KR20080052509A - 유행성 독감 바이러스에 대한 백신 - Google Patents

유행성 독감 바이러스에 대한 백신 Download PDF

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KR20080052509A
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설야프라카쉬 삼바라
자퀼린 카즈
메리 호엘쉐르
수레쉬 케이. 미탈
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더 거버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈, 센터스 포 디지즈 컨트롤 앤드 프리벤션
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Abstract

본 발명은 조류 또는 유행성 독감에 대한 면역 반응을 유도하는 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물은 조류 독감 항원을 포함하는 아데네바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 및 상기 재조합 벡터와 아데노바이러스를 포함하는 면역성 조성물로 이루어진다. 또한, 상기 아데노바이러스 벡터 또는 재조합 아데노바이러스를 투여하여 조류 또는 유행성 독감에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.

Description

유행성 독감 바이러스에 대한 백신{VACCINE AGAINST PANDEMIC STRAINS OF INFLUENZA VIRUSES}
본 발명은 미국 가출원 번호 60/670,826(4. 11. 2005)에 대한 우선권을 주장하고 있으며, 상기 가출원의 명세서는 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 발명은 미국국립보건원으로부터 부여받은 것에 이어서 미국정부의 지지로 완성되었다. 미국정부는 본 발명의 특정 권한을 가진다.
본 발명은 백신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 조류 독감 바이러스에 대한 백신을 제조하기 위한 재조합 벡터에 관한 것이다.
고도의 악성 조류 독감의 유행성 발발은 전세계 인간과 동물에게 심각한 위협을 준다. 인간과 조류 독감 바이러스 사이 유전적 재조합은 인간이 면역성을 결핍하고 있는 조류 기원의 신규한 헤마토글루티닌(HA)을 포함하는 바이러스를 낳게 된다. 20세기의 1918, 1957 및 1968년의 유행성 발발들은 상기 항원 변종에 대한 결과들이었다. 최근 조류 독감의 발발은 H5N1, H7N7 및 H9N2 서브타입 독감 바이 러스들에 의해 발생되고, 이들의 인간 감염은 가축인 가금류에서 순환하는 독감 바이러스의 유행성 가능성의 새로운 인식을 낳게 되었다. 유행성 발발에 의한 경제적 영향은 200,000명 정도의 사망, 730,000명 정도의 환자, 42명 정도의 외래환자 및 5000만 명 정도의 추가적인 환자 등으로, 미국에서만 1650억 달러에 이르는 것으로 추정된다.
전세계의 생물학적 테러의 지배적인 위협의 맥락에서, 고도의 악성 독감을 이용하여 고의로 감염된 자들이 탐색되기 어려운 대량 살상의 생물학적 무기로서 활동할 수 있다.
지금까지, 잠재적인 유행성 조류 독감에 대한 안전하고 효율적인 백신을 개발하기 위한 3번의 주요한 접근이 시도되었지만 모두 성공하지는 못했다(Wood et al., Vaccine 20:S84-S87, 2002; Stephenson et al ., The Lancet 4:499-509, 2004 및 이들에서 인용된 참고문헌).
가금류에서 상기 독감의 치사율 때문에, 암탉의 알에서 성장하는 바이러스와 관련되는 현재의 백신 생산 전략은 불가능하다. 일부 접근들은 잠재적 유행성 독감과 관련된 면역성 항원을 발현시키는 비병원성 또는 독성이 약화된 변종을 분리하는데 초점을 맞추고 있다. 예를 들면, 자연발생적 H5 서브타입 항원 바이러스를 포함하는 독감의 비병원성 변종은 백신 후보물질로서 평가되고 있다. 일반적으로 상기 바이러스들은 보편적인 기술을 이용하여 성장하기 어려우며, 보호는 바이러스의 악성 변종을 포함하는 교차-반응에 대한 비병원성 백신 변종에 대한 증가되는 항체의 능력에 의존한다(Takada et al ., J. Virol . 73: 8303-8307, 1999; Wood et al ., Vaccine 18:579-80, 2000). 역유전자학 접근은 백신 후보물질을 개발하기 위해 병원성 H5N1 바이러스(A/HK/97)의 HA 항원의 정단부위(cleavage site)에서 일련의 염기성 아미노산을 제거하는 것이 적용되었다(Li et al ., J. Infect . Dis . 179:1132-1138, 1999).
또 다른 접근은 배큘로바이러스(baculovirus) 발현 시스템에서 생산된 재조합 HA("H5")를 이용하는 것이다. 그러나, 이는 충분한 면역반응을 달성하기 위해 정제된 단백질의 높은 용량과 아쥬반트의 사용이 요구되어진다(Treanor et al . Vaccine 19:1732-1737, 2001).
인간 및 비인간 모두에서 조류 독감에 의한 감염으로부터 보호하고, 효율적으로 생산될 수 있으며, 암탉의 알에서 성장하는 바이러스에 의존하지 않는 백신을 개발하는 것이 요구되어 진다. 이에, 본 발명은 유행성 조류 독감 변종에 의한 감염을 예방하는데 사용되는 신규한 조성물 및 방법을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 잠재적인 독감의 유행성 변종에 대한 보호적인 면역반응을 유도하는 방법, 및 상기 방법에서 사용되는 핵산 벡터 및 비병원성 바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 재조합 핵산을 제공한다. 본 문서에서 개시된 재조합 핵산은 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 상기 아데노바이러스 벡터는 인간 및 비인간 아데노바이러스 벡터를 포함하며, 조류 독감 변종의 항원에 해당하는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 조류 독감 항원을 발현하는 복제 결실 인간 또는 비인간 아데노바이러스와 같은, 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명의 백신 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 본 문서에서 개시된 아데노바이러스 벡터 및/또는 재조합 아데노바이러스를 포함한다.
또한, 본 발명은 조류 및/또는 병원성 변종의 독감에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 제공한다. 본 문서에서 개시된 상기 방법에서 조류 독감 변종의 적어도 하나의 항원에서 암호화하는 아데노바이러스 벡터 및/또는 상기 항원을 발현하는 재조합 아데노바이러스에 기반한 면역성 조성물이 조류 또는 유행성 변종의 독감에 노출되기 전 또는 후의 개체에 투여된다.
본 발명의 상기 및 다른 물질, 특징 및 이점은 발명의 상세한 설명 및 도면에서 더 자세하게 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
서열목록의 간략한 설명
서열번호: 1(5'-tccatgagct tcctgatcct-3')는 면역증강 올리고뉴클레오티드이다.
서열번호: 2(5'-tccatgacgt tcctgacgtt-3')는 면역증강 올리고뉴클레오티드이다.
서열번호: 3(5'-tgactgtgaa cgttcgagat ga-3')는 면역증강 올리고뉴클레오티드이다.
서열번호: 4는 HAd5 E1의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 5 및 6(소 아데노바이러스 E1의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머들이다.
서열번호: 7은 BAd3 E1의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 8 내지 13은 BAd3 E1 전사의 탐색을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머들이다.
서열번호: 14 및 15는 돼지 아데노바이러스 E1의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머들이다.
서열번호: 16은 PAd3 E1의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 17 내지 22는 Pad3 E1 전사의 탐색을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머들이다.
독감 바이러스들은 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 막으로 싸여진 네가티브-센스(negative-sense) 바이러스들이다. 독감 바이러스들은 이들의 핵심 단백질들을 근거로 A, B 및 C인 3개의 별개의 종류로 분류될 수 있다. 상기 분류 내에서, 서브타입들은 2개의 항원성 표면 단백질인 헤마토글루티닌(hemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 특성을 근거로 분류될 수 있다. 상기 B 및 C 유형 독감 바이러스들은 크게 인간에게 제한되는 반면에, A 바이러스는 인간, 비인간 및 조류를 포함하는 다양한 종류에 대한 병원체이다. 주기적으로, 비인간 변종, 특히 조류 독감은 인간을 감염시키고, 일부의 경우 높은 사망률을 가지는 심각한 질병을 발생시킨다. 조류 변종 및 인간 변종이 함께 감염된 개체에서 상기 변종들의 재조합은, 인간에게 면역성이 결핍되어 있어 유행성 독감을 일으키는 재조합 독감 바이러스를 발생시킨다. 20세기 동안, 1918, 1957 및 1968년 때 세번의 유행성 독감이 발생하였으며, 전세계 수많은 사망자를 발생시켰다.
고도의 유행성 조류 독감 H5N1 바이러스들은 동남아시아에서 가축인 가금류에서 풍토병이 되었다. 2004년 초반 이후로, H5N1 바이러스들로 감염된 인간은 종종 증가하고 높은 사망률을 보인다고 보고되고 있다. 고도의 유행성 H5N1 독감 바이러스들은 1997년 인간에게 호흡기 질환의 원인으로 인식되었고, 6명의 사망자를 포함하는 18건의 문서화된 사례가 발생했을 때, 홍콩의 가축 농장 및 시장에서 독감이 발생했었다. 2개의 추가적인 인간 H5N1 감염들은 2003년에 홍콩의 가정에서 확인되었다. 그 이후로, H5N1 바이러스들은 9개의 아시아 국가들에 퍼졌고, 최근에는 동유럽의 몇몇 나라로 확대되었다. 120개 이상의 실험실에서 확인된 50% 이상의 치사율을 가지는 인간 감염은 2004년 1월 이후로 세계보건기구에 보고되었다. 지금까지, 인간 H5N1 바이러스 감염은 인간에서 인간으로의 전염은 예외적인 경우에 불구하고, 대부분은 감염된 가금류로부터 바이러스가 직접 전염되었기 때문이다. 인간 및 조류 독감 바이러스 사이 유전적 재조합 및/또는 H5N1 바이러스 게놈의 돌연변이는 H5 서브타입의 신규한 독감 바이러스를 발생시키고, 상기 신규 바이러스는 면역학적으로 인간에서 전염을 유지하는 능력이 있다면 유행성을 일으킬 수 있다. 그러므로, 고도의 병원성 H5N1 및 다른 조류 독감 변종에 대한 효과적인 백신이 긴급하게 요구되어 진다.
H5N1 독감의 1997년 발발에 대응하여 개발되고 평가된 백신들은 단지 인간에 대하여 미약한 면역성을 나타냈을 뿐이고, 2004년 인간들로부터 분리한 H5N1 바이러스들은 1997년 및 2003년에 분리한 것들로부터 유전적 및 항원적으로 구별되고, 유도된 면역반응이 항원적으로 구별되는 바이러스 변종에 대하여 보호하지 못하기 때문에, 새로운 백신의 개발을 요구되었다.
병원성 변종과 HA 서브타입을 공유하는 자연발생적 비병원성 변종으로부터 생산되거나 자발적인 단백질 절단 부위의 결실에 의한 비병원성이 되도록 조작된 비-병원성 조류 독감 바이러스는 암닭의 알에서만 생산되어 왔다. 세계적인 유행이 일어나는 경우, 가금류의 감염은 닭의 광범위한 폐사를 유발하고, 결국 백신 제조를 위해 사용되는 달걀의 부족을 야기하게 될 것이다. 재조합 HA 백신들은 가치가 있지만 효율적인 보호를 위해 잠재적으로 유해한 보조제를 필요로 한다. 따라서 세포-기반 및/또는 재조합 DNA 기술들을 포함하는 백신 제조 공정의 다변화는 유행성 상황에서 백신 생산 능력을 증진시킬 수 있다. 더 나아가, 재조합 DNA 기술들은 바이러스 서열이 알려지자마자 하나 이상의 바이러스 유전자의 클로닝과 발현이 시작될 수 있게 됨에 따라, 백신 이용성을 촉진하는데 이점을 가져온다.
본 발명은 신규 조성물, 및 독감 백신을 제조하는 방법 및 독감 바이러스의 조류 및/또는 유행성 변종에 대한 인간, 비인간 포유류 및 조류 개체들을 면역화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 조류 독감에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 적용되는 현재의 이용가능한 독감 백신의 부족한 면역성 및 제조의 장애를 극복한 것이다. 본 발명의 상기 조성물 및 방법은 하나 이상의 면역성 조류 독감 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 이용하는 것이고, 선택적으로 면역반응을 강화시키고, 사망률을 줄이고, 조류 또는 유행성 독감 변종에 의해 노출 또는 감염된 후 회복을 촉진시키는 내부 단백질과 병용할 수 있다. 본 발명은 인간 및 비-인간 아데노바이러스들이 조류(및 잠재적인 유행성) 독감 변종에 대한 면역반응을 유도하는 효과적인 벡터임을 제공하는 최초의 보고이다. 덧붙여, 본 발명의 조성물 및 방법은 조류 독감 바이러스의 잠재적인 유행성 변종에 대한 백신으로서 평가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스는 조직 배양에서 쉽게 배양할 수 있으며, 상업적 제조를 위해 적절한 양으로 정제될 수 있다. 더 나아가, 유도된 면역반응은 강하고 오래 지속되고, 중화시키는 항체 생산 및 T 세포 반응에 관련된 항원의 조합에 의존하며, 독감의 항원적으로 별개의 변종에 대하여 보호할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
본 발명은 하나 이상의 독감 항원들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 아데노바이러스는 조류 독감 변종("조류 독감 항원")의 적어도 하나의 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 조류 헤마토글루티닌("HA") 항원을 암호화할 수 있다. 상기 벡터는 H5 서브타입, H7 서브타입 또는 H9 서브타입 변종(예를 들면, 최근 발생한 조류 독감에서의 H5N1, H7N7 또는 H9HA로부터 선별된)과 같은 조류 독감 변종의 하나의 HA를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 조류 HA 항원의 다수(하나 이상)를 암호화할 수 있다. 상기 하나의 서브타입(예를 들면, H5N1의 변형, H7N7의 변형 또는 H9HAHA의 변형)의 변형을 암호화하는 HA 항원 또는 상기 HA 항원들은 다른 유형의 HA 항원이 될 수 있다(즉, 다른 서브타입의 하나 이상의 HA 항원을 포함하는 조합에서 하나 이상의 HA 항원을 포함하는, H5 및 H7, H5 및 H9, H7 및 H9, 또는 H5, H7 및 H9의 조합).
또한, 재조합 아데노바이러스 벡터는 조류 독감 뉴라미니다아제("NA") 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. NA 항원은 벡터 또는 조류 HA 항원을 포함하는 조합에 의해 암호화될 수 있다. 상기 벡터는 조류 HA 항원 및 NA 항원 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 때, HA 및 NA 항원은 동일한 변종이 될 수 있고, 다른 변종의 조류 독감으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 최근 아시아의 인간에서 조류 독감의 발생들은 독감 A의 H5N1, H7N7 및 H9N2에 의한 것이다. 아데노바이러스 벡터는 예를 들면, N1 서브타입 NA, N7 서브타입 NA 또는 N2 서브타입 NA를 암호화할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다른 NA 서브타입, 예를 들면 N3(예를 들면, 비병원성 H5N3 변종 조류 독감 바이러스에 대응하는)과 같은 NA 서브타입을 암호화할 수 있다. 본 발명의 기술은 조류 HA 서브타입(주로, H5, H7 또는 H9)은 아데노바이러스 벡터에서 9개의 NA 서브타입으로 조합될 수 있음을 알 수 있다. 상기 HA 항원에 관하여 설명한 것처럼, 아데노바이러스 벡터는 다수의 NA 항원들을 암호화할 수 있고, 하나의 NA 서브타입의 변형 또는 다른 NA 서브타입들의 표본이 될 수 있다.
상기 아데노바이러스 벡터들은 다수의 독감 항원들을 암호화할 수 있다. 다수의 독감 항원들은 다수의 조류 HA 항원들, 다수의 조류 NA 항원들 또는 조류 HA 항원들 및 NA 항원들의 조합과 같은 둘 이상의 조류 독감 항원들을 암호화할 수 있다. 또한, 상기 벡터들은 조류 또는 비조류 독감 변종의 하나 이상의 내부 단백질을 포함하는 조합에서 하나 이상의 조류 독감 항원을 암호화할 수 있다. 조류 독감 내부 단백질의 경우, 내부 단백질은 조류 독감의 동일 또는 다른 변종으로부터 선별될 수 있다. 암호화되는 내부 단백질은 인간 변종의 독감(전형적으로, 독감 A)과 같은 비-조류 독감 변종의 독감으로부터 선별될 수 있다. 예를 들면, 내부 단백질 또는 단백질들은 H1N1, H2N2 또는 H3N2 독감 변종으로부터 선별될 수 있다. 내부 단백질(M1, M2, NP, PB1, PB2, NS1 및 NS2)들은 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 내부 단백질의 조합은 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 M 단백질(하나 이상의 M1 및/또는 M2), NP 단백질 또는 M 및 NP 단백질을 암호화할 수 있다.
인간 및 비-인간 아데노바이러스 벡터들은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 둘 모두 하나 이상의 상기 독감 항원을 포함하는 것으로 제조될 수 있다. 인간 아데노바이러스 벡터들은 인간 아데노바이러스 항원형 5("HAd5") 벡터들을 포함한다. 또한, 상기 아데노바이러스 벡터는 돼지 또는 소와 같은 비-인간 아데노바이러스 벡터(예를 들면, BAd3 및 PAd3 벡터들)이다. 전형적으로, 아데노바이러스 벡터는 인간 또는 동물 세포들에서 삽입된 유전자들의 전사 및 번역의 다수의 사이클이 불가능한 복제가 결실된 아데노바이러스이다. 복제가 결실된 아데노바이러스 벡터들은 복제에 관련된 하나 이상의 유전자(또는 부위)에 돌연변이를 가지고, 하나 이상의 E1 부위 유전자, E3 부위 유전자, E2 부위 유전자 및/또는 E4 부위 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 복제가 결핍된 아데노바이러스 벡터는 E1 부위 유전자, E3 부위 유전자, E2 부위 유전자, E4 부위 유전자 또는 상기들의 조합에서 결실 또는 돌연변이를 가질 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 조류 독감 HA 항원, 조류 독감 NA 항원, 또는 조류 HA 항원 및 조류 NA 항원 둘 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가 결실된 인간 아데노바이러스 벡터이다. 선택적으로, 상기 아데노바이러스 벡터는 다양한 하나의 HA 서브타입 또는 다른 HA 서브타입인 다수의 조류 HA 항원들을 암호화한다. 상기 아데노바이러스 벡터는 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질 또는 M 및 NP 단백질의 조합과 같은 적어도 하나의 독감 내부 단백질을 암호화한다.
또한, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 조류 독감 HA 항원, 조류 독감 NA 항원, 또는 조류 HA 항원 및 조류 NA 항원 둘 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 돼지 또는 소 아데노바이러스 벡터와 같은 복제가 결핍된 비-인간 아데노바이러스 벡터이다. 선택적으로, 상기 아데노바이러스 벡터는 다양한 하나의 HA 서브타입 또는 다른 HA 서브타입인 다수의 조류 HA 항원들을 암호화한다. 상기 아데노바이러스 벡터는 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질 또는 상기 단백질의 조합과 같은 적어도 하나의 독감 내부 단백질을 암호화한다.
또한, 본 발명은 조류 독감 변종의 적어도 하나의 항원을 발현하는 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 일반적으로, 아데노바이러스는 조류 HA 항원 및/또는 조류 NA 항원을 발현한다. 따라서, 아데노바이러스는 예를 들면, H5HA 항원, H7HA 항원 및/또는 H9HA 항원과 같은 조류 HA 항원을 포함할 수 있다. 유사하게, 아데노바이러스는 예를 들면, H1NA 항원, H7NA 항원 및/또는 H2NA 항원과 같은 조류 NA 항원을 포함할 수 있다. 일부의 경우, 아데노바이러스는 다수의 조류 HA 항원, 다수의 조류 NA 항원 또는 조류 HA 및 NA의 조합과 같은 다수의 조류 독감 항원을 발현한다. 예를 들면, 아데노바이러스는 다수의 하나의 HA(또는 NA) 서브타입을 발현할 수 있다. 또한, 아데노바이러스는 다른 서브타입의 둘 이상의 HA(또는 NA) 항원들을 발현할 수 있다. 일부 경우, 아데노바이러스는 M1, M2, 및/또는 NP 단백질과 같은 적어도 하나의 독감 내부 단백질을 발현한다. 아데노바이러스는 다수의 독감 항원을 발현하고, 다수의 항원은 동일한 계통 또는 서브타입, 또는 다른 계통 또는 서브타입이 될 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 또는 돼지 또는 소 아데노바이러스와 같은 비-인간 아데노바이러스 중 어느하나가 될 수 있다. 일반적으로, 아데노바이러스는 복제가 결실된 인간 또는 비인간 아데노바이러스이다. 예를 들면, 복제가 결실된 아데노바이러스는 E1 부위 유전자, E3 부위 유전자, E2 부위 유전자 및/또는 E4 부위 유전자에서 돌연변이(예를 들면, 결실, 추가 또는 치환)를 가질 수 있다.
