KR20230101172A

KR20230101172A - 포유류 비병원성 및 발육란 고증식성 재조합 인플루엔자 바이러스

Info

Publication number: KR20230101172A
Application number: KR1020210191058A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 안세희; 홍승민
Original assignee: 주식회사 지나이너
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-07-06

Abstract

본 발명은 포유류 비병원성 및 발육란 고증식성을 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법과 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 제작하기 위한 재조합 벡터 및 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 아미노산 변이를 포함하는 중합효소 염기성 단백질 2(PB2)를 포함하며, 인체에 대한 비-병원성과 높은 면역원성, 그리고 발육란에서 높은 증식을 통해 우수한 생산성을 가져, 조류 인플루엔자 바이러스 백신주로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

포유류 비병원성 및 발육란 고증식성 재조합 인플루엔자 바이러스 {MAMMALIAN AVIRULENT AND EMBRYONATED EGG HIGHLY REPLICATIVE RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS}

본 발명은 포유류 비병원성 및 발육란 고증식성 특성을 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법과 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 제작하기 위한 재조합 벡터 및 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자는 전 세계적으로 매년 10억 명이 감염되고 3~5백만 명이 중증으로 진행, 29만~65만 명이 사망하는 전염성이 강한 급성호흡기감염증병이다. 조류 인플루엔자 A H5N1, H5N6, H7N4 및 H7N9 바이러스에서 사람 감염이 확인되었고, 새로운 조류 인플루엔자의 사람 감염이 지속적으로 발생하고 있다. 대유행 인플루엔자 발생의 필수 요소인 사람간 전파 능력은 간단한 유전자 변이 만으로도 획득될 수 있다는 사실이 밝혀지고 있고, WHO는 인플루엔자 바이러스가 계속 변이를 일으키고 있어 전 세계가 인플루엔자 대유행의 가능성에 여전히 취약하며 지속적인 감시가 필요하다고 밝혔다.

국내 조류 인플루엔자는 주로 저병원성 H9N2 아형의 바이러스에 의한 저병원성 조류인플루엔자로 1996년 최초 발생 이후 발생이 없다가 1999년 발생 이후부터 2004년까지 매년 발생하고 있으며, 그 빈도는 20-30% 정도로 국내 계군에 만연해 있으며, 외국의 경우처럼 산란율 저하 및 폐사로 경제적인 피해를 초래하고 있다 (Lee et al., 2000, Avian Dis, 44:527-535). 1996년 및 최근에 분리된 H9N2 바이러스들은 계태아 증식성이 낮아 (이 등., 1998, 서울대학교 대학원 석사학위논문) 불활화 백신 제조 시 적게는 10배에서 많게는 100배를 농축하여야만 효과를 얻을 수 있는 것으로 생각되고 있다.

인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제(neuraminidase, NA), 핵단백질(nucleoprotein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M1, M2), 중합효소 염기성 단백질 1 및 2, 중합효소 산성 단백질(polymerase base protein 1, polymerase base protein 2, polymerase acidic protein; 각각 PB1, PB2, PA), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.

역유전학(reversed genetics) 시스템은 인플루엔자 A 바이러스에서 바이러스 게놈의 조작을 가능하게 한다. 최근 연구 결과, pol I 프로모터로부터 8개의 모든 vRNA를 플라스미드 발현시키고 중합효소 복합체 단백질을 공동발현 시키면 감염성 인플루엔자 A 바이러스가 형성되는 것으로 확인되었다(Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 246:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679). 플라스미드로부터 완전히 활성화된 인플루엔자 A 바이러스를 생성하는데 헬퍼 바이러스를 사용한 감염을 필요로 하지 않는 이러한 방법은 기술적 제한없이 모든 유전자 단편의 조작을 가능하게 한다.

인플루엔자 바이러스의 증식성은 HA와 NA 활성의 조화가 중요한 것으로 알려져 있다. 일반적으로 발육란(계태아)에서의 바이러스 생산성은 세포배양과는 달리, 병원성이 높은 바이러스의 경우 계태아의 폐사를 초래하므로 요막강 내 바이러스 역가는 낮으며, 계태아의 조기 폐사로 인해 수확되는 요막액의 양이 줄어들어 바이러스 생산성이 감소하는 것으로 알려져 있다.

인체 인플루엔자 A 바이러스 백신주의 경우 역유전학을 통한 바이러스의 변이를 유도할 수 있기 때문에 고병원성 H5N1 바이러스의 병원성을 약화시키고, 계태아나 세포주에서의 증식성을 증가시키는 방향으로 개발이 이루어질 수 있었다.

이와 달리 조류에서 사용하는 저병원성 조류인플루엔자 백신은 저병원성 H9N2 조류인플루엔자 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(01310)를 발육란에서 20번 계대한 바이러스를 불활화한 백신을 사용하고 있다. 그러나, 20번 계대하는 과정에서 발육란 요막액 내에서의 증식성이 높아졌으나, 계태아에 대한 병원성이 매우 높아 접종 후 48시간 내 중사율이 증가하는 문제가 있다.

한편, H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스 KBNP-0028(KCTC 10866BP)는 발육란 고생산성 및 계태아 병원성이 없어, 생산성이 높으며 포유류에 대한 병원성과 관련된 돌연변이를 갖지 않아 안전한 백신주로 국내 특허등록(특허 제0708593호) 된 바이러스이다. KBNP-0028의 NS 게놈 절편을 PR8 바이러스의 나머지 7개 게놈 절편과 함께 재조합 바이러스(rPR-NS(0028))를 제작하는 경우, 마우스에서의 병원성이 낮고, 면역원성이 높으며 발육란에서의 증식성이 높은 것으로 알려져 있으며 이러한 특성과 관련된 아미노산의 변이가 특정[G139D, S151T, PL motif 변이 (GSEV > EPEV)] 되어 있다(특허 제 10-1426407호). 그러나, 이 경우에도 포유류 증식성은 잔존하는 것으로 알려져 있다.

조류인플루엔자 바이러스는 오랜 기간 동안 인간과 더불어 역사를 같이한 바이러스로 인체 내 면역 반응이 전무하기 때문에, 인간에서 인간으로 전파력은 기존 인간 독감 바이러스보다 훨씬 빠른 것으로 예상된다. 따라서, 조류 인플루엔자 바이러스의 발생을 조기에 막을 수 있는 예방 백신의 개발이 국민의 보건, 국가 경제력 및 국방력 제고에 필요하다.

