JP2024503698A - 変異型株ベースのコロナウイルスワクチン - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つ以上の変異型株に対するワクチンを含むコロナウイルスｍＲＮＡワクチン、及びワクチンの使用方法を提供する。

Description

本出願は、２０２１年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１３８，２２８号、２０２１年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／１４０，９２１号、２０２１年３月１５日出願、米国仮特許出願第６３／１６１，４３９号、２０２１年４月１２日出願、米国仮特許出願第６３／１７３，９７２号、２０２１年５月２６日出願、米国仮特許出願第６３／１９３，５５８号、２０２１年７月１６日出願、米国仮特許出願第６３／２２２，９３０号、２０２１年９月８日出願、米国仮特許出願第６３／２４１，９４４号、２０２１年１１月２９日出願、米国仮特許出願第６３／２８３，７９５号、及び２０２１年１１月３０日出願、米国仮特許出願第６３／２８４，５６５号（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対して米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張する。
ヒトコロナウイルスは、コロナウイルス科の伝染性の高いエンベロープを持ったプラス鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルス科の２つの亜科は、ヒトの疾患を引き起こすことが公知である。最も重要なのはβ－コロナウイルス（ベータコロナウイルス）である。いくつかの以前に公知のβ－コロナウイルスは、軽度から中等度の上気道感染症の一般的な病因である。しかし、近年、ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳなど、より致死性の高いコロナウイルスの発生が相次いでいる。最新の新型コロナウイルスは、２０１９年１２月に中国の武漢市で最初に確認され、高い死亡率と関連していた。この最近同定されたコロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と呼ばれ（元は「２０１９新型コロナウイルス」または「２０１９－ｎＣｏＶ」と呼ばれていた）、数百万人に急速に感染し、世界的なパンデミックを引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが引き起こすパンデミック疾患は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってＣＯＶＩＤ－１９（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９）と名付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株（武漢－Ｈｕ－１；ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株）の最初のゲノム配列は、２０２０年１月１０日に、北京の中国ＣＤＣから、ウイルス分子の進化及び疫学の分析及び解釈のための英国を拠点とするディスカッションフォーラムであるＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌで研究者によってリリースされた。その後、この配列は２０２０年１月１２日にＧｅｎＢａｎｋに寄託され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＮ９０８９４７．１が付けられた。その後、多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の変異型が特定され、その一部はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株よりも感染力が強い。
認可されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸ベースのワクチンの世界的な緊急使用認可の時点では、最近発見された、または今後出現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の懸念される変異株（ＶＯＣ）に対抗するための戦略はまだない。コロナウイルス感染症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックに関連する継続的な健康問題及び死亡率は、国際的に脅威となる懸念事項である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその変異型によって引き起こされた公衆衛生危機によって、これらのウイルスに対する効果的で安全なワクチン候補を迅速に開発することの重要性が強調される。
ウイルスのＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）が置換されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型の出現は、科学者及び保健当局の間で懸念を引き起こしている。コロナウイルスの宿主細胞への侵入は、ウイルスのＳタンパク質のＲＢＤと宿主のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の間の相互作用によって媒介される。ワクチン開発は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のこの領域に対する抗体応答を誘導することに焦点を当ててきた。最近では、中和「スーパーサイト」も ＮＴＤ で確認された。ワクチン有効性の有意な低下は、Ｓタンパク質のＲＢＤ（例えば、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙ）及びＮＴＤ（例えば、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、及びΔ２４２－２４４）のアミノ酸置換と相関している。これらの置換を含む最近流行している分離株の一部、英国（Ｂ．１．１．７、アルファ）、南アフリカ共和国（Ｂ．１．３５１、ベータ）、ブラジル（Ｐ．１系統、ガンマ）、ニューヨーク（Ｂ．１．５２６、イオタ）、及びカリフォルニア（Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９またはＣＡＬ．２０Ｃ系統、イプシロン）は、疑似ウイルス中和（ＰｓＶＮ）アッセイにおける回復期血清からの中和の減少、及び特定のモノクローナル抗体に対する耐性を示した。特に、ＮＴＤサブドメイン、特に中和スーパーサイトの変異は、Ｂ．１．３５１系統ウイルスで最も広範囲に発生している。ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｓｉｔｅ ｏｆ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２． Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２１．０３．０２８（２０２１）を参照のこと。
２０Ｅ（ＥＵ１）、２０Ａ．ＥＵ２、Ｄ６１４Ｇ－Ｎ４３９Ｋ、ミンククラスター５、Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．１．７＋Ｅ４８４Ｋ、及びＢ．１．３５１のＳ変異型を発現する２つの直交水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びレンチウイルスＰｓＶＮアッセイを使用して、第１相参加者及びｍＲＮＡ－１２７３を２回投与された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）由来の血清の中和能力の評価を報告した。Ｗｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｒｕｍ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｍＲＮＡ－１２７３ Ｖａｃｃｉｎｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｃ２１０２１７９（２０２１）を参照のこと。その後の研究では、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチン接種後の完全なＢ．１．３５１変異型に対する中和力価の低下が実証されたが、レベルは依然として有意であり、防御効果が期待される。この主要な懸念される変異株に対するｍＲＮＡ－１２７３の継続的な有効性の予測にもかかわらず、ワクチンを介した防御の持続期間はまだ不明である。
Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ａ６７Ｖ、Δ６９－７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ／Δ１４３－１４５、Δ２１１／Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ、及びそれらの任意の組み合わせなどの変異型に存在する重要な変異を組み込んだＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の融合前安定化Ｓタンパク質をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型に対するさらなるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの開発及び評価の必要性が依然としてある。追加のワクチンは、現在も世界中で流行している祖先の野生型ウイルスだけでなく、複数の流行している変異型にも適用範囲を拡大するために必要である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン、ｍＲＮＡ－１２７３（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが開発）は、第１相試験のヒト参加者において高いウイルス中和力価を誘発することが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２０２０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２０２０）、症候性のＣＯＶＩＤ－１９疾患及び重篤な疾患の予防において非常に有効である（Ｂａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。しかし、英国（Ｂ．１．１．７系統；アルファ変異型）及び南アフリカ（Ｂ．１．３５１系統、ベータ変異型）で最近ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型が出現し、感染率の上昇ならびに自然感染またはワクチン接種によって誘発される免疫を回避する可能性に起因して懸念が生じている（Ｖｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｔｅｇａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｗｉｂｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｃｏｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
２０２０年９月に南イングランドで初めて検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７変異型（アルファ変異型）は急速に広がり、伝播の増大及びウイルス負荷の増大に関連している（Ｒａｍｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。この変異型にはウイルスゲノムに１７個の変異がある。このうち、６９－７０ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈを含む、８つの変異がスパイク（Ｓ）タンパク質にある。この変異型のうち２つの重要な特徴、Ｓタンパク質の６９－７０欠失及びＮ５０１Ｙ変異は、英国の科学者及び政策立案者の間で、感染の増大及び潜在的な死亡率の増大に基づいて懸念を引き起こし、さらなるシャットダウンにつながる。６９－７０の欠失は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヒト回復期血清サンプルによる中和に対する感受性の低下と関連している（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ，２０２１）。Ｎ５０１は、ＡＣＥ－２受容体と相互作用する６つの重要なアミノ酸の１つであり（Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．２０２０）、チロシン置換によりＡＣＥ－２受容体に対する結合親和性が増大することが示されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
Ｂ．１．３５１変異型（ベータ変異型）は、過去数か月にわたって南アフリカで出現し、Ｂ．１．１．７変異型と同様に、感染率の増大及び感染後のウイルス量の増大が報告されている（Ｔｅｇａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０年）。Ｓタンパク質に存在する変異は、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、及びＡ７０１Ｖの変更を伴う Ｂ．１．１．７変異型より広範囲であり、これらの変異のうち３つはＲＢＤに位置している（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）。Ｂ．１．３５１は、ブラジルで報告された変異型と、ＲＢＤにおける重要な変異を共有している（Ｔｅｇａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｎａｖｅｃａ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。ＲＢＤは中和抗体の主な標的であるため、これらの変異は、すでに承認され開発が進んでいるモノクローナル抗体、及びウイルス中和における感染またはワクチン接種によって誘発されるポリクローナル抗体の有効性に影響し得る（Ｇｒｅａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｗｉｂｍｅｒ ｅｔ ａｌ，２０２１）。
最近のデータは、Ｂ．１．３５１変異型であるＥ４８４Ｋに存在する重要な変異がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に対する耐性を与え、モノクローナル抗体療法の治療効果を制限する可能性があることを示唆している （Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｇｒｅａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｗｅｉｓｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｗｉｂｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。さらに、Ｅ４８４Ｋ変異は、回復期血清のパネルに対する中和を減少させることが示された（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｗｉｂｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。ワクチン接種に関しては、ｍＲＮＡ－１２７３がＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株に対して回復期血清よりも有意に高い中和力価を誘導することは明らかである（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２０２０）。組換えＶＳＶ ＰｓＶＮアッセイを用いた最近の研究では、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチン接種参加者の血清は、Ｅ４８４ＫまたはＫ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０Ｙの組み合わせに対する中和力価が低下していることが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０２１）が、Ｂ．１．１．７またはＢ．１．３５１変異型で見つかったＳ変異の完全なコンステレーションに対するｍＲＮＡ－１２７３の臨床試験参加者由来の血清の評価は行われていない。
ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株、Ｄ６１４Ｇ変異型、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１変異型、及び以前に出現した変異型（２０Ｅ、２０Ａ．ＥＵ２、Ｄ６１４Ｇ－Ｎ４３９Ｋ、及びミンククラスター５変異型）由来のＳタンパク質を用いた、組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰｓＶＮアッセイに対するｍＲＮＡ－１２７３ワクチン接種を受けた第１相臨床試験参加者由来の血清の中和を調べた（データは実施例で考察する）。Ｓタンパク質のＲＢＤ領域に存在する単一の変異と変異の組み合わせとの両方の影響を評価した。さらに、ＶＳＶ及び偽型レンチウイルス中和アッセイにおける直交評価を、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンを２つの異なる用量レベルで投与したＮＨＰからの血清に対して実施した。これは、この評価がワクチン誘導性の免疫原性及び防御の有用な前臨床モデルであるためである。これらのアッセイの両方を使用すると、疑似ウイルスの中和に関する確認データが得られた。全体として、ｍＲＮＡ－１２７３を投与されたヒト及び非ヒト霊長類におけるこの包括的な疑似ウイルス中和分析によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型がワクチンにどのような影響を与える可能性があるかを解明するために必要な重要な実証が得られる。
本発明は、とりわけ、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原からの少なくとも１つのアミノ酸変異によって異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むワクチンに関し、ここでこの変異とは、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、変異が挿入である場合、それは２Ｐ変異ではないか、または２Ｐ変異に加えられるものである。このようなワクチン（本明細書では任意選択で変異型ワクチンとも称する）は、血清陽性または血清陰性の対象に投与してもよい。例えば、対象者はナイーブでかつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応する抗体を持っていない場合もあるし、または、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがあるか、または以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を誘導するワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）の用量を投与されたことがあるせいで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する既存の抗体を持っている場合がある。変異型ワクチンは、対象が接種するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含む唯一のワクチンである場合がある。あるいは、変異型ワクチンは、プライム及び／またはブースト用量として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含む他のワクチンと組み合わせて投与され得る。
