PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(이하, NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 매트릭스 단백질(이하, M) 코딩 폴리뉴클레오타이드;를 포함하는 발육란 고증식성 및 무병원성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물에 관한 것이다.
상기 HA 단백질은 서열번호 1 내지 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 16 내지 30으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 NA 단백질은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 NS 단백질은 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소 B1(PB1)은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 42의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소 B2(PB2)은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 43의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소 A(PA)는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 44의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 뉴클레오캡시드(NP)는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 45의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 46의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기의 실질적인 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.
상기 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체는 SNU50-5-E20일 수 있으며, 예를 들어, 기탁번호 KCTC 12076BP의 재조합 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스일 수 있다. 상기 변이체는 저증식성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스인 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/2010 (H5N1)(이하 SNU50-5-E2)를 발육란(계태아)에서 18회 계대하여 고증식성 H5N1 바이러스인 SNU50-5-E20이 확립한 것이다.
또한, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스(이하, 'PR8 바이러스'로 칭함; NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)일 수 있으며, H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 백신주 제작에 널리 사용되는 바이러스이다.
상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)(등록특허 제0708593호, 이하, 'KBNP-0028')이며, 상기 KBNP-0028 균주는 등록특허 제0708593호의 실시예 1에서와 같이 분리된 국내 분리주로서 저병원성이고, 현재 특허균주 기탁기관인 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치하는 유전자은행에 2005년 10월 26일자로 기탁하여 보관중이다(KCTC 10866BP).
본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 혈구응집 단백질(HA) 및 뉴라미니다제 (NA) 단백질; 저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(NS); 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의, 중합효소 B1(PB1), 중합효소 B2(PB2), 중합효소 A(PA), 뉴클레오캡시드(NP) 및 매트릭스 단백질(M);을 포함하는 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다.
상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는, H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 혈구응집 단백질(hemagglutinin; 이하, HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 뉴라미니다제 (neuraminidase, 이하, NA) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(nonstructural protein; 이하, NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(이하, PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B2(이하, PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(이하, PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(이하, NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 매트릭스 단백질(이하, M) 코딩 폴리뉴클레오타이드;를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 HA 단백질은 서열번호 1 내지 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 16 내지 30으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 NA 단백질은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 NS 단백질은 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소 B1(PB1)은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 42의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소 B2(PB2)은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 43의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소 A(PA)는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 44의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 뉴클레오캡시드(NP)는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 45의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 46의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 HA 단백질 또는 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기한 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기의 실질적인 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.
상기 각각의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 및/또는 RNA의 형태로 포함된 것일 수 있다. RNA의 형태로 포함된 것인 경우에는 본 명세서에 기재된 DNA 서열에 포함된 염기 중 T가 U로 치환된 형태로 포함된 것일 수 있다.
상기 H5N1 바이러스, H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 및 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 상기 기재한 바와 동일하다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스는 병원성이 없어서 안전하며, 고면역원성을 가지는바, 효과 좋은 인플루엔자 바이러스 백신 제작에 매우 유용하며, 특히 우수한 안전성으로 인하여 생독백신 뿐만 아니라 진단용 항원으로써도 사용 가능하다.
상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 대전에 소재하는 생명공학연구원 유전자원센터에 2014년 12월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC12734BP 를 부여 받았다.
본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;를 포함하는 형질전환용 조성물에 관한 것이다.
상기 각각의 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 각각의 벡터에 포함되어 총 8개의 벡터에 나누어져 포함된 것일 수 있으며, 또는 하나의 벡터에 2종 이상의 상기 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 포함된 것일 수 있으며, 예들 들어, 상기 8종의 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 1개의 벡터에 모두 포함된 것일 수도 있다.
상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 일례는 상기 형질전환용 조성물로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
상기 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15 및 ST1 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포이면 사용 가능하다.
본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신에 관한 것이다.
상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스(HN(E20)-PB2(01310))의 생독백신으로써의 효능을 알아보기 위해, 상기 재조합 바이러스(HN(E20)-NS(0028))를 접종하고 2주 후에 모바이러스인 50-5-E20를 공격접종하고, 3주 후에 고병원성 H5N1, A/mandarin duck/Korea/K10-483/2010(H5N1)(K10-483)을 공격접종한 결과 대조군 대비 유의적인 방어효능을 확인하였다 (실시예 참조).