본 발명의 상기 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스는 다양한 목적으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스는 시험관 내 및 생체 내(알 내 포함)에서 재조합 조류(및 다른) 독감 항원들을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 재조합 조류 독감 항원들을 생산하는 방법은 본 발명의 특징이다. 예를 들면, 재조합 독감 항원들은 조류 독감 바이러스 항원을 암호화하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노바이러스를 복제함에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 아데노바이러스가 둘 이상의 조류 독감 바이러스 항원, 또는 적어도 하나의 조류 독감 바이러스 및 비-조류 독감 바이러스 항원을 암호화하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 조류 독감 항원은 독감의 H5, H7 또는 H9으로부터 선별된 HA 항원 또는 NA 항원이 될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 아데노바이러스가 다수의 독감 항원들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 실시예에서는, 재조합 조류 독감 바이러스 항원을 발현하는 아데노방이러스는 복제가 결실된 벡터의 복제를 지지할 수 있는 세포 내로 복제가 결실된 벡터를 도입함으로써 제조될 수 있다. 상기 세포들은 전형적으로 복제가 결실된 아데노바이러스 벡터로부터 제거된 하나 이상의 E 단백질을 암호화하는 이종의 핵산과 같은, 상보적인 복제 기능을 제공하는 적어도 하나의 이종의 핵산을 포함한다. 본 발명의 실시예에서는, 상기 복제가 결실된 아데노바이러스 벡터의 성장을 지지할 수 있는 세포들은 다른 종에 친화성을 가지는 다른 변종의 아데노바이러스의 성장을 지지할 수 있다. 선택적으로, 재조합 조류 독감 바이러스 항원은 분리되고, 예를 들면, 백신과 같은 면역성 조성물을 제조하기 위해 이용된다.
또한, 본 발명은 다른 친화성을 가지는 복제가 결실된 다수의 아데노바이러스의 복제를 지지하는 세포주에 관한 것이다. 상기 다수의 기능성 세포주들은 아데노바이러스의 다른 변종의 다수의 E 단백질을 암호화하는 이종의 핵산들을 포함한다. 본 발명의 실시예에서는, 상기 세포주들은 첫번째 아데노바이러스 변종의 적어도 하나의 E 단백질 및 다른 아데노바이러스의 적어도 하나의 E 단백질을 암호화하는 적어도 두개의 별개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 이종의 핵산을 포함한다. 상기 E 단백질들은 상기 세포주에서 자라는 재조합 아데노바이러스 벡터들로부터 제거된 보체로 선택되어질 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, 상기 세포들은 하나 이상의 E1 단백질들이 부족하여 복제가 결실된 아데노바이러스의 성장을 지지하는 것이 의도되어 지고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 E1 단백질에 대응하여 암호화한다. 유사하게, 상기 세포들은 하나 이상의 E3 단백질들이 부족하여 복제가 결실된 아데노바이러스의 성장을 지지하는 것이 의도되어 지고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 E3 단백질에 대응하여 암호화한다. 전형적으로, 상기 세포들은 다른 종류의 친화성을 가지는 아데노바이러스의 다수의 변종의 E 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하여, 인간 아데노바이러스 E 유전자(또는 이의 단편) 및 비-인간 E 유전자(또는 이의 단편)과 같은, 다른 종류의 친화성으로 아데노바이러스의 다수의 변종의 성장을 선택적으로 지지한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 소 또는 돼지 E 단백질을 암호화한다.
본 발명의 상기 아데노바이러스 백터 및 재조합 아데노바이러스들은 백신을 포함하는 면역성 조성물의 복합체에 이용될 수 있다. 상기 면역성 조성물은 앞서 논의되었던 적어도 하나의 조류 독감 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역성 조성물은 상기 논의되었던 적어도 하나의 조류 독감 항원을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 포함한다. 상기 면역성 조성물은 아데노바이러스 벡터 및/또는 아데노바이러스에 추가적으로 약학적으로 허용가능한 매개체 또는 첨가제를 포함한다. 따라서, 상기 면역성 조성물은 조류 독감 항원을 암호화하거나 발현하는 아데노바이러스 벡터 및/또는 아데노바이러스의 일부를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 면역성 조성물은 면역증강 분자, 미로입자 또는 나노입자를 포함한다.
또한, 본 발명은 조류 또는 유행성(또는 잠재적인 유행성) 변종 독감에 대한 면역반응을 유도 또는 발생시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상에 대한 조류 독감 항원을 발현(또는 암호화하는)하는 적어도 하나의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에서 시행되는 것과 관련되는 것이다. 전형적으로, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 적어도 하나의 조류 독감 또는 유행성 독감 변종에 노출되기 이전에 대상에 투여된다. 즉, 전형적으로 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 예를 들면, 백신과 같은 예방용으로 시행될 수 있다.
재조합 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 처리는 하나 이상의 조류 또는 병원성 독감 변종에 의한 감염 때문에 심각한 질병 또는 사망으로부터 대상을 보호하는 면역반응을 유도할 수 있다. 일부 경우, 상기 면역 반응은 다수의 조류 독감 변종과 같은, 하나 이상의 독감 변종에 의해 발생되는 질병에 대해 보호한다. 전형적으로, 상기 면역반응은 적어도 하나의 조류 독감 항원에 결합하는 항체를 중화시키는 것을 포함하고, 일부의 경우, 다수의 조류 독감 변종으로 교차 반응할 수 있다. 예를 들면, 조류 독감 HA 항원을 발현하는 아데노바이러스 또는 아데노방이러스 벡터의 처리는 대응하는 HA 서브타입의 독감의 감염에 대하여 보호(또는 부분적으로 보호)하는 HA의 서브타입에 대한 항체를 중화시키는 것을 유도할 수 있다. 유사하게, 조류 NA 항원을 발현하는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 처리는 NA의 서브타입에 반응하는 항체를 유도할 수 있다.
일부의 경우, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 둘 이상의 조류 HA 및/또는 NA 항원을 발현(또는 암호화)하기 위해 처리되었다. 또한, 하나의 조류 독감 항원을 포함하는, 다수의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 처리되었다. 하나의 바이러스 또는 벡터, 또는 다수의 바이러스 또는 벡터, 예를 들면 HA항원과 같은 항원에서 처리된 경우, 다양한 동일한 서브타입이 될 수 있거나 다른 독감 서브타입의 항원이 될 수 있다. 선택적으로, 하나(또는 여러) 아데노바이러스 또는 벡터는 M1, M2, NP 또는 NS1 단백질과 같은 독감의 구조 또는 비구조 단백질의 발현을 낳는다. 하나 이상의 내부 단백질 항원의 함유물은 독감 특정 T 세포들의 생산을 증진하는 백신에 의해 발생되는 면역반응에 이용된다. 따라서, 상기 면역반응은 T 세포 반응을 포함할 수 있는 조성물에 의해 유도된다. 일반적으로, 상기 T 세포 반응은 다수의 동일 또는 다른 서브타입의 독감과 같은, 다수의 독감 변종들 사이에서 보존될 수 있는 독감 내부 단백질의 에피토프에 대해 특이적이다.
본 발명의 실시예에서는, H5HA 항원, H7HA 항원 또는 H9 항원과 같은 하나의 조류 HA 항원을 발현하는 복제가 결실되는 아데노바이러스가 처리되었다. 또한, 둘 이상의 HA 항원을 발현하는 아데노바이러스가 처리되었다. 또한, 하나 이상의 HA 항원 및 적어도 하나의 NA 항원을 발현하는 아데노바이러스가 처리되었다. 또한, 상기 아데노바이러스는 적어도 하나의 조류 HA 항원, 적어도 하나의 NA 항원, 및 조류 또는 비조류 독감 변종의 하나 이상의 독감 내부 단백질(M1, M2 및/또는 NP 단백질)을 발현한다. 상기 아데노바이러스는 H5 조류 HA, N1 조류 NA 및 인간 M(M1 및/또는 M2) 및/또는 NP 단백질들을 발현하는 아데노바이러스이다. 다수의 다른 실시예에는 변종 또는 면역반응이 요구되는 변종을 기초로 당업계에서 일반적인 기술에 의해 결정되었다.
본 발명의 실시예에서는, 다수의 인간 또는 비인간 아데노바이러스는 하나 이상의 독감 항원을 포함하는 것을 처리될 수 있다. 예를 들면, 다수의 아데노바이러스들은 동시 또는 여러번(즉, 하나 이상의 면역조성물을 동시적 또는 순서적으로 운반된다) 처리될 수 있다. 일부의 경우, 다수의 아데노바이러스들은 카테일로 처리되었다. 각각의 아데노바이러스 칵테일의 처리는 하나의 독감 항원을 발현할 수 있고, 일부 또는 모든 아데노바이러스들은 다양한 독감 항원을 발현할 수 있다. 예를 들면, H5 조류 HA 항원을 발현하는 아데노바이러스 칵테일은 M2 단백질을 발현하는 아데노바이러스와 함께 처리된다. 또한, H5 조류 HA 항원 및 N1 조류 NA 항원을 발현하는 아데노바이러스는 M2 및/또는 NP 단백질로 조합하여 처리된다. 또한, 다수의 HA 항원(다양한 하나의 HA 서브타입, 또는 다른 HA 서브타입에 대응하는 항원)을 발현하는 첫 번째 아데노바이러스는 조류 또는 인간 M2 및/또는 NP 단백질을 발현하는 두 번째 아데노바이러스와 함께 처리된다.
본 발명의 다른 실시예에서는 재조합 아데노바이러스 보다는 아데노바이러스 벡터들은 핵산(예를 들면, DNA) 백신들의 형태로 대상에 처리될 수 있다.
선택적으로, 상기 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 적어도 하나의 추가적인 면역증강 성분인 약학적으로 허용가능한 매개체 또는 첨가제를 추가적으로 포함하는 면역성 조성물로 개체에 처리한다. 상기 면역증강 성분은 MF59 및 알루미늄 아쥬반트와 같은, 아쥬반트를 포함한다. 또한, 초기 면역성에 관련된 자극 수용체 및 상기 수용체에 결합하는 자연발생 또는 합성 면역증강 조성물은 아데노바이러스 및/또는 아데노바이러스 벡터로 함께 처리될 수 있다. 예를 들면, 특정 톨(Toll)-유사 수용체(TLR7, TLR8 및 TLR9과 같은)를 자극하는 물질은 독감 항원을 발현하는 아데노바이러스 재조합물 및/또는 아데노바이러스 벡터의 조합으로 처리될 수 있다. 일부의 경우, 아데노바이러스 또는 벡터는 면역증강 CpG 올리고뉴클레오티드의 조합으로 처리될 수 있다. 일부의 경우, 아데노바이러스 또는 벡터는 상대적으로, 톨-유사 수용체 및 상기 수용체의 활성을 낳는 리간드를 발현하는 추가적인 아데노바이러스 벡터의 조합으로 처리될 수 있다.
본 발명의 면역성 조성물은 독감 특정 면역반응을 유도하기 위해 인간 또는 비-인간(예를 들면, 고양이, 개, 돼지, 조류)에 처리될 수 있다. 예를 들면, 만약 상기 개체이 인간이라면, 하나 이상의 조류 독감 항원을 포함하는 인간, 소 또는 돼지의 아데노바이러스 재조합물(또는 아데노바이러스 벡터)는 면역반응을 유도하기 위해 처리될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 조성물 및 방법은 닭, 오리, 뿔닭, 칠면조, 거위 등과 같은 가축 가금류를 포함하는 조류에서 독감 특정 면역반응을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 조성물 및 방법은 고양이, 개, 말을 포함하는 비인간, 영장류, 기타 가축 및 야생동물에서 독감 특정 면역반응을 유도하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 면역성 조성물의 다양한 루트의 처리가 가능하다. 상기 방법은 아데노바이러스 및/또는 아데노바이러스 벡터의 비강, 구강, 눈, 정맥, 근육 내, 피부, 피내 및 피하 운반을 포함한다. 본 발명의 실시예에서는 면역성 조성물들이 가축 새에 음료로, 부화 이전 알에 스프레이 또는 작은 물방울에 의해 처리되었다.
추가적인 기술은 하기 특정 제목 하에서 설명한다.
용어
본 발명에 있어서, 모든 기술 및 특정 용어는 본 발명에 관련된 당업계에서 일반적인 기술에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 분자생물학에서 일반적인 용어의 정의는 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994(ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al .(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 1-56081-569-8)에서 찾을 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "하나"는 명백히 표시되는 문맥이 없으면 다수의 참고문헌에 포함된다. 유사하게, 용어 "또는"은 명백히 표시되는 문맥이 없으면 "및"을 포함하는 것을 의미한다. 염기 크기, 아미노산 크기, 모든 분자무게 또는 분자량을 이해하기 위해서는, 주어진 핵산 또는 폴리펩티드들은 대략적이고, 설명을 위해 제공된 것이다. 상기 설명과 유사 또는 동등한 방법 또는 물질들은 실시 또는 실험에서 사용될 수 있고, 적절한 방법 및 물질들은 하기 설명하고 있다. 용어 "함유하다"는 "포함하다"는 의미이다. 약어 "예"는 "예를 들면"과 동등한 의미이다.
본 발명의 다양한 실시예의 이해를 쉽게 위해서는, 하기 특정 용어의 설명을 제공한다:
아쥬반트(Adjuvant): 항원성을 증진하기 위해 사용되는 수단: 항원에 미네랄(명반, 수산화 알루미늄, 인산화 알루미늄)의 현탁액 등이 흡수된; 또는 항원 용액은 오일(MF-59, Freund의 불완전한 아쥬반트)에 에멀젼된, 때때로 항원성(항원의 퇴화를 억제 및/또는 마크로파지의 유입을 일으키는)을 더 증진시키기 위해 살해된 마이코박테리아(Freund의 완전한 아쥬반트)의 함유물을 포함하는 워터 인 오일 유제.
항원(Antigen): 동물 내로 주입, 흡수 또는 도입되는 조성물을 포함하여 동물에서 항체의 생산 또는 T 세포반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 기질이다. 용어 "항원"은 모든 관련된 에피토프를 포함한다. "항원성 폴리펩티드"는 T세포반응 또는 항체반응과 같은 면역반응을 자극시킬 수 있는 폴리펩티드이다. "에피토프" 또는 "항원성 결정체"는 B 및/또는 T 세포반응을 위한 항원의 부위를 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 T 세포는 에피토프가 MHC 분자와 관련되어 제시되었을때 에피토프에 반응한다. 에피토프는 항원성 폴리펩티드의 3차 폴딩에 의해 배열된 인접하는 아미노산 또는 비인접한 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프가 변성시키는 용매의 처리에 의해 전형적으로 잃어버림에 반해, 변성시키는 용매의 노출에 유지될 수 있다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 구조에서 적어도 3 이상, 적어도 5, 대략 9 또는 대략 8 ~ 10 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 구조의 결정방법은 예를 들면, 엑스-레이 크리스탈로그래피(x-ray crystallography) 및 다차원 핵자기 공명 스펙트로스코피(multi-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy)를 포함한다.
독감 항원은, 면역반응이 항원성 에피토프를 공유하는 변종을 요구 또는 관련된 것이기 위해 독감 변종으로부터 선별된 헤마토글루티닌(HA) 또는 뉴라미니다제(NA) 항원이 될 수 있다. 또한, 독감 항원은 PB1, PB2, PA, M1, M2, NP, NS1 또는 NS2 단백질과 같은, 독감 내부 단백질이 될 수 있다. 조류 독감 항원은 조류 독감 변종의 독감 항원이다. 다양한 독감 항원은 자연발생된 변종 또는 기술적 변종이 될 수 있다. 본 발명에 있어서, "다양한"은 표준 단백질에 결실, 첨가 또는 치환 또는 관련된 다른 변이와 같은 하나 이상의 아미노산 변형을 가지는 단백질(예를 들면, 항원)을 의미한다.
항체(Antibody): 항원에 특별히 결합(면역반응)하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자인 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분. 자연발생적 항체(예를 들면, IgG, IgM, IgD)는 다이설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 무거운(H) 사슬과 2개의 가벼운(L) 사슬인 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 용어 "항체반응"은 항원에 대한 특정 항체의 분비를 이용하여 항원에 대한 면역학적 반응을 의미한다. 항체반응은 B 세포의 표면에 B 세포 수용체(막 결합 IgD)와 항원(또는 에피토프)의 상호작용을 통해 개시된 B 세포 매개 면역반응이다. B 세포는 같은 종류의 항원에 의해 B 세포 수용체의 자극의 결합에 이어, 항체 반응을 일으키기 위해 항원 특정 면역글로불린을 분비하는 형질세포 내로 분화한다. "중화된 항체"는 예를 들면, 플라크 중화 분석에서 측정될 때, 감염 및/또는 복제를 억제하는 바이러스의 에피토프에 결합하는 항체이다.
동물(Animal): 예를 들면, 포유류 및 조류를 포함하는 살아있는 다세포 척추 생물체. 용어 "포유류"는 인간 및 비인간 포유류를 포함한다. 유사하게, 용어 "개체"은 인간, 및 비인간 영장류, 반려동물(개 및 고양이 등), 가축(돼지, 양, 소 등) 뿐만 아니라 큰 고양이와 같은 야생동물과 같은 비인간 대상를 포함한다. 용어 "개체"은 상기 생물체의 생명주기의 단계에 관계없이 적용된다. 따라서, 용어 "개체"은 상기 생물체(즉, 상기 생물체는 가축 또는 야생의 포유류 또는 조류)에 의존하는 태내에 있거나 알에 있는 생물체에도 적용된다.
cDNA(complementary DNA): 내부 부족한 DNA 조각, 비-코딩 단편 및 전사를 결정하는 조절서열. cDNA는 전형적으로 세포로부터 추출된 mRNA로부터 역전사에 의해 실험실에서 합성된다. 독감 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제조하는 맥락에서, cDNA는 음성 가닥 RNA 게놈(또는 게놈 단편)으로부터 역전사 또는 복제(예를 들면, PCR에 의해) 등에 의해 제조될 수 있다.
숙주세포(Host cells): 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포. 상기 세포는 원핵 도는 진핵일 수 있다. 또한, 상기 용어는 대상 숙주세포의 자손을 포함한다. 모든 자손은 복제 동안 돌연변이가 일어날 수 있기 때문에 모세포와 동일하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는, 폴리뉴클레오티드 서열(상기 독감 항원을 암호화하는 것을 포함하는)이 재조합 아데노바이러스 및/또는 독감 항원을 제조하기 위해 발현될 수 있는 숙주세포 내로 삽입될 수 있다.
면역반응(Immune response): 자극에 대해, B 세포, T 세포 또는 단핵구 등과 같은 면역체계의 세포의 반응은 특별한 항원(즉, "항원-특정 반응")에 대해 특이적이다. 일부의 경우, 면역반응은 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응과 같은 T 세포 반응이다. 다른 경우, 특정 항체를 생산하는 B 세포 반응이다. "보호적 면역반응"은 병원성 독감 바이러스의 해로운 기능 또는 활성을 억제하고, 병원성 독감 바이러스에 의한 감염을 줄이고, 병원성 생물체에 의한 감염에 의해 질환 증상(죽음을 포함)을 줄이는 면역반응이다. 보호적 면역반응은 예를 들면 바이러스 복제의 억제에 의해, 플라크 감소 분석에서 플라크 형성에 의해 또는 ELISA-중화 분석(NELISA), 또는 생체 내 바이러스 처리에 대한 저항을 측정함으로써 측정될 수 있다. 세포-매개 면역반응은 예를 들면, ELISpot, 4차-라벨링, 면역독성분석과 같은 다양한 면역학적 분석에 의해 측정될 수 있다.
면역성 조성물(Immunogenic composition): 측정가능한 CTL 반응, 또는 측정가능한 B 세포 반응(예를 들면, 에피토프에 특별히 결합하는 항체의 생산)을 유도하는, 독감 바이러스(또는 다른 병원체)의 면역성 에피토프를 포함하는 조성물. 이는 에피토프(병원체에 의해 발현되는 폴리펩티드 또는 관련된 폴리펩티드에 대한 면역반응을 유도하기 위해 사용되는)를 발현하기 위해 사용될 수 있는 독감 바이러스(또는 다른 병원성 생물체)의 면역성 에피토프를 암호화하는 분리된 핵산을 의미한다. 시험관 내 사용에서, 면역성 조성물은 분리된 핵산, 단백질 또는 펩티드로 구성될 수 있다. 생체 내 사용에서, 면역성 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 매개체 또는 아쥬반트 및/또는 다른 물질에 면역성 에피토프를 발현하는 핵산 또는 바이러스를 포함한다. 독감 항원과 같은 면역성 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 당업계에서 인지된 분석으로 CTL 또는 항체 반응을 유도하는 능력에 대해 쉽게 실험될 수 있다.
내부 단백질(Internal Protein): 독감의 내부 단백질은 두 개의 표면 항원 헤마토글루티닌(HA) 및뉴라미니다제(NA)를 제외한, 독감 게놈에 의해 암호화되는 모든 구조적 및 비구조적 단백질을 포함한다. 독감 A의 내부 단백질은 6개의 게놈 RNA 단편에 의해 암호화되고, 3개의 폴리머라제 구성 PB1, PB2 및 PA; 뉴클레오캡시드 단백질(NP); 기질 단백질(M1); 막 통과 단백질(M2); 및 2개의 비구조 단백질: NS1 및 NS2를 포함한다.
분리된(Isolated): "분리된" 생물학적 구성(핵산 또는 단백질 또는 세포 소기관과 같은)은 예를 들면, 다른 염색체 및 염색체 외의 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포 소기관과 같은 자연발생적 구성에서 생물체에서 다른 생물학적 구성으로부터 상당히 분리하고 정제되는 것이다. "분리된" 핵산 및 단백질은 표준 정재 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 또한, 상기 용어는 화학적으로 합성된 핵산뿐만 아니라 숙주세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질을 포함한다.
