KR101414225B1

KR101414225B1 - 발육계란 고증식성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터

Info

Publication number: KR101414225B1
Application number: KR1020120076915A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 김재홍; 김일환
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2014-07-07
Also published as: KR20140010581A

Abstract

인플루엔자 바이러스의 발육계란 고증식성과 관련이 있는 NS 단백질 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 발육계란 고증식용 조성물; NS 단백질 코딩 유전자가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 발현 벡터; 상기 발현 벡터로 형질전환된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 및 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물이 제공된다.　 본 발명의 발육계란 고증식성 관련 NS 단백질과 그의 아미노산 서열은 인플루엔자 예방을 위한 백신주의 계태아 생산성을 높여주어 인플루엔자 사독백신 개발에 유용하게 이용될 수 있다는 장점을 갖는다.

Description

발육계란 고증식성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터 {RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PREPARING HIGHLY PRODUCTIVE INFLUENZA VIRUS, AND USE THEREOF}

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 발육계란 고증식성과 관련이 있는 NS 단백질 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 발육계란 고증식성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물; NS 단백질 코딩 유전자가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 발현 벡터; 상기 발현 벡터로 형질전환된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 및 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.　

인플루엔자 바이러스는 오소믹스바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS)으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 중합효소 단위체 B2, B1 및 A (polymerase subunit B2, B1 & A; 각각 PA, PB1, PB2), 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M₁, M₂), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.

과거 인체 인플루엔자 A 백신은 계태아 증식성이 탁월한 재배열 주를 포르말린으로 불활성화 하여 HA와 NA만을 정제한 단위 백신으로, 항원 생산성 향상을 위해 최신 유행하는 인체 인플루엔자 바이러스와 발육란 증식성이 탁월한 것으로 알려진 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)을 혼합 감염시켜 증식성이 탁월하나, 최근 바이러스의 HA와 NA를 갖는 재배열 주를 선발하여 백신 생산에 사용하였으나(Kilbourne E.D., Future influenza vaccines and the use of genetic recombinants. Bull. World Health Organ 1969. 41:643), 최근 역유전학 기술을 사용하여 발육계란 증식성이 탁월하며 특성이 잘 알려진 PR8 바이러스나 A/WSN/33(H1N1) 바이러스나 저온 적응시켜 약독화 시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스 등의 8개 게놈을 바이러스 게놈 전사벡터에 클로닝하고, PA, PB1, PB2, NP 코딩 부분을 발현하는 벡터에 클로닝 하여 12개 플라스미드(특허 제0908757호)를 293T 등의 세포주에 트랜스펙션 하여 원하는 바이러스를 작출하거나 벡터의 한 방향으로 바이러스 게놈 전사가 일어나고, 다른 방향으로는 mRNA가 만들어지는 8개의 플라스미드를 트랜스펙션(특허 제0862758호; Vaccine 2002, 20:3165-3170)시켜 재조합 바이러스를 작출하고 있다.

통상 PR8 바이러스의 발육계란 증식성이 탁월하므로 HA와 NA 유전자는 최근 유행하는 바이러스로부터 PCR 법으로 증폭하여 역 유전학 벡터에 클로닝하고, PR8의 나머지 유전자 6개와 함께 트랜스펙션 하여 백신주를 작출하며 바이러스를 불활화 하여 사독백신을 제조하고 있다.

생독백신의 경우 PR8 바이러스의 backbone을 사용하지만 NS1 유전자를 결손 시킨 후 NS1 유전자가 없어도 바이러스 증식이 가능한 vero 세포에서 증식시키거나[Virology 1998, 252:324-330; PLoS one 2009,4(6):e5984], 저온에서 적응시켜 병원성을 감소시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스의 6개 유전자를 사용하거나(Virology 2003, 306:18-24; Journal of Virology 2010, 84:44-51), 저온 적응시킨 A/turkey/OH/313053/04(H3N2) 바이러스의 PB1 유전자에 HA 유전자 유래의 염기서열을 삽입하여 약독화 시킨 후 6개 유전자와 최근 유행하는 바이러스의 HA와 NA 유전자를 함께 트랜스펙션 하여 약독화 된 생독백신주를 생산하고 있다(Journal of Virology 2011, 85:456-459). 생독백신은 적은 바이러스를 접종해도 생체에서 증식하며 면역을 형성시킬 수 있지만 상기의 방식으로 제작된 백신주의 생산성이 PR8 대비 현저히 낮은 단점이 있다. 사독백신의 경우도 특정 바이러스의 HA와 NA를 사용하고 PR8 바이러스 내부 유전자를 치환하여 제작한 백신주의 발육계란 증식성이 모 바이러스인 PR8 대비 현저히 낮은 경우가 있어 PR8 바이러스의 내부유전자를 치환하거나 백신 바이러스의 HA 및 NA의 아미노산에 돌연변이를 주어 발육계란 증식성을 개선한 바이러스 제작 기술 개발이 이루어졌다(Vaccine 2010, 28:8008-8014; Vaccine 2011, 29:5153-5162; Vaccine 2011, 29:8032-8041).

