KR101361774B1 - 계태아 고증식성 저병원성 재조합 인플루엔자 바이러스 - Google Patents

계태아 고증식성 저병원성 재조합 인플루엔자 바이러스 Download PDF

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Abstract

계태아 고증식성 저병원성인 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자 및 NA 아미노산 서열; 계태아 고증식성과 관련된 상기 HA 아미노산 서열 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 NA 아미노산 서열 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스; 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물; 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물; 및 상기 HA 아미노산 서열 및 NA 아미노산 서열을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 계태아 증식성을 증가시키는 방법이 제공된다.

Description

계태아 고증식성 저병원성 재조합 인플루엔자 바이러스{HIGHLY REPLICATIVE AND LAW PATHOGENICITY RECOMBINANT INFLUNEZA VIRUS}
본 발명은 계태아 고증식성 저병원성 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자 및/또는 NA 아미노산 서열; 계태아 고증식성과 관련된 상기 HA 아미노산 서열 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 NA 아미노산 서열 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스; 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물; 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물; 및 상기 HA 아미노산 서열 및 NA 아미노산 서열을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 계태아 증식성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M1, M2), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2 (polymerase subunit A, B1 & B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.
과거 인체 인플루엔자 A 백신은 계태아 증식성이 탁월한 재배열 주를 포르말린으로 불활성화 하여 HA와 NA만을 정제한 단위 백신으로, 항원 생산성 향상을 위해 최신 유행하는 인체 인플루엔자 바이러스와 발육란 증식성이 탁월한 것으로 알려진 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)을 혼합 감염시켜 제조되었다. 최근 역유전학 기술을 사용하여 계태아 증식성이 탁월하며 특성이 잘 알려진 PR8 바이러스나 A/WSN/33(H1N1) 바이러스나 저온 적응시켜 약독화 시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스 등의 8개 게놈을 바이러스 게놈 전사벡터에 클로닝하고, PA, PB1, PB2, NP 코딩 부분을 발현하는 벡터에 클로닝 하여 12개 플라스미드(특허 제0908757호)를 293T 등의 세포주에 transfection 하여 원하는 바이러스를 작출하거나 벡터의 한 방향으로 바이러스 게놈 전사가 일어나고, 다른 방향으로는 mRNA가 만들어지는 8개의 플라스미드를 trnasfection (특허 제0862758호)시켜 재조합 바이러스를 작출하고 있다.
통상 HA와 NA 유전자는 최근 유행하는 바이러스로부터 PCR 법으로 증폭하여 역유전학 벡터에 클로닝하고, PR8의 나머지 유전자 6개와 함께 transfection 하여 백신주를 작출하며 바이러스를 불활화하여 사독백신을 제조하고 있다.
인플루엔자 바이러스는 닭에 대한 병원성에 따라 저병원성 조류인플루엔자와 고병원성 인플루엔자로 분류되는데 고병원성 인플루엔자 바이러스로는 H5와 H7 아형의 바이러스가 알려져 있으며 이 들 바이러스의 고병원성은 HA 단백질의 cleavage site의 반복되는 염기성 단백질 때문인 것으로 알려져 있다. 즉 HA 단백질의 활성화를 위해 단백분해효소에 의해 HA1과 HA2로 절단되어야 하는데 cleavage site에 염기성 아미노산이 반복되는 경우 모든 장기에 분포하는 퓨린 유사 내인성 단백분해효소(furin-like endogenous protease)에 의해 HA 단백질이 활성화 되므로 바이러스 증식이 일어나며 저병원성 인플루엔자 바이러스의 경우 trypsin과 같은 외인성 단백분해효소에 의해서만 활성화 되므로 호흡기나 소화기에서만 활성화되어 국소감염만 일어나게 된다.
고병원성 인플루엔자 바이러스는 가금에 대한 막대한 피해 뿐 아니라 인체 감염시 사망에 이르는 치명적인 바이러스로 특히 돼지에서의 적응과정 없이 조류에서 사람으로 직접 감염되어 발생한 H5N1 인플루엔자 바이러스의 경우 1997년 H5N1으로 인해 홍콩에서 18명의 사람이 감염되어 그중 6명이 사망하고 이후 2003년 말 아시아에서 시작되어 유럽과 아프리카로 확산 되었으며 2003년부터 2011년 10월 10일 현재까지 WHO에 보고된 확진된 사람 감염예는 총 566 명으로 그중 332명이 사망하여 58.7%의 사망률을 보이고 있고, 이집트, 인도네시아, 캄보디아에서는 처음 발생한 이후로 매년 감염사례가 보고되고 있어 전 세계적으로 공포의 대상이 되고 있다(WHO/GIP).