작동가능하게 연결된(Operably linked): 첫 번째 핵산 서열이 두 번째 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓여있을 때, 첫 번째 서열은 두 번째 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들면, 만약 프로모터가 암호화하는 서열의 전사 도는 발현에 영향을 준다면, 상기 프로모터는 작동가능하게 연결된 것이다.
폴리뉴클레오티드(Polynucleotide): 용어 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열은 적어도 10개의 염기 길이를 가지는 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 생물체 또는 이로부터 파생된 것의 자연발생적 게놈에서 직접 인접한(5' 말단의 하나 및 3' 말단의 하나) 암호화하는 서열 또는 직접 인접하지 않은 암호화된 서열을 포함한다. 그러므로 상기 용어는 예를 들면, 벡터로; 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스로; 또는 원핵 또는 진핵의 게놈 DNA로 삽입되거나 다른 서열과 독립적인 분리된 분자(예를 들면, cDNA)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 각 뉴클레오티드의 변형된 형태가 될 수 있다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA의 한 가닥 및 두가닥 형태를 포함한다.
폴리펩티드(Polypeptide): 길이 또는 번역 후 변형(예를 들면, 당화 또는 인산화)에 관계없이, 단백질 또는 단편 또는 단백질의 서열과 같은 아미노산의 사슬. 용어 "펩티드"는 전형적으로 3 및 30개의 아미노산 길이 상이의 아미노산 사슬을 의미하는데 사용된다. 예를 들면, 면역학적 관련 펩티드는 대략 7 및 25개의 아미노산 길이(예를 들면 대략 8 및 10개의 아미노산)가 될 수 있다.
질환의 예방 및 치료(Preventing or treating a disease): 독감 바이러스에 의한 감염을 억제하는 것은 병원성 독감 바이러스에 노출에 의해 발생되는 질환의 완전한 발전을 억제하는 것을 의미한다. 예를 들면, 독감 감염을 억제하는 것은 바이러스에 노출된 대상에 바이러스의 수 또는 감염성을 줄이거나, 바이러스에 노출된 것으로 알려진 사람의 증상의 발전을 막는 것과 같은, 바이러스에 의한 감염의 결과인 증상을 줄이는 것을 의미한다. "처리"는 바이러스를 가지는 대상에 관련된 질병 또는 병적인 조건의 징후 또는 증상을 개선 또는 막는 치료적 또는 예방적 간섭을 의미한다.
프로모터(Promoter): 프로모터는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열의 배열이다. 프로모터는 폴리머라제 Ⅱ 유형 프로모터(TATA 요소)의 경우와 같이, 전사의 개시부위 가까운 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 선택적으로 전사의 개시 부위로부터 수천의 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있는 말단의 증진자 또는 억제자 요소를 포함한다. 구성 및 유도 프로모터 모두 포함된다(Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987).
프로모터의 특정, 비-제한적인 예들은 포유류 세포들(예를 들면, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터 또는 포유류 바이러스(예를 들면, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 매개 초기 유전자 프로모터, 리트로바이러스(retrovirus) 길이 말단 반복; 아데노바이러스 늦은 프로모터; 백신니아 바이러스(vaccinia virus) 7.5K 프로모터)로부터 게놈으로부터 유래한 프로모터들이 사용된다. 또한, 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의한 제조된 프로모터들이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 숙주에 삽입된 유전적 서열의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 포함하는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 전형적으로 발현벡터는 복제 기점, 프로모터 및 형질전환 세포의 표현형을 선별할 수 있는 특정 핵산 서열을 포함한다.
정제된(Purified): 용어 "정제된"(예를 들면, 아데노바이러스 또는 재조합 아데노바이러스에 관하여)은 절대적인 순도를 요구하는 것이 아니고 상대적인 용어를 의미한다. 예를 들면, 정제된 핵산은 세포 내의 일반적인 환경보다 핵산이 더 풍부하다. 유사하게, 정제된 펩티드는 단백질 또는 펩티드는 세포의 일반적인 환경보다 단백질 또는 펩티드가 더 풍부하다. 본 발명의 실시예에서는, 제조는 무게 또는 용량에 의해 전체 제조의 적어도 50%(70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 등, 이에 한정하지 않는다)에서 특정된 구성요소를 제시하기 위해 정제된다.
재조합(Recombinant): 재조합 핵산은 자연발생적 서열 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 같은 두 개의 다른 분리된 서열의 단편의 인위적 조합에 의해 만들어진 서열이다. 상기 인위적 조합은 화학적 합성에 의해, 그 이상의 일반적인 방법에 의해, 또는 유전적 엔지니어 기술과 같은 분리된 핵산의 단편의 인위적인 조종에 의해 달성될 수 있다.
개체(Subject): 인간, 비인간 포유류 및 조류를 포함하는 인간 및 수의학적 개체 모두를 포함하는 카테고리의 살아있는 다세포 척추동물.
T 세포(T cell): 면역반응에 중요한 백혈구 세포, T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. CD4+ T 림프구는 CD4로 알려진 세포 표면의 마커를 운반하는 면역세포이다. 또한, 헬퍼(helper) T 세포로 알려져 있는 상기 세포들은 킬러(killer) T 세포 반응뿐만 아니라 항체반응을 포함하는 면역반응을 지시한다. CD8+ T 세포는 CD8 마커를 운반하고 세포사멸 또는 킬러 효과 기능을 가지는 T 세포를 포함한다.
형질도입된(transduced) 또는 트랜스펙션된(transfected): 형질도입된 세포는 분자생물학 기술에 의해 핵산분자 내부에 도입된 세포이다. 본 발명에 있어서, 용어 "도입" 또는 "형질도입"은 핵산분자를 바이러스 벡터로 트랜스펙트, 플라스미드 벡터로 형질전환 및 전기천공법, 리포펙션 및 입자총가속에 의해 순수 DNA의 삽입을 포함하여, 세포 내로 삽입될 수 있는 모든 기술을 포함한다.
백신(Vaccine): 백신은 개체에 예방 또는 치료적인 면역반응을 유도하는 약학적 조성물이다. 일부의 경우, 면역반응은 보호적인 면역반응이다. 전형적으로, 백신은 병원성 항원에 대한 항원-특이적 면역반응을 유도한다. 본 발명에 있어서, 백신은 조류(또는 유행성) 독감에 대한 면역반응을 유도한다. 상기 백신은 아데노바이러스 벡터 또는 재조합 아데노바이러스를 포함한다.
벡터(Vector): 숙주세포 내로 도입하여 형질전환된 숙주세포를 생산하기 위한 핵산분자. 벡터는 복제기점과 같은, 숙주세포에서 복제하는 것을 허락하는 핵산서열을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 당업계에서 알려진 하나 이상의 선택가능한 마커유전자 및 다른 유전적 요소를 포함할 수 있는 용어 "벡터"는 플라스미드, 선형 핵산 분자 및 기술된 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스를 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "아데노바이러스"는 숙주세포에서 바이러스 입자를 생산하기 위해 복제하는(예를 들면, 감염의) 하나 이상의 아데노바이러스의 성분을 포함하는 핵산을 의미한다. 아데노바이러스는 조립된 바이러스의 적어도 한 부분을 암호화하는 핵산을 포함한다. 따라서, 대부분의 경우, 상기 용어를 바꾸어 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 용어는 이해를 빠르게 하기 위해 구체화되어 사용되며, 실시예에 한정되는 것은 아니다.
독감 바이러스( Influenza Virus )
독감 바이러스는 단편화된 한 가닥(음성 또는 안티센스) 게놈. 독감 바이러스는 한 가닥의 RNA 게놈 및 기질 단백질에 의해 배열되어 둘러싸고 있는 외부 지질단백질(lipoprotein)을 포함하는 내부 리보핵산 단백질의 중요부를 포함한다. 독감 A의 단편화된 게놈은 10개의 폴리펩티드들을 암호화하는 8개의 선형 RNA 분자들을 포함한다. 2개의 폴리펩티드들인 HA 및 NA는 독감에 대한 보호적인 면역반응을 위해 요구되는 초기 항원성 결정체 또는 에피토프를 포함한다. HA 및 NA 단백질의 항원성 특성을 근거로 독감 변종은 서브타입들로 분류된다. 예를 들면, 최근의 아시아 조류 독감의 발생은 HA 및NA의 표현형을 기초로 하는 H5N1, H7N7 및 H9N2로 카테고리화 될 수 있다. 상기 서브타입들은 가금류에서 높은 감염성을 보였으며, 상당한 병원성 및 사망률을 일으키는 직접 인간을 감염시키기 위한 종간 장벽(species barrier)을 넘는 것이 가능했다.
HA는 세포를 둘러싸고, 접근 및 출입을 매개하는 지질단백질로부터 돌출한 표면단백질이다. HA 단백질은 대략 566개의 아미노산 길이이고, 단편 4의 게놈의 대략 1780개의 염기의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. HA 및 다른 독감항원의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 이력뿐만 아니라 최근에 분리되었고, 조류 독감 변종은 예를 들면, GENEBANK® 데이타베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)에서 찾을 수 있다. 예를 들면, 최근의 조류 H5 서브타입 HA 서열은 AY075033, AY075030, AY818135, AF046097, AF046096 및 AF046088를 포함하고; 최근의 H7 서브타입 HA 서열은 AJ704813, AJ704812 및 Z47199를 포함하고; 최근의 조류 H9 서브타입 HA 서열은 AY862606, AY743216 및 AY664675를 포함한다. 당업계에서 일반적인 기술 중 하나는 이전에 기술된 또는 새로이 발견된 조류 HA 항원을 본 발명의 조성물 및 방법으로 활용될 수 있다. 전형적으로 적절한 HA 서열 또는 서열들은 순환하는 또는 예측된 조류 및/또는 병원성 HA 서브타입(예를 들면, 세계 보건 기구에 의해 권장되는 대로)을 기초로 하여 선택될 수 있다.
독감에 대한 중화시키는 항체의 우수한 표적인 HA 항원 외에도, 뉴라미니다제(NA) 역시 독감에 대한 보호적인 면역반응의 표적이다. NA는 독감 게놈 단편 6의 대략 1410개의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 대략 450개의 아미노산 단백질이다. 최근의 병원성 조류 독감 변종은 N1, N7 및 N2 서브타입들에 속한다. NA 폴리뉴클레오티드들 및 아미노산 서열들은 예를 들면, N1: AY651442, AY651447 및 AY651483; N7: AY340077, AY340078 및 AY340079; 및, N2: AY664713, AF508892 및 AF508588를 포함한다. 추가적인 NA 항원들은 순환하는 및/또는 예상된 조류 및/또는 유행성 서브타입들을 기초로 하는, 이전에 기술된 또는 새로이 발견된 NA 항원들 사이에서 선택될 수 있다. 독감 게놈의 나머지 단편들은 내부 단백질을 암호화한다. 내부 단백질만 가지는 면역화는 보호적인 중화 항체 반응이 상당히 증가하지 않는 반면에, 하나 이상의 내부 단백질에 대한 T 세포반응은 독감 감염에 대한 보호를 위해 상당히 기여할 수 있다. 다형성 HA 및 NA 항원에 비해, 내부단백질들은 종 사이 및 이형 사이 더 높게 보전된다. 따라서, 조류 또는 인간의 이형의 내부 단백질에 독감의 노출에 의해 유도된 T 세포 수용체는 다른 조류 및 인간 서브타입의 비교가능한 내부 단백질에 결합한다.
PB2는 RNA-의존 RNA 폴리머라제 복합체를 포함하는 3개의 단백질들 중 하나인 759개의 아미노산 폴리펩티드이다. PB2는 독감 게놈 단편 1의 대략 2340개의 뉴클레오티드들에 의해 암호화된다. 남은 2개의 폴리머라제 단백질, 757개의 아미노산 폴리펩티드 PB1 및716개의 아미노산 폴리펩티드 PA는 상대적으로 2341개의 폴리뉴클레오티드 서열 및 2234개의 뉴클레오티드 서열(단편 2 및 3)에 의해 암호화된다.
단편 5는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를형성하는 498개의 아미노산 뉴클레오 단백질(NP)을 암호화하는 1565개의 뉴클레오티드를 구성한다. 단편 7은 252개의 아미노산 M1 단백질 및 M RNA의 다양한 스플라이스로부터 번역되는 96개의 아미노산 M2 단백질을 암호화하는 1027개의 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 단편 8은 NS1 및 NS2인 2개의 비구조 단백질을 암호화하는 890개의 뉴클레오티드를 구성한다. M(M1 및 M2) 및 NP 단백질들은 보호적인 체액 및/또는 세포의 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 일부 내부 단백질은 본 발명의 조성물 및 방법에 포함(예를 들면, 추가로 하나 이상의 조류 HA 및/또는 NA 항원)될 수 있고, 또한, 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스는 일반적으로 하나 이상의 M1, M2 및/또는 NP 단백질을 포함한다. 바이러스 한 변종의 내부 단백질에 대한 반응이 독감의 다른 변종의 내부 단백질과 상호작용하는 경향 때문에 내부 단백질은 조류 및/또는 인간 변종으로부터 선별될 수 있다. 예를 들면, 내부 단백질은 조류 H5N1, H7N7 및/또는 H9N2 변종들로부터 선별될 수 있다. 또한, 내부 단백질은 인간 H3N2, H1N1 및/또는 H2N2로부터 선별될 수 있다. 상기 내부 단백질의 폴리펩티드 및 아미노산 서열은 예를 들면, H3N2 M 및 NP 핵산, 및 단백질은 각각 접근번호 AF255370 및 CY000756에 의해 제시되는 것과 같이 GENEBANK®에서 찾을 수 있다. 독감의 내부 단백질은 변종들 사이 보전되고, 독감에 대한 보호적인 면역반응에 기여하는 교차-반응 T 세포반응을 유도하는 경향이 있다.
접근번호에 의해 표시된 특정 핵산 및 단백질들은 비-독점적인 샘플들이고, 수많은 추가적인 독감 항원 서열들은 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 문맥에서 지표될 수 있는 것은 당업계의 기술에 의해 고려될 수 있다. 예를 들면, 추가적인 독감 항원 및 이들을 암호화하는 핵산들은 상기 문헌들의 항원 및 핵산에 대해 초기 구조에서 일반적으로 유사하다. 아미노산(및 폴리뉴클레오티드) 서열들 사이 유사성은 서열들, 서열 동일성으로 불리는 다른 것들 사이 유사성의 관점으로 명백해진다. 서열 동일성은 종종 퍼센티지 동일성(또는 유사성): 더 높은 퍼센티지가 두 서열의 더 유사한 1차 구조를 가지는 관점으로 측정된다. 일반적으로 두 아미노산 서열의 1차 구조가 유사하면, 폴딩 및 조립된 고차의 구조가 더 유사하다. 예를 들면, 같은 독감 서브타입의 HA 항원들은 전형적으로 높은 정도의 서열 동일성을 공유한다. HA 항원(특별한 서브타입의)의 변종들은 하나 또는 소수의 아미노산 결실, 추가 또는 치환을 가지지만 이들의 아미노산(및 일반적으로 이들의 폴리뉴클레오티드 서열)의 매우 높은 퍼센티지를 공유한다. 서로 다른 서브타입의 변종의 정도가 있지만, 이들의 전체적인 항원성 특성은 유지된다. 대조적으로 다른 서브타입의 HA 항원들은 더 적은 서열 동일성(예를 들면, 포켓에 결합하는 수용체에서)을 공유 및/또는 이들의 항원성 특성의 차이는 더 이상 동일하지 않다.
서열 동일성을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘들은 하기에서 설명된다: Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; and Pearson and Lipman, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994, 이들은 상세한 서열 정렬 방법 및 상동 계산을 보여준다.
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련된 사용을 위해, 생명공학정보를 위한 국립센터(NCBI, Bethesda, MD)를 포함 및 인터넷상의 여러 정보로부터 이용가능하다(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403, 1990). 상기 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법은 인터넷상의 NCBI 웹 사이트에서 이용 가능하다. 두 핵산 사이 서열 유사성의 또 다른 지표는 혼성화하는(hybridize) 능력이다. 두 핵산의 서열이 더 유사할수록, 이들이 혼성화하는 조건이 더 엄격해진다. 혼성화 조건의 염격도는 서열 의존적이고 다른 환경 매개변수 하에서 다르다. 따라서 특별한 정도의 염격도를 결정하는 혼성화 조건들은 선택적인 혼성화 방법의 특성, 조성물 및 혼성화 핵산 서열의 길이 등에 의존할 것이다. 일반적으로, 혼성화의 온도 및 혼성화 완충용액의 이온 세기(특히, NA+ 및/또는 Mg++ 농도)는 혼성화의 염격도를 결정할 것이고, 세척 시간 역시 염격도에 영향을 준다. 일반적으로, 염격한 조건은 주어진 이온 정도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 녹는점(Tm) 보다 대략 5 ~ 20 ℃ 더 낮은 것으로 선택된다. 상기 Tm은 완벽하게 일치하는 프로브를 위해 표적 서열의 50%를 혼성화하는데 온도(주어진 이온 염격도 및 pH 하에서)이다. 핵산 혼성화의 조건 및 염격도의 계산은 예를 들면, Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993.and Ausubel et al . Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999에서 찾을 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, "염격한 조건"은 혼성화 분자 및 표적 도구 서열 사이 25% 이하 불일치한다면 혼성화가 일어날 것이라는 조건을 포함한다. 상기 "염격한 조건"은 더 구체적인 정의를 위해, 염격도의 특별한 수준으로 분류될 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, "온건한 염격도" 조건은 25% 이상의 서열 불일치를 가지는 분자들이 혼성화되지 않는 조건이다; "중간 염격도" 조건은 15% 이상의 서열 불일치를 가지는 분자들이 혼성화되지 않는 조건이다; "높은 염격도" 조건은 10% 이상의 서열 불일치를 가지는 분자들이 혼성화되지 않는 조건이다; "매우 높은 염격도" 조건은 6% 이상의 서열 불일치를 가지는 분자들이 혼성화되지 않는 조건이다. 대조적으로, "매우 낮은 염격도" 조건 하의 혼성화하는 핵산들은 훨씬 낮은 서열 동일성을 가지거나 핵산의 단지 짧은 서열에 걸쳐서 서열 동일성을 가지는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명에 있어서, "아데노바이러스"는 서열 유사성 또는 상기 혼성화 측정에 의해 측정됨으로써 다양한 H5, H7 및/또는 H9 서브타입 헤마토글루티닌 항원(또는 본 발명의 다른 항원)과 같은 다수의 독감 항원을 포함 및/또는 발현할 수 있다.
아데노바이러스 벡터( Adenovirus vectors )
본 발명에 있어서, 용어 "아데노바이러스"는 포유류 아데노바이러스(Mastadenovirus) 및 조류 아데노바이러스(Aviadenovirus) 속(genera)을 포함하는 모든 아데노바이러스를 포함하는 의미이다. 적어도 47개의 인간 항원형의 아데노바이러스들이 확인되었다(FIELDS et al ., VIROLOGY, volume 2, chapter 67(3d ed., Lippincont-Raven Publishers). 아데노바이러스들은 대략 36 kb 크기의 선형 이중 가닥 DNA 바이러스들이다. 상기 게놈은 각 말단에 뒤집힌 서열(ITR)을 포함하고, 초기 유전자 및 후기 유전자에 캡시드로 둘러싸인 서열을 포함한다. 주요 초기 유전자들은 E1, E2, E3 및 E4 부위에 포하묀다. 상기 중, E1 부위(특히, E1a 및 E1b)에 포함된 유전자들은 바이러스 복제에 필요하다. 예를 들면, E4 및 L5 부위는 바이러스 증식에 관련되고, 주요 후기 유전자들은 L1 ~ L5 부위에 포함된다. 예를 들면, 인간 Ad5 아데노바이러스 게놈은 완벽히 서열화되었고, 상기 서열은 world wide web(예를 들면, GENBANK® 접근번호 M73260)에서 이용가능하다. 유사하게, 인간 및 비인간 아데노바이러스의 다른 항원형(Ad2, Ad3, Ad7, Ad12 등)의 게놈의 부분 또는 전체의 일부가 또한 서열화 되었다.
재조합 아데노바이러스들로 개체에 감염 또는 재조합 아데노바이러스 벡터로 도입하는 경우, 아데노바이러스 게놈 내 포함된 외생의 핵산들은 숙주세포 RNA 폴리머라제 및 번역에 의해 전사 및 번역된다. 따라서, 하나 이상의 독감 항원들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 아데노바이러스 벡터 내로 삽입될 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 독감 항원을 생산하기 위해 전사 및 번역되는 대상 세포 내로 도입될 수 있다. 최근에, 비-복제 아데노바이러스 벡터들이 면역학적으로 효과적인 HA1 종 백신을 생산 및 수송을 위해 사용되었다(Van Kampen et al., Vaccine 23:1029-1036, 2005). 본 발명의 조성물 및 방법의 맥락에서 상기 H5, H7 또는 H9 서브타입의 헤마토글루티닌 항원과 같은 적어도 하나의 조류 독감 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 확립된 분자생물 절차에서 사용하는 아데노바이러스 벡터 내로 삽입된다. 독감 항원을 암호화하는 핵산들(예를 들면, cDNA)는 제한 효소(restriction enzyme)로 녹이기, DNA 폴리머라제(polymerase)로 채우기, 엑소뉴클라제(exonuclease)에 의해 결실, 터미널 디옥시뉴클레오시드 트랜스퍼라제(terminal deoxynucleotide transferase)에 의해 연장, 합성 또는 복제된 DNA 서열의 연결, 한가닥 박테리오파지(bacteriophage)를 매개로, 또는 PCR 또는 다른 시험관 내 증폭으로 조합한 특정 올리고누클레오티드의 사용으로 부위-직접 서열 변형과 같은 표준 절차로 조정될 수 있다.
