CN111148528A - 流感疫苗 - Google Patents

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CN111148528A CN201780087550.3A CN201780087550A CN111148528A CN 111148528 A CN111148528 A CN 111148528A CN 201780087550 A CN201780087550 A CN 201780087550A CN 111148528 A CN111148528 A CN 111148528A
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亚瑟·扬
孙仁
尼古拉斯·C·吴
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University of California
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Invervax
University of California
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Abstract

本文提供了与疫苗，例如流感疫苗相关的组合物，该疫苗包括基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于重组病毒的疫苗、基于抗体的疫苗和基于病毒的疫苗。本文还提供了与疫苗，例如流感疫苗相关的方法，包括鉴定用于疫苗的表位、生产、配制和施用疫苗的方法。

Description

流感疫苗
交叉引用
本申请要求2016年12月28日提交的第62/439,865号美国临时申请和2017年8月25日提交的第62/550,167号美国临时申请的权益，这些临时申请通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式通过电子方式提交的序列表，其通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2017年12月27日，命名为46690-708_601_SL.txt，大小为152,030字节。
背景技术
疫苗通过提供针对特定疾病的主动适应性免疫，极大地促进人类健康。对改进的疫苗，例如流感疫苗，存在需求。改进的疫苗可表现出更高的安全性、增加的免疫原性、更广范围的病原体覆盖或其任何组合。
发明内容
本公开内容的一个方面提供了一种多肽，其包含选自SEQ ID NO：2、3、8、11、12、40、41、43、51、52、58、59、61、62、84和92的第一序列；和选自SEQ ID NO：17、20、21、22、24、26、29、30、32、33、34、44、45、49、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93和94的第二序列。
本公开内容的另一方面提供了一种多肽，其包含选自SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、52、58、59、61、62、84和92的第一序列；和选自SEQ ID NO：17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、44、45、49、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93和94的第二序列。
本公开内容的另一方面提供了一种多肽，其包含：(a)与SEQ ID NO：8、11、12、40、41、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、43、44、45、49、51、52、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(b)与SEQ ID NO：2或43的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、44、45、49、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(c)与SEQ ID NO：21、22、24、26、30、32、49、53、60、70、85、86、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、8、11、12、40、41、43、51、52、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(d)与SEQ ID NO：17、20、29、31、33、34、44、45、73、74、75、76、77、78、82、83、87、88、89、90或91的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(e)与SEQ ID NO：2或43的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(f)与SEQ ID NO：3、51或52的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93、94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(g)与SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：21、22、24、26、30、32、49、53、60、70、85、86、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(h)与SEQ ID NO：2、8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、43、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、43、44、45、49、51、52、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二不同序列，其中包含所述第一序列和所述第二不同序列的连续序列在PB1、PA或NP中未发现。
本公开内容的另一方面提供了一种包含第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列的多肽，其中所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的每一个与选自SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94的不同序列具有至少75％的序列同一性，其中所述多肽不是天然存在的。
在一些情况下，所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的至少一个可以与选自SEQ ID NO：17、20-22、24、26、29-34、44、45、49、53、60、70、72-78、82、83、85-91、93和94的序列具有至少75％的序列同一性。在一些情况下，所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的至少一个可以与选自SEQ ID NO：2、3、43、51和52的序列具有至少75％的序列同一性。在一些情况下，所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的至少一个可以与选自SEQ ID NO：8、11、12、40、41、58、59、61、62和92的序列具有至少75％的序列同一性。
本文提供的多肽可以进一步包含与乙型流感NP蛋白的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。本文提供的多肽可以进一步包含与SEQ ID NO：116、117或118的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。在一些情况下，每个序列的长度可以是至多10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。在一些情况下，第一序列和第二序列可以直接连接。在一些情况下，第一序列和第二序列可以通过连接体连接。在一些情况下，所述连接体可包含多个甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸或赖氨酸。所述连接体可包含序列RVKR(SEQ ID NO：110)。本文提供的多肽可以进一步包含序列GALNNRFQIKGVELKSK(SEQ ID NO：103)。SEQ ID NO：103可以连接至所述多肽的氨基末端部分。本文提供的多肽可包含SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、43、44、45、49、51、52、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93和94。
本文提供的多肽可以是分离的多肽。
本公开内容的另一方面提供了包含本文提供的多肽的组合物。
本公开内容的另一方面提供了编码本文提供的多肽的多核苷酸。
本文提供的多核苷酸可以是分离的。
本公开内容的另一方面提供了包含本文提供的多核苷酸的组合物。
本公开内容的另一方面提供了包含本文提供的多核苷酸的载体。
本文提供的载体可以是非人灵长类动物载体。本文提供的载体可以是腺病毒载体。本文提供的载体可以是黑猩猩腺病毒载体。在一些情况下，所述黑猩猩腺病毒载体可以与C68(AdC68)(SEQ ID NO：104)、C7(AdC7)、C6(AdC6)(SEQ ID NO：105)、Pan7或Pan9的序列的至少50％具有至少50％的序列同一性。
本文提供的载体可以是分离的。
本公开内容的另一方面提供了包含本文提供的载体的组合物。
本公开内容的另一方面提供了包含本文提供的多核苷酸的病毒。
本公开内容的另一方面提供了包含本文提供的载体的病毒。
本文提供的病毒可以是分离的。病毒可以是腺病毒。
本公开内容的另一方面提供了包含本文提供的病毒的组合物。
本公开内容的另一方面提供了包含至少五种不同肽的组合物，其中所述至少五种不同肽中的每一种包含以下序列、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：与选自SEQID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94的序列具有至少75％序列同一性的序列。在所述组合物的一些情况下，每种肽的长度可以是至多10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。本文提供的组合物可进一步包含肽，该肽包含与乙型流感NP蛋白的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。本文提供的组合物可进一步包含肽，该肽包含与SEQ ID NO：116、117或118的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。本文提供的组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。本文提供的组合物可以被配制用于皮下、鼻内或肌肉内施用。
本公开内容的另一方面提供了一种方法，其包括向受试者施用本文提供的组合物。在一些情况下，该施用可以是皮下施用。在一些情况下，该施用可以是鼻内施用。在一些情况下，该施用可以是肌肉内施用。本文提供的方法可进一步包括第二次向所述受试者施用所述组合物。在一些情况下，在施用后可以诱导免疫应答。该免疫应答可以是全身性免疫应答。在一些情况下，所述受试者可以是人。在一些情况下，所述受试者可能感染有病毒。该病毒可以是流感病毒。该流感病毒可以是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。在一些情况下，该流感病毒可以是甲型流感病毒。在一些情况下，所述组合物在施用时在所述受试者中诱导针对甲型流感病毒株的一个或多个亚型的交叉保护。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体并单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
本发明的新特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用到本发明原理的示例性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在附图中：
图1示出了一种发现疫苗表位的方法。
图2示出了经接种的小鼠的流感攻击的结果。
图3A示出了经接种的小鼠相对于初始体重的百分比。
图3B示出了未经接种的小鼠相对于初始体重的百分比。
图3C示出了第1组(注射AdCre的)小鼠相对于初始体重的百分比。
图3D示出了第2组经接种的小鼠相对于初始体重的百分比。
图4示出了图3A和图3B中经接种和未经接种的小鼠的存活百分比。
图5示出了一种产生本文提供的基于腺病毒的疫苗的方法。
具体实施方式
本文提供了用于形成疫苗，例如流感疫苗的方法和组合物。该方法可包括，例如，使用编码一个或多个流感表位，例如一个或多个甲型流感表位，例如一个或多个甲型流感肽表位的序列，制备重组病毒疫苗，例如重组腺病毒疫苗。所述一个或多个表位可包含“不变”序列，例如对突变具有低耐受性的序列。所述一个或多个表位可包含经实验证实的人CD8T细胞甲型流感表位。重组腺病毒可表达至少1、5、8、10、25、50、100或1000个肽表位。在一些情况下，所表达的表位例如通过共价键连接在例如单个多肽中。在一些情况下，所表达的表位不连接，例如，每个表位可以从单独的启动子、单独的核酸或单独的病毒表达。在一些情况下，所述一个或多个表位描述于免疫表位数据库和分析资源(Immune EpitopeDatabase and Analysis Resource)(worldwideweb.iedb.org)中。包含一个或多个表位的单个多肽可以与来自例如甲型流感、乙型流感或丙型流感的全长病毒蛋白质的一个、两个或更多个拷贝(或全长病毒蛋白质的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，或与这类蛋白质具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％序列同一性的序列)连接。
定义
本文所用的术语仅仅是为了描述特定情况的目的，并非意在限制。如本文所用的，单数形式“一种”、“一个”及“该”也可包括复数形式，除非上下文另有明确指明。此外，当在具体实施方式和/或权利要求书中使用术语“含有”、“包括”、“包含”、“具有”或其变化形式时，这些术语可以以与术语“包含”类似的方式涵盖在内。
术语“约”或“大约”可意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其可部分依赖于该值是如何测量或确定的，例如测量系统的局限性。例如，根据给定值的实际情况，“约”可指在1个或大于1个标准差之内。当特定值在本申请和权利要求书中描述时，除非另有说明，否则术语“约”可意指在该特定值的可接受误差范围内，如由术语“约”修饰的值的±10％。
如本文所用的，术语“多肽”及其语法等同语可以指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的连续且非分支的链，该肽(酰胺)键可以是当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成的共价化学键。除非另有说明，否则术语“多肽”和“肽”在本文中使用时是可互换的。最短的多肽可以是二肽，其仅有两个通过单个肽键连接的氨基酸。对于本公开内容来说，这些术语不应被解释为关于长度上限的限制。这些术语还可以包括天然氨基酸的类似物，以及在侧链、手性或性质方面被修饰的氨基酸。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核酸”和“寡核苷酸”及其语法等同语可以互换使用，并且可以指线性或环状构象以及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。对于本公开内容来说，这些术语不应被解释为关于长度上限的限制。这些术语还可以包括天然核苷酸的类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如硫代磷酸骨架)被修饰的核苷酸。这些术语的修饰还可包括脱甲基化、CpG甲基化的添加、细菌甲基化的去除和/或哺乳动物甲基化的添加。通常，特定核苷酸的类似物可以具有相同的碱基配对特异性，即A的类似物可以与T碱基配对。
如本文所用的术语“抗原”及其语法等同语可以指含有一个或多个能够被一个或多个受体结合的表位的分子。例如，抗原可以刺激宿主的免疫系统，以在呈递抗原时产生细胞抗原特异性免疫应答，或体液抗体应答。抗原还可以具有自身或者当与另一种分子组合存在时引发细胞和/或体液应答的能力。例如，甲型流感病毒蛋白质可被TCR识别。
如本文所用的术语“表位”及其语法等同语可指可被抗体、B细胞、T细胞或工程化细胞识别的抗原的一部分。例如，表位可以是被TCR识别的甲型流感病毒表位。还可以识别抗原内的多个表位。表位也可以突变。
如本文所用的，术语“突变”及其语法等同语可指缺失、异源核酸的插入、倒位或置换，包括本领域通常理解的开放阅读框消融(ablating)突变。
如本文所用的，术语“基因”及其语法等同语可以指编码单个多肽、蛋白质或RNA的核酸区段(也称为“编码序列”或“编码区”)，任选地伴有相关的调节区，如启动子、操纵子、终止子等，它们可以位于编码序列的上游或下游。
如本文与病毒结合使用的，术语“天然存在的”及其语法等同语可以表示该病毒可以在自然界中发现，即它可以从自然界来源中分离并且没有被有意修饰。
本文提及的术语“抑制”、“减轻”或“预防”或这些术语的任何变化形式可包括任何可测量的减轻或完全抑制以实现期望的结果。
如本文所用的，“启动子”及其语法等同语可以是控制序列，其为控制转录起始和转录速率的核酸序列的区域。启动子可含有调节蛋白质和分子如RNA聚合酶和其它转录因子可以结合的遗传元件。术语“可操作地定位的”、“可操作地连接的”、“在控制下”和“在转录控制下”可以意指启动子处于与核酸序列相关的正确功能位置和/或方向，以控制该序列的转录起始和/或表达。在一些情况下，启动子可以与或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”可以指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
术语“受试者”及其语法等同语可指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“受试者”和“患者”在本文中用于例如哺乳动物受试者如人类受试者时可互换使用。
鉴定用于疫苗的表位的方法
本公开内容的一个方面提供了鉴定用于疫苗的表位的方法。该方法可用来鉴定病原体的表位序列，该病原体例如是病毒，例如RNA病毒，例如流感病毒，例如甲型流感、乙型流感或丙型流感病毒。在一些情况下，本文提供的方法与用于疫苗的病原体表位序列的鉴定结合使用，该病原体例如是病毒，例如RNA病毒，例如流感病毒，例如甲型流感、乙型流感或丙型流感病毒。该表位序列可以来自PB1、PB1-F2、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2中的一个或多个，或与其中的一个或多个具有同源性。
可以确定不变性或不变肽区域，例如，如2015年4月6日提交的国际PCT申请公开WO/2015/157189所述，其通过引用整体并入本文。不变性可以描述氨基酸残基在病原体适应性(fitness)的背景下的功能重要性。不变性可以是病原体适应性的量度。在氨基酸残基水平上，不变性可以与氨基酸残基对突变的耐受性程度以及该突变对病原体繁殖能力的不利程度，即病原体的适应性有关。不变性可以与氨基酸残基在病原体存活中的作用相关。例如，病原体中对病原体增殖发挥有害作用的突变可以被认为是破坏性突变，并且不会在病原体群体内传播。与有害突变相关的相关氨基酸位置可以被表征为不变的，因为其突变不会被耐受。
所述方法可包括生成核酸文库。在一些情况下，该核酸文库可以允许模拟可以在特定病原体株中发生的所有可能的突变，例如，通过生成突变甲型流感病毒或乙型流感病毒池(pool)。在一些情况下，所述方法可以进一步包括将文库引入细胞中以支持病原体例如甲型流感病毒池的产生。有时，所述方法可以进一步包括用病原体池感染细胞多轮(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10轮或更多轮)，从而获得产生的病原体例如甲型流感病毒池，并生成第二测序文库。所述方法可以进一步包括获得第二测序文库的核酸序列。在一些情况下，所述方法可以进一步包括比较序列(例如，比较来自文库的序列与来自第二文库的序列，或来自最后一轮感染的文库)以获得不变的序列区域，例如，不变的肽区域。在该序列段中的所有可能的突变中，不变序列区域可以具有<0.05、<0.08、<0.1、<0.2、<0.3或<0.4的平均不变性比(最终群体中突变体的频率/初始群体中的频率)。所述方法可以进一步包括评价不变序列区域。在一些情况下，所述方法可以进一步包括对不变序列区域的HLA亲和结合分析，用于疫苗开发和患者治疗的一些其它免疫原性分析，或其任何组合。如本文所用的，术语“免疫原性”可以指特定物质(例如抗原或表位)诱导免疫应答的能力。在一些情况下，针对用于疫苗的表位序列的第一次筛选包括鉴定免疫原性肽序列，然后评价表位序列的序列不变性。
HLA亲和结合分析可以使用分析程序进行，如来自丹麦技术大学(TechnicalUniversity of Denmark)生物序列分析中心(Center for Biological SequencesAnalysis，CBS)的NetMHCpan4.0、来自国立卫生研究院(National Institute of Health)的HLA Peptide Binding Predictions服务器、来自免疫表位数据库(Immune EpitopeDatabase，IEDB)的MHC-1结合预测服务器等。
在一些情况下，可以进一步分析通过本文提供的方法鉴定的候选不变序列。例如，可以将候选不变序列与例如各种数据库中，如流感研究数据库(Influenza ResearchDatabase)(https：//www.fludb.org)中的流感病毒表位的经实验测试的免疫原性数据进行比较。在比较后，可以鉴定具有经实验证明的免疫原性的候选不变序列(例如，登录在https：//fludb.org)，并进行进一步分析或疫苗开发。例如，可以选择这样的候选不变序列或其变体作为本文所述的多肽的组成表位序列之一，其可以从本文所述的转基因表达，并且该转基因可以是用于产生基于病毒的疫苗，例如基于腺病毒的疫苗的载体，例如病毒载体的一部分。
另外的分析
可以进行另外的分析以选择候选不变序列或肽，以用于疫苗开发以及将疫苗施用于患者以治疗或预防病况，例如流感。这些另外的分析或筛选可涉及基于免疫学测定的免疫应答的分析。在一些情况下，首先对试验动物进行免疫(初免(prime))，在初免后数周进行或不进行第二次免疫(加强)，并在例如最后一次免疫后2至4周收集血液或组织样品。这些研究可以允许测量与保护性免疫相关的免疫参数，如特异性抗体(例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的诱导和特异性T淋巴细胞应答的诱导，以及确定抗原或抗原池是否提供保护性免疫。
可以从经免疫的测试动物中分离脾细胞、肺细胞、来自纵隔淋巴结的细胞或外周血单个核细胞，并测量抗原特异性T细胞的存在和细胞因子合成的诱导。单独的或与流式细胞术结合的ELISA、ELISPOT或细胞质细胞因子染色可在单细胞水平上提供此类信息。
可用来鉴定免疫效力的免疫学试验包括抗体测量、中和试验以及对抗原呈递细胞或抗原或病原体特异性淋巴细胞的活化水平或频率的分析。可以在此类研究中使用的试验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、猪、猴或人。
猴可以是有用的试验动物，例如，由于猴与人之间的MHC分子的相似性。病毒中和试验可用于检测不仅特异性结合病原体而且还中和病原体(例如病毒)功能的抗体。这些可以基于检测经免疫动物的血清中的抗体以及分析这些抗体抑制组织培养细胞中病原体(例如病毒)生长的能力。此类试验是本领域技术人员已知的。病毒中和试验可用来筛选也提供保护性免疫的抗原。
多肽
本公开内容的一个方面提供了包含一个或多个流感病毒表位序列，例如甲型流感病毒表位序列，由该序列组成，或基本上由该序列组成的多肽。
如本文所用的，“包含”根据指定序列或通式的序列的肽或多肽可以是在其N末端、C末端或两个末端可包含另外的氨基酸残基、氨基酸异构体和/或氨基酸类似物的肽或多肽。与仅由指定序列或通式组成的肽的活性相比，所述另外的残基可以改变或可以不改变其活性或功能，例如增加或降低该肽的活性。如本文所用的，“基本上由指定序列或通式组成”的肽可意指该肽可在其N末端、C末端或两个末端处包含另外的氨基酸残基、氨基酸异构体和/或氨基酸类似物，只要与仅由指定序列或通式组成的肽的活性相比，所述另外的残基不会实质上改变其活性或功能，例如，不会增加或降低该肽的活性。如本文所用的，“由指定序列或通式组成”的肽可意指该肽在其N末端和C末端均不包含另外的氨基酸残基、氨基酸异构体和/或氨基酸类似物。
所述多肽可包含通过本公开内容提供的示例性方法鉴定的表位序列，由该表位序列组成，或基本上由该表位序列组成。例如，所述多肽可包含一个或多个选自SEQ ID NO：1-94的表位序列或一个或多个选自表1、表2或表3的表位序列，由其组成，或基本上由其组成。下面的表1、表2和表3列出了表位序列和衍生出所述表位序列的病毒蛋白质或其变异。本文描述的每种多肽可以化学合成，或在体内或体外表达。该多肽可以由核酸编码，并且该核酸可以在载体，例如病毒载体，例如腺病毒载体内。该载体，例如腺病毒载体，可用来生成重组病毒，例如，重组腺病毒。本文的任何多肽可以与全长病毒蛋白质不同。本文提供的多肽可以是非天然存在的。术语“非天然存在的多肽”在本文中使用时，可以指其一级序列在自然界中不存在的多肽，例如，在自然界中的单个分子中无法找到。
表1
蛋白质 SEQ ID No： 序列
PB1 SEQ ID NO：1 GPATAQMAL
PB1 SEQ ID NO：2 GTFEFTSFFY
PB1 SEQ ID NO：3 YSHGTGTGY
PB1 SEQ ID NO：4 GLPVGGNEKKAKLANVVR
PB1 SEQ ID NO：5 GMMMGMFNMLSTVLGVS
PB1 SEQ ID NO：6 LQLFIKDYRYTYRCHRG
PB1 SEQ ID NO：7 RRAIATPGM
PA SEQ ID NO：8 FMYSDFHFI
PA SEQ ID NO：9 MRRNYFTAEVSHCRATEY
PA SEQ ID NO：10 QLMWALGENMA
PA SEQ ID NO：11 DVVNFVSMEFSLTDPRL
PA SEQ ID NO：12 KWGMEMRRCLLQSLQQI
NP SEQ ID NO：13 AEIEDLIFLA
NP SEQ ID NO：14 CTELKLSDY
NP SEQ ID NO：15 CTELKLTDQ
NP SEQ ID NO：16 CTELKLTDY
NP SEQ ID NO：17 ELRSRYWAIRTRSG
NP SEQ ID NO：18 ELKSRYWAIRTRSG
NP SEQ ID NO：19 GMDPRMCSL
NP SEQ ID NO：20 ILKGKFQTA
NP SEQ ID NO：21 ILRGSIAHK
NP SEQ ID NO：22 ILRGSVAHK
NP SEQ ID NO：23 LELRSRYWAI
NP SEQ ID NO：24 LIFLARSAL
NP SEQ ID NO：25 RGINDRNFW
NP SEQ ID NO：26 FLARSALILRGSVAHK
NP SEQ ID NO：27 RMVLSAFDER
NP SEQ ID NO：28 TLELRSGYWAIRTRSGGN
NP SEQ ID NO：29 IAYERMCNILKGKFQTAA
NP SEQ ID NO：30 FLARSALILRGSVAHKS
NP SEQ ID NO：31 FQGRGVFEL
NP SEQ ID NO：32 GQISIQPTFS
NP SEQ ID NO：33 WHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRM
NP SEQ ID NO：34 WHSNLNDTTYQRTRALVRTGMDPRM
NA SEQ ID NO：35 CVNGSCFTV
M1 SEQ ID NO：36 RMVLASTTAK
表2
Figure BDA0002182226080000141
Figure BDA0002182226080000151
Figure BDA0002182226080000161
表3
Figure BDA0002182226080000162
Figure BDA0002182226080000171
Figure BDA0002182226080000181
如本文所述的多肽可包含一个或多个表位序列，由其组成，或基本上由其组成。有时，本文所述的多肽可包含多于一个表位序列，由其组成，或基本上由其组成，其中一些表位序列相同，而其它表位序列不同，或者所有表位序列均相同，或者所有表位序列均不同。在一些情况下，一个或多个表位序列在多肽中重复，例如，大约、至少或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。有时，该多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成。该多肽可包含仅一个表位序列，由其组成，或基本上由其组成，并且所述一个表位序列可以在该多肽中存在大约、至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。
在一些情况下，多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自SEQ ID NO：1-94的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。本文提供的多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自SEQ ID NO：1-94的序列的至少8个连续氨基酸具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述多肽包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自SEQ ID NO：1-94的序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个或至少25个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自SEQ ID NO：1-94的序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个或至少25个连续氨基酸具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
在一些情况下，多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自表1、表2、表3或其任何组合的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。本文提供的多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自表1、表2、表3或其任何组合的序列的至少8个连续氨基酸具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。所述多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自表1、表2、表3或其任何组合的序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个或至少25个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。多肽可包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述一个或多个不同的表位序列中的每一个与选自表1、表2、表3或其任何组合的序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个或至少25个连续氨基酸具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