이러한 H5N1 바이러스의 위협에 대처하기 위한 백신주 개발은 고병원성 H5N1 바이러스의 병원성을 약화시키고, 계태아나 세포주에서의 증식성을 증가시키는 방향으로 이루어졌다. 국제수역사무국(OIE)에서는 계태아를 이용한 인플루엔자 백신주로 적합한 바이러스의 조건으로 발육란에 접종하여 3일간 배양하는 동안 계태아의 폐사율이 10%이하일 것을 권장하고 있는데 이는 백신주의 생산성뿐 아니라 계태아에 대한 병원성도 낮아야 한다는 것을 의미한다. 초기에는 야외에서 분리된 저병원성 H5N1 바이러스를 그대로 사독백신으로 개발하는 연구가 이루어졌으나 낮은 바이러스 역가와 잠재적인 위험성으로 역유전학 기술을 사용하여 고병원성 H5N1 바이러스의 병원성과 관련된 HA 단백질 cleavage site의 아미노산 서열을 저병원성 바이러스의 서열로 치환한 H5N1 바이러스의 HA 및 NA와 계태아나 세포주에서 증식성이 좋고, 병원성이 낮은 바이러스의 나머지 내부유전자를 갖도록 재조합 백신주를 개발하고 있다. 이렇게 작출된 재조합 바이러스들은 병원성이 낮아지고, 증식성이 증가되나 증식성이 좋지 않은 경우도 있어, 백신주의 증식성을 향상시키기 위한 기술 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 저증식성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스인 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/2010 (H5N1)(이하 SNU50-5-E2)를 발육란(계태아)에서 18회 계대하여 고증식성 H5N1 바이러스인 SNU50-5-E20를 확립하고, SNU50-5-
E2와 SNU50-5-E20의 전체 게놈 서열을 분석하여 두 균주 간 차이를 보이는 아미노산 서열을 확인하여, 계태아에서의 증식성과 관련된 HA 아미노산 서열과 NA 아미노산 서열을 확립하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일례는 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자 및 NA 아미노산 서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 예는 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 NA 아미노산 서열 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 예는 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 예는 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 예는 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 NA 아미노산 서열 코딩 폴리뉴클레오타이드를 인플루엔자 바이러스에 도입하여 인플루엔자 바이러스의 계태아 증식성을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 계태아에서의 고증식성 H5N1 바이러스를 확립하기 위해 야생조류의 분변에서 분리된 저증식성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스인 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/2010(H5N1)(이하, SNU50-5-E2)를 발육란(계태아)에서 18회 계대하여 고증식성 H5N1 바이러스인 SNU50-5-E20를 확립하였다. 확립된 계태아 고증식성의 SNU50-5-E20에서의 계태아 고증식성과 관련된 돌연변이를 동정하기 위하여, 전체 게놈서열을 분석하여 SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20 간에 차이를 보이는 아미노산 서열을 확인하여, SNU50-5-E20에서 변이가 나타난 계태아 고증식성과 관련된 HA 유전자와 NA 유전자를 분리하였다.
계태아에서의 고증식성 SNU50-5-E20의 HA 아미노산 서열은 모균주인 SNU50-5-E2의 HA 아미노산 서열(서열번호 1)과 비교하여 119번 아미노산으로 히스티딘(H) 대신 티로신(Y)을 가지거나(H119Y), 177번 아미노산으로 리신(K) 대신 글루탐산(E)을 가지거나(K177E), 333번 아미노산으로 루이신(L) 대신 프로린(P)을 가지거나(L333P), 393번 아미노산으로 아르기닌(R) 대신 리신(K)을 가지거나(R393K), 이들 아미노산 변이 중 2개 이상의 아미노산 변이를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 계태아에서의 고증식성 SNU50-5-E20의 NA 아미노산 서열은 모균주인 SNU50-5-E2의 NA 아미노산 서열(서열번호 17)과 비교하여 369번 아미노산으로 세린(S) 대신 아스파라긴(N)을 갖는(S369N) 아미노산 변이를 갖는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 일례는 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자, 또는 상기 HA 아미노산 분자를 포함하는 계태아 고증식용 조성물을 제공한다. 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자는, 인플루엔자 바이러스의 HA 아미노산 서열에 있어서, 119번 위치에서 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환 (H119Y), 177번 위치에서 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환 (K177E), 333번 위치에서 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환(L333P), 및 393번 위치에서 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환(R393K)으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 아미노산 변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.
예컨대, 상기 인플루엔자 바이러스는 HA 및 NA를 갖는 모든 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 예컨대, H1N1, H2N1, H3N1, H4N1, H5N1, 고병원성 H5N1, H6N1, H7N1, H8N1, H9N1, H10N1, H11N1, H12N1, H13N1, H14N1, H15N1, 및 H16N1 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/2010(H5N1)(이하, SNU50-5-E2)일 수 있다.