상기한 문제를 해결하고 포유류에 비 병원성이면서도 우수한 면역원성과 증식성을 갖는 인플루엔자 바이러스 백신주의 개발을 위해, 본 발명의 발명자가 예의 노력한 결과, 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2) 의 중합효소 염기성 단백질 2(PB2) 단백질에 아미노산 변이를 포함하는 변이 단백질 및/또는 이를 코딩하는 게놈을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스는 발육란에서 고증식성을 가지면서도, 인체에 대한 감염위험이 매우 낮은 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)을 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 변이시킨 단백질을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 더 포함할 수 있다.

상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스의 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1), 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA), 핵단백질(nucleoprotein: NP), 매트릭스 단백질(matrix: M) 및 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 더 포함할 수 있다.

상기 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2) 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)는 아형 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)일 수 있다.

상기 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)는 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 뉴라미다제(neuraminidase; NA)일 수 있다.

상기 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질은 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) 또는 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA)에서 226번 류신이 글루타민으로 변이된 것 일 수 있다.

상기 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다.

상기 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스의 PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질은 인플루엔자 바이러스 A/Perto Rico/8 (H1N1)의 PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질일 수 있다.

상기 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1)은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

상기 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

상기 핵단백질(nucleoprotein: NP)는 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다.

상기 매트릭스 단백질(matrix: M)은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다.

상기 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다.

본 발명의 다른 형태로, 기탁번호 KCTC 14691BP의 재조합 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 형태로, 상기한 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신에 관한 것이다.

상기 백신은 사독 백신 또는 생독 백신 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 형태로, 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 변이된 PB2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

중합효소 염기성 단백질 2(PB2)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 서열로 구성되는 아미노산 서열에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 형태로, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 변이된 PB2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 인플루엔자 바이러스의 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 핵단백질(nucleoprotein: NP)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 매트릭스 단백질(matrix: M)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함된 것 일 수 있다.

상기 중합효소 염기성 단백질 2(PB2)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 서열로 구성되는 아미노산 서열에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 PB2 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 형태로, 상기 재조합 벡터 또는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 발육란에 접종하는 단계를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조방법은 접종된 발육란을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 아미노산 변이를 포함하는 중합효소 염기성 단백질 2(PB2)를 포함하며, 인체에 대한 비-병원성과 높은 면역원성, 그리고 발육란에서 높은 증식을 통해 우수한 생산성을 가져, 조류 인플루엔자 바이러스 백신주로서 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스(rSL20(P), rSL20(P)-L226Q, rSL20(P)-310PB2 및 rSL20(P)-MVV310PB2)와 야생형 조류 인플루엔자 바이러스(Y280 wild type, rPR8)의 MDCK 세포주에서 증식성을 보여주는 그래프이다.
도 1b은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스(rSL20(P), rSL20(P)-L226Q, rSL20(P)-310PB2 및 rSL20(P)-MVV310PB2)와 야생형 조류 인플루엔자 바이러스(Y280 wild type, rPR8)의 A549 세포주에서 증식성을 보여주는 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스 rSL20(P), rSL20(P)-L226Q 및 rSL20(P)-MVV310PB2를 각각 접종한 마우스의 체중 변화를 보여주는 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스 rSL20(P), rSL20(P)-L226Q 및 rSL20(P)-MVV310PB2를 각각 접종한 마우스의 생존률을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하에서, 본 발명을 보다 상세하기 설명한다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)을 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 변이(I66M, I109V, 및 I133V)시킨 단백질을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2) 단백질에서 66번 아이소루신(I)을 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 변이시킨 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

조류 인플루엔자 바이러스는 11-12개의 단백질들을 발현하는 8개의 조각난 단일가닥 RNA를 게놈(genome)으로 가지고 있으며, 이 RNA들은 4개의 바이러스 단백질인 핵단백질 (nucleoprotein, NP), 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1; PB1), 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2; PB2), 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein; PA)과 함께 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP)을 형성하고, 감염된 세포 내에서 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)에 의해 전사 및 복제된다. 이 RNA 중합효소는 capped RNA와 결합, 핵산내부가수분해효소 절단, RNA전사 활동(RNA-directed RNA transcription activity)을 포함한 여러 활성을 가지고 있다. 조류 인플루엔자 바이러스의 RNA 중합효소는 헤테로트라이머 구조를 가지며, 세 개의 단위체(subunit) PB1(polymerase basic 1), PB2(polymerase basic 2), 그리고 PA(polymerase acidic)로 구성된다. 상기 RNA 중합효소는 바이러스 게놈의 복제와 바이러스의 mRNA 합성을 수행한다. 그 중 중합효소 단위체 PB2는 감염된 숙주 세포의 mRNA의 캡 구조에 결합하는 단백질로 알려져 있다.

본 발명에서 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2; PB2)는 중합효소 단위체 B2(polymerase subunit B2) 또는 PB2라고도 지칭될 수 있다. 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스에 포함되는 PB2는 인플루엔자 바이러스는 한국에서 2001년에 분리된 저벙원성 조류 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 PB2 단백질의 아미노산 서열을 기초 66번 아이소루신(I)을 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 치환한 변이를 포함하는데 기술적 특징이 있다. 상기한 치환 변이를 포함하는 PB2 단백질을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스는 포유류에서 우수한 면역원성을 유지하면서도 병원성은 나타내지 않으며, 발육란에서 증식성이 우수해, 백신주로 활용되는데 유리한 특성을 갖는다.

상기한 PB2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 I66M, I109V, 및 I133V 변이를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 것 일 수 있다.

일 예로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스에 포함되는 PB2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것 일 수 있다.

본 발명에서 "서열로 구성되는"은 해당 서열만으로 이루어지거나 해당 서열을 포함하면서 서열이 상이해지지 않는 조건으로 서열의 양 말단에 추가의 서열을 포함하는 것도 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 일 예로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열만으로 이루어진 경우뿐 아니라, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하면서, 양쪽 말단에 추가의 아미노산 서열을 포함하는 경우까지, 본 발명에 해당한다.

다른 일 예로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스에 포함되는 PB2 단백질은 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의하여 코딩되는 것 일 수 있다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 바이러스의 종류, 아형, 균주(strain) 등에 상관없이 역유전학 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 일 예로 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 바이러스에 재조합되는 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)의 종류에 따라 아형이 결정될 수 있다. 일 예로, H9 형의 HA와 N2형의 NA 단백질을 재조합 한 경우, H9N2 아형의 재조합 인플루엔자 바이러스 일 수 있다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스의 게놈은 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있다.