따라서, 상기 백신은 면역원성이 우수할 뿐 아니라, 마우스를 비롯한 포유류 외에도 조류에 대해서도 병원성이 없기 때문에, 사독백신뿐 아니라 생독백신으로도 사용 가능하다.
또한, 상기 백신은 닭과 오리 등의 조류뿐 아니라 인간, 돼지, 개, 마우스, 말, 고양이, 소, 면양, 산양, 낙타 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다.
본 발명의 또 다른 일례는 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 진단 대상은 조류 또는 포유류일 수 있으며, 예를 들어, 인간을 제외한 포유류 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은 제조된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 무병원성 및 고면역원성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 상기 바이러스 제조용 조성물, 상기 바이러스 제조방법, 상기 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신, 및 상기 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 병원성이 없어서 안전하며, 고면역원성을 가지는바, 효과 좋은 인플루엔자 바이러스 백신 제작에 매우 유용하며, 특히 우수한 안전성으로 인하여 생독백신 뿐만 아니라 진단용 항원으로써도 사용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 HN(E20)과 HN(E20)-NS(0028)의 BALB/c 마우스 병원성을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 HN(E20)-NS(0028) 106 EID50/ml 을 BALB/c 마우스에 접종한 후 2주 후에 모 바이러스인 SNU50-5-E2를 공격하여 체중의 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 HN(E20)-NS(0028) 106 EID50/ml 을 BALB/c 마우스에 접종한 후 2주 후에 모 바이러스인 SNU50-5-E2를 공격하여 폐사율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 HN(E20)-NS(0028) 104 EID50/ml 을 BALB/c 마우스에 접종한 후 2주 후에 모 바이러스인 SNU50-5-E2를 공격하여 체중의 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 HN(E20)-NS(0028) 104 EID50/ml 을 BALB/c 마우스에 접종한 후 2주 후에 모 바이러스인 SNU50-5-E2를 공격하여 폐사율을 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 바이러스 제작
재조합 인플루엔자 바이러스 제작을 위하여, 호프만 박사의 역유전학 벡터시스템(특허 제0862758호)을 사용하였다.
구체적으로, 각각 SNU50-5-E20 바이러스의 HA 단백질을 코딩하는 유전자와 NA 단백질을 코딩하는 유전자 절편이 클로닝된 호프만 벡터(특허 제 1361773호; 특허 제 1361774호), 0028 바이러스의 NS 단백질을 코딩하는 유전자 절편이 클로닝된 호프만 벡터(특허 제 1426407호), 각각 PR8 바이러스의 PB1 단백질, PB2 단백질, PA 단백질, NP 단백질 및 M 단백질을 코딩하는 유전자 절편이 클로닝된 호프만 벡터 (St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공 받은 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW195-NP, 및 pHW197-M 역유전학용 플라스미드(Vaccine 2002, 20:3165-3170; pHW2000 (등록특허 제10-0862758호 참조)) 플라스미드를 준비하였다.
그 다음, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X106개/2ml 부유하여 각 웰에 첨가한 후 3 내지 4시간 동안 부탁시키고, 배지를 제거한 후 Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.
그 다음, 상기 준비된 플라스미드 8개를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각 300ng씩의 양으로 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 plus reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다.
그 다음, lipofectamine 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 상기 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다. 얻어진 반응 생성물을 상기 293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕를 첨가하였다. 그 다음, 6-웰 배양용기를 5% CO2, 37에서 20시간 배양한 후 웰당 트립신 10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가하고, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발육란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 그 다음, 상기 접종된 발육란을 37에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집 여부를 확인한 결과 모두 혈구응집 양성을 보였다. 이 재조합 바이러스의 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스를 -70에서 보관하며 실험에 사용하였다.
상기 재조합 바이러스(HN(E20)-NS(0028))는 대전에 소재하는 생명공학연구원 유전자원센터에 2014년 12월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC12734BP를 부여 받았다.
실시예 2. 계태아에서의 바이러스 특성 평가( 역가 측정)
상기의 재조합 바이러스의 계태아에서의 증식역가 (50% embryo infection dose, EID50/ml)를 측정하기 위하여, 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 10-1 내지 10-9까지 10진 희석하여, 각 희석 배수 별로 10 내지 11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강 경로로 100㎕씩 접종하고 3일간 배양하였다. 그 다음, 요막액을 수확하여 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하여 Reed-Muench 계산식에 따라 바이러스 역가(EID50/ml)를 측정하고, 얻어진 바이러스 역가(EID50/ml(log10))를 하기의 표 1에 나타내었다.