したがって、本開示は、いくつかの態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で第２の流行のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含むワクチン、例えばその有効用量を対象に投与することを含む方法を提供し、ここでこの対象は、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む１回目のワクチンを以前に投与されており、かつ第１及び第２の２Ｐ安定化スパイク抗原の各々は、この第１の抗原及び第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、ここで、この第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質のアミノ酸配列に関して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質を有し、この変異とはアミノ酸の置換、欠失、または挿入である。
いくつかの態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む１回目のワクチン、例えばその有効量を対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２Ｐスパイク抗原、任意選択で２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを対象に投与することとを含む方法を提供し、ここでこの第１及び第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸のそれぞれが、それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、ここでこの第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原は、第１のコードされたスパイクタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、この変異とはアミノ酸置換、欠失、または挿入である。
別の態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む１回目のワクチン、例えばその有効量を対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２Ｐスパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを対象に投与することとを含む方法を提供し、ここでこの第１及び第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸のそれぞれが、それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、ここでこの第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原は、第１のコードされたスパイクタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、この変異とはアミノ酸置換、欠失、または挿入であり、ここでこの第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原は、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原であり、この第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原は、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイク抗原である。
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型抗原などのコロナウイルス抗原に対して強力な中和抗体応答を誘発し得る高度に免疫原性の抗原（複数可）をコードする１つ以上のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子を含む組成物（例えば、ワクチン）である。
本開示は、いくつかの態様において、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸（例えば、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ））を提供し、ここで、この抗原は、第１の流行するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株の抗原に関する少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、この変異とはアミノ酸の置換、欠失または挿入であり、この抗原は２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではなく、このｍＲＮＡとは脂質ナノ粒子内にある。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のウイルス株は、１年のうちの少なくともある期間、流行している。いくつかの実施形態では、第１及び第２のウイルス株は、同じパンデミックまたは流行期の間に流行中にある。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株の抗原に対して第２のアミノ酸の変異、欠失、またはアミノ酸の変異と欠失との両方を有し、この第２の変異または欠失は、流行中の第３のウイルス株に相当する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＲＢＤとＮＴＤの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＲＢＤ及びＮＴＤと、リンカーによって結合された膜貫通ドメインとの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、リンカーによって連結されたＮＴＤ、ＲＢＤ、及びインフルエンザ赤血球凝集素膜貫通（ＨＡＴＭ）ドメイン（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＮＴＤ－ＲＢＤ融合体である。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、Ｓ１タンパク質サブユニットである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、Ｓ１タンパク質サブユニットである。
いくつかの実施形態では、抗原におけるアミノ酸の変異、欠失、またはアミノ酸変異と欠失との両方は、第１のウイルスにおける対応する構造または機能とは量または種類が異なるウイルスの構造または機能と関連している。いくつかの実施形態では、この機能は、ＡＣＥ２受容体結合、ウイルス伝播性、ウイルス取り込み、ウイルス病因、フリン切断の変化、またはウイルス複製である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、５７、６０、及び６３のいずれか１つのタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のｍＲＮＡとを含む組成物を提供し、ここでこの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の変異、欠失、またはアミノ酸変異と欠失との両方を有するアミノ酸配列を有し、ここでこの第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない。
いくつかの実施形態では、組成物は、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするサードメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に関して、少なくとも１つのアミノ酸の変異、欠失、またはアミノ酸変異及び欠失の両方を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする、第４のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含み、ここでこの第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、この第１、第２及び第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸の変異、欠失またはアミノ酸の変異と欠失との両方を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする、第５のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含み、ここでこの第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、この第１、第２、第３及び第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸の変異、欠失またはアミノ酸の変異と欠失との両方を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする、第６のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含み、ここでこの第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、この第１、第２、第３、第４及び第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸の変異、欠失またはアミノ酸の変異と欠失との両方を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原、ならびに任意選択で第３、第４、第５及び第６の抗原は、それぞれスパイクタンパク質の抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原、ならびに任意選択で第３、第４、第５及び第６の抗原は、それぞれスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの抗原である。