상기 HA와 NA 단백질은 백신을 투여하는 개체에 목적하는 면역원성을 부여하기 위해 적절한 인플루엔자 바이러스로부터 분리하여 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스에 재조합 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 아형의 제한없이 제조될 수 있어, 백신주로서 활용이 더욱 용이하다.

일 예로, A/H1 내지 A/H16 중 선택된 아형의 HA와 N1 내지 N9로 이루어진 군에서 선택된 아형의 NA를 포함할 수 있다. 구체적으로, 국내에서 분리되고, 인체 감염 가능성이 높은 A형 조류 인플루엔자 바이러스 중, A/H1, A/H2, A/H3, A/H4, A/H5, A/H6, A/H7, A/H9 및 A/H10 중 선택된 HA와 N1, N2, 및 N7 중 선택된 NA를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 A/H9형의 HA와 N2형의 NA 단백질을 포함하도록 H9N2 아형의 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 구축하여, 백신주로서 활용 가능성을 확인하였다.

보다 구체적인 일 예로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 상기한 PB2 변이 단백질과 함께 2020년 한국에서 분리된 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미다제(NA); 또는 이 들의 게놈을 포함할 수 있다.

다른 구체적인 일 예로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 뉴라미다제(NA) 및 상기 바이러스는 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(HA)에서 226번 류신을 글루타민으로 치환한 변이를 포함하는 HA 변이 단백질을 포함하거나; 이들의 게놈을 포함할 수 있다.

일 예로, 상기 헤마글루티닌(HA)은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 다른 일 예로, 서열번호 13 또는 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 코딩되는 것 일 수 있다.

다른 일 예로, 상기 뉴라미다제(NA)는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 다른 일 예로, 서열번호 15의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 것 일 수 있다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 상기 치환 변이를 포함하는 PB2 단백질과 함께 인플루엔자 바이러스의 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1), 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA), 핵단백질(nucleoprotein: NP), 매트릭스 단백질(matrix: M) 및 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

또한, 또한, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스의 게놈은 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1), 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA), 핵단백질(nucleoprotein: NP), 매트릭스 단백질(matrix: M) 및 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있다.

바람직한 일 예로, PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질을 모두 포함할 수 있으나, 상기 각 단백질은 단일 종의 바이러스에 유래되거나 다 종의 바이러스로부터 각각 유래된 것 일 수 있다. 또한, 상기 PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질은 본 기술분야에 공지된 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것 또는 이의 돌연변이를 제한없이 사용할 수 있다.

상기 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1)은 인플루엔자 바이러스의 중합효소를 구성하는 단위체(subunit)로 중합효소 단위체 B1(polymerase subunit B1)이라고도 지칭된다. 일 예로, PB1 단백질은 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 PB1 단백질 일 수 있다. 다른 일 예로, PB1 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 또 다른 일 예로, 상기 중합효소 염기성 단백질 1(PB1)은 서열번호 16의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 것 일 수 있다.

상기 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)은 인플루엔자 바이러스의 중합효소를 구성하는 단위체(subunit)로 중합효소 단위체 A(polymerase subunit A)이라고도 지칭된다. 일 예로, PA 단백질은 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 PA 단백질 일 수 있다. 다른 일 예로, PA 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되거는 것일 수 있다. 다른 일 예로, 상기 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)는 단백질은 서열번호 17의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 것 일 수 있다.

상기 핵단백질(nucleoprotein: NP)은 바이러스의 음성 가닥 RNA를 캡슐화하는 구조 단백질로, 핵단백질(NP)은 종의 특이성을 결정하는 주요 요인 중 하나이다. 상기 핵단백질(NP)은 일 예로 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 NP 단백질 일 수 있다. 다른 일 예로, 상기 핵단백질(NP)는 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 상기 핵단백질(NP)은 서열번호 18의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 것 일 수 있다.

상기 매트릭스 단백질(matrix: M)은 일 예로 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 M 단백질 일 수 있다. 다른 일 예로 상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 19의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 것 일 수 있다.

상기 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)은 일 예로 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 NS 단백질 일 수 있다. 다른 일 예로, 상기 비구조 단백질(NS)은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 상기 비구조 단백질(NS)은 서열번호 20의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 것 일 수 있다.

일 예로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 상기한 변이를 포함하는 PB2 단백질과 함께, A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1), 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA), 핵단백질(nucleoprotein: NP), 매트릭스 단백질(matrix: M) 및/또는 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)을 포함할 수 있다. 이러한 재조합 인플루엔자 바이러스의 경우, 포유류에 대한 비병원성, 높은 면역원성 및 증식률을 가져 백신주로서 활용이 우수하다.

구체적인 일 예로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 PB2 단백질, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HA 단백질, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 NA 단벡질, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 PB1 단백질, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 PA 단백질, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 NP 단백질, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 NS 단백질을 포함하거나; 상기한 단백질들을 코딩하는 게놈을 포함할 수 있다.

상기한 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는, 본 명세서에서는 rSL20(P)-MVV310PB2로 명명되었고, 2021년 9월 1일 국제기탁기관인 생물자원센터(KCTC)에 수탁되어, KCTC 14691BP의 기탁번호를 부여 받았다.

따라서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14691BP의 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

또 다른 형태로, 본 발명읜 상기한 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다.

본 발명에서 상기 백신은 백신 제조에 사용되는 백신용 조성물을 포함하는 의미이며, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 포함하는 것으로 이해된다.

일 예로 상기 백신은 바이러스 균주를 그대로 포함하는 생독 백신 일 수 있다.

다른 일 예로, 상기 백신은 사독 백신일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 불활화 처리되어 동물용 또는 인체용 불활화 백신으로 제공될 수 있다. 상기 바이러스의 불활화 방법은 본 발명 기술분야에서 통상적으로 이용되는 백신 제조방법 또는 바이러스 불활화 방법을 이용할 수 있고, 구체적인 실시예에 기재된 방법으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 치환 변이를 갖는 PB2 단백질 또는 이를 코딩하는 게놈을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스는 포유류에 대한 병원성을 나타내지 않으며, 면역원성과 계태아에서 증식성이 우수해, 백신주로서 우수한 특성을 갖는다. 따라서, 이를 유효성분으로 포함하는 백신은 투여 개체의 감염 위험성을 낮추면서 우수한 백신 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 재조합 인플루엔자 바이러스를 각각 접종한 마우스에 접종한 결과, 본 발명의 치환 변이를 포함하는 PB2 단백질을 갖는 rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스를 접종한 마우스에서는 체중 감소 및 마우스 폐사가 나타나지 않아, 백신으로서 유용할 것으로 판단된다　

또 다른 일 실시예에서 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID₅₀/ml)를 측정한 결과, 본 발명의 rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스를 접종한 경우 가장 높은 계태아 증식성을 가짐을 확인했고, rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스와 동일한 유래의 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M 및 NS 단백질을 포함하면서, PB2에 변이를 포함하지 않는 rSL20(P)-310PB2 재조합 바이러스의 경우 계태아 증식성이 10배 가량 감소함을 확인하였다. 이에 따라, PB2 단백질에서 I66M, I109V 및 I133V 변이를 포함하는 경우 계태아 증식성이 높아 백신으로 활용이 우수하다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스와 함께 혼합될 수 있는 부형제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 백신의 효과를 유지 또는 향상시키거나, 백신의 안정성 등을 높이기 위한 부형제라면 제한없이 본 발명의 백신에 포함하여 사용될 수 있다. 또한, 백신의 효과 개선을 위한 아쥬반트를 더 포함하여 사용할 수 있다.