인플루엔자 바이러스의 병원성과 발육계란 증식성은 다수의 유전자와 관련된 특성으로 HA, NA, PA, PB1, PB2, NP, NS에서 다양한 아미노산 돌연변이가 보고되어 있다. NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로부터 코딩되는 NS1은 숙주세포의 선천성면역을 억제하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 그 기능은 다양하다. 즉, NS1은 IFN-β 전사를 억제하고, double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR), 2'-5' oligoadenylate synthetase (OAS)/RNase L의 항바이러스 작용을 억제하며 숙주세포의 mRNA 프로세싱과 핵에서 세포질로의 이동을 억제하는 반면 바이러스 mRNA 번역을 증강시키고, 숙주세포의 아포토시스를 억제한다(Journal of General Virology 2008, 89:2359-2376). NS1은 1번 내지 73번 아미노산으로 이루어진 RNA-결합 도메인, 79번 내지 207번 아미노산으로 이루어진 효능 도메인(effector domain), 다양한 숙주세포의 PDZ 도메인과 결합하는 PDZ-ligand (PL) 모티프(227번 내지 230번 아미노산)로 구성된다(Science 2006 311:1576-1580). NS1과 NS2는 특정 아미노산이 결손되는 경우 바이러스 증식성과 병원성이 감소하는 것으로 알려져 있을 뿐 특정 NS1과 NS2가 다른 NS1과 NS2 대비 발육계란에서의 증식성을 향상시킨 다는 사실과 그와 관련된 아미노산 서열은 밝혀져 있지 않은 상황이다.

이에, 본 발명자들은 발육란에서의 증식성이 PR8 보다 탁월한 바이러스 제작을 위해, H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스) 기반 벡터시스템에서 PR8 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환하여 재조합 바이러스들을 제작하였고, 이와 같은 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환한 재조합 바이러스가 발육란에서의 증식성이 탁월하고, 계태아 병원성이 없어서 고생산성 백신으로써 유용함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드의 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스)의 발육계란 증식성 향상에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

또 다른 예는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스) 게놈을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 예는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스)를 제공한다.

또 다른 예는 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스(이하, 'PR8 바이러스'로 칭함; NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)는 인플루엔자 바이러스의 백신주 제작에 널리 사용되는 바이러스로서, 발육계란 증식성이 좋은 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 기존 PR8을 기초로 하는 벡터 시스템의 발육계란에서의 증식성을 더욱 개선시키면서도, PR8의 계태아 무병원성은 유지시키기 위한 연구를 거듭하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 PR8 바이러스 유래 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드들로부터 선발한 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환하여 발육계란 증식성이 탁월하고, 계태아 병원성이 없는 인플루엔자 백신 제작용 벡터시스템의 조성을 제공한다. 즉, 본 발명은 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 있어서 NS 단백질 코딩 유전자가 인플루엔자 바이러스의 발육계란 고생산성과 관련 있음을 제안하는 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 발육계란에서 고증식성인 인플루엔자 바이러스 제작용 역 유전학 벡터 시스템의 조성은, PR8 기반의 역 유전학 벡터시스템에 한정되는 것은 아니며 발육계란 증식성이 낮은 모든 인플루엔자 역 유전학 벡터시스템에 적용될 수 있다.　

우선, 본 발명의 일례는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드의 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스를 발육계란 고증식성이 되도록 하는 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 발육계란 고증식성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 발육계란 고증식성 PR8 바이러스의 제조용 조성물이 제공된다. 또 다른 예에서, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스의 NS 단백질 코딩 유전자와 치환하는 단계를 포함하는, 발육계란 고증식의 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 발육계란 고증식성 PR8 바이러스를 제조하는 방법이 제공된다.

상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/wild bird/Korea/SNU50-5/2009(H5N1)(이하, SNU50-5), A/duck/Korea/SNU31D/2009(H7N2)(이하, SNU31D), A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)(이하, KBNP-0028), A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(이하 01310), A/chicken /Korea/SNU8011/2008(H9N2)(이하, SNU8011), A/chicken/Korea/SNU9037/2009(H9N2) (이하, SNU9037), A/dog/Korea/SNU9046 /2009(H3N2)(이하, SNU9046)와 외국의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인, A/duck/Hong Kong/820/80(H5N3)(이하, HK820) 등일 수 있으며, 보다 구체적으로 서울대학교 조류질병학실에 보관중인 SNU9037일 수 있다. 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 저병원성이지만 병원성 바이러스이기 때문에 기탁기관에 기탁이 불가능하여 서울대학교 조류질병학실에서 accession number SNU9037로 보관중이다.

상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스, 예컨대, SNU9037의 NS1 단백질은 다음으로 이루어진 특징 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

48번 아미노산이 아스파라긴(A),

59번 아미노산이 히스티딘(H),

63번 아미노산이 아르기닌(R),

73번 아미노산이 프로린(P),

84번 아미노산이 이소루이신(I),

91번 아미노산이 알라닌(A),

171번 아미노산이 아스파라긴(N),

176번 아미노산이 이소루이신(I),

180번 아미노산이 알라닌(A),

202번 아미노산이 트레오닌(T)

216번 아미노산이 세린(S), 및

230번 아미노산이 이소루이신(I).

NS2 단백질은 다음으로 이루어진 특징 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

19번 아미노산이 루이신,

23번 아미노산이 프로린, 및

29번 아미노산이 세린.

H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스가 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로서 상기와 같은 특성을 갖는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질 및/또는 NS2 단백질을 코딩 하는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 경우 계태아 증식성이 증진되고 계태아 무병원성이 유지된다.　