재조합 바이러스 EID50/ml(log10)
HN(E20) 9.2±0.2
HN(E20)-NS(0028) 8.4±0.2
상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 바이러스 역가(EID50/ml(log10))를 살펴보면, HN(E20)(SNU50-5-E20 접종군)의 경우 109.2, HN(E20)-NS(0028)(실시예)의 경우 108.4 EID50/ml을 보여서, HN(E20)-NS(0028)은 HN(E20) 대비 약간 낮은 계태아 증식성을 보임을 확인하였다.
실시예 3. 마우스 병원성 측정
상기 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 각각 10진 희석하여 졸레틸(Virbac S.A., France) 15mg/kg로 마취한 BALB/C 마우스(6주령 암컷, 주식회사 코아텍) 5수에 비강으로 각각 106 EID50를 접종하였다. 그 후, 매일 폐사 유무를 조사하였고, 체중을 측정하여 체중 변화를 도 1에 나타내었으며, 체중이 25% 감소 한 경우 폐사한 것으로 간주하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 폐사율은 HN(E20)은 100%이고, HN(E20)-NS(0028)과 대조군(바이러스 대신 인산완충용액 접종)에서는 폐사율이 0% 였고, HN(E20)-NS(0028) 접종 마우스에서는 체중의 감소가 관찰되지 않았다.
실시예 4: 방어 효능 평가
4-1. 저병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스 방어 효능 평가
HN(E20)-NS(0028)의 생독백신으로써의 효능을 알아보기 위해 HN(E20)-NS(0028)을 졸레틸(Virbac S.A., France) 15mg/kg로 마취한 BALB/C 마우스(6주령 암컷, 주식회사 코아텍) 5수에 비강으로 각각 106 EID50/ml과 104 EID50/ml을 접종 하였고, 2주 후에 106 EID50/ml의 SNU50-5-E2(저병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스; 서울대학교 수의학과 김재홍 교수님 실험실에서 입수)로 공격접종 한 후 14일간 매일 체중을 측정하여 체중 변화를 도 2 내지 5에 나타내었으며, 체중이 25% 감소 한 경우 폐사한 것으로 간주하였다.
도 2 및 3에 나타낸 바과 같이, 106 EID50/ml의 HN(E20)-NS(0028)을 접종한 경우 관찰기간 동안 음성 대조군(mock, PBS 접종) 대비 체중의 변화가 전혀 관찰되지 않았고, 폐사도 없었으나, SNU50-5-E2 접종군 (HN(E20))은 6일 이내에 모두 25% 이상의 체중 감소가 관찰되어 100% 폐사율을 보였다.
한편, 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이 104 EID50/ml의 HN(E20)-NS(0028)을 접종한 경우 접종 후 3일과 4일에 음성 대조군(mock, PBS 접종) 대비 10%의 체중 변화가 관찰되었으나 유의적이지 않았고(P>0.05), 이후 정상 체중으로 회복되는 것을 확인하였다. SNU50-5-E2 접종군은 6일 이내에 모두 25% 이상의 체중 감소가 관찰되어 100% 폐사율을 보였다. 따라서, HN(E20)-NS(0028)은 SNU50-5-E2 공격을 효과적으로 방어하여 생독백신으로써의 효능이 확인되었다.
4-2. 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스 방어 효능 평가
HN(E20)-NS(0028)의 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스 방어 효능을 알아보기 위해, 상기 실시예 4-1과 같이 HN(E20)-NS(0028)을 BALB/c 마우스에 106 EID50/ml과 104 EID50/ml 을 접종한 후 3주 후에 K10-483(고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스; 건국대학교 수의학과 송창선 교수님 실험실에서 입수)을 공격접종 하였다. 14일간 매일 체중을 측정하여 체중 변화를 표 2에 나타내었으며, 체중이 25% 감소한 경우 폐사한 것으로 간주하였다.