多肽可包含至少两个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述至少两个不同的表位序列中的每一个与选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。所述多肽可包含至少三个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述至少三个不同的表位序列中的每一个与SEQ IDNO：1-94或选自表1、表2或表3的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。所述多肽可包含至少四个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述至少四个不同的表位序列中的每一个与SEQ ID NO：1-94或选自表1、表2或表3的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。所述多肽可包含至少五个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述至少五个不同的表位序列中的每一个与SEQ ID NO：1-94或选自表1、表2或表3的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。所述多肽可包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个或至少51个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述不同的表位序列中的每一个与SEQ ID NO：1-94或选自表1、表2或表3的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。
一个非限制性实例涉及一种多肽，其包含至少51个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述51个不同的表位序列中的每一个与选自表3的不同序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。有时，多肽可包含至少51个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述51个不同的表位序列中的每一个与选自表3的不同序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个或至少25个连续氨基酸具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些情况下，多肽包含来自表3的每个序列，由其组成，或基本上由其组成。
在一些情况下，多肽包含至少8个氨基酸。该多肽可包含至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少1500个、至少2000个、至少2500个、至少3000个、至少4000个、至少5000个或更多个氨基酸。在一些情况下，该多肽包含至多20个、至多30个、至多40个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、至多300个、至多500个、至多800个、至多1000个、至多1500个、至多2000个、至多2500个、至多3000个、至多4000个或至多5000个氨基酸，或由其组成。该多肽可包含约8至约5000个氨基酸、约8至约4000个氨基酸、约8至约3000个氨基酸、约8至约2000个氨基酸、约8至约1000个氨基酸、约8至约500个氨基酸、约100至约5000个氨基酸、约100至约2500个氨基酸、约100至约1000个氨基酸、约1500至约3000个氨基酸、约1000至约3000个氨基酸或约1000至约2500个氨基酸，由其组成，或基本上由其组成。该多肽可以由少于5000、4000、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、750、500、250或100个氨基酸组成，例如，当合成或最初表达时，例如在细胞中。
本文提供了一种工程化多肽，其包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述表位序列可以衍生自病毒蛋白质，例如流感病毒蛋白质，例如甲型流感病毒蛋白质的至少一部分，或者是其变体或片段。在一些实施方案中，该甲型流感病毒蛋白质可以是PB1、PB1-F2、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2。PB2可以是RNA依赖性RNA聚合酶复合物的一部分，其可以促进从宿主前mRNA分子的“夺帽(cap-snatching)”以启动转录，并且可以有助于复制。在某些情况下，PB1可以是RNA依赖性RNA聚合酶，其可以与vRNA和cRNA的末端结合以启动转录和复制，并且可以在RNA链延伸期间催化核苷酸的顺序添加。PA可用于病毒转录和复制，并且可具有内切核酸酶活性。在一些情况下，PA与聚合酶活性无关。HA可以结合细胞表面上的唾液酸以供附着，并且可以在低pH下经历构象变化，暴露融合肽，该融合肽可以与内体膜相互作用，形成孔，病毒RNP可以通过该孔释放到细胞质中。NP可以包被病毒RNA以形成病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物，该复合物对于vRNP向细胞核内的运输可能是至关重要的。通过HA-唾液酸键的裂解最终释放病毒可能需要NA，HA-唾液酸键可以将病毒锚定到细胞膜上。NA还可以防止病毒颗粒聚集。M1可以形成病毒粒子和栓系NP w/vRNP的中间体核心，并且可以驱动病毒从细胞膜出芽。M2可以具有离子通道活性，并且可以将质子从酸化内体导入病毒颗粒内，从而导致vRNP与病毒组分的其余部分的pH依赖性解离。NS1可以抑制细胞抗病毒1型干扰素应答，并且可以依赖于与dsRNA的结合。NEP/NS2可能是通过募集细胞输出机制进行vRNP的核输出所必需的。甲型流感病毒蛋白质可以是NP、PB1或PA。
本文提供的多肽的一个非限制性实例包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述表位序列与衍生自PB1蛋白或者是其变体的序列(例如但不限于选自SEQ ID NO：1-7、43、51、52和63-66的序列，或选自SEQ ID NO：2、3、43、51和52的序列)的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。在一些情况下，该多肽进一步包含一个或多个不同的表位序列，该表位序列与选自SEQ IDNO：8-42、44-50、53-62、67-80和82-94的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。该多肽可包含SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94，由其组成，或基本上由其组成。在一些情况下，该多肽不包含全长PB1序列。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述表位序列与衍生自PA蛋白或者是其变体的序列(例如但限于选自SEQ ID NO：8-12、40、41、58、59、61、62、84和92的序列，或选自SEQ ID NO：8、11、12、40、41、58、59、61、62、84和92的序列)的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。有时，该多肽可以进一步包含一个或多个不同的表位序列，该表位序列与选自SEQ ID NO：1-7、13-39、42-57、60、63-80、82、83、85-91和94的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。该多肽可包含SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94，由其组成，或基本上由其组成。在一些情况下，该多肽不包含全长PA序列。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述表位序列与衍生自NP蛋白或者是其变体的序列(例如但不限于选自SEQ ID NO：13-34、37、39、42、44-50、53-57、60、67-80、82、83、85-91、93和94的序列，或选自SEQ ID NO：17、20-22、24、26、29-34、44、45、49、53、60、70、73-78、82、83、85-91、93和94的序列)的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。有时，该多肽可以进一步包含一个或多个不同的表位序列，该表位序列与选自SEQ IDNO：1-12、35、36、38、43、51、52、58、59、61-66、84和92的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。该多肽可包含SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94，由其组成，或基本上由其组成。在一些情况下，该多肽不包含全长NP序列。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述表位序列与衍生自NA蛋白或者是其变体的序列(例如但不限于选自SEQ ID NO：35和38的序列)的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。有时，该多肽可以进一步包含一个或多个不同的表位序列，该表位序列与选自SEQ ID NO：1-34、36、37、39-80和82-94的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。该多肽可包含SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94，由其组成，或基本上由其组成。在一些情况下，该多肽不包含全长NA序列。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例包含一个或多个不同的表位序列，由其组成，或基本上由其组成，所述表位序列与衍生自M1蛋白或者是其变体的序列(例如但不限于SEQ ID NO：36)的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。有时，该多肽进一步包含一个或多个不同的表位序列，该表位序列与选自SEQ IDNO：1-35、37-80和82-94的序列的至少8个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％或100％的序列同一性。该多肽可包含SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94，由其组成，或基本上由其组成。在一些情况下，该多肽不包含全长M1序列。
本文提供的多肽的一个非限制性实例可包含以下序列，由其组成，或基本上由其组成：选自SEQ ID NO：2、3、8、11、12、40、41、43、51、52、58、59、61、62、84和92的第一序列；和选自SEQ ID NO：17、20、21、22、24、26、29、30、32、33、34、44、45、49、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93和94的第二序列。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例可包含以下序列，由其组成，或基本上由其组成：选自SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、52、58、59、61、62、84和92的第一序列；和选自SEQ ID NO：17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、44、45、49、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93和94的第二序列。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例可包含以下序列，由其组成，或基本上由其组成：(a)与SEQ ID NO：8、11、12、40、41、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、43、44、45、49、51、52、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(b)与SEQ ID NO：2或43的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、44、45、49、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(c)与SEQ ID NO：21、22、24、26、30、32、49、53、60、70、85、86、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、8、11、12、40、41、43、51、52、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(d)与SEQ ID NO：17、20、29、31、33、34、44、45、73、74、75、76、77、78、82、83、87、88、89、90或91的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(e)与SEQ ID NO：2或43的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(f)与SEQ ID NO：3、51或52的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQID NO：8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93、94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(g)与SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：21、22、24、26、30、32、49、53、60、70、85、86、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或(h)与SEQ ID NO：2、8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、43、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、43、44、45、49、51、52、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列，其中包含所述第一序列和所述第二不同序列的连续序列在PB1、PA或NP中未发现。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例可包含选自以下至少两组的序列，由其组成，或基本上由其组成：(a)与SEQ ID NO：8、40、41或84的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(b)与SEQ ID NO：11、58或59的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(c)与SEQ IDNO：12、61、62或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(d)与SEQ ID NO：2或43的至少8个连续氨基酸具有至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(e)与SEQ ID NO：3、51或52的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(f)与SEQ ID NO：32、93、94或70的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(g)与SEQ IDNO：21、22或85的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(h)与SEQ ID NO：24、49或86的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(i)与SEQ ID NO：26、53、30或60的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(j)与SEQ ID NO：17、82或83的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(k)与SEQ ID NO：20、44或45的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(1)与SEQ ID NO：29、87、88、89、90或91的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；(m)与SEQ ID NO：31的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；和(n)与SEQID NO：33、34、73、74、75、76、77或78的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列；其中至少一个序列选自组(a)-(d)，并且至少一个序列选自组(f)-(n)。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例可包含以下序列，由其组成，或基本上由其组成：(o)至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：8、40、41或84中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：8、40、41或84中的任一个具有至少55％、至少66％、至少77％、至少88％或100％的序列同一性；(p)至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：11、58或59中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：11、58或59中的任一个的至少9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸具有至少52％、至少58％、至少64％、至少70％、至少76％、至少82％、至少88％、至少94％或100％的序列同一性；(q)至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：12、61、62或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：12、61、62或92中的任一个的至少9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸具有至少52％、至少58％、至少64％、至少70％、至少76％、至少82％、至少88％、至少94％或100％的序列同一性；(r)至少1或2个序列，每个序列与SEQ ID NO：2或43中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1或2个序列，每个序列与SEQ IDNO：2或43中的任一个的至少9或10个连续氨基酸具有至少至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的序列同一性；(s)至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：3、51或52中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：3、51或52中的任一个的至少9或10个连续氨基酸具有至少55％、至少66％、至少77％、至少88％或100％的序列同一性；(t)至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：32、93、94或70中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：32、93、94或70中的任一个的至少9或10个连续氨基酸具有至少60％、70％、80％、90％或100％的序列同一性；(u)至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：21、22或85中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：21、22或85中的任一个的9个连续氨基酸具有至少55％、至少66％、至少77％、至少88％或100％的序列同一性；(v)至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：24、49或86中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或与SEQ ID NO：24、49或86中的任一个的9个连续氨基酸具有至少55％、至少66％、至少77％、至少88％或100％的序列同一性；(w)至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：26、53、30或60中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2、3或4个序列，每个序列与SEQ ID NO：26、53、30或60中的任一个的至少9、10、11、12、13、14、15或16个连续氨基酸或SEQ ID NO：30或60中的任一个的至少9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸具有至少50％、至少56％、至少62％、至少68％、至少75％、至少81％、至少87％、至少93％或至少100％的序列同一性；(x)至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：17、82或83中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：17、82或83中的任一个的至少9、10、11、12、13或14个连续氨基酸具有至少50％、至少57％、至少60％、至少71％、至少78％、至少85％、至少92％或100％的序列同一性；(y)至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：20、44或45中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2或3个序列，每个序列与SEQ ID NO：20、44或45中的任一个的9个连续氨基酸具有至少55％、至少66％、至少77％、至少88％或100％的序列同一性；(z)至少1、2、3、4、5或6个序列，每个序列与SEQ ID NO：29、87、88、89、90或91中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2、3、4、5或6个序列，每个序列与SEQ ID NO：29、87、88、89、90或91中的任一个的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个连续氨基酸具有至少50％、至少55％、至少61％、至少66％、至少72％、至少83％、至少88％、至少94％或100％的序列同一性；(aa)与SEQ ID NO：31的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：31的9个连续氨基酸具有至少55％、至少66％、至少77％、至少88％或100％序列同一性的序列；(bb)至少1、2、3、4、5、6、7或8个序列，每个序列与SEQ ID NO：33、34、73、74、75、76、77或78中的任一个的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％的序列同一性，或至少1、2、3、4、5、6、7或8个序列，每个序列与SEQ ID NO：33、34、73、74、75、76、77或78中的任一个的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸具有至少52％、至少56％、至少60％、至少64％、至少68％、至少72％、至少76％、至少80％、至少84％、至少88％、至少92％、至少96％或100％的序列同一性；或(o)-(bb)的任何组合。
本文提供的多肽的另一个非限制性实例可包含以下序列，由其组成，基本上由其组成：(cc)至少两个选自SEQ ID NO：8、40、41和84的序列；(dd)至少两个选自SEQ ID NO：11、58和59的序列；(ee)至少两个选自SEQ ID NO：12、61、62和92的序列；(ff)至少两个选自SEQ ID NO：2和43的序列；(gg)至少三个选自SEQ ID NO：3、51和52的序列；(hh)至少两个选自SEQ ID NO：32、93、94和70的序列；(ii)至少两个选自SEQ ID NO：21、22和85的序列；(jj)至少两个选自SEQ ID NO：24、49和86的序列；(kk)至少两个选自SEQ ID NO：26、53、30和60的序列；(11)至少两个选自SEQ ID NO：17、82和83的序列；(mm)至少两个选自SEQ ID NO：20、44和45的序列；(nn)至少两个选自SEQ ID NO：29、87、88、89、90和91的序列；或(oo)至少两个选自SEQ ID NO：33、34、73、74、75、76、77和78的序列。
在一些情况下，本文提供的多肽可以进一步包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒蛋白质的全长氨基酸序列(或全长序列的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)，所述一种或多种病毒蛋白质例如是一种或多种流感病毒蛋白质，例如，一种或多种甲型流感、乙型流感或丙型流感病毒蛋白质，例如来自甲型流感、乙型流感或丙型流感的PB1、PB1-F2、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2。在一些情况下，本文提供的疫苗包含多肽，该多肽包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒蛋白质的全长氨基酸序列(或全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)，所述一种或多种病毒蛋白质例如是一种或多种流感病毒蛋白质，例如，一种或多种甲型流感、乙型流感或丙型流感病毒蛋白质，例如来自甲型流感、乙型流感或丙型流感的PB1、PB1-F2、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2，例如，或者该多肽由疫苗中的单独核酸或病毒例如腺病毒表达。本文提供的多肽可包含病毒蛋白质的全长氨基酸序列(或全长序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％)的序列的1、2、3、4或5个或更多个拷贝。该全长氨基酸序列(或全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)可以在多肽的N末端、多肽的C末端、在多肽内部，或者，例如，如果存在多个拷贝，则在多肽的N末端和C末端。例如，多肽可以包含来自表1、表2或表3的至少5、10、20、30、40、50或51个序列(例如，每个序列来自表1、表2或表3之一)，每个序列由连接体隔开或不由连接体隔开，以及一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒蛋白质的全长氨基酸序列(或全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)的1、2或3个拷贝，所述一种或多种病毒蛋白质例如是一种或多种流感病毒蛋白质，例如，一种或多种甲型流感、乙型流感或丙型流感病毒蛋白质，例如来自甲型流感、乙型流感或丙型流感的PB1、PB1-F2、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2。
在一些情况下，本文提供的多肽可进一步包含流感NP蛋白的全长氨基酸序列(或全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)，该流感例如是甲型流感、乙型流感或丙型流感。在一些情况下，NP蛋白序列(或NP的全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)可以来自任何合适的乙型流感病毒株。例如，可以基于流感季节的流行株或预期的流行株来选择序列。可以随机选择从中选择NP序列的乙型流感病毒株。例如，多肽可包含来自特定乙型流感病毒株的NP蛋白序列的氨基酸序列(或NP的全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)，该乙型流感病毒株例如是属于B/Victoria谱系的B/Brisbane/60/2008-样，或属于B/Yamagata谱系的B/Phuket/3073/2013-样或B/Pennsylvania/49/2015。乙型流感NP蛋白的全长氨基酸序列的衍生物(或片段)可以与乙型流感NP蛋白的全长氨基酸序列(或NP的全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)具有至少60％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性、至少99.5％的同一性、至少99.8％的同一性、至少99.9％的同一性、至少99.99％的同一性。乙型流感NP蛋白的全长氨基酸序列的衍生物(或片段)可包含与乙型流感NP蛋白的全长氨基酸序列不同的至多100个氨基酸、至多80个氨基酸、至多60个氨基酸、至多50个氨基酸、至多40个氨基酸、至多30个氨基酸、至多20个氨基酸、至多15个氨基酸、至多10个氨基酸、至多9个氨基酸、至多8个氨基酸、至多7个氨基酸、至多6个氨基酸、至多5个氨基酸、至多4个氨基酸、至多3个氨基酸、至多2个氨基酸或仅1个氨基酸，或由所述氨基酸组成。多肽可包含表1中的所有序列，每个序列之间具有或不具有连接体，以及全长蛋白质(或蛋白质全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)例如来自乙型流感病毒株的NP蛋白的一个或两个拷贝。多肽可包含表2中的所有序列，每个序列之间具有或不具有连接体，以及全长蛋白质(或蛋白质全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)例如来自乙型流感病毒株的NP蛋白的一个或两个拷贝。多肽可包含表3中的所有序列，每个序列之间具有或不具有连接体，以及全长蛋白质(或蛋白质全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)例如来自乙型流感病毒株的NP蛋白的一个或两个拷贝。
在一些情况下，多肽可包含来自属于B/Victoria谱系的病毒的NP蛋白的氨基酸序列(全长或片段)。例如，多肽可包含与来自乙型流感/Brisbane/60/2008的NP蛋白(登录号：AGK63064.1，SEQ ID NO：116)的全长或片段(例如，包含氨基酸1-560、38-557、50至500、100至500、200至400、1至100、100至200、200至300、300至400或500至560)具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多肽可包含来自属于B/Yamagata谱系的病毒的NP蛋白的氨基酸序列(全长或片段)。例如，多肽可包含与来自乙型流感/Yamagata/16/1988的NP蛋白(登录号：ABL77260.1，SEQ ID NO：117)或来自乙型流感/Pennsylvania/49/2015的NP蛋白(登录号：AOZ82278.1，SEQ ID NO：118)的全长或片段(例如，包含氨基酸1至560、2至560、50至500、100至500、200至400、1至100、2至100、100至200、200至300、300至400或500至560)具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多肽可包含来自属于B/Victoria谱系的病毒的NP蛋白的氨基酸序列(全长或片段)或其衍生物，以及来自属于B/Yamagata谱系的病毒的NP蛋白的氨基酸序列(全长或片段)或其衍生物。
本文提供的多肽可包含按顺序排列的一个或多个表位序列，由其组成，或基本上由其组成。在一些情况下，表位序列以特定顺序排列，其中考虑促进免疫原性、增加表达、促进多肽稳定性、增加多肽溶解度、促进多肽链的体内切割，或可能影响疫苗性能的其它任何因素，或其任何组合。还可以操纵多肽中表位序列的顺序，以精细调节疫苗的某些方面，如本领域技术人员能够实现的那样上调或下调一个或多个特定参数。