예컨대, SNU9037의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 이 유전자로부터 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 NS1 단백질과 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 NS2 단백질이 생성된다:

SNU9037 NS 유전자 염기서열 (서열번호 1)

ATGGATTCCAATACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGACTGTTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGATTTGCAGACCAAGAACTGGGTGATGCCCCATTCCTAGACCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGAGGCAACACTCTTGGTCTGGACATCGAAACAGCTACCCATGCGGGAAAGCGGATAGTAGAGCGGATTCTGGAAGAAGAACCCGATGAGGCACTTAAAATGGCTGTTGCTTCAATACCTGCTTCACGCTATCTAGCTGATATGACTCTTGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTTATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCTGGGTCCCTTTGTATCAAAATGGACCAGGCAATAATGGATAAAAATATCACTTTAAAAGCAAACTTCAGTGTGATTTTTAATCGGCTAGAAACCCTAATACTACTCAGAGCTTTCACGGAAGAAGGAGCAATTGTGGGGGAAATCTCACCATTACCTTCTCTTCCAGGACATACTAATGAGGATGTCAAAATTGCAATTGGGGCCCTCATCGGAGGACTTGAGTGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCACTTGGAGAAGCAGTGATGAGAATGGGGGACCTTCACTCCCTTCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTGAGTCAGAAATTTGA

SNU9037 NS1 단백질 아미노산 서열(서열번호 2)

MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATHAGKRIVERILEEEPDEALKMAVASIPASRYLADMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIKMDQAIMDKNITLKANFSVIFNRLETLILLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTNEDVKIAIGALIGGLEWNDNTVRVSETLQRFTWRSSDENGGPSLPSKQKRKMARTIESEI

SNU9037 NS2 단백질 아미노산 서열(서열번호 3)

MDSNTVSSFQDILMRMSKLQLGPSSEDLSGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRMGDLHSLQNRNGKWREQLSQKFEEIRWLIEEVRHRLKITENSFEQITFMQALQLLLEVEQEIRTFSFQLI.

보다 구체적으로, 본 발명에서 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스의 NS 유전자와 치환되는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 NS1 단백질 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 NS2 단백질을 코딩 하는 것일 수 있다.

구체 예에서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 SNU9037의 NS 유전자로부터 유래하는 NS1 단백질(서열번호 2) 및/또는 NS2 단백질(서열번호 3) 의 코딩 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명은 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스의 게놈(NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)에서 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 것을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터는 발육계란 증식성이 우수하고, 계태아 병원성이 낮은 바이러스 제작을 위한 벡터 시스템으로 유용하다.　

보다 구체적으로, 상기 재조합 발현 벡터는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스(GenBank accession number: NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적혈구응집 단백질(HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴라미디다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 및 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 및 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로부터 코딩되는 NS1 단백질은 다음으로 이루어진 특징 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있고:

48번 아미노산이 아스파라긴(A),

59번 아미노산이 히스티딘(H),

63번 아미노산이 아르기닌(R),

73번 아미노산이 프로린(P),

84번 아미노산이 이소루이신(I),

91번 아미노산이 알라닌(A),

171번 아미노산이 아스파라긴(N),

176번 아미노산이 이소루이신(I),

180번 아미노산이 알라닌(A),

202번 아미노산이 트레오닌(T)

216번 아미노산이 세린(S), 및

230번 아미노산이 이소루이신(I);

19번 아미노산이 루이신,

23번 아미노산이 프로린, 및

29번 아미노산이 세린.

상기한 바와 같이, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 SNU9037로부터 유래하는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 구체적으로, 서열번호 2의 NS1 단백질 아미노산 서열 및/또는 서열번호 3의 NS2 단백질의 아미노산 서열을 갖는 NS 단백질의 코딩 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

예컨대, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 도 2의 개열지도를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 예는, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 게놈 중 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 변이 균주, 구체적으로 PR8 바이러스의 게놈 중 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

상기 재조합 바이러스는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 재조합 PR8 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 PR8 바이러스는 PR8 게놈에서 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNU9037의 NS1 단백질(서열번호 2)과 NS2 단백질(서열번호 3)의 코딩 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열번호 1의 NS 유전자로 치환된, 보다 구체적으로 서열번호 1의 NS 유전자(NS1 단백질(서열번호 2)과 NS2 단백질(서열번호 3)를 코딩)로 치환된 균주 (rPR8-SNU9037(NS))(KCTC 12077BP) 일 수 있다.

상기 재조합 바이러스는 발육계란 증식성이 우수하고, 계태아 병원성이 없어서 생산성이 우수하여 인플루엔자 바이러스 백신 제작에 매우 유용하다.

이에, 본 발명의 또 다른 예는 상기 발육계란 고생산성 및 조류와 포유류 무병원성의 재조합 바이러스 및/또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 특히, PR8 바이러스(NC_002016 내지 NC_002023) 게놈에서 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNU9037의 NS1 단백질(서열번호 2)과 NS2단백질(서열번호 3)의 코딩 폴리뉴클레오타이드(서열번호 1의 NS 유전자)로 치환된 균주(rPR8-SNU9037(NS)) (KCTC 12077BP)일 수 있다.

상기 백신은 증식성이 우수할 뿐 아니라 계태아에 대하여 병원성이 없어 생산성이 우수하여, 생독백신 또는 사독백신, 보다 바람직하게는 사독백신으로 사용 가능하다.

상기 백신은 닭과 오리 등의 조류뿐 아니라, 인간, 돼지, 개, 마우스 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다.　