일 예로, Montanide ISA70(SEPPIC, France), 수산화알루미늄젤(Al(OH)3-gel), Arlacel A special(ICI, USA), 및/또는 Freund's adjuvant 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 백신은 닭과 오리 등의 조류뿐 아니라 인간, 돼지, 개, 마우스 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다. 특히, 본 발명의 PB2 단백질 또는 이의 게놈을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 경우 포유류에 비병원성이면서 면역원성 및 증식성이 높아, 우수한 백신 효율을 갖는다.

본 발명은 또 다른 형태로, 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터는 역유전학(reserved genetics)을 이용해서 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다. 상기한 변이를 포함하는 PB2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 이용해 역유전학 법으로 생산된 재조합 인플루엔자 바이러스는 PB2 단백질의 변이를 포함하여 포유류에서 병원성을 나타내지 않는 특성을 갖는다.

본 발명에서 폴리뉴클레오타이드는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하기 위한 뉴클레오타이드의 중합 사슬로, 용어 염기서열, 유전자 또는 게놈서열과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

상기 중합효소 염기성 단백질 2(PB2)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 서열로 구성되는 아미노산 서열에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 것 일 수 있고, 다른 일 예로, 서열번호 2의 아미노산로 구성되는 PB2 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 12의 염기서열로 구성되거나 이로 이루어진 것 일 수 있다.

또 다른 형태로, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 제공한다.

일 예로, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 핵단백질(nucleoprotein: NP)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 매트릭스 단백질(matrix: M)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함된 것 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각각 하나의 벡터에 포함되거나 하나의 벡터에 하나 이상 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함될 수 있다.

상기 중합효소 염기성 단백질 2(PB2)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 서열로 구성되는 아미노산 서열에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 것 일 수 있고, 다른 일 예로, 서열번호 2의 아미노산로 구성되는 PB2 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 12의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것 일 수 있다.

일 예로 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(HA)에서 226번 류신을 글루타민으로 치환한 변이를 포함하는 HA 변이 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 다른 일 예로 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 HA 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 13의 염기서열 또는 서열번호 14의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있다.

일 예로 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 Y280 lineage (A/CHICKEN/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 뉴라미다제(NA)를 코딩하는 것 일 수 있다. 다른 일 예로 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 NA 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 15의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있다.

일 예로, 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 PB1 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 다른 일 예로, 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 PB1 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 16의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있다.

일 예로, 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 PA 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 다른 일 예로, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 PA 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 17의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있다.

일 예로, 핵단백질(nucleoprotein: NP)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 NP 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 다른 일 예로, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 NP 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 18의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있다.

일 예로, 매트릭스 단백질(matrix: M)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 M 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 다른 일 예로, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 M 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 19의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있다.

일 예로, 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 A/Perto Rico/8/34(H1N1)의 NS 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 다른 일 예로, 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 NS 단백질을 코딩하는 것 일 수 있다. 또 다른 일 예로, 서열번호 20의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물은 역유전학을 통해 상기 조성물에 포함된 폴리뉴클레오타이드로 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조할 수 있다. 일 예로, 각각의 폴리뉴클레오타이드를 각각 Pol I과 Pol II를 포함하는 벡터에 클로닝하고, 8개 벡터를 세포 또는 발육란에 공동 형질감염(co-transfection)하여 재조합 바이러스를 생산할 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 또 다른 형태로, 인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 또는

인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 치환된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 핵단백질(nucleoprotein: NP)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 매트릭스 단백질(matrix: M)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 세포 또는 발육란에 접종하는 것을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조방법을 제공한다.

상기 세포 또는 발육란은 상기한 벡터 또는 이를 포함하는 조성물로 형질 감염시키고, 배양을 통해서 바이러스를 증식시키는 방법으로 바이러스를 생산할 수 있는 것이라면 종류에 제한없이 본 발명에 사용될 수 있다. 한편 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 포유류 세포에서는 낮은 증식성을 나타내어 인체에 대한 매우 낮은 감염 위험성을 나타내는 것을 특징으로 하므로, 상기 세포는 포유류 세포를 제외한 세포인 것이 바람직하다.

상기 제조방법은 형질감염된 세포 또는 발육란을 배양하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 세포 또는 발육란의 배양은 본 발명 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배양 조건, 배지 등을 이용하여 수행될 수 있다.

일 예로, A/KOREA/01310/2001(H9N2)의 PB2 단백질에서 66번 아미노산을 아이소루신(I)에서 메티오닌(M)으로, 109번 아미노산을 아이소루신(I)에서 메티오닌(M)으로, 133번 아미노산을 아이소루신(I)에서 발린(V)으로 변이시킨 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 12)를 클로닝한 벡터 또는

상기 서열번호 12의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝한 벡터, HA를 코딩하는 뉴클레오타이드(서열번호 13)를 클로닝한 벡터, NA를 코딩하는 뉴클레오타이드(서열번호 15)를 클로닝한 벡터, PB1을 코딩하는 뉴클레오타이드(서열번호 16)를 클로닝한 벡터, PA을 코딩하는 뉴클레오타이드(서열번호 17)를 클로닝한 벡터, NP를 코딩하는 뉴클레오타이드(서열번호 18)를 클로닝한 벡터, M을 코딩하는 뉴클레오타이드(서열번호 19)를 클로닝한 벡터 및/또는 NS(서열번호 20)를 클로닝한 벡터를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 세포로 공동 형질감염하거나, 발육란에 요막강 경로로 접종하여 배양한 후 바이러스를 얻었다. 상기에서 얻어진 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 바이러스 역가(EID₅₀/ml(log10))가 우수해 높은 계태아 증식성을 가지며, 포유류 세포주에서 증식하지 못해, 포유류에 비병원성인, 즉, 인체에 대한 낮은 감염 위험을 가짐을 확인하였다.