하나 이상의 독감 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 생산에 관하여, 당업계에서 일반적인 기술 중 하나를 설명하기 위해 충분한 바람직한 절차를 하기에서 찾을 수 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992(and Supplements to 2003); and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999.
전형적으로, 독감 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터(promoter) 및 폴리아데닐화 시그널(polyadenylation signal) 등을 포함하는 전사 조절 서열에 조작 가능하게 연결된다. 프로모터는 숙주세포의 전사 절차(machinery)(또는 도입된 합성적 절차)에 의해 인지되는 폴리뉴클레오티드 서열이고, 이는 전사의 개시에 관련된다. 폴리 아데닐화 시그널은 번역을 위해 핵에서 세포질로 나가는 전사의 적절한 프로세싱(processing) 및 트래피킹(trafficking)을 위한 mRNA 전사 말부에 일련의 뉴클레오티드 추가를 지시하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
당업계에서 알려진 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 매개 초기 유전자 프로모터("CMV"), 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(herpes simplex virus thymidine kinase )("tk"), SV40 초기 전사 단위(early transcription unit), 폴리오마(polyoma), 리트로바이러스(retroviruses), 파필로마 바이러스(papilloma virus), 헤파터티스 비 바이러스(hepatitis B virus), 및 인간 및 유인원 면역 결여 바이러스(immunodeficiency viruses)를 포함하는 바이러스 프로모터를 포함한다. 다른 프로모터들은 면역글로불린의 무거운 사슬, 면역글로불린의 가벼운 사슬, T 세포 수용체, HLA DQ α 및 DQ β, β-인터페론(interferon), 인터루킨-2(interleukin-2), 인터루킨-2 수용체(interleukin-2 receptor), MHC class II, HLA-DRα, 베타-액틴(β-actin), 근육 크레아틴 키나제(muscle creatine kinase), 프리알부민(prealbumin)(transthyretin), 엘라타제(elastase) I, 메탈로티오네인(metallothionein), 콜라게나제(collagenase), 알부민(albumin), 페토프로테인(fetoprotein), 베타-글로빈(β-globin), c-fos, c-HA-ras, 인슐린(insulin), 신경 세포 접합 분자(neural cell adhesion molecule, NCAM), 알파 원-안티트립신(α1-antitrypsin), H2B(TH2B) 히스톤(histone), 타입 원 콜라겐(type I collagen), 글루코즈-조절 단백질(glucose-regulated proteins(GRP94 및 GRP78)), 랫트 성장 호르몬(rat growth hormone), 인간 혈청 아밀로이드(human serum amyloid A, SAA), 트로포닌 원(troponin I, TNI), 패틀릿트-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor), 및 디스트로핀(dystrophin), CD11c과 같은 수지상세포-특이 프로모터(dendritic cell-specific promoters), CD68과 같은 마크로파지 특이 프로모터(macrophage-specific promoters), 랑게린(Langerin)과 같은 랑게르한스 세포-특이 프로모터(Langerhans cell-specific promoters), 및 케라티노사이트(keratinocytes)에 대한 특이 프로모터, 및 피부 및 폐의 상피세포(epithelial cells)를 포함하는 포유류 유전자로부터 분리된다.
프로모터는 유도성(inducible) 또는 항상성(constitutive) 중 어느 하나가 될 수 있다. 유도성 프로모터는 유도자 물질이 존재하는 경우를 제외하고, 비활성 또는 낮은 활성을 가지는 프로모터이다. 상기 프로모터의 예들은 본 발명에서는 MT II, MMTV, 콜라게나제(collagenase), 스트로멜리신(stromelysin), SV40, 뮤린(murine) MX 유전자, 알파-2-마크로글로불린(alpha-2-macroglobulin), MHC class I 유전자 h-2kb, HSP70, 프로리페린(proliferin), 종양 네크로시스 인자(tumor necrosis factor), 또는 티로이드 자극 호르몬 유전자 프로모터(thyroid stimulating hormone gene promoter)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
그러나, 전형적으로 프로모터는 추가적인 인자가 없는 경우에 숙주세포 내로 도입한 상태로 높은 수준의 전사를 가지는 항상성 프로모터이다. 선택적으로 전사 조절 서열은 하나 이상의 증진자 요소를 포함하고, 이는 최소의 프로모터만에 의한 전사를 증가시키는 하나 이상의 전사 인자에 결합하는 결합 인지 부위이다.
또한, 프로모터는 유전자 전사의 적절한 종료 및 폴리아데닐화에 영향을 주는 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 것이 요구된다. 폴리아데닐화 시그널의 예시는 소 성장 호르몬, SV40 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자로부터 분리된다. 상기 또는 다른 폴리 아데닐화 시그널 중 일부는 본 발명의 아데노 시그널 중 일부는 본 발명의 아데노 바이러스 벡터 문맥에서 사용될 수 있다.
전형적으로, 독감 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 전사 개시 부위를 포함하는 완전한 길이 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 될 것이다. 그러나, 이는 항원의 면역성 부위(일부분)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하는 것이 가능하다. 만약 폴리뉴클레오티드 서열이 번역 개시 부위 또는 코돈이 부족하다면, 벡터의 생산 동안 항원 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 앞서는 적절한 부위에서 도입될 수 있다.
아데노바이러스를 암호화하는 핵산 벡터는 당업계에서 알려져 있고, 이는 유전자 치료 및 백신 적용을 위해 사용된다. 아데노바이러스의 예는 하기에서 설명되고 이들은 본 발명의 참고문헌으로 삽입된다: Berkner, BioTechniques 6:616-629, 1988; Graham, Trend Biotechnol, 8:85-87, 1990; Graham & Prevec, in Vaccines : new approaches to immunological problems, Ellis(ed.), pp.363-390, Butterworth-Heinemann, Woburn, 1992; Mittal et al ., in Recombinant and Synthetic Vaccines, Talwar et al . (eds) pp. 362-366, Springer Verlag, New York, 1994; Rasmussen et al ., Hum . Gene Ther . 16:2587-2599, 1999; Hitt & Graham, Adv . Virus Res . 55:479-505, 2000, 미국 공개 특허 출원 제 2002/0192185호.
일반적으로, 복제 결함이 있는 즉, 헬퍼 의존 아데노바이러스 벡터, 조건적 복제에 적절한 및 복제에 적절한 아데노바이러스 벡터 및 바이러스를 추가함에도 불구하고 숙주세포에 자발적으로 복제가 불가능한 것들을 위해 수정된 벡터들이 사용될 수 있다. 일반적으로, 복제 결함 바이러스의 게놈은 감염된 세포에서 바이러스 복제를 위해 필요한 서열의 일부가 부족하다. 이 부위들은 특히, 치료적 대상의 분자를 위해 암호화하는 서열에 의해 제거되거나(전체적 또는 부분적), 비기능적으로 남겨지거나 다른 서열에 의해 대체될 수 있다. 전형적으로, 복제 결함된 아데노바이러스는 결실 즉, E1(E1a 및/또는 E1b), E3 부위, E2 부위 및/또는 E4 부위 중 하나 이상이 결실된 것과 같은 돌연변이를 포함한다. ITR 및 패키징 요소들을 제외한 전체 아데노바이러스 게놈은 결실되어, 결과적으로 헬퍼 의존 벡터 또는 내용없는("gutless") 벡터로 알려진 아데노바이러스 벡터가 될 수 있다.
일부의 경우, 이종의 DNA 서열들은 결실된 아데노바이러스 서열의 위치에 삽입된다(Levrero et al ., Gene 101:195-202, 1991; Ghosh-Choudhury et al ., Gene 50:161-171, 1986). 다른 구조는 E1 부위에서 결실 및 E4 부위의 비필수적인 일부의 결실을 포함한다(wo 94/12649). 또한, 아데노바이러스 벡터의 예시는 미국 특허 번호: 6,328,958, 6,669, 942 및 6,420,170에서 설명되고, 이들은 본 발명의 참고문헌으로 삽입된다.
복제가 결핍된 재조합 아데노바이러스들은 다른 방식, 예를 들면 재조합 아데노바이러스의 복제를 위해 필수적인 모든 결핍된 기능들을 보충이 가능한 적합한 세포주에서 제조될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 일부가 삽입된 보충(complementation ) 세포주(293 세포들과 같은)에서 생산될 수 있다. 상기 세포주들은 왼쪽-핸드 ITR, 캡시드화 부위 및 E1a, E1b 및 pIX 단백질을 암호화하는 부위의 일부를 포함하는 E1 부위를 포함하는 아데노바이러스 항원형(serotype) 5(Ad5) 게놈의 왼쪽 핸드 말단(left-hand end)(대략 11 ~ 12 %)를 포함한다. 상기 세포주는 E1 부위에 대한 결핍이 있는 재조합 아데노바이러스를 트랜스-보충(trans-complementing)하는 것이 가능하다. 전형적으로, E1A 및 E1B 단백질 모두의 발현은 E1 보충을 위해 필요하다.
인간 아데노바이러스 벡터들은 공통적으로 인간 및 동물 세포 및 생물체 내로 외생의 핵산을 도입하는데 이용된다. 아데노바이러스들은 넓은 숙주세포 범위를 나타내고, 아데노바이러스 벡터들은 인간뿐만 아니라 조류를 포함한 비인간을 감염시키는데 이용될 수 있다. 대부분 공통적으로 인간 아데노바이러스 벡터들은 아데노바이러스 항원형 5 바이러스로부터 유래된 HAd5 벡터들이다. 본래의 아데노바이러스 게놈의 큰 크기 때문에 이종의 폴리펩티드 서열의 삽입은 셔틀(shuttle) 플라스미드를 이용하는 것을 편리하게 수행된다. 독감 항원과 같은 셔틀들은 배양된 세포들에서 아데노바이러스 게놈의 전부 또는 일부로 동종의 재조합을 진행하는 셔틀벡터로 복제된다. 추가적으로, 동종의 재조합은 완전한 길이의 아데노바이러스 벡터들을 생성하기 위해 박테리아에서 행하여 질 수 있다.
일부의 경우, 인간 아데노바이러스에 대한 미리 존재하는 숙주 면역성을 피하기 위해 비인간 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 요구된다. 인간 아데노바이러스를 이용한 감염은 인간 개체에서 공통적이고, 많은 또는 대부분 개체들은 재조합 인간 아데노바이러스를 결합 및 중화하는 순환하는 항체의 적정량을 가진다. 따라서 인간 아데노바이러스 벡터를 포함하는 인간 개체 백신 접종의 적어도 일부 개체에서 독감 서열을 포함하는 벡터의 중화 때문에 독감에 대한 면역반응의 효율적인 생성이 되지 않을 것이다. 상기 문제를 피하기 위해, 비인간 아데노바이러스 벡터들은 인간 아데노바이러스에 대한 기존의 면역성을 우회하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 동물 기원의 아데노바이러스들은 비인간뿐만 아니라 인간 세포를 효율적으로 감염시키는 것이 가능하고, 하기 감염은 인간 세포들에서 일반적으로 증식이 불가능하다(출원 WO 94/26914). 따라서, 동물 기원의 아데노바이러스는 본 발명의 벡터 및 바이러스의 문맥에서 사용될 수 있다. 인간 및 동물 백신 개발을 위한 동물 아데노바이러스 벡터들의 사용은 Bangari & Mittal, Vaccine 24:849-862, 2006에서 상세히 논의되고, 본 발명의 참고문헌으로 삽입된다. 예를 들면, 동물 아데노바이러스 벡터들은 개, 소, 쥐(예를 들면, MAV1, Beard et al ., Virology 75:81, 1990), 양, 돼지, 조류(예를 들면, 닭) 또는 다른 유인원(예를 들면, SAV) 아데노바이러스들로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 소 및 돼지 아데노바이러스들은 ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 및 769, 및 돼지 아데노바이러스 5359 하에서 ATCC(유형 1 내지 8)로부터 이용가능한 다양한 소 이종을 포함하는 독감 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 추가적으로, 번호 VR-591-594, 941-943, 195-203와 같은 ATCC에서 참고되는 SAd25, SAd22, SAd23 및 SAd24를 포함하는 다양한 이종의 유인원 아데노바이러스, 변종 Phelps(ATCC VR-432), Fontes(ATCC VR-280), P7-A(ATCC VR-827), IBH-2A(ATCC VR-828), J2-A(ATCC VR-829), T8-A(ATCC VR-830), K-11(ATCC VR-921) 및 ATCC VR-831 내지 835로 참고되는 변종과 같은 ATCC에서 이용가능한 조류 아데노바이러스의 여러 이종들(1 내지 10)뿐만 아니라 쥐 아데노바이러스 FL(ATCC VR-550) 및 E20308(ATCC VR-528), 및 양 아데노바이러스 유형 5(ATCC VR-1343) 또는 유형 6(ATCC VR-1340) 등이 사용될 수 있다.
예를 들면, 소 및 돼지 아데노바이러스 벡터들 모두는 인간 세포를 감염시킬 수 있고, 조류 독감 항원을 발현시키는 벡터로 이용될 수 있다. 소 및 돼지 아데노바이러스 벡터의 예시는 공개된 미국 특허 출원 번호 2002/0192185 및 미국 특허 번호 6,492,343 및 6,451,319에서 설명되고, 본 발명에서 참고문헌으로 삽입된다.
본 발명의 조성물 및 방법은 독감 항원에 적용가능하다. 특히, 상기 조성물 및 바법은 독감의 조류 변종에 대한 면역반응을 발현하고 생성하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 아데노바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 및 면역성 조성물은 조류 또는 유행성 변종 독감의 HA 항원을 포함한다.
수많은 조류 HA 항원들은 확정되었고, 상기 서열을 획득할 수 있었다. 예를 들면, NCBI 데이터베이스에서 공개적으로 이용이 가능하다(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi). 최근의 조류 독감의 발생으로부터 HA 항원의 예시는 AY818135(A/Viet Nam/1203/04); AF084280(A/Hong Kong/483/97); AF036356(A/Hong Kong/156/97); AY575870(A/Hong Kong/213/03)로 제시되었다. 상기 서열들을 포함하는 핵산들은 바이러스 분리집단으로부터 복제 및/또는 증식에 의해 획득될 수 있거나, 합성적으로 생산될 수 있다. 유사하게, 새로이 신생 변종 또는 새롭게 분리된 변종들로부터 분리된 신규한 HA 항원들은 본 발명의 벡터, 바이러스 및 조성물로 삽입될 수 있다. 선택적으로 상기 바이러스, 벡터 및/또는 면역성 조성물들은 조류 또는 비조류(예를 들면, 인간 독감 변종)의 하나 이상의 내부 단백질을 포함한다.
조류 및/또는 기타 독감 항원을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 상기 아데노바이러스 벡터의 적합한 숙주세포로의 도입에 대한 설명부분에서 기술된 벡터로 제조할 수 있다. 복제 결함 벡터의 경우, 아데노바이러스 벡터는 통상적으로 결함 기능을 보완하는 세포주에 도입된다. 예를 들면, E1 결함 바이러스는 아데노바이러스 E1 단백질을 코딩하는 도입 핵산이 발현되므로 E1 기능을 보완하는 세포주에서 배양할 수 있다. 세포주의 예로는 아데노바이러스 E1(예, E1A)를 발현하도록 조작된 인간과 비인간 세포주가 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 E1 단백질을 발현하는 293 세포가 E1 부위가 결손된 재조합 복합-결함 아데노바이러스를 증식시키는데 통상적으로 이용된다. 또한 적합한 세포주로는 MDBK-221, FBK-34 및 다양한 기원의 태아 망막세포가 있다. 돼지 및 소 재조합 아데노바이러스를 증식시키기에 적합한 세포주의 예로 각각 FPRT-HE1-5 세포(Bangari & Mittal, Virus Res. 105:127-136,2004) 및 FBRT-HE1 세포(van Olphen et al ., Virology, 295:108-118, 2002)를 들 수 있다. 실시예에서, 세포는 상이한 종 친화성을 가진 둘 이상의 상이한 바이러스 변종과 같은 하나 이상의 바이러스 변종의 아데노바이러스 E1 유전자를 발현한다. 예를 들면, 세포는 인간 및 비인간의 E1 유전자(예를 들면, 돼지 및/또는 소 E1 유전자)를 발현할 수 있다. 당업자는 복제-결함 아데노바이러스 벡터의 복제 기능을 보완하는 적합한 별개의 또는 대체 세포주를 용이하게 선택하거나 생산할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 공지된(또는 당업계에 공지된) 다양한 포유동물 세포주는 특정 아데노바이러스 벡터에 기초하여 본 명세서에 공지된 실시예의 변종과 같은 아데노바이러스 변종의 E1 및/또는 E3 유전자로 트랜스펙션될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터와 동일한 변종에 해당하는(즉, 동일하거나 기능적으로 유사한 변종에서 유래한) E1(및/또는 E3) 유전자를 선택하는 것이 일반적이다. 당업자는 또한 실시예의 아데노바이러스 유전자와 기능적으로 유사한 변이형(상당한 서열 동일성을 공유하거나 매우 엄격한 조건하에서 특이적으로 혼성화하는 변이형)이 또한 독감 항원을 코딩하는 아데노바이러스 벡터의 증식을 지지하는 세포주를 생산하는 데 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
외인성 핵산이 융합된 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 생산하는 통상적인 방법은 본 명세서에 삽입된 Ng 등(Hum . Gene Ther . 10:2667-2672, 1999, and Hum . Gene Ther . 11:693-699, 2000)에 기술되어 있다. 간략히 기재하면, 독감 항원을 포함하는 인간 아데노바이러스 벡터를 생산하기 위해서는 강력한 프로모터(예를 들면, CMV 최조기 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 독감 항원(예를 들면, 하나 이상의 조류 HA 항원)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 pDC311 등의 셔틀 벡터에 삽입된다. pDC311 셔틀 벡터는 3.1 kb E1 결손, Cre 재조합효소 및 온전한 패키징 신호(Ψ) 존재 하에 부위 특이적 재조합을 위한 loxP 부위를 가진 HAd5의 왼쪽 말단(약 4kb)을 포함하는 플라스미드이다. 셔틀 벡터는 패키징 신호는 부족하고 loxP 부위를 포함하고 있는 복제 결함 HAd5 게놈(예를 들면 E1 및/또는 E3 부위 유전자에 결손을 포함하는)을 포함한 플라스미드와 함께 Cre 재조합효소를 발현하는 적합한 세포(예를 들면, 293 Cre 세포)에 공동 트랜스펜션된다. 동종의 Cre 매개 재조합은 삽입된 독감 항원을 발현하는 복제 결함 아데노바이러스를 코딩하는 아데노바이러스 벡터 플라스미드의 생산을 초래한다.
보완성의 복제 기능을 발현하는 세포(예를 들면, 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E1 기능이 부족한 경우 E1)는 전기천공법, 인산 칼슘 침전, 리포펙션(lipofection) 등의 표준 과정을 통해 재조합 아데노바이러스 벡터로 트랜스펙션하거나 저 위험수준(예를 들면, 1-1000 p.f.u./세포)으로 아데노바이러스로 감염시킬 수 있다. 일부의 경우에 세포의 컨플루언트 단층이 60 mm 디쉬를 사용하여 활용된다. 그런 다음, 세포를 아데노바이러스 발현 및 복제에 적합한 시간 동안 배양하고, 재조합 아데노바이러스를 수확하기 전에 활발한 성장을 유지하고 바이러스 발견을 최대화하기 위해 세포를 분리한다. 통상적으로 하기 여러 계대(예를 들면, 2-5 계대) 재조합체는 세포를 용해하여 바이러스를 방출시킨 다음 농축시킨 후 회수한다. 재조합 아데노바이러스는 밀도 구배(예를 들면, 염화 세슘 밀도 구배)를 통해 바이러스를 포함하는 용해물을 통과시킴으로써 농축할 수 있다. 농축한 후 재조합 아데노바이러스를 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% 자당)에 투석하고, 역가를 측정하고 -80℃에서 사용할 때까지 저장한다. 백신에 이용되는 면역성 조성물의 제조에 적합한 대량의 아데노바이러스 생산 방법은 본 명세서에 참조로 삽입된 US 공개 특허 제 20030008375호 등에 기재되어 있다.
아데노바이러스 벡터로부터 재조합 독감 바이러스 항원의 생산
조류 독감 항원을 발현할 수 있는 아데노바이러스 벡터 핵산 및/또는 아데노바이러스를 포함하는 면역성 조성물의 제조에 활용될 뿐 아니라, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 고 병원성의 조류 독감 변종의 재조합 HA 항원과 기타 다른 독감 항원 등의 재조합 독감 항원의 생산 및 제조에 사용될 수 있다. 인간 및 비인간 아데노바이러스 벡터를 이용한 재조합 항원을 생산하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 실시예의 조성물과 방법은 본 명세서에 전체가 삽입된 미국 특허등록 제 5,824,770호 및 제 6,824,770호에 기재되어 있다. 또한, 상업적으로 이용되는 벡터, 예를 들어 Stratagene(La Jolla, CA)사의 ADEASYTM 아데노바이러스 벡터 시스템을 재조합 독감 단백질을 발현할 수 있는 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 재조합체(재조합 아데노바이러스)를 생산하기 위해 이용한다.