또한, 본 발명은 상기 발육계란 고생산성 및 계태아 무병원성의 재조합 바이러스에 대한 항혈청을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 및 진단용 키트를 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 rPR8-SNU9037(NS) (KCTC 12077BP)일 수 있다. 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것일 수 있으며, 진단 대상 환자는 조류 또는 포유류일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

국내외 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 SNU50-5, HK820, SNU31D KBNP-0028(KCTC 10866BP, 특허등록 제0708593호), 01310(특허등록 제0708593호), SNU8011, SNU9037, SNU9046을 10 내지 11일령 specific pathogen free(SPF) 계태아의 요막강에 접종하여 배양한 후 요막액을 수확하여 RNA를 추출한 후 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 RT-PCR로 증폭한 후 아가로스겔에 전기영동 하여 증폭산물을 잘라내어 정제하였고, 염기서열을 결정하여 외국의 주요 인플루엔자 바이러스들과 NS1 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과 SNU9037은 01310과 SNU8011과 92.1%의 비교적 높은 상동성을 보였으나 비교한 나머지 바이러스들과는 67.3% 내지 90.8%의 상동성을 보였고(표 1 참조), SNU9037의 NS2는 SNU31D와 97.5%, HK820과 96.6%의 높은 상동성을 보였으나 나머지 바이러스들과는 80.1% 내지 95.0%의 상동성을 보였다(표 2 참조).

본 발명의 국내외 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 NS 단백질 코딩 뉴클레오타이드의 발육계란 생산성과 계태아 병원성과의 관련성을 알아보기 위해 PR8 바이러스 기반의 역유전학 벡터시스템의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 대신 SNU50-5, HK820, KBNP-0028, 01310, SNU8011, SNU9037, 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 치환하여 재조합 바이러스인 rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-HK820(NS), rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS), rPR8-SNU8011(NS), rPR8-SNU9037(NS)를 역유전학 기술로 제작하였다. 제작한 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID₅₀/ml)를 측정한 결과 rPR8의 경우 10^8.8, rPR8-SNU50-5(NS)의 경우 10^8.5, rPR8-HK820(NS)의 경우 10^8.3, rPR8-KBNP-0028(NS)의 경우 10^8.7, rPR8-01310(NS)의 경우 10^8.2, rPR8-SNU8011(NS)의 경우 10^8.1, 을 보여서, 이종 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스들은 rPR8 대비 유사하거나 조금 높거나 낮은 역가를 보이는 것으로 나타났다. 그러나, rPR8-SNU9037(NS)의 경우 10^9.6EID₅₀/ml을 보여, rPR8 대비 월등히 높은 계태아 증식성을 보였다(표 3).

본 발명의 SNU9037의 NS를 갖는 rPR8-SNU9037(NS)가 PR8과 다른 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 NS 코딩 폴리뉴클레이타이드를 갖는 재조합 바이러스인 rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-HK820(NS), rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS), rPR8-SNU8011(NS) 대비 높은 발육계란 증식성을 보인 원인을 알아보기 위해 각 바이러스들의 NS1 단백질과 NS2 단백질의 아미노산을 비교한 결과 SNU9037 바이러스의 NS1 단백질은 이외 바이러스들과 달리 48번 아미노산으로 세린 대신 아스파라긴, 59번 아미노산으로 아르기닌이나 메티오닌 대신 히스티딘, 63번 아미노산으로 글루타민이나 리신 대신 아르기닌, 73번 아미노산으로 세린 대신 프로린, 84번 아미노산으로 발린 대신 이소루이신, 91번 아미노산으로 세린이나 트레오신 대신 알라닌, 171번 아미노산으로 알라닌이나 트레오닌이나 아스파탐산 대신 아스파라긴, 176번 아미노산으로 아스파라긴 대신 이소루이신, 180번 아미노산으로 발린이나 이소루이신 대신 알라닌, 202번 아미노산으로 알라닌 대신 트레오닌, 216번 아미노산으로 프로린 대신 세린, 230번 아미노산으로 발린 대신 이소루이신을 가지고 있어 차이를 보였고, NS2는 19번 아미노산으로 메티오닌 대신 루이신, 23번 아미노산으로 세린 대신 프로린, 29번 아미노산으로 아스파라긴 대신 세린을 가지고 있어 차이를 보였다(표 4 참조).

본 발명의 재조합 바이러스들의 계태아에 대한 병원성을 알아보기 위해 10-11일령의 SPF 발육란에 요막강 경로로 10^-1 내지 10^-8 희석한 rPR8, rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS),　rPR8-SNU8011(NS), rPR8-SNU9037(NS) 바이러스를 각 희석배수에 대해 3개의 발육란을 접종하고, 3일간 폐사유무와 병변유무를 확인한 결과 rPR8, rPR8-KBNP-0028(NS) 및 rPR8-SNU9037(NS)에서는 출혈이나 충혈과 같은 병변과 폐사는 관찰되지 않아 계태아에 대한 병원성이 없었으나 rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-01310(NS),　rPR8-SNU8011(NS), 에서는 병변과 함께 폐사가 관찰되어 계태아에 대한 병원성이 있었다(도 1).

본 발명은 기존의 PR8 바이러스를 이용한 백신 제조에 있어서 발육계란 증식성을 개선하고자, 발육계란 증식성이 우수하면서도 계태아 병원성이 없는 재조합 PR8 바이러스를 제공하며, 본 발명에서 제공되는 재조합 PR8 바이러스는 발육계란 고생산성, 계태아 무병원성이어서 사독백신 개발에 유용하다.