중복된 기재를 피하기 위해서, 별도의 언급이 없는 한, 재조합 인플루엔자 바이러스 부분에서 기술한 본 발명 각 구성에 대한 정의 및 설명은 재조합 벡터, 백신, 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물 및 재조합 인플루엔자 바이러스 제조방법에 그대로 준용된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 바이러스 제작

1-1. 재조합 바이러스 제작

재조합 인플루엔자 바이러스 제작을 위하여, 호프만 박사의 역유전학 벡터시스템(특허 제0862758호)을 사용하였다. 벡터 구성은 특허에 기재된 내용과 동일한 벡터 pHW2000를 분양받아 실험에 사용하였다.

구체적으로, 2020년 한국에서 분리된 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/chicken/KOREA/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA)의 게놈 절편(서열번호 13), 뉴라미다제(neuraminidase; NA) 게놈 절편(서열번호 15)이 클로닝된 호프만 벡터;

상기 Y280 lineage H9N2 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) 유전자의 226번 아미노산을 류신에서 글루타민으로 변이시킨 유전자(서열번호 14)를 클로닝한 호프만 벡터(Y280-L226Q);

국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 01310(A/chicken/Korea/01310/2001)(H9N2)의 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2) 게놈 절편(서열번호 11)이 클로닝된 호프만 벡터;

인플루엔자 바이러스 01310(A/chicken/Korea/01310/2001)(H9N2)의 PB2 단백질에서 66번 아미노산을 아이소루신(I)에서 메티오닌(M)으로, 109번 아미노산을 아이소루신(I)에서 발린(V)으로, 133번 아미노산을 아이소루신(I)에서 발린(V)으로 변이시킨 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 12)를 클로닝한 호프만 벡터(01310-MVV);

인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 PB2(서열번호 22), PB1(서열번호 16), PA(서열번호 17), NP(서열번호 18), M(서열번호 19) 또는 NS(서열번호 20)의 게놈 절편을 각각 클로닝한 호프만 벡터 플라스미드를 준비하였다.

8개 단백질에 대한 각각의 벡터 플라스미드를 조합하여 재조합바이러스를 제조하였고, 각 재조합 바이러스의 유전자 구성은 하기의 표 1에 나타난 바와 같다.

재조합바이러스	HA	NA	PB2	PB1	PA	NP	M	NS
Y280 야생형	Y280	Y280	Y280	Y280	Y280	Y280	Y280	Y280
rSL20(P)	Y280	Y280	PR8	PR8	PR8	PR8	PR8	PR8
rSL20 (P) -L226Q	Y280 -L226Q	Y280	PR8	PR8	PR8	PR8	PR8	PR8
rSL20 (P) -310PB2	Y280	Y280	01310	PR8	PR8	PR8	PR8	PR8
rSL20 (P)-MVV310PB2	Y280	Y280	01310-MVV	PR8	PR8	PR8	PR8	PR8

구체적으로, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 DMEM(GIBCO BRL) 배지에 2X10⁶개/2ml 부유하여 각 웰에 첨가한 후 3 내지 4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후, Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다. 재조합 바이러스에 포함시킬 HA, NA, PB2, PB1, PA, NP, M, 및 NS 게놈을 클로닝한 플라스미드 8개를 모두 하나의 1.5ml 튜브에 각각 300ng씩의 양으로 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하였다. 또 다른 1.5ml 튜브에 plus reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml 튜브에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다. 기다리는 동안 리포펙타민(lipofectamine) 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 상기 플라스미드가 있는 튜브에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다. 얻어진 반응 생성물을 상기293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕를 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO₂, 37℃에서 20시간 배양한 후, 각 웰 당 트립신 10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가하고, 24시간 후 상층액을 수확하였다. 상기 수확된 상층액 200㎕를 10 내지 11일령 SPF 발육란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하였다. 상기 접종된 발육란을 37℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집 여부를 확인한 결과 모두 혈구응집 양성을 보였다.

이 재조합 바이러스의 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발육란에서 증식시킨 바이러스를 -70℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

1-2. 바이러스 역가 측정

상기의 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID₅₀/ml)를 측정하기 위하여, 각각의 재조합 바이러스들을 인산완충용액으로 10^-1 내지 10^-9까지 10진 희석하여 각 희석 배수 별로 10 내지 11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강 경로로 100㎕씩 접종하였다. 그 후 3일간 배양한 후, 요막액을 수확하여 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하여 Reed-Muench 계산식에 따라 바이러스 역가(EID₅₀/ml)를 측정하였다.

그 결과 얻어진 바이러스 역가(EID₅₀/ml(log10))를 아래의 표 2에 나타내었다.

재조합 바이러스	EID ₅₀ /ml(log10)
Y280 야생형	9.67 ± 0.29
rSL20(P)	9.41 ± 0.12
rSL20(P)-L226Q	9.42 ± 0.14
rSL20(P)-310PB2	8.57 ± 0.46
rSL20(P)-MVV310PB2	9.58 ± 0.14

표 2에 나타낸 바와 같이, 바이러스 역가(EID₅₀/ml(log10))를 살펴보면, rSL20(P)의 경우 10^9.41와 rSL20(P)-L226Q는 10^9.42 로 비슷하였고, rSL20(P)-310PB2의 경우 10^8.57 로 10배 가량 감소하였으나, MVV 변이를 갖는 PB2 단백질을 포함하는 유전자를 갖는 rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스는 10^9.58 EID₅₀/ml로 높은 계태아 증식성을 가짐을 확인하였다.

실시예 2: 재조합 바이러스의 포유류 병원성 평가

2-1. 포유류 세포주에서의 재조합 바이러스의 증식성 평가

실시예 1에서 제조한 재조합 바이러스의 포유류에서의 증식성을 확인하기 위해, 야생형 인플루엔자 바이러스 Y280(Y280 wild-type), 실시예 1의 네 가지 재조합 바이러스, 그리고 인플루엔자 바이러스 PR8의 전체 유전자를 역유전학을 사용해 재생성한 바이러스(rPR8)를 1 MOI로 MDCK 세포주(생물자원센터, 한국)와 A549 세포주(생물자원센터, 한국)에 접종하고 0, 24, 48, 72시간 마다 상층액을 수득하여 시간대별 증식한 바이러스의 양을 TCID₅₀/0.1ml로 측정하였다.