상술한 바와 같이, 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터의 E1 및/또는 E3 유전자 부위에 하나 이상의 조류 독감 바이러스 항원을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로 둘 또는 셋 이상의 독감 항원이 이종 핵산에 의해 암호화된다. 반대로 면역원성 에피토프를 포함하는 독감 항원 절편은 아데노바이러스 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 일반적으로 독감 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 고발현을 유도할 수 있는 전사 조절 서열(예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서 및/또는 폴리아데닐화 서열)과 작동가능하게 연결된다. 포유동물 세포에서 외래 유전자의 성공적인 발현과 발현 카세트의 구축 방법을 제공하는 많은 진핵생물 프로모터와 폴리아데닐화 서열은 당업계에 예를 들어, 본 명세서에 참조로 삽입된 미국 특허등록 제 5,151,267호에 공지되어 있다. 프로모터는 면역원성 단백질의 최적 발현을 유도하고 차례로 체액성, 세포 매개성 및 점막 면역반응을 공지된 기준에 따라 만족스럽게 유도하는 것을 선택한다.
선택적으로, 독감 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 항원의 후속 정제를 용이하게 하는 펩티드(예를 들면, 에피토프) 또는 폴리펩티드 태그(tag)을 암호화하는 일부분을 포함한다. 일반적으로, 독감 항원은 발현 및/또는 정제를 용이하게 하는 하나 이상의 펩티드(또는 폴리펩티드)에 연결된 융합단백질로서 발현된다. 다수의 적합한 태그는 당업계에 공지되어 있고, 그러한 태그를 포함하는 발현된 단백질은 상업적으로 이용가능한 시약 및 키트를 이용하여 용이하게 분리할 수 있다. 바람직하게는 재조합 항원을 다음 단계에 적용하기 전에 상기 태그를 효소로 또는 화학적으로 절단하여 항원으로부터 제거할 수 있다. 태그의 예로는 Myc 에피토프 태그, 히스티딘 태크 및 GST 태그가 있다.
하나 이상의 바이러스 항원을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 상보적인 E1 부위(및/또는 E2 부위)를 암호화하는 발현 카세트가 도입된 세포주에서 발현될 수 있다. 이들 재조합 세포주는 하나 이상의 독감 항원 또는 그의 절편을 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열로 대체된 E1 유전자 부위 결손을 가진 재조합 아데노바이러스가 재조합 아데노바이러스에 의해 암호화되는 소정의 외래 유전자 또는 절편을 복제하고 발현할 수 있게 한다. 선택적으로 이러한 세포주는 아데노바이러스의 한가지 변종 이상에 해당하는 E1(및/또는 E2) 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 세포주는 돼지 또는 소 아데노바이러스 변종의 E1 뿐 아니라 인간 아데노바이러스 E1을 발현하는 핵산을 포함하는 유전자를 함유한다.
약학적 조성물로 사용하기 위하여, 재조합 독감 항원은 일반적으로 배양된 세포에서 발현된 후 정제된다. 배양된 세포에서 발현된 재조합 단백질을 분리하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 특정 방법은 Sambrook 등(In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 2001)과 Brent 등Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 2003)에 기재되어 있다. 당업자는 재조합 폴리펩티드를 정제하는 무수한 방법이 있고 그러한 전형적인 단백질 정제 방법이 아데노바이러스 벡터로부터 발현된 독감 항원을 정제하는 데 사용될 것이라는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 상기 방법은 이온 교환, 겔 여과, HPLC, 단일클론 항체 친화성 크로마토그래피 및 과도 생산 후 불용성 단백질 봉입체(inclusion bodies)를 포함한 단백질 크로마토그래피 방법이 있다. 또한, 정제는 부착된 태그(상술한 바와 같이)에 근거하며, 예를 들면 여섯-히스티딘 서열은 상기 단백질에 재조합하여 융합되고 니켈 친화성 컬럼(예를 들면, 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 금속 친화성 크로마토그래피 매트릭스(The QIAexpressionist, QIAGEN, 1997))를 이용한 폴리펩티드 정제를 용이하게 하는 데 이용될 것이다.
바람직하게는 재조합 독감 항원은 개체에게 투여하기 위한 백신 담체에 결합된다. 백신 담체는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), KLH(keyhole limpet hemocyanin) 및 로타바이러스 VP6가 있다. 일부의 경우 알룸과 같은 하나 이상의 아쥬반트가 하기 서술한 바와 같이 개체에게 투여하기 위한 재조합 독감 항원에 결합된다.
아데노바이러스 벡터 및 재조합 아데노바이러스를 포함한 면역성 조성물
독감 항원(예를 들면, 조류 독감 항원)을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터 및 재조합 아데노바이러스는 시험관 내, 생체외 또는 생체내에서 세포 또는 개체에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 의도하는 용도에 적합한 약학 조성물로서 벡터 또는 바이러스를 제조하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 기재한 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스를 포함한 약제 또는 약학적 조성물을 제조하는 방법은 본 명세서에 포함된다. 일반적으로, 약학적 조성물(약제)의 제조는 사람 또는 동물에게 유해한 발열물질(pyrogen) 및 기타 다른 불순물을 필수적으로 포함하지 않는 약학적 조성물 제조를 수반한다. 통상적으로 약학적 조성물은 조성물 성분을 안정하게 하고 목표 세포에 의한 핵산 또는 바이러스의 흡입을 허용하게 하는 적절한 염과 완충액을 포함한다.
약학적(예를 들면, 면역원성) 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용된 담체 또는 부형제 내에 산재된 유효량의 아데노바이러스 벡터 또는 바이러스를 포함한다. "약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"이란 용어는 인간 또는 동물 개체에 투여했을 때 역효과, 알레르기 또는 다른 바람직하지 못한 반응을 일으키지 않는 분자 자체 및 조성물을 의미한다. 다수의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 약리학적으로 허용가능한 부형체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences(E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition(1975))에 기재되어 있다.
통상적으로, 담체의 성질은 사용하는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 비경구용 제품은 물, 생리식염수, 평형염액, 수성의 덱스트로스, 글리세롤 또는 매개체(vehicle) 등의 약학적으로 허용가능하고 생리학적으로 허용가능한 액체를 포함한 주입가능액을 함유한다. 고체 조성물의 경우(예를 들면, 파우더, 알약, 정제, 캡슐형), 종래 무독성 고체 담체는 예를 들면 약과 비슷한 수준의 만니톨, 락토오스, 전분 또는 스테아린산마그네슘이 있다. 생물학적 중성 담체 뿐 아니라 투여되는 약학적 조성물은 침윤제 또는 에멀션화제, 보존제 및 pH 완충제 등의 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들면 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노러레이트(sorbitan monolaurate)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 는 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 이러한 약학적으로 작용하는 물질을 위한 상기 매디아 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 종래 매디아 또는 작용제가 유효성분과 맞지 않는 경우를 제외하고는 면역성 조성물에서 그의 사용이 예상된다. 또한, 보충 유효 성분을 상기 조성물에 첨가할 수 있다. 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로오스과 같은 적당한 계면 활성제로 혼합된 물에 벡터 또는 바이러스를 포함한다. 또한 분산(dispersion)은 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 혼합액 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용을 위한 통상적인 조건하에 이들 조제품은 미생물 성장을 막기 위한 보존제를 포함한다.
약학적 조성물(약제)는 예방 차원(예를 들면, 백신)에서 제조되어 인간 또는 비인간 개체(가금류, 예를 들면 닭, 오리, 뿔닭, 칠면조 및 거위와 같은 조류)에게 투여하여 하나의 독감 항원(또는 복수의 독감 항원)에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 통상적으로 면역학적으로 유효한 양의 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스(또는 본 명세서에 개시된 바와 같이 아데노바이러스 벡터를 발현함으로써 생산되는 재조합 독감 항원)를 포함한다. 백신 조성물의 면역학적으로 유효한 양의 예를 들면, 1회분 이상을 투여하였을 때 면역능력이 있는 개체에게 보호성 면역반응과 같은 소정의 면역반응을 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 일반적으로, 면역학적으로 유효한 양의 백신은 감염원(예를 들면, 독감 바이러스)에 노출되기 전에(즉, 예방) 1회분 이상을 투여하여 감염원에 대한 보호성 면역반응을 유도한다. 본 발명에서 조류 독감 항원을 포함하는 아데노바이러스 벡터 및/또는 아데노바이러스(및/또는 그러한 아데노바이러스를 발현함으로써 생산되는 재조합 독감 항원)는 조류 및/또는 유행성 독감에 대한 보호성 면역반응을 유도하기 위하여 1회분 이상을 개체에게 투여할 수 있다.
조성물이 면역반응을 향상시키기 위해 감염된 후 투여되는 경우에는 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양이 투여된다. 치료학적으로 유효한 양은 개체에게 소정의 효과를 달성하기 위해 사용되는 조성물의 양이다. 예를 들면, 바이러스 감염에 의해 발생하는 증상을 막거나 변화시키기 위해 바이러스 복제를 억제하는데 필요한 조성물의 양이 될 수 있다. 개체에게 투여할 때, 일반적으로 시험관 내 또는 생체 내 효과를 얻기 위한 목표 조직 농도를 달성하기 위한 적량이 사용될 것이다.
예를 들면, 본 발명의 조성물은 조류 독감 바이러스의 병원성 H5N1, H7N7 또는 H9N2 변종과 같은 조류 독감 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 사람(또는 사람이 아닌)개체에게 투여될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및/또는 아데노바이러스는 조류(또는 유행성) 독감의 적어도 하나의 변종 또는 서브타입에 대한 예방성 또는 부분 보호성 면역반응을 유도한다. 즉, 본 발명에 기재된 약학적 조성물은 독감을 예방하거나 투여되는 상당수의 집단에서 바이러스의 병원성 변종에 노출되어 발생하는 심각한 증상(예를 들면, 병적 상태 및/또는 사망)을 줄일 수 있다. 일부의 경우에, 면역반응은 조류(또는 유행성) 독감의 다양한 변종 또는 다양한 서브타입을 사람 및 사람이 아닌 개체(조류 포함)에 투여하여 유도되는 그들에 대한 보호성(protective) 또는 부분 보호성 면역반응이다.
전형적으로, 독감에 대한 보호성 면역반응은 HA 항원과 결합하는 중화 항체(neutralizing antibodies)의 생산과 관련이 있다. 이들 항원은 다형성이 높고, 하나의 서브타입에 대해 생성되는 항체는 또 다른 서브타입의 독감에 대해서는 보호가 되지 않기 때문에, 본 발명의 면역원성 약학적 조성물은 하나 이상의 벡터 또는 바이러스에 의한 하나 이상의 HA 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스를 포함한다. 상술한 바와 같이, HA 항원은 단일 HA 서브타입 또는 하나 이상의 HA 서브타입의 변이형이다. 선택적으로 NA 항원을 발현하는 아데노바이러스(또는 NA 항원을 코딩하는 벡터)가 투여된다.
독감 항원에 대한 T-세포 반응은 독감에 대한 면역반응을 넓혀 백신 효능을 증가시킨다. 독감 A의 M2 및 NP 단백질과 같은 내부 단백질은 적당한 B-세포 및/또는 T-세포 에피토프를 가지고 있고, HA 및 NA 항원과 같은 항원 폴리펩티드와 조합하여 투여하면 독감 감염에 의한 병적 상태를 줄이고 면역적 방어를 증가시키는 T 세포 반응을 유도한다. 또한, 상기 내부 단백질 에피토프는 조류 및 인간 독감의 다양한 변종에 대한 교차 방어를 제공하는 독감 서브타입 사이에 더욱 잘 보존되어 있다. 따라서, 독감 내부 단백질을 발현하는 하나 이상의 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스를 포함하는 약학적 조성물은 독감 특이적 면역반응을 유도하기 위해 투여될 수 있다.
독감 항원(조류 독감 항원을 포함한)을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 포함한 치료학적 조성물은 목표 조직(보통, 기도)에 보통의 경로가 유효하다면 보통 경로를 통해 투여된다. 여기에는 구강, 비강, 안구, 구강내 또는 점막(직장, 질) 또는 국소 투여가 포함된다. 또한, 세포기저막(orthotopic), 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사 경로를 통해 투여된다. 상기 면역성 조성물은 통상적으로 생리학적으로 허용가능한 담체, 완충액 또는 부형제를 포함한 약학적으로 허용가능한 조성물로 투여된다.
또한, 면역성 조성물은 액상 용액 또는 현탁액; 용액에 적합한 고체형, 또는 현탁액과 같은 주사가능한 조성물 형태로 투여되고, 주사하기 전에 액상으로 조제된다. 또한, 이들 조제물질을 유제로 만든다. 상기 목적을 위한 전형적인 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 대략 인산염생리식염완충액 ml당 인간 혈청 알부민 100 mg을 포함한다. 다른 약학적으로 허용가능한 담체는 수용액, 염, 보존제, 완충액 등의 무독성 부형제를 포함한다. 비수용매에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 야채 기름 및 에틸오리에이트(ethyloleate) 등의 주입가능한 유기 에스테르 등이 있다. 수용성 담체는 물, 알콜/수용액, 식염수 및 염화나트륨, Ringer's 덱스트로스 등의 비경구 매개체를 포함한다. 정맥 주사용 매개체는 유체 및 영양 보충물을 포함한다. 보존제는 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체를 포함한다. 약학적 조성물의 여러 성분의 pH 및 정확한 농도는 공지된 파라미터에 따라 조정된다.
구강 투여에 적합한 추가 제형. 구강 제형은 약학적 수준의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 셀루로오즈, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 조성물(약제)는 용액, 현탁액, 에이로졸 또는 파우더 형태이다. 제형의 예가 참조로 본 명세서에 삽입된 미국 특허 공개 번호 20020031527호에 개시되어 있다. 경로가 국소적이면 형태는 크림, 연고, 고약 또는 스프레이가 될 것이다. 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스의 근육내, 비강내 및 국소적 투여 방법의 예시가 본 명세서에 참조로 삽입된 미국 특허등록 제 6,716,823호에 개시되어 있다.
선택적으로, 약학적 조성물 또는 약제는 독감 항원에 대한 면역반응을 증가시키기 위해 적합한 아쥬반트를 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 "아쥬반트"는 면역반응의 증강제 또는 향상제이다. "적합한"이란 용어는 백신 접종한 개체에게서 역반응이 생기지 않고 면역반응을 증진시키기 위해 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스와 조합하여 사용되는 물질을 포함하는 것을 의미한다. 특정 아쥬반트의 유효량은 백신 접종된 개체의 면역반응에 대한 아쥬반트의 증강 효과를 최적화하는 정도로 쉽게 정해진다. 예를 들면, 0.5%-5%(예를 들면, 2%)의 수산화 알루미늄(또는 인산 알루미늄) 및 MF-59 오일 에멀젼(0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.5% 소르비탄트리올레이트. 스쿠알렌(5.0%) 수성 에멀젼)이 독감 백신에 바람직하게 활용되는 아쥬반트이다. 다른 아쥬반트로는 물 에멀젼을 포함한 미네랄, 야채 또는 피쉬 오일, Freund's 아쥬반트, E. Coli J5, 덱스트란 설페이트, 산화철, 알긴산 나트륨, Bacto-아쥬반트, Carbopol(BF Goodrich Company, Cleveland, Ohio), 폴리-아미노산 및 아미노산 공중합체, 사포닌, 카라기닌, REGRESSIN(Vetrepharm, Athens, Ga.), AVRIDINE(N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸)-프로판디아민), O-아세틸화된 그룹으로 산재된 긴 사슬 다분산(polydispersed).베타.(1,4) 연결된 만난 폴리머(e.g. ACEMANNAN), 비병원성의 마이코박테리아 변종에서 유래한 단백질이 제거된 고도로 정제된 세포벽 추출물(EQUIMUNE, Vetrepharm Research Inc., Athens Ga.), 만니트 모노올리에이트, 파라핀 오일 및 무라밀 디펩티드가 있다. 당업자는 적합한 아쥬반트를 선택할 수 있을 것이다.
면역성 조성물의 유효량은 의도된 목표, 예를 들면 사람 또는 사람이 아닌 개체의 백신 예방 접종에 기초하여 정해진다. 적절한 용량은 개체의 특성, 예를 들면, 개체가 사람인지의 여부, 나이, 체중 및 개체의 조건 또는 상태에 관한 건강 고려사항, 방식, 투여 경로 및 회분 수 및 약학적 조성물이 핵산 또는 바이러스를 포함하고 있는 지의 여부에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 면역성 조성물은 독감 항원 또는 독감 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 목적으로 투여될 것이다. 따라서 1회분은 재조합 아데노바이러스의 면역학적으로 유효한 양이다.
독감 항원을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 전형적인 용량은 10 p.f.u. 에서 105 p.f.u./투여 이다. 예를 들면, 약학적 조성물은 재조합 아데노바이러스의 약 100 p.f.u.부터 이며, 예를 들면, 1 회분에 각각 재조합 아데노바이러스 약 1000 p.f.u., 약 10,000 p.f.u. 또는 100,000 p.f.u.를 포함한다. 선택적으로 약학적 조성물은 투여시 최소 약 100만 이상을 포함한다. 예를 들면, 특정 독감 항원을 발현하는 재조합 아데노바이러스 약 107, 108, 109 또는 1010 p.f.u.를 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 일부의 경우에 단일 아데노바이러스를 투여한다면, 다수의 독감 항원을 발현하는 재조합 바이러스가 투여될 때 더 많은 용량의 바이러스가 개체에 투여된다. 또한, 상이한 독감 항원을 발현하는 몇몇의 아데노바이러스 각각이 투여될 때 바이러스 총 용량이 108 이상 또는 109 또는 1010 p.f.u. 이상임에도 불구하고 더 적은 각각의 바이러스가 투여된다.
또한, 아데노바이러스 벡터(핵산 벡터)가 투여될 수 있다. 예를 들면, 독감 항원을 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 핵산 백신을 투여할 때, 핵산 흡수 및/또는 발현 촉진제로 부피바카인, 카디오독소(cardiotoxin) 및 수크로오스 등이 포함되고 핵산 물질을 전달하기 위해 사용되는 리포솜 또는 지질 조합제 등의 트랜스펙션 촉진 매개체가 포함될 수 있다. 음이온 및 중성의 리포솜이 널리 이용되고 핵산 분자 전달로 잘 알려져 있다(Liposomes : A Practical Approach, RPC New Ed., IRL Press, 1990). 또한, 양이온 지질 조합제가 핵산 분자 전달에 이용되는 매개체라는 것은 잘 알려져있다. 적합한 지질 조합제는 LIPOFECTIN®의 DOTMA(N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드)와 DOTAP(1,2-비스(올레일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판)가 포함된다(Felgner et al ., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 84:7413-7416, 1987; Malone et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 86:6077-6081, 1989; U.S. Pat. Nos. 5,283,185 and 5,527,928, and International Publication Nos WO 90/11092, WO 91/15501 and WO 95/26356 참조). 이들 양이온 지질은 바람직하게는 중성 지질 예를 들면, DOPE(디올레일포스파티딜에탄올아민)과 결합시켜 사용한다. 또한, 상기 지질 또는 리포솜 조합제에 첨가되는 트랜스펙션-촉진 조성물에는 스페르민(spermine) 유도체(국제 공개 번호 WO 93/18759 참조) 및 GALA, 그라미시딘 S 및 양이온 담즙염 등의 막투과 화합물(국제 공개번호 WO 93/19768 참조)이 포함된다.
또한, 조류 독감 바이러스 유전자를 코딩하는 핵산(아데노바이러스 벡터)은 캡슐에 넣고, 특정 담체에 흡착하거나 결합시킬 수 있다. 적합한 특정 담체에는 폴리(락테이트) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드)에서 유래한 PLG 미세입자 뿐 아니라 메타크릴산폴리메틸 폴리머에서 유래한 것을 포함한다(Jeffery et al ., Pharm . Res. 10:362-368, 1993, 참조). 다른 특정 시스템과 폴리머가 사용되며, 예를 들면, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 스페르민, 스페미딘 및 이들 분자의 컨쥬게이트가 있다.
따라서 제형화된 백신 조성물은 면역 반응을 일으키기에 충분한 양의 조류 독감 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노바이러스를 함유한 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 플라스미드)를 포함할 것이다. 적절한 유효량은 당업자가 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 그러한 양은 통상적인 시도을 통해 결정되는 범위를 쉽게 넓힐 것이다. 예를 들면, 기타 투여에서 DNA 2 mg가 사용되는 반면, 면역반응은 DNA 1 ㎍과 같이 작은 양을 사용하여 얻을 수 있다. 일반적으로 게놈 절편을 포함한 폴리뉴클레오티드의 유효량은 약 10 ㎍ 내지 1 mg 이지만, 이 범위 이상 및 이하 또한 유효할 수 있다.