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原、ならびに場合によっては第３、第４、第５及び第６の抗原はそれぞれ、互いに少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株であり、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株であり、第１及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株は、年間のうち少なくともある期間は、人口に蔓延している。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、組成物中のお互いのｍＲＮＡに対して約１：１の比率で存在する。他の実施形態では、ワクチンは、同時製剤化されない別個のワクチンである。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中であり、この脂質ナノ粒子は、イオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１：
の構造を有する。
いくつかの実施形態では、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、中性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）である。
本開示は、いくつかの態様において、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、５７、６０、及び６３のいずれか１つのタンパク質に対して少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡに対して少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するｍＲＮＡを提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡに対して少なくとも９８％の配列同一性を有するｍＲＮＡを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡを含むｍＲＮＡを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の第１の有効量を対象に投与することと、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸の第２の有効量を対象に投与することとを含む方法を提供し、この第１及び第２の抗原が、第１の抗原及び第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、ここで、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の変異、欠失、またはアミノ酸の変異と欠失との両方を有するアミノ酸配列を有し、かつ、この第１及び第２の抗原の各々は、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない。
いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが対象集団に存在する期間中に検出される免疫優勢な新興株である。
いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、少なくとも１年以内に対象集団において検出可能である。いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、同じシーズンの間、対象集団において検出可能である。いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、同じパンデミックまたは流行期の間、対象集団において検出可能である。
いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸である。いくつかの実施形態では、第１の核酸はＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、第２のワクチンは、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２の核酸は、１：１の比で第２のワクチン中に存在する。
いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸は、第２の核酸であり、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のスパイク抗原は一価の抗原である。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のスパイク抗原は多価の抗原である。
いくつかの実施形態では、第１のコードされた抗原は、１つ以上のプライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫（初回免疫）からなる１回目のワクチンとして対象に投与され、第２のコードされた抗原はブーストとして対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、１：１の比でブースト用量中に存在する。
いくつかの実施形態では、第２のコードされた抗原は、１つ以上のプライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫からなる１回目のワクチンとして対象に投与され、第１のコードされた抗原はブーストとして対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のコードされた抗原は、ブーストとして一緒に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第１のコードされた抗原は、プライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫として、及びワクチン接種を完了するためのブーストとして対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第１のコードされた抗原は、プライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫として、及び最初のワクチン接種におけるブーストとして対象に投与され、第２のコードされた抗原は、最初のワクチン接種から３か月以上後にブーストとして対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ブーストとは、季節的ブーストまたはパンデミックシフトブーストである。
本開示は、いくつかの態様において、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２の核酸を含む第２のワクチンの第２の有効用量を対象に投与することを含む方法を提供し、ここで、この対象は、事前に第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む１回目のワクチンの第１の有効用量を投与されており、この第２のワクチンは、第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、この第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の対応するアミノ酸配列に関して、少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を有し、この変異はアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、この第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない。
いくつかの実施形態では、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表しており、この第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原である。いくつかの実施形態では、この第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのものであり、この第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表する抗原である。
いくつかの実施形態では、この第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、複数の第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表する抗原であり、及び／またはこの第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第２の複数の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表する抗原である。
