KR101415836B1 - 면역원성이 향상된 인플루엔자 바이러스의 ｈａ2 공통 에피톱의 제조 방법 - Google Patents

면역원성이 향상된 인플루엔자 바이러스의 ｈａ2 공통 에피톱의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 유래의 HA2 절편의 154번째 아미노산인 아스파라긴(N)에 N-글리칸 생성이 일어나지 않도록 154번째 아미노산인 아스파라긴 또는 156번째 아미노산인 세린(S)이나 트레오닌(T)을 다른 아미노산으로 치환하여 HA2 공통 에피톱에 대한 면역원성을 증가시키는 방법과 이러한 방법을 통해 면역원성이 증가된 재조합 바이러스가 제공된다. 본 발명의 HA2 공통 에피톱 면역원성 향상기술과 HA2 공통 에피톱 고면역원성 바이러스는 인플루엔자 예방을 위한 백신주 개발과 백신주로써 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역원성이 향상된 인플루엔자 바이러스의 ＨＡ2 공통 에피톱의 제조 방법{A METHOD OF PREPARING HA2 COMMON EPITOPE OF INFLUENZA VIRUS WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY}
본 발명은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 HA2 절편에 존재하는 공통 에피톱(이하 "HA2 공통 에피톱")에 대한 면역원성을 향상시키기 위한 기술과 그 기술을 적용하여 제작한 인플루엔자 바이러스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 공통 에피톱에 가까이 위치한 HA2 절편의 154번째 아미노산인 아스파라긴(N)에 N-글리칸 생성이 일어나지 않도록 154번째 아미노산인 아스파라긴 또는 156번째 아미노산인 세린(S)이나 트레오닌(T)을 다른 아미노산으로 치환하여 면역원성이 증가된 HA2 공통 에피톱을 제조하는 방법과 이러한 방법을 통해 면역원성이 증가된 재조합 바이러스에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 오소믹스바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS)으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 중합효소 단위체 B2, B1 및 A (polymerase subunit B2, B1 & A; 각각 PA, PB1, PB2), 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M1, M2), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.
인플루엔자 바이러스는 NP와 M의 항원성에 따라 A, B, C형(type)으로 분류되며 HA 단백질과 NA 단백질의 항원성에 따라 HA 단백질은 16개의 아형(subtype)과 NA 단백질은 9개의 아형으로 세분되며 이러한 HA와 NA 단백질 아형의 조합에 의해 144종의 인플루엔자 바이러스 아형이 존재한다. HA 단백질은 내인성 또는 외인성 단백분해효소에 의해 HA1 절편과 HA2 절편으로 잘라지며 이 둘은 디설파이드(disulfide) 결합으로 연결되어있다. HA 단백질은 아미노산 서열의 유사성에 따라 4개의 클레이드, H1(H1, H2, H5, H6, H11, H13, H16으로 구성); H3(H3, H4, H14로 구성), H7(H7, H10, H15로 구성); H9(H8, H9, H12로 구성)로 분류된다(PLoS one 2008, 3:e3942).
최근 역유전학 기술을 사용하여 계태아 증식성이 탁월하며 특성이 잘 알려진 PR8 바이러스나 A/WSN/33(H1N1) 바이러스나 저온 적응시켜 약독화 시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스 등의 8개 게놈을 바이러스 게놈 전사벡터에 클로닝하고, PA, PB1, PB2, NP 코딩 부분을 발현하는 벡터에 클로닝 하여 12개 플라스미드(특허 제0908757호)를 293T 등의 세포주에 트랜스펙션하여 원하는 바이러스를 작출하거나 벡터의 한 방향으로 바이러스 게놈 전사가 일어나고, 다른 방향으로는 mRNA가 만들어지는 8개의 플라스미드를 트랜스펙션(특허 제0862758호; Vaccine 2002, 20:3165-3170)시켜 재조합 바이러스를 작출하고 있다.
인플루엔자 바이러스의 방어에는 HA 단백질이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 HA 단백질에는 바이러스 간에 고 다양성-인플루엔자 바이러스의 숙주 항체 반응을 회피하는 과정에서 발생한 돌연변이 결과-을 보이는 A, B, C, D, E 부분이 에피톱으로 중요한 것으로 알려져 있다(Nature 1981, 289:373378; Journal of General Virology 1982, 62:153-169). 이러한 인플루엔자 바이러스 에피톱의 고 다양성으로 인해 최근 유행하는 바이러스의 HA와 NA 단백질의 항원성을 기존 백신과 비교하여 차이가 있는 경우 교체하여 방어능력을 극대화 시키고 있다.
지금까지 발생한 인플루엔자 대유행 사례를 살펴보면 대유행 직전 유행한 인플루엔자 바이러스와 항원성 면에서 큰 차이를 보이는 바이러스들이 사람에 감염됨으로써 사람 간 전파가 급속도로 일어나 큰 피해를 초래한 것으로 기존 자연감염이나 백신 접종으로 생성된 항체가 새로운 바이러스에 대해 교차방어 능력이 없거나 낮았음을 의미한다. 따라서 최근에는 방어항원이면서도 인플루엔자 바이러스 간 보존되어 있는 에피톱을 발굴하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다. NP 단백질과 M1 단백질은 타입 A 인플루엔자 바이러스에서는 보존되어 있어 백시니아 바이러스에 인플루엔자 바이러스의 NP와 M1 유전자를 삽입한 백신이나, 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질과 M1 단백질로 바이러스유사결정(virus-like particle, VLP)으로 만든 백신이나 M2e 단백질의 항원성 펩티드 백신이 교차방어 능력이 있음을 보고하였다(Clinical Infectious Diseases, 2011, 52:1; PLoS one 2010, 5:e13972; Virology Journal 2010, 7:151).
최근에는 빈번한 돌연변이로 인해 항원성에 차이가 있는 것으로 알려진 HA 단백질에서 동일한 아형이나 서로 다른 아형의 HA 단백질에서 보존되어 있는 에피톱들이 재조합 단클론항체 기술을 통해 발굴되었다. 사람 단클론 항체인 5J8은 HA 단백질의 수용기 결합부분 주변에 존재하는 133, 137, 199, 222번 아미노산을 인식하는 항체로 20세기 출현한 H1N1 인플루엔자 바이러스와 2009년 대유행 H1N1 바이러스에 대한 중화능력이 있어 이 아미노산들로 이루어진 에피톱이 교차방어에 중요한 것으로 알려졌고(Journal of Virology 2011, 85:10905-10908), 13D4 및 9F4 단클론 항체는 다양한 H5N1 바이러스들을 중화하는 것으로 알려져 있으며 에피톱은 각각152번과 182번 아미노산과 260번 내지 263번 아미노산으로 이루어져 있다(Journal of Infectious Diseases 2009, 199:49; Journal of Virology 2010, 84:8275-8286).
F045-092와 F026-427 사람 단클론 항체는 H1, H2, H3, H5 아형의 인플루엔자 바이러스들을 교차중화 시킬 수 있는 것으로 알려져 있고, 에피톱에서 136번 세린이 중요한 것으로 알려져 있다(Journal of Virology 2011, 85:11048-11057). S139/1 단클론 항체는 H1, H2, H3, H13 인플루엔자 바이러스에 대한 교차중화 능력이 있으며 E193, E156, N158이 에피톱을 구성하는 것으로 알려져 있고(PLoS PATHOGENS 2009, 5:e1000350)), 1C9 단클론 항체는 많은 인플루엔자 바이러스에서 보존된 융합펩티드(fusion peptide)에 결합하는 것으로 알려졌으며 H5N1 바이러스 감염에 의한 마우스 폐사를 방어할 수 있는 것으로 보고되었다(Journal of Virology 2009, 83:2553-2562). CR6261, F10, C179단클론 항체는 서로 다른 연구자들에 의해 제작되었는데 다양한 HA 아형에서 가장 보존된 줄기 부분의 융합펩티드(fusion peptide) 부분과 HA2 절편 알파 헬릭스 A 부분을 인식하며 HA1 절편의 318번 아미노산과 HA2 절편 48내지 58 아미노산들을 포함하는 부분이 에피톱(이후 HA2 공통 에피톱)인 것으로 알려져 있다 (Science 2009, 324:246-251; PLoS one 2008, 3:e3942; Nature Structural and Molecular Biology 2009, 16:265-273; Journal of Virology 1993, 67:2552-2558). 그러나 이러한 연구는 교차방어 능력이 있는 항체를 이용한 인플루엔자 감염증 예방이나 치료를 위한 것으로 치료 효과를 위해서는 다량의 이종 항체의 투여가 불가피하고, 중화항체의 수준도 높지 않아 마우스 폐사는 막을 수 있지만 심각한 체중감소는 예방할 수 없으며 감염 초기에 투여해야 원하는 치료효과를 얻을 수 있다. HA2 공통 에피톱은 다양한 인플루엔자 바이러스에서 가장 보존되어 있어 이종 아형 인플루엔자 바이러스 방어(heterosubtypic protection)를 위한 유니버셜 백신(universal vaccine)으로 유망하나 HA 단백질과 바이러스 엔벨롭이 연접하는 안쪽(HA 단백질의 줄기부분)에 위치하여 HA 단백질의 바깥쪽 표면에 위치하는 에피톱 보다 항체 접근성이 낮아 면역원성이 낮을 것으로 예상된다. 따라서 현재 널리 사용되는 인플루엔자 백신에서 HA2 공통 에피톱에 대한 항체생산이 더 잘 일어나도록 면역원성을 향상시킨 유니버셜 백신 개발이 필요하나 현재까지 이러한 기술은 개발된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 증대시키기 위해 저병원성 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2 바이러스의 HA2 절편의 154번 아스파리긴에 결합되는 글리칸(이후 154N-글리칸)을 결손 시킨 바이러스를 역 유전학 기술로 제작하였으며 이 바이러스들과 이들의 모 바이러스(154N-글리칸 보유)를 각각 함유하는 사독오일백신을 제작한 후 닭에 접종하여 얻은 항혈청의 혈구응집억제능력을 H9N2 모 바이러스로 측정하여 항체생성 여부를 확인하였고, 모 바이러스(H9 클레이드)와 다른 클러스터에 속하는 H5N1 바이러스(H1 클레이드) 방어능력을 바이러스 중화시험으로 평가한 결과 154N-글리칸이 결손된 바이러스들은 H5N1 바이러스를 중화하여 방어효능을 보였지만 154N-글리칸을 갖는 모 바이러스는 H5N1 바이러스에 대한 방어효능이 없음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 이러한 결과는 HA2 절편의 154N-글리칸 결손이 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 증대시켜 이종 아형바이러스 방어 효능을 갖게 하였음을 의미하는 것이다.