도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 야생형 인플루엔자 바이러스 Y280은 MDCK 에서만 증식가능 하였고, PR8 바이러스의 6개 내부 유전자를 가진 rSL20(P)와 rSL20(P)-L226Q 재조합 바이러스의 경우 두 세포주에서 야생형 인플루엔자 바이러스 PR8(rPR8) 이상의 높은 증식성을 보였으며, A549 세포주에서는 rSL20(P)가 rSL20(P)-L226Q보다 더 높은 증식성을 나타냈다.

그러나, 01310의 PB2 게놈을 갖는 rSL20(P)-310PB2와 변이를 포함하는 MVVPB2를 가진 rSL20(P)-MVV310PB2 두 바이러스는 두 세포주 모두에서 증식하지 못하여, 인체에 대한 매우 낮은 감염 위험을 가짐을 확인하였다. 상기와 같은 결과를 통해, 상기 두 종류의 바이러스는 상호 유사한 수준의 낮은 포유류 독성을 나타내는 것을 확인하였고, 상기 실시예 1-2에서 확인한 바와 같이 계태아에서의 증식역가 측면에서는 rSL20(P)-MVV310PB2 가 현저히 우수하므로, 종합적으로 rSL20(P)-MVV310PB2 가 사독 백신주로 더욱 적합한 바이러스가 될 수 있음을 확인하였다.

2-2. 마우스에서 재조합 바이러스의 병원성 평가

실시예 1의 재조합 바이러스가 포유류에서 병원성을 갖는지 확인하기 위해, rSL20(P), rSL20(P)-L226Q 및 rSL20(P)-MVV310PB2의 재조합 바이러스 각각을 6주령 BALB/c 암컷 마우스에 10⁶ EID₅₀/0.05ml으로 비강 내 접종하고, 1주간 체중을 측정하여 병원성을 확인하였다. 그리고, 3일째 폐를 샘플링하여 폐 내 증식성을 확인하였다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, rSL20(P) 재조합 바이러스를 접종한 경우, 7일째까지 지속적으로 체중이 감소하였고, rSL20(P)L226Q 재조합 바이러스를 접종한 경우 3일째에 이미 60%가 안락사 기준의 체중으로 감소하였으며 4일째에는 모든 개체가 폐사하여, rSL20(P)L226Q 재조합 바이러스가 가장 병원성이 높음을 알 수 있었다. 그러나, rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스를 접종한 경우, 마우스에서 체중 감소가 확인되지 않았다. 이러한 결과는 도 2b에서도 확인할 수 있었다. rSL20(P) 재조합 바이러스와 rSL20(P)L226Q 재조합 바이러스를 접종한 경우 각각 4일 이후 또는 6일 이후에 마우스 개체가 폐사하였으나, rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스를 접종한 경우 마우스의 폐사가 나타나지 않았다.

또한, 3일째에 샘플링한 폐에서 폐 유제액을 10일령 발육란에 각각 접종하고, 증식한 바이러스를 10진 희석하여 TCID₅₀/0.1ml로 역가를 측정하는 방법으로 폐에서 증식한 바이러스의 양을 확인하였다. TCID₅₀/0.1ml 값은 3회 측정한 값의 평균으로 나타내었다.

Recombinant virus	Virus isolation rate	Log₁₀ TCID₅₀/0.1 ml
rSL20(P)	3/3	4.00 ± 0.25
rSL20(P)-L226Q	3/3	5.00 ± 0.25
rSL20(P)-MVV310PB2	0/3	0.00 ± 0.00

표 3에 나타낸 바와 같이, 다른 바이러스 접종군에서는 마우스의 폐에서 바이러스가 검출되었으나, rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스를 접종한 마우스의 폐에서는 바이러스가 검출되지 않아, 포유류에 대하여 본 발명의 재조합 바이러스가 병원성이 없음을 확인하였다.

실시예 3: 재조합 바이러스의 항체 형성능 평가

3-1. 재조합 바이러스의 닭에서 항체 형성능 평가

실시예 1의 재조합바이러스가 사독 백신주로 사용될 수 있는지 확인하기 위해서, rSL20(P), rSL20(P)-L226Q 및 rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스를 각각 포르말린으로 불활화하여 발육란에 접종하고, 불활화 여부를 확인하였다. 이 후, 재조합 바이러스와 ISA70을 3:7 (v/v) 로 섞어 그룹당 각 3주령 SPF 닭 5마리에 피하로 0.5ml을 접종하였다. 접종 3, 4주 후에 채혈하여 혈청을 RDE 및 비동화 처리 후 세 가지 항원을 이용하여 HI test를 하였다. 결과는 표 4 나타내었다.

불활화 재조합 바이러스	백신접종 후 주(week) (wpv)	HI 역가의 기하평균(GMT)^a
		Antigen
		rSL20(P)	rSL20(P)-L226Q	rSL20(P)-MVV310PB2
rSL20(P)	3 wpv	1195 (756 - 1633)^b	256 (256 - 256)^b	1195 (756 - 1633)^b
rSL20(P)	4 wpv	2303 (721 - 3884)^b	288 (90 - 486)^b	1195 (461 - 1929)^b
rSL20(P)-L226Q	3 wpv	1741 (888 - 2594)^b	256 (61 - 451)^b	1075 (283 - 1867)^b
rSL20(P)-L226Q	4 wpv	1638 (942 - 2355)^b	307 (66 - 548)^b	1331 (478 - 2184)^b
rSL20(P)-MVV310PB2	3 wpv	2560 (653 - 4467)^b	371 (117 - 625)^b	2304 (125 - 4483)^b
rSL20(P)-MVV310PB2	4 wpv	2048 (491 - 3605)^b	666 (239 - 1092)^b	1434 (737 - 2130)^b
^aGeomatric mean of HI titer ^b GMT 계산한 값의 95% 신뢰도의 신뢰구간

표 4에 나타낸 바와 같이, 모든 바이러스 백신 접종군에서 항체가 검출되었고, 실시예 1의 재조합 바이러스가 면역원성을 가짐을 확인하였다. 특히, rSL20(P)-MVV310PB2 재조합 바이러스 백신을 접종한 경우 높은 항체가 검출됨을 확인되어, 포유류에 병원성을 가지지 않으면서도, 높은 면역원성을 가져 백신주로서 개발에 유용함을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC14691BP

