KR101788790B1

KR101788790B1 - 고증식성 및 무병원성 인플루엔자 바이러스

Info

Publication number: KR101788790B1
Application number: KR1020150180487A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 김재홍; 김일환
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2015-12-16
Publication date: 2017-11-15
Also published as: KR20160073342A

Abstract

본 발명은 무병원성 및 고증식성 H5N2 계통 재조합 인플루엔자 바이러스, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스 제조방법, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 백신, 및 상기 재조합 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

고증식성 및 무병원성 인플루엔자 바이러스{HIGHLY REPLICATIVE AND AVIRULENT INFLUENZA VIRUS}

인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M1, M2), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2 (polymerase subunit A, B1 & B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.

조류 인플루엔자 바이러스는 닭에 대한 병원성에 따라 저병원성 조류 인플루엔자와 고병원성 조류 인플루엔자로 분류되는데 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스로는 H5와 H7 아형의 바이러스가 알려져 있으며 이들 바이러스의 고병원성은 HA 단백질의 cleavage site의 반복되는 염기성 단백질 때문인 것으로 알려져 있다. 즉 HA 단백질의 활성화를 위해 단백분해효소에 의해 HA1과 HA2로 절단되어야 하는데 cleavage site에 염기성 아미노산이 반복되는 경우 모든 장기에 분포하는 퓨린 유사 내인성 단백분해효소 (furin-like endogenous protease)에 의해 HA 단백질이 활성화 되므로 바이러스 증식이 일어나며 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 트립신(trypsin)과 같은 외인성 단백분해효소에 의해서만 활성화 되므로 호흡기나 소화기에서만 활성화되어 국소감염만 일어나게 된다.

고병원성 조류인플루엔자 바이러스는 가금의 급성 폐사 뿐 아니라 인체 감염 시 사망에 이르는 치명적인 바이러스로, 특히 돼지에서의 적응과정 없이 조류에서 사람으로 직접 감염되어 발생한 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 1997년 H5N1으로 인해 홍콩에서 18명의 사람이 감염되어 그 중 6명이 사망하고, 이후 2003년 말 아시아에서 시작되어 유럽과 아프리카로 확산 되었으며, 2003년부터 2011년 10월 10일 현재까지 WHO에 보고된 확진 된 사람 감염예는 총 566 명으로, 그 중 332명이 사망하여 58.7%의 사망률을 보이고 있고, 이집트, 인도네시아, 캄보디아에서는 처음 발생한 이후로 매년 감염사례가 보고되고 있어 전 세계적으로 공포의 대상이 되고 있다 (WHO/GIP).

또한, 국내 고병원성 조류인플루엔자는 5차례 발생하였으며 과거 4차례는 H5N1 아형 바이러스에 의해 발생하였고, 최근에는 H5N8 아형 바이러스가 원인이었다. H5N1 아형의 바이러스는 아시아 지역에서 가장 빈발하는 아형이며 이들은 HA 유전자의 계통분류에 의해 몇 가지 clades로 세분되는데 그 중 2.3.2 clade 바이러스들이 가장 빈발하는 것으로 알려져 있다.

과거 인체 A형 인플루엔자 백신은 계태아 증식성이 탁월한 재배열 주를 포르말린으로 불활성화 하여 HA와 NA만을 정제한 단위 백신으로, 항원 생산성 향상을 위해 최신 유행하는 인플루엔자 바이러스와 발육란 증식성이 탁월한 것으로 알려진 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)을 혼합 감염시켜 유행하는 바이러스의 HA와 NA를 갖는 재배열 주를 선발하여 백신 생산에 사용하므로 증식성이 탁월한 것으로 알려져 있다(Kilbourne E.D., Future influenza vaccines and the use of genetic recombinants. Bull. World Health Organ 1969. 41:643).

최근에는 역 유전학 기술을 사용하여 계태아 증식성이 탁월하고, 특성이 잘 알려진 PR8 바이러스나 A/WSN/33 (H1N1) 바이러스나 저온 적응시켜 약독화 시킨 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) 바이러스 등의 8개 게놈을 바이러스 게놈 전사벡터에 클로닝하고, PA, PB1, PB2, NP 코딩 부분을 발현하는 벡터에 클로닝 하여 12개 플라스미드 (특허 제0908757호)를 293T 등의 세포주에 transfection 하여 원하는 바이러스를 제조하거나 벡터의 한 방향으로 바이러스 게놈 전사가 일어나고, 다른 방향으로는 mRNA가 만들어지는 8개의 플라스미드를 trnasfection (특허 제0862758호) 시켜 재조합 바이러스를 제조하고 있으며, 통상적으로 HA와 NA 유전자는 최근 유행하는 바이러스로부터 PCR 법으로 증폭하여 역 유전학 벡터에 클로닝하고, PR8의 나머지 유전자 6개와 함께 transfection 하여 백신주를 제조한 후 바이러스를 불활화하여 사독백신을 제조하고 있다.