在一些实施方案中，所述多肽包含直接(例如“背对背”)连接在一起的超过一个表位序列。或者，该多肽可包含超过一个表位序列，由其组成，或基本上由其组成，其中至少两个相邻的表位序列用连接体序列连接。该多肽可以始终包含单一类型的连接体序列。该多肽可包含超过一个不同类型的连接体序列。连接体序列的选择可以根据以下因素而不同：肽序列的选择，对许多不同参数的具体要求，例如但不限于表达水平、折叠和稳定性、溶解度、细胞和亚细胞靶向、免疫原性、体外和体内半衰期。
连接体可以是用来分隔单个多肽中的多个结构域的短氨基酸序列。在一些情况下，连接体序列可包含3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。连接体序列可包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或至少50个氨基酸。连接体序列可包含至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多15个、至多20个、至多30个、至多40个、至多50个或至多100个氨基酸。
连接体序列可包含在天然多结构域蛋白质中存在的序列，其连接其中的结构域。连接体序列可包含人工创建的连接体。该连接体也可以是天然连接体蛋白质和人工创建的序列的连接产物。在一些情况下，可以选择具体的连接体序列用于多肽的体内可切割性。例如，可能希望在某些表位序列之间切割，从而使分离的两个或更多个多肽部分分别呈递给抗原呈递细胞。连接体可包含多个甘氨酸、丙氨酸或其任何组合。连接体可包含多个精氨酸、缬氨酸、赖氨酸或其任何组合。在这类示例性情况下，可以选择连接体序列，如LEAGCKNFFPRSFTSCGSLE(SEQ ID NO：95)、CRRRRRREAEAC(SEQ ID NO：96)。有时，可能希望使用柔性连接体序列，例如但不限于Gly和Ser残基的序列段(“GS”连接体)，如(GGGGS)n(n＝1至10)(SEQ ID NO：107)、(Gly)8(SEQ ID NO：97)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：98)、(GGGGS)4(SEQ ID NO：99)。在一些情况下，可能希望使用刚性连接体序列，例如但不限于(EAAAK)n(SEQ ID NO：108)，富含Pro的序列，如(XP)n(SEQ ID NO：109)，其中X表示可以使用任意氨基酸(n＝1至20)。在一些情况下，可以选择连接体序列RVKR(SEQ ID NO：110)。在一些情况下，连接体序列RVKR(SEQ ID NO：110)可以是免疫刺激性的。所述多肽可包含来自表1、表2或表3的每个序列，由其组成，或基本上由其组成，其中每个序列由连接体隔开。所述多肽可包含来自表1、表2或表3的每个序列，由其组成，或基本上由其组成，其中每个序列不由连接体隔开。所述多肽可包含来自表1、表2或表3的每个序列，由其组成，或基本上由其组成，其中一些序列由连接体隔开，一些序列不由连接体隔开。
在本公开内容的某些方面，本文提供的多肽进一步包含与一个或多个上述表位序列连接的CD4+(辅助)T细胞表位。“连接”可以是例如直接或间接共价连接，或直接或间接非共价连接。该CD4+(辅助)T细胞表位可以是ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO：100)。在一些情况下，该CD4+(辅助)T细胞表位是AKFVAAWTLKAAA(HLA DR结合表位，PADRE)(SEQ ID NO：101)，或PADRE序列的非天然氨基酸衍生物，AKXVAAWTLKAAAZC(SEQ ID NO：102)，其中X是L-环己基丙氨酸，Z是氨基己酸。在一些情况下，该CD4+(辅助)T细胞表位可以是GALNNRFQIKGVELKSK(SEQ ID NO：103)。在一些实施方案中，本文提供的多肽的C末端，例如，包含选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列的多肽的C末端，与赖氨酸连接，并且该赖氨酸与CD4+T细胞表位的N末端连接。CD4+(辅助)T细胞表位的C末端可以与赖氨酸连接，并且该赖氨酸可以与包含选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列的肽的N末端连接。
多肽可以连接至全长病毒蛋白质，例如，全长PB1、PB1-F2、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2蛋白，或者多肽可以例如通过本文所述的连接体连接至与来自例如甲型流感、乙型流感或丙型流感的任何这些蛋白质的全长序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％序列同一性的蛋白质，或者该连接可以不使用连接体。
本文提供的多肽可包含一种或多种天然氨基酸、非天然氨基酸或其组合。氨基酸残基可以是既含有氨基又含有羧基的分子。用于所述肽的合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体(氨基酸异构体)，以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。氨基酸可以是α-氨基酸、β-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物。α-氨基酸可以是含有与碳结合的氨基和羧基的分子，该碳被称为α-碳。β-氨基酸可以是含有β构型的氨基和羧基的分子。天然存在的氨基酸可以是在自然界中合成的肽中常见的20种氨基酸中的任何一种，并且用单字母缩写A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V表示。
本文提供的多肽可包含一种或多种疏水性、亲水性、极性或带电荷的氨基酸。疏水性氨基酸可包括小的疏水性氨基酸和大的疏水性氨基酸。小的疏水性氨基酸可以是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物和异构体。大的疏水性氨基酸可以是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似物和异构体。极性氨基酸可以是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其类似物和异构体。带电荷的氨基酸可以是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或其类似物。
本文提供的多肽可包含一种或多种氨基酸类似物。氨基酸类似物可以是在结构上类似于氨基酸并且可以在拟肽大环化合物的形成中替代氨基酸的分子。氨基酸类似物包括β-氨基酸和其中氨基或羧基被类似反应性基团替代(例如，用仲胺或叔胺替代伯胺，或用酯替代羧基)的氨基酸。
本文提供的多肽可包含一种或多种非天然氨基酸。非天然氨基酸可以是不是自然界合成的肽中常见并且用单字母缩写A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V表示的二十种氨基酸之一的氨基酸。
氨基酸类似物可包括β-氨基酸类似物。氨基酸类似物可包括丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或色氨酸的类似物。
氨基酸类似物可以是外消旋的。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的D异构体。在一些情况下，使用氨基酸类似物的L异构体。在一些实施方案中，氨基酸类似物包含呈R或S构型的手性中心。有时，β-氨基酸类似物的氨基被诸如叔丁氧羰基(BOC基团)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、甲苯磺酰基等保护基团取代。有时，β-氨基酸类似物的羧酸官能团例如作为其酯衍生物得到保护。在一些情况下，使用氨基酸类似物的盐。
本文提供的多肽可包含非必需氨基酸。非必需氨基酸残基可以是相对于肽的野生型序列可能发生改变而不消除或基本不改变其基本生物学或生物化学活性(例如，受体结合或激活)的残基。本文提供的肽可包含必需氨基酸。“必需”氨基酸残基可以是当相对于肽的野生型序列发生改变时导致该肽的基本生物学或生物化学活性消除或基本上消除的残基。
本文提供的多肽可包含保守氨基酸置换。保守氨基酸置换可以是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的氨基酸置换。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族可包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，K、R、H)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D、E)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、具有β分支的侧链的氨基酸(例如，T、V、I)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，Y、F、W、H)。因此，肽中预测的非必需氨基酸残基例如可以被来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基所替代。可接受的置换的其它例子可以是基于电子等排考虑(例如，正亮氨酸置换甲硫氨酸)或其它性质(例如，2-噻吩丙氨酸置换苯丙氨酸，或6-Cl-色氨酸置换色氨酸)的置换。
疫苗组合物
本文提供的各个表位序列，如本文提供的其中各个表位序列连接起来的多肽，表达本文提供的各个表位序列或多肽的核酸，包含表达本文提供的各个表位序列或多肽的核酸的载体，或包含此类核酸或载体的病毒，可以被配制成疫苗。本文提供的疫苗可以是用来刺激抗体产生并提供针对一种或多种疾病(例如流感)的免疫的任何物质。该疫苗可以由活病原体、减毒活病原体或已被例如化学品、热或辐射灭活的灭活病原体制备。该疫苗可含有病原体的亚单位或部分，其中这些亚单位可任选地缀合。该疫苗还可以被制备成基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于病毒载体的疫苗、基于抗体的疫苗或基于抗原呈递细胞的疫苗。
例如，所述疫苗可以针对病原体提供保护。病原体可以是任何传染性生物体，包括细菌、真菌、病毒、原生动物等。该疫苗还可包括肿瘤或癌症疫苗。本文提供的组合物，例如疫苗，当施用到受试者体内，例如人体内时，可以诱导全身性免疫应答。本文提供的组合物，例如疫苗，当施用到受试者体内，例如人体内时，除了全身性免疫应答外，还可以在例如呼吸道中诱导粘膜免疫应答。
所述疫苗可以是传统疫苗或通用疫苗。传统疫苗可以是可针对特定病原体的疫苗。麻疹疫苗是传统疫苗的一个例子。它可以靶向麻疹病毒血凝素(H)蛋白上存在的表位，这些表位已经保持了超过50年。
季节性疫苗可以是另一种类型的传统疫苗。例如，流感疫苗可以每年进行改进，并针对给定年份出现的流感病毒群体进行调整。在一些情况下，流感疫苗作为三价疫苗产生，其可包括甲型流感病毒的两个亚型：H1N1和H3N2，以及一种乙型流感病毒株。有时，流感疫苗作为四价疫苗产生，其可包括甲型流感病毒的两个亚型和两种乙型流感病毒株。可以根据基于监测的预报来选择甲型和乙型流感病毒的具体菌株，所述预报可以预测每年流行菌株的致病性，并且可以因国家而异。
通用疫苗可以是提供针对多种病原体株和/或针对同一家族内的多种病原体的广泛保护的疫苗。示例性的通用疫苗包括来自Inovio Pharmaceuticals的
Figure BDA0002182226080000381
流感疫苗、来自BiondVax的M-001和来自Immune Targeting Systems的FP-01。这些通用疫苗可以靶向流感病毒蛋白质内存在的保守区域或表位。保守区域或表位可以展现出至少70％、80％、90％、95％、99％的序列同源性或序列同一性。
疫苗组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂(carrier)来配制，所述载剂包括赋形剂和助剂，其有助于将一种或多种活性剂，如一种或多种肽、核酸、蛋白质(例如，抗体或其片段)、APC或本文所述的病毒，加工成可药用的制品。合适的制剂可取决于所选择的给药途径。
在一些情况下，所述疫苗组合物被配制为基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗、基于细胞的疫苗或基于病毒的疫苗。例如，疫苗组合物可包括阳离子脂质制剂中的裸cDNA；脂肽(参见，例如，Vitiello，A.等人，J.Clin.Invest.95：341，1995)、裸cDNA或肽，例如包封在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球中(参见，例如，Eldridge等人，Molec.Immunol.28：287-294，1991；Alonso等人，Vaccine 12：299-306，1994；Jones等人，Vaccine 13：675-681，1995)；免疫刺激复合物(ISCOMS)中含有的肽组合物(参见，例如，Takahashi等人，Nature 344：873-875，1990；Hu等人，Clin Exp Immunol.113：235-243，1998)；或多个抗原肽系统(MAP)(参见，例如，Tarn，J.P.，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85：5409-5413，1988；Tarn，J.P.，J.Immunol.Methods 196：17-32，1996)。有时，将疫苗配制为基于肽的疫苗，或基于核酸的疫苗，其中该核酸编码该肽。有时，将疫苗配制为基于抗体的疫苗。有时，将疫苗配制为基于细胞的疫苗。
疫苗组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂来配制，所述载剂包括赋形剂和助剂，其有助于将一种或多种活性剂，如一种或多种肽、核酸、蛋白质(例如，抗体或其片段)、APC或本文所述的病毒，加工成可药用的制品。合适的制剂可取决于所选择的给药途径。
基于肽的疫苗
本文提供了基于肽的疫苗，其包含一个或多个表位序列或一种或多种本文所述的多肽。例如，该多肽可包含一个或多个选自SEQ ID NO：1-94的表位序列或一个或多个选自表1、表2或表3的表位序列，由其组成，或基本上由其组成。基于肽的疫苗可包含一种多肽。基于肽的疫苗可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、51个或更多个不同的肽序列，例如，每种肽可以与SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、43、44、45、49、51、52、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的至少8、9、10、14、16、17、18或25个氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。基于肽的疫苗可用来治疗或预防流感感染。
在一些实施方案中，组合物包含一种或多种肽或多肽，基本上由其组成，或由其组成，所述肽或多肽可以是或者可以不是纯化的如本文所述的肽或多肽。如本文所用的，“包含”一种或多种如本文所述的肽或多肽的组合物可意味着该组合物可含有其它化合物，包括一种或多种本文未描述的蛋白质。如本文所用的，“基本上由一种或多种肽或多肽组成的”组合物可意味着除了本文所述的肽或多肽之外，该组合物还可以包含其它化合物，只要其它化合物不会实质上改变该组合物中含有的所述一种或多种肽或多肽的活性或功能即可。如本文所用的，“由一种或多种如本文所述的肽或多肽组成的”组合物可意味着除了一种或多种本文所述的肽或多肽之外，该组合物不含其它蛋白质。由一种或多种本文所述的肽或多肽组成的组合物可包含除蛋白质之外的成分，例如药学上可接受的载剂、表面活性剂、防腐剂等。在一些实施方案中，由一种或多种本文所述的肽或多肽组成的组合物可含有不显著量的污染物，其可包括肽或多肽污染物，例如一种或多种本文所述的肽或多肽的较小片段，其可以如下产生：例如，一种或多种本文所述的肽或多肽的合成、后续加工、储存条件和/或蛋白质降解。
基于肽的疫苗可以使用合适的技术、载剂和赋形剂来配制。可以配制基于肽的疫苗以改善其生物半衰期、稳定性、功效、生物利用度、生物活性或其组合。
有时，疫苗可包含含有相同序列的多种本文所述多肽的混合物，或本文所述的不同多肽的多个拷贝的混合物。可以修饰多肽，例如通过脂化或附着于载体蛋白。脂化可以是脂质基团与多肽的共价连接。脂化的多肽可以稳定结构并且可以增强疫苗治疗的功效。
脂化可以分为几种不同的类型，如N-豆蔻酰化、棕榈酰化、GPI-锚添加、异戊烯化和几种其它类型的修饰。N-豆蔻酰化可以是肉豆蔻酸(一种C14饱和酸)与甘氨酸残基的共价连接。棕榈酰化可以是长链脂肪酸(C16)与半胱氨酸残基的硫酯连接。GPI-锚添加可以是经由酰胺键的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接。异戊烯化可以是类异戊二烯脂质(例如，法尼基(C-15)、香叶基香叶基(C-20))与半胱氨酸残基的硫醚连接。其它类型的修饰可包括通过半胱氨酸的硫原子连接S-二酰基甘油，经由丝氨酸或苏氨酸残基的O-辛酰基缀合，S-archaeol与半胱氨酸残基的缀合，和胆固醇连接。
用于生成脂化多肽的脂肪酸可包括饱和的、单不饱和的或多不饱和的C2至C30脂肪酰基。示例性脂肪酸可包括棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基和癸酰基。
在一些实施方案中，将具有佐剂性质的脂质部分附接至目标肽，以在不存在外源佐剂的情况下引发或增强免疫原性。脂化肽或脂肽可被称为自身佐剂脂肽。
上文和本文其它地方描述的任何脂肪酸可以引发或增强目标肽的免疫原性。可引发或增强免疫原性的脂肪酸可包括棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基和癸酰基。在一些情况下，可引发或增强免疫原性的脂肪酸可包括棕榈酰基。棕榈酰基的非限制性实例包括Pam2Cys、Pam3Cys或Pam3OH。
Pam2Cys，也称为二棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸或S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸，对应于MALP-2的脂质部分，MALP-2是从发酵支原体(Mycoplasmafermentans)中分离的一种巨噬细胞激活性脂肽。
Pam3Cys，也称为Pam3OH或N-棕榈酰基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸，是跨越革兰氏阴性细菌内膜和外膜的Braun脂蛋白N末端部分的合成形式。
考虑使用的其它脂肪酸基团包括Set2Cys(也称为S-(2，3-双(硬脂酰氧基)丙基)半胱氨酸或二硬脂酰基-5-甘油基-半胱氨酸)、Lau2Cys(也称为S-[2，3-双(月桂酰氧基)丙基]半胱氨酸或二月桂酰基-S-甘油基-半胱氨酸)和Oct2Cys(也称为S-[2，3-双(辛酰氧基)丙基]半胱氨酸或二辛酰基-S-甘油基-半胱氨酸)。
其它合适的脂肪酸基团包括合成的三酰化和二酰化脂肽，FSL-I(源自唾液支原体的合成脂蛋白I)、Pam3Cys(三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸)和S-[2，3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸，其中“Pam3”是“三棕榈酰基-S-甘油基”。Pam3Cys的衍生物也适合使用，其中衍生物包括S-[2，3-双(棕榈酰氧基)-(2-R，S)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4-羟基三盐酸盐(“(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4”，公开为SEQ IDNO：111)；Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala(SEQ ID NO：112)；PaM3Cys-Ser-(Lys)4(SEQ ID NO：113)；Pam3Cys-Ala-Gly；PamsCys-Ser-Gly；Pam3Cys-Ser；PaM3CyS-OMe；Pam3Cys-OH；PamCAG，棕榈酰基-Cys((RS)-2，3-二(棕榈酰氧基)-丙基)-Ala-Gly-OH；等等。另一个非限制性实例包括Pam2CSK4(SEQ ID NO：114)(二棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸-丝氨酸-(赖氨酸)4；或Pam2Cys-Ser-(Lys)4(SEQ ID NO：114))。
可以将诸如裸肽或脂化肽的肽并入脂质体中。例如，脂化肽的脂质部分可以自发地整合到脂质体的脂双层中。因此，脂肽可以呈现于脂质体的“表面”上。脂化肽可以是包封在脂质体内的肽。
适合掺入制剂中的示例性脂质体包括但不限于多层囊泡(MLV)、寡层囊泡(OLV)、单层囊泡(UV)、小单层囊泡(SUV)、中等大小的单层囊泡(MUV)、大单层囊泡(LUV)、巨大单层囊泡(GUV)、多泡囊泡(MVV)、通过反相蒸发法制备的单层或寡层囊泡(REV)、通过反相蒸发法制备的多层囊泡(MLV-REV)、稳定的多层囊泡(SPLV)、冷冻并解冻的MLV(FATMLV)、通过挤出法制备的囊泡(VET)、通过弗氏压碎制备的囊泡(FPV)、通过融合制备的囊泡(FUV)、脱水-再水化囊泡(DRV)和泡状体(bubblesomes)(BSV)。
根据制备方法，脂质体可以是单层或多层的，并且可以在大小上不等，直径范围为约0.02μm至大于约10μm。有时，脂质体可以是小单层囊泡(25-50nm)、大单层囊泡(100-200nm)、巨大单层囊泡(1-2μm)和多层囊泡(MLV；1μm-2μm)。所递送的肽可以包封在脂质体内或吸附在表面上。脂质体的大小和表面性质可以针对期望的结果进行优化。例如，单层和多层脂质体在血管内施用后数小时至数天提供持续释放。延长的药物释放可以通过多囊泡脂质体实现，也称为
Figure BDA0002182226080000431
技术。与ULV和MLV不同，多囊泡脂质体由被脂质层网络包围的多个非同心水性腔室组成，这赋予水平提高的稳定性和更长的药物释放持续时间。可以进一步修饰脂质体以获得所需的结果。例如，脂质体可以被聚乙二醇化或具有其它表面修饰，以干扰被网状内皮系统的识别和摄取，并提供增加的循环时间。
脂质体可以吸附许多类型的细胞，然后释放掺入的药剂(例如，本文所述的多肽)。在一些情况下，脂质体与靶细胞融合，由此脂质体的内容物然后排空到靶细胞中。脂质体可以被吞噬细胞内吞。胞吞之后可以是脂质体脂质的溶酶体内降解和所包封的药剂的释放。
本文提供的脂质体还可包含载体脂质。在一些实施方案中，该载体脂质是磷脂。能够形成脂质体的载体脂质包括但不限于二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(PC；卵磷脂)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)。其它合适的磷脂还包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)；二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)等，或其组合。在一些实施方案中，脂质体还包含调节脂质体形成的甾醇(例如胆固醇)。载体脂质可以是任何已知的非磷酸极性脂质。
如本文所述的多肽还可以附接至载体蛋白以供作为疫苗递送。该载体蛋白可以是免疫原性载体元件，并且可以通过任何重组技术附接。示例性载体蛋白包括海水养殖匙孔
Figure BDA0002182226080000441
血蓝蛋白(mcKLH)、聚乙二醇化的mcKLH、Blue Carrier*蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、阳离子化BSA、卵清蛋白和细菌蛋白质如破伤风类毒素(TT)。
如本文所述的多肽也可以被制备为多种抗原肽(MAP)。多肽可以在N末端或C末端附接到小的非免疫原性核心。构建在该核心上的多肽可提供高度局部化的肽密度。该核心可以是树枝状核心残基或由双官能单元组成的基质。用于构建MAP的合适的核心分子可包括氨、乙二胺、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。例如，赖氨酸核心分子可以经由肽键通过其每个氨基连接至另外两个赖氨酸。这种第二代分子具有四个游离氨基，每个游离氨基可以与另外的赖氨酸共价连接以形成具有8个游离氨基的第三代分子。多肽可以经由其C末端与这些游离基团中的每一个连接，以形成八价多抗原肽(也称为“MAP8”结构)。具有四个游离氨基的第二代分子可用来形成四价或四聚体MAP，例如具有与核心共价连接的四个肽的MAP(也称为“MAP4”结构)。第一个赖氨酸残基的羧基可以是游离的、酰胺化的或与β-丙氨酸或另一种封闭化合物偶联。如本文所用的，MAP系统结构的“线性部分或分子”可以指与核心基质连接的抗原肽。因此，一簇抗原表位可以形成MAP的表面，并且小的基质形成其核心。可以使用经典Merrifield合成方法在固体树脂上合成树枝状核心和整个MAP。
用于MAP制备的多肽可以是相同的，或者可以包含多种不同的序列和长度。该多肽可以来源于细菌、病毒或真菌。该肽可以来源于病毒，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或HIV。
有时，可以对本文所述的多肽进行环化，以产生对蛋白水解降解具有抗性的环肽。可以使用本领域已知的方法通过二硫键、羊毛硫氨酸、二碳杂(dicarba)、肼或内酰胺桥在肽序列的侧链或末端之间进行环化。
在一些实施方案中，如本文所述的多肽与诸如维生素B12、脂质或环氧乙烷化合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)和聚氧乙烯(POE)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)、单甲氧基PEG(mPEG)等分子缀合。环氧乙烷化合物可以用例如胺结合末端官能团如N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯和脂族醛或硫醇结合基团如马来酰亚胺、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酸酯进一步官能化。由于氨基(α-氨基和ε-赖氨酸氨基)和半胱氨酸残基非常适合于缀合，因此本文提供的肽可以进一步包括一个或多个氨基酸残基，以供与环氧乙烷分子或本领域已知的载体化合物缀合。通过使用特定的连接体可以进一步改变所缀合的肽的药代动力学和药效学性质。例如，丙基和戊基连接体可用来提供具有松散构象的缀合物，而苯基连接体可用来提供更致密的构象以及与C末端相邻的屏蔽域。在一些情况下，相对于松散构象，致密构象在维持生物活性、延长血浆半衰期、降低蛋白水解敏感性和免疫原性方面可能更有效。
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以使用本领域已知的方法，例如原位化学反应或定点诱变进行高糖基化。高糖基化可以导致N-连接或O-连接的蛋白质糖基化。可以通过选择特定的糖来优化给定肽的清除率。例如，聚唾液酸(PSA)可以以不同的大小获得，并且其清除率取决于聚合物的类型和分子大小。因此，例如，具有高分子量的PSA可以适合于递送低分子量肽，而具有低分子量的PSA可以适合于递送具有高分子量的肽。糖的类型可用来将肽靶向至特定组织或细胞。例如，与甘露糖缀合的多肽可以被甘露糖特异性凝集素，例如甘露糖受体和甘露糖结合蛋白质识别，并且被肝脏摄取。在一些实施方案中，所述多肽可以是高糖基化的，以改善它们在不同环境条件下的物理和化学稳定性，例如，抑制在应激条件下的失活，并减少由生产和储存条件引起的聚集。
在一些实施方案中，诸如微粒、纳米颗粒(大小范围为10至1000nm的颗粒)、纳米乳剂、脂质体等药物递送系统可用来提供对敏感蛋白质的保护、延长释放、降低给药频率、增加患者的依从性并控制血浆水平。可以使用各种天然或合成的微粒和纳米颗粒，其可以是可生物降解的和/或生物相容的聚合物。微粒和纳米颗粒可以由脂质、聚合物和/或金属制成。聚合物微粒和纳米颗粒可以由诸如淀粉、藻酸盐、胶原、壳聚糖、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)等天然或合成聚合物制成。在一些实施方案中，纳米颗粒是固体脂质纳米颗粒(SLN)、碳纳米管、纳米球、纳米胶囊等。在一些实施方案中，该聚合物是亲水性的。在一些实施方案中，该聚合物是硫醇化的聚合物。
由于从微粒和纳米颗粒释放药物的速率和程度可取决于聚合物的组成和制备方法，因此可以选择给定的组成和制备方法，例如喷雾干燥、冻干、微挤出和双重乳液，以赋予所需的药物释放曲线。由于引入微粒或纳米颗粒之中或之上的肽在制剂开发期间可能易于在水-有机物界面处变性，因此可以使用不同的稳定赋形剂和组合物来防止聚集和变性。例如，可以将PEG和糖，例如PEG(MW 5000)和麦芽糖与α-胰凝乳蛋白酶，添加到组合物中以减少聚集和变性。另外，可以使用如本文所述的化学修饰的肽，例如缀合的肽和高糖基化的肽。
蛋白质稳定性也可以通过选择的制备方法实现。例如，为了防止水-有机物界面处的降解，可以使用被称为
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技术的非水性方法。固态的肽也可以使用水包油包固体(s/o/w)方法包封，例如，喷雾干燥或喷雾冷冻干燥的肽或负载有肽的固体纳米颗粒可以使用s/o/w方法包封在微球中。
可以使用疏水性离子配对(HIP)复合来增强蛋白质稳定性并增加向微粒和纳米颗粒内的包封效率。在疏水性离子配对(HIP)复合中，肽的可电离官能团与含有带相反电荷的官能团的离子配对剂(例如，表面活性剂或聚合物)复合，导致形成HIP复合物，其中亲水性蛋白质分子以疏水性复合物的形式存在。
本文描述的多肽可以化学合成，或在细胞系统或无细胞系统中重组表达。多肽可以例如通过液相合成、固相合成或通过微波辅助的肽合成来合成。可以修饰如本文所述的多肽，例如通过酰化、烷基化、酰胺化、精氨酰化、聚谷氨酰化、聚甘氨酰化、丁酰化、γ-羧化、糖基化、丙二酰化、羟基化、碘化、核苷酸添加(例如ADP-核糖基化)、氧化、磷酸化、腺苷酰化、丙酰化、S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化、琥珀酰化、硫酸化、糖基化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化或异戊烯化(例如，法尼基化或香叶基香叶基化)、糖基磷脂酰肌醇化、脂化、黄素部分(例如，FMN或FAD)的附接、血红素C的附接、磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)、亚视黄基席夫碱形成、白喉酰胺形成、乙醇胺磷酸甘油附接、尾下素形成、生物素化、聚乙二醇化、ISG化、SUMO化、遍在蛋白化、类泛素化(Neddylation)、PUP化(Pupylation)、瓜氨酸化、脱酰胺、eliminylation、氨基甲酰化或其组合。
在生成多肽后，可以对多肽进行一轮或多轮纯化步骤以除去杂质。该纯化步骤可以是利用诸如基于亲和力、基于大小排阻、基于离子交换等的分离方法的色谱步骤。在一些情况下，所述肽至多为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或100％纯或不存在杂质。在一些情况下，所述肽至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或100％纯度或不存在杂质。在一些情况下，所述肽组合物中肽的量为总组合物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或100％(重量)。如本文所用的，多肽的“纯化的”肽可以意指已从该肽中除去一定量的与该肽天然相关的大分子组分。如本文所用的，包含一种或多种纯化的本发明的肽、基本上由其组成或由其组成的组合物可以意指该组合物不含一定量的与所述一种或多种肽或多肽天然相关的大分子组分和/或用来合成所述肽或多肽的试剂。在一些实施方案中，本文所述的组合物仅由一种或多种本文所述的肽或多肽，例如，一种或多种固体或结晶形式的肽或多肽组成。
在一些实施方案中，本文所述的肽或多肽或核酸分子可以是分离的。如本文所用的，“分离的”化合物(例如，肽、多肽、核酸分子)可指从其天然环境中分离的化合物。例如，分离的肽或多肽可以是不具有位于N末端、C末端或两者的侧翼、对应于全长多肽的其天然氨基酸的肽或多肽。作为另一个实例，分离的肽可以是固定在不与该肽天然关联的底物上的肽。作为另一个实例，分离的肽或多肽可以是连接至不与该肽天然关联的另一分子(例如PEG化合物)上的肽或多肽。类似地，“分离的”核酸分子可以是不具有位于其5′末端、3′末端或两者的侧翼、对应于全长核酸分子的其天然核酸碱基的核酸分子。作为另一个实例，分离的核酸分子可以是结合至不与该核酸分子天然关联的底物或化合物(例如标记物，如荧光标签)的核酸分子。作为另一个实例，对于核酸分子，术语“分离的”可以意指它与其所天然存在于的核酸和细胞分开。
基于肽的疫苗可包含大约、至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、51、55、60、65、70或75个不同的肽序列。不同的肽序列可包括本文所述的任何多肽。
基于核酸的疫苗
本文提供了基于核酸的疫苗，其编码大约、至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、51、55、60、65、70或75种如本文所述的多肽。基于核酸的疫苗可用来治疗或预防流感感染。