본 발명의 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자가 SNU50-5-E2을 18회 계대한 SNU50-5-E20로부터 얻어진 것인 경우, 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자는, SNU50-5-E2의 HA 아미노산 서열(서열번호 1)을 기준으로, 119번 위치에서 히스티딘(H)을 티로신(Y)으로 치환 (H119Y), 177번 위치에서 리신(K)을 글루탐산(E)으로 치환 (K177E), 333번 위치에서 루이신(L)을 프로린(P)으로 치환
(L333P), 및 393번 위치에서 아르기닌(R)을 리신(K)으로 치환(R393K)으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 아미노산 변이를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다:
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환된 것(H119Y; 서열번호 2);
서열번호 1의 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환된 것(K177E; 서열번호 3);
서열번호 1의 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환된 것(L333P; 서열번호 4);
서열번호 1의 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(R393K; 서열번호 5);
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환되고 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환된 것(H119Y/K177E; 서열번호 6);
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환되고 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환된 것(H119Y/L333P; 서열번호 7);
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환되고 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(H119Y/R393K; 서열번호 8);
서열번호 1의 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환되고 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환된 것(K177E/L333P; 서열번호 9);
서열번호 1의 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환되고 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(K177E/R393K; 서열번호 10);
서열번호 1의 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환되고 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(L333P/R393K; 서열번호 11);
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환되고 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환되고 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환된 것(H119Y/K177E/L333P; 서열번호 12);
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환되고 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환되고 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(H119Y/K177E/R393K; 서열번호 13);
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환되고 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환되고 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(H119Y/L333P/R393K; 서열번호 14);
서열번호 1의 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환되고 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환되고 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(K177E/L333P/R393K; 서열번호 15); 및
서열번호 1의 119번 위치의 히스티딘(H)이 티로신(Y)으로 치환되고 177번 위치의 리신(K)이 글루탐산(E)으로 치환되고 333번 위치의 루이신(L)이 프로린(P)으로 치환되고 393번 위치의 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환된 것(H119Y/K177E/L333P/R393K; 서열번호 16).
또 다른 예는 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산 분자를 제공한다. 상기 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산 분자는, 인플루엔자 바이러스의 NA 아미노산 서열에 있어서, 369번 위치의 세린(S)이 아스파라긴(N)으로 치환된 것(S369N)일 수 있다.
예컨대, 상기 인플루엔자 바이러스는 HA 및 NA를 갖는 모든 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 예컨대 H5N1 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 구체적으로 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/2010(H5N1)(이하, SNU50-5-E2)일 수 있다.
본 발명의 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산 분자가 SNU50-5-E2을 18회 계대한 SNU50-5-E20로부터 얻어진 것인 경우, 상기 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산 분자는, SNU50-5-E2의 NA 아미노산 서열(서열번호 17)을 기준으로, 369번 위치의 세린(S)이 아스파라긴(N)으로 치환된 것(S369N; 서열번호 18)일 수 있다.
상기한 바와 같은 계태아 증식성과 관련된 HA 및/또는 NA 아미노산 서열 변이는 대표적으로 H5N1 인플루엔자 바이러스에서 확인하였지만, H5N1에 한정되는 것은 아니며 다양한 저증식성 인플루엔자 바이러스에 적용될 수 있다.　
본 발명의 다른 예는 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 분자 및/또는 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산 분자를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 계태아 증식성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 예는 인플루엔자 바이러스의 HA 아미노산 서열에 있어서, 119번 위치에서 히스티딘(H)을 티로신(Y)으로 치환 (H119Y), 177번 위치에서 리신(K)을 글루탐산(E)으로 치환 (K177E), 333번 위치에서 루이신(L)을 프로린(P)으로 치환(L333P), 및 393번 위치에서 아르기닌(R)을 리신(K)으로 치환(R393K)으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 아미노산 변이를 포함하는 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 인플루엔자 바이러스의 NA 아미노산의 369번 위치의 세린(S)이 아스파라긴(N)으로 치환된 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산 분자 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산 코딩 서열 및 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산 분자 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발현벡터에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 HA 아미노산은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 계태아 고증식성과 관련된 HA 아미노산은 서열번호 2 내지 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한 상기 인플루엔자 바이러스의 NA 아미노산을 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 상기 계태아 고증식성과 관련된 NA 아미노산은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 SNU50-5-E20의 HA 유전자(예컨대, 서열번호 2 내지 16의 코딩 유전자)와 NA 유전자(예컨대, 서열번호 18의 코딩 유전자)와 계태아 증식성과의 관련성을 확인하기 위하여, SNU50-5-E2의 HA 유전자(서열번호 1의 코딩 유전자)와 NA 유전자(서열번호 17의 코딩 유전자)를 가지며, A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스(이하, 'PR8 바이러스'로 칭함; NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)의 나머지 6개 유전자, 즉 PA, PB1, PB2, NP, M, 및 NS 유전자를 갖는 재조합 바이러스[rPR8-SNU50-5-E2(HA-NA)]와 상기 분리된 SNU50-5-E20의 HA 유전자(예컨대, 서열번호 2 내지 16의 코딩 유전자)와 NA 유전자(예컨대, 서열번호 18의 코딩 유전자)를 가지며 PR8의 나머지 6개 유전자(PA, PB1, PB2, NP, M, 및 NS 유전자)를 갖는 재조합 바이러스[rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)]를 제작하여 50% 계태아 감염농도(EID50/ml)를 비교한 결과, 두 재조합 균주 간 뚜렷한 증식성 차이를 확인하였다.