H5N1 바이러스의 위협에 대처하기 위한 백신주 개발은 고병원성 H5N1 바이러스의 병원성을 약화시키고, 계태아나 세포주에서의 증식성을 증가시키는 방향으로 이루어졌다. 초기에는 야외에서 분리된 저병원성 H5N1 바이러스를 그대로 사독백신으로 개발하는 연구가 이루어졌으나 낮은 바이러스 역가와 잠재적인 위험성으로 인해 역 유전학 기술을 사용하여 고병원성 H5N1 바이러스의 병원성과 관련된 HA 단백질 cleavage site의 아미노산 서열을 저병원성 바이러스의 서열로 치환한 H5N1 바이러스의 HA 및 NA와 계태아나 세포주에서 증식성이 좋고, 병원성이 낮은 바이러스의 나머지 6개 게놈 분절을 갖도록 재조합 백신주를 개발하고 있다.

PR8 바이러스는 마우스에 대한 병원성이 잔존하고 있기 때문에 역 유전학 기법으로 제조한 PR8 바이러스는 생독백신으로 사용할 수 없는데, PR8 바이러스의 backbone을 사용하지만 NS1 유전자를 결손 시킨 후 NS1 유전자가 없어도 바이러스 증식이 가능한 vero 세포에서 증식시키거나 (Virology 1998, 252:324-330; PLoS one 2009,4(6):e5984), A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000 (H9N2) (KBNP-0028) 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 NS 게놈분절로 PR8의 NS 게놈분절을 교체하여 재조합 PR8 바이러스를 약독화시키거나 (특허 제 1426407호), A/chicken/Korea/01310/2001 (H9N2) (01310) 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 PB2 게놈분절로 PR8의 PB2 게놈분절을 교체하여 재조합 PR8 바이러스를 약독화시키거나 (특허 제 1423695호), 저온에서 적응시켜 병원성을 감소시킨 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) 바이러스의 6개 유전자를 사용하거나 (Virology 2003, 306:18-24; Journal of Virology 2010, 84:44-51), 저온 적응시킨 A/turkey/OH/313053/04 (H3N2) 바이러스의 PB1 유전자에 HA 유전자 유래의 염기서열을 삽입하여 약독화 시키고 있다 (Journal of Virology 2011, 85:456-459).

생독백신은 낮은 역가의 바이러스를 접종해도 생체에서 증식하며 면역을 형성시킬 수 있지만 저온 적응주를 기반으로 제작된 백신주의 생산성이 PR8 대비 현저히 낮은 단점이 있다. 따라서 사독백신의 경우 마우스에 대한 병원성은 잔존하더라도 기존 PR8 바이러스 내부 유전자를 치환하거나 백신 바이러스의 HA 및 NA의 아미노산에 돌연변이를 주어 발육란에서의 증식성을 개선하거나 (Vaccine 2010, 28:8008-8014; Vaccine 2011, 29:5153-5162; Vaccine 2011, 29:8032-8041), HA의 수용기 결합 친화도와 NA의 효소활성의 균형을 맞추어주어 발육란 증식성을 개선하는 기술 개발이 이루어졌다 (특허 제0708593호).

CR6261, F10, C179단클론 항체는 서로 다른 연구자들에 의해 제작되었는데 다양한 HA 아형에서 가장 보존된 줄기 부분의 융합펩티드 (fusion peptide) 부분과 HA2 절편 알파 헬릭스 A 부분을 인식하며 HA1 절편의 318번 아미노산과 HA2 절편 48내지 58 아미노산들을 포함하는 부분이 에피톱 (이후 HA2 공통 에피톱)인 것으로 알려져 있다 (Science 2009, 324:246-251; PLoS one 2008, 3:e3942; Nature Structural and Molecular Biology 2009, 16:265-273; Journal of Virology 1993, 67:2552-2558). 그러나, 이러한 연구는 교차방어 능력이 있는 항체를 이용한 인플루엔자 예방이나 치료를 위한 것으로 치료 효과를 위해서는 다량의 이종 항체의 투여가 불가피하고, 중화항체의 수준도 높지 않아 마우스 폐사는 막을 수 있지만 심각한 체중감소는 예방할 수 없으며 감염 초기에 투여해야 원하는 치료효과를 얻을 수 있다. HA2 공통 에피톱은 다양한 인플루엔자 바이러스에서 보존되어 있어 이종 아형 인플루엔자 바이러스 방어 (heterosubtypic protection)를 위한 유니버셜 백신 (universal vaccine)으로 유망하나 HA 단백질과 바이러스 엔벨롭(envelope)이 연접하는 안쪽 (HA 단백질의 줄기부분)에 위치하여 HA 단백질의 바깥쪽 표면에 위치하는 에피톱 보다 항체 접근성이 낮아 면역원성이 낮을 것으로 예상되었으며 H9N2인플루엔자 백신에서 HA2 공통 에피톱에 대한 항체생산이 더 잘 일어나도록 면역원성을 향상시킨 유니버셜 백신 제작 기술이 개발된 바 있다 (특허 제10-1415836호).

백신접종 한 동물과 감염동물을 구별하기 위한 방법으로 DIVA (differentiating infected from vaccinated animal) 백신이 개발된 바 있다 (Avian Pathology, 2003 32:47-55). 즉, H7N1 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 감염과 백신접종 동물을 구분하기 위해 H7N3 백신을 접종하고, H7N1 바이러스를 감염시켜 감염동물의 혈액에 NA1에 대한 항체 유무를 검사하여 감염을 확인하였다.