基于核酸的疫苗可以使用合适的技术、载剂和赋形剂配制。该核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂合体，其中该核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。所述疫苗可以是基于DNA的疫苗、基于RNA的疫苗、基于杂合DNA/RNA的疫苗或基于杂合核酸/肽的疫苗。该肽可以是具有以下序列的多肽，该序列与选自SEQ ID NO：1-94的肽或选自表1、表2或表3的序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的序列同源性或同一性。该肽可以是具有以下序列的多肽，该序列与选自SEQ ID NO：1-94的肽或选自表1、表2或表3的序列具有至多40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的序列同源性或同一性。
核酸分子可以指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本文所述的核酸可含有磷酸二酯键，但在一些情况下，如以下(例如在引物和探针如标记探针的构建中)所概述的，包括可具有替代骨架的核酸类似物，其包含，例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺键和肽核酸(在本文中也称为“PNA”)骨架和连接。其它类似物核酸包括具有双环结构的核酸，包括锁定核酸(在本文中也称为“LNA”)；荷正电骨架；非离子骨架和非核糖骨架。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(参见，例如，Jenkins等人，Chem.Soc.Rev.(1995)pp 169176)。几种核酸类似物描述于例如Rawls，C & E News，1997年6月2日，第35页。“锁定核酸”也包括在核酸类似物的定义内。LNA是一类核酸类似物，其中核糖环被连接2′-O原子与4′-C原子的亚甲基桥“锁定”。所有这些参考文献均在此明确引入作为参考。可以对核糖-磷酸骨架进行这些修饰，以增加这类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。例如，PNA：DNA和LNA-DNA杂合体可以表现出更高的稳定性，因此可以在一些实施方案中使用。靶核酸按照指定可以是单链或双链的，或者含有双链或单链序列的部分。根据应用，所述核酸可以是DNA(包括，例如，基因组DNA、线粒体DNA和cDNA)、RNA(包括，例如，mRNA和rRNA)或杂合体，其中该核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等碱基的任何组合。
本文提供了包含编码本文所述多肽的多核苷酸的载体。在一些情况下，该载体可用来治疗或预防流感感染。在一些情况下，该载体可用来产生一种或多种本文所述的多肽。
编码本文提供的多肽的多核苷酸可以针对目标受试者如人类、小鼠、猪或狗进行密码子优化。例如，本文提供的多核苷酸可以针对小鼠进行密码子优化以用于临床前动物实验。在一些情况下，该主题可用于在农业上预防流感，例如用于预防猪流感或禽流感。这种类型的优化可能需要对外源衍生(例如重组)的DNA进行突变，以模拟预期宿主生物体或细胞的密码子偏好，同时编码相同的蛋白质。
所述载体可以是环状质粒或线性核酸。该环状质粒或线性核酸可能能够指导特定核苷酸序列在合适的受试细胞中的表达。所述载体可以具有与编码肽的核苷酸序列可操作地连接的启动子，该核苷酸序列可以与终止信号可操作地连接。所述载体还可以含有正确翻译核苷酸序列所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，意味着其至少一种组分相对于其至少一种其它组分是异源的。表达盒中核苷酸序列的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，该启动子可以仅在宿主细胞暴露于某些特定外部刺激时才启动转录。
所述载体可以是质粒。该质粒可用于用编码肽的核酸转染细胞，所转化的宿主细胞可在发生该肽表达的条件下培养和维持。
所述质粒可包含编码本文公开的各种多肽中的一种或多种多肽的核酸序列。单个质粒可含有单种多肽的编码序列，或多于一种多肽的编码序列。有时，所述质粒可以进一步包含编码佐剂如免疫刺激分子如细胞因子的编码序列。
所述质粒可以进一步包含起始密码子和终止密码子，起始密码子可以在编码序列的上游，终止密码子可以在编码序列的下游。起始和终止密码子可与编码序列符合读框。所述质粒还可以包含与编码序列可操作地连接的启动子，和位于编码序列上游的增强子。该增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。
所述质粒还可以包含哺乳动物的复制起点，以便在染色体外维持该质粒并在细胞中产生该质粒的多个拷贝。该质粒可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAXI、pCEP4或pREP4。
所述质粒还可以包含调节序列，该调节序列可以很好地适合于在施用该质粒的细胞中的基因表达。编码序列可包含可以允许该编码序列在宿主细胞中更有效转录的密码子。
所述质粒可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，CA)、pYES2(Invitrogen，SanDiego，CA)、MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)、pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)。
所述载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或者在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。示例性载体包括pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并使细胞能够将序列翻译成被免疫系统识别的抗原的其它任何表达载体。
基于核酸的疫苗还可以是线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其可以通过电穿孔有效递送至受试者，并表达一种或多种本文公开的肽。该LEC可以是不含任何磷酸骨架的任何线性DNA。该DNA可以编码一种或多种本文公开的肽。该LEC可含有启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。肽的表达可以通过启动子来控制。该LEC也可能不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。该LEC不能含有与多肽表达无关的其它核酸序列。
所述LEC可以衍生自任何能够被线性化的质粒。该质粒可以表达肽。示例性质粒包括：pNP(Puerto Rico/34)、pM2(New Caledonia/99)、WLV009、pVAX、pcDNA3.0、provax或能够表达编码抗原的DNA并使细胞能够将序列翻译成被免疫系统识别的抗原的其它任何表达载体。
可以通过肠胃外递送方法将基于核酸的疫苗递送至受试者。肠胃外递送可包括静脉内、透皮、口服、胆囊内、实质内、肝动脉内、门静脉内、肿瘤内或经静脉递送。有时，肠胃外递送可利用针(例如，皮下针)来递送基于核酸的疫苗。基于核酸的疫苗可以配制在水溶液，例如盐水中。可以通过电穿孔进一步辅助递送。有时，肠胃外递送可以使用基因枪作为递送方法。基于核酸的疫苗可以被配制为DNA包被的微粒，例如DNA包被的金或钨珠。基因枪递送方法可以使用弹道递送方法将核酸加速递送到靶细胞中。有时，肠胃外递送可以使用气动注射作为递送方法。基于核酸的疫苗可以被配制成水溶液。
基于核酸的疫苗也可以通过局部递送方法递送至受试者。基于核酸的局部疫苗可以被配制成裸DNA的气雾滴注剂，以递送到粘膜表面，如鼻和肺粘膜、眼部给药或阴道粘膜上。
基于核酸的疫苗可以进一步通过脂质介导的递送方法递送至受试者。有时，脂质介导的递送方法可以是细胞转染剂(cytofectin)介导的递送方法。细胞转染剂可以是可以结合并跨细胞膜转运核酸分子的阳离子脂质。核酸可以通过基于细胞转染剂的脂质体引入。有时，脂质介导的递送方法可以是中性脂质介导的递送方法。
本文提供的组合物，例如疫苗，可包含至少5、10、25、50、100或1000种不同的核酸。
基于重组病毒的疫苗
本文提供了基于重组病毒的疫苗。
如上所述的载体可以是病毒载体，例如，重组病毒载体。在一些情况下，如上所述的基于核酸的疫苗可以是重组病毒的形式。该重组病毒可包含被衣壳蛋白包封的如本文所述的重组病毒载体，该衣壳蛋白通常衍生自病毒载体和来自流感病毒以外的其它病毒来源。
所述病毒载体可以基于一系列不同的病毒，例如但不限于腺病毒、腺相关病毒(AAV)、甲病毒、杆状病毒、新城疫病毒(NDV)、痘病毒。副流感病毒5(PIV5)和水泡性口炎病毒(VSV)。在一些情况下，所述载体可以是重组病毒载体，其包含编码一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种)本文所述多肽的多核苷酸和编码来自流感病毒以外的病毒的病毒蛋白质的多核苷酸序列。疫苗可包含一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种)不同的病毒载体，每种载体表达具有不同序列的多肽。
基于腺病毒的疫苗可以感染广泛的宿主。在一些情况下，腺病毒疫苗可以诱导高水平的转基因表达而没有病毒基因整合到宿主基因组中的潜力。由于它们在细胞培养物中以高滴度生长的能力，本文所述的腺病毒疫苗可以安全且廉价地制备。在一些情况下，用于本文提供的疫苗的腺病毒载体可以通过Toll样受体依赖性和Toll样受体非依赖性途径固有地刺激先天免疫应答。在一些情况下，腺病毒疫苗也可以感染树突细胞(DC)，从而通过例如共刺激分子的上调、被感染的DC增加的细胞因子和趋化因子产生，或此两者，导致更有效的向免疫细胞的抗原呈递给。
本文所述的腺病毒载体可以以两种不同的形式生成：复制缺陷型或复制型。复制缺陷型腺病毒载体可以通过缺失复制所必需的E1基因来获得。有时，也可以使复制缺陷型腺病毒载体缺乏E3基因，以便为外源基因插入物创造更多空间。可以插入具有所需转基因的表达盒，该转基因例如是编码一种或多种本文所述的多肽的多核苷酸。可以使复制型腺病毒载体缺失E3基因。有时，复制型Ad载体可以模拟天然病毒感染，因此由于先天性和适应性免疫的各种元件的固有刺激，可以发挥有效的佐剂效应。
在本公开内容的一些实施方案中，所述载体可以是腺病毒载体。在一些情况下，所述载体是非人腺病毒载体。在一些情况下，所述载体可以是非人灵长类动物腺病毒载体。在一些情况下，所述载体可以是黑猩猩腺病毒载体。
在某些实施方案中，黑猩猩腺病毒载体可用于表达一种或多种多肽，如例如美国专利6,083,716中所公开的C68(AdC68)(SEQ ID NO：104)，例如Tatsis等人，“Chimpanzee-origin adenovirus vectors as vaccine carriers，”Gene Therapy 13：421-429(2006)中所公开的C7(AdC7)，Haut等人，“A Partial E3 Deletion in Replication-DefectiveAdenoviral Vectors Allows for Stable Expression of Potentially ToxicTransgene Products”，Human Gene Therapy Methods DOI：10.1089/hgtb.2016.044(2016)中公开的C6(AdC6)(SEQ ID NO：105)，Roy等人，“Rescue of chimeric adenoviralvectors to expand the serotype repertoire.”J Virol Methods141(a)：14-21(2007)中公开的Pan7和Pan9。
或者，所述载体可以基于AAV。重组AAV可具有宽泛的趋向性，感染多种宿主、组织以及增殖和非增殖细胞类型。可以与本公开内容结合使用的AAV可以包括但不限于AAV血清型2(AAV2)、AAV5、AAV7、AAV1和AAV6。
所述载体也可以基于杆状病毒。可用作本文提供的疫苗例如流感疫苗的载体的杆状病毒可包括但不限于α杆菌病毒、β杆菌病毒、γ-杆状病毒和δ-杆状病毒。
或者，所述载体可以基于痘病毒。痘病毒可以是双链DNA病毒。痘病毒基因组可以非常大；哺乳动物痘病毒可具有大约130kb的基因组，而禽痘病毒基因组甚至更大，约为300kb。如此大的基因组大小可以允许插入超过10kb的外源DNA而不损害感染性或其它必需的病毒功能。痘病毒可以具有其自身的转录机制、病毒DNA依赖性RNA聚合酶和转录后修饰酶，从而允许自给自足的细胞质复制。结果，所插入的转基因产物可以高水平表达，从而导致有效的细胞免疫应答。
可以创建重组痘苗病毒以表达如本文所述的多肽。可以与本公开内容结合使用的非复制性痘病毒载体包括但不限于修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)、NYVAC和ALVAC株。由于在鸡胚成纤维细胞中的重复传代所导致的其原始基因组的约15％的损失，MVA变成复制缺陷的。来源于Copenhagen痘苗株的NYVAC株通过从原始病毒基因组中缺失18个不同的开放阅读框而变成复制缺陷的。ALVAC是一种在人类细胞中不会复制的金丝雀痘病毒载体，通过在鸡胚成纤维细胞中传代超过200次诱导进一步减毒。
或者，所述载体可以基于甲病毒。甲病毒可以是单链正义RNA病毒，其可以在所感染的细胞的细胞质中复制。可以与本公开内容结合使用的甲病毒包括但不限于委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、辛德毕斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合体。
可以将甲病毒载体设计为具有编码结构蛋白质的基因的缺失。这类甲病毒载体被称为“复制子”。甲病毒载体可以潜在地靶向引流淋巴结中的抗原呈递细胞，如树突细胞，其可导致抗原特异性免疫应答的有效产生。此外，甲病毒载体可以通过在一些细胞中诱导凋亡而为疫苗抗原的交叉引发创造适当的环境。甲病毒载体本身也可以进一步增强疫苗免疫力。
VEE在人类中可能具有致病性，但SIN则没有。当人是疫苗接种受试者时，VEE/SIN嵌合体可用来避免安全性问题。在VEE/SIN嵌合体中，VEE可以作为复制子组件，而SIN可以作为结构和包装组件。
可用作产生本文所述疫苗的载体的其它RNA病毒可包括但不限于NDV、PIV5和VSV。
如本文所述的腺病毒载体或基于腺病毒的疫苗可通过本文提供的方法产生，例如，根据图5所示的程序产生。
产生基于腺病毒的疫苗的方法可包括质粒DNA的制备和纯化。本文的质粒DNA可以是重组腺病毒载体DNA，其包含编码包含一个或多个如本文所述的表位序列的多肽的多核苷酸。如上所述，重组腺病毒载体可缺乏E区基因，例如，E1、E3、E5或其组合。内源病毒基因的缺失可以为插入目的基因，例如，表达本文所述多肽的多核苷酸提供基因组空间。作为实例，E1缺失的重组腺病毒载体可以通过体外连接方法或同源重组方法来构建。
体外连接方法可以使用完整的腺病毒DNA基因组和含有Ad的左端、具有右反向末端重复序列(ITR)、包装信号和E1A增强子序列的质粒。在目的基因(例如编码本文所述多肽的多核苷酸)可以插入该质粒的病毒序列的下游后，可以切下含有病毒序列和目的基因的片段，并将其连接到限制酶切位点，替换病毒E1区的一部分，从而产生重组腺病毒DNA载体。
或者，重组腺病毒载体也可以通过使用同源重组方法来制备。可以使用具有在体内重组的重叠片段的两种或更多种质粒。示例性的第一质粒可含有整个腺病毒基因组，其中缺失DNA包装区和E1区。示例性的第二质粒(穿梭载体)可含有右ITR、包装信号、与第一质粒重叠的序列。在可以将目的基因，例如表达本文所述多肽的多核苷酸引入第二质粒中之后，可以将两种质粒共转染到重组细胞中。在该细胞中，可以在第一和第二质粒之间发生同源重组，从而产生重组腺病毒载体。用于同源重组的细胞的非限制性实例可包括酵母、细菌和哺乳动物细胞系，如293细胞、293T细胞、Hela细胞。在一些情况下，可以从重组细胞中纯化重组腺病毒载体。或者，重组过程可以在体外进行。
产生基于腺病毒的疫苗的方法可以进一步包括用纯化的DNA质粒转染宿主细胞。在一些实施方案中，该DNA质粒，例如重组腺病毒载体，在转染前线性化。在一些情况下，该转染可以生成腺病毒噬斑。
在一些情况下，所述重组腺病毒载体缺乏可以介导腺病毒复制的E1基因。因此，在一些情况下，有必要补充E1基因以供重组腺病毒复制。在一些情况下，可以使用已经用腺病毒感染产生并且在基因组中具有E1基因的293细胞系。经工程化用来产生E1基因产物的其它细胞系也可用于此目的。在一些情况下，含有其它病毒基因组元件的DNA片段或一种或多种辅助病毒也可用于产生重组腺病毒。例如，辅助病毒可以提供用于病毒包装的包装信号，而重组病毒载体可以缺乏包装信号。或者，可以将含有包装信号的DNA片段共转染到宿主细胞中以供产生重组腺病毒。贡献用于产生重组腺病毒载体的基因组材料的本文使用的一种或多种质粒载体或辅助病毒可包含报道基因、选择标记或可用于病毒产生的其它任何基因。
可以使用本领域技术人员可用的任何转染方法进行细胞转染。转染方法可包括但不限于电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、阳离子聚合物、树状聚体、脂质体、微粒轰击、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、原生质体融合、impalefection、磁转染、核转染或其任何组合。
产生基于腺病毒的疫苗的方法可以进一步包括病毒的分离和扩增。病毒的分离可包括分离腺病毒噬斑，然后可以筛选噬斑。在一些情况下，筛选可以通过病毒核酸的测序来进行。在一些情况下，可以针对完整的、未改变的转基因序列筛选噬斑。可以通过相继感染更大数目的细胞进一步扩增正确的噬斑。方法可以进一步包括分离并任选地裂解感染的细胞，然后可以纯化病毒颗粒。纯化可以通过各种方法进行，例如但不限于超速离心和透析。方法可以进一步包括通过例如噬斑测定来确定感染滴度。方法可以进一步包括通过例如紫外线吸光度测量来确定病毒颗粒浓度。
可以通过肠胃外递送方法将基于重组病毒的疫苗递送至受试者。肠胃外递送可包括静脉内、透皮、口服、胆囊内、实质内、肝动脉内、门静脉内、肿瘤内或经静脉递送。有时，肠胃外递送可利用针(例如，皮下针)来递送基于重组病毒的疫苗。基于重组病毒的疫苗可以配制在水溶液，例如盐水中。有时，肠胃外递送可以使用气动注射作为递送方法。基于核酸的疫苗可以被配制成水溶液。
基于重组病毒的疫苗也可以通过局部递送方法递送至受试者。该疫苗可以直接施用至感染区域，例如鼻腔。
基于抗体的疫苗
本文提供了基于抗体的疫苗，其可包含结合本文所述的肽或多肽序列的实体。基于抗体的疫苗可用于对抗流感感染。该实体可以是抗体。
基于抗体的疫苗可以使用任何合适的技术、载剂和赋形剂配制。该抗体可以是天然抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或者可以是抗体片段。该抗体可以识别一个或多个本文所述的表位序列。该抗体可以识别一个或多个选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列。该抗体可以识别与选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列具有至多40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％序列同源性或同一性的序列。该抗体可以识别与选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％序列同源性或同一性的序列。该抗体可以识别序列长度为选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的序列长度。该抗体可以识别序列长度为选自SEQ ID NO：1-94的序列或选自表1、表2或表3的序列的至多30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的序列长度。在一些实施方案中，该抗体识别来自诸如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒等多种流感病毒株的表位。
抗体可包括完全装配的抗体、可以结合抗原的抗体片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv、单链抗体、双抗体(diabody)、抗体嵌合体、杂合抗体、双特异性抗体、人源化抗体等)和包含前述片段的重组肽。
抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体的制备是本领域已知的，并且可以通过根据已知技术将来自对抗原致敏的宿主的脾细胞与骨髓瘤细胞融合或通过用合适的转化载体转化脾细胞以使细胞永生化来实现。所述细胞可以在选择性培养基中培养，克隆，并筛选，以选择结合指定抗原的单克隆抗体。可以找到许多关于制备单克隆和多克隆抗体的参考文献。
天然抗体(天然免疫球蛋白)可以是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链可经由一个共价二硫键连接到重链上，而二硫键的数目可随着不同免疫球蛋白同种型的重链而有所不同。每条重链和轻链也可具有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一个末端具有可变域(VH)，随后是数个恒定域。每条轻链可在一个末端具有可变域(VL)且在另一末端具有恒定域；轻链的恒定域可与重链的第一个恒定域对齐，而轻链可变域可与重链的可变域对齐。特定的氨基酸残基可在轻链和重链可变域之间形成界面。
可变区可赋予抗原结合特异性。在一些情况下，可变性并非均匀地分布在整个抗体的可变域中。在轻链以及重链的可变域中，可变性可集中在三个被称为互补决定区(CDR)或高变区的区段。可变域中更高度保守的部分可位于框架(FR)区中。天然重链和轻链的可变域各自可包含四个FR区，主要采用β折叠片构型，经由三个CDR连接，其形成连接β折叠片结构的环，并且在一些情况下形成β折叠片结构的一部分。每条链中的CDR可通过FR区近距离地靠在一起，并与另一条链的CDR一起促成形成抗体的抗原结合位点。在一些情况下，恒定域可能不直接参与抗体与抗原的结合，但可展现出多种效应物功能，如Fc受体(FcR)结合、抗体参与抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性的引发和肥大细胞的脱粒。
高变区可以指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基和/或来自“高变环”的那些残基。如同在本文中所认为的，框架或FR残基可以是除高变区残基之外的那些可变域残基。
抗体片段可包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；微小抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化可产生两个相同的抗原结合片段(被称为“Fab”片段，其各带有一个抗原结合位点)，以及残余的“Fc”片段，其名称反映出它容易结晶的能力。胃蛋白酶处理则产生F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点，并且依然能够交叉连接抗原。
Fv可以是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和结合位点。这个区域可由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体构成。就是以这种构型，每个可变域的三个CDR可以相互作用而在VH-VL二聚体的表面上限定出抗原结合位点。六个CDR可共同地给抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单一可变域(或半个Fv，其只包含三个对抗原具有特异性的CDR)也可具有识别并结合抗原的能力，虽然其亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段可含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab片段与Fab′片段的不同可在于，在重链CHI域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中可用于Fab′，其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离巯基。Fab′片段可通过还原F(ab′)2片段的重链二硫键而产生。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链，基于其恒定域的氨基酸序列，可以归为两种截然不同的类型(称为κ(kappa)和λ(1ambda))之一。
根据其重链的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归为不同的类别。五种主要的人免疫球蛋白类别包括：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的数种可进一步被分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同免疫球蛋白类别的亚单位结构和三维构型是公知的。不同的同种型可具有不同的效应物功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。
单克隆抗体可以从任何合适的物种获得，例如鼠、兔、绵羊、山羊或人单克隆抗体。
组合物，例如疫苗，可包含大约或至少或至多5、10、25、50或100种不同的抗体。
基于抗原呈递细胞(APC)的疫苗
本文提供了基于APC的疫苗，其呈递本文所述的多肽。基于APC的疫苗可用于对抗流感感染。基于APC的疫苗可以使用任何合适的且本领域了解的已知技术、载剂和赋形剂来配制。APC可包括单核细胞、单核细胞衍生的细胞、巨噬细胞和树突细胞。有时，基于APC的疫苗可以是基于树突细胞的疫苗。
基于树突细胞(DC)的疫苗可以通过本领域已知的任何方法制备。在一些情况下，基于树突细胞的疫苗可以通过离体或体内方法制备。离体方法可包括使用以本文所述多肽离体脉冲的自体DC，以在施用于患者之前激活或加载DC。体内方法可包括使用与本文所述的肽偶联的抗体靶向特异性DC受体。基于DC的疫苗可进一步包含DC激活剂，如TLR3、TLR-7-8和CD40激动剂。基于DC的疫苗可进一步包含佐剂和药学上可接受的载剂。
基于病毒的疫苗
基于病毒的疫苗可以基于活病毒或灭活病毒生成。病毒可以被工程化为表达包含任何本文所述序列的一种或多种蛋白质。基于活病毒的疫苗可以使用减毒病毒或可以冷适应的病毒。基于灭活病毒的疫苗可包含完整病毒粒子、分裂的病毒粒子或纯化的表面抗原(例如，来自甲型流感病毒的HA和/或N)。用于灭活病毒的化学手段可包括用有效量的一种或多种下列试剂处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基亚乙基亚胺或其组合。非化学病毒灭活方法是本领域已知的，例如紫外线、热灭活或γ辐射。
可以通过各种方法从含病毒的流体中收获病毒粒子。例如，纯化过程可以涉及使用线性蔗糖梯度溶液进行的区带离心，该线性蔗糖梯度溶液包括去污剂以破坏病毒粒子。在可选的稀释后，可以通过渗滤纯化抗原。
通过用去污剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三正丁酯、Triton X-100、Triton N101、十六烷基三甲基澳化铵、Tergitol NP9等)处理纯化的病毒粒子以产生亚病毒粒子制品，包括“吐温-醚”分裂过程，可以获得分裂的病毒粒子。分裂流感病毒的方法是本领域熟知的。病毒的分裂可以通过用破坏性浓度的分裂剂破坏或破碎传染性或非传染性的完整病毒来进行。该破坏可导致病毒蛋白质的完全或部分溶解，从而改变病毒的完整性。分裂剂可以是非离子或离子(例如阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫代糖苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、CTAB(十六烷基三甲基澳化铵)、磷酸三正丁酯、Cetavlon、肉豆蔻基三甲基铵盐、lipofectin、lipofectamine和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如Triton表面活性剂，如Triton X-100或TritonN101)、聚氧乙烯失水山梨醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一个示例性分裂程序可以使用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且可以在初始病毒粒子纯化过程中(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)进行分裂。因此，分裂过程可涉及澄清含病毒粒子的材料(以去除非病毒粒子材料)，浓缩所收获的病毒粒子(例如，使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，从非病毒粒子材料中分离整个病毒粒子，在密度梯度离心步骤中使用分裂剂(例如，使用含有分裂剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)分裂病毒粒子，然后过滤(例如，超滤)以除去不需要的物质。可以将分裂的病毒粒子有效地重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品是分裂式疫苗。
纯化的表面抗原疫苗可包含流感表面抗原血细胞凝集素，并且通常还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINTM、AGPRIPPALTM和INFLUVACTM产品是其实例。
基于灭活病毒的疫苗可包括病毒体(无核酸的病毒样脂质体颗粒)。可以通过用去污剂溶解流感病毒，然后除去核衣壳并重建含有病毒糖蛋白的膜来制备病毒体。还可以通过将病毒膜糖蛋白添加到过量的磷脂中以在其膜中产生具有病毒蛋白质的脂质体来制备病毒体。
药物组合物和施用
本文提供了可用来提供针对流感病毒感染的免疫的药物组合物。在本公开内容的某些方面，该药物组合物可以是疫苗。
组合物可包含一种或多种多肽、核酸、蛋白质(例如，抗体或其片段)、APC或本文所述的病毒，或其组合，以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物可进一步包含用于多肽、多核苷酸或载体的载剂。组合物可进一步包含防腐剂。在一些情况下，组合物可进一步包含其它试剂以维持适当的物理或化学性质，例如但不限于盐浓度、重量摩尔渗透压浓度、pH、疏水性/亲水性和溶解度。组合物可进一步包含适当的渗透促进剂以增强递送。组合物可进一步包含可增强多肽、多核苷酸或载体的免疫原性的适当佐剂。
制剂
本文提供的组合物，例如疫苗，可以部分地基于该组合物的预期给药途径来配制。该组合物，例如疫苗，可包含一种或多种活性剂，例如一种或多种肽、核酸、蛋白质(例如，抗体或其片段)、APC、本文所述的病毒，或其组合。包含一种或多种活性剂与一种或多种佐剂的组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制，该载剂包括赋形剂、稀释剂和/或助剂，例如，其有助于将所述一种或多种活性剂加工成可以施用的制品。本文所述的一种或多种活性剂可使用本文所述的多种给药途径或方式递送至受试者，例如口服、颊部、局部、直肠、透皮、透粘膜、皮下、静脉内和肌肉内应用，以及通过吸入。
本文所述的组合物，例如疫苗，可以是液体制品，如悬浮液、糖浆或酏剂。该组合物，例如疫苗，也可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制品，如无菌悬浮液或乳液。在一些情况下，可以将水溶液包装以供原样使用，或者冻干，并在施用之前将冻干制品与无菌溶液混合。该组合物，例如疫苗，可以作为溶液或悬浮液递送。通常，诸如胶冻剂、乳膏、洗剂、栓剂和软膏的制剂可以提供对一种或多种活性剂有更长时间暴露的区域，而溶液中的制剂，例如喷雾剂，可以提供更即时的、短期的暴露。
用于吸入(例如，经鼻给药或经口吸入)的制剂
本文所述的组合物，例如疫苗，可以被配制用于通过受试者的鼻道施用。其中载剂是固体的适于经鼻给药的制剂可以包括颗粒大小例如在约10至约500微米范围内的粗粉末，其可以以鼻吸的方式施用，例如，通过鼻道从紧贴鼻子的粉末容器中快速吸入。该制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器施用气雾剂。该制剂可包括疫苗的水溶液或油性溶液。
本文提供的组合物，例如疫苗，可以被配制成气雾剂制剂。气雾剂制剂可以是，例如，气雾剂溶液、悬浮液或干粉。气雾剂可以通过呼吸系统或鼻道施用。例如，可将组合物悬浮或溶解在合适的载剂(例如，药学上可接受的推进剂)中，并使用鼻喷雾剂或吸入剂直接施用于肺部。例如，包含一种或多种活性剂的气雾剂制剂可以在推进剂或溶剂与推进剂的混合物中溶解、悬浮或乳化，例如用于作为鼻喷雾剂或吸入剂施用。气雾剂制剂可以在压力下含有任何可接受的推进剂，例如化妆品或皮肤病学或药学上可接受的推进剂。