따라서, 본 발명의 일례는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2 바이러스의 HA2 절편의 154N-글리칸을 결손 시켜 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 증대시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 예는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2 바이러스의 HA2 절편의 154N-글리칸을 결손 시켜 면역원성이 증진된 HA2 공통 에피톱의 제조 방법을 제공한다
또 다른 예는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 154N-글리칸을 결손 시켜 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 증대시킨 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, H9N2 바이러스)를 제공한다.
또 다른 예는 상기 재조합 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 154N-글리칸을 결손 시켜 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 증대시킨 조류 인플루엔자 바이러스(예컨대, H9N2 바이러스)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "HA2 공통 에피톱"은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에서 유래하는 HA2 절편에 공통적으로 존재하는 에피톱을 의미한다.
HA2 공통 에피톱은 다양한 인플루엔자 바이러스에서 제일 보존되어 있고 이에 대한 항체는 다양한 인플루엔자 바이러스 감염증을 예방 및 치료할 수 있다고 알려져 있으나, 에피톱이 HA 단백질과 바이러스 엔벨롭이 연접하는 안쪽에 위치하여 HA 단백질의 바깥쪽 표면에 위치하는 에피톱 보다 항체 접근성이 낮아 상대적으로 면역원성이 낮은 것으로 평가된다.
이에, 본 발명자들은 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 개선하면서도 바이러스 고증식성은 유지시키기 위한 연구를 거듭하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 01310 H9N2 바이러스의 HA2 절편에서 154N-글리칸을 제거하는 경우 HA2 공통 에피톱의 면역원성이 증가하여 이에 대한 항체가 더 잘 만들어지므로 01310 H9N2 바이러스뿐 아니라 H5N1 바이러스도 중화할 수 있어 유니버설 백신으로 개발이 가능하다는 사실을 제안하는 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 증대시키기 위한 기술은 154N-글리칸 제거와 H9N2 바이러스에 한정되는 것은 아니며 HA2 공통 에피톱 인근에 존재하는 N-글리칸과 다양한 인플루엔자 바이러스에 적용될 수 있다.　
우선, 본 발명의 일례는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2 바이러스 HA의 HA2 절편, 예컨대, HA2 절편의 154N-글리칸 결손을 유발시키는 단계를 포함하는 HA2 공통 에피톱의 면역원성의 증진 방법 또는 면역원성이 증진된 HA2 공통 에피톱의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 저병원성이면서 면역원성이 우수한 조류인플루엔자 H9N2 바이러스 변이체의 제조 방법으로 적용될 수 있다.
상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(이후 '01310')(특허 제0790801호)일 수 있다. 상기 01310 균주는 등록특허 제0790801호의 실시예1에서와 같이 분리된 국내 분리주로서 저병원성이다. 그러나, 상기 01310 균주는 저병원성이지만 병원성 바이러스이기 때문에 기탁기관에 기탁이 불가능하며, 현재 농림수산검역검사본부 조류질병과에 보관중이다. 상기 01310 바이러스의 HA 및 NA 유전자의 GenBank accession no.는 각각 JX094859 및 JX094860이다.
본 명세서에서, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편은 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 다음과 같이 표현되는 것을 의미한다:
154아스파라긴(N)-X-세린(S) 또는 트레오닌(T)156,
상기 서열 중, X는 프로린을 제외한 아미노산, 즉 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 발린(V), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산, 보다 구체적으로 글리신(G)일 수 있다.
바람직한 구체예에서 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA (HA1과 HA2 절편을 포함한 서열) 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스, 예컨대, 01310의 HA2 절편의 154N-글리칸 결손은 HA2 절편의 아미노산 서열 중 아스파라긴(N)-연결 글리코실레이션 부위(N-linked glycosylation site)인 154번째부터 156번째까지의 아미노산 중 하나 이상을 치환하여 수행될 수 있다.
본 명세서에 있어서, ' HA2 절편의 154N-글리칸 결손', '154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편 (폴리펩타이드)', 또는 '154N-글리칸 결손을 갖는 154번째부터 156번째까지의 아미노산' 등과 같이 '154N-글리칸 결손'과 관련된 표현은 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편이 다음의 변이 중 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다:
상기 154번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산, 즉 20개 필수 아미노산 중에서 아스파라긴을 제외한 19개 아미노산[즉, 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)]으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산, 보다 구체적으로 아스파트산(D) 또는 트레오닌(T)으로 치환, 및/또는
156번째 아미노산인 세린(S) 또는 트레오닌(T)이 다른 아미노산, 즉 20개 필수 아미노산 중에서 세린과 트레오닌을 제외한 18개 아미노산[즉, 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)]으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산, 보다 구체적으로 아스파라긴(N) 또는 글루타민(Q)으로 치환.
상기 HA2 절편의 154N-글리칸 결손이 일어난 경우의 HA2 절편의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 유전자 서열의 예를 들면 다음과 같다:
154-아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S)-156
(코딩 유전자 서열: 서열번호 5, 아미노산 서열: 서열번호 6)
서열번호 5 (01310 HA-DGS)
TGCCATAGCTGGATTCATAGAAGGAGGTTGGCCAGGACTAGTTGCAGGCTGGTACGGGTTTCAGCACTCAAATGATCAAGGGGTTGGAATAGCCGCAGACAAAGAATCAACTCAAGAAGCAGTTGATAAAATAACATCCAAAGTAAATAATATAATCGACAAAATGAACAAGCAGTATGAAATCATTGATCATGAGTTCAGTGAGATTGAAGCCAGACTCAATATGATCAACAATAAGATTGATGACCAAATACAGGACATCTGGGCGTACAATGCAGAATTACTAGTACTGCTTGAAAACCAGAAAACACTCGATGATCATGATGCAAATGTGAACAATCTGTATAATAAGGTGAAGAGAGCATTGGGTTCAAATGCAATAGAGGATGGGAAGGGATGCTTCGAGTTGTATCACAAATGTGATGATCAATGCATGGAAACAATTAGA GACGGGAGT TATGACAGGCTAAAGTATAAAGAAGAATCAAAACTAGAAAGGCAGAAAATAGAAGGGGTAAAACTGGAGTCTGAAGAAACTTACAAGATTCTTACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGCTTGCAATAGGGCTTGCTGCCTTCATGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA,
서열번호 6 (01310 HA-DGS)
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서열번호 26 (01310 HA-DGS의 HA2 절편)
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154-아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T)-156
(코딩 유전자 서열: 서열번호 7, 아미노산 서열: 서열번호 8)
서열번호 7 (01310 HA-DGT)
TGCCATAGCTGGATTCATAGAAGGAGGTTGGCCAGGACTAGTTGCAGGCTGGTACGGGTTTCAGCACTCAAATGATCAAGGGGTTGGAATAGCCGCAGACAAAGAATCAACTCAAGAAGCAGTTGATAAAATAACATCCAAAGTAAATAATATAATCGACAAAATGAACAAGCAGTATGAAATCATTGATCATGAGTTCAGTGAGATTGAAGCCAGACTCAATATGATCAACAATAAGATTGATGACCAAATACAGGACATCTGGGCGTACAATGCAGAATTACTAGTACTGCTTGAAAACCAGAAAACACTCGATGATCATGATGCAAATGTGAACAATCTGTATAATAAGGTGAAGAGAGCATTGGGTTCAAATGCAATAGAGGATGGGAAGGGATGCTTCGAGTTGTATCACAAATGTGATGATCAATGCATGGAAACAATTAGA GACGGGACT TATGACAGGCTAAAGTATAAAGAAGAATCAAAACTAGAAAGGCAGAAAATAGAAGGGGTAAAACTGGAGTCTGAAGAAACTTACAAGATTCTTACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGCTTGCAATAGGGCTTGCTGCCTTCATGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA,
서열번호 8 (01310 HA-DGT)
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서열번호 27 (01310 HA-DGT의 HA2 절편)
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154-아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N)-156
(코딩 유전자 서열: 서열번호 9, 아미노산 서열: 서열번호 10)
서열번호 9 (01310 HA-NGN)
TGCCATAGCTGGATTCATAGAAGGAGGTTGGCCAGGACTAGTTGCAGGCTGGTACGGGTTTCAGCACTCAAATGATCAAGGGGTTGGAATAGCCGCAGACAAAGAATCAACTCAAGAAGCAGTTGATAAAATAACATCCAAAGTAAATAATATAATCGACAAAATGAACAAGCAGTATGAAATCATTGATCATGAGTTCAGTGAGATTGAAGCCAGACTCAATATGATCAACAATAAGATTGATGACCAAATACAGGACATCTGGGCGTACAATGCAGAATTACTAGTACTGCTTGAAAACCAGAAAACACTCGATGATCATGATGCAAATGTGAACAATCTGTATAATAAGGTGAAGAGAGCATTGGGTTCAAATGCAATAGAGGATGGGAAGGGATGCTTCGAGTTGTATCACAAATGTGATGATCAATGCATGGAAACAATTAGA AACGGGAAT TATGACAGGCTAAAGTATAAAGAAGAATCAAAACTAGAAAGGCAGAAAATAGAAGGGGTAAAACTGGAGTCTGAAGAAACTTACAAGATTCTTACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGCTTGCAATAGGGCTTGCTGCCTTCATGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA,
서열번호 10 (01310 HA-NGN)
MEIIALIAILVVTGTSDADKICIGYQSTNSTETVDTLVENNVPVTHTKELLHTEHNGMLCATNLGHPLILDTCTIEGLVYGNPSCDLLLGGKEWSYIVERSSAVNGMCYPGRVENLEELRSFFSSARSYKRLLLFPDRTWNVTFNGTSKACSGSFYRSMRWLTHKNNSYPIQDAQYTNDWGKNILFMWGIHHPPTDTEQMNLYKKADTTTSITTEDINRTFKPGIGPRPLVNGQQGRIDYYWSVLKPGQTLRIRSNGNLIAPWYGHILSGESHGRILKTDLNSGNCIIQCQTEKGGLNTTLPFQNVSKYAFGNCPKYVGVKSLKLAVGLRNVPATSGRGLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYGFQHSNDQGVGIAADKESTQEAVDKITSKVNNIIDKMNKQYEIIDHEFSEIEARLNMINNKIDDQIQDIWAYNAELLVLLENQKTLDDHDANVNNLYNKVKRALGSNAIEDGKGCFELYHKCDDQCMETIR NGN YDRLKYKEESKLERQKIEGVKLESEETYKILTIYSTVASSLVLAIGLAAFMFWAMSNGSCRCNICI,
서열번호 28 (01310 HA-NGN의 HA2 절편)
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154-아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q)-156
(코딩 유전자 서열: 서열번호 11, 아미노산 서열: 서열번호 12)
서열번호 11 (01310 HA-NGQ)