도 1은 PR8 벡터 시스템에서 rPR8, rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS), rPR8-SNU8011(NS), 및 rPR8-SNU9037(NS) 바이러스의 계태아에 대한 병원성을 비교한 결과이다.
도 2는 PR8 바이러스의 형질전환을 위한 발현 벡터의 개열지도를 예시한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 재조합 PR8 바이러스 작출

1-1: PR8 바이러스의 준비

본 발명에서 재조합 바이러스의 모바이러스로 사용된 PR8 바이러스는 다음과 같은 방법으로 준비하였다.

구체적으로, PR8(A/Puerto Rico/8/34(H1N1)) 바이러스 전체 cDNA에 대응하는pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M, 및 pHW198-NS 역유전학용 플라스미드(Vaccine 2002, 20:3165-3170)를 St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공받았다. 상기 8개 플라스미드를 갖는 바이러스 제작을 위하여, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X10⁶개/2ml의 양으로 부유하여 각 웰에 첨가한 후, 3-4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후, Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.

상기 준비된 8개 플라스미드를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각의 양이 300ng씩이 되도록 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 PLUS reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다. 기다리는 동안 lipofectamine 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다.

얻어진 반응 생성물을 상기 293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO₂, 37℃에서 20시간 배양한 후, 웰당 트립신10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발생란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발생란을37℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집이 되는 경우 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스로부터 RNA를 추출하여 염기서열을 결정하여 PR8 바이러스(NC_002016 내지 NC_002023 포함)가 제대로 제작되었는지 확인한 후 -70℃에서 보관하였다. 이와 같이 제작된 균주를 아래 실험의 PR8 바이러스 균주로 사용하였다. rPR8은 재조합 바이러스를 의미하는 것으로, 야생형 PR8과 동일한 유전자 조성을 가지며, 'PR8'과 혼용 가능하다.

1-2: 바이러스 증식

각 시료(PR8(실시예 1-1), SNU50-5, A/duck/Hong HK820(일본 훗가이도대학교 수의과대학 Kida 교수님)), KBNP-0028(A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2), KCTC 10866BP, 특허등록 제0708593호), 01310(A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2), 특허등록 제0790801호), SNU31D, SNU8011, SNU9037, SNU9046 (이상, 서울대학교 조류질병학실)를 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY) 3개의 요막강 (allantoic cavity)에 각각 접종(총 27개 종란 사용)하고, 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 요막액 (allantoic fluid)을 수확하여 하기의 평판혈구응집검사를 수행하였다.　 상기 요막액 20㎕와 상기 각각의 시료를 접종한SPF 발육란 (Sunrise Co., NY)을 부화시킨 닭에서 추출한 0.1%(w/v) 닭 적혈구 20㎕를 유리 평판에 점적 후 혼합하여 평판혈구응집검사를 실시하여 양성인 시료는 -70℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

1-3: 역전사효소 - 중합효소연쇄반응 , 유전자 클로닝 , 염기서열 결정 및 분석

RNA분리를 위하여, rPR8, SNU50-5, HK820, SNU31D, 01310, KBNP-0028, SNU8011, SNU9037, SNU9046 바이러스의 발육란 배양 요막액 150㎕로부터 Viral Gene spin 키트 (iNtRON Co. Ltd., 성남, 대한민국)를 사용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 RNA를 분리한 후 QIAGEN 사의 one-step RT-PCR 키트와 인플루엔자 바이러스 NS 단백질 코딩 뉴클레오타이드 증폭용 프라이머 (Bm-NS-1; Bm-NS-890R 프라이머; Hoffmann 등, Archives Virol, 2001)를 사용하여 각 바이러스의 NS 단백질 코딩 뉴클레오타이드를 증폭하였다.

즉, 5X one step RT buffer 20㎕, dNTP(2.5mM) 4㎕, 각 유전자 증폭용 전 방향 및 역방향 프라이머(10pmol/㎕) 각각 1㎕, one-step enzyme mix 4㎕, RNA 4㎕, RNase 제거 3차멸균증류수 66㎕를 혼합하여 PCR 기기(C-1000, Bio Rad Laboratories Inc., USA)에서 50℃에서 30분간 반응한 후 95℃에서 15분 가열하였고, 94℃-20초-58℃-30초-72℃-7분간 반응을 30회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응시켰다.

얻어진 증폭 산물을 아가로스겔에서 전기영동하고, Gel extraction kit(QIAGEN Co. USA)를 사용하여 정제한 후, ABI3777 자동염기서열 분석기(마크로젠, 서울, 대한민국)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. Bioedit 프로그램을 사용하여 염기서열을 NS1와 NS2 아미노산 서열로 번역한 후 GenBank 상에 등록되어 있는 A/WSN/33(H1N1)(M12597; 이하 WSN33), A/California/04/09(H1N1)(FJ969514; 이하 Cal04), A/chicken/Korea/IS/06(H5N1)(EU233679; 이하 IS06), A/Hong Kong/213/03(H5N1)(AY576369; 이하 HK213), A/Hong Kong/485/97(H5N1)(AF084287; 이하 HK485), A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)(AF144307; 이하 GD1), A/Vietnam/1203/04(H5N1)(AY651553; 이하 VN1203), A/Hong Kong/1073/99(H9N2)(AJ278649; 이하 HK1073)과 다중배열 하여, 아미노산 상동성을 각각 표1과 표 2에 정리하였다. 표 1 및 표 2에 기재된 rPR8은 상기 실시예 1-1에서 제작된 재조합 바이러스를 의미하는 것으로, 야생형 PR8과 동일한 유전자 조성을 가지며, 'PR8'과 혼용 가능하다.