いくつかの実施形態では、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原であり、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原である。
いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが対象集団に存在する期間中に検出される免疫優勢な新興株または懸念される変異株である。いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、少なくとも１年以内に対象集団において検出可能である。いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、同じシーズンの間、対象集団において検出可能である。いくつかの実施形態では、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、同じパンデミック期間または流行期間の間、対象集団において検出可能である。
いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸は、ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２の核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、第２のワクチンは、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２の核酸は、１：１の比で第２のワクチン中に存在する。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のワクチンは一価ワクチンである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のワクチンは、複数の懸念される変異株を代表する抗原をコードする複数の核酸を含む多価ワクチンである。
いくつかの実施形態では、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、１つ以上のプライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫からなる１回目のワクチンとして対象に投与され、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は１回以上の投与でブーストとして対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、１つ以上のプライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫からなる１回目のワクチンとして対象に投与され、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は１回以上のブーストとして対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ブーストとして一緒に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、１：１の比でブースト用量中に存在する。
いくつかの実施形態では、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、プライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫として、及びワクチン接種を完了するためのブーストとして対象に投与され、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、１回目のワクチン接種が完了してから少なくとも ３か月後にブースターレジメンとして対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、プライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫として、及び初回のワクチン接種におけるブーストとして対象に投与され、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、初回のワクチン接種から６か月超の後にブーストとして対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ブーストとは、複数の懸念される変異株に対する防御を提供するための季節的ブーストまたはパンデミックシフトブーストである。
いくつかの実施形態では、ブースト用量は５０μｇである。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は２０μｇ～５０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は２０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は２５μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は３０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は４０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は５０μｇである。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は３０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は１０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は１０μｇ～３０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は１０μｇ～２０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は、少なくとも１０μｇであり、かつ２５μｇ未満である。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は５μｇ～３０μｇである。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の有効用量は、少なくとも５μｇであり、かつ２５μｇ未満である。
いくつかの態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含む方法を提供し、この第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新興変異型であって、この抗原は初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に関して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、この変異とは、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、この対象は初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陽性である。
本開示はまた、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含む方法を提供し、この第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新興変異型であって、この抗原は初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に関して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、この変異とは、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、この対象は初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陰性である。
いくつかの実施形態では、ワクチンの初回用量が投与されてから２週間から１年の間に、対象にワクチンの第２用量が投与される。いくつかの実施形態では、対象には、ワクチン投与後２週間から１年の間に第２のワクチンを投与し、この第２のワクチンは、初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２のワクチンは、第１及び第２の核酸の混合物を含み、この第１の核酸及び第２の核酸は、第２のワクチン中に１：１の比で存在する。
いくつかの態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに由来する第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むブースターワクチンを対象に投与することを含む方法を提供し、ここで、この対象は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む１回目のワクチンの少なくとも１つのプライム用量を以前に投与されており、このブースターワクチンが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、ここで第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含み、この第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、このブースターワクチンは、１回目のワクチンの初回投与後少なくとも６か月後に２５～１００μｇの用量で投与され、かつ、この第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない。
いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは５０μｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、１回目のワクチンの２回目の用量の少なくとも約６か月後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、１回目のワクチンの２回目の用量の６～１２か月後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、１回目のワクチンの２回目の用量の少なくとも約８か月後に投与される。
いくつかの実施形態では、ブースト用量は、複数の懸念される変異株に対する中和免疫応答を提供するための季節的ブーストまたはパンデミックシフトブーストである。
マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭで免疫したマウス由来であった。中和されているウイルスには、Ｄ６１４Ｇ変異または南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異のいずれかが含まれていた。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１μｇのＮＴＤ＿ｅｘｔ－ＲＢＤ＿ｅｘｔ－ＴＭを投与したマウス由来であった。中和されているウイルスには、Ｄ６１４Ｇ変異または南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異のいずれかが含まれていた。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１μｇのＲＢＤ＿＿ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿３１７＿５１６＿＿ＴＭを投与したマウス由来のものであった。中和されているウイルスには、Ｄ６１４Ｇ変異または南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異のいずれかが含まれていた。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目及び２２日目に１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与され、次いで２１３日目に南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異を含む１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与されたマウス由来であった。サンプルを２１２日目（３回目の用量の投与前）と２３３日目（３回目の用量の投与後）に採取した。各時点における中和抗体価を示す。中和されているウイルスには、Ｄ６１４Ｇ変異または南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異のいずれかが含まれていた。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目及び２２日目に１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与され、次いで２１３日目に南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異を含む１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与されたマウス由来であった。サンプルを２１２日目（３回目の用量の投与前）と２３３日目（３回目の用量の投与後）に採取した。２つの時点間の相対的な力価変化を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目及び２２日目に１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与され、次いで２１３日目に南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異を含む１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与されたマウス由来であった。サンプルを２１２日目（３回目の用量の投与前）と２３３日目（３回目の用量の投与後）に採取した。２つの時点における異なる変異型間の相対力価変化を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目及び２２日目に０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与され、次いで２１３日目に南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異を含む０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与されたマウス由来であった。サンプルを２１２日目（３回目の用量の投与前）及び２３３日目（３回目の用量の投与後）に採取した。各時点における中和抗体価を示す。中和されているウイルスには、Ｄ６１４Ｇ変異または南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異のいずれかが含まれていた。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目及び２２日目に０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与され、次いで２１３日目に南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異を含む０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与されたマウス由来であった。サンプルを２１２日目（３回目の用量の投与前）及び２３３日目（３回目の用量の投与後）に採取した。２つの時点間の相対的な力価変化を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目及び２２日目に０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与され、次いで２１３日目に南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１に関連する変異を含む０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与されたマウス由来であった。サンプルを２１２日目（３回目の用量の投与前）及び２３３日目（３回目の用量の投与後）に採取した。２つの時点における異なる変異型間の相対力価変化を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目に（プライム用量）１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、２２日目に（ブースター用量）再度投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（３回目の用量の投与前）、２３３日目（４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（４回目の用量の投与後１４日）に採取した。Ｄ６１４Ｇ変異（左のバー）または南アフリカＢ．１．３５１変異型に関連する変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む疑似ウイルスの中和に基づいた、各時点における中和抗体力価を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目に（プライム用量）１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、２２日目に（ブースター用量）再度投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（３回目の用量の投与前）、２３３日目（４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（４回目の用量の投与後１４日）に採取した。図６Ａで試験した各スパイクタンパク質について、２１２日目から２４８日目までの中和力価の動態を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目に（プライム用量）１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、２２日目に（ブースター用量）再度投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（３回目の用量の投与前）、２３３日目（４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（４回目の用量の投与後１４日）に採取した。各時点で、Ｄ６１４Ｇ変異のみを含むスパイクタンパク質と比較した、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価の相対変化を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目に（プライム用量）１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、２２日目に（ブースター用量）再度投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（３回目の用量の投与前）、２３３日目（４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（４回目の用量の投与後１４日）に採取した。２回目の投与から２週間後の３６日目の血清の、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、再度２２日目（ブースター用量）に投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの０．