TGCCATAGCTGGATTCATAGAAGGAGGTTGGCCAGGACTAGTTGCAGGCTGGTACGGGTTTCAGCACTCAAATGATCAAGGGGTTGGAATAGCCGCAGACAAAGAATCAACTCAAGAAGCAGTTGATAAAATAACATCCAAAGTAAATAATATAATCGACAAAATGAACAAGCAGTATGAAATCATTGATCATGAGTTCAGTGAGATTGAAGCCAGACTCAATATGATCAACAATAAGATTGATGACCAAATACAGGACATCTGGGCGTACAATGCAGAATTACTAGTACTGCTTGAAAACCAGAAAACACTCGATGATCATGATGCAAATGTGAACAATCTGTATAATAAGGTGAAGAGAGCATTGGGTTCAAATGCAATAGAGGATGGGAAGGGATGCTTCGAGTTGTATCACAAATGTGATGATCAATGCATGGAAACAATTAGA AACGGGCAA TATGACAGGCTAAAGTATAAAGAAGAATCAAAACTAGAAAGGCAGAAAATAGAAGGGGTAAAACTGGAGTCTGAAGAAACTTACAAGATTCTTACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGCTTGCAATAGGGCTTGCTGCCTTCATGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA,
서열번호 12 (01310 HA-NGQ)
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서열번호 29 (01310 HA-NGQ의 HA2 절편)
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154-트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)-156
(코딩 유전자 서열: 서열번호 13, 아미노산 서열: 서열번호 14)
서열번호 13 (01310 HA-TGT)
TGCCATAGCTGGATTCATAGAAGGAGGTTGGCCAGGACTAGTTGCAGGCTGGTACGGGTTTCAGCACTCAAATGATCAAGGGGTTGGAATAGCCGCAGACAAAGAATCAACTCAAGAAGCAGTTGATAAAATAACATCCAAAGTAAATAATATAATCGACAAAATGAACAAGCAGTATGAAATCATTGATCATGAGTTCAGTGAGATTGAAGCCAGACTCAATATGATCAACAATAAGATTGATGACCAAATACAGGACATCTGGGCGTACAATGCAGAATTACTAGTACTGCTTGAAAACCAGAAAACACTCGATGATCATGATGCAAATGTGAACAATCTGTATAATAAGGTGAAGAGAGCATTGGGTTCAAATGCAATAGAGGATGGGAAGGGATGCTTCGAGTTGTATCACAAATGTGATGATCAATGCATGGAAACAATTAGA ACCGGGACT TATGACAGGCTAAAGTATAAAGAAGAATCAAAACTAGAAAGGCAGAAAATAGAAGGGGTAAAACTGGAGTCTGAAGAAACTTACAAGATTCTTACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGCTTGCAATAGGGCTTGCTGCCTTCATGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA,
서열번호 14 (01310 HA-TGT)
MEIIALIAILVVTGTSDADKICIGYQSTNSTETVDTLVENNVPVTHTKELLHTEHNGMLCATNLGHPLILDTCTIEGLVYGNPSCDLLLGGKEWSYIVERSSAVNGMCYPGRVENLEELRSFFSSARSYKRLLLFPDRTWNVTFNGTSKACSGSFYRSMRWLTHKNNSYPIQDAQYTNDWGKNILFMWGIHHPPTDTEQMNLYKKADTTTSITTEDINRTFKPGIGPRPLVNGQQGRIDYYWSVLKPGQTLRIRSNGNLIAPWYGHILSGESHGRILKTDLNSGNCIIQCQTEKGGLNTTLPFQNVSKYAFGNCPKYVGVKSLKLAVGLRNVPATSGRGLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYGFQHSNDQGVGIAADKESTQEAVDKITSKVNNIIDKMNKQYEIIDHEFSEIEARLNMINNKIDDQIQDIWAYNAELLVLLENQKTLDDHDANVNNLYNKVKRALGSNAIEDGKGCFELYHKCDDQCMETIR TGT YDRLKYKEESKLERQKIEGVKLESEETYKILTIYSTVASSLVLAIGLAAFMFWAMSNGSCRCNICI,
서열번호 30 (01310 HA-TGT의 HA2 절편)
GLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYGFQHSNDQGVGIAADKESTQEAVDKITSKVNNIIDKMNKQYEIIDHEFSEIEARLNMINNKIDDQIQDIWAYNAELLVLLENQKTLDDHDANVNNLYNKVKRALGSNAIEDGKGCFELYHKCDDQCMETIR TGT YDRLKYKEESKLERQKIEGVKLESEETYKILTIYSTVASSLVLAIGLAAFMFWAMSNGSCRCNICI.
조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 01310 바이러스의 HA2 절편의 154N-글리칸이 결손 되는 경우 HA2 공통 에피톱의 면역원성이 증대되어 이 바이러스로 제조한 백신을 접종하여 얻은 항혈청은 다른 아형의 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 H5N1 바이러스(A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009, 농림수산검역검사본부; 이후 CSM-H5N1)에 대해서도 중화능력을 보인다.　
예컨대, 상기 01310 바이러스의 HA (전체서열이므로) 및 NA 유전자는 각각 서열번호 1과 서열번호 3의 염기서열을 가지며, 이 유전자로부터 각각 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HA (전체서열이므로) 와 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 NA 단백질이 생성된다. 또한, 서열번호 2의 HA의 338번째 아미노산인 Arg와 339번째 아미노산인 Gly이 절단되어 339번째 아미노산 (Gly)로부터 시작하는 HA2 절편(서열번호 25)이 생성된다.
또 다른 예에서, 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 H9N2 균주, 보다 구체적으로 01310 바이러스의 HA2 절편의 아미노산 서열 중 154N-글리칸 결손을 포함하는 연속하는 10개 이상, 구체적으로 20개 이상의 아미노산으로 이루어진 HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다.
보다 구체적으로, 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 H9N2 균주, 보다 구체적으로 01310 바이러스의 HA2 절편(서열번호 25)의 아미노산 서열 중 154N-글리칸 결손을 갖는 154번째부터 156번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상, 보다 구체적으로 20개 이상, 예컨대 10 내지 100개, 또는 20 내지 100개의 아미노산으로 이루어진, HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공되며, 이 때,
상기 HA2 절편의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열 및 154N-글리칸 결손을 갖는 154번째부터 156번째까지의 아미노산은 앞서 정의한 바와 같다.
보다 구체적으로, 상기 HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자는 HA2 절편(서열번호 25)의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 다음의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 치환된 것일 수 있다:
154-아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S)-156
154-아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T)-156
154-아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N)-156
154-아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q)-156, 및
154-트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)-156.
상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 154N-글리칸 결손을 포함하는 HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자는 서열번호 26, 27, 28, 29 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 이들 폴리펩타이드 분자는 각각 서열번호 5, 7, 9, 11, 또는 13의 염기서열에 의하여 암호화된 서열번호 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩(암호화)하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
구체예에서, 상기 폴리펩타이드 분자는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편, 예컨대, 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 HA2 절편의154번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 아스파라긴(N)을 제외한 19개 아미노산 중에서 선택된 하나 이상으로 치환되거나, 156번째 아미노산인 세린 또는 트레오닌이 세린 및 트레오닌을 제외한 나머지 18개 아미노산 중에서 선택된 하나 이상으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 HA2 절편 및 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편은 앞서 정의한 바와 같다.
예컨대, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 01310(특허 제0790801호)로부터 유래하는 아미노산 서열(서열번호 2) 중 HA2 절편(서열번호 25)의 154번째부터 156번까지의 아미노산 서열이 아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S), 아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T), 아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N), 아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q), 또는 트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)인 것을 코딩 하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편은 서열번호 26, 27, 28, 29, 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 이들은 서열번호 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질로부터 유래하는 것일 수 있고, 상기 HA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5, 7, 9, 11, 또는 13의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호 5, 7, 9, 11, 또는 13의 염기서열 중 서열번호 26, 27, 28, 29 또는 30의 아미노산을 코딩하는 부위에 해당하는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 염기서열이 동물세포에서의 발현을 위하여 필요한 프로모터 등의 발현 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있고, 상기 재조합 벡터의 모벡터는 특별한 제한이 없으며, 동물세포에서의 발현을 위하여 통상적으로 사용 가능한 모든 벡터일 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명은 H1N1 계통 인플루엔자 바이러스의 게놈 중에서 HA 단백질 코딩 유전자 및 NA 단백질 코딩 유전자가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스, 예컨대 H9N2 바이러스의 HA 단백질 코딩 유전자 및 NA 단백질 코딩 유전자로 치환된 것을 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 구체적으로, H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스인 PR8 바이러스(Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34(H1N1))의 게놈(GenBank accession number NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함; NC_002016: 매트릭스 단백질(M) 유전자, NC_002017: 적혈구응집 단백질(HA) 유전자, NC_002018: 뉴라미니다제(NA) 유전자, NC_002019: 뉴클레오캡시드(NP) 유전자, NC_002020: 비구조단백질(NS) 유전자, NC_002021: 중합효소 B1(PB1) 유전자, NC_002022: 중합효소 A(PA) 유전자, NC_002023: 중합효소 B2(PB2) 유전자)에서 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002017) 및 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002018)가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 코딩 뉴클레오타이드 및 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 것을 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 이 때, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 HA의 HA2 절편은 앞서 설명한 바와 같은 154N-글리칸 결손을 갖는 것일 수 있다. 상기 재조합 바이러스는 HA2 공통 에피톱의 면역원성이 우수하고, 다른 아형 바이러스에 대한 이종 아형 방어효능이 있으며 발육계란 증식성이 우수하여 유니버셜 백신 생산에 유용하다.　