SNU9037은 01310과 SNU8011과 92.1%의 비교적 높은 상동성을 보였으나 비교한 나머지 바이러스들과는 67.3% 내지 90.8%의 상동성을 보였다(표 1 참조).

또한, SNU9037의 NS2는 SNU31D와 97.5%, HK820과 96.6%의 높은 상동성을 보였으나 나머지 바이러스들과는 80.1% 내지 95.0%의 상동성을 보였다(표 2 참조).

1-3. 재조합 바이러스 제작

재조합 인플루엔자 바이러스 작출을 위해 호프만 박사의 역유전학 벡터시스템(특허 제0862758호)을 사용하였다.

구체적으로, 실시예 1-2에서 증폭한 SNU50-5, HK820, KBNP-0028, 01310, SNU8011 및 SNU9037의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 TOPO-TA cloning 벡터(Invitrogen Co. USA)에 클로닝하여 M13F/M13R 프라이머(M13F, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(서열번호 4); M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(서열번호 5)로 염기서열을 결정하고, BsmBI(NEB Inc, USA) 20U/2㎕, NEBuffer(NEB Inc., USA) 2㎕, pHW2000 플라스미드(한국특허등록 제0862758호, 국립수의과학검역원으로부터 St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사, 호프만 박사의 동의를 얻어 입수) 10㎍/3㎕, 멸균 3차증류수 13㎕를 혼합하여 50℃에서 1.5시간 배양한 후 아가로스겔에 전기영동하여 해당 DNA를 Gel extraction kit(QIAGEN Co.)로 정제하였다.

또한 상기 pHW2000 플라스미드에 대하여 상기와 동일한 방법으로 BsmBI을 처리하여 아가로스겔에 전기영동하여 정제한 pHW2000 벡터 6㎕와 NS 2㎕에 T4 DNA 라이게이즈 (1,000,000 U/㎕; NEB Inc, USA) 1㎕, 10X 반응 버퍼(NEB Inc, USA) 1㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 정치한 후, 대장균(Escherichia coli, OneShot

top10 competent cell, Invitrogen Co. USA)에 transformation 한 후 염기서열을 분석하여 유전자의 염기서열의 돌연변이가 없는 정확한 클론을 선발하여 플라스미드를 추출하였다.

상기 실시예 1-1에서 St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공 받은 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, 및 pHW197-M 역유전학용 플라스미드(Vaccine 2002, 20:3165-3170; pHW2000 (등록특허 제10-0862758호 참조) 에 PR8 바이러스의 NS 제외 7개 유전자를 삽입한 플라스미드)와 각 바이러스의 상기 NS 플라스미드를 갖는 재조합 바이러스를 제작하기 위해, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X10⁶개/2ml의 양으로 부유하여 각 웰에 첨가한 후, 3-4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후, Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.

상기 준비된 8개 플라스미드(PR8 바이러스의 NS 유전자를 제외한 7개 유전자 대응 7개 플라스미드 + 동종(PR8) 또는 이종 바이러스(SNU50-5, HK820, KBNP-0028, 01310, SNU8011, SNU9037)의 NS 유전자 대응 1개 플라스미드)를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각의 양이 300ng씩이 되도록 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 PLUS reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다.

기다리는 동안 lipofectamine 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다.

얻어진 반응 생성물을 상기 293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO₂, 37℃에서 20시간 배양한 후, 웰당 트립신10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발생란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발생란을37℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집이 되는 경우 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스로부터 RNA를 추출하여 해당 PB2, PB1, PA 유전자의 염기서열을 결정하여 바이러스가 제대로 제작되었는지 확인한 후 -70℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

본 실시예 결과, rPR8-SNU50-5(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNU50-5의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-HK820(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 HK820의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-KBNP-0028(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 KBNP-0028의 NS 유전자(서열번호 1)로 치환), rPR8-01310(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 01310의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-SNU8011(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNU8011의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-SNU9037(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNU9037의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환)를 제작하였으며, 이중에서 rPR8-SNU9037(NS: 서열번호 1)를 대전에 소재하는 생명자원센터에 2011년 11월18일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC 12077BP를 부여받았다.

1-4. 바이러스 역가 측정

상기에서 제작한 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID₅₀/ml)를 측정하기 위하여, 각각의 재조합 바이러스들을 인산완충용액으로 10^-1 내지 10^-9까지 10진 희석하여 각 희석 배수 별로 10-11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강 경로로 100㎕씩 접종하였다. 그 후 3일간 배양한 후, 요막액을 수확하여 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하여 Reed-Muench 계산식에 따라 바이러스 역가(EID₅₀/ml)를 측정하였다.