이에 본 발명자들은 2010년 유행한 clade 2.3.2.1 H5N1 바이러스(C360)의 HA1의 cleavage site의 반복되는 염기성 아미노산 서열(RERRRKR)을 ASGR로 치환하고, HA2 공통항원의 면역원성을 증가시키기 위해 HA2 154N-linked glycosylation site 아미노산 서열을 ₁₅₄NGT₁₅₆에서 ₁₅₄NGE₁₅₆로 치환하였으며 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스인 01310의 NA와 PB2를 가지며 PR8 바이러스의 나머지 PB1, PA, NP, M, NS 게놈 분절을 갖는 재조합 바이러스(rH5N2-CP-PB2(01310))를 제작하여 발육란 증식성이 뛰어나면서도 마우스 병원성이 전혀 없으며 국내에서 유행한 H5N1과 H5N8과 NA 아형이 달라 DIVA 백신으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 H5N1 바이러스의 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드;를 포함하는 발육란 고증식성 및 무병원성 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 HA5 단백질; 저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 및 중합효소 B2(PB2); 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1), 중합효소 A(PA), 뉴클레오캡시드(NP), 매트릭스 단백질(M) 및 비구조단백질(NS);을 포함하는 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 저병원성 조류인플루엔자의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;를 포함하는 형질전환용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 형질전환용 조성물로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다

본 발명의 일례는 H5N1 바이러스의 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드;를 포함하는 발육란 고증식성 및 무병원성 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물에 관한 것이다.

상기 HA5 단백질은 H5N1 바이러스(예컨데, clade 2.3.2.1 H5N1 바이러스)의 야생형 HA5 단백질이 변형된 HA5 단백질일 수 있으며, H5N1 바이러스의 야생형 HA5의 339번내지 345번 아미노산 서열 RERRRKR을 ASGR로 site-directed mutagenesis 한 것일 수 있다. 또한, 상기 H5N1 바이러스의 변형된 HA5 단백질은 HA1 단백질 및 HA2 단백질로 절단될 수 있다.

상기 변형된 HA5 단백질의 HA1 단백질은 야생형 HA1 단백질의 cleavage site의 반복되는 염기성 아미노산 서열인 RERRRKR을 ASGR로 치환된 변형 HA1 단백질일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA1 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 4의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 변형된 HA5 단백질의 HA2 단밸질은 HA2 공통항원의 면역원성을 증가시키기 위해 야생형 HA2 단백질의 154N-linked glycosylation site 아미노산 서열을 ₁₅₄NGT₁₅₆에서 ₁₅₄NGE₁₅₆로 치환하여 약독화한 154N-glycan 결손 변형 HA5 단백질 일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA2 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 6의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 변형된 HA5 단백질은 상기 변형 HA1 단백질 및 변형 NA2 단백질을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 2의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 NA 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 9의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소 B2(PB2)는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 10의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소 B1(PB1)은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 16의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소 A(PA)는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 17의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 뉴클레오캡시드(NP)는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 18의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 19의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 비구조단백질(NS)은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 20의 염기서열을 포함하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기의 실질적인 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

상기 H5N1 바이러스는 clade 2.3.2.1 H5N1 바이러스(C360)인 것일 수 있다.

또한, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스(이하, 'PR8 바이러스'로 칭함; NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)일 수 있으며, H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 백신주 제작에 널리 사용되는 바이러스이다.

상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)(등록특허 제0708593호, 이하, 'KBNP-0028')이며, 상기 KBNP-0028 균주는 등록특허 제0708593호의 실시예 1에서와 같이 분리된 국내 분리주로서 저병원성이고, 현재 특허균주 기탁기관인 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치하는 유전자은행에 2005년 10월 26일자로 기탁하여 보관중이다(KCTC 10866BP).

본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 HA5 단백질; 저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 및 중합효소 B2(PB2); 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1), 중합효소 A(PA), 뉴클레오캡시드(NP), 매트릭스 단백질(M) 및 비구조단백질(NS);을 포함하는 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다.

상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 H5N1 바이러스의 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드; 저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 변형된 HA5 단백질의 HA1 단백질은 야생형 HA1 단백질의 cleavage site의 반복되는 염기성 아미노산 서열인 RERRRKR을 ASGR로 치환된 변형 HA1 단백질일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA1 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 변형된 HA5 단백질의 HA2 단밸질은 HA2 공통항원의 면역원성을 증가시키기 위해 야생형 HA2 단백질의 154N-linked glycosylation site 아미노산 서열을 ₁₅₄NGT₁₅₆에서 ₁₅₄NGE₁₅₆로 치환하여 약독화한 154N-glycan 결손 변형 HA5 단백질 일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA2 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 변형된 HA5 단백질은 상기 변형 HA1 단백질 및 변형 NA2 단백질을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 NA 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소 B2(PB2)는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소 B1(PB1)은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소 A(PA)는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 뉴클레오캡시드(NP)는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 비구조단백질(NS)은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 H5N1 바이러스, H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 및 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 상기 기재한 바와 동일하다.

상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 대전에 소재하는 생명공학연구원 유전자원센터에 2014년 12월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC12733BP를 부여 받았다.