재조합 바이러스 Virus titer (Log10 EID50/90ul) Mortality
HN(E20)-NS(0028) 6 0
4 0
Mock (PBS) 0 100
Negative control 0 0
표 2에 나타낸 바와 같이, HN(E20)-NS(0028) 106 EID50/ml과 104 EID50/ml 을 접종한 경우 모두25% 이상의 체중 변화가 관찰되지 않아 0%의 폐사율을 보였으나, PBS를 접종한 대조군 (mock)의 경우 100% 폐사율을 보였다. 바이러스를 공격하지 않은 음성 대조군의 경우 폐사가 전혀 일어나지 않았다. 따라서, HN(E20)-NS(0028)은 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스의 공격을 104 EID50/ml의 낮은 역가에서도 효과적으로 방어하여 생독백신으로써의 경제성과 효능이 있음을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12734BP 20141215
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> AVIRULENT AND HIGHLY IMMUNOGENIC INFLUENZA VIRUS <130> DPP20156134KR <150> KR 10-2014-0181876 <151> 2014-12-16 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence (1) of SNU50-5-E20 HA <400> 1 Met Glu Lys Ile Ala Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Asn Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Asp Ser Pro Ile Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Leu Ser Ser Thr Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser 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Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Ser Val Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Gly Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asp Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 370 375 380 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Arg Val Asn Ser Ile Ile Asp 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ccaaatttgc 60 attggttatc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaatgtt 120 actgtcacac atgcccaaga tatactggaa aagacacaca atggaaagct ctgcagtcta 180 aatggagtta agcctctcat cttgagggat tgcagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240 cccatgtgtg atgaattcct caatgtgccg gaatggtcct acatagtgga gaaggacagc 300 ccaatcaatg gcctctgcta cccaggggac ttcaacgact atgaggagct aaaacacttg 360 ttgagcagta caaaccattt tgagaaaatt caaatcattc ccaggagttc ttggtccaat 420 catgatgcct catcaggagt gagctccgca tgtccatata atgggaggtc ctcttttttc 480 agaaatgtgg tgtggctcat caaaaagaac aatgcatacc caacaataga aaggagttac 540 aataatacta atcaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgca 600 gcggagcaaa caaagctcta tcaaaaccca accacttacg tttctgttgg gacatcaaca 660 ttgaaccaga gatcggtccc agaaatagct accaggccca aagtgaacgg gcaaagtgga 720 agaatggagt ttttctggac aatcttaaag ccaaatgatg ctatcaattt cgagagtaat 780 gggaatttta ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaaggaga ctcagcaatc 840 atgaaaagtg gactggagta tggtaactgc aataccaagt gccaaactcc aatgggtgca 900 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tctatctttc tggatgtgct ccaatggatc attgcaatgc 1680 aggatttgca tttaa 1695 <210> 31 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of SNU50-5-E20 NA <400> 31 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val 1 5 10 15 Ile Gly Ile Ala Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile 20 25 30 Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln Tyr Gln Pro Glu Pro 35 40 45 Cys Asn Gln Ser Ile Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln 50 55 60 Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Phe Leu Thr Glu Gln Ala Val 65 70 75 80 Thr Ser Val Ala Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Ser Gly 85 90 95 Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly 100 105 110 Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu 115 120 125 Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His 130 135 140 Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser 145 150 155 160 Cys Pro Val Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser 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taactcaggg agctctgttg 420 aatgacaagc attctaatgg aaccgtcaaa gatagaagcc cttacagaac cttaatgagt 480 tgtcccgtgg gtgaggctcc ttctccatat aactcaaggt ttgagtcagt tgcttggtcg 540 gcaagtgctt gtcatgatgg catcagttgg ttgacaattg gaatttctgg tccagacaat 600 ggggctgtgg ctgtgttgaa atacaatggc ataataacag acactatcaa gagttggagg 660 aacaacattt tgagaaccca agaatctgaa tgtgcatgtg taaatggctc ttgctttact 720 gtaatgactg atggaccaag taatgggcag gcttcatata aaatcttcaa gatagaaaaa 780 ggaaaagtag tcaaatcagt tgaattgaat gctcctaatt atcactacga ggaatgctcc 840 tgttatcctg atgcaggcaa aatcatgtgt gtatgtaggg