그 결과 얻어진 바이러스 계태아 감염역가(EID₅₀/ml(log10))를 아래의 표 1에 나타내었다. 바이러스 역가(EID₅₀/ml(log10))를 살펴보면, rPR8의 경우 10^8.8, rPR8-SNU50-5(NS)의 경우 10^8.5, rPR8-HK820(NS)의 경우 10^8.3, rPR8-KBNP-0028(NS)의 경우 10^8.7, rPR8-01310(NS)의 경우 10^8.2, rPR8-SNU8011(NS)의 경우 10^8.1, 을 보여서, 이종 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스들은 rPR8 대비 유사하거나 조금 높거나 낮은 역가를 보이는 것으로 나타났다. 그러나, rPR8-SNU9037(NS)의 경우 10^9.6EID₅₀/ml을 보여, rPR8 대비 월등히 높은 계태아 증식성을 보였다(표 3).

재조합 바이러스의 계태아 증식성 비교

Recombinant viruses	EID₅₀/ml(log10)
rPR8	8.8±0.3
rPR8-SNU50-5(NS)	8.5
rPR8-HK820(NS)	8.3
rPR8-KBNP-0028(NS)	8.7±0.0
rPR8-01310(NS)	8.2±0.1
rPR8-SNU8011(NS)	8.1±0.6
rPR8-SNU9037(NS)	9.6

본 발명의 SNU9037의 NS를 갖는 rPR8-SNU9037(NS)가 PR8과 다른 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 NS 코딩 폴리뉴클레이타이드를 갖는 재조합 바이러스인 rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-HK820(NS), rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS), rPR8-SNU8011(NS) 대비 높은 발육계란 증식성을 보인 원인을 알아보기 위해 각 바이러스들의 NS1 단백질과 NS2 단백질의 아미노산을 비교한 결과 SNU9037 바이러스의 NS1 단백질은 이외 바이러스들과 달리 48번 아미노산으로 세린 대신 아스파라긴, 59번 아미노산으로 아르기닌이나 메티오닌 대신 히스티딘, 63번 아미노산으로 글루타민이나 리신 대신 아르기닌, 73번 아미노산으로 세린 대신 프로린, 84번 아미노산으로 발린 대신 이소루이신, 91번 아미노산으로 세린이나 트레오신 대신 알라닌, 171번 아미노산으로 알라닌이나 트레오닌이나 아스파탐산 대신 아스파라긴, 176번 아미노산으로 아스파라긴 대신 이소루이신, 180번 아미노산으로 발린이나 이소루이신 대신 알라닌, 202번 아미노산으로 알라닌 대신 트레오닌, 216번 아미노산으로 프로린 대신 세린, 230번 아미노산으로 발린 대신 이소루이신을 가지고 있어 차이를 보였고, NS2는 19번 아미노산으로 메티오닌 대신 루이신, 23번 아미노산으로 세린 대신 프로린, 29번 아미노산으로 아스파라긴 대신 세린을 가지고 있어 차이를 보였다(표 4).

SNU9037 NS1과 NS2 특이 아미노산 서열

	SNU9037	Location of Amino acid	Other influenza viruses
NS1	N	48	S
	H	59	R/M
	R	63	Q/K
	P	73	S
	I	84	V
	A	91	S/T
	N	171	A/T/D
	I	176	N
	A	180	V/I
	T	202	A
	S	216	P
	I	230	V
NS2	L	19	M
	P	23	S
	S	29	N

실시예 2: 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 재조합 PR8 바이러스 계태아 병원성

2-1. 계태아 병원성 측정

상기 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 각각 10진 희석하여 10^- ¹내지 10^- ⁸희석하여 200㎕의 양으로 10 내지 11일령 SPF 종란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하여 3일간 37℃에 배양하며 폐사한 종란과 3일까지 생존한 종란을 4℃에서 12 내지 24시간 보관한 후 계태아에서의 폐사와 출혈이나 충혈 등의 병변을 관찰하여 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보여지는 바와 같이, rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-01310(NS), 및 rPR8-SNU8011(NS)에서는 계태아의 폐사와 병변이 관찰되어 계태아에 대한 병원성을 갖는다는 것을 알 수 있는 반면, rPR8-SNU9037(NS)는 rPR8과 rPR8-KBNP-0028(NS)와 함께 계태아의 병변을 관찰할 수 없어 병원성이 없었다 (도 1).

계태아를 이용한 백신 생산시 중간에 죽는 계태아는 백신 생산에 사용할 수 없으므로 계태아에 대한 무병원성은 백신 고생산성과 함께 백신주의 조류에 대한 낮은 병원성을 의미하므로 SNU9037 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 계태아 생산성과 안전성이 높은 다양한 백신주 제작에 유용하게 사용될 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC12077BP