본 발명자들은 clade 2.3.2.1 H5N1 바이러스의 HA의 cleavage site의 반복되는 염기성 아미노산 서열(RERRRKR)을 ASGR로 치환하고, HA2 공통항원의 면역원성을 증가시키기 위해 HA2 154N-linked glycosylation site 아미노산 서열을 ₁₅₄NGT₁₅₆에서 ₁₅₄NGE₁₅₆로 치환하였으며 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스인 01310의 NA를 가지며 나머지 PR8 바이러스의 나머지 6개 PB1, PB2, PA, NP, M, NS 게놈 분절을 갖는 재조합 바이러스(rH5N2-CP)와 01310의 PB2를 추가로 가지며 나머지 5개 게놈 분절을 갖는(rH5N2-CP-PB2(01310))의 증식성을 확인하기 위해 10^- ¹내지 10^-9까지 10진 희석한 rH5N2-CP-PB2(01310)을 10일령 SPF 발육란에 요막강 경로로 100ul씩 접종하였고, 아침과 저녁으로 매일 계태아 생사를 확인하며 3일간 37에서 배양하였다. 또한, 마우스 병원성을 확인하기 위해 6주령 BALB/c 마우스에 수당 10⁶ EID₅₀/ml 을 접종하여 병원성을 측정한 결과 rH5N2-CP와 rH5N2-CP-PB2(01310)은 모두 높은 증식성을 보였고, rH5N2-CP와 rH5N2-CP-PB2(01310) 모두 관찰 기간 동안 체중의 변화가 없었으나 rH5N2-CP의 경우 3일과 6일 폐장에서 비교적 높은 농도의 바이러스가 검출되었으나 rH5N2-CP-PB2(01310)에서는 바이러스가 검출되지 않아 병원성이 없는 것으로 확인되었다.

따라서, 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 발육란 증식성이 우수하고, 마우스 병원성이 없어서 안전하고 효과 좋은 인플루엔자 바이러스 백신 제작에 매우 유용하며, 특히 우수한 안전성으로 인하여 사독백신뿐 아니라 생독백신으로 사용 가능하다.

본 발명의 또 다른 일례는 H5N1 바이러스의 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 저병원성 조류인플루엔자의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;를 포함하는 형질전환용 조성물에 관한 것이다.

상기 각각의 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 각각의 벡터에 포함되어 총 8개의 벡터에 나누어져 포함된 것일 수 있으며, 또는 하나의 벡터에 2종 이상의 상기 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 포함된 것일 수 있으며, 예들 들어, 상기 8종의 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 1개의 벡터에 모두 포함된 것일 수도 있다.

상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, ?gt4?B, ?-Charon, 奫z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pL? 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 형질전환용 조성물로 형질전환된 세포에 관한 것이다.

상기 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15 및 ST1 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포이면 사용 가능하다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신에 관한 것이다.

상기 백신은 면역원성이 우수할 뿐 아니라 마우스를 비롯한 포유류와 조류에 대하여 병원성이 없어서 사독백신뿐 아니라 생독백신으로도 사용 가능하다.

또한, 상기 백신은 닭과 오리 등의 조류뿐 아니라 인간, 돼지, 개, 마우스, 말, 고양이, 소, 면양, 산양, 낙타 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다.

또한, 국내에서 유행한 H5N1과 H5N8과 NA 아형이 달라 DIVA 백신으로도 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.

상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 진단 대상은 조류 또는 포유류일 수 있으며, 예를 들어, 인간을 제외한 포유류 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조방법은 제조된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 무병원성 및 고증식성 H5N2 계통 재조합 인플루엔자 바이러스, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스 제조방법, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 백신, 및 상기 재조합 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 H5N2 계통 재조합 인플루엔자 바이러스는 발육란 고증식성, 마우스 무병원성, DIVA 가능 백신뿐만 아니라 진단용 항원 및 포유류 병원성 조류인플루엔자 백신주 확보 차원으로써도 유용하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 rH5N2-CP-PB2(01310)와 rH5N2-CP 재조합 바이러스를 BALB/c 마우스 접종한 후 체중 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

비교예 1. rH5N2-CP 바이러스 제조

Clade 2.3.2.1 H5N1 바이러스의 약독화된 HA cleavage site와 HA2 154N-glycan 결손된 HA5와 01310 NA2 게놈 분절을 갖는 PR8 재조합 바이러스 (rH5N2-CP) 제작를 제작하기 위해, 호프만 박사의 역유전학 벡터시스템 (특허 제0862758호)을 사용하였다.

구체적으로, clade 2.3.2.1 바이러스 (C360)의 HA5의 339번내지 345번 아미노산 서열 RERRRKR을 ASGR로 site-directed mutagenesis 하였고, HA2 154N-linked glycosylation site 아미노산 서열을 ₁₅₄NGT₁₅₆에서 ₁₅₄NGE₁₅₆로 치환하여 클로닝한 약독화 154N-glycan 결손 HA5 게놈 절편 호프만 벡터와 H9N2 아형 바이러스인 01310을 발육란에서 20대 계대한 바이러스 (01310-E20)의 NA 게놈 절편이 클로닝된 호프만 벡터, PR8의 PB2, PB1, PA, NP, M, NS 게놈 절편이 클로닝된 호프만 벡터 [St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공 받은 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW195-NP, 및 pHW197-M 역유전학용 플라스미드 (Vaccine 2002, 20:3165-3170; pHW2000 (등록특허 제10-0862758호 참조)) 플라스미드를 준비하였다.