用于经鼻给药的气雾剂制剂可以是被设计用于以滴剂或喷雾剂施用至鼻道的水溶液。鼻溶液可类似于鼻分泌物，因为它们可以是等渗的并且略微缓冲以维持约5.5至约6.5的pH。在一些情况下，可以使用该范围之外的pH值。该制剂中还可包含抗微生物剂或防腐剂。
可以设计用于吸入的气雾剂制剂，使得当通过鼻或口呼吸途径施用时，一种或多种活性剂被携带到受试者的呼吸系统中。吸入溶液可以例如通过喷雾器施用。包含精细粉末或液体药物的吸入或吹入剂可以作为药剂或药剂组合在推进剂(例如，用来帮助分布)中的溶液或悬浮液的药物气雾剂递送至呼吸系统。推进剂可以是液化的气体，包括卤代烃，例如碳氟化合物，如氟化氯化烃、氢氯氟烃和氢氯烃，以及烃和烃醚。
卤代烃推进剂可包括其中所有氢被氟替代的碳氟化合物推进剂，其中所有氢被氯和至少一个氟替代的含氯氟烃推进剂，含氢的碳氟化合物推进剂，和含氢的含氯氟烃推进剂。烃推进剂可包括，例如，丙烷、异丁烷、正丁烷、戊烷、异戊烷和新戊烷。也可使用烃的混合物作为推进剂。醚推进剂包括，例如，二甲醚以及醚。气雾剂制剂还可包含超过一种推进剂。例如，气雾剂制剂可包含超过一种来自相同类别的推进剂，如两种或更多种碳氟化合物；或者超过一种、超过两种、超过三种来自不同类别的推进剂，如氟代烃和烃。本文所述的组合物，例如疫苗，还可以用压缩气体，例如惰性气体，如二氧化碳、一氧化二氮或氮气分配。
气雾剂制剂还可以包含其它组分，例如，乙醇、异丙醇、丙二醇，以及表面活性剂或其它组分，如油和去污剂。这些组分可用来稳定制剂并且/或者润滑阀组件。
气雾剂制剂可以在压力下包装，并且可以使用溶液、悬浮液、乳液、粉末和半固体制品配制成气雾剂。例如，溶液气雾剂制剂可包含活性剂在例如(基本上)纯的推进剂或推进剂与溶剂的混合物中的溶液。该溶剂可用来溶解一种或多种活性剂和/或延缓推进剂的蒸发。溶剂可包括，例如，水、乙醇和二醇。可以使用合适的溶剂的任何组合，任选地与防腐剂、抗氧化剂和/或其它气雾剂组分组合。
气雾剂制剂可以是分散体或悬浮液。悬浮气雾剂制剂可包含一种或多种活性剂(例如肽)和分散剂的悬浮液。分散剂可包括，例如，失水山梨醇三油酸酯、油醇、油酸、卵磷脂和玉米油。悬浮气雾剂制剂还可包含润滑剂、防腐剂、抗氧化剂和/或其它气雾剂组分。
气雾剂制剂可以类似地配制成乳液。乳液气雾剂制剂可包含，例如，醇如乙醇，表面活性剂，水，和推进剂，以及活性剂或活性剂的组合，例如一种或多种肽。使用的表面活性剂可以是非离子的、阴离子的或阳离子的。乳液气雾剂制剂的一个实例包含，例如，乙醇、表面活性剂、水和推进剂。乳液气雾剂制剂的另一个实例包含，例如，植物油、单硬脂酸甘油酯和丙烷。
用于肠胃外给药的制剂
包含一种或多种活性剂的组合物，例如疫苗，可以被配制用于肠胃外给药，并且可以以单位剂量形式提供于安瓿、预填充注射器、小体积输注器或添加有防腐剂的多剂量容器中。该组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，例如在水性聚乙二醇中的溶液。
对于可注射的制剂，可以从本领域已知的适当媒介物中选择媒介物，包括水溶液或油性悬浮液，或乳液，其具有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂，甘露糖醇、右旋糖，或无菌水溶液和类似的药物媒介物。该制剂还可包含生物相容的、可生物降解的聚合物组合物，如聚(乳酸-共-乙醇酸)。这些材料可以制成微米或纳米球，装载药物，并进一步包衣或衍生化以提供优异的持续释放性能。适用于眼周或眼内注射的媒介物包括，例如，活性剂在注射级水中的悬浮液、脂质体和适用于亲脂性物质的媒介物，以及本领域已知的媒介物。
肠胃外注射可包括皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内和心内给药。皮下给药可以作为浓注施用到皮下组织中。人类受试者的皮下注射部位可包括上臂、腹部、大腿前部、上背部、臀部上部区域的外部区域。肌肉内给药可以直接注射到肌肉中。肌肉内注射部位可包括三角肌、背臀肌(dorsogluteal)、股直肌、股外侧肌和臀外侧肌。静脉内给药可以是将液体制剂直接递送到静脉中。静脉内给药可施用于外周静脉(例如臂、手、腿和足中的静脉)或中央静脉(例如上腔静脉、下腔静脉和右心房)。腹膜内给药可以注射到腹膜中。心内给药可以直接注射到心肌或心室中。
有时，所述组合物，例如疫苗，可以被配制用于静脉内施用于哺乳动物受试者，如人类。用于静脉内给药的组合物，例如疫苗，可以是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在一些情况下，该组合物，例如疫苗，可以包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。成分可以分开供应或以单位剂型混合在一起，例如，作为在指示活性剂的量的气密容器如安瓿或小药囊(sachette)中的干燥冻干粉或无水浓缩物。当通过输注施用该组合物时，其可以用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶分配。当通过注射施用该组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以使成分可以在施用前混合。
当通过注射施用时，包含一种或多种活性剂的组合物，例如疫苗，可以配制在水溶液中，特别是生理上相容的缓冲液，如Hanks溶液、林格液或生理盐水缓冲液中。该溶液可含有配制用剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述一种或多种活性剂可以是粉末形式，以供在使用前用合适的媒介物，例如无菌无热原水重建。在另一个实施方案中，该组合物，例如疫苗，不包含佐剂或其它任何为了增强由活性剂刺激的免疫应答而添加的物质。在另一个实施方案中，该组合物，例如疫苗，可包含抑制对一种或多种活性剂的免疫应答的物质。
在一些实施方案中，将一种或多种活性剂配制成贮库型(depot)制品。这样的长效制剂可以通过植入或透皮递送(例如，皮下或肌肉内)、肌肉内注射或使用透皮贴剂来施用。因此，例如，一种或多种活性剂可以用合适的聚合材料或疏水性材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂来配制，或者配制为微溶的衍生物，例如，配制为微溶的盐。
用于局部给药的制剂
在本公开内容的某些方面，本文提供的组合物，例如疫苗，可以包含一种或多种当局部施用或注射在特定感染部位或其附近时发挥局部和区域性作用的药剂。例如粘性液体、溶液、悬浮液、基于二甲基亚砜(DMSO)的溶液、脂质体制剂、凝胶、胶冻剂、乳膏、洗剂、软膏、栓剂、泡沫或气雾喷雾剂的直接局部应用可用于局部给药，以产生例如局部和/或区域性作用。用于这类制剂的药学上合适的媒介物包括，例如，低级脂族醇、聚乙二醇(例如，甘油或聚乙二醇)、脂肪酸的酯、油、脂肪、硅氧烷等。这类制品还可以包含防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)和/或抗氧化剂(例如抗坏血酸和生育酚)。在一些实施方案中，包含一种或多种活性剂的局部/外用制剂用来治疗表皮或粘膜病毒感染。
本文提供的组合物，例如疫苗，可含有皮肤病学可接受的载剂。这类载剂与皮肤、指(趾)甲、粘膜、组织和/或毛发相容，并且可包括满足这些要求的任何皮肤病学载剂。本领域普通技术人员可以容易地选择这类载剂。在配制皮肤软膏时，可以将一种或多种药剂配制在油质烃基质、无水吸收基质、油包水吸收基质、水包油可除水基质和/或水溶性基质中。这类载剂和赋形剂的实例包括湿润剂(例如，尿素)、二醇(例如，丙二醇)、醇(例如，乙醇)、脂肪酸(例如，油酸)、表面活性剂(例如，肉豆蔻酸异丙酯和月桂基硫酸钠)、吡咯烷酮、甘油单月桂酸酯、亚砜、萜(例如，薄荷醇)、胺、酰胺、烷烃、烷醇、水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶，以及聚合物如聚乙二醇。
例如，通过添加合适的增稠剂和/或胶凝剂，可用水性或油性基质配制软膏和乳膏。可以用水性或油性基质配制洗剂，并且该洗剂通常还将含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。用于递送药物剂的透皮贴剂的构建和使用是本领域中已知的。这样的贴剂可被构造用于药物剂的连续递送、脉冲式递送或按需递送。
可用来形成组合物和剂型的润滑剂可包括硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂或其混合物。另外的润滑剂包括，例如，syloid硅胶、合成二氧化硅的凝结气雾剂或其混合物。可任选地以少于组合物的约1重量％的的量加入润滑剂。
本文提供的组合物，例如疫苗，可以是适于局部施用的任何形式，包括水性、水性-含醇或油性溶液，洗剂或血清分散体，水性、无水或油性凝胶，通过在水相中分散脂肪相(O/W或水包油)获得的乳液，或者相反，(W/O或油包水)，微乳液或微胶囊，离子和/或非离子类型的微粒或脂质囊泡分散体。除一种或多种活性剂外，本文提供的组合物的各种组分的量可以是本领域中使用的量。这些组合物可以构成用于面部、手部、身体和/或粘膜或用于清洁皮肤的保护、处理或护理乳膏、乳液、洗剂、凝胶或泡沫。该组合物还可以由构成肥皂或清洁皂的固体制品组成。
用于局部/外部施用的本文提供的组合物，例如疫苗，可包含一种或多种抗微生物防腐剂，如季铵化合物、有机汞、对羟基苯甲酸酯、芳族醇、氯丁醇等。
用于口服给药的制剂
有时，本文提供的组合物，例如疫苗，可以被配制用于口服给药。
对于口服给药，可以通过将一种或多种活性剂与本领域已知的药学上可接受的载剂组合，来容易地配制本文提供的组合物。此类载剂使活性剂能够被配制成由待治疗的患者口服摄入的片剂，包括可咀嚼片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、锭剂、硬糖、液体、凝胶、糖浆、浆液、粉末、悬浮液、酏剂、糯米纸等。此类制剂可包含药学上可接受的载剂，包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂。固体载剂可以是一种或多种物质，其也可以充当稀释剂、调味剂、稳定剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。在粉末中，载剂可以是细碎的固体，其与细碎的活性组分混合。在片剂中，活性组分通常与具有所需粘合能力的载剂按照适当的比例混合，并压制成需要的形状和大小。粉末和片剂可含有约百分之一(1％)至约百分之七十(70％)的一种或多种活性剂。合适的载剂包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。通常，所述一种或多种活性剂的浓度水平范围可以是口服剂型总组合物的约0.5％、约5％、约10％、约20％或约30％至约50％、约60％、约70％、约80％或约90％(重量)，其量足以提供所需的剂量单位。
用于口服使用的水性悬浮液可含有一种或多种活性剂和药学上可接受的赋形剂，如悬浮剂(例如，甲基纤维素)、润湿剂(例如，卵磷脂、溶血卵磷脂和/或长链脂肪醇)以及着色剂、防腐剂、调味剂等。
由于例如存在大的亲脂性部分，因此可能需要油或非水性溶剂将一种或多种活性剂带入溶液中。或者，可以使用乳液、悬浮液或其它制品，例如脂质体制品。关于脂质体制品，可以使用任何已知的制备用于治疗病况的脂质体的方法。配体也可以附接到脂质体上，以将这些组合物引导到特定的作用部位。
可以通过任选地研磨所得到的混合物，并在加入合适的助剂(如果需要)后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯，来获得作为固体赋形剂的用于口服使用的药物制品。具体地，合适的赋形剂是填充剂，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；调味成分；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，如藻酸钠。药剂也可以被配制成持续释放制品。
糖衣丸芯上可设有合适的包衣。为达到该目的，可使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆(carbopol)凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或糖衣丸包衣中，以用于标识或表征活性剂的不同组合。
可口服使用的药物制品包括由明胶制成的推入配合式胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可以含有与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和可选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性剂可溶解或悬浮在合适的液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可添加稳定剂。所有用于口服给药的制剂可以是适合于给药的剂量。
适于口服给药的其它形式包括液体形式制品，包括乳液、糖浆、酏剂、水溶液、水性悬浮液或意欲在使用前不久转化成液体形式制品的固体形式制品。乳液可以在溶液中制备，例如在丙二醇水溶液中制备，或者可以含有乳化剂，例如卵磷脂、失水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶。水溶液可以通过将活性组分溶解在水中并加入合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。水性悬浮液可以通过用粘性材料，如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它公知的悬浮剂，将细碎的活性组分分散在水中来制备。可以与组合物一起施用的合适的填充剂或载剂包括适量使用的琼脂、醇、脂肪、乳糖、淀粉、纤维素衍生物、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、二氧化硅、无菌盐水等，或其混合物。固体形式制品包括溶液、悬浮液和乳液，并且除活性组分外，还可含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲液、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
糖浆或悬浮液可以通过将活性化合物加到浓缩的糖(例如蔗糖)水溶液中来制备，也可以向其中加入任何辅助成分。这类辅助成分可包括调味剂、延缓糖结晶的试剂或增加其它任何成分的溶解度的试剂，例如作为多元醇，例如甘油或山梨醇。
当配制用于口服给药的化合物时，可能希望使用胃滞留制剂来增强胃肠(GI)道的吸收。在胃中保留数小时的制剂可缓慢释放活性剂并提供可在本文中使用的持续释放。可以使用可膨胀、漂浮和生物粘附技术来使活性剂的吸收最大化。
用于眼科给药的制剂
在一些情况下，本文提供的组合物可以通过眼睛施用，例如以滴眼剂递送。滴眼剂可以通过将所述一种或多种活性剂溶解在无菌水溶液如生理盐水、缓冲溶液等中，或通过合并将在使用前溶解的粉末组合物来制备。如本领域中已知的，可选择其它媒介物，包括但不限于：平衡盐溶液、盐水溶液、水溶性聚醚如聚乙二醇、聚乙烯类如聚乙烯醇和聚维酮、纤维素衍生物如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物如矿物油和白凡士林、动物脂肪如羊毛脂、丙烯酸聚合物如羧基聚亚甲基凝胶、植物脂肪如花生油，和多糖如葡聚糖，和粘多糖如透明质酸钠。如果需要，可以添加在滴眼剂中常用的添加剂。这类添加剂包括等渗剂(例如，氯化钠等)、缓冲剂(例如，硼酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等)、防腐剂(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇等)、增稠剂(例如，糖类，如乳糖、甘露醇、麦芽糖等；例如，透明质酸或其盐，如透明质酸钠、透明质酸钾等；例如，粘多糖如硫酸软骨素等；例如，聚丙烯酸钠、羧乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其它试剂)。
其它制剂
在一些实施方案中，本文提供的组合物以耳用溶液、悬浮液、软膏或插入物施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物，例如疫苗，被配制用于作为栓剂给药。例如，可以首先熔化低熔点蜡，如甘油三酯、脂肪酸甘油酯、Witepsol S55(德国Dynamite NobelChemical的商标)或可可脂的混合物，并且可以均匀地分散活性组分，例如，通过搅拌。然后可将熔融的均匀混合物倒入适当大小的模具中，使其冷却并固化。在一些实施方案中，本文所述的组合物，例如疫苗，被配制用于阴道给药。在一些情况下，阴道栓、卫生棉、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂含有一种或多种组合物，例如本文所述的疫苗。
成分，例如载剂、赋形剂
本文提供的组合物，例如疫苗，可包含一种或多种载剂和赋形剂(包括但不限于缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油(包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水溶液、右旋糖和甘油水溶液、调味剂、着色剂、防粘剂(detackifier)和其它可接受的添加剂、佐剂或粘合剂，达到近似生理条件所需的其它药学上可接受的辅助物质，如pH缓冲剂、张度调节剂、乳化剂、湿润剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在另一种情况下，所述组合物基本不含防腐剂。在其它实施方案中，所述组合物，例如疫苗，含有至少一种防腐剂。关于药物剂型的一般方法可见于Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(Lippencott Williams&Wilkins，Baltimore Md.(1999))。应当认识到，虽然可使用本领域普通技术人员已知的任何合适的载剂来施用本文所述的药物组合物，但载剂的类型可根据给药方式而不同。合适的制剂和另外的载剂描述于Remington″The Science andPractice of Pharmacy″(第20版，Lippincott Williams & Wilkins，Baltimore Md.)中，其教导通过引用整体并入本文。
脂质体和微球
本文提供的组合物，例如疫苗，可以包封在脂质体内。可生物降解的微球也可用作组合物的载剂。
本文提供的组合物，例如疫苗，可以在脂质体或微球(或微粒)中施用。制备用于施用至患者的脂质体和微球的方法是本领域技术人员已知的。例如，美国专利4,789,734描述了将生物材料包封在脂质体中的方法，其内容在此引入作为参考。该材料可以溶解在水溶液中，加入适当的磷脂和脂质以及表面活性剂(如果需要)，并根据需要透析或超声处理该材料。由聚合物或蛋白质形成的微球是本领域技术人员已知的，并且可被设计成通过胃肠道直接进入血流中。或者，可并入化合物，并植入微球或微球复合物以供在数天至数月的时间段内缓慢释放。
防腐剂/无菌性
本文提供的组合物，例如疫苗，可包含用于单次施用(例如，免疫)的材料，或可包含用于多次施用(例如，免疫)的材料(例如，“多剂量”试剂盒)。该组合物，例如疫苗，可包含一种或多种防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。在一些实施方案中，该疫苗基本上不含(例如，<10μg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞。在一些实施方案中，使用α-生育酚琥珀酸酯作为汞化合物的替代物。可使用防腐剂来防止使用过程中的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、Onamer M或本领域技术人员已知的其它试剂。在眼科产品中，例如，这类防腐剂的用量可以是0.004％至0.02％。在本申请的组合物中，防腐剂，例如苯扎氯铵，可以以0.001％至小于0.01％，例如0.001％至0.008％，优选约0.005％(重量)的水平使用。浓度为0.005％的苯扎氯铵可足以保持本文提供的组合物免受微生物侵袭。
作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代(或除此之外)，该组合物，例如疫苗，可以包含在具有用于去除材料的无菌接合器的容器中。
在一些情况下，本文提供的组合物，例如疫苗，可以是无菌的。该组合物，例如疫苗，可以是无热原的，例如，每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，并且可以每剂量<0.1EU。该组合物，例如疫苗，可以在本领域已知的合适的媒介物中配制成无菌溶液或悬浮液。该组合物，例如疫苗，可以通过常规的已知灭菌技术进行灭菌，例如，可以对该组合物进行过滤除菌。
盐/重量摩尔渗透压浓度
在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，包含一种或多种盐。为了控制张度，可以在本文提供的组合物例如疫苗中包含生理盐如钠盐。其它盐可包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠和/或氯化镁等。在一些实施方案中，该组合物，例如疫苗，与一种或多种药学上可接受的盐一起配制。所述一种或多种药学上可接受的盐可包括无机离子的盐，例如钠、钾、钙、镁离子等的盐。这类盐可包括与诸如盐酸、氢澳酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸等无机或有机酸形成的盐。如果活性剂(例如多肽)含有羧基或其它酸性基团，则可将其与无机或有机碱转化为药学上可接受的加成盐。合适的碱的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨、环己胺、二环己胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等。
组合物，例如疫苗，可具有200mOsm/kg至400mOsm/kg、240-360mOsm/kg或290-310mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。
缓冲液/pH
本文提供的组合物，例如疫苗，可包含一种或多种缓冲液，如Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(例如，具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。在一些情况下，以5-20mM的范围包含缓冲液。
本文提供的组合物，例如疫苗，具有约5.0至约8.5、约6.0至约8.0、约6.5至约7.5或约7.0至约7.8的pH。
去污剂/表面活性剂
本文提供的组合物，例如疫苗，包含一种或多种去污剂和/或表面活性剂，例如聚氧乙烯失水山梨醇酯表面活性剂(通常称为“吐温”)，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAXTM商品名出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如线性EO/PO嵌段共聚物；其重复的乙氧基(氧基-1，2-乙二基)基团的数目可以变化的辛苯昔醇(octoxynols)，例如，辛苯昔醇-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物，如TergitolTM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，如三乙二醇单月桂醚(Brij 30)；和失水山梨醇酯(俗称“SPAN”)，如失水山梨醇三油酸酯(Span 85)和失水山梨醇单月桂酸酯，辛苯昔醇(如辛苯昔醇-9(Triton X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，十六烷基三甲基澳化铵(“CTAB”)，或脱氧胆酸钠，特别是用于分裂表面抗原疫苗。所述一种或多种去污剂和/或表面活性剂可仅以痕量存在。在一些情况下，所述组合物，例如疫苗，可包含各少于1mg/ml的辛苯昔醇-10和聚山梨醇酯80。在此可以使用非离子表面活性剂。表面活性剂可以根据其“HLB”(亲水/亲脂平衡)来分类。在一些情况下，表面活性剂具有至少10、至少15和/或至少16的HLB。
在一些实施方案中，在组合物，例如疫苗中使用表面活性剂的混合物，例如吐温80/Span 85混合物。聚氧乙烯失水山梨醇酯和辛苯昔醇的组合也可能是合适的。另一种组合可包括月桂醇聚醚9加聚氧乙烯失水山梨醇酯和/或辛苯昔醇。表面活性剂的量(重量％)可以是：聚氧乙烯失水山梨醇酯(如吐温80)0.01％至1％，特别是约0.1％；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(如Triton X-100，或Triton系列中的其它去污剂)0.001％至0.1％，特别是0.005％至0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1％至20％，优选0.1％至10％，特别是0.1％至1％或约0.5％。
佐剂
本文提供的组合物，例如疫苗，可包含一种或多种佐剂。佐剂可用来增强在接受疫苗的受试者中引发的(体液和/或细胞)免疫应答。有时，佐剂可引发Th1型应答。在一些情况下，佐剂可引发Th2型应答。Th1型应答的特征可在于诸如IFN-γ的细胞因子的产生，而相反，Th2型应答的特征可在于诸如IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子的产生。
基于脂质的佐剂，如MPL和MDP，可以与本文公开的组合物例如疫苗一起使用。例如，单磷酰脂质A(MPL)是可以引起脂质体抗原向特定T淋巴细胞的呈递增加的佐剂。另外，胞壁酰二肽(MDP)也可以作为合适的佐剂与本文所述的组合物例如疫苗一起使用。
佐剂还可以包含刺激分子，如细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括：CCL20、α-干扰素(IFN-a)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、MIP-1-、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC 5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI和TAP2。
另外的佐剂可包括：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2及其功能片段。
在一些情况下，所述一种或多种佐剂可以是Toll样受体的调节剂。Toll样受体调节剂的实例包括TLR-9激动剂和TLR-2激动剂，并且不限于toll样受体的小分子调节剂，如咪喹莫特(R837)。可以使用本文所述组合物例如疫苗的佐剂的其它实例包括皂苷、CpG ODN等。
在一些情况下，所述一种或多种佐剂选自细菌类毒素、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物、铝盐、脂质体、CpG聚合物、水包油乳液或其组合。
有时，所述一种或多种佐剂可以基于铝盐(明矾)或其衍生物。示例性的明矾可包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、硫酸铝钠、硫酸铝铵、硫酸铝铯，或氢氧化铝和氢氧化镁的混合物。明矾还可包含结晶羟基氧化铝(AIOOH)。有时，AIOOH佐剂可以由形成聚集体的纳米长度级板状初级颗粒组成，代表材料中的功能性亚单位。这些聚集体可以是多孔的，并且可以具有直径范围为约1μm至约20μm的不规则形状。在与抗原混合后，这些聚集体可以分解成较小的片段，这些片段可以重新聚集以将吸附的抗原分布在整个疫苗中。在一些实施方案中，佐剂包含有序的杆状AIO(OH)纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述一种或多种佐剂是水包油乳液。水包油乳液可包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中该油和表面活性剂是可生物降解的和生物相容的。乳液中的小油滴的直径可小于5μm，甚至可具有亚微米直径，这些小尺寸用微流化器来实现，以提供稳定的乳液。尺寸小于220nm的小液滴可以是优选的，因为它们可以进行过滤除菌。
所用的油可包括例如来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源可包括坚果、种子和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的例子。可以使用例如从荷荷巴豆中获得的荷荷巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。谷物组可包括：玉米油和诸如小麦、燕麦、黑麦、大米、苔麸(teff)、黑小麦(triticale)等其它谷粒的油。甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然并非天然存在于种子油中，但可以通过从坚果油和种子油开始水解、分离和酯化适当的物质来制备。来自哺乳动物乳的脂肪和油可以是可代谢的，并且可以与本文所述的组合物例如疫苗一起使用。用于从动物来源获得纯油的分离、纯化、皂化和其它手段的程序是本领域已知的。鱼可含有可以容易地回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡可以举例说明几种可在此使用的鱼油。许多支链油可以在5-碳异戊二烯单元中生物化学合成，并且通常可以被称为萜类化合物。鲨鱼肝油含有一种被称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物——2，6，10，15，19,23-六甲基-2，6，10，14，18,22-二十四碳六烯。也可以使用角鲨烯的饱和类似物——角鲨烷。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，可以从商业来源容易地获得，或者可以通过本领域已知的方法获得。
其它有用的油包括生育酚，其可以包含在本文所述的组合物，例如疫苗中，以用于老年患者(例如，年龄60岁或更大)，因为维生素E可以对该受试者组中的免疫应答具有积极作用。此外，生育酚可具有抗氧化性质，这可有助于稳定乳液。存在各种生育酚(α、β、γ、δ、ε或ξ)；在一些情况下，使用α。α-生育酚的一个实例是DL-α-生育酚。α-生育酚琥珀酸酯可以与本文提供的组合物，例如流感疫苗相容，并且可以是有用的防腐剂，作为汞化合物的替代物。在一些实施方案中，可以使用油的混合物，例如角鲨烯和α-生育酚。可以使用2-20％(体积)范围内的油含量。
具体的水包油乳液佐剂包括，例如，角鲨烯、聚山梨醇酯80和失水山梨醇三油酸酯的亚微米乳液。按体积计，该乳液的组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％Span 85。以重量计，这些比例变为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80和0.48％Span85。该佐剂被称为“MF59”。MF59乳液有利地包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
水包油乳液可以是角鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80的亚微米乳液。这些乳液可含有2％至10％角鲨烯、2％至10％生育酚和0.3％至3％聚山梨醇酯80，并且角鲨烯：生育酚的重量比可优选≤1(例如，0.90)，因为这可提供更多稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以以约5∶2的体积比或以约11∶5的重量比存在。一种这样的乳液可以通过将吐温80溶解在PBS中以得到2％溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，然后对该混合物进行微流化来制备。所得到的乳液具有亚微米小油滴，例如平均直径为100-250nm，优选约180nm。该乳液还可包含3-去-O-酰化的单磷酰脂质A(3d-MPL)。这种类型的另一种有用的乳液可以每个人用剂量包含0.5-10mg角鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨醇酯80。
水包油乳液可以是角鲨烯、生育酚和Triton去污剂(例如Triton X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL(参见下文)。该乳液可含有磷酸盐缓冲液。
水包油乳液可以是包含聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)、Triton去污剂(例如Triton X-100)和生育酚(例如α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液可包含质量比为约75∶11∶10的这三种组分(例如，750μl/ml聚山梨醇酯80、110u/ml Triton X-100和100μ/ml α-生育酚琥珀酸酯)，并且这些浓度应包括来自抗原的这些组分的任何贡献。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL。水相可含有磷酸盐缓冲液。