구체적으로, 상기 재조합 바이러스는 H1N1 계통 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스(GenBank accession number NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002023), 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002021), 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002022), 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002019), 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002016), 및 비구조단백질(NS) 코딩 폴리뉴클레오타이드(NC_002020)와, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 적혈구응집 단백질(HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드와 뉴라미니다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 H9N2 계통 바이러스일 수 있으며, 보다 구체적으로 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)('01310')일 수 있다. 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편을 포함하는 HA 단백질을 코딩하는 것일 수 있다.
상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 및 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편은 앞서 정의한 바와 같다.
보다 구체적으로, 상기 154N-글리칸 결손은 HA단백질(예컨대 서열번호 2)로부터 유래하는 HA2 절편(예컨대, 서열번호 25)의 N-linked glycosylation site인 154번째부터 156번째까지의 아미노산인 '아스파라긴(N)-프로린 제외 모든 아미노산(X)-세린(S) 또는 트레오닌(T)'에서 154번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 아스파라긴을 제외한 19개 아미노산 중에서 선택된 하나 이상으로 치환되거나, 및/또는 156번째 아미노산인 세린 또는 트레오닌이 세린 및 트레오닌을 제외한 나머지 18개 아미노산 중에서 선택된 하나 이상으로 치환되어 수행된 것일 수 있으며, 한 구체예에서, HA2 절편(서열번호 25)의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열을 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 치환하여 얻어진 것일 수 있다:
아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S),
아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T),
아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N),
아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q) (예컨대, KCTC 12206BP), 및
트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T).
이 때, 상기 HA 단백질은 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스, 예컨대, 01310(특허 제0790801호)로부터 유래하는 HA 단백질일 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 NA 단백질은 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스, 예컨대 01310(특허 제0790801호)로부터 유래하는 NA 단백질일 수 있으며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
따라서, 구체예에서, 상기 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 HA2 절편(서열번호 25)의 154번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 아스파라긴(N)을 제외한 19개 아미노산 중에서 선택된 하나 이상으로 치환되거나, 156번째 아미노산인 세린 또는 트레오닌이 세린 및 트레오닌을 제외한 나머지 18개 아미노산 중에서 선택된 하나 이상으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 154N-글리칸 결손을 갖는 HA2 절편 단백질의 코딩 폴리뉴클레오타이드는 HA2 절편(서열번호 25)의 154번째부터 156번까지의 아미노산 서열이 아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S)인 폴리펩타이드 분자(서열번호 26), 아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T)인 폴리펩타이드 분자(서열번호 27), 아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N)인 폴리펩타이드 분자(서열번호 28), 아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q)인 폴리펩타이드 분자(서열번호 29), 또는 트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)인 폴리펩타이드 분자(서열번호 25)를 코딩 하는 것일 수 있다. 상기 HA2 절편의 154N-글리칸 결손을 갖는 HA 단백질은 서열번호 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 것이고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5, 7, 9, 11, 또는 13의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
구체예에서, 상기 재조합 바이러스는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 예컨대 PR8 바이러스의 게놈 중 HA 유전자가 서열번호 6, 8, 10, 12, 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 4의 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 H1N1 계통 인플루엔자 바이러스 변이 균주일 수 있다. 상기 재조합 바이러스는 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 단백질을 갖고 PR8 바이러스의 나머지 6개 유전자를 갖는 H9N2 재조합 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 H9N2 재조합 바이러스는 PR8 게놈에서 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 01310(특허 제0790801호)의 HA 단백질에서 유래하는 HA2 절편(서열번호 25)의 154번 내지 156번 아미노산의 변이로 154N-글리칸이 제거되도록 하는 폴리뉴클레오타이드로 치환된 것으로서, 서열번호 6를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 서열번호 5)로 치환된 바이러스주 rPR8-01310(HA-DGS-NA), 서열번호 8을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 서열번호 7)로 치환된 바이러스주 rPR8-01310(HA-DGT-NA), 서열번호 10를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 서열번호 9)로 치환된 바이러스주 rPR8-01310(HA-NGN-NA), 서열번호 12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 서열번호 11)로 치환된 바이러스주 rPR8-01310(HA-NGQ-NA) (KCTC 12206BP), 및/또는 서열번호 14를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 서열번호 13)로 치환된 바이러스주 rPR8-01310(HA-TGT-NA)) 일 수 있다.
상기 재조합 바이러스는 HA2 공통 에피톱의 면역원성이 증가하여 이종 아형 바이러스에 대한 방어 효능을 획득하며 발육란(계태아) 증식성이 우수하여 효과 좋은 인플루엔자 바이러스 백신 제작에 매우 유용하다.
이에, 본 발명의 또 다른 예는 상기 HA2 공통 에피톱 고 면역원성 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 특히, PR8 바이러스 게놈(NC_002016 내지 NC_002023)에서 01310(특허 제0790801호) 유래의 HA2 절편(서열번호 25)의154N-글리칸 결손을 갖는 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드(서열변호 5, 7, 9, 11, 또는 13)와 01310(특허 제0790801호)의 NA 단백질(서열번호 4) 코딩 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 서열번호 3)로 치환된 균주, 예컨대, rPR8-01310(HA-DGS-NA, 서열번호 5로 치환), rPR8-01310(HA-DGT-NA, 서열번호 7로 치환), rPR8-01310(HA-NGN-NA, 서열번호 9로 치환), rPR8-01310(HA-NGQ-NA, 서열번호 11로 치환), 및 rPR8-01310(HA-TGT-NA, 서열번호 13으로 치환)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
상기 백신은 닭과 오리 등의 조류뿐 아니라 인간, 돼지, 개, 마우스 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다.　 상기 백신은 사독 백신 또는 생독 백신으로 사용 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자에 대한 항체 및/또는 상기 HA2 공통 에피톱 고 면역원성 재조합 바이러스에 대한 항혈청을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 및 진단용 키트를 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), 및 rPR8-01310(HA-TGT-NA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있고, 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것일 수 있으며, 진단 대상 환자는 조류 또는 포유류일 수 있다.
국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 01310(특허등록 제0790801호) 을 10 내지 11일령 specific pathogen free(SPF) 계태아의 요막강에 접종하여 배양한 후 요막액을 수확하여 RNA를 추출한 후 01310(특허등록 제0790801호)의 HA 및 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 RT-PCR로 증폭한 후 아가로스겔에 전기영동 하여 증폭산물을 잘라내어 정제하였고, 염기서열을 분석하였다. 01310(특허등록 제0790801호)의 HA 단백질 유래의 HA2 절편의 154N-글리칸의 HA2 공통 에피톱 면역원성에 대한 영향을 알아보기 위해, HA2 절편(예컨대, 서열번호 25에 해당)의 154번 내지 156번 아미노산 서열로 아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S), 아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T), 아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N), 아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q), 또는 트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)을 갖도록 site-directed mutagenesis를 수행하여 돌연변이 HA 유전자(HA-DGS, HA-DGT, HA-NGN, HA-NGQ, HA-TGT)를 클로닝 하였다. PR8 바이러스 기반의 역 유전학 벡터시스템의 HA 및 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 대신에, HA2 절편에 상기한 site-directed 돌연변이를 갖는 01310 바이러스 HA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 01310 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 치환하여 재조합 바이러스인 rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), rPR8-01310(HA-TGT-NA)를 역 유전학 기술로 제작하였다. 제작한 재조합 바이러스들의 혈구응집역가(Hemagglutination titer)를 측정한 결과 모두 rPR8과 01310 대비 유사한 역가를 보였다 (표 1).
본 발명의 rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), rPR8-01310(HA-TGT-NA) 바이러스의 HA2 절편 공통 항원의 면역원성을 비교하기 위해 각 바이러스를 0.1%(v/v) 포르말린으로 불활화 하거나 0.01M BEI(binary ethylenimine, SIGMA-ALDRICH, USA)로 불활화 한 후 ISA70 미네랄 오일과 3대 7의 비율(부피기준)로 혼합하여 에멀젼을 만들어 사독오일백신을 제조하였고, 01310 바이러스를 함유하는 상업용 사독오일백신을 대조군으로 하여 6주령의 SPF 닭(SPAFAS, USA)에 500㎕ 씩 근육접종 한 후 2주에 채혈하여 수확한 혈청을 이용하여 01310 바이러스로 혈구응집억제 검사로 항체 생성 여부를 확인하고, A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009 (H5N1)(저병원성 조류인플루엔자 바이러스, GenBank accession No. JF510040 - JF510047; CSM-H5N1) 바이러스로 중화시험을 수행하였다. 그 결과, 모 바이러스인 01310(HA2 절편의 154N-글리칸 결손 변이 없음)으로 제조한 상업용 사독오일백신을 접종한 닭의 혈청은 모 바이러스인 01310에 대해 높은 혈구응집억제 항체가 검출되었으나, CSM-H5N1 바이러스에 대해서는 중화항체가 전혀 검출되지 않았다. 반면, HA2 절편의 154N-글리칸 결손을 갖는 재조합 균주인 rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), 및/또는 rPR8-01310(HA-TGT-NA) 바이러스로 각각 제조한 사독오일백신을 접종한 닭의 혈청은 모두 모 바이러스인 01310에 대해 높은 혈구응집억제 항체가 검출되었고, 또한 CSM-H5N1 바이러스에 대한 중화항체가 검출되어 유니버설 백신 효능이 확인되었다(도 1).
본 발명은 기존 인플루엔자 백신의 HA2 공통 에피톱에 대한 낮은 면역원성을 향상시켜 이종 아형 바이러스 방어효능을 부여하고자, HA2 공통 에피톱 면역원성이 우수한 H9N2 재조합 바이러스를 제공하며, 본 발명에서 제공되는 H9N2 재조합 바이러스는 HA2 공통 에피톱에 대한 중화항체 생산을 유발하여 이종 아형 바이러스 방어효능이 있는 유니버셜 백신으로 유용하다.
도 1은 각 백신접종 시험계의 혈구응집억제 항체가와 중화항체를 음성 및 양성 대조 혈청과 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA2 공통 에피톱 인근 154N- linked glycan 제거 재조합 바이러스 작출
1-1: 역전사효소 - 중합효소연쇄반응 , 유전자 클로닝 , 및 염기서열 결정
RNA분리를 위하여, 01310 바이러스(특허등록 제0790801호의 실시예 1에서 분리)의 발육란 배양 요막액(발육란 상단 난각과 난막을 제거하고, 10ml 주사기를 요막강 안에 주사하여 채취) 150㎕로부터 Viral Gene spin 키트 (iNtRON Co. Ltd., 성남, 대한민국)를 사용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 RNA를 분리한 후, QIAGEN 사의 one-step RT-PCR 키트와 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 게놈 증폭용 프라이머 (HA 증폭용 프라이머,Bm-HA-1, Bm-NS-890R; NA 증폭용 프라이머, Ba-NA-1, Ba-NA-1413R; Hoffmann 등, Archives Virol, 2001)를 사용하여 01310 바이러스의 HA와 NA 유전자를 증폭하였다.