이에, 본 발명의 또 다른 예는 인플루엔자 바이러스에 있어서, HA 아미노산 서열이 119번 위치의 히스티딘(H)을 티로신(Y)으로 치환 (H119Y), 177번 위치의 리신(K)을 글루탐산(E)으로 치환 (K177E), 333번 위치의 루이신(L)을 프로린(P)으로 치환(L333P), 및 393번 위치의 아르기닌(R)을 리신(K)으로 치환(R393K)으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 아미노산 변이를 포함하는 것인, 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주를 제공한다. 또 다른 예는 인플루엔자 바이러스에 있어서, NA 아미노산 서열의 369번 위치의 세린(S)이 아스파라긴
(N)으로 치환(S369N)된, 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주를 제공한다. 또 다른 예에서, HA 아미노산 서열이 119번 위치에서 히스티딘(H)을 티로신(Y)으로 치환 (H119Y), 177번 위치에서 리신(K)을 글루탐산(E)으로 치환 (K177E), 333번 위치에서 루이신(L)을 프로린(P)으로 치환(L333P), 및 393번 위치에서 아르기닌(R)을 리신(K)으로 치환(R393K)으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 아미노산 변이, 및 NA 아미노산 서열의 369번 위치의 세린(S)이 아스파라긴(N)으로 치환(S369N)된 아미노산 변이를 갖는, 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주를 제공한다.
상기 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주는 앞서 설명한 발현벡터로 형질전환된 재조합 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
구체예에서, 상기 인플루엔자 변이 균주 또는 재조합 인플루엔자 바이러스는 HA 유전자로서 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 및/또는 NA 유전자로서 서열번호 18의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 것일 수 있다. 한 구체예에서, HA 유전자로서 서열번호 16의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 및 NA 유전자로서 서열번호 18의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 재조합 균주를 제작하여 대전에 소재하는 생명공학연구원 유전자원센터에 2011년 11월3일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 12046BP를 부여받았다.
본 발명의 변이균주 또는 재조합 균주의 모균주로 사용되는 균주로서, H1N1 계통의 인플루엔자 바이러스인 PR8 바이러스를 사용하였지만, 이에 한정되지 않고 백신주로 사용되는 모든 인플루엔자 바이러스, 예컨대 저병원성 인플루엔자 바이러스에 적용하여 HA 및/또는 NA 유전자가 상기한 변이를 갖도록 하거나, 상기한 발현벡터를 이용하여 본래의 HA 및/또는 NA 유전자를 대체하여 형질도입함으로써, 기존 백신주의 계태아 저증식성 문제를 해결할 수 있다. 상기 변이균주 또는 재조합 균주의 모균주로서, 상기PR8 바이러스 외에, 예컨대, A/WSN/33(H1N1) 바이러스 또는 저온 적응시켜 약독화 시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 등을 사용할 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주 및/또는 재조합 인플루엔자 바이러스 균주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 백신은 닭과 오리 등의 조류뿐 아니라 돼지, 개, 인간과 마우스 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다.　
본 발명의 또 다른 예는, 인플루엔자 바이러스의 HA 유전자 및/또는 NA 유전자를 변이시켜서 계태아 증식성을 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 방법은,
인플루엔자 바이러스의 HA 아미노산 서열이 119번 위치의 히스티딘(H)을 티로신(Y)으로 치환 (H119Y), 177번 위치의 리신(K)을 글루탐산(E)으로 치환 (K177E), 333번 위치의 루이신(L)을 프로린(P)으로 치환(L333P), 및 393번 위치의 아르기닌(R)을 리신(K)으로 치환(R393K)으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 아미노산 변이를 포함하도록 HA 유전자를 변이시키는 단계;
인플루엔자 바이러스의 NA 아미노산 서열이 369번 위치의 세린(S)이 아스파라긴(N)으로 치환(S369N)된 아미노산 변이를 갖는 NA 단백질을 코딩하도록 변이시키는 단계; 또는
상기 두 단계를 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스의 HA 아미노산 서열은 서열번호 1일 수 있고, 인플루엔자 바이러스의 NA 아미노산 서열은 서열번호 17일 수 있다.
따라서, 상기 방법은
인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열의 코딩 유전자로 치환하는 단계;
인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 서열번호 18의 아미노산 서열의 코딩 유전자로 치환하는 단계; 또는
상기 두 단계를 모두 포함하는 것일 수 있다.