水包油乳液可以是角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(“PluronicTM L121”)的乳液。该乳液可以被配制在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中。该乳液可以是用于胞壁酰二肽的有用递送媒介物，并且可在“SAF-1”佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烷、2.5％PluronicL121和0.2％聚山梨醇酯80)中与苏氨酰基-MDP一起使用。它也可以在没有Thr-MDP的情况下使用，如“AF”佐剂(5％角鲨烷、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)。
水包油乳液可以是包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如，聚氧乙烯(12)十六十八烷基醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如，失水山梨醇酯或二缩甘露醇酯，如失水山梨醇单油酸酯或“Span 80”)的乳液。该乳液可以是热可逆的，并且/或者具有至少90％的小油滴(按体积计)，其大小小于200nm。该乳液还可以包含以下一种或多种：醛醇；冷冻保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。该乳液可包含TLR4激动剂。可以将这类乳液冻干。
水包油乳液可以是角鲨烯、泊洛沙姆105和Abil-Care的乳液。佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)可以是5％角鲨烯、4％泊洛沙姆105(pluronic多元醇)和2％Abil-Care85(Bis-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16聚二甲基硅氧烷；辛酸/癸酸甘油三酯)。
水包油乳液可以是具有0.5-50％的油、0.1-10％的磷脂和0.05-5％的非离子表面活性剂的乳液。磷脂组分可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米小液滴大小可能是有利的。
水包油乳液可以是不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或Span 80)的亚微米水包油乳液。添加剂可包括QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂性缀合物(如GPI-OlOO，通过经由葡糖醛酸的羧基向脱酰基皂苷添加脂肪族胺来产生)、二甲基双十八烷基澳化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，含有佐剂，如亲水性或亲脂性胶凝剂、亲水性或亲脂性活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、遮光剂、气味吸收剂和染料。这些各种佐剂的量可以是在所考虑的领域中使用的量，并且例如，占组合物总重量的约0.01％至约20％。根据它们的性质，可以将这些佐剂引入脂肪相、水相和/或脂质囊泡中。
包含与一种或多种佐剂组合的一种或多种活性剂如肽、核酸分子、抗体或其片段、APC和/或本文所述病毒的本文提供的组合物，例如疫苗，可被配制成包含某些摩尔比。例如，可以使用活性剂与一种或多种佐剂相组合的约99∶1至约1∶99的摩尔比。在一些实施方案中，活性剂与一种或多种佐剂相组合的摩尔比范围可选自约80∶20至约20∶80；约75∶25至约25∶75，约70∶30至约30∶70，约66∶33至约33∶66，约60∶40至约40∶60；约50∶50；约90∶10至约10∶90。活性剂与一种或多种佐剂相组合的摩尔比可以是约1∶9，并且在一些情况下可以是约1∶1。与一种或多种佐剂组合的活性剂，如肽或多肽、核酸分子、抗体或其片段、APC和/或本文所述的病毒，可以在相同的剂量单位中，例如，在一个小瓶、栓剂、片剂、胶囊、气雾喷雾剂中配制在一起；或者每种药剂、形式和/或化合物可以配制在单独的单位中，例如两个小瓶、栓剂、片剂，两个胶囊、片剂和小瓶，气雾喷雾剂等中。
本文提供的组合物，例如疫苗，可包含一种或多种选自明矾、单磷酰脂质A(MPL)、咪喹莫特(R837)(一种小合成抗病毒分子——TLR7配体)、Pam2Cys和有序杆状AIO(OH)纳米颗粒(Rod)的佐剂。在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，包含明矾。在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，包含Rod。在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，包含Rod、MPL和R837。在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，包含MPL和R837。在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，包含明矾、MPL和R837。在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，包含Pam2Cys。
另外的药剂
本文提供的组合物，例如疫苗，可以与另外的活性剂一起施用。另外的活性剂的选择可以至少部分地取决于所治疗的病况。另外的活性剂可包括，例如，对病原体感染(例如，病毒感染)具有治疗效果的任何活性剂，包括，例如，用来治疗炎性病况的药物，如NSAID，例如布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、酮洛芬或阿司匹林。在一些实施方案中，用于治疗或预防流感感染的制剂可含有一种或多种常规流感抗病毒剂，如维生素D、金刚烷胺、阿比朵尔、拉尼米韦、金刚乙胺、扎那米韦、帕拉米韦和奥司他韦。在用于逆转录病毒如HIV感染的治疗中，制剂可含有一种或多种常规抗病毒药物，如蛋白酶抑制剂(洛匹那韦/利托那韦
Figure BDA0002182226080000801
茚地那韦
Figure BDA0002182226080000802
利托那韦
Figure BDA0002182226080000803
奈非那韦(nelfmavir)
Figure BDA0002182226080000804
沙奎那韦硬明胶胶囊
Figure BDA0002182226080000805
阿扎那韦
Figure BDA0002182226080000806
氨普那韦
Figure BDA0002182226080000807
呋山那韦(fosamprenavir)
Figure BDA0002182226080000808
替拉那韦(tipranavir)
Figure BDA0002182226080000809
)、逆转录酶抑制剂，包括非核苷和核苷/核苷酸抑制剂(AZT(齐多夫定，
Figure BDA00021822260800008010
)、ddl(去羟肌苷，
Figure BDA00021822260800008011
)、3TC(拉米夫定，
Figure BDA00021822260800008012
)、d4T(司他夫定，
Figure BDA0002182226080000811
)、阿巴卡韦
Figure BDA0002182226080000812
FTC(恩曲他滨，
Figure BDA0002182226080000813
)、替诺福韦
Figure BDA0002182226080000814
依非韦仑
Figure BDA0002182226080000815
和奈韦拉平
Figure BDA0002182226080000816
)、融合抑制剂T20(恩夫韦肽，
Figure BDA0002182226080000817
)、整合酶抑制剂(MK-0518和GS-9137)和成熟抑制剂(PA-457
Figure BDA0002182226080000818
)。作为另一个实例，制剂可另外含有一种或多种补充剂，如维生素C、维生素E和其它维生素和抗氧化剂。
本文提供的组合物，例如疫苗，可包含一种或多种抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
在一些实施方案中，所述组合物，例如疫苗，可以不含谷蛋白。
共溶剂
可通过本文提供的组合物中的共溶剂来提高该组合物的组分的溶解度。此类共溶剂包括聚山梨醇酯20、60和80，Pluronic F68、F-84和P-103，环糊精，或本领域技术人员已知的其它试剂。此类共溶剂可在约0.01重量％至2重量％的水平下使用。
渗透促进剂
在一些实施方案中，本文提供的组合物，例如疫苗，可包含一种或多种渗透促进剂。例如，该组合物可包含合适的固体或凝胶相载剂或赋形剂，其增加渗透或帮助药剂或药剂组合穿过渗透性屏障例如皮肤递送。促进渗透的化合物的实例包括，例如，水、醇(例如，萜烯，如甲醇、乙醇、2-丙醇)、亚砜(例如，二甲基亚砜、癸基甲基亚砜、十四烷基甲基亚砜)、吡咯烷酮(例如，2-吡咯烷酮，N-甲基-2-吡咯烷酮、N-(2-羟乙基)吡咯烷酮)、月桂氮
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酮、丙酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、四氢糠醇、L-α-氨基酸、阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂(例如，肉豆蔻酸异丙酯和十二烷基硫酸钠)、脂肪酸、脂肪醇(例如油酸)、胺、酰胺、氯贝酸酰胺、六亚甲基月桂酰胺、蛋白水解酶、α-没药醇、d-柠檬烯、尿素和N，N-二乙基-间甲苯酰胺等。另外的实例包括湿润剂(例如，尿素)、二醇(例如，丙二醇和聚乙二醇)、甘油单月桂酸酯、烷烃、烷醇、ORGELASE、碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和/或其它聚合物。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种这样的渗透促进剂。
用于持续释放制剂的添加剂
在一些实施方案中，一种或多种活性剂可以可释放地附接到生物相容性聚合物上，以用于在插入物之上、之中或附着到插入物的持续释放制剂中，以供局部、眼内、眼周或全身给药。从生物相容性聚合物的控制释放可与水溶性聚合物一起使用，以形成可滴注的制剂。从生物相容性聚合物如PLGA微球或纳米球的控制释放可以在适合于眼内植入或注射以供持续释放给药的制剂中使用。可以使用任何合适的可生物降解和生物相容的聚合物。
给药途径
本文所述的组合物，例如疫苗，可以通过多种途径递送至受试者，例如人。递送途径可包括口服(包括颊部和舌下)、直肠、经鼻、局部、透皮、透粘膜、经肺、阴道、栓剂或肠胃外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)给药或适于通过雾化、吸入或吹入给药的形式。所述组合物，例如疫苗，可以施用至肌肉，或者可以通过皮内或皮下注射施用，或者透皮施用，例如通过离子电渗疗法施用。所述组合物，例如疫苗，可以通过表皮施用递送至受试者。
治疗方案
本文提供的组合物，例如疫苗，可以以约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL或更多的剂量体积施用于受试者。半剂量，例如约0.25mL，可施用于儿童。有时，该疫苗可以以更高的剂量施用，例如约1mL。
所述组合物，例如疫苗，可以按照1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂量-疗程方案施用。有时，该疫苗可以按照2、3或4剂量-疗程方案施用。有时，该疫苗可以按照2剂量-疗程方案施用。
2剂量-疗程方案的第一剂量和第二剂量的施用可以相隔约0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2个月、4个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、10年、20年或更长时间。本文所述的组合物，例如疫苗，可以每年一次、每年两次、每年三次、每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年一次施用于受试者。有时，该组合物，例如疫苗，可以每2、3、4、5、6、7年或更多年一次施用于受试者。有时，该组合物，例如疫苗，可以每4、5、6、7年或更多年一次施用。有时，该组合物，例如疫苗，可以一次施用于受试者。有时，该组合物，例如疫苗，可以在一段时间内作为多剂量疫苗由受试者服用，例如2剂量疫苗，其中第二剂量可以在第一剂量后4-5年服用。在一些情况下，组合物，例如疫苗，在8月至3月、9月至2月、10月至1月、11月至12月的某个时间，例如在北半球的某个地区施用。在一些情况下，组合物，例如疫苗，在3月至10月、4月至9月、5月至8月、6月至7月的某个时间，例如在南半球的某个地区施用。
剂量实例不是限制性的，仅用来举例说明用于施用本文所述的组合物，例如疫苗的具体给药方案。在一些实施方案中，可以从动物模型确定用于人类的“治疗有效量”。例如，可以制定人用剂量以达到已经发现在动物中治疗有效的循环、肝脏、局部和/或胃肠浓度。基于动物数据和其它类型的类似数据，本领域技术人员可以确定适合施用于人的组合物，例如疫苗的治疗有效量。
本文所述的组合物，例如疫苗，可用来治疗或预防季节性流感或大流行性流感。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可以针对流感病毒亚型。甲型流感病毒可以基于血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(N)进行亚型分析，这两种蛋白质在病毒包膜的表面上表达。甲型流感病毒可以展现出约18种HA亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hl 1、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18；和大约11种N亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11。HA和N亚型可以以任何组合方式组合在一起。已经观察到的HA和N亚型组合的非限制性实例包括：H1N1、H1N2、H1N7、H2N2、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、HI 1N6、H12N5、H13N6和H14N5。在一些实施方案中，本文所述的疫苗可以针对具有本文公开的HA和N亚型的组合的甲型流感病毒。在一些情况下，该组合可由HxNy表示，其中x代表任何H1-H18亚型，y代表任何N1-N11亚型。例如，在一些实施方案中，本文公开的疫苗可以针对被表示为H1Ny的亚型，它是H1与本文所述的任何N亚型的组合，或针对被表示为H2Ny的亚型，等等。在一些实施方案中，本文所述的疫苗可以针对具有HA和N亚型组合H1N1、H1N2、H1N7、H2N2、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6或H14N5的甲型流感病毒。
在一些实施方案中，本文所述的组合物，例如疫苗，可以针对乙型流感病毒。乙型流感病毒可以分为谱系和毒株。乙型流感病毒可属于B/Yamagata或B/Victoria谱系。示例性的乙型流感病毒株包括Brisbane/60/2008、Massachusetts/2/2012和Wisconsin/1/2010。
在一些实施方案中，本文所述的组合物，例如疫苗，可以针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和/或丙型流感病毒。在一些实施方案中，本文所述的组合物，例如疫苗，可以针对甲型流感病毒株、乙型流感病毒株、丙型流感病毒株或其组合。
在一些实施方案中，本文所述的组合物，例如疫苗，可用来治疗具有流感感染如甲型流感病毒感染、乙型流感病毒感染或丙型流感病毒感染的患者。有时，本文所述的组合物，例如疫苗，可用作针对甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒感染的疫苗接种方法。有时，本文所述的组合物，例如疫苗，提供针对与甲型流感病毒、乙型流感病毒和/或丙型流感病毒相关的不同株的交叉保护。
如本文所用的术语“治疗有效量”可以指有效减轻、改善或预防待治疗的疾病或病况的症状或体征的量。例如，在一些实施方案中，治疗有效量可以是在具有病毒感染，例如流感感染，例如甲型流感感染的体征和/或症状的受试者中具有有益效果的量。在一些实施方案中，治疗有效量可以是与对照相比抑制或减轻病毒感染，例如流感感染，例如甲型流感感染的体征和/或症状的量。流感感染，例如甲型流感感染的体征和症状，在本领域中是公知的，并且可以包括发热、咳嗽、咽喉痛、流鼻涕、鼻塞、头痛、肌肉疼痛、发冷、疲劳(疲倦)、恶心、呕吐、腹泻、疼痛(例如腹痛)、结膜炎、呼吸短促、呼吸困难、肺炎、急性呼吸窘迫、病毒性肺炎、呼吸衰竭、神经病学改变(例如，精神状态改变、癫痫发作)或其组合。在一些实施方案中，治疗有效量可以是与对照相比足以将受试者中的任何体征和/或症状减少大约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的量。
当提及一种或多种活性剂时，治疗有效量可以是已被医学或制药领域的各个管理或咨询组织(例如，FDA、AMA)中的任一个或制造商或供应商推荐或批准的剂量范围、给药方式、制剂等。
在本公开内容的一些方面，所述组合物可包含基于肽的制剂。包含本文所述多肽的组合物可以以约1nmol/剂至约1000μmol/剂施用于受试者。在一些实施方案中，该组合物可以以约1nmol/剂、约5nmol/剂、约10nmol/剂、约20nmol/剂、约30nmol/剂、约40nmol/剂、约50nmol/剂、约60nmol/剂、约70nmol/剂、约80nmol/剂、约90nmol/剂、约100nmol/剂、约200nmol/剂、约300nmol/剂、约400nmol/剂、约500nmol/剂、约600nmol/剂、约700nmol/剂、约800nmol/剂、约900nmol/剂、约1μmol/剂、约1μmol/剂、约2μmol/剂、约3μmol/剂、约4μmol/剂、约5μmol/剂、约6μmol/剂、约7μmol/剂、约8μmol/剂、约9μmol/剂、约10μmol/剂、约20μmol/剂、约50μmol/剂、约100μmol/剂、约200μmol/剂、约300μmol/剂、约400μmol/剂、约500μmol/剂、约750μmol/剂、约1000μmol/剂的剂量或其任意两者之间的任何剂量施用于受试者。在一些情况下，该组合物可以以约50nmol/剂的剂量施用于受试者。
在本公开内容的一些方面，所述组合物可包含编码本文所述多肽的多核苷酸。施用于受试者的组合物可包含约1pmol/剂至约1000μmol/剂的剂量的多核苷酸。在一些实施方案中，施用于受试者的组合物可包含约1pmol/剂、约5pmol/剂、约10pmol/剂、约20pmol/剂、约30pmol/剂、约40pmol/剂、约50pmol/剂、约60pmol/剂、约70pmol/剂、约80pmol/剂、约90pmol/剂、约100pmol/剂、约200pmol/剂、约300pmol/剂、约400pmol/剂、约500pmol/剂、约600pmol/剂、约700pmol/剂、约800pmol/剂、约900pmol/剂、1nmol/剂、约5nmol/剂、约10nmol/剂、约20nmol/剂、约30nmol/剂、约40nmol/剂、约50nmol/剂、约60nmol/剂、约70nmol/剂、约80nmol/剂、约90nmol/剂、约100nmol/剂、约200nmol/剂、约300nmol/剂、约400nmol/剂、约500nmol/剂、约600nmol/剂、约700nmol/剂、约800nmol/剂、约900nmol/剂、约1μmol/剂、约1μmol/剂、约2μmol/剂、约3μmol/剂、约4μmol/剂、约5μmol/剂、约6μmol/剂、约7μmol/剂、约8μmol/剂、约9μmol/剂、约10μmol/剂、约20μmol/剂、约50μmol/剂、约100μmol/剂、约200μmol/剂、约300μmol/剂、约400μmol/剂、约500μmol/剂、约750μmol/剂、约1000μmol/剂的剂量或其任意两者之间的任何剂量的多核苷酸。
在本公开内容的一些方面，所述组合物可包含含有编码本文所述多肽的多核苷酸的重组病毒。包含重组病毒的组合物可以以约103至1012个病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)、或约105至1010PFU、或约105至108PFU、或约108至1010PFU施用于受试者。在一些实施方案中，施用于受试者的本公开内容的病毒疫苗的量可以是约103至1012个病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)，或约105至1010PFU，或约105至108PFU，或约108至1010PFU。有时，施用于受试者的本公开内容的病毒疫苗可以以约103PFU/剂至约104PFU/剂、约104PFU/剂至约105PFU/剂、约105PFU/剂至约106PFU/剂、约107PFU/剂至约108PFU/剂、约109PFU/剂至约1010PFU/剂、约1010PFU/剂至约1011PFU/剂、约1011PFU/剂至约1012PFU/剂、约1012PFU/剂至约1013PFU/剂、约1013PFU/剂至约1014PFU/剂或约1014PFU/剂至约1015PFU/剂的剂量施用。施用于受试者的本发明的病毒疫苗可以包含约2x103PFU/剂、3x103PFU/剂、4x103PFU/剂、5x103PFU/剂、6x103PFU/剂、7x103PFU/剂、8x103PFU/剂、9x103PFU/剂、约104PFU/剂、约2x104PFU/剂、约3x104PFU/剂、约4x104PFU/剂、约5x104PFU/剂、约6x104PFU/剂、约7x104PFU/剂、约8x104PFU/剂、约9x104PFU/剂、约105PFU/剂、2x105PFU/剂、3x105PFU/剂、4x105PFU/剂、5x105PFU/剂、6x105PFU/剂、7x105PFU/剂、8x105PFU/剂、9x105PFU/剂、约106PFU/剂、约2x106PFU/剂、约3x106PFU/剂、约4x106PFU/剂、约5x106PFU/剂、约6x106PFU/剂、约7x106PFU/剂、约8x106PFU/剂、约9x106PFU/剂、约107PFU/剂、约2x107PFU/剂、约3x107PFU/剂、约4x107PFU/剂、约5x107PFU/剂、约6x107PFU/剂、约7x107PFU/剂、约8x107PFU/剂、约9x107PFU/剂、约108PFU/剂、约2x108PFU/剂、约3x108PFU/剂、约4x108PFU/剂、约5x108PFU/剂、约6x108PFU/剂、约7x108PFU/剂、约8x108PFU/剂、约9x108PFU/剂、约109PFU/剂、约2x109PFU/剂、约3x109PFU/剂、约4x109PFU/剂、约5x109PFU/剂、约6x109PFU/剂、约7x109PFU/剂、约8x109PFU/剂、约9x109PFU/剂、约1010PFU/剂、约2x1010PFU/剂、约3x1010PFU/剂、约4x1010PFU/剂、约5x1010PFU/剂、约6x1010PFU/剂、约7x1010PFU/剂、约8x1010PFU/剂、约9x1010PFU/剂、约1010PFU/剂、约2x1010PFU/剂、约3x1010PFU/剂、约4x1010PFU/剂、约5x1010PFU/剂、约6x1010PFU/剂、约7x1010PFU/剂、约8x1010PFU/剂、约9x1010PFU/剂、约1011PFU/剂、约2x1011PFU/剂、约3x1011PFU/剂、约4x1011PFU/剂、约5x1011PFU/剂、约6x1011PFU/剂、约7x1011PFU/剂、约8x1011PFU/剂、约9x1011PFU/剂或约1012PFU/剂、约1012PFU/剂至约1013PFU/剂、约1013PFU/剂至约1014PFU/剂或约1014PFU/剂至约1015PFU/剂，或其任意两者之间的任何剂量。
有时，施用于受试者的本公开内容的病毒疫苗可以以约104个病毒颗粒/剂、约104个病毒颗粒/剂至约105个病毒颗粒/剂、约105个病毒颗粒/剂至约106个病毒颗粒/剂、约107个病毒颗粒/剂至约108个病毒颗粒/剂、约109个病毒颗粒/剂至约1010个病毒颗粒/剂、约1010个病毒颗粒/剂至约1011个病毒颗粒/剂、约1011个病毒颗粒/剂至约1012个病毒颗粒/剂、约1012个病毒颗粒/剂至约1013个病毒颗粒/剂、约1013个病毒颗粒/剂至约1014个病毒颗粒/剂或约1014个病毒颗粒/剂至约1015个病毒颗粒/剂的剂量施用。在一些实施方案中，施用于受试者的本公开内容的病毒疫苗可以以约1x109个病毒颗粒/剂、约1.5x109个病毒颗粒/剂、约2x109个病毒颗粒/剂、约2.5x109个病毒颗粒/剂、约3x109个病毒颗粒/剂、约3.5x109个病毒颗粒/剂、约4x109个病毒颗粒/剂、约4.5x109个病毒颗粒/剂、约5x109个病毒颗粒/剂、约5.5x109个病毒颗粒/剂、约6x109个病毒颗粒/剂、约6.5x109个病毒颗粒/剂、约7x109个病毒颗粒/剂、约7.5x109个病毒颗粒/剂、约8x109个病毒颗粒/剂、约8.5x109个病毒颗粒/剂、约9x109个病毒颗粒/剂、约1x1010个病毒颗粒/剂、约2x1010个病毒颗粒/剂、约3x1010个病毒颗粒/剂、约4x1010个病毒颗粒/剂、约5x1010个病毒颗粒/剂、约6x1010个病毒颗粒/剂、约7x1010个病毒颗粒/剂、约8x1010个病毒颗粒/剂、约9x1010个病毒颗粒/剂的剂量或其任意两者之间的任何剂量施用。在一些实施方案中，施用于受试者的本公开内容的病毒疫苗可以以约7.5x109个病毒颗粒/剂的剂量施用。
本文提供的组合物，例如疫苗，可以在与病原体感染例如甲型流感感染相关的症状发作之前、期间或之后施用。示例性症状可包括发热、咳嗽、咽喉痛、流鼻涕、鼻塞、头痛、肌肉疼痛、发冷、疲劳、恶心、呕吐、腹泻、疼痛(例如腹痛)、结膜炎、呼吸短促、呼吸困难、肺炎、急性呼吸窘迫、病毒性肺炎、呼吸衰竭、神经病学改变(例如，精神状态改变、癫痫发作)或其组合。在一些情况下，该组合物，例如疫苗，可以施用于受试者以治疗病原体感染，例如流感感染，例如甲型流感感染。有时，该组合物，例如疫苗，可以施用于受试者以用于预防目的，例如预防性处置病原体感染，例如流感感染，例如甲型流感感染。该组合物，例如疫苗，可以施用于受试者以引发受试者的免疫应答。该组合物，例如疫苗，可以在病原体感染之前、病原体感染期间或作为针对病原体感染的预防措施施用于受试者，以引发受试者的免疫应答。在施用本文提供的组合物，例如疫苗后，与病原体相关的症状可以在大约、至少或至多1天、5天、1周、2周、3周或1个月内减少大约、至少或至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
流感感染例如甲型流感感染的并发症可以是，例如，肺炎、支气管炎、鼻窦感染或耳部感染。在一些情况下，流感感染，例如甲型流感感染，会使慢性健康问题恶化，例如，患有哮喘的人可能在具有流感感染时发生哮喘发作，或者患有慢性充血性心力衰竭的人可能在具有流感感染时发生该病况的恶化。在一些实施方案中，可以将治疗有效量的组合物，例如本文所述的疫苗施用于患有流感感染并发症的受试者。在一些实施方案中，可以将治疗有效量的组合物，例如本文所述的疫苗施用于具有流感感染(例如，甲型流感感染)和一种或多种慢性健康问题的受试者。
本文提供的组合物，例如疫苗，或本文所述的试剂盒，可以储存在2℃至8℃。有时，该组合物，例如疫苗，可以在室温下储存。在一些实施方案中，该组合物，例如疫苗，可以不冷冻储存。在一些实施方案中，该组合物，例如疫苗，可以在诸如-20℃或-80℃的温度下储存。在一些实施方案中，该组合物，例如疫苗，可以远离阳光储存。
实施例
提供以下实施例是为了说明，而不是为了限制。
实施例1
肽序列TYQRTRALV(SEQ ID NO：37)的选择基于1)是worldweb.fiudb.org中经实验验证的BALB/C甲型流感病毒CD8 T细胞表位，以及2)在该序列段中的所有可能的突变中，平均不变性比(最终群体中的突变体的频率/初始群体中的频率)<0.08(通常每个残基具有6-7个由密码子内单核苷酸改变引起的可能的突变)。将肽与Pam2Cys(一种激活TLR2并与该肽共价连接的脂质体佐剂)和来自HA的CD4T细胞表位(GALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO：115))缀合(通过中心赖氨酸连接的表位，和通过两个丝氨酸与中心赖氨酸缀合的Pam2Cys)。(CSBio，Menlo Park，CA合成该脂肽。)用每20μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)50nmol具有序列TYQRTRALV(SEQ ID NO：37)的Pam2Cys-肽(2.5μM)制备制剂。将20μL体积的该制剂鼻内施用至10只BALB/C小鼠(“第2组”)中的每一只。将20μl体积的PBS鼻内施用至10只对照BALB/C小鼠(“第1组”)中的每一只。施用后四周，用100TCID50PR8甲型流感病毒攻击两组小鼠。与对照组(第1组)中的0％(0/10)相比，疫苗组(第2组)中60％(6/10)的小鼠在甲型流感病毒致死性攻击9天后存活，显示出统计学显著性的疫苗保护(见图2)。
实施例2
该实施例描述了用包含4个流感病毒表位的疫苗进行接种。生成携带4个流感病毒表位的重组腺病毒：ELRSRYWAIRTRSG(NP)(SEQ ID NO：17)、FYIQMCTEL(NP)(SEQ ID NO：79)、TYNAELLVLL(HA)(SEQ ID NO：80)和TYQRTRALV(NP)(SEQ ID NO：37)。该重组腺病毒含有单个转基因，其中四个肽串联编码并且被连接体RVKR(SEQ ID NO：110)隔开。转基因产物的序列是GALNNRFQIKGVELKSKTYQRTRALVRVKRELRSRYWAIRTRSGRVKRFYIQMCTELRVKRTYNAELLVLL(SEQ ID NO：81)。为了生成重组腺病毒载体，针对在小鼠细胞中表达对转基因进行密码子优化。将该重组腺病毒以2x107pfu(噬斑形成单位)的剂量在20μl中(对于皮下和鼻内各为7.5x109个病毒颗粒)同时皮下和鼻内施用至第1组小鼠(10只BALB/C小鼠)。28天后用5-10 LD50(致死剂量50)的致死剂量(约100TCID50或组织培养感染剂量50)的H1N1流感攻击小鼠。该组中的所有10只小鼠均存活。10只小鼠中有9只最初体重减轻，但到攻击后第12天恢复了大部分体重。见图3A和图4。
在对照组(第2组，未接种的，皮下和鼻内注射盐水)中，用5-10LD50(致死剂量50)的致死剂量(约100TCID50或组织培养感染剂量50)的H1N1流感攻击10只BALB/C小鼠。10只小鼠均未存活，到攻击后第9天所有小鼠均死亡。见图3B和图4。
在另一组实验中，使用注射AdCre的小鼠作为Ad载体的对照组(图3C中的第1组)。AdCre是使用与重组腺病毒疫苗相同的腺病毒载体产生的腺病毒，但插入了Cre重组酶基因而不是表达4个表位的核苷酸序列。如图3C所示，该对照组中的5只小鼠中有3只死亡，另外2只小鼠体重大大减轻。相反，在接种组(图3D中的第2组)中，5只小鼠的体重减轻均未>10％。AdCre中的所有5只小鼠的症状评分均为3或更高(未示出)，而疫苗组中的所有5只小鼠均不高于1。
实施例3
该实施例描述了用包含9个流感病毒表位的疫苗进行接种。生成携带9个流感病毒表位的重组腺病毒。还可以使用包含9个流感病毒表位的肽的疫苗混合物。流感病毒表位可包含表1中列出的表位的任何组合。
可以使用HLA-B44-转基因小鼠进行疫苗接种。可以采用初免-加强方案。初免可以使用9种Pam2Cys佐剂肽。加强可以使用携带9个流感病毒表位或具有通用辅助T细胞表位的重组腺病毒。接种后，用流感病毒PR8株攻击小鼠。监测小鼠的健康、体重和存活，以评估疫苗接种赋予的保护作用。
实施例4
该实施例描述了用于流感病毒的异亚型保护试验的实验程序和材料。
杀伤曲线
可以进行杀伤曲线实验(致死剂量曲线)以确定LD50(50％受试动物死亡时的剂量)，使得5-10 LD50的攻击剂量可以用于该保护实验。
第1天：每组3只小鼠，鼻内，25ul
Vict 1d是H3N2，并且是3.2×107TCID50/ml
1)A组：10TCID50Vict 1d(H3N2)(使其为第5个：稀释#5：50ul稀释#4+450ul PBS)
2)B组：100TCID50Vict 1d(使其为第4个：稀释#4：50ul稀释#3+450ul PBS)
3)C组：1,000TCID50Vict 1d(使其为第3个：稀释#3：50ul稀释#2+450ul PBS)
4)D组：10,000TCID50Vict 1d(使其为第2个：稀释#2：50ul稀释#1+450ul PBS)
5)E组：100,000TCID50Vict 1d(使其为第1个：稀释#1：100ul病毒储备液+700ul PBS)
异亚型保护
第1天：免疫小鼠：
1)第1组：10只小鼠，采用20ul盐水i.n.(鼻内)和20ul盐水s.c.(皮下)
2)第2组：10只小鼠，采用在20ul AdBALB中的2×107pfu i.n.和相同材料s.c.