보다 구체적으로, 5X one step RT buffer 20㎕(QIAGEN 사), dNTP(2.5mM) 4㎕, 각 유전자 증폭용 전 방향 및 역방향 프라이머(10pmol/㎕) 각각 1㎕, one-step enzyme mix 4㎕(QIAGEN 사), 앞서 01310 바이러스로부터 분리한 HA와 NA의 RNA를 각각 4㎕, 및 RNase 제거 3차멸균증류수 66㎕를 혼합하여 PCR 기기(C-1000, Bio Rad Laboratories Inc., USA)에서 50℃에서 30분간 반응한 후 95℃에서 15분 가열하였고, 94℃-20초-58℃-30초-72℃-7분간 반응을 30회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응시켰다. 얻어진 증폭 산물을 아가로스겔에서 전기영동하고, Gel extraction kit(QIAGEN Co. USA)를 사용하여 정제한 후, ABI3777 자동염기서열 분석기(마크로젠, 서울, 대한민국)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
그 결과, 01310의 HA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, NA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지며, HA 단백질과 NA 단백질은 각각 서열번호 2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것으로 나타났다.
1-2: 재조합 바이러스 제작
재조합 인플루엔자 바이러스 작출을 위해 호프만 박사의 역유전학 벡터시스템(특허 제0862758호)을 사용하였다.
구체적으로, 실시예 1-1에서 증폭한 01310의 HA와 NA 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 TOPO-TA cloning 벡터(Invitrogen Co. USA)에 클로닝하여 M13F/M13R 프라이머(M13F, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(서열번호 31); M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(서열번호 32))로 염기서열을 결정하고, 제한효소 (HA 유전자는 BsmBI(NEB Inc, USA); NA 유전자는 BsaI(NEB Inc, USA)) 20U/2㎕, NEBuffer(NEB Inc., USA) 2㎕, pHW2000 플라스미드, 멸균 3차증류수 13㎕를 혼합하여 50℃에서 1.5시간(BsmBI) 또는 37℃에서 1.5시간(BsaI) 배양한 후 아가로스겔에 전기영동 하여 해당 DNA를 Gel extraction kit(QIAGEN Co.)로 정제하였다.
또한 상기 pHW2000 플라스미드(한국특허등록 제0862758호, St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사, 호프만 박사의 동의를 얻어 입수) 10㎍/3㎕에 대하여 상기와 동일한 방법으로 BsmBI과 BsaI으로 각각 처리하여 아가로스겔에 전기영동하여 정제한 pHW2000 벡터(BsmBI 처리) 6㎕와 HA 2㎕; pHW2000 벡터(BsaI 처리) 6㎕와 NA 2㎕ 각각에 T4 DNA 라이게이즈 (1,000,000 U/㎕; NEB Inc, USA) 1㎕, 10X 반응 버퍼(NEB Inc, USA) 1㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 정치한 후, 대장균(Escherichia coli, OneShot
Figure 112012056319630-pat00001
top10 competent cell, Invitrogen Co. USA)에 transformation 한 후 염기서열을 분석하여 유전자의 염기서열의 돌연변이가 없는 정확한 클론을 선발하여 플라스미드를 추출하였다. 이렇게 제작된 01310 HA삽입 pHW2000 벡터를 pHW01310-HA, 01310 NA 삽입 pHW2000 벡터를 pHW01310-NA로 명명하였다.
01310 HA의 154N-글리칸을 제거하기 위해 154내지 156 아미노산 서열로
NGN을 갖도록 NGN-F(서열번호 15, 5'-GGAAACAATTAGAAACGGGAATTATGACAGGCTAAAG-3')와 NGN-R(서열번호 16, 5'-CTTTAGCCTGTCATAATTCCCGTTTCTAATTGTTTCC-3') 프라이머,
TGT를 갖도록 TGT-F(서열번호 17, 5'-GCATGGAAACAATTAGAACCGGGACTTATGACAGGC-3')와 TGT-R(서열번호 18, 5'-GCCTGTCATAAGTCCCGGTTCTAATTGTTTCCATGC-3') 프라이머,
NGQ를 갖도록 NGQ-F(서열번호 19, 5'-GGAAACAATTAGAAACGGGCAATATGACAGGCTAAAG-3')와 NGQ-R(서열번호 20, 5'-CTTTAGCCTGTCATATTGCCCGTTTCTAATTGTTTCC-3') 프라이머,
DGT를 갖도록 DGT-F(서열번호 21, 5'-GGAAACAATTAGAGACGGGACTTATGACAGG-3 )와 DGT-R(서열번호 22, 5'-CCTGTCATAAGTCCCGTCTCTAATTGTTTCC-3') 프라이머,
DGS를 갖도록 DGS-F(서열번호 23, 5'-GGAAACAATTAGAGACGGGAGTTATGACAGGCTAAAG-3'), DGS-R(서열번호 24, 5 -CTTTAGCCTGTCATAACTCCCGTCTCTAATTGTTTCC-3') 프라이머를 제작하고,
상기 01310 HA 유전자(서열번호 1)를 pHW2000에 클로닝하여 선발한 정확한 클론으로부터 추출한 플라스미드를 사용하여 site-directed mutagenesis를 수행하여 pHW01310-HA-DGS(HA 단백질의 154내지 156번째 아미노산이 'DGS'로 치환), pHW01310-HA-DGT(HA 단백질의 154내지 156번째 아미노산이 'DGT'로 치환), pHW01310-HA-NGN(HA 단백질의 154내지 156번째 아미노산이 'NGN'로 치환), pHW01310-HA-NGQ(HA 단백질의 154내지 156번째 아미노산이 'NGQ'로 치환), 및 pHW01310-HA-TGT(HA 단백질의 154내지 156번째 아미노산이 'TGT'로 치환)를 제작하였다.
보다 구체적으로, 상기 돌연변이(site-directed mutagenesis)는 site-directed mutagenesis kit (인트론, 성남, 대한민국)을 사용하여 수행되었으며, 반응조건 (total 50ul reaction)은 다음과 같이 하였다:
Dw: 39ul,
10X reation buffer: 5ul,
Plamid (pHW01310 HA, 20ng/ul): 1ul,
forward primer(10uM): 1ul,
reverse primer(10uM): 1ul,
dNTP: 2ul, 및
Muta-direct Enzyme (DNA polymerase, high fidelity): 1ul.
이를 95℃ 30초로 처리한 후 95℃ 30초, 55? 1분, 72℃ 6분 처리 조건으로 순서대로 18회 반복하여 원하는 부위에 돌연변이가 생길 수 있도록 처리한 후 Mutazyme enzyme (DpnI) 1ul를 섞어준 후 37?에서 1시간 30분 처리하여 돌연변이되지 않은 원래의 플라스미드를 제거하고 돌연변이된 플라스미드는 competent cell (대장균)에 형질전환하여 원하는 돌연변이가 일어난 플라스미드 클론을 얻었다. 각각 얻어진 돌연변이 클론은 염기서열을 확인하여 원하는 부위에 돌연변이가 일어났음을 확인하였다.
St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공 받은 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M, 및 pHW198-NS 역유전학용 플라스미드(Vaccine 2002, 20:3165-3170; pHW2000 (등록특허 제10-0862758호 참조) 에 PR8 바이러스의 8개 유전자, 즉 NC_002016: 매트릭스 단백질(M) 유전자, NC_002017: 적혈구응집 단백질(HA) 유전자, NC_002018: 뉴라미니다제(NA) 유전자, NC_002019: 뉴클레오캡시드(NP) 유전자, NC_002020: 비구조단백질(NS) 유전자, NC_002021: 중합효소 B1(PB1) 유전자, NC_002022: 중합효소 A(PA) 유전자, NC_002023: 및 중합효소 B2(PB2) 유전자를 삽입한 플라스미드) 중 pHW194-HA와 pHW196-NA 대신 pHW01310-HA-DGS와 pHW01310-NA, pHW01310-HA-DGT와 pHW01310-NA, pHW01310-HA-NGN와 pHW01310-NA, pHW01310-HA-NGQ와 pHW01310-NA, 또는 pHW01310-HA-TGT와 pHW01310-NA 를 교체하여 01310의 돌연변이 HA와 NA를 갖는 재조합 바이러스들(rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), rPR8-01310(HA-TGT-NA))을 제작하였다.
이를 위하여, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X106개/2ml의 양으로 부유하여 각 웰에 첨가한 후, 3-4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후, Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.
상기 준비된 8개 플라스미드(PR8 바이러스의 pHW194-HA와 pHW196-NA 제외한 6개 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW195-NP, pHW197-M, 및 pHW198-NS 플라스미드+pHW01310-HA-DGS와 pHW01310-NA, pHW01310-HA-DGT와 pHW01310-NA, pHW01310-HA-NGN와 pHW01310-NA, pHW01310-HA-NGQ와 pHW01310-NA, 또는 pHW01310-HA-TGT와 pHW01310-NA 플라스미드)를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각의 양이 300ng씩이 되도록 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 PLUS reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다.
기다리는 동안 lipofectamine 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다.
얻어진 반응 생성물을 상기 293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO2, 37℃에서 20시간 배양한 후, 웰당 트립신10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발생란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발생란을 37℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 요막액 20㎕와 상기 각각의 시료를 접종한 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY)을 부화시킨 닭에서 추출한 0.1%(w/v) 닭 적혈구 20㎕를 유리 평판에 점적 후 혼합하여 혈구응집이 되는 경우 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스로부터 RNA를 추출하여 해당 HA와 NA 유전자의 염기서열을 결정하여 바이러스가 제대로 제작되었는지 확인한 후 -70℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.
본 실시예 결과, rPR8-01310(HA-DGS-NA)(HA 단백질의 154 내지 156 아미노산으로 DGS 보유), rPR8-01310(HA-DGT-NA)(HA 단백질의 154 내지 156 아미노산으로 DGT 보유), rPR8-01310(HA-NGN-NA)(HA 단백질의 154 내지 156 아미노산으로 NGN 보유), rPR8-01310(HA-NGQ-NA)(HA 단백질의 154 내지 156 아미노산으로 NGQ 보유), rPR8-01310(HA-TGT-NA)(HA 단백질의 154 내지 156 아미노산으로 TGT 보유)을 제작하였으며, 이중에서 rgPR8-01310(HA-NGQ)-NA)를 대전에 소재하는 생명자원센터에 2012년 5월 10일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC 12206BP을 부여 받았다.