20210901

<110> Geniner Co., Ltd. <120> MAMMALIAN AVIRULENT AND EMBRYONATED EGG HIGHLY REPLICATIVE RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS <130> G1.1P <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 760 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PB2 wild of 01310 <400> 1 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met 50 55 60 Glu Ile Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Lys Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Ile His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Arg Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp 225 230 235 240 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Val Asp 245 250 255 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val 260 265 270 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Gly Thr Gln 275 280 285 Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu 290 295 300 Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Ile Gly Leu Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Val Lys Lys Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu 340 345 350 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg 355 360 365 Arg Ala Thr Ala Leu Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu 370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Ile Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Val Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ala Arg Gly Gln Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Val Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn *** 755 760 <210> 2 <211> 760 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PB2 MVV mutant <400> 2 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met 50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Lys Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Ile His Tyr Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Arg Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp 225 230 235 240 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Val Asp 245 250 255 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val 260 265 270 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Gly Thr Gln 275 280 285 Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu 290 295 300 Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Ile Gly Leu Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Val Lys Lys Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu 340 345 350 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg 355 360 365 Arg Ala Thr Ala Leu Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu 370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Ile Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Val Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ala Arg Gly Gln Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Val Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn *** 755 760 <210> 3 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA wild of Y280 <400> 3 Met Glu Thr Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Val Val Ala Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Pro Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn 100 105 110 Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr 130 135 140 Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg 145 150 155 160 Trp Leu Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Gln Asp Ala Gln Tyr 165 170 175 Thr Asn Asn Gln Gly Lys Asn Ile Leu Leu Met Trp Gly Ile Asn His 180 185 190 Pro Pro Thr Asp Asp Val Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr 195 200 205 Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Met Asn Arg Val Phe Lys Pro Leu 210 215 220 Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asp Tyr 225 230 235 240 Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp 245 250 255 Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser 260 265 270 His Gly Arg Ile Leu Lys 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caaattgaga gtatgattga agctgagtcc 1800 tctgtcaaag agaaagacat gaccaaagag ttctttgaga acaaatcaga aacatggccc 1860 attggagagt cccccaaagg agtggaggaa agttccattg ggaaggtctg caggacttta 1920 ttagcaaagt cggtattcaa cagcttgtat gcatctccac aactagaagg attttcagct 1980 gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaacctgga acctgggacc 2040 tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc tgattaatga tccctgggtt 2100 ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc cttacacatg cattgagtta g 2151 <210> 18 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP gene of PR8 <400> 18 atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttac gaacagatgg agactgatgg agaacgccag 60 aatgccactg aaatcagagc atccgtcgga aaaatgattg gtggaattgg acgattctac 120 atccaaatgt gcaccgaact caaactcagt gattatgagg gacggttgat ccaaaacagc 180 ttaacaatag agagaatggt gctctctgct tttgacgaaa ggagaaataa ataccttgaa 240 gaacatccca gtgcggggaa agatcctaag aaaactggag gacctatata caggagagta 300 aacggaaagt ggatgagaga actcatcctt tatgacaaag aagaaataag gcgaatctgg 360 cgccaagcta ataatggtga cgatgcaacg gctggtctga ctcacatgat gatctggcat 420 tccaatttga atgatgcaac ttatcagagg acaagagctc ttgttcgcac cggaatggat 480 cccaggatgt gctctctgat gcaaggttca actctcccta ggaggtctgg agccgcaggt 540 gctgcagtca aaggagttgg aacaatggtg atggaattgg tcagaatgat caaacgtggg 600 atcaatgatc ggaacttctg gaggggtgag aatggacgaa aaacaagaat tgcttatgaa 660 agaatgtgca acattctcaa agggaaattt caaactgctg cacaaaaagc aatgatggat 720 caagtgagag agagccggaa cccagggaat gctgagttcg aagatctcac ttttctagca 780 cggtctgcac tcatattgag agggtcggtt gctcacaagt cctgcctgcc tgcctgtgtg 840 tatggacctg ccgtagccag tgggtacgac tttgaaaggg agggatactc tctagtcgga 900 atagaccctt tcagactgct tcaaaacagc caagtgtaca gcctaatcag accaaatgag 960 aatccagcac acaagagtca actggtgtgg atggcatgcc attctgccgc atttgaagat 1020 ctaagagtat taagcttcat caaagggacg aaggtgctcc caagagggaa gctttccact 1080 agaggagttc aaattgcttc caatgaaaat atggagacta tggaatcaag tacacttgaa 1140 ctgagaagca ggtactgggc cataaggacc agaagtggag gaaacaccaa tcaacagagg 1200 gcatctgcgg gccaaatcag catacaacct acgttctcag tacagagaaa tctccctttt 1260 gacagaacaa ccattatggc agcattcaat gggaatacag aggggagaac atctgacatg 1320 aggaccgaaa tcataaggat gatggaaagt gcaagaccag aagatgtgtc tttccagggg 1380 cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcagcgagcc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440 atgagtaatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtacga caattaa 1497 <210> 19 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M gene of PR8 <400> 19 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tagcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120 gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180 ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 caaactgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300 aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360 gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420 gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480 tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540 ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600 gaggccatgg aggttgctag tcaggctagg caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660 actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720 cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcgcta ttgccgcaaa 780 tatcattggg atcttgcact tgacattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840 ttaccgtcgc tttaaatacg gactgaaagg agggccttct acggaaggag tgccaaagtc 900 tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gagtgctgtg gatgctgacg atggtcattt 960 tgtcagcata gagctggagt aaaaaactac cttgtttcta ct 1002 <210> 20 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS gene of PR8 <400> 20 atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgagttgcag accaagaact aggcgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120 aaatccctaa gaggaagggg cagtactctc ggtctggaca tcaagacagc cacacgtgct 180 ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240 atggcctctg tacctgcgtc gcgttaccta actgacatga ctcttgagga aatgtcaagg 300 gactggtcca tgctcatacc caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac 360 caggcgatca tggataagaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420 ctggagactc taatattgct aagggctttc accgaagagg gagcaattgt tggcgaaatt 480 tcaccattgc cttctcttcc aggacatact gctgaggatg tcaaaaatgc agttggagtc 540 ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600 ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacga 660 gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tga 693 <210> 21 <211> 760 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PB2 wild of PR8 <400> 21 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asn Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Thr 50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Met Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Ile Thr Asn Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Ile Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Arg Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ser Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp 225 230 235 240 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Val Asp 245 250 255 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Ala Val 260 265 270 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln 275 280 285 Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu 290 295 300 Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu 340 345 350 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg 355 360 365 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu 370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Val Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Ile Glu Met Ser Met Arg Gly Val Arg Ile 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Ile Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asn Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ile Arg Gly Gln Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Phe Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Thr Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn *** 755 760 <210> 22 <211> 2280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PB2 wild gene of PR8 <400> 22 atggagagaa taaaggaact aagagatttg atgtcacagt ctcgcactcg cgagatactg 60 acaaaaacca ctgtggacca tatggccata atcaagaaat acacatcggg aagacaggag 120 aagaaccccg ctctcagaat gaaatggatg atggcaatga aatacccgat tacagctgac 180 aaaagaataa tggagataat ccctgaaaga aatgagcaag gtcaaactct ctggagcaaa 240 acgaatgatg ctggatcaga taaggtaatg gtatcacctc tggctgtgac gtggtggaat 300 agaaatggac caacaacaag cacaatccat tatcccaagg tatataaaac ttactttgag 360 aaggttgaaa ggttgaaaca cggaaccttt ggccccattc atttccgaaa tcaagtcaaa 420 atacgccgca gggttgacat aaacccgggc catgcagacc tcagtgctag agaagcacaa 480 gatgttatca tggaggtcgt tttcccgaat gaggttggag ccaggatact gacatcagaa 540 tcacaattga caataacaaa ggaaaagaaa gaagaactcc aggattgtaa gattgctcct 600 ttaatggtgg catacatgtt agaaagagaa ctggttcgca agaccagatt cctaccagtg 660 gctggcggga caagcagcgt gtatatagaa gtactacatt tgactcaagg aacctgctgg 720 gagcagatgt acacaccagg aggggaagta aggaatgatg atgttgacca gagtttgatc 780 attgctgcta gaaacattgt aaggagagca acagtatcag cagacccatt ggcctcgctc 840 ttggagatgt gtcatggtac acaaataggc ggaataagaa tggtagacat ccttagacaa 900 aacccaacag aagagcaagc cgtggatata tgcaaggcag caataggcct aagaatcagt 960 tcatctttca gctttggagg tttcactttc aaaagaacaa gtgggtcttc tgtcaagaag 1020 gaagaagaag tgcttacagg caacctccag acattgaaaa taagagtgca tgagggatat 1080 gaggaattca caatggttgg gcgaagagca acagccctcc taaggaaagc aaccagaagg 1140 ctgattcaac tgatagtaag tgggagagac gaacaatcaa tcgctgaagc gatcattgta 1200 gcaatggtat tttcacaaga ggactgcatg ataaaggcag tccgaggtga tttgaacttc 1260 gtgaacagag cgaaccagcg actgaacccc atgcaccaac ttctgaggca cttccaaaaa 1320 gatgcaaaag tgttgtttca gaactgggga attgaaccca tcgacaatgt catggggatg 1380 attggaatat tgcccgacat gactcccagc acagagatgt cactaagagg agtgagagtc 1440 agcaaaatgg gagtggacga atactctagc actgaaagag tggttgtgag tattgatcgt 1500 ttcttaaggg ttcgagatca gagggggaac atacttctat cccctgaaga agttagtgag 1560 acacaaggga cggaaaagtt aacaataaca tattcatcgt ctatgatgtg ggagattaac 1620 ggcccggaat cagtgctagt taacacatac caatggatca ttaggaattg ggagactgtg 1680 aagattcagt ggtctcaaga tcctactatg ttatacaata aggtggaatt tgaacccttt 1740 caatctctgg tacctaaagc tgccagaggc caatatagtg gatttgtgag aacgctattc 1800 caacaaatgc gtgatgtact gggaacattt gacactgttc agataataaa gctgctacca 1860 tttgccgcag ccccaccaga gcagagtagg atgcagtttt cttctctgac tgtgaatgta 1920 agaggctcag gaatgagaat ccttgtgaga ggcaactccc ctgtgtttaa ttacaacaag 1980 gcaaccaaga ggcttacagt cctcgggaag gatgcaggtg cactcacaga agacccagat 2040 gaaggaacag caggagtgga atccgcagta ttgagaggat tcctaattct aggcaaagaa 2100 gacaagagat acggaccagc attgagcatc aacgaattga gcaatcttgc gaaaggggag 2160 aaagctaatg tattgatagg gcaaggagac gtagtgttgg taatgaaacg gaaacgggac 2220 tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcgaatggc catcaattag 2280 2280