20111118

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PREPARING HIGHLY PRODUCTIVE INFLUENZA VIRUS, AND USE THEREOF <130> DPP20116476KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS gene of SNU9037 <400> 1 atggattcca atactgtgtc aagctttcag gtagactgtt ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccattcctag accggcttcg ccgagatcag 120 aaatccctaa gaggaagagg caacactctt ggtctggaca tcgaaacagc tacccatgcg 180 ggaaagcgga tagtagagcg gattctggaa gaagaacccg atgaggcact taaaatggct 240 gttgcttcaa tacctgcttc acgctatcta gctgatatga ctcttgaaga aatgtcaagg 300 gactggttta tgctcatgcc caagcagaaa gtggctgggt ccctttgtat caaaatggac 360 caggcaataa tggataaaaa tatcacttta aaagcaaact tcagtgtgat ttttaatcgg 420 ctagaaaccc taatactact cagagctttc acggaagaag gagcaattgt gggggaaatc 480 tcaccattac cttctcttcc aggacatact aatgaggatg tcaaaattgc aattggggcc 540 ctcatcggag gacttgagtg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600 ttcacttgga gaagcagtga tgagaatggg ggaccttcac tcccttcaaa acagaaacgg 660 aaaatggcga gaacaattga gtcagaaatt tga 693 <210> 2 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NS1 protein of SNU9037 <400> 2 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Asn 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr His Ala Gly Lys Arg Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Pro Asp Glu Ala Leu Lys Met Ala 65 70 75 80 Val Ala Ser Ile Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Ala Asp Met Thr Leu Glu 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala 100 105 110 Gly Ser Leu Cys Ile Lys Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile 115 120 125 Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Thr Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile 145 150 155 160 Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Asn Glu Asp Val Lys Ile 165 170 175 Ala Ile Gly Ala Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val 180 185 190 Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Thr Trp Arg Ser Ser Asp Glu 195 200 205 Asn Gly Gly Pro Ser Leu Pro Ser Lys Gln Lys Arg Lys Met Ala Arg 210 215 220 Thr Ile Glu Ser Glu Ile 225 230 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NS2 protein of SNU9037 <400> 3 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Met Arg Met 1 5 10 15 Ser Lys Leu Gln Leu Gly Pro Ser Ser Glu Asp Leu Ser Gly Met Ile 20 25 30 Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Gly Lys 50 55 60 Trp Arg Glu Gln Leu Ser Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile 65 70 75 80 Glu Glu Val Arg His Arg Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln 85 90 95 Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu Gln Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu 100 105 110 Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile 115 120 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F primer <400> 4 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R primer <400> 5 caggaaacag ctatgac 17

Claims

저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하고,
상기 NS1 단백질은 다음으로 이루어진 특징을 포함하는, 발육계란 고증식성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물:
서열번호 2의 48번 위치의 아미노산이 아스파라긴(A),
서열번호 2의 59번 위치의 아미노산이 히스티딘(H),
서열번호 2의 63번 위치의 아미노산이 아르기닌(R),
서열번호 2의 73번 위치의 아미노산이 프로린(P),
서열번호 2의 84번 위치의 아미노산이 이소루이신(I),
서열번호 2의 91번 위치의 아미노산이 알라닌(A),
서열번호 2의 171번 위치의 아미노산이 아스파라긴(N),
서열번호 2의 176번 위치의 아미노산이 이소루이신(I),
서열번호 2의 180번 위치의 아미노산이 알라닌(A),
서열번호 2의 202번 위치의 아미노산이 트레오닌(T)
서열번호 2의 216번 위치의 아미노산이 세린(S), 및
서열번호 2의 230번 위치의 아미노산이 이소루이신(I).
제1항에 있어서, 상기 저병원성 조류인플루엔자는 SNU9037인, 발육계란 고증식성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 저병원성 조류인플루엔자의 NS1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 NS1 단백질인, 발육계란 고증식성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스인, 발육계란 고증식성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적혈구응집 단백질(HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴라미디다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 및 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드와, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 NS1 단백질은 다음으로 이루어진 특징을 포함하는, 재조합 발현 벡터:
서열번호 2의 48번 위치의 아미노산이 아스파라긴(A),
서열번호 2의 59번 위치의 아미노산이 히스티딘(H),
서열번호 2의 63번 위치의 아미노산이 아르기닌(R),
서열번호 2의 73번 위치의 아미노산이 프로린(P),
서열번호 2의 84번 위치의 아미노산이 이소루이신(I),
서열번호 2의 91번 위치의 아미노산이 알라닌(A),
서열번호 2의 171번 위치의 아미노산이 아스파라긴(N),
서열번호 2의 176번 위치의 아미노산이 이소루이신(I),
서열번호 2의 180번 위치의 아미노산이 알라닌(A),
서열번호 2의 202번 위치의 아미노산이 트레오닌(T)
서열번호 2의 216번 위치의 아미노산이 세린(S), 및
서열번호 2의 230번 위치의 아미노산이 이소루이신(I).
제5항에 있어서, 상기 저병원성 조류인플루엔자는 SNU9037인, 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서, 상기 저병원성 조류인플루엔자의 NS1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 NS1 단백질인, 재조합 발현 벡터.
제5항에 있어서, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스인, 재조합 발현 벡터.
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스가 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 재조합 인플루엔자 바이러스.
제9항에 있어서, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스인, 재조합 인플루엔자 바이러스.
제10항에 있어서, NS1 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드인, 재조합 인플루엔자 바이러스.
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스가 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신.
제12항에 있어서, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스인, 조류 인플루엔자 바이러스 백신.
제13항에 있어서, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 NS1 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 1이 염기서열을 갖는 것인, 조류 인플루엔자 바이러스 백신.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 NS1 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드인 것인, 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것인, 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
기탁번호 KCTC12077BP의 재조합 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스.
제1항에 있어서, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS2 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 NS2 단백질은 서열번호 3의 19번 위치의 아미노산이 루이신이거나, 서열번호 3의 23번 위치의 아미노산이 프로린이거나, 서열번호 3의 29번 위치의 아미노산이 세린인,
발육계란 고증식성 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
제5항에 있어서, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS2 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 NS2 단백질은 서열번호 3의 19번 위치의 아미노산이 루이신이거나, 서열번호 3의 23번 위치의 아미노산이 프로린이거나, 서열번호 3의 위치의 29번 아미노산이 세린인, 재조합 발현 벡터.