아데노바이러스 벡터 핵산은 당업계에 알려진 다양한 기법을 이용하여 담체 입자(예를 들어 핵심 담체)에 코팅된다. 담체 입자는 적절한 입자-매개 전달 장치로부터 세포내 전달에 이용되는 입자 크기 범위 내에 적당한 밀도를 가진 재료로부터 선택된다. 최적의 담체 입자 크기는 목표 세포의 직경에 의존할 것이다. 또한, 콜로이드 골드 입자가 사용되며, 코팅된 콜로이드 골드는 조직(피부 또는 근육 등)에 투여(예를 들며, 주사)된 후 면역 적합 세포에 의해 흡수된다.
텅스텐, 금, 백금 및 이리듐 담체 입자가 사용될 수 있다. 텅스텐 및 금 입자가 바람직하다. 텅스텐 입자는 직경 0.5 내지 2.0 ㎛가 용이하게 사용가능하다. 상기 입자가 입자 가속 전달 방식에 적합한 밀도를 가지고 있고 DNA에 매우 효과적으로 코팅되더라고 텅스텐은 몇몇 세포형태에 유독할 수 있다. 금입자 또는 미정질의 금(Engelhard 사(East Newark, N.J)에서 구입한 골드 파우더 A1570)이본 발명의 방법에서 사용될 것이다. 금입자는 크기가 균일하고(Alpha Chemicals 사에서 구입한 직경 1-3 ㎛ 또는 Degussa, South Plainfield, N.J.사에서 구입한 직경 0.95 ㎛), 독성이 적다.
금 또는 텅스텐 입자에 DNA 또는 RNA를 코팅하거나 침전시키기 위한 여러가지 방법이 알려져 있다. 대부분의 그런 방법은 소정 양의 금 또는 텅스텐을 플라스미드 DNA, CaCl2 및 스페르미딘과 결합시킨다. 코팅과정 동안 반응 혼합액이 균일하도록 계속 와동(vortexing) 시킨다. 핵산을 침전시킨후, 코팅된 입자를 적합한 멤브레인에 옮기고 사용하기 전에 건조시키고 시료 모듈 또는 카세트 표면에 코팅하거나 유전자 총과 같은 적합한 입자 전달 기구에 사용하기 위한 전달 카세트에 로딩한다. 또한, 핵산 백신은 경피 투여 패치 등을 사용하여 점막 또는 피부를 통해 투여한다. 상기 패치는 침윤제, 화학제 및 개체 세포에 핵산을 통과시키기 위한 피부를 투과하는 성분을 포함할 수 있다.
항원의 확산에 집중하거나 지연시킴으로써 비특이적 방식의 면역반응을 강화하거나 향상시키는 아쥬반트 뿐만 아니라, 유전자 면역증강 인자가 항 조류 독감 면역반응을 향상시키기 위해 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스와 함께 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들면, 몇몇의 CpG 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 5'-tccatgagcttcctgatcct-3'(서열번호 1); 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'(서열번호 2) 및 5'-tgactgtgaacgttcgagatga-3'(서열번호 3))가 항원과 결합시켜 투여하면 강력한 면역증강 분자가 되는 것으로 증명된 바 있다. CpG 올리고뉴클레오티드의 예는 본 명세서에 삽입된 공개물인 미국특허 등록 제 6,610,661; 6,589,940 및 6,514,948호에 개시되어 있다. 올리고뉴클레오티드를 함유하는 CpG는 Toll-like receptors(TLR 7 및 TLR9 등)과 상호작용하여 인터페론 감마(IFN-γ)를 생성하여 항바이러스 면역반응을 강화한다.
또한, TLR의 발현이 감소한 몇몇의 개체(예를 들면, 노령자)는 조류 독감 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스가 발현되는 세포에 TLR(예들 들면, TLR5, TLR7 및 TLR9)의 공동발현으로 이득을 얻을 수 있다. 또한, TLR를 포함하는 아데노바이러스가 상기 약학적 조성물에 함유될 수 있다. TLR은 독감 항원을 암호화하는 동일한 아데노바이러스 벡터와 융합되거나 별개의 아데노바이러스 벡터 또는 바이러스로 약학적 조성물(약제)에 포함될 수 있다. 선택적으로, TLR 및 그의 리간드(예를 들면, CpG 올리고뉴클레오티드, 플라겔린(flagellin)가 약학적 조성물에 함께 포함된다.
몇몇의 실시예에서, 약학적 조성물(예를 들면, 백신 조성물)은 닭, 오리, 칠면조 및 거위와 같은 가금류, 그러나 이에 제한되지 않는 조류 개체에 투여된다. 약학적 조성물은 어린조류 및/또는 성체 조류 및/또는 알(egg)내 배아에 투여할 수 있다. 백신 조성물 투여를 위한 가금산업에 활용되는 방법은 잘 알려져 있으며 그러한 방법은 본 명세서에 개시된 조류 독감 항원을 함유하는 아데노바이러스 등의 면역성 조성물을 투여하는 데 적합하다. 예를 들면, 아데노바이러스에 기초한 독감 백신은 음료수로 가금류에 투여할 수 있다. 다양한 방법이 길든 조류의 음료수에 백신을 투여하는데 이용된다. 하나의 편리한 방법으로, 면역성 조성물을 함유한 용액을 하나 이상의 급수기에 연결된 정맥내 용액 가방(예를 들면, 프랑스, 라용, 머티리얼 인코포레이션사의 SELECT FIELD BAG BOOSTTM system 시스템)에 넣는다. 선택적으로 용액은 염료(또는 다른 시각적으로 탐지할 수 있는 지시약, 예를 들면 탈지분유)를 백신 투여 모니터링을 용이하게 하기 위해 희석제와 함께 포함한다. 아데노바이러스에 기초한 백신의 경우, 용액이 살균제, 예를 들면 전달 시스템을 제거하는데 사용하는 염소 또는 다른 살균제를 포함하지 않는 것이 중요하다. 바람직하게 조류의 식음 활동을 백신/물 용액의 소비를 증가시키기 위해 자극할 수 있다. 예를 들면, 조명 염격도 증가, 음식 전달 및/또는 조류 방해(예를 들면, 무리지어 걷게 함)로 조류가 백신을 충분히 가진 음료수 소비를 늘리도록 자극한다.
또 다른 방법으로, 백신 조성물을 스프레이로 투여한다. 일반적으로 스프레이 적용은 공동 공간에 거주하는 많은 새에게 수행할 수 있으며, 예를 들면 스프레이 투여는 운송 박스내에 하루 키운 새에게 수행하거나 통상적인 보호물에 들어있는 새에게 수행한다. 예를 들면 새로 부화된 새는 본 명세서에 참조로 삽입된 미국 특허등록 제 6,713,07, 4,674,490 및 4,449,968호에 기재된 스프레이 전달 시스템을 사용하여 백신 접종할 수 있다. 하나의 구체적인 방법으로, 운송 박스에 들어 있는 하루 키운 새를 그룹으로 대략 150 마리를 매우 작은 물방울(예를 들면, 약 100 μ 내지 500 μ 직경)을 형성하는 스프레이 노즐에 의해 전달되는 물과 같은 수성 매체로 희석된 백신에 노출하였다. 백신은 컨테이너 표면 및 다른 새로부터 구강을 통해서 뿐 아니라 안구, 비강을 통해 하루 키운 새에 흡수된다. 백신은 더 많이 키운 새에 스프레이 투여, 예를 들면 가압 스프레이 장치 또는 조절된 물방울을 이용하는 장치를 사용하여 전달될 수 있다. 가압 스프레이 장치는 일반적으로 압력챔버, 창(lance) 및 노즐을 포함한다. 노즐과 작동 압력은 보통 10 μ 내지 1000 μ 범위의 입자크기를 변경하기 위해 바뀐다. 물방울은 흡입, 안구 또는 구강 경로를 통해 노즐 방출에 의해 직접 새에 닿거나 땅에 놓인 백신 또는 스프레이 장치에 의한 다른 새와의 접촉에 의해 간접적으로 닿는다. 백신 조성물의 스프레이 투여를 위한 장치는 용이하게 입수할 수 있으며 장치의 예가 본 명세서에 참조로 삽입된 미국 특허등록 제 5,312,353호 및 제 4,863,443호에 개시되어 있다. 원예 및 곤충 통제 이용을 위해 개발된 조절된 물방울을 이용한 장치는 가금류에 아데노바이러스에 기초한 백신을 전달하는데 이용될 수 있다. 그러한 장치로, 희석된 백신이 흡입에 의한 흡수에 적합한 크기를 가진 분무된 백신 스프레이를 형성하는 회전원판에 전달될 때 스프레이가 원심력에 의해 생성된다. 상기 분무된 백신은 가압 스프레이 장치에 의해 뿌려지는 것보다 더 넓은 범위에 백신을 뿌리는 팬에 의해 살포될 수 있다. 이러한 과정은 상대적으로 적은 부피의 희석액(예를 들면, 물)이 필요하다는 장점이 있다. 예를 들면, 30,000마리의 새를 약 1리터의 백신 용액을 가지고 백신 접종할 수 있다.
상기 방법 외에 가금류에 면역성 조성물을 투여하는 더욱 침해적이고 힘든 과정을 이용할 수도 있다: 안약, 고정 및 난절법(윙웹 이나 발의 피부 경로를 통한), 주사 및 알내 투여. 가금에 백신을 전달하는 적합한 자동화 및 반 자동화 주사 장치는 본 명세서에 참조로 삽입된 미국 특허등록 제 4,681,565호 및 제 4,515,590호에 기재되어 있다.
조류 독감 항원을 포함한 아데노바이러스의 알내 투여는 가금류의 독감에 대한 보호성 면역반응을 유도하는데 바람직하게 사용된다. 일반적으로 알내 투여는 부화하기전에 면역 적합한 잉태중 적절한 단계에 알에 하나 이상의 조류 독감 바이러스 항원을 함유한 면역학적으로 유효한 양의 아데노바이러스를 주사하는 것을 포함한다. 예를 들어, 계란은 배양 17.5일과 19일 사이에 주입된다. 부피는 알 본래의 모습을 붕괴시키지 않도록 0.01과 0.l ml 사이의 범위(예를 들면, 0.05 ml)로 한다. 일반적으로 알 껍데기에 작은 구멍을 만들어 면역성 조성물을 전달하도록 주사 바늘을 삽입한다. 주사는 손으로 또는 제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용가능한 자동화 기계의 도움(예를 들면, Embrex(Triangle Park, N.C.)사의 기계)으로 수행한다. 백신 조성물을 투여하기에 적합한 가금 알에 용액의 알내 투여를 위한 방법과 장치는 본 명세서에 참조로 삽입된 미국 특허등록 제 4,903,635, 5,056,464, 5,136,979, 5,699,751, 5,900, 929, 6,032,612, 6,244,214 및 6,981,470 호에 기재되어 있다.
도 1A는 HAd5-H5HA 벡터를 나타내는 그림이다. Cre 재조합효소-매개 부위-특정 재조합 시스템은 조류 독감 바이러스(H5N1) A/HK/156/97의 HA를 발현하는 HAd5 벡터를 제조하는데 이용된다. CMV 프로모터의 대조군 하에서 HA 유전자는 수송 벡터(3.1 kb E1 결실을 가지는 HAd5(4kb)의 왼쪽 끝, Cre 재조합효소 존재 하에서 부위 특정 재조합에 대한 loxP 부위 및 pDC311-H5를 생산하기 위한 완전한 패키징 신호를 포함하는 pDC311-플라스미드) 내 Stul 부위에 삽입되었다. 293 Cre 세포들(Cre 재조합효소를 발현하는 293 세포들)은 HAd-H5HA 벡터를 제조하기 위해 pDC311-H5HA 및 pBHGlox△E1, 3Cre(패키징 신호를 제외한 거의 모든 HAd5 게놈, E1 및 E5 결실, Cre 재조합 효소의 존재 하에서 부위 특정 재조합에 대한 loxP를 포함하는 플라스미드)로 함께 트랜스펙트된다.
도 1B는 HAd5-H5HA 벡터에 의해 암호화하는 헤마글루티닌(HA)의 발현을 보여주는 웨스턴블롯을 나타내는 그림이다. HAd5-H5HA는 감염된 세포에서 HA를 효율적으로 발현하였다. A는 HAd-H5HA 벡터에서 H5-HA 유전자 카세트의 구조 및 B는 HAd-H5HA 벡터로 감염된 세포에서 H5HA 발현을 나타내는 그림이다. 293 Cre 세포들은 HAd-△E1E3 또는 HAd-H5HA로 가장(mock)-감염된 또는 감염된 것이다. 상기 세포들은 감염 24시간 후 얻었고 세포 추출물이 제조되었다. 세포 추출물은 H5HA를 암호화하는 DNA 벡터를 가지는 면역성의 래빗에 의해 생성되는 래빗 H5HA-특정 혈청을 이용하여 웨스턴블롯에 의해 분석되었다.
도 2는 HAd-H5HA 벡터는 고도의 병원성 동형타입의 H5N1(A/HK/483/97) 바이러스에 대한 완벽한 보호를 제공하는 것을 나타내는 그래프이다. 25(6-8주 나이) 암탉 BALB/c 마우스들은 5그룹(5마리/1그룹)으로 나누었고, 각각 PBS(□), 명반 없이 재조합 H5HA(배큘로바이러스에서 발현된 조류 HK/156/97 독감 바이러스의 헤마글루티닌)의 10㎍(◇), 명반 있는 정제된 H5HA의 10㎍(×), HAd-△E1E3의 108 p.f.u.(△) 또는 HAd-H5HA의 108 p.f.u.(■)으로 0 및 28일에 근육 내로 접종되었다. 동물들은 70일에 H5N1(A/HK/483/97)의 100 LD50으로 접종되었다. 마우스들은 접종 후 14일까지 매일 임상적 징후 및 체중의 변화를 모니터하였다.
도 3A 내지 3C는 HAd-H5HA 백신으로 면역화된 마우스에서 동형 및 이형 조류 독감 바이러스 변종에 대한 항체 반응의 무력화의 IQR 및 범위를 보여주는 박스 위스커 블롯(Box-whisker blot)을 보여주는 그래프이다. (A)HK/156/97,(B)HK/213/03 및 VN/1203/04 변종, *, # 및 $: 표시된 데이터 사이 차이는 p=0.001, im : 근육 내 면역, 및 in : 비강 내 면역.
도 4는 HAd-H5A 백신으로 면역화된 마우스들에서 HA-518-에피토프-특정 CD8 T 세포들의 유도를 보여주는 유세포분석의 산점도(scatter plot)를 나타내는 그래프이다. 면역화된 마우스들(그룹당 3마리)로부터 비장 세포의 유세포분석을 위해, HA 518 펜타머 에피토프로 염색하였다. 펜타머-양성 세포들(원형으로 된)은 CD8 T 림프구군의 퍼센티지로 보여준다.
도 5는 HA-518-에피토프-특정 CD8 T 세포들에 의해 인터페론 감마(IFN-γ) 분비를 나타내는 막대 그래프이다. ELISpot은 면역화된 마우스들의 비장 세포들에서 인터페론 감마를 측정하였다. 데이터는 유효 및 SD(에러바)를 나타낸다. im= 근육 내 면역, in=비강 내 면역. 배양은 NP147 -155(사선의 윗쪽 막대), HA(흰 막대) 또는 PMA(Phorbol myristate acetate)+이오노마이신(검은 막대).
도 6은 최근의 H5N1 바이러스들에 대한 보호를 보여주는 그래프이다. BALB/C 마우스들(15마리/그룹)은 HAd-H5HA의 108 p.f.u.으로 4주 간격에 2번씩 근육 내 접종(●) 또는 비강 내 접종(○)되었다. HAd-△E1E3는 음성 대조군으로 제공하였다. A 및 B 또는 C 및 D는 각 그룹에서 5마리를 A/HK/483/97 또는 A/VN/1203/04로 2차 면역한 4주 후에 접종되어 각각의 50% 치사량(LD50)을 나타내고, E는 A/HK/213/03로 2차 면역한 4주 후에 접종되어 50% 마우스 감염량(MID50)을 나타내는 그래프이다. 퍼센트 초기 체중(A 및 B) 및 생존한 후 접종(C 및 D)을 보여준다. 에러바는 유효의 표준 오차를 나타낸다. A/HK/483/97 또는 A/VN/1203/04로 시도된 마우스들은 접종 후 14일까지 매일 임상적 징후 및 체중의 변화를 모니터되었다. A/HK/213/03로 접종된 마우스들은 3일 후 안락사시켰고, 폐들은 모았다. 조직은 얼렸고, 한번 녹인 후 항생물질을 포함한 1㎖ PBS에서 균질화되었다. 균질 현탁액은 11일 된 알에서 바이러스 감염성에 대한 적정 농도가 되기 전에 고체 잔해들은 원심분리에 의해 작은 알로 만들었다.
도 7A 내지 7D는 돼지 및 소 아데노바이러스 벡터로부터 조류 독감 헤마그루티닌의 발현을 나타내는 개략도(A 및 C) 및 웨스턴블롯의 이미지(B 및 D)를 나타내는 그림이다. PAd 게놈의 초기 부위(E1)에 삽입된 초기 프로모터에 인접한 사이토메갈로바이러스(CMV)의 대조군 하에서 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스(A/HK/156/97)의 헤마토글루티닌 서브타입 5(H5HA)을 운반하는 PAd 벡터(PAd-H5HA)가 제조되었다. 도 7A는 PAd 벡터의 구조를 나타내는 개략도이다: PAd-△E1E3(E1 및 E3 결실을 포함하는 PAd). ITR, inverted terminal repeat); △E1, E1 결실; △E3, E3 결실; H5, H5HA; 및 pA, 시미언바이러스 40 아데닌 다중화 신호(simian virus 40 polyadenylation signal). 도 7B는 FPRT HE1-5 세포들이 PAd-△E1E3 또는 PAd-H5HA로 가장 감염 또는 감염되었고, 감염 24시간 후, 세포들은 채취하고 세포 추출물은 H5HA에 대한 래빗 초면역 혈청(Hyperimmune Serum)을 이용하 여 웨스턴블롯에 의해 분석된 것을 나타낸다. BAd 게놈의 초기 부위 1(E1)에 삽입된 초기 프로모터에 인접한 사이토메갈로바이러스(CMV)의 대조군 하에서 H5N1 인플루엔자 바이러스(A/HK/156/97)의 헤마토글루티닌 서브타입 5(H5HA)을 운반하는 BAd 벡터(BAd-H5HA)가 제조되었다. 도 7C는 BAd 벡터의 구조를 나타내는 개략도이다: BAd-△E1E3(E1 및 E3 결실을 포함하는 BAd). ITR, inverted terminal repeat); △E1, E1 결실; △E3, E3 결실; H5, H5HA; 및 pA, 시미언바이러스 40 아데닌 다중화 신호(simian virus 40 polyadenylation signal). 도 7D는 FBRT HE1 세포들이 BAd-△E1E3 또는 BAd-H5HA로 가장 감염 또는 감염되었고, 감염 24시간 후, 세포들은 채취하고 세포 추출물은 H5HA에 대한 래빗 초면역 혈청(Hyperimmune Serum)을 이용하여 웨스턴블롯에 의해 분석된 것을 나타낸다.
도 8A 내지 8B는 트랜스펙트된 세포에서 돼지 및 소의 E1 유전자들의 발현을 보여주는 그림이다. 도 8A는 BAd3 E1A, E1B-19 kDa(E1B-1), 및 E1B-55 kDa(E1B-2)의 발현은 특정 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR에 의해 탐색되는 것을 나타낸다. 도 8B는 PAd3 E1A, E1B-19 kDa(E1B-1), 및 E1B-55 kDa(E1B-2)의 발현은 특정 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR에 의해 탐색되는 것을 나타낸다. 특정 밴드들은 화살표로 나타내었다.
< 실시예 1> 조류 헤마글루티닌 ( hemagglutinin , HA ) 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 제조
상동성 재조합은 조류 H5HA 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 일례를 생산하기 위해 이용된다. Ng 등(Human Gene Therapy 10:2667-2672, 1999) 의 Cre 재조합효소-매개 부위 특이적 재조합 시스템이 조류 HA 항원을 포함한 HAd5 벡터를 제조하기 위해 활용된다. H5N1 독감 변종의 HA 항원을 발현하는 HAd5 E1 삽입 벡터를 제조하기 위하여, 사이토메갈로 바이러스 최조기 프로모터("CMV" 프로모터)의 조절하에 A/HongKong/156/97 변종의 HA 유전자를 셔틀 벡터(pDC311)의 StuⅠ 부위에 삽입한다. pDC311 셔틀 벡터는 3.1 kb E1 결손, Cre 재조합효소 및 온전한 패키징 신호(Ψ) 존재 하에 부위 특이적 재조합을 위한 loxP 부위를 가진 HAd5의 왼쪽 말단(약 4kb)을 포함하는 플라스미드이다. 벡터 pDC311-H5는 pBHGlox△E1,3Cre와 함께 293 Cre(Cre 재조합효소를 발현하는 293 세포)에 공동 트랜스펙션된다. pBHGlox△E1,3Cre 플라스미드는 패키징 신호를 제외한 거의 모든 HAd5 유전자 및 E1 및 E3 부위 유전자의 결손을 포함한다. 또한 상기 플라스미드는 Cre 재조합효소 매개 재조합을 위한 loxP 부위를 포함한다. 293 Cre 세포에 함께 도입될 때, 두 개의 플라스미드 사이의 Cre 매개 재조합으로 HAd5-HA 벡터가 생성된다(도 1A). 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과, 세포 추출액은 도입된 조류 HA 항원이 발현되는 것으로 나타났다(도 1B).