그 다음, 293T 세포 (생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5% (v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X10⁶개/2ml 부유하여 각 웰에 첨가한 후 3 내지 4시간 동안 부착시킨 후, 배지를 제거하고 Opti-MEM 배지 (Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.

그 다음, 상기 준비된 플라스미드 8개를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각 300ng씩의 양으로 넣고, 최종 25ul가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 plus reagent (Invitrogen Co. USA) 6ul와 Opti-MEM 배지 69ul를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다.

그 다음, lipofectamine 4ul (Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96ul를 혼합하여 15분간 반응한 후 100ul를 취하여 상기 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다. 얻어진 반응 생성물을 상기293T 세포가 들어있는 각 웰에 100ul를 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO₂, 37에서 20시간 배양한 후 웰 당 트립신 10ug (2.5ug/4ul)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발육란을 37에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집 여부를 확인한 결과 모두 혈구응집 양성을 보였다.

이 재조합 바이러스의 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스를 rH5N2-CP로 명명하고, -70에서 보관하며 실험에 사용하였다.

실시예 1. rH5N2-CP-PB2(01310) 재조합 바이러스 제조

Clade 2.3.2.1 H5N1 바이러스의 약독화된HA cleavage site와 HA2 154N-glycan 결손된 HA5, 01310 NA2 및 PB2 게놈 분절을 갖는 PR8 재조합 바이러스 (rH5N2-CP-PB2(01310)) 제작하기 위해, 상기의 약독화 154N-glycan 결손 HA5 게놈 절편 호프만 벡터와 H9N2 아형 바이러스인 01310을 발육란에서 20대 계대한 바이러스 (01310-E20)의 NA 게놈 절편이 클로닝된 호프만 벡터와 01310-E20 PB2 게놈 절편이 클로닝된 호프만 벡터 (특허 제 1426407호), PR8의 PB1, PA, NP, M, NS 게놈 절편이 클로닝된 호프만 벡터 [St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공 받은 pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW195-NP, 및 pHW197-M 역유전학용 플라스미드 (Vaccine 2002, 20:3165-3170; pHW2000 (특허 제10-0862758호 참조))] 플라스미드를 준비하였다.

그 다음, 293T 세포 (생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5% (v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X10⁶개/2ml 부유하여 각 웰에 첨가한 후 3-4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후 Opti-MEM 배지 (Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.

그 다음, lipofectamine 4ul (Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96ul를 혼합하여 15분간 반응한 후 100ul를 취하여 상기 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다. 얻어진 반응 생성물을 상기293T 세포가 들어있는 각 웰에 100ul를 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO₂, 37에서 20시간 배양한 후 웰당 트립신 10ug (2.5ug/4ul)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발육란을 37에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집 여부를 확인한 결과 모두 혈구응집 양성을 보였다. 이 재조합 바이러스의 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스를 -70에서 보관하며 실험에 사용하였다.

이 바이러스를 rH5N2-CP-PB2(01310)로 명명하고, 대전에 소재하는 생명공학연구원 유전자원센터에 2014년 12월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 12733BP를 부여 받았다.

실시예 2. 바이러스 역가 측정

상기의 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가 (50% embryo infection dose, EID₅₀/ml)를 측정하기 위하여, 각각의 재조합 바이러스들을 인산완충용액으로 10^-1 내지 10^-9까지 10진 희석하여 각 희석 배수 별로 10-11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강 경로로 100ul씩 접종하였다. 그 후 3일간 배양한 후, 요막액을 수확하여 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하여 Reed-Muench 계산식에 따라 바이러스 역가 (EID₅₀/ml)를 측정하고, 얻어진 바이러스 역가 (EID₅₀/ml(log10))를 아래의 표 1에 나타내었다.

Recombinant viruses	EID50/ml(log10)
rH5N2-CP	9.3±0.3
rH5N2-CP-PB2(01310)	9.4±0.4

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 바이러스 역가 (EID₅₀/ml(log10))를 살펴보면, rH5N2-CP 의 경우 10^9.3, rH5N2-CP-PB2(01310)의 경우 10^9.4 EID₅₀/ml을 보여서, rH5N2-CP와 rH5N2-CP-PB2(01310)는 모두 높은 계태아 증식성을 보임을 확인하였다.

실시예 3. 마우스 병원성 측정

상기 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 각각 10진 희석하여 졸레틸 (Virbac S.A., France) 15mg/kg로 마취한 BALB/C 마우스 (6주령 암컷, 주식회사 코아텍) 5수에 비강으로 각각 10⁶EID₅₀를 접종하였다. 그 후, 매일 폐사 유무를 조사하였고, 체중을 측정하여 체중 변화를 도 1에 나타내었으며, 체중이 25% 감소 한 경우 폐사한 것으로 간주하였다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, rH5N2-CP 및 rH5N2-CP-PB2(01310)은 대조군(바이러스 대신 인산완충용액 접종)과 같이 폐사율이 0% 였다.

또한, 접종 3일과 6일 후에 BALB/c 마우스 3마리를 각각 희생시켜 폐장에서의 바이러스 유무와 역가를 상기의 방법과 동일한 방법으로 측정하여 하기의 표 2에 타나내었다.