ataactggca tggctcaaat 900 cggccgtggg tgtctttcaa ccaaaatctg gaatatcaaa taggatatat atgcagtgga 960 attttcgggg acaatccacg ccccaatgat ggaacaggca gttgcggtcc ggtgtcctct 1020 aatggggcat atggagtaaa agggttttca ttcaaatacg gtaatggtgt ttggatcgga 1080 agaacaaaaa gcactagttc cagaaatggt tttgagatga tttgggatcc gaatgggtgg 1140 actgaaacgg acagtagctt ctcagtaaag caagacatcg tagcaataac tgactggtca 1200 ggatatagtg ggagttttgt ccagcatcca gaattaacag gattagattg catgagacct 1260 tgtttctggg ttgagctaat cagagggcgg cccaaagaaa atacaatttg gactagtggg 1320 agcagcatat ccttttgtgg tgtagatagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1380 gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag 1410 <210> 33 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence (1) of 0028 NS <400> 33 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Gly Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Phe Lys Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Val Ala Ser Val Pro Ala Thr Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala 100 105 110 Gly Ser Leu Cys Ile Lys Ile Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Thr Ile 115 120 125 Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Thr Phe Gly Arg Leu Glu Thr Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe 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Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ile Thr Gly 290 295 300 Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Met Phe Leu Ala 305 310 315 320 Met Ile Thr Tyr Met Thr Arg Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val 325 330 335 Leu Ser Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile 355 360 365 Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Asp Ser 370 375 380 Thr Arg Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Ile Glu Gly Thr 385 390 395 400 Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser 405 410 415 Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala 435 440 445 Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp 450 455 460 Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys 465 470 475 480 Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe 485 490 495 Tyr 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of PR8 PA <400> 39 Met Glu Asp Phe Val Arg Gln Cys Phe Asn Pro Met Ile Val Glu Leu 1 5 10 15 Ala Glu Lys Thr Met Lys Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Lys Ile Glu Thr 20 25 30 Asn Lys Phe Ala Ala Ile Cys Thr His Leu Glu Val Cys Phe Met Tyr 35 40 45 Ser Asp Phe His Phe Ile Asn Glu Gln Gly Glu Ser Ile Ile Val Glu 50 55 60 Leu Gly Asp Pro Asn Ala Leu Leu Lys His Arg Phe Glu Ile Ile Glu 65 70 75 80 Gly Arg Asp Arg Thr Met Ala Trp Thr Val Val Asn Ser Ile Cys Asn 85 90 95 Thr Thr Gly Ala Glu Lys Pro Lys Phe Leu Pro Asp Leu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Lys Glu Asn Arg Phe Ile Glu Ile Gly Val Thr Arg Arg Glu Val His 115 120 125 Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile Lys Ser Glu Lys Thr His 130 135 140 Ile His Ile Phe Ser Phe Thr Gly Glu Glu Met Ala Thr Lys Ala Asp 145 150 155 160 Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Ser Arg Ala Arg Ile Lys Thr Arg Leu Phe 165 170 175 Thr Ile Arg Gln Glu Met Ala Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ser Phe Arg 180 185 190 Gln Ser Glu Arg 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agaaatgggg 540 atcacaactc attttcagag aaagagacgg gtgagagaca atatgactaa gaaaatgata 600 acacagagaa caatgggtaa aaagaagcag agattgaaca aaaggagtta tctaattaga 660 gcattgaccc tgaacacaat gaccaaagat gctgagagag ggaagctaaa acggagagca 720 attgcaaccc cagggatgca aataaggggg tttgtatact ttgttgagac actggcaagg 780 agtatatgtg agaaacttga acaatcaggg ttgccagttg gaggcaatga gaagaaagca 840 aagttggcaa atgttgtaag gaagatgatg accaattctc aggacaccga actttctttc 900 accatcactg gagataacac caaatggaac gaaaatcaga atcctcggat gtttttggcc 960 atgatcacat atatgaccag aaatcagccc gaatggttca gaaatgttct aagtattgct 1020 ccaataatgt tctcaaacaa aatggcgaga ctgggaaaag ggtatatgtt tgagagcaag 1080 agtatgaaac ttagaactca aatacctgca gaaatgctag caagcatcga tttgaaatat 1140 ttcaatgatt caacaagaaa gaagattgaa aaaatccgac cgctcttaat agaggggact 1200 gcatcattga gccctggaat gatgatgggc atgttcaata