１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の３回目の用量の投与前）、２３３日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与後１４日）に採取した。Ｄ６１４Ｇ変異（左のバー）または南アフリカＢ．１．３５１変異型に関連する変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む疑似ウイルスの中和に基づいた、各時点における中和抗体力価を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、再度２２日目（ブースター用量）に投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの０．１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の３回目の用量の投与前）、２３３日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与後１４日）に採取した。図７Ａで試験した各スパイクタンパク質について、２１２日目から２４８日目までの中和力価の動態を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、再度２２日目（ブースター用量）に投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの０．１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の３回目の用量の投与前）、２３３日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与後１４日）に採取した。各時点で、Ｄ６１４Ｇ変異のみを含むスパイクタンパク質と比較した、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価の相対変化を示す。 マウス血清サンプルの中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に０．１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭを投与し、再度２２日目（ブースター用量）に投与したマウスから得た。２１３日目（３回目の投与）及び２３４日目（４回目の投与）に、南アフリカ変異型Ｂ．１．３５１（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）に関連する変異を含むＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭの０．１μｇをマウスに投与した。サンプルを、２１２日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の３回目の用量の投与前）、２３３日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与前）、及び２４８日目（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１の４回目の用量の投与後１４日）に採取した。２回目の投与から２週間後の３６日目の血清の、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価を示す。 マウス血清サンプルのタンパク質特異的ＩｇＧおよび中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に１０、１、または０．１μｇのＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＨＡＴＭを投与され、再度２２日目（２回目の用量）に投与されたマウスから採取された。血清を、３６日目（２回目の投与から１４日後）に採取した。ＥＬＩＳＡによって測定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な総ＩｇＧを示す。 マウス血清サンプルのタンパク質特異的ＩｇＧおよび中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に１０、１、または０．１μｇのＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＨＡＴＭを投与され、再度２２日目（２回目の用量）に投与されたマウスから採取された。血清を、３６日目（２回目の投与から１４日後）に採取した。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１変異型に関連する変異を有するスパイクタンパク質、３）Ｐ．１変異型に関連する変異を含むスパイクタンパク質、ならびに４）Ｂ．１．１．７変異型に関連する変異及びＥ４８４Ｋ変異を含むスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルの１つを含む疑似ウイルスに対する血清サンプルの中和力価を示す。 マウス血清サンプルのタンパク質特異的ＩｇＧおよび中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に１０、１、または０．１μｇのＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＨＡＴＭを投与され、再度２２日目（２回目の用量）に投与されたマウスから採取された。血清を、３６日目（２回目の投与から１４日後）に採取した。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する中和力価のベースラインと比較した、図８Ｂで試験した各ウイルスに対する血清の中和力価の減少を示す。 マウス血清サンプルのタンパク質特異的ＩｇＧおよび中和力価を示す。血清は、１日目（プライム用量）に１０、１、または０．１μｇのＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＨＡＴＭを投与され、再度２２日目（２回目の用量）に投与されたマウスから採取された。血清を、３６日目（２回目の投与から１４日後）に採取した。図８Ｂ～図８Ｃで試験した各疑似ウイルス及びスパイクタンパク質に対する、対照ｍＲＮＡ－１２７３、ならびに２Ｐ安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡを有する２回投与（１日目及び１４日目）によって誘発された血清の、Ｂ．１．１．７変異型に関連する変異を含むが、Ｅ４８４Ｋ変異は含まない疑似ウイルスで免疫化したマウス由来の参照中和力価を示す。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、罹患率及び死亡率が高い、新たに出現した呼吸器ウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２００２年に出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び２０１２年に出現した中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と比較して、世界中に急速に伝播している。世界保健機関（ＷＨＯ）の報告によると、２０２１年３月の時点で、ＣＯＶＩＤ－１９の現在のアウトブレイクにより、世界中で約１２，０００万人超の症例が確認され、２６５万人超が死亡している。ＣＯＶＩＤ－１９感染の新しい症例は増大しており、依然として急速に増大している。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９を予防及び治療し、ＣＯＶＩＤ－１９が世界中に及ぼす深刻な影響を軽減するために、さまざまな安全かつ効果的なワクチン及び薬物を開発することが重要である。さまざまなモダリティを使用して製造されたワクチン及び薬物、ならびに安全性及び有効性が改善されたワクチンが不可欠である。コロナウイルス疾患（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）及び具体的にはコロナウイルス２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチン及び治療薬の高度な設計及び開発を加速する必要が残っている。
２０２０年１月７日、中国湖北省武漢市で２０１９年１２月に発生した新規肺炎の病因として、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が特定された（Ｌｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ． Ａｐｒ；９２（４）：４０１－４０２．）。その後まもなく、このウイルスは中国でアウトブレイクを引き起こし、世界中に伝播した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム構造の分析によれば、それはβ－コロナウイルス（ＣｏＶ）に属している（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０ Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．；９（１）：２２１－２３６）。