Virus^a	Virus reisolation in mouse lung^b
Virus^a	3 DPI	6 DPI
rH5N2-CP	3/3 (4.1)	3/3 (2.9)
rH5N2-CP-PB2(01310)	0/3 (<0.5)	0/3 (<0.5)
Mock(PBS)	0/3 (<0.5)	0/3 (<0.5)

표 2에서 확인할 수 있듯이, rH5N2-CP 은 3일과 6일 후에 각각 10^4.1EID₅₀와 10^2.9EID₅₀의 역가를 보였다. 그러나 rH5N2-CP-PB2(01310)은 3일과 6일 후에 모두 바이러스가 검출되지 않아 마우스 폐장에서의 증식성이 없는 것으로 확인 되었다.

한국생명공학연구원

KCTC12733BP

20141215

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> HIGHLY REPLICATIVE AND AVIRULENT INFLUENZA VIRUS <130> DPP20156133KR <150> KR 10-2014-0181877 <151> 2014-12-16 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H5N1 HA5 (H5-ASGR-NGE (H5N1)) <400> 1 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Thr Thr Ile Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Leu Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Lys Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Ser Glu His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly 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aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaaggaga ctccacaatt 840 atgaaaagtg aagtggaata tggtaactgc aacaccaggt gtcagactcc gataggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcggaga atgtcccaaa 960 tatgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tcaagcatca 1020 ggtaggggac tgtttggagc tatagcaggt tttatagagg gaggatggca gggaatggta 1080 gatggttggt atgggtacca ccacagcaat gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa 1140 gaatctactc aaaaggcaat agacggagtc accaataagg tcaactcgat cattgacaaa 1200 atgaacactc agtttgaggc cgtaggaagg gaatttaata acttagagag gagaatagag 1260 aatttaaaca agaagatgga agacggattc ctagatgttt ggacttataa tgctgaactt 1320 ctggttctca tggaaaatga gagaactcta gatttccatg actcaaatgt caagaacctt 1380 tacgataagg tcagactaca gcttaaggat aatgcaaaag agttgggtaa cggttgtttc 1440 gagttctatc acaaatgtaa taatgaatgt atggaaagtg taagaaacgg agaatatgac 1500 tacccgcagt attcagaaga agcaagacta aaaagagagg aaataagtgg agtaaaattg 1560 gaatcaatag gaatctacca aatactgtca 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gtaataatga atgtatggaa agtgtaagaa acggagaata tgactacccg 480 cagtattcag aagaagcaag actaaaaaga gaggaaataa gtggagtaaa attggaatca 540 ataggaatct accaaatact gtcaatttat tcaacagtgg cgagttccct agtgctggca 600 atcatgatgg ctggtctgtc tttatggatg tgttccaacg gatcgttaca gtgcagaatt 660 tgcatttaa 669 <210> 7 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 01310 NA <400> 7 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Ala Thr Thr 20 25 30 Val Thr Leu His Phe Lys Gln Asn Glu Cys Ser Ile Pro Ser Asn Asn 35 40 45 Gln Ala Val Pro Cys Asp Ile Glu Lys Glu Leu Cys Pro Lys Val Val 50 55 60 Glu Tyr Arg Ser Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe Ala 65 70 75 80 Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Ser Ile 85 90 95 Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Ser Ser Asn Lys Cys Tyr 100 105 110 Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asp Asn Lys His Ser Asn 115 120 125 Gly Thr Ile His 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agaaatgcaa ctgctagttt catttatgat ggagtgcttg ttgacagtat tggctcatgg 600 tctcaaaata ttctcagaac tcaggagtca gaatgcgttt gcatcaatgg aacttgtaca 660 gtagtaatga ctgatggaag tgcatcagga agagctgaca ctagaatact attcattaaa 720 gaggggaaaa ttgtacatat tagccaatta tcaggaagtg ctcagcatat agaggaatgt 780 tcttgttatc ccagatatcc agacgtcaga tgtgtttgca gagacaattg gaaaggatct 840 aataggccca ttatagatat aaatatggcg gattatagca ttgattccag ttatgtgtgc 900 tcgggacttg ttggcgacac accaaggaat gatgatagct ctagcaacag caactgcaaa 960 gatcctaata atgagagagg gaacccggga gtaaaagggt gggcctttga ctatggaaat 1020 gatgtttgga tggggagaac aatcagcaag gattcacgct caggttatga aactttcaga 1080 gtcattggtg gttggaccac agctaactcc aaatcacagg tgaatagaca agtcatagtt 1140 gacaataaca actggtctgg ttattctggc attttctctg ttgaaggcaa aagctgcatc 1200 aataggtgtt tttatgtgga gttgataaga ggaaggccac aagagactag agtatggtgg 1260 acctcaaaca gcattgtcgt gttttgtggc acttcaggta cctatggaac aggctcatgg 1320 cctgatgggg cgaatatcaa ttttatgcct atataa 1356 <210> 10 <211> 2280 <212> DNA <213> 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gaaacattgt aaggagagca acagtatcag cagacccatt ggcctcgctc 840 ttggagatgt gtcatggtac acaaataggc ggaataagaa tggtagacat ccttagacaa 900 aacccaacag aagagcaagc cgtggatata tgcaaggcag caataggcct aagaatcagt 960 tcatctttca gctttggagg tttcactttc aaaagaacaa gtgggtcttc tgtcaagaag 1020 gaagaagaag tgcttacagg caacctccag acattgaaaa taagagtgca tgagggatat 1080 gaggaattca caatggttgg gcgaagagca acagccctcc taaggaaagc aaccagaagg 1140 ctgattcaac tgatagtaag tgggagagac gaacaatcaa tcgctgaagc gatcattgta 1200 gcaatggtat tttcacaaga ggactgcatg ataaaggcag tccgaggtga tttgaacttc 1260 gtgaacagag cgaaccagcg actgaacccc atgcaccaac ttctgaggca cttccaaaaa 1320 gatgcaaaag tgttgtttca gaactgggga attgaaccca tcgacaatgt catggggatg 1380 attggaatat tgcccgacat gactcccagc acagagatgt cactaagagg agtgagagtc 1440 agcaaaatgg gagtggacga atactctagc actgaaagag tggttgtgag tattgatcgt 1500 ttcttaaggg ttcgagatca gagggggaac atacttctat cccctgaaga agttagtgag 1560 acacaaggga cggaaaagtt aacaataaca tattcatcgt ctatgatgtg ggagattaac 1620 ggcccggaat cagtgctagt taacacatac caatggatca ttaggaattg ggagactgtg 1680 aagattcagt ggtctcaaga tcctactatg ttatacaata aggtggaatt tgaacccttt 1740 caatctctgg tacctaaagc tgccagaggc caatatagtg gatttgtgag aacgctattc 1800 caacaaatgc gtgatgtact gggaacattt gacactgttc agataataaa gctgctacca 1860 tttgccgcag ccccaccaga gcagagtagg atgcagtttt cttctctgac tgtgaatgta 1920 agaggctcag gaatgagaat ccttgtgaga ggcaactccc ctgtgtttaa ttacaacaag 1980 gcaaccaaga ggcttacagt cctcgggaag gatgcaggtg cactcacaga agacccagat 2040 gaaggaacag caggagtgga atccgcagta ttgagaggat tcctaattct aggcaaagaa 2100 gacaagagat acggaccagc attgagcatc aacgaattga gcaatcttgc gaaaggggag 2160 aaagctaatg tattgatagg gcaaggagac gtagtgttgg taatgaaacg gaaacgggac 2220 tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcgaatggc catcaattag 2280 2280 <210> 11 <211> 757 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of PR8 PB1 <400> 11 Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gln Asn 1 5 10 15 Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp 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ccagcaacag