1-3. 바이러스의 혈구응집 역가 측정
상기에서 제작한 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가를 확인하기 위하여 혈구응집역가를 측정하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 인산완충용액 50 ㎕씩을 분주하고, 첫 번째 웰에 상기 제작된 재조합 바이러스 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 다시 50 ㎕를 채취하여 다음 웰에 첨가하여 섞어주는 과정을 반복하며 마지막 웰에서는 50 ㎕를 채취해 제거하는 방법으로 연쇄 희석(serial dilution)을 실시하였다.　 상기와 같이 바이러스가 2배 단위로 희석된 각 웰에 0.5%(v/v) 닭 적혈구50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 완벽한 혈구응집이 일어난 웰의 희석배수(2n)를 혈구응집 역가(HAU)로 하였다.
그 결과 얻어진 바이러스 혈구응집 역가(HAU)를 아래의 표 1에 나타내었다.
Recombinant viruses HAU
01310 210
rPR8-01310(HA-DGS-NA) 210
rPR8-01310(HA-DGT-NA) 211
rPR8-01310(HA-NGN-NA) 210
rPR8-01310(HA-NGQ-NA) 210
rPR8-01310(HA-TGT-NA) 210
표1에서 알 수 는 바와 같이, 모 바이러스인 01310의 혈구응집역가는 210을 보였고, rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), rPR8-01310(HA-TGT-NA)는 210 내지 211을 보여, 상기 제작된 재조합 바이러스들이 모바이러스인 01310과 유사한 혈구응집역가를 보이는 것으로 나타나서, 재조합 바이러스에서 모 바이러스의 고증식성이 유지되는 것을 확인하였다.
1-4. 계태아 병원성 측정
상기 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 10-3 부피배 희석하여 200㎕의 양으로 10 내지 11일령 SPF 종란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하여, 3일 간 37℃에서 배양하였다. 폐사한 종란과 3일까지 생존한 종란을 4℃에서 12 내지 24시간 보관한 후, 계태아에서의 폐사와 출혈이나 충혈 등의 병변을 관찰하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.
바이러스 발육란수 접종 후 폐사 발육란수
1일 2일 3일
rPR8-01310(HA-DGS-NA) 5 0 0 0
rPR8-01310(HA-DGT-NA) 5 0 0 0
rPR8-01310(HA-NGN-NA) 5 0 0 0
rPR8-01310(HA-NGQ-NA) 5 0 0 0
rPR8-01310(HA-TGT-NA) 5 0 0 0
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 재조합 바이러스 rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), 및 rPR8-01310(HA-TGT-NA)는 모두 3일 동안 계태아 폐사를 전혀 일으키지 않는 것으로 나타나서, 계태아 저병원성이 확인되었으며, OIE 권고 사항을 충족하는 백신주로 사용할 수 있는 것으로 평가되었다.
실시예 2: 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA2 공통 에피톱 인근 154N- linked glycan 제거 재조합 바이러스 면역원성 및 항원성 측정
2-1. 사독오일백신 제조 및 백신 접종
상기 재조합 바이러스 rPR8-01310(HA-NA), rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), 및 rPR8-01310(HA-TGT-NA)의 HA2 공통 에피톱의 면역원성을 비교하기 위하여, 각 바이러스를 0.1%(v/v) 포르말린으로 불활화하거나 0.01M BEI(binary ethylenimine, SIGMA-ALDRICH, USA)로 불활화한 후, ISA70 미네랄 오일( Seppic Inc. Paris)과 3:7(불활화된 바이러스:미네랄 오일)의 부피비로 혼합하여 에멀젼을 만들어 사독오일백신을 제조하였고, 6주령의 SPF 닭(SPAFAS, USA)에 500㎕ 씩 근육접종 하였다.
2-2. 바이러스 혈구응집억제 항체 및 중화항체 역가 측정
상기 백신 접종한 닭으로부터 접종 2주 후에 채혈하여 수확한 혈청을 이용하여 01310 바이러스와 CSM-H5N1 바이러스로 혈구응집억제 검사를 실시하였고, H5N1 바이러스인 CSM-H5N1 바이러스로 중화시험을 수행하였다. 혈구응집억제검사는 상기에서 설정한 역가에 기초하여 실시하였다. 즉, 4(22)-혈구응집단위의 01310 주 또는 CSM-H5N1 주(A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009, GenBank accession No. JF510040 내지 JF510047; 농림수산검역검사본부) 25 ㎕와 각각의 항혈청 25 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분 간 반응시킨 후, 0.5%(v/v) 닭 적혈구 50 ㎕를 첨가하여 4℃에서 30분 경과 후 혈구응집이 완전히 억제된 웰의 수를 혈구응집 억제역가로 하였다.
바이러스 중화시험은 시험관에서 혈청을 PBS로 2진 희석한 후 96-웰 플레이트에 100㎕씩 옮기고 동량의 CSM-H5N1 바이러스 (100 TCID50/25㎕)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 중화시켰다. 중화 완료된 혼합액 25㎕와 섬유아세포 부유액(199+F10; GIBCO) 100㎕를 각 웰에 접종한 후 37℃에서 4일간 배양하여 완전 중화가 일어나 세포변성효과가 전혀 나타나지 않는 최고 희석 배수를 중화항체 역가로 하였다.
얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, 혈청 시료 이름 중 F는 포르말린으로 불화화한 백신을 접종한 닭에서 채취한 혈청을 뜻하고, B는 BEI로 불활화한 백신을 접종한 닭에서 채취한 혈청을 뜻하며, 이들 뒤의 숫자는 시험계의 개체 번호를 나타낸다. 또한, 각 혈청 시료 괄호 안의 숫자 두 개 중 앞 숫자는 01310으로 측정한 혈구응집억제 역가 (H5N1 양성혈청은 CSM-H5N1 바이러스로 측정)이고, 뒤의 숫자는 CSM-H5N1 바이러스로 측정한 중화항체 역가를 나타낸다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 01310 상업용 사독오일백신(wild-type (NGT))을 접종한 닭의 혈청에서 모 바이러스인 01310에 대해 높은 혈구응집억제 항체가 검출되었으나 CSM-H5N1 바이러스에 대해서는 중화항체가 전혀 검출되지 않았다. 한편 재조합 바이러스 rPR8-01310(HA-DGS-NA), rPR8-01310(HA-DGT-NA), rPR8-01310(HA-NGN-NA), rPR8-01310(HA-NGQ-NA), rPR8-01310(HA-TGT-NA) 각각으로 제조한 사독오일백신을 접종한 닭의 혈청은 모 바이러스인 01310에 대해 높은 혈구응집억제 항체가 검출되었고, CSM-H5N1 바이러스에 대해서도 중화항체가 검출되어 유니버설 백신 효능이 확인되었다.
한국생명공학연구원 KCTC12206BP 20120510
<110> SNU R&DB FOUNDATION REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> A METHOD OF PREPARING HA2 COMMON EPITOPE OF INFLUENZA VIRUS WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY <130> DPP20117002KR <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1683 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of HA protein coding gene of A/chicken/Korea/01310/2001 (H9N2), CE20 <400> 1 atggaaataa tagcactaat agctatactg gtagtgacag gaacaagcga tgctgataaa 60 atttgcattg gctaccagtc aacaaactcc acagaaactg ttgatacact agtagaaaac 120 aatgtccctg tgacacatac caaagaattg ctccacacag agcacaatgg aatgttatgt 180 gcaacaaact tgggacaccc tcttatccta gacacctgca ccattgaagg gttggtgtac 240 ggcaatcctt cctgtgattt gctactggga gggaaagagt ggtcttacat tgtcgaaaga 300 tcatcagctg ttaatgggat gtgctaccct ggaagggtag agaatctgga agaactcagg 360 tcctttttca gttctgctcg ctcctacaaa agactcctac tttttccaga ccgtacttgg 420 aatgtgactt tcaatgggac aagcaaagca tgctcaggct cattctacag aagtatgaga 480 tggctgacac acaagaacaa ttcttaccct attcaagacg cccaatatac caacgactgg 540 ggaaagaata ttctcttcat gtggggcata caccatccac ctactgatac tgagcaaatg 600 aatctataca aaaaagctga tacaacaaca agtataacaa cggaagatat caatcgaact 660 ttcaaaccag ggatagggcc aaggcctctt gtcaatggtc aacaaggaag aattgattat 720 tattggtcag tactaaagcc aggccagaca ttgcgaataa gatccaatgg aaatctaatt 780 gccccatggt atggacacat tctttcagga gaaagccatg gaagaatcct gaagaccgat 840 ttgaatagtg gcaactgcat aatacaatgc caaactgaga aaggtggttt gaacacgacc 900 ttgccattcc aaaatgtcag caaatatgca tttgggaact gtcccaaata tgttggagtg 960 aagagtctca aactggcagt tggtctaagg aatgtgcctg ctacatcagg tagagggctt 1020 ttcggtgcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagttgc aggctggtac 1080 gggtttcagc actcaaatga tcaaggggtt ggaatagccg cagacaaaga atcaactcaa 1140 gaagcagttg ataaaataac atccaaagta aataatataa tcgacaaaat gaacaagcag 1200 tatgaaatca ttgatcatga gttcagtgag attgaagcca gactcaatat gatcaacaat 1260 aagattgatg accaaataca ggacatctgg gcgtacaatg cagaattact agtactgctt 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgatcatgat gcaaatgtga acaatctgta taataaggtg 1380 aagagagcat tgggttcaaa tgcaatagag gatgggaagg gatgcttcga gttgtatcac 1440 aaatgtgatg atcaatgcat ggaaacaatt agaaacggga cttatgacag gctaaagtat 1500 aaagaagaat caaaactaga aaggcagaaa atagaagggg taaaactgga gtctgaagaa 1560 acttacaaga ttcttaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaataggg 1620 cttgctgcct tcatgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 2 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HA protein of A/chicken/Korea/01310/2001 (H9N2), CE20 <400> 2 Met Glu Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ile Leu Val Val Thr Gly Thr Ser 1 5 10 15 Asp Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Val Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Met Cys Tyr Pro Gly Arg 100 105 110 Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Phe Phe Ser Ser Ala Arg Ser 115 120 125 Tyr Lys Arg Leu Leu Leu Phe Pro Asp Arg Thr Trp Asn Val Thr Phe 130 135 140 Asn Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg 145 150 155 160 Trp Leu Thr His Lys Asn Asn Ser Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr 165 170 175 Thr Asn Asp Trp Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile His His 180 185 190 Pro Pro Thr Asp Thr Glu Gln Met Asn Leu Tyr Lys Lys Ala Asp Thr 195 200 205 Thr Thr Ser Ile Thr Thr Glu Asp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Gly 210 215 220 Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg Ile Asp Tyr 225 230 235 240 Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn 245 250 255 Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser 260 265 270 His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Asn Ser Gly Asn Cys Ile Ile 275 280 285 Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln 290 295 300 Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Pro Lys Tyr Val Gly Val 305 310 315 320 Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Thr Ser 325 330 335 Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp 340 345 350 Pro Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln 355 360 365 Gly Val Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp 370 375 380 Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln 385 390 395 400 Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn 405 410 415 Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr 420 425 430 Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp 435 440 445 His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu 450 455 460 Gly Ser Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His 465 470 475 480 Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp 485 490 495 Arg Leu Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu 500 505 510 Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr 515 520 525 Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe 530 535 540 Met Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 545 550 555 560 <210> 3 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of NA protein coding gene of A/chicken/Korea/01310/2001 (H9N2), CE20 <400> 3 atgaatccaa atcagaaaat aataacaatt ggctctgtct ctctaaccat tgcaacagta 60 tgtttcctca tgcagattgc cattctagca acgactgtaa cactgcactt caagcaaaat 120 gaatgcagca taccctcgaa caaccaagca gttccatgtg acatagagaa agaactttgt 180 cctaaagtgg tagaatacag gagttggtcg aaaccgcagt gtcagattac agggtttgct 240 cctttctcca aggacaactc aatccggctt tctgctggtg ggagcatttg ggtaacaaga 300 gaaccttatg tatcatgcag ctccaataaa tgttatcaat ttgcacttgg gcagggaacc 360 acgctagata acaaacactc aaatgggaca atacatgata gaatctctca tcgaaccctt 420 ttaatgaacg agttgggtgt tccatttcat ttgggaacca aacaggtgtg tatagcatgg 480 tccagctcaa gctgtcatga tgggagagca tggttacatg tttgtgtcac tggagatgat 540 agaaatgcaa ctgctagttt catttatgat ggagtgcttg ttgacagtat tggctcatgg 600 tctcaaaata ttctcagaac tcaggagtca gaatgcgttt gcatcaatgg aacttgtaca 660 gtagtaatga ctgatggaag tgcatcagga agagctgaca ctagaatact attcattaaa 720 gaggggaaaa ttgtacatat tagccaatta tcaggaagtg ctcagcatat agaggaatgt 780 tcttgttatc ccagatatcc agacgtcaga tgtgtttgca gagacaattg gaaaggatct 840 aataggccca ttatagatat aaatatggcg gattatagca ttgattccag ttatgtgtgc 900 tcgggacttg ttggcgacac accaaggaat gatgatagct ctagcaacag caactgcaaa 960 gatcctaata atgagagagg gaacccggga gtaaaagggt gggcctttga ctatggaaat 1020 gatgtttgga tggggagaac aatcagcaag gattcacgct caggttatga aactttcaga 1080 gtcattggtg gttggaccac agctaactcc aaatcacagg tgaatagaca agtcatagtt 1140 gacaataaca actggtctgg ttattctggc attttctctg ttgaaggcaa aagctgcatc 1200 aataggtgtt tttatgtgga gttgataaga ggaaggccac aagagactag agtatggtgg 1260 acctcaaaca gcattgtcgt gttttgtggc acttcaggta cctatggaac aggctcatgg 1320 cctgatgggg cgaatatcaa ttttatgcct atataa 1356 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of NA protein of A/chicken/Korea/01310/2001 (H9N2), CE20 <400> 4 