< 실시예 2> HAd - H5 면역화된 동물에서 면역원성 및 보호성 효능
조류 HA를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 면역원성을 확인하기 위하여, 마우스를 재조합 아데노바이러스로 접종하고 치사량의 조류 독감 바이러스의 면역 성을 테스트하였다. 25마리의 6-8 주령 암탉 C57BL/6 마우스를 무작위로 그룹당 5마리로 다섯 그룹으로 나누었다. 상기 동물을 PBS, 알룸을 흡착하지 않은 15 ㎍ 재조합 H5(배큘로바이러스에 발현된 조류 H5N1 독감 바이러스의 헤마글루티닌), 알룸을 흡착한 15 ㎍ H5(H5 + alum), 108p.f.u.의 HAd-△E1E3(HAd5 대조 벡터) 또는 108 p.f.u.의 HAd-H5(H5를 발현하는 HAd5 벡터)에 1일과 28일에 근육내 주사하였다. 혈청 시료를 21일과 49일에 회수하여 ELISA 및 미세중화법(micro-neutralization assay)으로 H5-특이적 면역 반응을 모니터하였다. 70일째 동물을 100 LD50의 H5N1(A/HK/483/97)바이러스을 투여하여 체중의 증가 또는 감소 및 독감 감염에 대한 명확한 임상적 증상을 매일 모니터하였다.
HAd-H5의 단일 접종은 21일째에 3.5 로그에 대해 H5-특이적 IgG ELISA 역가를 유도하여 HAd-H5에 의해 발현된 H5의 면역원성이 가장 높음을 보여주었다. 혈청 시료를 회수하여 바이러스 중화법으로 H5N1 바이러스 중화 항체 반응의 생성을 모니터하였다. HAd-H5를 가진 마우스의 면역은 많은 양의 H5 + 알룸으로 얻어지는 것과 비슷한 H5N1-특이적 중화 항체 반응을 유도하였다(표 1).
HAd-H5로 면역이 유도된 마우스는 병원성의 H5N1 바이러스로 면역성 테스트한 결과 병적상태 및 폐사에 대해 완전히 보호되었다. 70일에 100 LD50의 H5N1(A/HK/483/97)바이러스을 동물에 투여하여 면역성을 테스트하였다. 보호수준은 다량의 재조합 H5 + 알룸에서 관찰된 것보다 더 좋았다(표 1 및 도 2). HAd5- H5를 투여한 경우, 어떠한 마우스에서도 투여후 시각적으로 불편한 부분은 발견되지 않았다.
HAd-H5HA 백신으로 면역유도된 마우스에서 혈청학상의 반응
그룹 Geometric Mean Horse HI titers Geometric Mean Neutralization Titers Survival
PBS 25 20 0
HAd -5(10 8 p.f.u.) i.m. 25 20 0
HAd - H5HA( 10 8 p.f.u.) i.m. 696.4 2228 100
rH5HA + alum i.m. 696.4 2228 100
rH5HA i.m. 37.9 60 80
< 실시예 3> HAd5 - HA 의 비강내 투여로 보호성 면역반응이 일어난다.
HAd-H5HA 벡터가 HA에 특이적인 항체 반응을 유도하는 능력은 근육내 및 비강내 투여를 통해 측정하였다. 셋 세트의 15마리(6 내지 8 주령) 암탉 BALB/c 마우스를 무작위로 3 그룹(5 동물/그룹)으로 나누어 0일과 28일에 108 p.f.u.의 HAd-△E1E3에 근육내 주사하거나 108 p.f.u.의 HAd-H5HA를 근육내 또는 비강내 투여하였다. 21일과 49일에 혈청을 회수하여 말 적혈구를 이용한 HI(hemagglutination inhibition) 분석을 통해 A/HK/483/97, A/HK/213/03 및 A/VN/1203/04 변종에 대한 H5-특이적 면역 반응의 발생을 모니터하였다. HAd5-H5HA의 근육내 또는 비강내 투여는 표 2에서 보는 바와 같이 ELISA에 의한 강한 HA 항체 역가를 유도하였다.
HAd5-HA 백신에 의해 유도된 상동 및 새로운 H5 변종에 대한 역가
그룹 A/HK/156/97 A/HK/213/03 A/VN/1203/04
1st bleed 2nd bleed 1st bleed 2nd bleed 1st bleed 2nd bleed
벡터 대조군 5 5 5 5 5 5
HAd5-H5 i.m. 95 189 21.4 23.1 14.1 18
HAd5-H5 i.n. 146 218 36.4 36.4 18.2 18
유사하게는 바이러스 중화법 BALB/c 마우스(그룹당 20 마리)가 1×108 p.f.u.의 HAd-H5HA로 4주마다 2회에 근육내 또는 비강내 투여하여 면역성을 주었다. 다른 그룹의 마우스(그룹당 20 마리)에 알룸이 흡착된 108 p.f.u.의 HAd-△E1E3 또는 3 ㎍의 rH5HA를 근육내 투여하여 면역성을 주었다. 혈청 시료를 두 번째 면역 유도 4주 후에 회수하여 바이러스 중화법으로 상동성 바이러스(HK/156/97) 또는 항원의 기원이 서로 다른 바이러스(A/Hong Kong/213/2003[HK/213/03] 및 A/Vietnam/1203/04[VN/1203/04])와 반응하는 능력을 측정하였다. HK/156/97에 비해, 헤마글루티닌 서브유닛의 아미노산 상동성은 HK/213/03의 경우 94.8%이고 VN/1203/04의 경우 95.5%이다. 실시예 결과는 도 3에 도시되어 있다. rH5HA + 알룸으로 면역이 유도된 마우스는 상동성의 HK/156/97 바이러스에 대한 높은 바이러스 중화 항체 역가를 보였으나 HK/213/03 또는 VN/1203/04 바이러스를 중화하지는 못하였다. 대조적으로, HAd-H5HA로 면역이 유도된 마우스는 상동성과 이종성의 바이러스에 대한 중화항체를 생산하여 HK/156/97에 대한 더 높은 중화 항체 역가와 이종성의 HK/213/03 또는 VN/1203/04 바이러스에 대한 더 낮은 항체 역가를 보였다.
< 실시예 4> HAd5 - H5 백신 접종은 HA -특이적 T 세포 반응을 유도한다.
HAd-H5HA 백신이 HA-특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하는지 측정하기 위하여, BALB/c 마우스를 108 p.f.u의 HAd-△E1E3 또는 108 p.f.u의 HAd-H5HA를 근육내 또는 비강내 투여하여 독감 에피토프에 대한 비장의 T 세포 반응을 원래 H1N1 바이러스, A/Puerto Rico/8/34의 HA에 대해 표시되는 면역원성의 HA518(HA518 -526)에 대한 Kd-특이적 펜타머(pentamer)를 염색함으로써 측정한다. 상기 에피토프는 현재 순환하고 있는 조류 및 인간 H5N1 바이러스를 포함한 H5N1 바이러스 뿐 아니라 H9N2 변종과 같은 다른 바이러스에서도 널리 보존되어 있다. 정맥내(i.n.) 또는 근육내(i.m.) HAd-H5HA 벡터를 가진 마우스는 HAd-△E1E3으로 면역이 유도된 마우스보다 최소 3 내지 8배 더 많은 수의 HA-특이적 CD8+ T 세포를 가졌다(도 4). NP-147(NP147-155)-에피토프 특이적 CD8+ T 세포의 증가가 HAd-H5HA 백신으로 면역이 유도된 동물에서 관찰되지 않았다. 대조적으로, H5N1 바이러스에 감염된 대조 마우스는 강한 NP 147 에피토프-특이적 CD8+ T 세포 반응을 보였다. HAd-△E1E3 또는 rH5HA + 알룸으로 백신 접종된 마우스는 HA518 에피토프-특이적 CD8+ T 세포 빈도수가 증가하였다.
에피토프 특이적 T 세포 반응은 10 ㎍/ml의 설계된 펩티드(MHC 클래스 Ι 결합 에피토프 포함: H5N3 감염 동물에서 우성 에피토프인 NP147 및 HA462 및 HA518)로 면역반응시킨 감마를 조사한 공통유전자의 비장 세포로 1×106 비장 세포를 자극함으로써 정해진다. PMA+이노마이신(ionomycin)을 양성 대조군으로 사용하였다. IFN-γ 생산은 도 5에서 보는 바와 같이 ELIspot 분석으로 측정하였다. HAd5-H5 백신접종은 HA의 클래스 ΙMHC 결합 에피토프에 대한 HA-특이적 T 세포 반응을 유도하였다. 상기 T 세포 반응은 재조합 H5 + 알룸을 접종한 동물에서는 관찰되지 않았다.
< 실시예 5> HAd5 - H5HA 백신 접종은 치명적 감염( challenge )을 방어한다.
근육내 또는 비강내 투여 경로에 의한 HAd5-H5HA 백신 접종된 동물은 상동성 변종 바이러스 및 최근 조류 독감 변종으로 면역성을 주었다. 백신 접종후 마우스를 100 LD50 A/HK/156/97 또는 A/HK/1203/04 변종 바이러스로로 감염시켰다. 표 3에서 보는 바와 같이, 모든 백신 접종된 동물이 상동성 바이러스 또는 다른 H5N1 바이러스 변종으로 치명적 면역성 테스트에서 생존하였다.
HAd-H5HA가 치명적 감염을 방어한다.
그룹 하기 바이러스 투여에 대한 생존율(%)
A/HK/156/97 A/VN/1203/04
벡터 대조군 0 0
HAd-H5HA i.m. 100 100
HAd-H5HA i.n. 100 100
< 실시예 6> A/ HK /483/97 또는 A/ VN /1203/04 바이러스로 감염된 동물의 병적상태
다양한 H5N1 변종 감염에 대한 방어능을 측정하기 위하여, HAd-H5HA로 면역화된 마우스를 HK/483/97, HK/213/03 또는 VN/1203/04 바이러스로 감염시켰다. 유독한 HK/483/97 및 VN/1203/04 변종과 달리, HK/213/03 바이러스는 마우스에 매우 치명적이지는 않다. 따라서, HK/213/03에 대한 백신 효능을 측정하기 위해서 감염 4일 후에 HK/213/03 감염된 동물 폐의 바이러스 역가를 측정하였다. HAd-H5HA로 정맥내 또는 근육내 마우스의 면역주사는 최소의 병적 상태를 보였고, HK/483/97 바이러스 감염 후 폐사를 완전히 방어하였다(도 6A 및 B). HAd-H5HA를 둘 중 하나의 접종 경로로 백신 접종한 모든 마우스는 생존하였고 최근의 H5N1 바이러스, VN/1203/04로 치명적 감염후 체중 감소를 측정한 바와 같이 적은 병적상태를 보였다(도 6C 및 D).
또한, 어느 하나의 접종 경로로 HAd-H5HA 백신 접종되고 HK/213/03 바이러스로 감염된 마우스는 감염 4일 후에 폐에서 바이러스를 탐지할 수 없었던 반면(도 6E), 대조군 벡터인 HAd-△E1E3 백신 접종된 마우스는 평균 106 EID50/ml 이상의 폐 바이러스 역가를 가졌다(p〈0.001). 따라서, HAd-H5HA 백신은 낮은 농도의 교차 중화 혈청 항체 역가의 존재하에서도 이종성의 H5N1 바이러스에 대한 상당한 방어능을 유도하였다.
상기 데이터는 유행성 독감 백신으로 조류 독감 항원의 Ad 벡터-기초한 전달의 잠재력을 확인시켜 준다. 상기 벡터는 강한 체액성 및 세포성 면역을 유도하고 아쥬반트 필요없이 계속 진화하는 H5N1 바이러스에 대한 교차 방어능을 부여한다.
< 실시예 7> H5N1 독감 바이러스의 HA 를 발현하는 비인간 벡터의 제조 및 특징
E1이 삽입되거나 되지 않은 E1 및 E3 부위 결손된 비인간 아데노바이러스(돼지 아데노바이러스 타입 3, PAd3 또는 소 아데노바이러스 타입 3, BAd3)의 게놈 전체를 포함하는 감염 클론을 E. coli BJ5183에서 상동 재조합으로 제조하였다. CMV 프로모터 및 소 성장 호르몬 BGH 폴리아데닐화 신호 측면의 H5N1의 HA 유전자를 AvrⅡ 부위에서 pDS2(Bangari & Mittal, Virus Research 105:127-136, 2004) 에 클로닝하여 pDS-H5를 얻었다. 소 아데노바이러스에 관하여 van Olphen & Mittal,(J. Virol . Methods , 77:125-129, 1999E. coli BJ5183)에 기재된 바와 같이 E. coli BJ5183에서 상동성 재조합을 이용하여, pPAd-H5(돼지 아데노바이러스의 E1A 유전자 부위에 조류 HA 삽입된 게놈 플라스미드)는 E3-결손된 PAd3 게놈 DNA 및 StuΙ 선형화된 pDS2-H5를 가진 E. coli의 공동 형질전환으로 제조하였다.
PAd3 벡터로 부터 H5N1 독감의 HA를 생성하기 위하여, 단층 배양의 FPRT HE1-5 세포(Bangari & Mittal, Virus Res . 105:127-136, 2004에 기재된 E1 발현 돼지 세포주)를 제조사의 추천에 따른 LIPOFECTION®-매개 트랜스펙션을 이용하여 PacI-제한효소 절단된 pPAd-H5(5 ㎍/60-mm dish)로 트랜스펙션하였다. 재조합 바이러스-유도된 세포변성 효과는 감염 후 2-3주에 볼 수 있다.
PAd3 게놈의 초기 부위 1(E1)에 삽입된 H5N1 바이러스(HK/156/97)의 HA 유전자의 전장(full-length) 코딩 부위를 포함한 복제-결함 재조합 PAd3 벡터(PAd-H5HA)(도 7A)가 웨스턴 블롯팅에서 보는 바와 같이 FPRT HE1-5 세포에서 효과적으로 발현되었다(도 7B). E1 및 E3 부위의 결손을 가진 PAd(PAd-△E1E3)을 음성 대조군으로 하였다.
유사하게는, BAd3 게놈의 초기 부위 1(E1)에 삽입된 H5N1 바이러스(HK/156/97)의 HA 유전자의 전장(full-length) 코딩 부위를 포함한 복제-결함 재조합 BAd3 벡터(BAd-H5HA)(도 7C)가 도 7D에서 보는 바와 같이 BAd3 E1을 발현하는 FBRT HE1 세포(van Olphen et al ., Virology 295:108-118, 2002)에서 효과적으로 발현되었다. E1 및 E3 부위의 결손을 가진 BAd3(BAd-△E1E3)를 음성 대조군으로 하였다.
상기 비인간 아데노바이러스 벡터는 조류(및 다른) 독감 변종에 특이적인 보호성 면역반응을 유도하기 위해 사람과 사람이 아닌 개체에 투여하는 백신 벡터로 적합하다.
< 실시예 8> 아데노바이러스를 발현하는 세포주
다른 종 다형성(인간과 비인간)을 가진 아데노바이러스 벡터의 E1 항원을 발현하는 새로운 세포주를 제조하였다. 상기 다기능성 세포주는 아데노바이러스 및/또는 재조합 단백질을 생산하는 다수의 변종 유래의 바이러스에 해당하는 재조합 벡터 유래의 복제 결함 아데노바이러스의 생산을 최적화하는데 특히 유효하다.
두 가지의 다기능성 세포주를 소나 돼지 세포에서 HAd5 E1 유전자를 발현하는 상기 세포주에 기초하여 제조하였다. FBRT-HE1은 사람 아데노바이러스 변종 HAd5의 E1 유전자(서열번호 4)를 발현하는 태아 소 망막세포주이다. FBRT-HE1 세포주의 구축 및 분리는 van Olphen 등(Virology 295:108-118, 2002)에 기재되어 있다. 간단히 기술하면, 최초의 태아 소 망막(FBRT)세포는 HAd5 E1(PGK프로모터 조절하에 있는)을 포함한 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 다수의 G418-저항성 콜로니를 분리하여 웨스턴 블롯으로 E1B-19kDa 단백질의 발현을 측정하였다. 또한, E1B-19kDa을 발현하는 세포주를 면역침전법으로 E1A, E1B-19kDa 및 E1B-55kDa 발현을 테스트하였다. 대표적인 세포주로 설계된 FBRT-HE1이 모든 E1 단백질을 발현하였다:E1A,E1B-19 kDa 및 E1B-55 kDa. FBRT-HE1 세포주는 E1 결손된 소 아데노바이러스 벡터뿐 아니라 E1 결손된 인간 아데노바이러스 벡터의 성장을 지지한다.
다기능성 세포주를 생성하기 위하여, BAd3 E1을 포함하는 절편(604-3148)을 BAd E1-F(ccatgaagtacctggtcctc; 서열번호 5) 및 BAd E1-R(ccccacctatttatacccctc; 서열번호 6) 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. BAd3 E1 유전자(서열번호 7)를 포함하는 PCR 절편을 EcoRV 부위에 pPGK-puro와 KpnΙ-XbaΙ 부위에 pCMV-puro에 클로닝하여 pPGK-BE1 및 pCMV-BE1를 얻었다. 그런 다음 상기 플라스미드를 리포펙틴(Life Technologies)을 사용하여 FBRT-HE1 세포를 트랜스펙션하는데 사용한다. 트랜스펙션 48시간 후에 세포를 3 ㎍/ml 퓨로마이신을 포함한 선별 배지에서 배양하였다. pPGK-BE1 또는 pCMV-BE1가 트랜스펙션된 FBRT-HE1 세포의 항체 선별 약 30일 후에 분별있는 세포 콜로니가 관찰되었다. 24 콜로니(pPGK-BE1 또는 pCMV-BE1 트랜스펙션된 세포에서 각각 12개의 콜로니)를 회수하여 증폭한 후 특정 프라이머 세트(표 4)를 이용한 RT-PCR로 세가지 BAd3 E1 전사체(E1A, E1B-1 및 E1B-2)의 발현을 스크리닝하여 모든 세가지 BAd3 E1 전사체를 발현하는 클론을 동정하였다. 도 8A에서 보는 바와 같이 FBRT-HE1/PE1 세포 클론은 PGK 프로모터하에 세가지 BAd3 E1의 발현을 보인다.
소 E1 전사체의 RT PCR을 위한 프라이머
유전자 프라이머 서열(5'to 3')
BAd E1A(For) ctgatatcatgaagtacctggcctc (서열번호 8)
BAd E1A(Rev) atgcaatggtaggtttgg (서열번호 9)
BAd E1B-1(For) gatatcatggatcacttaagcgttc (서열번호 10)
BAd E1B-1(Rev) gtcgacaactgatgtgctcgaaacg (서열번호 11)
BAd E1B-2(For) gatatcgttcaagatcacccagag (서열번호 12)
BAd E1B-2(Rev) gtcgaccacttttaatcctgctc (서열번호 13)
유사하게, 다기능성 돼지 세포는 HAd5 E1을 발현하는 세포주에 돼지 아데노바이러스 E1(PAd3 E1)을 도입함으로써 생성된다. FPRT-HE1-5는 HAd5 E1(서열번호 4)를 발현하는 태아 돼지 망막 세포주이다. FPRT-HE1-5의 제조는 본 명세서에 참조로 삽입된 Bangari & Mittal(Virus Res . 105:127-136, 2004)에 기재되어 있다. 간략히 서술하면, 초기 태아 돼지 망막(FPRT) 세포는 사이토메갈로바이러스(CMV) 최조기 또는 포스포글리세르산키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터의 조절하에 HAd5 E1을 포함한 플라스미드로 트랜스펙션되었다. CMV 또는 PGK 프로모터 조절하에 HAd5 E1 서열로 트랜스펙션하여 얻어진 형질전환된 세포주를 선별하여 특성을 확인하였다. FPRT-HE1-5는 모든 E1 유전자를 효율적으로 발현하는 세포주의 하나이고 E1-결손된 돼지 및 사람 아데노바이러스 벡터를 생성하고 증식시키는데 이용될 수 있다.
PAd3 플라스미드는 FPRT-HE1-5 세포로 트랜스펙션하기 위해 제조하였다. pcDNA3.1(Invitrogen)의 네오마이신 ORF를 pBABE-puro(Addgene)의 퓨로마이신 ORF로 대체하여 플라스미드 pCMV-puro를 얻었다. 플라스미드 pcDNA3.1-puro의 CMV 프로모터 서열을 pGT-N28(New England Biolabs)의 PGK 프로모터로 대체하여 플라스미드 pPGK-puro를 얻었다. PAd3 E1을 포함한 절편(526-3259)은 PAd E1-F(TGGATCCTCGACATGGCGAACAGACTT; 서열번호 14) 및 PAd E1-R(TCTCGAGTCATCCTCAGTCATCGTCATCG; 서열번호 15) 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. PAd3 E1 유전자(서열번호 16)의 코딩 서열을 포함하는 PCR 산물을 pPGK-puro 또는 pCMV-puro의 BamHΙ-XhoΙ 부위에 클로닝하여 각각 pPGK-PE1 및 pCMV-PE1을 얻었다.