tgttaagcac tgtattaggc 1260 gtctccatcc tgaatcttgg acaaaagaga tacaccaaga ctacttactg gtgggatggt 1320 cttcaatcct ctgacgattt tgctctgatt gtgaatgcac ccaatcatga agggattcaa 1380 gccggagtcg acaggtttta tcgaacctgt aagctacttg gaatcaatat gagcaagaaa 1440 aagtcttaca taaacagaac aggtacattt gaattcacaa gttttttcta tcgttatggg 1500 tttgttgcca atttcagcat ggagcttccc agttttgggg tgtctgggat caacgagtca 1560 gcggacatga gtattggagt tactgtcatc aaaaacaata tgataaacaa tgatcttggt 1620 ccagcaacag ctcaaatggc ccttcagttg ttcatcaaag attacaggta cacgtaccga 1680 tgccatatag gtgacacaca aatacaaacc cgaagatcat ttgaaataaa gaaactgtgg 1740 gagcaaaccc gttccaaagc tggactgctg gtctccgacg gaggcccaaa tttatacaac 1800 attagaaatc tccacattcc tgaagtctgc ctaaaatggg aattgatgga tgaggattac 1860 caggggcgtt tatgcaaccc actgaaccca tttgtcagcc ataaagaaat tgaatcaatg 1920 aacaatgcag tgatgatgcc agcacatggt ccagccaaaa acatggagta tgatgctgtt 1980 gcaacaacac actcctggat ccccaaaaga aatcgatcca tcttgaatac aagtcaaaga 2040 ggagtacttg aggatgaaca aatgtaccaa aggtgctgca atttatttga aaaattcttc 2100 cccagcagtt catacagaag accagtcggg atatccagta tggtggaggc tatggtttcc 2160 agagcccgaa ttgatgcacg gattgatttc gaatctggaa ggataaagaa agaagagttc 2220 actgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atag 2274 <210> 43 <211> 2280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 PB2 <400> 43 atggaaagaa taaaagaact acgaaatcta atgtcgcagt ctcgcacccg cgagatactc 60 acaaaaacca ccgtggacca tatggccata atcaagaagt acacatcagg aagacaggag 120 aagaacccag cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagcagac 180 aagaggataa cggaaatgat tcctgagaga aatgagcaag gacaaacttt atggagtaaa 240 atgaatgatg ccggatcaga ccgagtgatg gtatcacctc tggctgtgac atggtggaat 300 aggaatggac caataacaaa tacagttcat tatccaaaaa tctacaaaac ttattttgaa 360 agagtcgaaa ggctaaagca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420 atacgtcgga gagttgacat aaatcctggt catgcagatc tcagtgccaa ggaggcacag 480 gatgtaatca tggaagttgt tttccctaac gaagtgggag ccaggatact aacatcggaa 540 tcgcaactaa cgataaccaa agagaagaaa gaagaactcc aggattgcaa aatttctcct 600 ttgatggttg catacatgtt ggagagagaa ctggtccgca aaacgagatt cctcccagtg 660 gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttgcatt tgactcaagg aacatgctgg 720 gaacagatgt atactccagg aggggaagtg aggaatgatg atgttgatca aagcttgatt 780 attgctgcta ggaacatagt gagaagagct gcagtatcag cagatccact agcatcttta 840 ttggagatgt gccacagcac acagattggt ggaattagga tggtagacat ccttaggcag 900 aacccaacag aagagcaagc cgtggatata tgcaaggctg caatgggact gagaattagc 960 tcatccttca gttttggtgg attcacattt aagagaacaa gcggatcatc agtcaagaga 1020 gaggaagagg tgcttacggg caatcttcaa acattgaaga taagagtgca tgagggatat 1080 gaagagttca caatggttgg gagaagagca acagccatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140 ttgattcagc tgatagtgag tgggagagac gaacagtcga ttgccgaagc aataattgtg 1200 gccatggtat tttcacaaga ggattgtatg ataaaagcag tcagaggtga tctgaatttc 1260 gtcaataggg cgaatcaacg attgaatcct atgcatcaac ttttaagaca ttttcagaag 1320 gatgcgaaag tgctttttca aaattgggga gttgaaccta tcgacaatgt gatgggaatg 1380 attgggatat tgcccgacat gactccaagc atcgagatgt caatgagagg agtgagaatc 1440 agcaaaatgg gtgtagatga gtactccagc acggagaggg tagtggtgag cattgaccgt 1500 tttttgagaa tccgggacca acgaggaaat gtactactgt ctcccgagga ggtcagtgaa 1560 acacagggaa cagagaaact gacaataact tactcatcgt caatgatgtg ggagattaat 1620 ggtcctgaat cagtgttggt caatacctat caatggatca tcagaaactg ggaaactgtt 1680 aaaattcagt ggtcccagaa ccctacaatg ctatacaata aaatggaatt tgaaccattt 1740 cagtctttag tacctaaggc cattagaggc caatacagtg ggtttgtaag aactctgttc 1800 caacaaatga gggatgtgct tgggacattt gataccgcac agataataaa acttcttccc 1860 ttcgcagccg ctccaccaaa gcaaagtaga atgcagttct cctcatttac tgtgaatgtg 1920 aggggatcag gaatgagaat acttgtaagg ggcaattctc ctgtattcaa ctataacaag 1980 gccacgaaga gactcacagt tctcggaaag gatgctggca ctttaactga agacccagat 2040 gaaggcacag ctggagtgga gtccgctgtt ctgaggggat tcctcattct gggcaaagaa 2100 gacaagagat atgggccagc actaagcatc aatgaactga gcaaccttgc gaaaggagag 2160 aaggctaatg tgctaattgg gcaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg gaaacgggac 2220 tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattag 2280 2280 <210> 44 <211> 2151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 P <400> 44 