이와 같은 유전자 변이 또는 재조합에 의하여, 인플루엔자 바이러스의 계태아 증식성을 증가시켜, 백신주로서의 유용성을 보다 증진시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는, 상기 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주 및/또는 재조합 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 항혈청을 함유하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다. 예컨대, 상기 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주 및/또는 재조합 인플루엔자 바이러스 균주는 H5N1의 계태아 고증식성 변이체(예컨대, SNU50-5-E20)의 HA 및/또는 NA 유전자를 PR8 인플루엔자 바이러스에 도입시킨 재조합 바이러스인 rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)에 대한 항혈청을 함유하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물일 수 있다.　 또 다른 예는 상기 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주 및/또는 재조합 인플루엔자 바이러스 균주, 예컨대, rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)에 대한 항혈청을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 키트를 제공한다. 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것일 수 있으며, 상기 진단 대상 환자는 조류 또는 포유류일 수 있다.
본 발명자들은 2010년 야생조류의 분변 부유액을 10일령 SPF 발육란의 요막강 경로로 접종하여 저증식성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스인 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/ 2010(H5N1) (이하 SNU50-5-E2)를 분리하였고, 이 바이러스를 발육란에서 18회 계대하여 고증식성 H5N1 바이러스인 SNU50-5-E20를 확립하였다. SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20의 50% 계태아감염농도를 측정한 결과 각각 107.9 EID50/ml와 1010 EID50/ml로 100배 이상의 역가 차이를 보였다. 계태아 고증식성과 관련된 돌연변이를 동정하기 위해 SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20의 전체 게놈서열을 분석하여 두 바이러스 간에 차이를 보이는 아미노산 서열을 확인한 결과, SNU50-5-E20에서, HA는 119번, 177번, 333번, 및 393번 아미노산이 히스티딘에서 티로신으로(H119Y), 리신이 글루탐산으로(K177E), 루이신이 프로린으로(L333P), 아르기닌이 리신으로(R393K) 각각 변이되었고, NA는 369번 아미노산인 세린이 아스파라긴으로 변이(S369N) 되었으며, PB2, PB1, NP, NS1, NS2등의 나머지 유전자에서는 유의미한 변이가 관찰되지 않았다.
상기와 같이 계태아 증식성이 증진된 변이체의 HA 아미노산 서열에서 동정된 아미노산 변이에 의해서 항원성이 유지될 수 있는지를 확인하기 위하여, 아미노산 변이 지점인 119번, 177번, 및 333번 아미노산의 HA5 단백질 3차구조 상의 위치를 확인하였다 (도 2 참조). 그 결과 177번 아미노산은 HA 단백질의 말단부분에 노출되어 있었고, 119번 아미노산은 HA 삼중복합체의 연접부분에 위치하였고, 333번 아미노산은 HA 단백질 단일체의 안쪽에 위치하고 있어 HA 단백질의 수용기와의 결합력에 직접 영향을 주는 것 보다는 삼중복합체 및 단일체 3차구조 형성과 구조 안정성에 영향을 줄 것으로 추측되나 지금까지 그 기능이 확인되지 않은 고유한 변이인 것으로 나타났다. 즉, 상기 HA 아미노산 변이는 HA 단백질의 항원성을 결정하는 에피토프 부위인 190-Helix와 130-Loop와 무관하며, 기존에 인플루엔자 바이러스의 항원성에 영향을 미치는 것으로 알려진 아미노산 위치와 모두 무관하며, 도 2에 나타난 바와 같이, HA 단백질의 3차 구조에도 영향을 미치지 않으므로, 위와 같은 HA 아미노산 변이는 인플루엔자 바이러스의 항원성에 영향을 주지 않고, 본 발명에 의하여 변이된 계태아 증식성이 증진된 인플루엔자 바이러스는 고유의 항원성을 유지할 수 있다.
또한 NA 아미노산 서열 변이인 S369N 역시 지금까지 그 기능이 보고되지 않은 변이이다.
발육란에서의 증식성과 HA와 NA 유전자의 관련성을 확인하기 위해 SNU50-5-E2의 HA와 NA를 가지며 PR8의 나머지 6개 유전자를 갖는 rPR8-SNU50-5-E2(HA-NA)와 SNU50-5-E20의 HA와 NA를 가지며 PR8의 나머지 6개 유전자를 갖는 rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)를 제작하여 50% 계태아감염농도(EID50/ml)를 비교한 결과 각각 107.9 EID50/ml와 1010 EID50/ml로 100배 이상의 역가 차이가 확인되어 SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20의 계태아 증식성 차이는 HA 및 NA 아미노산 변이 때문이라는 것을 확인하였고, SNU50-5-E20과 rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)의 계태아에 대한 병원성을 비교한 결과 SNU50-5-E20은 3일내에 계태아 100% 폐사와 계태아 전신의 충혈 및 출혈을 보였으나, rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)은 폐사가 전혀 없어 OIE 권고 사항에 적합한 백신주라는 사실을 확인하였다.