对于2x107pfu AdBALAB：向3小瓶AdBALB中各加入115ul PBS。将小瓶混合在一起(应该总共420ul，刚好足够；第6组中也可以使用来自小瓶的一些)并如上施用。
3)第3组：5只小鼠，采用在20ul AdBALB5-pep中的2×107pfu i.n.和相同材料s.c.
对于2x107pfu AdBALAB 5-pep：向1小瓶AdBALB5-pep中加入230μl PBS并如上施用。
4)第4组：5只小鼠，采用在20ul中的7.5×109个病毒颗粒i.n.和相同材料s.c.
对于10x109pfu AdBALAB5-pep：向1小瓶AdBALB5-pep中加入722ul PBS并如上施用。
5)第5组：5只小鼠，采用20ul AdCre i.m.(肌肉内)
对于20μlAdCre：向1小瓶AdCre中加入653ul PBS并如上施用。
6)第6组：5只小鼠，采用20ul AdBALB i.m.
对于20μlAdBALB：向1小瓶AdBALB中加入115μl PBS并如上施用。
第2-15天：监测体重、存活和临床评分
第29天：攻击小鼠：均在20ul中i.n.
1)第1-4组：5-10 LD50(基于杀伤曲线选择)Vict 1d
2)第5-6组：100 TCID50 PR8(1/10，000稀释病毒储备液：10ul病毒储备液+990ul PBS；10ul该稀释液+990ul PBS用于工作储备液)
第30-43天：监测体重、存活和临床评分
试剂
总共55只6-12周龄雌性BALB/C小鼠。
腺病毒：AdBALB(没有表位序列的对照病毒)；AdBALB5-pep(携带5个不同流感表位序列的疫苗)；AdCre(没有表位序列但有Cre转基因的对照病毒)。流感病毒：PR8；Vict 1d(H3N2)。
实施例5
该实施例描述了具有51个不同流感病毒表位的基于重组腺病毒的疫苗(AdFlu51pep)。用表达表3中所有51个表位序列的单个转基因改造重组腺病毒，这些表位序列串联编码并且被连接体RVKR(SEQ ID NO：110)隔开。这51个表位序列的顺序可以是随机的，从而生成多种不同的转基因序列。转基因产物的一个实例或转基因产物的一部分的序列如表4中所列。
表4
Figure BDA0002182226080000931
该转基因可以表达与乙型流感病毒NP蛋白例如SEQ ID NO：116、117或118或乙型流感病毒NP蛋白片段(例如，SEQ ID NO：116、117或118的氨基酸2-560)的一个或多个(例如，2、3、4或5个)拷贝连接的多肽。在一些情况下，该疫苗包含具有第二转基因的第二腺病毒，该第二转基因可以表达包含乙型流感病毒NP蛋白例如SEQ ID NO：116、117或118或乙型流感病毒NP蛋白片段的一个或多个(例如，2、3、4、5个)拷贝的多肽。在一些情况下，腺病毒可包含能够表达包含SEQ ID NO.106的多肽和第二多肽的转基因，该第二多肽包含乙型流感病毒NP蛋白例如SEQ ID NO：116、117或118或乙型流感病毒NP蛋白片段的一个或多个(例如，2、3、4或5个)拷贝。
实施例6
该实施例描述了如实施例5所述的基于腺病毒的流感疫苗的产生。
首先，可以使用常规分子克隆技术构建含有表达SEQ ID NO：106的转基因的穿梭载体(Add2)。该转基因由CMV启动子驱动。此时可以通过转染到293T细胞中来检查转基因的表达。如果在转染的293T细胞中未能观察到多肽表达，则将优化载体构建体。
然后将Maxiprep pAdFlu51pep进行线性化并转染到293细胞中以生成腺病毒噬斑。将复制缺陷型C68辅助病毒或C6病毒补充到转染的293细胞中用于腺病毒包装。接种后7-10天形成病毒噬斑。然后可以挑选噬斑，冷冻以备以后使用，或者进行病毒扩充。pAdFlu51pep病毒的实验室规模扩充可以通过将亚汇合的293细胞通过不同大小的细胞培养瓶如T25、T75或甚至T150连续传代来进行。
将细胞培养基和裂解的细胞进行离心以获得病毒储备液。滴度测定根据常规病毒滴度测定程序进行。
实施例7
该实施例描述了如实施例5所述的基于腺病毒的疫苗在人类受试者中的临床研究。
进行开放标签、无对照的1期研究，以在健康成人中评价含有表3中51个不同表位序列的基于腺病毒的疫苗(AdFlu51pep疫苗)。
目的：评价AdFlu51pep疫苗在18至55岁的男性和女性健康成年志愿者中的安全性、耐受性和免疫原性。
剂量
AdFlu51pep疫苗的起始剂量范围为3×105至1×109PFU，肌肉内注射至三角肌一次，包括3×105PFU、3×106PFU、3×107PFU、3×108PFU和1×109PFU的剂量水平。
每个剂量水平招募6至12名可评价的健康成人。
安全性监测
注射后7天和随访时(第14天和第28天)可记录注射部位和全身反应原性和药物使用。每次研究访视期间都可以进行临床和实验室评价。实验室分析可包括全血细胞计数和肌酐、C-反应蛋白和肝功能的检验。列出每个参与者的不良事件。
免疫原性
可以通过测定参与者的血清样品来评估免疫原性。用来测定T细胞免疫原性的IFN-γ ELISPOT采用在基线时(接种前)和注射后28和180天收集的参与者血清样品进行。
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅通过示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在用所附权利要求限定本发明的范围，并因此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
<110> 英福瓦克思公司
<120> 流感疫苗
<130> 46690-708.601
<140>
<141>
<150> 62/550,167
<151> 2017-08-25
<150> 62/439,865
<151> 2016-12-28
<160> 118
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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Ser
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Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser
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Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu
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Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met
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Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala
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Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile Ala
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Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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Leu Val Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 50
Arg Trp Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 51
Tyr Ser His Trp Thr Gly Thr Gly Tyr
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 52
Tyr Ser His Gly Ser Gly Thr Gly Tyr
1 5
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 53
Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys
1 5 10 15
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 54
Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 55
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 55
Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Val Lys Phe Gln Thr
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 56
Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Lys Thr
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 57
Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 58
Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Tyr Pro Arg
1 5 10 15
Leu
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 59
Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Asp Gln Arg
1 5 10 15
Leu
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 60
Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 61
Lys Leu Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln
1 5 10 15
Ile
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 62
Lys Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln
1 5 10 15
Val
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 63
Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Phe Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys His Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 64
Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys Leu Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 65
Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys Pro Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 66
Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys His Arg
1 5 10 15
Val
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 67
Phe Gln Gly Pro Gly Val Phe Glu Leu
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 68
Ser Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 69
Gly Gln Val Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser
1 5 10
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 70
Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser
1 5 10
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 71
Gly Gln Asn Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser
1 5 10
<210> 72
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 72
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met
20 25
<210> 73
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 73
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met
20 25
<210> 74
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 74
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Lys Arg Ala Leu
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met
20 25
<210> 75
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 75
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ser Leu
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met
20 25
<210> 76
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 76
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Ile
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met
20 25
<210> 77
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 77
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu
1 5 10 15
Val Arg Ser Gly Met Asp Pro Arg Met
20 25
<210> 78
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 78
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Arg Asp Pro Arg Met
20 25
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 79
Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu
1 5
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 80
Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10
<210> 81
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 81
Gly Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Val Lys Arg Glu Leu
20 25 30
Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Arg Val Lys Arg
35 40 45
Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Arg Val Lys Arg Thr Tyr Asn
50 55 60
Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu
65 70
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Glu Leu Arg Ser Arg His Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly
1 5 10
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 83
Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ser Arg Thr Arg Ser Gly
1 5 10
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Phe Met Phe Ser Asp Phe His Phe Ile
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 85
Val Leu Arg Gly Ser Ile Ala His Lys
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 86
Leu Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu
1 5
<210> 87
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 87
Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 89
Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Lys Thr
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 91
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 91
Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr
1 5 10 15
Ala Val
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Lys Trp Gly Met Glu Leu Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln
1 5 10 15
Ile
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 93
Ser Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 94
Gly Gln Val Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser
1 5 10
<210> 95
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 95
Leu Glu Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Pro Arg Ser Phe Thr Ser Cys
1 5 10 15
Gly Ser Leu Glu
20
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 96
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys
1 5 10
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 97
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 98
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 99
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 99
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 100
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 101
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 101
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> L-环己基丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 氨基己酸
<400> 102
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Xaa Cys
1 5 10 15
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 103
Gly Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser
1 5 10 15
Lys
<210> 104
<211> 36519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 104
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480
atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540
tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagatga ggcacctgag agacctgccc 600
gatgagaaaa tcatcatcgc ttccgggaac gagattctgg aactggtggt aaatgccatg 660
atgggcgacg accctccgga gccccccacc ccatttgaga caccttcgct gcacgatttg 720
tatgatctgg aggtggatgt gcccgaggac gatcccaatg aggaggcggt aaatgatttt 780
tttagcgatg ccgcgctgct agctgccgag gaggcttcga gctctagctc agacagcgac 840
tcttcactgc atacccctag acccggcaga ggtgagaaaa agatccccga gcttaaaggg 900
gaagagatgg acttgcgctg ctatgaggaa tgcttgcccc cgagcgatga tgaggacgag 960
caggcgatcc agaacgcagc gagccaggga gtgcaagccg ccagcgagag ctttgcgctg 1020
gactgcccgc ctctgcccgg acacggctgt aagtcttgtg aatttcatcg catgaatact 1080
ggagataaag ctgtgttgtg tgcactttgc tatatgagag cttacaacca ttgtgtttac 1140
agtaagtgtg attaagttga actttagagg gaggcagaga gcagggtgac tgggcgatga 1200
ctggtttatt tatgtatata tgttctttat ataggtcccg tctctgacgc agatgatgag 1260
acccccacta caaagtccac ttcgtcaccc ccagaaattg gcacatctcc acctgagaat 1320
attgttagac cagttcctgt tagagccact gggaggagag cagctgtgga atgtttggat 1380
gacttgctac agggtggggt tgaacctttg gacttgtgta cccggaaacg ccccaggcac 1440
taagtgccac acatgtgtgt ttacttgagg tgatgtcagt atttataggg tgtggagtgc 1500
aataaaaaat gtgttgactt taagtgcgtg gtttatgact caggggtggg gactgtgagt 1560
atataagcag gtgcagacct gtgtggttag ctcagagcgg catggagatt tggacggtct 1620
tggaagactt tcacaagact agacagctgc tagagaacgc ctcgaacgga gtctcttacc 1680
tgtggagatt ctgcttcggt ggcgacctag ctaggctagt ctacagggcc aaacaggatt 1740
atagtgaaca atttgaggtt attttgagag agtgttctgg tctttttgac gctcttaact 1800
tgggccatca gtctcacttt aaccagagga tttcgagagc ccttgatttt actactcctg 1860
gcagaaccac tgcagcagta gccttttttg cttttattct tgacaaatgg agtcaagaaa 1920
cccatttcag cagggattac cagctggatt tcttagcagt agctttgtgg agaacatgga 1980
agtgccagcg cctgaatgca atctccggct acttgccggt acagccgcta gacactctga 2040
ggatcctgaa tctccaggag agtcccaggg cacgccaacg tcgccagcag cagcagcagg 2100
aggaggatca agaagagaac ccgagagccg gcctggaccc tccggcggag gaggaggagt 2160
agctgacctg tttcctgaac tgcgccgggt gctgactagg tcttcgagtg gtcgggagag 2220
ggggattaag cgggagaggc atgatgagac taatcacaga actgaactga ctgtgggtct 2280
gatgagtcgc aagcgcccag aaacagtgtg gtggcatgag gtgcagtcga ctggcacaga 2340
tgaggtgtcg gtgatgcatg agaggttttc tctagaacaa gtcaagactt gttggttaga 2400
gcctgaggat gattgggagg tagccatcag gaattatgcc aagctggctc tgaggccaga 2460
caagaagtac aagattacta agctgataaa tatcagaaat gcctgctaca tctcagggaa 2520
tggggctgaa gtggagatct gtctccagga aagggtggct ttcagatgct gcatgatgaa 2580
tatgtacccg ggagtggtgg gcatggatgg ggttaccttt atgaacatga ggttcagggg 2640
agatgggtat aatggcacgg tctttatggc caataccaag ctgacagtcc atggctgctc 2700
cttctttggg tttaataaca cctgcatcga ggcctggggt caggtcggtg tgaggggctg 2760
cagtttttca gccaactgga tgggggtcgt gggcaggacc aagagtatgc tgtccgtgaa 2820
gaaatgcttg tttgagaggt gccacctggg ggtgatgagc gagggcgaag ccagaatccg 2880
ccactgcgcc tctaccgaga cgggctgctt tgtgctgtgc aagggcaatg ctaagatcaa 2940
gcataatatg atctgtggag cctcggacga gcgcggctac cagatgctga cctgcgccgg 3000
cgggaacagc catatgctgg ccaccgtaca tgtggcttcc catgctcgca agccctggcc 3060
cgagttcgag cacaatgtca tgaccaggtg caatatgcat ctggggtccc gccgaggcat 3120
gttcatgccc taccagtgca acctgaatta tgtgaaggtg ctgctggagc ccgatgccat 3180
gtccagagtg agcctgacgg gggtgtttga catgaatgtg gaggtgtgga agattctgag 3240
atatgatgaa tccaagacca ggtgccgagc ctgcgagtgc ggagggaagc atgccaggtt 3300
ccagcccgtg tgtgtggatg tgacggagga cctgcgaccc gatcatttgg tgttgccctg 3360
caccgggacg gagttcggtt ccagcgggga agaatctgac tagagtgagt agtgttctgg 3420
ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat ctgtgctttt ctgtgtgttg 3480
cagcagcatg agcggaagcg gctcctttga gggaggggta ttcagccctt atctgacggg 3540
gcgtctcccc tcctgggcgg gagtgcgtca gaatgtgatg ggatccacgg tggacggccg 3600
gcccgtgcag cccgcgaact cttcaaccct gacctatgca accctgagct cttcgtcgtt 3660
ggacgcagct gccgccgcag ctgctgcatc tgccgccagc gccgtgcgcg gaatggccat 3720
gggcgccggc tactacggca ctctggtggc caactcgagt tccaccaata atcccgccag 3780
cctgaacgag gagaagctgt tgctgctgat ggcccagctc gaggccttga cccagcgcct 3840
gggcgagctg acccagcagg tggctcagct gcaggagcag acgcgggccg cggttgccac 3900
ggtgaaatcc aaataaaaaa tgaatcaata aataaacgga gacggttgtt gattttaaca 3960
cagagtctga atctttattt gatttttcgc gcgcggtagg ccctggacca ccggtctcga 4020
tcattgagca cccggtggat cttttccagg acccggtaga ggtgggcttg gatgttgagg 4080
tacatgggca tgagcccgtc ccgggggtgg aggtagctcc attgcagggc ctcgtgctcg 4140
ggggtggtgt tgtaaatcac ccagtcatag caggggcgca gggcatggtg ttgcacaata 4200
tctttgagga ggagactgat ggccacgggc agccctttgg tgtaggtgtt tacaaatctg 4260
ttgagctggg agggatgcat gcggggggag atgaggtgca tcttggcctg gatcttgaga 4320
ttggcgatgt taccgcccag atcccgcctg gggttcatgt tgtgcaggac caccagcacg 4380
gtgtatccgg tgcacttggg gaatttatca tgcaacttgg aagggaaggc gtgaaagaat 4440
ttggcgacgc ctttgtgccc gcccaggttt tccatgcact catccatgat gatggcgatg 4500
ggcccgtggg cggcggcctg ggcaaagacg tttcgggggt cggacacatc atagttgtgg 4560
tcctgggtga ggtcatcata ggccatttta atgaatttgg ggcggagggt gccggactgg 4620
gggacaaagg taccctcgat cccgggggcg tagttcccct cacagatctg catctcccag 4680
gctttgagct cggagggggg gatcatgtcc acctgcgggg cgataaagaa cacggtttcc 4740
ggggcggggg agatgagctg ggccgaaagc aagttccgga gcagctggga cttgccgcag 4800
ccggtggggc cgtagatgac cccgatgacc ggctgcaggt ggtagttgag ggagagacag 4860
ctgccgtcct cccggaggag gggggccacc tcgttcatca tctcgcgcac gtgcatgttc 4920
tcgcgcacca gttccgccag gaggcgctct ccccccaggg ataggagctc ctggagcgag 4980
gcgaagtttt tcagcggctt gagtccgtcg gccatgggca ttttggagag ggtttgttgc 5040
aagagttcca ggcggtccca gagctcggtg atgtgctcta cggcatctcg atccagcaga 5100
cctcctcgtt tcgcgggttg ggacggctgc gggagtaggg caccagacga tgggcgtcca 5160
gcgcagccag ggtccggtcc ttccagggtc gcagcgtccg cgtcagggtg gtctccgtca 5220
cggtgaaggg gtgcgcgccg ggctgggcgc ttgcgagggt gcgcttcagg ctcatccggc 5280
tggtcgaaaa ccgctcccga tcggcgccct gcgcgtcggc caggtagcaa ttgaccatga 5340
gttcgtagtt gagcgcctcg gccgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagtct 5400
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aggtgaggtc gggctggtcg gggtcaaaaa ccagtttccc gccgttcttt ttgatgcgtt 5580
tcttaccttt ggtctccatg agctcgtgtc cccgctgggt gacaaagagg ctgtccgtgt 5640
ccccgtagac cgactttatg ggccggtcct cgagcggtgt gccgcggtcc tcctcgtaga 5700
ggaaccccgc ccactccgag acgaaagccc gggtccaggc cagcacgaag gaggccacgt 5760
gggacgggta gcggtcgttg tccaccagcg ggtccacctt ttccagggta tgcaaacaca 5820
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cctcggcact caggttgtca gtttctagaa acgaggagga tttgatattg acggtgccgg 6060
cggagatgcc tttcaagagc ccctcgtcca tctggtcaga aaagacgatc tttttgttgt 6120
cgagcttggt ggcgaaggag ccgtagaggg cgttggagag gagcttggcg atggagcgca 6180
tggtctggtt tttttccttg tcggcgcgct ccttggcggc gatgttgagc tgcacgtact 6240
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cctgccagcc ccgattatgc agggtgatga ggtccacact ggtggccacc tcgccgcgca 6360
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ccagcatgac ctcgtcgggg gggtcggcat cgatggtgaa gatgccgggc aggaggtcgg 6480
ggtcaaagta gctgatggaa gtggccagat cgtccagggc agcttgccat tcgcgcacgg 6540
ccagcgcgcg ctcgtaggga ctgaggggcg tgccccaggg catgggatgg gtaagcgcgg 6600
aggcgtacat gccgcagatg tcgtagacgt agaggggctc ctcgaggatg ccgatgtagg 6660
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cgagctcggc ggtgactagg acgtccagag cgcagtagtc gagggtctcc tggatgatgt 6960
catacttgag ctgtcccttt tgtttccaca gctcgcggtt gagaaggaac tcttcgcggt 7020
ccttccagta ctcttcgagg gggaacccgt cctgatctgc acggtaagag cctagcatgt 7080
agaactggtt gacggccttg taggcgcagc agcccttctc cacggggagg gcgtaggcct 7140
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ggaactggtg cttgaagtcg atatcgtcgc agcccccctg ctcccagagc tggaagtccg 7260
tgcgcttctt gtaggcgggg ttgggcaaag cgaaagtaac atcgttgaag aggatcttgc 7320
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tgatgacctg ggcggcgagc acgatctcgt cgaagccgtt gatgttgtgg cccacgatgt 7440
agagttccac gaatcgcgga cggcccttga cgtggggcag tttcttgagc tcctcgtagg 7500
tgagctcgtc ggggtcgctg agcccgtgct gctcgagcgc ccagtcggcg agatgggggt 7560
tggcgcggag gaaggaagtc cagagatcca cggccagggc ggtttgcaga cggtcccggt 7620
actgacggaa ctgctgcccg acggccattt tttcgggggt gacgcagtag aaggtgcggg 7680
ggtccccgtg ccagcgatcc catttgagct ggagggcgag atcgagggcg agctcgacga 7740
gccggtcgtc cccggagagt ttcatgacca gcatgaaggg gacgagctgc ttgccgaagg 7800
accccatcca ggtgtaggtt tccacatcgt aggtgaggaa gagcctttcg gtgcgaggat 7860
gcgagccgat ggggaagaac tggatctcct gccaccaatt ggaggaatgg ctgttgatgt 7920
gatggaagta gaaatgccga cggcgcgccg aacactcgtg cttgtgttta tacaagcggc 7980
cacagtgctc gcaacgctgc acgggatgca cgtgctgcac gagctgtacc tgagttcctt 8040
tgacgaggaa tttcagtggg aagtggagtc gtggcgcctg catctcgtgc tgtactacgt 8100
cgtggtggtc ggcctggccc tcttctgcct cgatggtggt catgctgacg agcccgcgcg 8160
ggaggcaggt ccagacctcg gcgcgagcgg gtcggagagc gaggacgagg gcgcgcaggc 8220
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ggttgacttg caggagtttt tccagggcgc gcgggaggtc cagatggtac ttgatctcca 8340
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ccgtcccccg tttcttcttg ggcggctggg gcgacggggg cggtgcctct tccatggtta 8460
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cggcaggggc acgtcggcgc cgcgcgcggg taggttctgg tactgcgccc ggagaagact 8580
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catgaactgc tcgatctcct cctcttgaag gtctccgcgg ccggcgcgct ccacggtggc 8820
cgcgaggtcg ttggagatgc ggcccatgag ctgcgagaag gcgttcatgc ccgcctcgtt 8880
ccagacgcgg ctgtagacca cgacgccctc gggatcgccg gcgcgcatga ccacctgggc 8940
gaggttgagc tccacgtggc gcgtgaagac cgcgtagttg cagaggcgct ggtagaggta 9000
gttgagcgtg gtggcgatgt gctcggtgac gaagaaatac atgatccagc ggcggagcgg 9060
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gggagggggc ctgcgtcgcc ggcggcgcac gggcagacgg tcgatgaagc gctcgatggt 9360
ctcgccgcgc cggcgtcgca tggtctcggt gacggcgcgc ccgtcctcgc ggggccgcag 9420
cgtgaagacg ccgccgcgca tctccaggtg gccggggggg tccccgttgg gcagggagag 9480
ggcgctgacg atgcatctta tcaattgccc cgtagggact ccgcgcaagg acctgagcgt 9540
ctcgagatcc acgggatctg aaaaccgctg aacgaaggct tcgagccagt cgcagtcgca 9600
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gctgctggtg atgaagttga aataggcggt tctgagacgg cggatggtgg cgaggagcac 9720
caggtctttg ggcccggctt gctggatgcg cagacggtcg gccatgcccc aggcgtggtc 9780
ctgacacctg gccaggtcct tgtagtagtc ctgcatgagc cgctccacgg gcacctcctc 9840
ctcgcccgcg cggccgtgca tgcgcgtgag cccgaagccg cgctggggct ggacgagcgc 9900
caggtcggcg acgacgcgct cggcgaggat ggcttgctgg atctgggtga gggtggtctg 9960
gaagtcatca aagtcgacga agcggtggta ggctccggtg ttgatggtgt aggagcagtt 10020
ggccatgacg gaccagttga cggtctggtg gcccggacgc acgagctcgt ggtacttgag 10080
gcgcgagtag gcgcgcgtgt cgaagatgta gtcgttgcag gtgcgcacca ggtactggta 10140
gccgatgagg aagtgcggcg gcggctggcg gtagagcggc catcgctcgg tggcgggggc 10200
gccgggcgcg aggtcctcga gcatggtgcg gtggtagccg tagatgtacc tggacatcca 10260
ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cgggaactcg cggacgcggt tccagatgtt 10320
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ttgcggtgtg ccccggttcg aggccggccg gattccgcgg ctaacgaggg cgtggctgcc 10740
ccgtcgtttc caagacccca tagccagccg acttctccag ttacggagcg agcccctctt 10800
ttgttttgtt tgtttttgcc agatgcatcc cgtactgcgg cagatgcgcc cccaccaccc 10860
tccaccgcaa caacagcccc ctccacagcc ggcgcttctg cccccgcccc agcagcaact 10920
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cctgatcgcg cgcgaggagg tgaccctggg cctgatgcac ctgtgggacc tgctggaggc 11400
catcgtgcag aaccccacca gcaagccgct gacggcgcag ctgttcctgg tggtgcagca 11460
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ctggctcctg gacctggtga acattctgca gagcatcgtg gtgcaggagc gcgggctgcc 11580
gctgtccgag aagctggcgg ccatcaactt ctcggtgctg agtttgggca agtactacgc 11640
taggaagatc tacaagaccc cgtacgtgcc catagacaag gaggtgaaga tcgacgggtt 11700
ttacatgcgc atgaccctga aagtgctgac cctgagcgac gatctggggg tgtaccgcaa 11760
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gatgcatagt ctgcagcggg ccctgaccgg ggccgggacc gagggggaga gctactttga 11880
catgggcgcg gacctgcact ggcagcccag ccgccgggcc ttggaggcgg cggcaggacc 11940
ctacgtagaa gaggtggacg atgaggtgga cgaggagggc gagtacctgg aagactgatg 12000
gcgcgaccgt atttttgcta gatgcaacaa caacagccac ctcctgatcc cgcgatgcgg 12060
gcggcgctgc agagccagcc gtccggcatt aactcctcgg acgattggac ccaggccatg 12120
caacgcatca tggcgctgac gacccgcaac cccgaagcct ttagacagca gccccaggcc 12180
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aaggtcctgg ccatcgtgaa cgcgctggtg gagaacaagg ccatccgcgg cgacgaggcc 12300
ggcctggtgt acaacgcgct gctggagcgc gtggcccgct acaacagcac caacgtgcag 12360
accaacctgg accgcatggt gaccgacgtg cgcgaggccg tggcccagcg cgagcggttc 12420
caccgcgagt ccaacctggg atccatggtg gcgctgaacg ccttcctcag cacccagccc 12480
gccaacgtgc cccggggcca ggaggactac accaacttca tcagcgccct gcgcctgatg 12540
gtgaccgagg tgccccagag cgaggtgtac cagtccgggc cggactactt cttccagacc 12600
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gccatcggct cctagtcgaa gaccccggcg caagtacggc gcggccagcc tgctgatgcc 16920
caactacgcg ctgcatcctt ccatcatccc cacgccgggc taccgcggca cgcgcttcta 16980
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cgccgctgca accacccctg ccgccctggt gcggagagtg taccgccgcg gccgcgcacc 17100