atggaagatt ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgattg tcgagcttgc ggaaaaaaca 60 atgaaagagt atggggagga cctgaaaatc gaaacaaaca aatttgcagc aatatgcact 120 cacttggaag tatgcttcat gtattcagat tttcacttca tcaatgagca aggcgagtca 180 ataatcgtag aacttggtga tccaaatgca cttttgaagc acagatttga aataatcgag 240 ggaagagatc gcacaatggc ctggacagta gtaaacagta tttgcaacac tacaggggct 300 gagaaaccaa agtttctacc agatttgtat gattacaagg agaatagatt catcgaaatt 360 ggagtaacaa ggagagaagt tcacatatac tatctggaaa aggccaataa aattaaatct 420 gagaaaacac acatccacat tttctcgttc actggggaag aaatggccac aaaggcagac 480 tacactctcg atgaagaaag cagggctagg atcaaaacca gactattcac cataagacaa 540 gaaatggcca gcagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg agaagagaca 600 attgaagaaa ggtttgaaat cacaggaaca atgcgtaagc ttgccgacca aagtctcccg 660 ccgaacttct ccagccttga aaattttaga gcctatgtgg atggattcga accgaacggc 720 tacattgagg gcaagctgtc tcaaatgtcc aaagaagtaa atgctagaat tgaacctttt 780 ttgaaaacaa caccacgacc acttagactt ccgaatgggc ctccctgttc tcagcggtcc 840 aaattcctgc tgatggatgc cttaaaatta agcattgagg acccaagtca tgaaggagag 900 ggaataccgc tatatgatgc aatcaaatgc atgagaacat tctttggatg gaaggaaccc 960 aatgttgtta aaccacacga aaagggaata aatccaaatt atcttctgtc atggaagcaa 1020 gtactggcag aactgcagga cattgagaat gaggagaaaa ttccaaagac taaaaatatg 1080 aagaaaacaa gtcagctaaa gtgggcactt ggtgagaaca tggcaccaga aaaggtagac 1140 tttgacgact gtaaagatgt aggtgatttg aagcaatatg atagtgatga accagaattg 1200 aggtcgcttg caagttggat tcagaatgag tttaacaagg catgcgaact gacagattca 1260 agctggatag agctcgatga gattggagaa gatgtggctc caattgaaca cattgcaagc 1320 atgagaagga attatttcac atcagaggtg tctcactgca gagccacaga atacataatg 1380 aagggagtgt acatcaatac tgccttgctt aatgcatctt gtgcagcaat ggatgatttc 1440 caattaattc caatgataag caagtgtaga actaaggagg gaaggcgaaa gaccaacttg 1500 tatggtttca tcataaaagg aagatcccac ttaaggaatg acaccgacgt ggtaaacttt 1560 gtgagcatgg agttttctct cactgaccca agacttgaac cacataaatg ggagaagtac 1620 tgtgttcttg agataggaga tatgcttata agaagtgcca taggccaggt ttcaaggccc 1680 atgttcttgt atgtgagaac aaatggaacc tcaaaaatta aaatgaaatg gggaatggag 1740 atgaggcgtt gcctcctcca gtcacttcaa caaattgaga gtatgattga agctgagtcc 1800 tctgtcaaag agaaagacat gaccaaagag ttctttgaga acaaatcaga aacatggccc 1860 attggagagt cccccaaagg agtggaggaa agttccattg ggaaggtctg caggacttta 1920 ttagcaaagt cggtattcaa cagcttgtat gcatctccac aactagaagg attttcagct 1980 gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaacctgga acctgggacc 2040 tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc tgattaatga tccctgggtt 2100 ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc cttacacatg cattgagtta g 2151 <210> 45 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 NP <400> 45 atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttac gaacagatgg agactgatgg agaacgccag 60 aatgccactg aaatcagagc atccgtcgga aaaatgattg gtggaattgg acgattctac 120 atccaaatgt gcaccgaact caaactcagt gattatgagg gacggttgat ccaaaacagc 180 ttaacaatag agagaatggt gctctctgct tttgacgaaa ggagaaataa ataccttgaa 240 gaacatccca gtgcggggaa agatcctaag aaaactggag gacctatata caggagagta 300 aacggaaagt ggatgagaga actcatcctt tatgacaaag aagaaataag gcgaatctgg 360 cgccaagcta ataatggtga cgatgcaacg gctggtctga ctcacatgat gatctggcat 420 tccaatttga atgatgcaac ttatcagagg acaagagctc ttgttcgcac cggaatggat 480 cccaggatgt gctctctgat gcaaggttca actctcccta ggaggtctgg agccgcaggt 540 gctgcagtca aaggagttgg aacaatggtg atggaattgg tcagaatgat caaacgtggg 600 atcaatgatc ggaacttctg gaggggtgag aatggacgaa aaacaagaat tgcttatgaa 660 agaatgtgca acattctcaa agggaaattt caaactgctg cacaaaaagc aatgatggat 720 caagtgagag agagccggaa cccagggaat gctgagttcg aagatctcac ttttctagca 780 cggtctgcac tcatattgag agggtcggtt gctcacaagt cctgcctgcc tgcctgtgtg 840 tatggacctg ccgtagccag tgggtacgac tttgaaaggg agggatactc tctagtcgga 900 atagaccctt tcagactgct tcaaaacagc caagtgtaca gcctaatcag accaaatgag 960 aatccagcac acaagagtca actggtgtgg atggcatgcc attctgccgc atttgaagat 1020 ctaagagtat taagcttcat caaagggacg aaggtgctcc caagagggaa gctttccact 1080 agaggagttc aaattgcttc caatgaaaat atggagacta tggaatcaag tacacttgaa 1140 ctgagaagca ggtactgggc cataaggacc agaagtggag gaaacaccaa tcaacagagg 1200 gcatctgcgg gccaaatcag catacaacct acgttctcag tacagagaaa