본 발명은 기존의 PR8 바이러스를 이용한 백신 제조에 있어서 병원성이 나타나는 문제점을 해결하고자, 병원성이 없거나 매우 낮으면서 면역원성이 우수한 재조합 PR8 바이러스를 제공하며, 본 발명에서 제공되는 재조합 PR8 바이러스는 발육란(계태아) 고생산성, 포유류 고면역원성, 및 조류와 포유류 무병원성이어서 사독백신뿐 아니라 생독백신으로서도 유용하다.
도 1은 야생조류 분리 저증식성 저병원성 H5N1 바이러스(SNU50-5-E2), 이 바이러스를 발육란에서 20대 계대하여 증식성이 증가한 고증식성　및 저병원성 H5N1 바이러스(SNU50-5-E20), 상기 바이러스 각각의 HA 유전자 및 NA 유전자를 갖는 PR8 재조합 바이러스인 rPR8-SNU50-5-E2(HA-NA)와　rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)의 50% 계태아 감염 역가를 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 저병원성 H5N1 바이러스 계태아 고증식성 관련 돌연변이 아미노산의 HA 단백질 3차구조 상의 위치를 보여주는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 계태아 고증식성 저병원성 H5N1 바이러스 분리
1-1. 바이러스 분리 및 계대
2010년 야생조류의 분변 부유액을 10일령 SPF 발육란의 요막강 경로로 접종하여 저증식성 및 저병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스인 A/Environment/Korea/SNU50-5-E2/2010(H5N1) (이하 SNU50-5-E2)를 분리하였으며, 이는 서울대학교 조류질병학실로부터 용이하게 입수 가능하다. SNU50-5-E2를 멸균 인산완충용액으로1000배 희석하여 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY) 3개에 요막강 경로로 200㎕씩 접종하여 37℃에서 배양하며 오전과 오후 검란하여 죽은 계태아는 4℃에 보관한 후 요막액을 수확하여 동일한 방법으로 18회 계대하여 SNU50-5-E20을 확립하였다.
상기 얻어진 각 균주를 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY) 3개의 요막강 (allantoic cavity)에 200㎕씩 접종하였고, 37℃에서 3일간 배양한 후 요막액 (allantoic fluid)을 수확하여 하기의 평판혈구응집검사를 수행하였다.　 상기 요막액 20㎕와 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY)을 부화시킨 닭에서 추출한 0.1% 닭 적혈구 20㎕를 유리 평판에 점적 후 혼합하여 평판혈구응집검사를 실시하여 양성인 시료를 -70℃에 보관하며 실험에 사용하였다.　
1.2. 바이러스 역가 측정
상기에서 제작한 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID50/ml)를 측정하기 위하여 각각의 재조합 바이러스들을 인산완충용액으로 10-1 내지 10-9까지 10진 희석하여 각 희석배수별로 10-11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강경로로 100㎕씩 접종하여 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하여 Reed-Muench 계산식에 따라 바이러스 역가(EID50/ml)를 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도1에서 알 수 는 바와 같이, SNU50-5(E2)의 혈구응집역가는 27이었고, 계태아 감염역가는 1x107EID50/ml을 보인 반면 SNU50-5(E20)의 혈구응집역가는 210이었고, 계태아 감염역가는 1x109EID50/ml 보여 계태아에서의 증식성이 뚜렷하게 증가 하였음을 확인할 수 있다.
1-3. RNA 분리, 역전사효소 - 중합효소연쇄반응 , 염기서열 결정 및 분석
RNA분리를 위하여, 상기 1-1에서 얻어진 SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20 바이러스의 발육란 배양 요막액 150㎕로부터 Viral Gene spin 키트 (iNtRON Co. Ltd., 성남, 대한민국)를 사용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 RNA를 분리한 후 QIAGEN 사의 one-step RT-PCR 키트와 인플루엔자 바이러스 게놈 증폭용 프라이머 (PB2 증폭용 프라이머,Ba-PB2-1, Ba-PB2-2341R; PB1 증폭용 프라이머, BmPB1-1, Bm-PB1-2341R; PA 증폭용 프라이머, Bm-PA-1, Bm-PA-2233R; HA 증폭용 프라이머, Bm-HA-1, Bm-NS-890R; NP 증폭용 프라이머, Bm-NP-1, Bm-NP1565R; NA 증폭용 프라이머, Ba-NA-1, Ba-NA-1413R; M 증폭용 프라이머, Bm-M-1, Bm-M-1027R; NS 증폭용 프라이머, Bm-NS-1; Bm-NS-890R; Hoffmann 등, Archives Virol, 2001)를 사용하여 바이러스의 8개 게놈을 증폭하였다. 즉, 5X one step RT buffer 20㎕, dNTP(2.5mM) 4㎕, 각 유전자 증폭용 전 방향 및 역방향 프라이머(10pmol/㎕) 각각 1㎕, one-step enzyme mix 4㎕, RNA 4㎕, RNase 제거 3차멸균증류수 66㎕를 혼합하여 PCR 기기(C-1000, Bio Rad Laboratories Inc., USA)에서 50℃에서 30분간 반응한 후 95℃에서 15분 가열하였고, 94℃-20초-58℃-30초-72℃-7분간 반응을 30회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응시켰다. 얻어진 증폭 산물을 아가로스겔에서 전기영동하고, Gel extraction kit(QIAGEN Co. USA)를 사용하여 정제한 후, ABI3777 자동염기서열 분석기(마크로젠, 서울, 대한민국)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
각 게놈의 코딩 염기서열을 Bioedit(ver 7.0.5.3; Hall, T.A.　 1999.　 BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.　 Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.)을 사용하여 아미노산으로 번역하였고, 다중배열하여 SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20 사이에 차이가 나는 아미노산을 동정하여 표 1에 정리하였다.
SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20 바이러스 아미노산 서열 차이
　 SNU50-5(E2) Location of Amino acid SNU50-5(E20)
HA H 119 Y
　 K 177 E
　 L 333 P
　 R 393 K
NA S 369 N
표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 두 바이러스 간에 차이를 보이는 아미노산 서열을 확인한 결과, HA 아미노산 서열은 119번, 177번, 333번, 393번 아미노산이 히스티딘에서 티로신으로(H119Y), 리신이 글루탐산으로(K177E), 루이신이 프로린으로(L333P), 아르기닌이 리신으로(R393K) 각각 변이되었고, NA 아미노산 서열은 369번 아미노산인 세린이 아스파라긴으로 변이(S369N) 된 것으로 나타났다.
조류와 포유류 수용기 결합력을 결정하는 238번(226, H3 numbering)과 240번(228, H3 numbering) 아미노산은 조류 수용기에 친화력을 보이는 아미노산이었고, HA 활성과 균형을 이루기 위한 NA stalk 부분의 아미노산 결손은 관찰되지는 않았다(표 2).
Figure 112013073004226-pat00001
*H3 numbering
SNU50-5-E20의 HA에서 변이가 일어난 것으로 동정된 119번, 177번, 333번 아미노산의 위치를 HA5 단백질 3차구조를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 177번 아미노산은 HA 단백질의 바깥쪽 말단부분에 노출되어 있었고, 119번 아미노산은 HA 삼중 복합체의 각 연접부분에 위치하였고, 333번 아미노산은 HA 단백질 단위체의 안쪽에 위치하고 있어 HA 단백질의 수용기와의 결합력에 직접 영향을 주는 것 보다는 삼중 복합체 및 단위체 3차구조 형성과 구조 안정성에 영향을 줄 것으로 추측되나 지금까지 그 기능이 확인되지 않은 고유한 변이이다. NA의 변이인 S369N도 지금까지 그 기능이 보고되지 않은 변이이다.
인플루엔자 바이러스의 방어에 가장 중요한 역할을 하는 HA 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과 SNU50-5-E20은 사람 유래 H5N1 바이러스인 A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)(GenBank 등록번호 AY651334)와 A/Hong Kong/213/2003(H5N1) (GenBank 등록번호 EF541401)와 93% 일치하였고, 국내 돼지에서 분리된 A/swine/Korea/C13/2008(H5N2)(GenBank 등록번호 ACJ53878)와는 99% 일치하여 90% 이상의 상동성을 보여주었다.
실시예 2: SNU50 -5 HA 및 NA 유전자를 갖는 PR8 재조합 바이러스 제작 및 특성 분석
2-1. 재조합 바이러스 제작
재조합 인플루엔자 바이러스 제작을 위하여, 호프만 박사의 역유전학 벡터시스템(특허 제0862758호)을 사용하였다.
구체적으로는 실시예 1-2에서 증폭한 SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20 바이러스의 HA와 NA 유전자를 TOPO-TA cloning 벡터(Invitrogen Co. USA)에 클로닝하여 M13F/M13R 프라이머(M13F, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (서열번호 19); M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(서열번호 20))로 염기서열을 결정하였고, BsmBI(NEB, Inc, USA) 20U/2㎕, 10 X 버퍼 2㎕, pHW2000 플라스미드(한국특허등록 제0862758호, 국립수의과학검역원으로부터 St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사, 호프만 박사의 동의를 얻어 입수) 10㎍/3㎕, 멸균 3차증류수 13㎕를 혼합하여 50℃에서 1.5시간 배양한 후 아가로스겔에 전기영동하여 해당 DNA를 Gel extraction kit(QIAGEN Co.)로 정제하였다.