ctcaaatggc ccttcagttg ttcatcaaag attacaggta cacgtaccga 1680 tgccatatag gtgacacaca aatacaaacc cgaagatcat ttgaaataaa gaaactgtgg 1740 gagcaaaccc gttccaaagc tggactgctg gtctccgacg gaggcccaaa tttatacaac 1800 attagaaatc tccacattcc tgaagtctgc ctaaaatggg aattgatgga tgaggattac 1860 caggggcgtt tatgcaaccc actgaaccca tttgtcagcc ataaagaaat tgaatcaatg 1920 aacaatgcag tgatgatgcc agcacatggt ccagccaaaa acatggagta tgatgctgtt 1980 gcaacaacac actcctggat ccccaaaaga aatcgatcca tcttgaatac aagtcaaaga 2040 ggagtacttg aggatgaaca aatgtaccaa aggtgctgca atttatttga aaaattcttc 2100 cccagcagtt catacagaag accagtcggg atatccagta tggtggaggc tatggtttcc 2160 agagcccgaa ttgatgcacg gattgatttc gaatctggaa ggataaagaa agaagagttc 2220 actgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atag 2274 <210> 17 <211> 2151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 PA <400> 17 atggaagatt ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgattg tcgagcttgc ggaaaaaaca 60 atgaaagagt atggggagga cctgaaaatc gaaacaaaca 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gaaggaaccc 960 aatgttgtta aaccacacga aaagggaata aatccaaatt atcttctgtc atggaagcaa 1020 gtactggcag aactgcagga cattgagaat gaggagaaaa ttccaaagac taaaaatatg 1080 aagaaaacaa gtcagctaaa gtgggcactt ggtgagaaca tggcaccaga aaaggtagac 1140 tttgacgact gtaaagatgt aggtgatttg aagcaatatg atagtgatga accagaattg 1200 aggtcgcttg caagttggat tcagaatgag tttaacaagg catgcgaact gacagattca 1260 agctggatag agctcgatga gattggagaa gatgtggctc caattgaaca cattgcaagc 1320 atgagaagga attatttcac atcagaggtg tctcactgca gagccacaga atacataatg 1380 aagggagtgt acatcaatac tgccttgctt aatgcatctt gtgcagcaat ggatgatttc 1440 caattaattc caatgataag caagtgtaga actaaggagg gaaggcgaaa gaccaacttg 1500 tatggtttca tcataaaagg aagatcccac ttaaggaatg acaccgacgt ggtaaacttt 1560 gtgagcatgg agttttctct cactgaccca agacttgaac cacataaatg ggagaagtac 1620 tgtgttcttg agataggaga tatgcttata agaagtgcca taggccaggt ttcaaggccc 1680 atgttcttgt atgtgagaac aaatggaacc tcaaaaatta aaatgaaatg gggaatggag 1740 atgaggcgtt gcctcctcca gtcacttcaa caaattgaga gtatgattga agctgagtcc 1800 tctgtcaaag agaaagacat gaccaaagag ttctttgaga acaaatcaga aacatggccc 1860 attggagagt cccccaaagg agtggaggaa agttccattg ggaaggtctg caggacttta 1920 ttagcaaagt cggtattcaa cagcttgtat gcatctccac aactagaagg attttcagct 1980 gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaacctgga acctgggacc 2040 tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc tgattaatga tccctgggtt 2100 ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc cttacacatg cattgagtta g 2151 <210> 18 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 NP <400> 18 atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttac gaacagatgg agactgatgg agaacgccag 60 aatgccactg aaatcagagc atccgtcgga aaaatgattg gtggaattgg acgattctac 120 atccaaatgt gcaccgaact caaactcagt gattatgagg gacggttgat ccaaaacagc 180 ttaacaatag agagaatggt gctctctgct tttgacgaaa ggagaaataa ataccttgaa 240 gaacatccca gtgcggggaa agatcctaag aaaactggag gacctatata caggagagta 300 aacggaaagt ggatgagaga actcatcctt tatgacaaag aagaaataag gcgaatctgg 360 cgccaagcta ataatggtga cgatgcaacg gctggtctga ctcacatgat gatctggcat 420 tccaatttga atgatgcaac ttatcagagg acaagagctc ttgttcgcac cggaatggat 480 cccaggatgt gctctctgat gcaaggttca actctcccta ggaggtctgg agccgcaggt 540 gctgcagtca aaggagttgg aacaatggtg atggaattgg tcagaatgat caaacgtggg 600 atcaatgatc ggaacttctg gaggggtgag aatggacgaa aaacaagaat tgcttatgaa 660 agaatgtgca acattctcaa agggaaattt caaactgctg cacaaaaagc aatgatggat 720 caagtgagag agagccggaa cccagggaat gctgagttcg aagatctcac ttttctagca 780 cggtctgcac tcatattgag agggtcggtt gctcacaagt cctgcctgcc tgcctgtgtg 840 tatggacctg ccgtagccag tgggtacgac tttgaaaggg agggatactc tctagtcgga 900 atagaccctt tcagactgct tcaaaacagc caagtgtaca gcctaatcag accaaatgag 960 aatccagcac acaagagtca actggtgtgg atggcatgcc attctgccgc atttgaagat 1020 ctaagagtat taagcttcat caaagggacg aaggtgctcc caagagggaa gctttccact 1080 agaggagttc aaattgcttc caatgaaaat atggagacta tggaatcaag tacacttgaa 1140 ctgagaagca ggtactgggc cataaggacc agaagtggag gaaacaccaa tcaacagagg 1200 gcatctgcgg gccaaatcag catacaacct acgttctcag tacagagaaa tctccctttt 1260 gacagaacaa ccattatggc agcattcaat gggaatacag aggggagaac atctgacatg 1320 aggaccgaaa tcataaggat gatggaaagt gcaagaccag aagatgtgtc tttccagggg 1380 cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcagcgagcc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440 atgagtaatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtacga caattaa 1497 <210> 19 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 M <400> 19 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120 gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180 ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300 aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360 gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420 gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480 tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540 ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600 gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660 actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720 cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtga 759 <210> 20 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PR8 NS <400> 20 atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgagttgcag accaagaact aggcgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120 aaatccctaa gaggaagggg cagtactctc ggtctggaca tcaagacagc cacacgtgct 180 ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240 atggcctctg tacctgcgtc gcgttaccta actgacatga ctcttgagga aatgtcaagg 300 gactggtcca tgctcatacc caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac 360 caggcgatca tggataagaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420 ctggagactc taatattgct aagggctttc accgaagagg gagcaattgt tggcgaaatt 480 tcaccattgc cttctcttcc aggacatact gctgaggatg tcaaaaatgc agttggagtc 540 ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600 ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacga 660 gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tga 693