tctccctttt 1260 gacagaacaa ccattatggc agcattcaat gggaatacag aggggagaac atctgacatg 1320 aggaccgaaa tcataaggat gatggaaagt gcaagaccag aagatgtgtc tttccagggg 1380 cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcagcgagcc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440 atgagtaatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtacga caattaa 1497 <210> 46 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 M <400> 46 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120 gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180 ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300 aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360 gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420 gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480 tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540 ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600 gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660 actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720 cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtga 759

Claims (31)

  1. H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 혈구응집(HA) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 뉴라미니다제(NA) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드;
    A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2) (기탁번호: KCTC10866BP)인 저병원성 조류인플루엔자의 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 비구조 단백질(NS) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드;
    를 포함하는 발육란 고증식성 및 무병원성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HA 단백질은 서열번호 1 내지 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 16 내지 30으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 NA 단백질은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 중합효소 B1(PB1)은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 42의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 중합효소 B2(PB2)은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 43의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 중합효소 A(PA)는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 44의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드(NP)는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드 는 서열번호 45의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 46의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체는 SNU50-5-E20(기탁번호: KCTC12046BP) 인 것인, 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스인 것인, 조성물.
  20. 삭제
  21. H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 혈구응집(HA) 단백질 및 뉴라미니다제(NA) 단백질;
    저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(NS) 단백질; 및
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1), 중합효소 B2(PB2), 중합효소 A(PA), 뉴클레오캡시드(NP) 및 매트릭스 단백질(M);
    을 포함하는 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스.
  22. 제21항에 있어서, 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는,
    H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 혈구응집(HA) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 뉴라미니다제(NA) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드;
    저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(NS) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드;
    를 추가로 포함하는 것인, 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스.
  23. 제21항에 있어서, 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는, 기탁번호 KCTC12734BP 바이러스인 것인, 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스.
  24. H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
    H5N1 바이러스의 발육란 고증식성 변이체의 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
    저병원성 조류인플루엔자의 비구조 단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
    H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
    를 포함하는 형질전환용 조성물.
  25. 제24항의 형질전환용 조성물로 형질전환된 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 세포.
  27. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신.
  28. 제27항에 있어서, 상기 백신은 생독백신인 것인, 백신.
  29. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
  30. 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 생성 유효량의 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제조방법은 제조된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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