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tgcagatcaa tggccctcac atgccgcctt cgcgttccca ttacgggcta ccgaggaaga 17220
aaaccgcgcc gtagaaggct ggcggggaac gggatgcgtc gccaccacca ccggcggcgg 17280
cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc 17340
gcggcgatcg gggcgatccc cggcattgct tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac 17400
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gcgaccccgc cccgatgcgg aggagacgct gctgacgcac acggacgagc cgcccccgta 17940
cgaggaggcg gtgaaactgg gtctgcccac cacgcggccc atcgcgcccc tggccaccgg 18000
ggtgctgaaa cccgaaaagc ccgcgaccct ggacttgcct cctccccagc cttcccgccc 18060
ctctacagtg gctaagcccc tgccgccggt ggccgtggcc cgcgcgcgac ccgggggcac 18120
cgcccgccct catgcgaact ggcagagcac tctgaacagc atcgtgggtc tgggagtgca 18180
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cgccgagttg caagatggcc accccatcga tgctgcccca gtgggcgtac atgcacatcg 18360
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catataaagc cgatggtgaa actgccacag aaaaaaccta tacatatgga aatgcacccg 18780
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caatctacgc agataaaacc tatcagcctg aacctcaagt gggtgatgct gaatggcatg 18900
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<211> 36604
<212> DNA
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<400> 105
catcatcaat aatatacctc aaacttttgg tgcgcgttaa tatgcaaatg agctgtttga 60
atttggggag ggaggaaggt gattggctgc gggagcggcg accgttaggg gcggggcggg 120
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gccagctgca ccacgctgcg cccccagcgg ttctgggtga tcttggcccg gttggggttc 22500
tccttcagcg cgcgctgccc gttctcgctc gccacatcca tctcgatagt gtgctccttc 22560
tggatcatca cggtcccgtg caggcaccgc agcttgccct cggcttcggt gcagccgtgc 22620
agccacagcg cgcagccggt gcactcccag ttcttgtggg cgatctggga gtgcgagtgc 22680
acgaagccct gcaggaagcg gcccatcatc gcggtcaggg tcttgttgct ggtgaaggtc 22740
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ccctgctcgg gcatcagctg gaaggcggac ttcaggtcgc tctccacgcg gtaccggtcc 22860
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gggttcttca ccgccattgt catcttagtc gccgccgccg aggtcagggg gtcgttctcg 22980
tccagggtct caaacactcg cttgccgtcc ttctcgatga tgcgcacggg gggaaagctg 23040
aagcccacgg ccgccagctc ctcctcggcc tgcctttcgt cctcgctgtc ctggctgatg 23100
tcttgcaaag gcacatgctt ggtcttgcgg ggtttctttt tgggcggcag aggcggcggc 23160
gatgtgctgg gagagcgcga gttctcgttc accacgacta tttcttcttc ttggccgtcg 23220
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cgctgctctg actgacttcc tccgcggccg gccattgtgt tctcctaggg agcaacaaca 23400
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gaggttccca agatcttcga gggtctgggc agcgacgaga ctcgggccgc gaacgctctg 24120
caaggaagcg gagaggagca tgagcaccac agcgccctgg tggagttgga aggcgacaac 24180
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cccctctcgg aggaggagat gcaggacccc gagagttcgg acgagggcaa gcccgtggtc 24360
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cacgggttcg tgcgccaggc ctgcaagatc tccaacgtgg agctgaccaa cctggtctcc 24600
tacatgggca tcctgcacga gaaccgcctg gggcaaaacg tgctgcacac caccctgcgc 24660
ggggaggccc gccgcgacta catccgcgac tgcgtctacc tgtacctctg ccacacctgg 24720
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cctgcacagg cagcgaagct cccgatccct ccagatacac atacaaagcc tcagcgtcca 36180
tagcttaccg agcggcagca gcagcggcac acaacaggcg caagagtcag agaaaagact 36240
gagctctaac ctgtccgccc gctctctgct caatatatag ccccagatct acactgacgt 36300
aaaggccaaa gtctaaaaat acccgccaaa taatcacaca cgcccagcac acgcccagaa 36360
accggtgaca cactcagaaa aatacgcgca cttcctcaaa cggccaaact gccgtcattt 36420
ccgggttccc acgctacgtc atcaaaacac gactttcaaa ttccgtcgac cgttaaaaac 36480
atcacccgcc ccgcccctaa cggtcgccgc tcccgcagcc aatcaccttc ctccctcccc 36540
aaattcaaac agctcatttg catattaacg cgcaccaaaa gtttgaggta tattattgat 36600
gatg 36604
<210> 106
<211> 948
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 106
Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Arg Val
1 5 10 15
Lys Arg Glu Leu Arg Ser Arg His Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly
20 25 30
Arg Val Lys Arg Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ser Arg Thr Arg
35 40 45
Ser Gly Arg Val Lys Arg Phe Met Tyr Ser Asp Phe His Phe Ile Arg
50 55 60
Val Lys Arg Phe Met Tyr Ser Asp Leu His Phe Ile Arg Val Lys Arg
65 70 75 80
Phe Met Tyr Thr Asp Phe His Phe Ile Arg Val Lys Arg Phe Met Phe
85 90 95
Ser Asp Phe His Phe Ile Arg Val Lys Arg Gly Thr Phe Glu Phe Thr
100 105 110
Ser Phe Phe Tyr Arg Val Lys Arg Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Tyr
115 120 125
Phe Tyr Arg Val Lys Arg Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Arg
130 135 140
Val Lys Arg Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Arg Val Lys Arg
145 150 155 160
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile Ala Arg Val Lys Arg Ile Leu Arg
165 170 175
Gly Ser Ile Ala His Lys Arg Val Lys Arg Ile Leu Arg Gly Ser Val
180 185 190
Ala His Lys Arg Val Lys Arg Val Leu Arg Gly Ser Ile Ala His Lys
195 200 205
Arg Val Lys Arg Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Arg Val Lys
210 215 220
Arg Leu Val Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Arg Val Lys Arg Leu Thr
225 230 235 240
Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Arg Val Lys Arg Tyr Ser His Gly Thr
245 250 255
Gly Thr Gly Tyr Arg Val Lys Arg Tyr Ser His Trp Thr Gly Thr Gly
260 265 270
Tyr Arg Val Lys Arg Tyr Ser His Gly Ser Gly Thr Gly Tyr Arg Val
275 280 285
Lys Arg Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala
290 295 300
His Lys Arg Val Lys Arg Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Gly Ser Val Ala His Lys Arg Val Lys Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met
325 330 335
Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Arg Val Lys Arg
340 345 350
Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr
355 360 365
Ala Ala Arg Val Lys Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Ile
370 375 380
Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Arg Val Lys Arg Val Ala Tyr Glu
385 390 395 400
Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Lys Thr Ala Ala Arg Val
405 410 415
Lys Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe
420 425 430
Gln Ile Ala Ala Arg Val Lys Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
435 440 445
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Val Arg Val Lys Arg Asp Val
450 455 460
Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Asp Pro Arg Leu Arg
465 470 475 480
Val Lys Arg Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr
485 490 495
Tyr Pro Arg Leu Arg Val Lys Arg Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met
500 505 510
Glu Phe Ser Leu Thr Asp Gln Arg Leu Arg Val Lys Arg Phe Leu Ala
515 520 525
Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys Ser Arg Val
530 535 540
Lys Arg Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala
545 550 555 560
His Lys Ser Arg Val Lys Arg Lys Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys
565 570 575
Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile Arg Val Lys Arg Lys Leu Gly Met
580 585 590
Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile Arg Val Lys
595 600 605
Arg Lys Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln
610 615 620
Gln Val Arg Val Lys Arg Lys Trp Gly Met Glu Leu Arg Arg Cys Leu
625 630 635 640
Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile Arg Val Lys Arg Phe Gln Gly Arg Gly
645 650 655
Val Phe Glu Leu Arg Val Lys Arg Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr
660 665 670
Phe Ser Arg Val Lys Arg Ser Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser
675 680 685
Arg Val Lys Arg Gly Gln Val Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Arg Val
690 695 700
Lys Arg Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Arg Val Lys Arg
705 710 715 720
Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu
725 730 735
Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser
740 745 750
Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr
755 760 765
Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu Asn
770 775 780
Asp Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
785 790 795 800
Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr
805 810 815
Tyr Gln Arg Lys Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met
820 825 830
Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg
835 840 845
Thr Arg Ser Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys
850 855 860
Arg Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala
865 870 875 880
Ile Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His
885 890 895
Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg
900 905 910
Ser Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu
915 920 925
Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Arg
930 935 940
Asp Pro Arg Met
945
<210> 107
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> 该序列可包含1-10个'Gly Gly Gly Gly Ser'重复单元
<400> 107
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 108
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(100)
<223> 该序列可包含1-20个'Glu Ala Ala Ala Lys'重复单元
<400> 108
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
50 55 60
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
85 90 95
Ala Ala Ala Lys
100
<210> 109
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> 该序列可包含1-20个'Xaa Pro'重复单元
<400> 109
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
1 5 10 15
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
20 25 30
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
35 40
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 110
Arg Val Lys Arg
1
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> S-[2,3-双(棕榈酰氧基)-(2-R,S)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸
<400> 111
Cys Ser Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸
<400> 112
Cys Ser Ser Asn Ala
1 5
<210> 113
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸
<400> 113
Cys Ser Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 二棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸
<400> 114
Cys Ser Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 115
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 115
Gly Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 116
<211> 560
<212> PRT
<213> 乙型流感病毒
<400> 116
Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile
20 25 30
Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn
35 40 45
Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Asp Asp Val Gly Arg
50 55 60
Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr
65 70 75 80
Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys
85 90 95
Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala His
100 105 110
Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu
115 120 125
Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu
130 135 140
Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp
145 150 155 160
Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser
180 185 190
Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys
195 200 205
Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu
210 215 220
Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Val Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg
245 250 255
Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys
260 265 270
Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys
275 280 285
Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg
290 295 300
Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser
305 310 315 320
Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile
325 330 335
Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr
340 345 350
Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro
355 360 365
Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu
370 375 380
Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu
385 390 395 400
Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys
405 410 415
Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala
420 425 430
Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser
435 440 445
Gly Gly Asn Glu Val Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys
450 455 460
Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala
465 470 475 480
Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val
485 490 495
Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr
500 505 510
Ser Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys
515 520 525
Asn Lys Thr Asn Pro Ile Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn
530 535 540
Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr
545 550 555 560
<210> 117
<211> 560
<212> PRT
<213> 乙型流感病毒
<400> 117
Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile
20 25 30
Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn
35 40 45
Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Ala Asp Val Gly Arg
50 55 60
Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr
65 70 75 80
Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys
85 90 95
Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala His
100 105 110
Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu
115 120 125
Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu
130 135 140
Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp
145 150 155 160
Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser
180 185 190
Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys
195 200 205
Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu
210 215 220
Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg
245 250 255
Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys
260 265 270
Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys
275 280 285
Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg
290 295 300
Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser
305 310 315 320
Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile
325 330 335
Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr
340 345 350
Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro
355 360 365
Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu
370 375 380
Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu
385 390 395 400
Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys
405 410 415
Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala
420 425 430
Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser
435 440 445
Gly Gly Asn Glu Val Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys
450 455 460
Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala
465 470 475 480
Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val
485 490 495
Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr
500 505 510
Asn Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys
515 520 525
Asn Lys Thr Asn Pro Val Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn
530 535 540
Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr
545 550 555 560
<210> 118
<211> 560
<212> PRT
<213> 乙型流感病毒
<400> 118
Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile
20 25 30
Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn
35 40 45
Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Asp Asp Val Gly Arg
50 55 60
Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr
65 70 75 80
Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys
85 90 95
Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala Tyr
100 105 110
Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu
115 120 125
Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu
130 135 140
Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp
145 150 155 160
Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser
180 185 190
Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys
195 200 205
Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu
210 215 220
Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Val Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg
245 250 255
Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys
260 265 270
Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys
275 280 285
Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg
290 295 300
Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser
305 310 315 320
Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile
325 330 335
Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr
340 345 350
Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro
355 360 365
Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu
370 375 380
Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu
385 390 395 400
Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys
405 410 415
Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala
420 425 430
Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser
435 440 445
Gly Gly Asn Glu Ala Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys
450 455 460
Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala
465 470 475 480
Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val
485 490 495
Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr
500 505 510
Ser Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys
515 520 525
Asn Lys Thr Asn Pro Ile Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn
530 535 540
Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr
545 550 555 560

Claims (53)

1.一种多肽，其包含选自SEQ ID NO：2、3、8、11、12、40、41、43、51、52、58、59、61、62、84和92的第一序列；和选自SEQ ID NO：17、20、21、22、24、26、29、30、32、33、34、44、45、49、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93和94的第二序列。
2.一种多肽，其包含选自SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、52、58、59、61、62、84和92的第一序列；和选自SEQ ID NO：17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、44、45、49、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93和94的第二序列。
3.一种多肽，其包含
a.与SEQ ID NO：8、11、12、40、41、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、43、44、45、49、51、52、53、60、70、73、74、75、76、77、78、82、83、85、86、87、88、89、90、91、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或
b.与SEQ ID NO：2或43的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、44、45、49、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或
c.与SEQ ID NO：21、22、24、26、30、32、49、53、60、70、85、86、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、8、11、12、40、41、43、51、52、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或
d.与SEQ ID NO：17、20、29、31、33、34、44、45、73、74、75、76、77、78、82、83、87、88、89、90或91的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或
e.与SEQ ID NO：2或43的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或
f.与SEQ ID NO：3、51或52的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93、94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或
g.与SEQ ID NO：2、8、11、12、40、41、43、58、59、61、62、84或92的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：21、22、24、26、30、32、49、53、60、70、85、86、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列；或
h.与SEQ ID NO：2、8、11、12、21、22、24、26、30、32、40、41、43、49、53、58、59、60、61、62、70、84、85、86、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第一序列，和与SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、43、44、45、49、51、52、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的至少8个连续氨基酸具有至少60％、至少75％、至少85％或100％序列同一性的第二序列，其中包含所述第一序列和所述第二不同序列的连续序列在PB1、PA或NP中未发现。
4.一种包含第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列的多肽，其中所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的每一个与选自SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94的不同序列具有至少75％的序列同一性，其中所述多肽不是天然存在的。
5.根据权利要求4所述的多肽，其中所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的至少一个与选自SEQ ID NO：17、20-22、24、26、29-34、44、45、49、53、60、70、72-78、82、83、85-91、93和94的序列具有至少75％的序列同一性。
6.根据权利要求4或5所述的多肽，其中所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的至少一个与选自SEQ ID NO：2、3、43、51和52的序列具有至少75％的序列同一性。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的多肽，其中所述第一序列、第二序列、第三序列、第四序列和第五序列中的至少一个与选自SEQ ID NO：8、11、12、40、41、58、59、61、62和92的序列具有至少75％的序列同一性。
8.根据上述权利要求中任一项所述的多肽，其进一步包含与乙型流感NP蛋白的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。
9.根据上述权利要求中任一项所述的多肽，其进一步包含与SEQ ID NO：116、117或118的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。
10.根据上述权利要求中任一项所述的多肽，其中每个序列的长度为至多10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
11.根据上述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述第一序列和第二序列是直接连接的。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中所述第一序列和所述第二序列通过连接体连接。
13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述连接体包含多个甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸或赖氨酸。
14.根据权利要求12所述的多肽，其中所述连接体包含序列RVKR(SEQ ID NO：110)。
15.根据上述权利要求中任一项所述的多肽，其进一步包含序列GALNNRFQIKGVELKSK(SEQ ID NO：103)。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中SEQ ID NO：103连接至所述多肽的氨基末端部分。
17.根据上述权利要求中任一项所述的多肽，其包含SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20、21、22、24、26、29、30、31、32、33、34、40、41、43、44、45、49、51、52、53、58、59、60、61、62、70、73、74、75、76、77、78、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93和94。
18.根据上述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是分离的多肽。
19.一种组合物，其包含根据权利要求1-18中任一项所述的多肽。
20.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-18中任一项所述的多肽。
21.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是分离的。
22.一种组合物，其包含根据权利要求20或21所述的多核苷酸。
23.一种载体，其包含根据权利要求20或21所述的多核苷酸。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体是非人灵长类动物载体。
25.根据权利要求23或24所述的载体，其中所述载体是腺病毒载体。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的载体，其中所述载体是黑猩猩腺病毒载体。
27.根据权利要求26所述的载体，其中所述黑猩猩腺病毒载体与C68(AdC68)(SEQ IDNO：104)、C7(AdC7)、C6(AdC6)(SEQ ID NO：105)、Pan7或Pan9的序列的至少50％具有至少50％的序列同一性。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的载体，其中所述载体是分离的。
29.一种组合物，其包含根据权利要求23-28中任一项所述的载体。
30.一种病毒，其包含根据权利要求20-21中任一项所述的多核苷酸。
31.一种病毒，其包含根据权利要求23-28中任一项所述的载体。
32.根据权利要求30或31所述的病毒，其中所述病毒是分离的。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的病毒，其中所述病毒是腺病毒。
34.一种组合物，其包含根据权利要求30-33中任一项所述的病毒。
35.一种包含至少五种不同肽的组合物，其中所述至少五种不同肽中的每一种包含以下序列、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：与选自SEQ ID NO：2、3、8、11、12、17、20-22、24、26、29-34、40、41、43-45、49、51-53、58-62、70、73-78和82-94的序列具有至少75％序列同一性的序列。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中每种肽的长度为至多10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
37.根据权利要求35或36所述的组合物，其进一步包含肽，所述肽包含与乙型流感NP蛋白的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的组合物，其进一步包含肽，所述肽包含与SEQID NO：116、117或118的氨基酸序列的至少10％具有至少50％序列同一性的序列。
39.根据权利要求19、22、29、34或35-38中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述组合物被配制用于皮下、鼻内或肌肉内施用。
41.一种方法，其包括向受试者施用根据权利要求19、22、29、34或35-40中任一项所述的组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述施用是皮下施用。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述施用是鼻内施用。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述施用是肌肉内施用。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其进一步包括第二次向所述受试者施用所述组合物。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中在所述施用后诱导免疫应答。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述免疫应答是全身性免疫应答。
48.根据权利要求41-47中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者感染有病毒。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述组合物在施用时在所述受试者中诱导针对甲型流感病毒株的一个或多个亚型的交叉保护。
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