그런 다음 상기 플라스미드를 Lipofectin(Life Technologies)를 이용하여 FPRT-HE1 세포주를 트랜스펙션하기 위해 사용하였다. 트랜스펙션 48시간 후에 세포를 2 ㎍/ml 퓨로마이신을 포함한 선별 배지에서 배양하였다. 분별있는 세포 콜로니가 pPGK-PE1 및 pCMV-PE1 트랜스펙션된 FPRT-HE1 세포에서 항생제 선별 30일 후에 관찰되었다. 24 콜로니(pPGK-PE1 및 pCMV-PE1 트랜스펙션된 세포에서 각각 12 콜로니)를 선택하여 특정 프라이머 세트(표 5)를 사용한 RT-PCR로 증폭하여 PAd3 E1 전사체(E1A, E1B-1 및 E1B-1) 발현을 스크리닝하였다. pPGK-PE1 및 pCMV-PE1 트랜스펙션된 세포 유래의 다수 클론이 세 가지 PAd3 E1 전사체 발현 양성이었다. 도 8B에서 보여지는 FPRT-HE1/PE1 세포 클론은 PGK 프로모터하의 E1 발현을 보여준다.
돼지 E1 전사체의 RT PCR을 위한 프라이머
유전자 프라이머 서열(5' to 3')
PAd E1A(For) aggtggaggtgattgtgactga (서열번호 17)
PAd E1A(Rev) gacgcaagaggaagtactgcta (서열번호18)
PAd E1B-1(For) ctggccaagcttactaacgtgaac(서열번호19)
PAd E1B-1(Rev) tttaagtcttctggtgccgcca (서열번호20)
PAd E1B-2(For) atgcatgagcgctacagctttg (서열번호21)
PAd E1B-2(Rev) ctgagttccgcaagaatgtgct (서열번호22)
< 실시예 9> 복수의 독감 항원을 발현하는 아데노바이러스
복수(다수)의 독감 항원을 융합한 아데노바이러스를 제조한다. Ng 등(Human Gene Therapy 10:2667-2672, 1999)의 Cre 재조합효소-매개 부위 특이적 재조합 시스템을 두 가지 이상의 독감 항원을 포함한 HAd5 벡터를 생산하기 위해 활용할 수 있다. 복수의 독감 항원을 발현하는 HAd5 E1 삽입 벡터를 제조하기 위해 선택된 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터("CMV 프로모터") 등의 프로모터 조절하에 클로닝하고 셔틀벡터의 StuΙ 부위에 삽입한다. pDC311과 같은 셔틀벡터는 Cre 재조합 효소 존재하에 부위 특이적 재조합을 위한 loxP 부위 및 완전한 패키징 신호(Ψ)를 포함한다. 상기 벡터를 pBHGlox△E1,3Cre와 함께 293 Cre(Cre 재조합 효소를 발현하는 293 세포)에 공동 트랜스펙션하였다. pBHGlox△E1,3Cre 플라스미드는 패키징 신호를 제외한 HAd5 거의 전체의 게놈과 E1 및 E3 부위 유전자 결손을 포함한다. 상기 플라스미드는 또한 Cre 재조합효소 매개 재조합을 위한 loxP 부위를 포함한다. 293 Cre 세포에 도입될 때, 두 개의 플라스미드 사이에 Cre 매개 재조합이 선택된 독감 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 생성한다. 선택적으로 이런 과정은 상술한 TLR과 같이 면역 기능을 증진시키는 추가 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 융합하는데 사용된다. 독감 항원 조합의 예를 표 6에 나타냈다. 표 6에 주어진 조합예는 실례가 될 것이다. 이와 유사하게 비인간 아데노바이러스벡터(예를 들면 PAd3 또는 BAd3)는 표 6의 독감 항원의 조합예를 발현하는 다양한 재조합체를 생성하는데 사용될 수 있다.
복수의 항원 아데노바이러스 벡터의 항원 조합예
조합예 Hemagglutinin(HA) Neuraminidase(NA) 내부 단백질(s)
1 H5 N1 (-)
2 H7 N7 (-)
3 H9 N2 (-)
4 H5 N1 M*
5 H7 N7 M
6 H9 N2 M
7 H5 N1 NP
8 H7 N7 NP
9 H9 N2 NP
10 H5 N1 M + NP
11 H7 N7 M + NP
12 H9 N2 M + NP
13 H5 N1 NS1
14 H7 N7 NS1
15 H9 N2 NS1
16 H5 M
17 H5 NP
18 H5 M + NP
19 H7 M
20 H7 NP
21 H7 M + NP
22 H9 M
23 H9 NP
24 H9 M + NP
25 H51 + H52 + H53
26 H51 + H52 + H53 N1
27 H51 + H52 + H53 M
28 H51 + H52 + H53 NP
29 H51 + H52 + H53 M
30 H51 + H52 + H53 N1 NP
31 H51 + H52 + H53 N1 M + NP
32 H5 + H7 + H9
33 H5 + H7 + H9 N1
34 H5 + H7 + H9 M
35 H5 + H7 + H9 NP
36 H5 + H7 + H9 M
37 H5 + H7 + H9 N1 NP
38 H5 + H7 + H9 N1 M + NP
윗 첨자로 표기된 숫자는 변이형을 의미한다.
*M은 M1, M2 중 하나 또는 M1 및 M2 양자를 의미한다.
상기 실시의 형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명은 이 실시의 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 범위는 하기 청구범위에 제한된다. 따라서 본 발명자는 이들 청구항의 범위 및 사상에 속하는 발명을 청구한다.
<110> Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention Purdue Research Foundation Sambhara, Suryaprakash Mittal, Suresh K. Bangari , Dinesh S. Katz, Jacqueline Hoelscher, Mary <120> VACCINE AGAINST PANDEMIC STRAINS OF INFLUENZA VIRUSES <130> 7fpi-10-09 <150> 60/670,826 <151> 2005-04-11 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> immunostimulatory oligonucleotide <400> 1 tccatgagct tcctgatcct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> immunostimulatory oligonucleotide <400> 2 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> immunostimulatory oligonucleotide <400> 3 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 4 <211> 2950 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 4 atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60 gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120 cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180 gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240 ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300 cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360 gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420 gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480 cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540 atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600 tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660 ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720 gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780 ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840 agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900 gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960 tgagctgtaa acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc 1020 ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc 1080 atggcgtgtt aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg 1140 ttacatctga cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact 1200 tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc 1260 aggcaaagtt agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga 1320 aatcctgtgg tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga 1380 aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt 1440 tgagttttat aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg 1500 attttctggc catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt 1560 tgtcttccgt ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag 1620 ccaggcggcg gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg 1680 aatgaatgtt gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac 1740 agaggatggg caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga 1800 ggaggctagg aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt 1860 tcaacagatc aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat 1920 agagcagctg accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt 1980 atatgcaaag gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat 2040 caggaattgt tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag 2100 ggtggccttt agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt 2160 ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa 2220 taccaacctt atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc 2280 ctggaccgat gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340 tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat 2400 cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat 2460 gctagtgaaa agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag 2520 ggcctctcag atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt 2580 agccagccac tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc 2640 cttgcatttg ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac 2700 taagatattg cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat 2760 gaccatgaag atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt gcagaccctg 2820 cgagtgtggc ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct 2880 gaggcccgat cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga 2940 tacagattga 2950 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 5 ccatgaagta cctggtcctc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 6 ccccacctat ttatacccct c 21 <210> 7 <211> 2507 <212> DNA <213> Bovine adenovirus type 3 <400> 7 atgaagtacc tggtcctcgt tctcaacgac ggcatgagtc gaattgaaaa agctctcctg 60 tgcagcgatg gtgaggtgga tttagagtgt catgaggtac ttcccccttc tcccgcgcct 120 gtccccgctt ctgtgtcacc cgtgaggagt cctcctcctc tgtctccggt gtttcctccg 180 tctccgccag ccccgcttgt gaatccagag gcgagttcgc tgctgcagca gtatcggaga 240 gagctgttag agaggagcct gctccgaacg gccgaaggtc agcagcgtgc agtgtgtcca 300 tgtgagcggt tgcccgtgga agaggatgag tgtctgaatg ccgtaaattt gctgtttcct 360 gatccctggc taaatgcagc tgaaaatggg ggtgatattt ttaagtctcc ggctatgtct 420 ccagaaccgt ggatagattt gtctagctac gatagcgatg 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gcccgacaag 1320 acgacccaga ctaccagcca gtagacgggg acagcccacc ccgggctagc ctggaggagg 1380 ctgaacagag cagcactcgt ttcgagcaca tcagttaccg agacgtggtg gatgacttca 1440 atagatgcca tgatgttttt tatgagaggt acagttttga ggacataaag agctacgagg 1500 ctttgcctga ggacaatttg gagcagctca tagctatgca tgctaaaatc aagctgctgc 1560 ccggtcggga gtatgagttg actcaacctt tgaacataac atcttgcgcc tatgtgctcg 1620 gaaatggggc tactattagg gtaacagggg aagcctcccc ggctattaga gtgggggcca 1680 tggccgtggg tccgtgtgta acaggaatga ctggggtgac ttttgtgaat tgtaggtttg 1740 agagagagtc aacaattagg gggtccctga tacgagcttc aactcacgtg ctgtttcatg 1800 gctgttattt tatgggaatt atgggcactt gtattgaggt gggggcggga gcttacattc 1860 ggggttgtga gtttgtgggc tgttaccggg gaatctgttc tacttctaac agagatatta 1920 aggtgaggca gtgcaacttt gacaaatgct tactgggtat tacttgtaag ggggactatc 1980 gtctttcggg aaatgtgtgt tctgagactt tctgctttgc tcatttagag ggagagggtt 2040 tggttaaaaa caacacagtc aagtccccta gtcgctggac cagcgagtct ggcttttcca 2100 tgataacttg tgcagacggc agggttacgc ctttgggttc cctccacatt 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oligonucleotide primer <400> 12 gatatcgttc aagatcaccc agag 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 13 gtcgaccact tttaatcctg ctc 23 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 14 tggatcctcg acatggcgaa cagactt 27 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 15 tctcgagtca tcctcagtca tcgtcatcg 29 <210> 16 <211> 2722 <212> DNA <213> Porcine adenovirus 3 <400> 16 atggcgaaca gacttcacct ggactgggac ggaaaccccg aggtggtgcc ggtgctggaa 60 tgggacccgg tggatctgcg cgacccctct ccgggggatg agggcttctg tgagccgtgc 120 tgggagagtc tggtcgatgg actgccggac gagtggctgg acagtgtgga cgaggtggag 180 gtgattgtga ctgagggggg tgagtcagag gacagtggtg ggagtgccgc tggtgactca 240 ggtggctctc agggggtctt tgagatggac cccccagaag agggggacag taatgaggag 300 gatatcagcg cggtggctgc ggaggtgctg tctgaactgg ctgatgtggt gtttgaggac 360 ccacttgcgc caccctctcc gtttgtgttg gactgccccg aggtacctgg 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ctgacgaggg tattttaagt cttctggtgc cgccactatg ttccctgctg gaggcgcgaa 1320 tgatggcgga gcaggtgcgg caggggctgt gcatcatcag gatgccgagc gcggagcggg 1380 agatgctgtt gcccagtggg tcatccggca gtggcagcgg ggccgggatg cgggaccagg 1440 tggtgcccaa gcgcccgcgg gagcaggaag aggaggagga ggacgaggat gggatggaag 1500 cgagcgggcg caggctcgaa gggccggatc tggtttagat cgccgccggc ccgggggagc 1560 gggtggagag gggagcgggg aggaggcggg ggggtcttcc atggttagct atcagcaggt 1620 gctttctgag tatctggaga gtcctctgga gatgcatgag cgctacagct ttgagcagat 1680 taggccctat atgcttcagc cgggggatga tctgggggag atgatagccc agcacgccaa 1740 ggtggagttg cagccgggca cggtgtacga gctgaggcgc ccgatcacca tccgcagcat 1800 gtgttacatc atcgggaacg gggccaagat caagattcgg gggaattaca cggagtacat 1860 caacatagag ccgcgtaacc acatgtgttc cattgcgggc atgtggtcgg tgactatcac 1920 ggatgtggtt tttgatcggg agctaccggc ccggggtggt ctgattttag ccaacacgca 1980 cttcatcctg cacggctgca acttcctggg ctttctgggc tcggtaataa cggcgaacgc 2040 cgggggggtg gtgcggggat gctacttttt cgcctgctac aaggcgcttg accaccgggg 2100 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Claims (75)

  1. 하나 또는 그 이상의 조류 독감 변종을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 조류 독감 HA 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  3. 제 2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열은 복수의 조류 독감 HA 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  4. 제 3항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열은 복수의 동일한 HA 항원 서브타입 변이형을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  5. 제 3항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열은 복수의 상이한 HA 서브타입의 HA항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  6. 제 1항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 조류 독감 NA 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  7. 제 1항에 있어서, 조류 독감 항원은 H5N1 변종 항원, H7N7 변종 항원 또는 H9N2 변종 항원인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  8. 제 1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열은 복수의 독감 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  9. 제 8항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 독감 내부 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  10. 제 9항에 있어서, 독감 내부 단백질은 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질, PB1 단백질, PB2 단백질, NS1 단백질 및 NS2 단백질 또는 그의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  11. 제 9항에 있어서, 독감 내부 단백질은 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질, 또는 그 중 둘 또는 그 이상의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  12. 제 9항에 있어서, 내부 단백질은 비조류 독감 바이러스 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  13. 제 9항에 잇어서, 내부 단백질은 H1N1, H2N2 또는 H3N2 독감 변종 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  14. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  15. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 비인간 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  16. 제 15항에 있어서, 비인간 아데노바이러스 벡터는 돼지 아데노바이러스 벡터, 소 아데노바이러스 벡터, 개 아데노바이러스 벡터, 쥐 아데노바이러스 벡터, 양 아데노바이러스 벡터, 조류 아데노바이러스 벡터 또는 원숭이 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  17. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  18. 제 17항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스는 하나 또는 그 이상의 E1 부위 유전자 및 E3 부위 유전자의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  19. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 조류 독감 변종의 HA, NA 항원 또 는 양자와 조류 독감 두 번째 변종의 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질 또는 그 중 둘 이상의 단백질 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 결함 인간 아데노바이러스 벡터로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  20. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 조류 독감 변종의 HA, NA 항원 또는 양자와 조류 독감 두 번째 변종의 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질 또는 그 중 둘 이상의 단백질 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 결함 돼지 또는 소 아데노바이러스 벡터로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  21. 하나 또는 그 이상의 조류 독감 변종 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  22. 제 21항에 있어서, 조류 HA 항원과 조류 NA 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  23. 제 22항에 있어서, 복수의 HA 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  24. 제 23항에 있어서, 아데노바이러스는 복수의 동일한 HA 항원 서브타입 변이형을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  25. 제 23항에 있어서, 아데노바이러스는 복수의 상이한 HA 서브타입의 HA 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  26. 제 23항에 있어서, 복수의 독감 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  27. 제 26항에 있어서, 복수의 독감 항원은 하나 또는 그 이상의 독감 내부 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  28. 제 27항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 독감 내부 단백질은 조류 독감 항원과는 상이한 변종에서 유래한 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  29. 제 27항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 독감 내부 단백질은 하나 또는 그 이상의 NP 단백질과 M 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  30. 제 21항에 있어서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  31. 제 21항에 있어서, 아데노바이러스는 비인간 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  32. 제 31항에 있어서, 비인간 아데노바이러스는 돼지 아데노바이러스, 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 쥐 아데노바이러스, 양 아데노바이러스, 조류 아 데노바이러스 또는 원숭이 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  33. 제 21항에 있어서, 아데노바이러스는 복제 결함 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  34. 제 33항에 있어서, 아데노바이러스는 하나 또는 그 이상의 E1 부위 유전자 및 E3 부위 유전자의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  35. 하나 또는 그 이상의 조류 독감 항원을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 조류 독감 항원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 아데노바이러스 벡터 및 재조합 아데노바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 면역성 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 제 1항 내지 20항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러 스 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 면역성 조성물.
  37. 제 35항에 있어서, 제 21항 내지 34항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 면역성 조성물.
  38. 제 35항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아쥬반트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역성 조성물.
  39. 첫 번째와 두 번째 아데노바이러스 E 단백질은 서로 다른 아데노바이러스 변종에서 선택되고, 분리 세포가 복수의 복제 결함 인간 및/또는 비인간 아데노바이러스 변종의 성장을 지지하는 것을 특징으로 하는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 아데노바이러스 E 단백질을 코딩하는 첫 번째 폴리뉴클레오티드 서열과 하나 또는 그 이상의 두 번째 아데노바이러스 E 단백질을 코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 이종 핵산으로 구성된 분리 세포주.
  40. 제 39항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 아데노바이러스 E 단백질과 하나 또는 그 이상의 두 번째 아데노바이러스 E 단백질이 모두 E1 단백질인 것을 특징으로 하는 세포주.
  41. 제 39항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째와 두 번째 아데노바이러스 E 단백질은 서로 다른 종 친화성(tropism)을 가진 아데노바이러스 변종에서 유래한 것을 특징으로 하는 세포주.
  42. 제 41항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 아데노바이러스 E 단백질은 하나 또는 그 이상의 인간 아데노바이러스 E 단백질로 구성되고, 하나 또는 그 이상의 아데노바이러스 E 단백질은 하나 또는 그 이상의 비인간 아데노바이러스 E 단백질로 구성된 것을 특징으로 하는 세포주.
  43. 제 42항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 두 번째 아데노바이러스 E 단백질은 하나 또는 그 이상의 소 E 단백질로 구성된 것을 특징으로 하는 세포주.
  44. 제 43항에 있어서, 복수의 인간 E1 단백질과 복수의 소 E1 단백질로 구성된 것을 특징으로 하는 세포주.
  45. 제 42항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 두 번째 아데노바이러스 E 단백질은 하나 또는 그 이상의 돼지 E 단백질로 구성된 것을 특징으로 하는 세포주.
  46. 제 45항에 있어서, 복수의 인간 E1 단백질과 복수의 돼지 E1 단백질로 구성된 것을 특징으로 하는 세포주.
  47. 조류 독감 변종의 하나 또는 그 이상의 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 또는 그 이상의 재조합 아데노바이러스 벡터 및 조류 독감 변종의 하나 또는 그 이상의 항원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 재조합 아데노바이러스로 이루어진 면역성 조성물을 개체에게 투여하는 단계로 구성된 개체에게 조류 또는 유행성 독감에 대한 면역반응을 유도하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 면역반응은 하나 또는 그 이상의 조류 또는 유행성 독감 변종에 대한 보호성 또는 부분 보호성 면역반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 면역반응은 복수의 조류 또는 유행성 독감 변종에 대한 보호성 또는 부분 보호성인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 47항에 있어서, 면역반응은 하나 또는 그 이상의 조류 또는 유행성 독감 변종의 항원과 결합하는 중화 항체(neutralizing antibodies)의 생산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 47항에 있어서, 면역반응은 복수의 조류 또는 유행성 독감 변종의 항원과 결합하는 중화 항체의 생산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 47항에 있어서, 면역반응은 또한 하나 또는 그 이상의 독감 내부 단백질에 특이적인 T 세포 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 내부 단백질은 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질 또는 그의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, T 세포 반응은 복수의 독감 변종 사이에 보존되어 있는 독감 내부 단백질의 에피토프에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 복수의 독감 변종은 한 가지 이상의 항원형을 갖는 것을 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 47항에 있어서, 면역성 조성물을 비강, 경구, 안구, 정맥내, 근육내, 경피, 피내 또는 피하 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 47항에 있어서, 개체는 인간 개체인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 47항에 있어서, 개체는 비인간 개체인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 47항에 있어서, 개체는 새인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 개체는 닭인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 발육계란내에 주입하여 면역성 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 60항에 있어서, 면역성 조성물을 스프레이 또는 입자 조절기로 공중에 있는 다수의 새에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 60항에 있어서, 면역성 조성물을 음료수로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 47항에 있어서, 복수의 독감 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 아데노바이러스 벡터 또는 복수의 독감 항원을 포함하는 아데노바이러스를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 복수의 항원은 조류 독감 변종의 HA 항원, NA 항원 또는 양자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 64항에 있어서, 복수의 항원은 동일한 HA 항원 서브타입의 변이형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 64항에 있어서, 복수의 항원은 상이한 조류 독감 서브타입에서 유래한 복수의 HA 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 64항에 있어서, 복수의 항원은 하나 또는 그 이상의 조류 독감 HA 항원 및 하나 또는 그 이상의 독감 내부 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 독감 내부 단백질은 M1 단백질, M2 단백질, NP 단백질 또는 그의 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 조류 독감 항원을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노바이러스를 세포에서 복제하는 단계로 구성된 재조합 조류 독감 바이러스 항원을 생산하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 복제 결함 벡터의 복제를 유지할 수 있는 세포에 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 도입함으로써 아데노바이러스를 복제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 71항에 있어서, 세포는 둘 또는 그 이상의 서로 다른 E 단백질을 발현하는 다기능성 세포이고, 서로 다른 E 단백질은 상이한 종 친화성을 가진 둘 또는 그 이상의 다른 아데노바이러스 변종 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 70항에 있어서, 조류 독감 항원은 하나 또는 그 이상의 HA 항원 또는 NA 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 항원은 H5, H7 또는 H9 독감 변종에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 70항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 복수의 독감 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
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