Claims

인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)을 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)을 발린(V)으로 변이시킨 단백질을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
제1항에 있어서,
인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)를 더 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스.
제1항에 있어서,
인플루엔자 바이러스의 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1), 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA), 핵단백질(nucleoprotein: NP), 매트릭스 단백질(matrix: M) 및 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2) 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 H9N2 인플루엔자 바이러스.
제2항에 있어서,
헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)는 아형 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질 및 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)인, 재조합 인플루엔자 바이러스.
제5항에 있어서,
상기 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)는 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/chicken/Korea/SL20/2020)(H9N2)의 뉴라미다제(neuraminidase; NA)이고,
상기 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질은 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/chicken/Korea/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) 또는 인플루엔자 바이러스 Y280 lineage (A/chicken/Korea/SL20/2020)(H9N2)의 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA)에서 226번 류신이 글루타민으로 변이된 것인, 재조합 인플루엔자 바이러스.
제6항에 있어서,
상기 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 재조합 인플루엔자 바이러스.
제6항에 있어서,
상기 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 재조합 인플루엔자 바이러스.
제3항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스의 PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질은 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질인, 재조합 인플루엔자 바이러스.
제3항에 있어서,
상기 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1: PB1)은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 것인, H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스.
제2항에 있어서,
상기 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein: PA)는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 것인, H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스.
제2항에 있어서,
상기 핵단백질(nucleoprotein: NP)는 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 것인, H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스.
제2항에 있어서,
상기 매트릭스 단백질(matrix: M)은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 것인, H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스.
제2항에 있어서,
상기 비구조 단백질(nonstructural protein: NS)은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 재조합 H9N2 인플루엔자 바이러스.
기탁번호 KCTC 14691BP의 재조합 인플루엔자 바이러스.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신.
제 16항에 있어서,
사독 백신 또는 생독 백신인, 백신.
인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 서열번호 1로 표시되는 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로, 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 변이된 PB2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
인플루엔자 바이러스 A/CHICKEN/KOREA/01310/2001(H9N2)의 서열번호 1로 표시되는 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2: PB2)에서 66번 아이소루신(I)이 메티오닌(M)으로, 109번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 그리고 133번 아이소루신(I)이 발린(V)으로 변이된 PB2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
제19항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함된 것인, 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
제18항의 재조합 벡터 또는 제19항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 발육란에 접종하는 단계를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조방법.
제21항에 있어서,
상기 제조방법은 접종된 발육란을 배양하는 단계를 더 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스 제조방법.