또한 상기 pHW2000에 대하여 상기와 동일한 방법으로 BsmBI을 처리하여 아가로오스겔에서 전기영동하여 정제한 pHW2000 벡터 6㎕와 NS 2㎕에 T4 DNA ligase (1,000,000 U/㎕, NEB Inc, USA) 1㎕, 10X 반응 버퍼 1㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 정치한 후, 대장균(Escherichia coli, OneShot
Figure 112013073004226-pat00002
top10 competent cell, Invitrogen Co. USA)에 transformation 한 후 염기서열을 분석하여 정확한 클론을 선발하여 플라스미드를 추출하였다.
호프만 벡터시스템의 PR8의 PB1, PB2, PA, NP, M, 및 NS 유전자에 해당하는 6개 플라스미드(St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공 받은 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW195-NP, pHW197-M, 및 pHW195-NS, 역유전학용 플라스미드(Vaccine 2002, 20:3165-3170; pHW2000 (등록특허 제10-0862758호 참조))와 상기 준비된 각 바이러스(SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20 바이러스)의 HA와 NA 플라스미드를 갖는 재조합 바이러스를 작출하기 위하여, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X106개/2ml 부유하여 각 웰에 첨가한 후 3-4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후 Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.
상기 준비된 플라스미드 8개를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각 300ng 씩의 양으로 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 plus reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다.
기다리는 동안 lipofectamine 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 상기 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다. 얻어진 반응 생성물을 상기293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕를 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO2, 37℃에서 20시간 배양한 후 웰당 트립신 10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발생란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발생란을 37℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집 여부를 확인한 결과 모두 혈구응집 양성을 보였다.
상기 1-3과 같은 방법으로 RNA를 추출하여 HA 및 NA 유전자를 증폭하여 염기서열을 확인하여 SNU50-5-E2와 SNU50-5-E20에 특이적인 서열을 확인하여 SNU50-5-E2의 HA(서열번호 1의 코딩 폴리뉴클레오타이드)와 NA(서열번호 17의 코딩 폴리뉴클레오타이드)를 갖는 재조합 바이러스를 rPR8-SNU50-5-E2(HA-NA), SNU50-5-E20의 HA(서열번호 16의 코딩 폴리뉴클레오타이드)와 NA(서열번호 18의 코딩 폴리뉴클레오타이드)를 갖는 재조합 바이러스를 rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)로 명명하였다. 이 중에서 rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)를 대전에 소재하는 생명공학연구원 유전자원센터(KCTC)에 2011년 11월 3일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 12046BP를 부여받았다.
이 재조합 바이러스들의 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스를 -70℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.
2-2. 바이러스 역가 측정
상기에서 제작한 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID50/ml)를 측정하기 위하여 각각의 재조합 바이러스들을 인산완충용액으로 10-1 내지 10-9까지 10진 희석하여 각 희석배수별로 10-11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강경로로 100㎕씩 접종하여 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하여 Reed-Muench 계산식에 따라 바이러스 역가(EID50/ml)를 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, SNU50-5(E2)의 혈구응집역가는 27이었고, 계태아 감염역가는 1x107.1EID50/ml을 보인 반면 SNU50-5(E20)의 혈구응집역가는 210이었고, 계태아 감염역가는　1x109.5EID50/ml 보여 계태아에서의 증식성이 뚜렷하게 증가 하였다.
2-3. 계태아 병원성 측정
상기 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 10-3 희석하여 200㎕의 양으로 10 내지 11일령 SPF 종란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하여, 3일 간 37℃에 배양하며 폐사한 종란과 3일까지 생존한 종란을 4℃에서 12 내지 24시간 보관한 후 계태아에서의 폐사와 출혈이나 충혈 등의 병변을 관찰하였다. 얻어진 결과를 표 3에 나타내었다.
바이러스 발육란수 접종 후 폐사 발육란수
1일 2일 3일
SNU50-5(E20) 5 3 2 0
rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA) 5 0 0 0
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, SNU50-5(E20)은 접종한 2일내 100% 계태아 폐사율을 보였으나, rPR8-SNU50-5-E20(HA-NA)는 모두 3일 동안 계태아 폐사가 전혀 일어나지 않아 OIE 권고 사항을 충족하는 백신주로 사용할 수 있을 것으로 평가되었다.
한국생명공학연구원 KCTC12046 20111103
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진, 인플루엔자 바이러스의 NA 아미노산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 H5N1 인플루엔자 바이러스인, 아미노산 분자.
  3. 제1항의 아미노산 분자를 코딩하는 유전자.
  4. 제1항의 아미노산 분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  5. 제1항의 아미노산 분자 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 계태아 증식성 증진용 조성물.
  6. 제1항의 아미노산 분자 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 계태아 고증식성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스 변이 균주.
  7. 제6항의 균주를 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
  8. 제6항의 균주에 대한 항혈청을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항혈청은 조류 또는 포유류 유래의 것인 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 진단 대상은 조류 또는 포유류인 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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J. Virol., Vol. 81, No. 23, pp. 12911-12917 (2007.12.31.) *
J. Virol., Vol. 85, No. 10, pp. 4667-4672 (2011.03.02.) *

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