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Ala Thr Thr 20 25 30 Val Thr Leu His Phe Lys Gln Asn Glu Cys Ser Ile Pro Ser Asn Asn 35 40 45 Gln Ala Val Pro Cys Asp Ile Glu Lys Glu Leu Cys Pro Lys Val Val 50 55 60 Glu Tyr Arg Ser Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe Ala 65 70 75 80 Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Ser Ile 85 90 95 Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Ser Ser Asn Lys Cys Tyr 100 105 110 Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asp Asn Lys His Ser Asn 115 120 125 Gly Thr Ile His Asp Arg Ile Ser His Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu 130 135 140 Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala Trp 145 150 155 160 Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Arg Ala Trp Leu His Val Cys Val 165 170 175 Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asp Gly Val 180 185 190 Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Gln Asn Ile Leu Arg Thr Gln 195 200 205 Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met Thr 210 215 220 Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe Ile Lys 225 230 235 240 Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Gln Leu Ser Gly Ser Ala Gln His 245 250 255 Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Asp Val Arg Cys Val 260 265 270 Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Ile Asp Ile Asn 275 280 285 Met Ala Asp Tyr Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu Val 290 295 300 Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Asn Ser Asn Cys Lys 305 310 315 320 Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala Phe 325 330 335 Asp Tyr Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ser 340 345 350 Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Arg Val Ile Gly Gly Trp Thr Thr Ala 355 360 365 Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Asn Asn Asn 370 375 380 Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys Ile 385 390 395 400 Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Gln Glu Thr 405 410 415 Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr Ser 420 425 430 Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn Phe 435 440 445 Met Pro Ile 450 <210> 5 <211> 1683 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of modified HA protein coding gene of 01310 HA-DGS <400> 5 atggaaataa tagcactaat agctatactg gtagtgacag gaacaagcga tgctgataaa 60 atttgcattg gctaccagtc aacaaactcc acagaaactg ttgatacact agtagaaaac 120 aatgtccctg tgacacatac caaagaattg ctccacacag agcacaatgg aatgttatgt 180 gcaacaaact tgggacaccc tcttatccta gacacctgca ccattgaagg gttggtgtac 240 ggcaatcctt cctgtgattt gctactggga gggaaagagt ggtcttacat tgtcgaaaga 300 tcatcagctg ttaatgggat gtgctaccct ggaagggtag agaatctgga agaactcagg 360 tcctttttca gttctgctcg ctcctacaaa agactcctac tttttccaga ccgtacttgg 420 aatgtgactt tcaatgggac aagcaaagca tgctcaggct cattctacag aagtatgaga 480 tggctgacac acaagaacaa ttcttaccct attcaagacg cccaatatac caacgactgg 540 ggaaagaata ttctcttcat gtggggcata caccatccac ctactgatac tgagcaaatg 600 aatctataca aaaaagctga tacaacaaca agtataacaa cggaagatat caatcgaact 660 ttcaaaccag ggatagggcc aaggcctctt gtcaatggtc aacaaggaag aattgattat 720 tattggtcag tactaaagcc aggccagaca ttgcgaataa gatccaatgg aaatctaatt 780 gccccatggt atggacacat tctttcagga gaaagccatg gaagaatcct gaagaccgat 840 ttgaatagtg gcaactgcat aatacaatgc caaactgaga aaggtggttt gaacacgacc 900 ttgccattcc aaaatgtcag caaatatgca tttgggaact gtcccaaata tgttggagtg 960 aagagtctca aactggcagt tggtctaagg aatgtgcctg ctacatcagg tagagggctt 1020 ttcggtgcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagttgc aggctggtac 1080 gggtttcagc actcaaatga tcaaggggtt ggaatagccg cagacaaaga atcaactcaa 1140 gaagcagttg ataaaataac atccaaagta aataatataa tcgacaaaat gaacaagcag 1200 tatgaaatca ttgatcatga gttcagtgag attgaagcca gactcaatat gatcaacaat 1260 aagattgatg accaaataca ggacatctgg gcgtacaatg cagaattact agtactgctt 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgatcatgat gcaaatgtga acaatctgta taataaggtg 1380 aagagagcat tgggttcaaa tgcaatagag gatgggaagg gatgcttcga gttgtatcac 1440 aaatgtgatg atcaatgcat ggaaacaatt agagacggga gttatgacag gctaaagtat 1500 aaagaagaat caaaactaga aaggcagaaa atagaagggg taaaactgga gtctgaagaa 1560 acttacaaga ttcttaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaataggg 1620 cttgctgcct tcatgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 6 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mino acid sequence of modified HA protein of 01310 HA-DGS <400> 6 Met Glu Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ile Leu Val Val Thr Gly Thr Ser 1 5 10 15 Asp Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Val Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Met Cys Tyr Pro 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gctaaagtat 1500 aaagaagaat caaaactaga aaggcagaaa atagaagggg taaaactgga gtctgaagaa 1560 acttacaaga ttcttaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaataggg 1620 cttgctgcct tcatgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 10 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of modified HA protein of 01310 HA-NGN <400> 10 Met Glu Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ile Leu Val Val Thr Gly Thr Ser 1 5 10 15 Asp Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Val Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Met Cys Tyr Pro Gly Arg 100 105 110 Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Phe Phe Ser Ser Ala Arg Ser 115 120 125 Tyr Lys Arg Leu Leu Leu Phe Pro 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Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln 355 360 365 Gly Val Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp 370 375 380 Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln 385 390 395 400 Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn 405 410 415 Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr 420 425 430 Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp 435 440 445 His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu 450 455 460 Gly Ser Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His 465 470 475 480 Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Gln Tyr Asp 485 490 495 Arg Leu Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu 500 505 510 Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr 515 520 525 Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe 530 535 540 Met Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 545 550 555 560 <210> 13 <211> 1683 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of modified HA protein coding gene of 01310 HA-TGT <400> 13 atggaaataa tagcactaat agctatactg gtagtgacag gaacaagcga tgctgataaa 60 atttgcattg gctaccagtc aacaaactcc acagaaactg ttgatacact agtagaaaac 120 aatgtccctg tgacacatac caaagaattg ctccacacag agcacaatgg aatgttatgt 180 gcaacaaact tgggacaccc tcttatccta gacacctgca ccattgaagg gttggtgtac 240 ggcaatcctt cctgtgattt gctactggga gggaaagagt ggtcttacat tgtcgaaaga 300 tcatcagctg ttaatgggat gtgctaccct ggaagggtag agaatctgga agaactcagg 360 tcctttttca gttctgctcg ctcctacaaa agactcctac tttttccaga ccgtacttgg 420 aatgtgactt tcaatgggac aagcaaagca tgctcaggct cattctacag aagtatgaga 480 tggctgacac acaagaacaa ttcttaccct attcaagacg cccaatatac caacgactgg 540 ggaaagaata ttctcttcat gtggggcata caccatccac ctactgatac tgagcaaatg 600 aatctataca aaaaagctga tacaacaaca agtataacaa cggaagatat caatcgaact 660 ttcaaaccag ggatagggcc aaggcctctt gtcaatggtc aacaaggaag aattgattat 720 tattggtcag tactaaagcc aggccagaca ttgcgaataa gatccaatgg aaatctaatt 780 gccccatggt atggacacat tctttcagga gaaagccatg gaagaatcct gaagaccgat 840 ttgaatagtg gcaactgcat aatacaatgc caaactgaga aaggtggttt gaacacgacc 900 ttgccattcc aaaatgtcag caaatatgca tttgggaact gtcccaaata tgttggagtg 960 aagagtctca aactggcagt tggtctaagg aatgtgcctg ctacatcagg tagagggctt 1020 ttcggtgcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagttgc aggctggtac 1080 gggtttcagc actcaaatga tcaaggggtt ggaatagccg cagacaaaga atcaactcaa 1140 gaagcagttg ataaaataac atccaaagta aataatataa tcgacaaaat gaacaagcag 1200 tatgaaatca ttgatcatga gttcagtgag attgaagcca gactcaatat gatcaacaat 1260 aagattgatg accaaataca ggacatctgg gcgtacaatg cagaattact agtactgctt 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgatcatgat gcaaatgtga acaatctgta taataaggtg 1380 aagagagcat tgggttcaaa tgcaatagag gatgggaagg gatgcttcga gttgtatcac 1440 aaatgtgatg atcaatgcat ggaaacaatt agaaccggga cttatgacag gctaaagtat 1500 aaagaagaat caaaactaga aaggcagaaa atagaagggg taaaactgga gtctgaagaa 1560 acttacaaga ttcttaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaataggg 1620 cttgctgcct tcatgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 14 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of modified HA protein of 01310 HA-TGT <400> 14 Met Glu Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ile Leu Val Val Thr Gly Thr Ser 1 5 10 15 Asp Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Val Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Met Cys Tyr Pro Gly Arg 100 105 110 Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Phe Phe Ser Ser Ala Arg Ser 115 120 125 Tyr Lys Arg Leu Leu Leu Phe Pro Asp Arg Thr Trp Asn Val Thr Phe 130 135 140 Asn Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg 145 150 155 160 Trp Leu Thr His Lys Asn Asn Ser Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr 165 170 175 Thr Asn Asp Trp Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile His His 180 185 190 Pro Pro Thr Asp Thr Glu Gln Met Asn Leu Tyr Lys Lys Ala Asp Thr 195 200 205 Thr Thr Ser Ile Thr Thr Glu Asp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Gly 210 215 220 Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg Ile Asp Tyr 225 230 235 240 Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn 245 250 255 Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser 260 265 270 His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Asn Ser Gly Asn Cys Ile Ile 275 280 285 Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln 290 295 300 Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Pro Lys Tyr Val Gly Val 305 310 315 320 Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Thr Ser 325 330 335 Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp 340 345 350 Pro Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln 355 360 365 Gly Val Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp 370 375 380 Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln 385 390 395 400 Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn 405 410 415 Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr 420 425 430 Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp 435 440 445 His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu 450 455 460 Gly Ser Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His 465 470 475 480 Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Thr Gly Thr Tyr Asp 485 490 495 Arg Leu Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu 500 505 510 Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr 515 520 525 Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe 530 535 540 Met Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 545 550 555 560 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGN-F primer <400> 15 ggaaacaatt agaaacggga attatgacag gctaaag 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGN-R primer <400> 16 ctttagcctg tcataattcc cgtttctaat tgtttcc 37 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGT-F primer <400> 17 gcatggaaac aattagaacc gggacttatg acaggc 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGT-R primer <400> 18 gcctgtcata agtcccggtt ctaattgttt ccatgc 36 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGQ-F primer <400> 19 ggaaacaatt agaaacgggc aatatgacag gctaaag 37 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGQ-R priemr <400> 20 ctttagcctg tcatattgcc cgtttctaat tgtttcc 37 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-F primer <400> 21 ggaaacaatt agagacggga cttatgacag g 31 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-R primer <400> 22 cctgtcataa gtcccgtctc taattgtttc c 31 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGS-F primer <400> 23 ggaaacaatt agagacggga gttatgacag gctaaag 37 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGS-R primer <400> 24 ctttagcctg tcataactcc cgtctctaat tgtttcc 37 <210> 25 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HA2 fragment of A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2) <400> 25 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp Lys Ile 35 40 45 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 50 55 60 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile 65 70 75 80 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Arg Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe Met Phe 195 200 205 Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 26 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA2 fragment of 01310 HA-DGS <400> 26 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp Lys Ile 35 40 45 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 50 55 60 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile 65 70 75 80 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asp Gly Ser Tyr Asp Arg Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe Met Phe 195 200 205 Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 27 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA2 fragment of 01310 HA-DGT <400> 27 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp Lys Ile 35 40 45 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 50 55 60 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile 65 70 75 80 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asp Gly Thr Tyr Asp Arg Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe Met Phe 195 200 205 Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 28 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA2 fragment of 01310 HA-NGN <400> 28 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp Lys Ile 35 40 45 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 50 55 60 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile 65 70 75 80 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Asn Tyr Asp Arg Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe Met Phe 195 200 205 Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 29 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA2 fragment of 01310 HA-NGQ <400> 29 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp Lys Ile 35 40 45 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 50 55 60 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile 65 70 75 80 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Gln Tyr Asp Arg Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe Met Phe 195 200 205 Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 30 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA2 fragment of 01310 HA-TGT <400> 30 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp Lys Ile 35 40 45 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 50 55 60 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile 65 70 75 80 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Thr Gly Thr Tyr Asp Arg Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe Met Phe 195 200 205 Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F primer <400> 31 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R primer <400> 32 caggaaacag ctatgac 17

Claims (21)

  1. 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편에 154 N-글리칸 생성이 일어나지 않도록 하는 단계를 포함하고,
    상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 H9N2 바이러스이고,
    상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편은 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 154아스파라긴(N)-X-세린(S) 또는 트레오닌(T)156으로 표현되는 것으로, 상기 서열 중, X는 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 발린(V), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이고,
    상기 154 N-글리칸 생성이 일어나지 않도록 하는 단계는 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 다음의 변이 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함하는 것인,
    면역원성이 향상된 인플루엔자 바이러스의 HA2 공통 에피톱의 제조 방법:
    상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 154번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환; 및
    상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 156번째 아미노산인 세린(S) 또는 트레오닌(T)이 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 154 N-글리칸 생성이 일어나지 않도록 하는 단계는 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열을 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 치환하는 것인,
    면역원성이 향상된 인플루엔자 바이러스의 HA2 공통 에피톱의 제조 방법:
    154-아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S)-156,
    154-아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T)-156,
    154-아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N)-156,
    154-아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q)-156, 및
    154-트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)-156.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 치환 전의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편은 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 것인,
    면역원성이 향상된 인플루엔자 바이러스의 HA2 공통 에피톱의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    154 N-글리칸 생성이 일어나지 않은 HA2 절편은 서열번호 26, 27, 28, 29, 또는 20의 아미노산 서열을 갖는 것인,
    면역원성이 향상된 인플루엔자 바이러스의 HA2 공통 에피톱의 제조 방법.
  5. 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 아미노산 서열 내의 154 N-글리칸 생성이 일어나지 않은 154번째부터 156번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지며,
    상기 저병원성 조류인플루엔자 바이러스는 H9N2 바이러스이고,
    상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편은 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 154아스파라긴(N)-X-세린(S) 또는 트레오닌(T)156으로 표현되는 것으로, 상기 서열 중, X는 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 발린(V), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이고,
    상기 154 N-글리칸 생성이 일어나지 않은 154번째부터 156번째까지의 아미노산은 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 다음의 변이 중 하나 이상을 포함하는 것인,
    HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자:
    저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질의 154번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환; 및
    저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질의 156번째 아미노산인 세린(S) 또는 트레오닌(T)이 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환.
  6. 제5항에 있어서,
    변이 전의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편은 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 것인, HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA2 절편의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열은 다음의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 치환된 것인, HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자:
    154-아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S)-156,
    154-아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T)-156,
    154-아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N)-156,
    154-아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q)-156, 및
    154-트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)-156.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 서열번호 26, 27, 28, 29, 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 HA2 절편 내의154번째부터 156번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산으로 이루어진, HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 HA2 공통 에피톱을 포함하는 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  11. H1N1 인플루엔자 바이러스의 게놈 중 HA 단백질 코딩 유전자 및 NA 단백질 코딩 유전자가 H9N2 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 코딩 유전자 및 NA 단백질 코딩 유전자로 치환되고,
    상기 H9N2 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 유래의 HA2 절편은 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 다음의 변이 중 하나 이상을 포함하는 것인,
    재조합 바이러스:
    154번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환; 및
    156번째 아미노산인 세린(S) 또는 트레오닌(T)이 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 티로신(Y), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(K)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 H1N1 인플루엔자 바이러스는 PR8 바이러스(Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34(H1N1))이고, 상기 H9N2 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)인, 재조합 바이러스.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 H9N2 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 338번째 아미노산과 339번째 아미노산이 절단되어 생성된 HA2 절편의 154번째부터 156번째까지의 아미노산 서열이 다음의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 치환된 것인,
    재조합 바이러스:
    154-아스파트산(D)-글리신(G)-세린(S)-156,
    154-아스파트산(D)-글리신(G)-트레오닌(T)-156,
    154-아스파라긴(N)-글리신(G)-아스파라긴(N)-156,
    154-아스파라긴(N)-글리신(G)-글루타민(Q)-156, 및
    154-트레오닌(T)-글리신(G)-트레오닌(T)-156.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 치환이 일어난 HA 단백질은 서열번호 6, 8, 10, 12, 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 것인,
    재조합 바이러스.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 HA 단백질의 코딩 유전자는 서열번호 5, 7, 9, 11, 또는 13의 염기서열을 갖는 것인,
    재조합 바이러스.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 NA 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것인,
    재조합 바이러스.
  17. 제11항에 있어서,
    기탁번호 KCTC 12206BP인, 재조합 바이러스.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
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