Claims

clade 2.3.2.1 H5N1 바이러스(C360)의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드;
저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드;
를 포함하는 발육란 고증식성 및 무병원성 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 NA 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중합효소 B2(PB2)는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중합효소 B1(PB1)은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중합효소 A(PA)는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드(NP)는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 단백질(M)은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 비구조단백질(NS)은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자는 A/chicken/Korea/01310/2001 인 것인, 조성물.
H5N1 바이러스의 HA5 단백질;
저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 및 중합효소 B2(PB2); 및
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1), 중합효소 A(PA), 뉴클레오캡시드(NP), 매트릭스 단백질(M) 및 비구조단백질(NS);
을 포함하는 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스.
제21항에 있어서, 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스는,
H5N1 바이러스의 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드;
저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드;
를 추가로 포함하는 것인, 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스.
제21항에 있어서, 상기 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스는, 기탁번호 KCTC12733BP 바이러스인 것인, 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스.
H5N1 바이러스의 HA5 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
저병원성 조류인플루엔자의 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
저병원성 조류인플루엔자의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터;
를 포함하는 형질전환용 조성물.
제24항의 형질전환용 조성물로 형질전환된 세포.
제25항에 있어서, 상기 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 세포.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신.
제27항에 있어서, 상기 백신은 생독백신인 것인, 백신.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 생성 유효량의 제1항, 제3항 내지 제17항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조방법.
제30항에 있어서, 상기 제조방법은 제조된 재조합 H5N2 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.