その後、多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型株が出現し、特定の初期の地理的地域で優勢となっている。ただし、ある地理的領域で急速に蔓延した一部の亜種は、世界中に急速に広がる可能性がある。これらの変異型は、懸念される変異型（ＶＯＣ）として知られている。２０２０年の秋以降、２つの主要な変異型が発見されており、その１つは英国（２０Ｂ／５０１Ｙ．Ｖ１、ＶＯＣ ２０２０１２／０１、もしくはＢ．１．１．７系統、またはアルファ変異型）で、もう１つは南アフリカ（２０Ｃ／５０１Ｙ．Ｖ２もしくはＢ．１．３５１系統、またはベータ変異型）である。２つの変異型は互いに別々に出現したが、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ 分離株と比較して伝達率が向上しているようである。さらに、これらの変異型、ならびに他の流行株、及び将来の変異型は、既存のワクチン及び抗体などの治療法による中和を避けるためにさらに変異し得るという懸念がある。このように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異型、及び任意の他の新たな変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、国際的な健康上の懸念となっている。
ウイルスの変異体株の出現の脅威は、ワクチン開発にとって大きな課題となっている。本明細書に開示される組成物は、世界的な健康上の懸念を引き起こす新たなウイルス株との闘いにおいて顕著な進歩をもたらす。本明細書では、異なる株に由来する同じまたは異なる抗原の組み合わせを単回または複数回投与することによって、複数の株のウイルスからの感染の脅威を軽減する、広範なウイルス中和能力を備えたワクチン及びワクチンプロトコールが開示される。例えば、本明細書に開示されるワクチン接種戦略は、いくつかの実施形態では、「一次シリーズ（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｅｒｉｅｓ）」のワクチン接種及びその後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のブースト（複数可）を含む。一次シリーズ（本明細書では、初期、オリジナル、または１回目のワクチン、またはワクチン接種とも呼ばれる）には、最初に同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の１回以上の投与（例えば２回の投与）が含まれる。ワクチンの初期のシリーズは、配列番号３６のアミノ酸配列またはそのドメインもしくはサブユニットを有する抗原などのスパイクタンパク質を有する抗原をコードするｍＲＮＡワクチンであってもよい。次いで、後続のブースターまたは一連のブースターワクチンが、例えば元のワクチンの直後、またはワクチン接種プロトコールのかなり後の時点（例えば、中和抗体力価が低下した後、または新株ワクチンの承認後）に投与される。
本明細書に開示される態様では、新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型株を使用して、以前に投与されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンへの補足としてｍＲＮＡ「ブースト」を設計し、これには、従来のブースト、季節性ブースト、及びパンデミックシフトブーストが含まれる。本明細書で使用されるブーストとは、その後の任意の用量を指す。従来のブーストは、２１～２８日、さらには２週間～６か月などの一定期間後に対象に投与される抗原の２回目の投与である。従来のブーストには、そのウイルス株及び必要に応じて他の変異型株に対する強力な免疫応答を生成するために、同じウイルス株に相当する同じ抗原を対象に投与することが含まれる。
パンデミックまたは流行期の間には、元のウイルス株に対して設計されたワクチンによる中和が効果的に受けられない新興ウイルス株が発生し得る。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の新興ウイルス株は放射状進化を経て発生すると考えられる。すなわち、ウイルスが進化するにつれて突然変異が互いに蓄積していく直線進化とは対照的に、さまざまな異なる突然変異が存在する。このような場合、パンデミックシフトブーストを使用して、新興のウイルス株に対する免疫防御を提供し得る。パンデミックシフトブーストとは、１回目のワクチンの完全なコースの後に対象に投与される後続ワクチンである。１回目のワクチンの完全なコースは、１回目のワクチンの１回以上の投与を含み得る。パンデミックシフトブーストは、ウイルス感染のパンデミックまたは流行中に出現した変異型ウイルス株に由来する抗原を含むワクチンで構成される。パンデミックシフトブーストは、１回目のワクチンの投与後いつでも投与され得る。１回目のワクチンは、パンデミックシフトブーストが、１回目のワクチンとは異なるウイルス変異型株に対するワクチンを含む限り、最初に検出されたウイルス株に対するワクチン、ウイルスの元の株とそのウイルスの変異型（複数可）との組み合わせ、またはウイルスの変異型株に対するワクチンであってもよい。
さらに、パンデミックまたは流行期以外の時期にも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異ウイルス株が出現する場合がある。これらの株は、例えばシーズンごとに出現する場合がある。このような変異型株を使用して、季節性ブーストとして送達される季節性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを設計してもよい。季節性ブーストは、パンデミックまたは流行期以外で変異型株が発生したときに起こる、１回目のワクチンの完全なコースの後に対象に投与される後続の用量である。従来のワクチンの設計では、ウイルスサーベイランス手法が使用されている。しかし、従来のワクチンは開発時間が遅いので、抗原設計の決定がかなり前に行われることが多く、ワクチンが投与される時に流行しているウイルス株と一致しない。開発期間中にウイルスが変異するか、または他の株が蔓延したりして、その結果、従来のワクチンの効果が低下する。従来のワクチンはすでに生産されているため適応できず、新しいワクチンの設計及び製造にはさらに時間がかかる。対照的に、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、これらの課題を克服し得る。これらは数週間で製造できるため、接種日近くに流行するコロナウイルスに対して設計できるようになる。例えば、ワクチン接種時に流行しているウイルス株に応じてコロナウイルスワクチンを迅速に開発する、季節的または毎年のコロナウイルスワクチン接種プログラムが開発され得る。すなわち、コロナウイルスのシーズンまたはその他のアウトブレイクに近いウイルスの予測は、シーズンまたはアウトブレイクが始まる数か月前からの予測よりも正確であると考えられており、したがって、本明細書に記載されているｍＲＮＡワクチンは、コロナウイルスのシーズンまたは予防接種が予定されている時期に近い、流行しているウイルスを標的にするように設計されているので、より効果的である場合もある。したがって、例示的な態様では、本開示のワクチンは、季節性コロナウイルス株と戦うように設計してもよく、それ自体、今後の北半球のシーズンまたは南半球のシーズンに使用するためのワクチンである。ワクチンは、特定の時点で流行しているコロナウイルスの理解に基づいて、今後のウイルスシーズンに流行または蔓延すると予測されるウイルスに対抗するように設計されている。ｍＲＮＡワクチンは数日で設計可能であり、申請者が開発した最近のワクチンでは、設計からワクチンの製造までちょうど５週間強で完了した。季節性ワクチン接種などの予防接種プログラムの開始にかなり近い段階で、どのようなウイルスがどの程度流行しているかに関するデータを取得して分析できる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び本明細書に記載の変異体株を含むコロナウイルスの表面上の重要なタンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質などのスパイク（Ｓ）タンパク質である。スパイクタンパク質には、ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏで細胞に感染する能力に関連する特定の領域が存在することがわかっている。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で用いられるワクチンは、スパイクタンパク質ドメイン、例えば、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、またはＲＢＤとＮＴＤとの組み合わせをコードするｍＲＮＡである。ＲＢＤとＮＴＤとは両方とも、ウイルスを中和するワクチンの能力に関連していることがわかっている。いくつかの実施形態では、ＲＢＤなどのドメイン抗原は、２Ｐ安定化変異を含む。本明細書に記載されるワクチン接種プロトコールには、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株及び／または新興の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のドメイン、サブユニット及び全長タンパク質をコードするｍＲＮＡの様々な用量及び用量も含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原は、２Ｐ安定化スパイクタンパク質を含まない。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株参照株と比較して、少なくとも１つのＲＢＤ変異を有するスパイクタンパク質抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株参照株と比較して、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのＲＢＤ変異を含むスパイクタンパク質抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株参照株と比較して、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０Ｙからなる群から選択される２つまたは３つ全てのＲＢＤ変異を含むスパイクタンパク質抗原をコードする核酸を含む。
多様なｍＲＮＡ構築物が設計されており、本明細書に開示されている。スパイク抗原をコードするｍＲＮＡを適切な送達ビヒクルに製剤化すると、新しく出現する変異型株のドメイン及び／またはサブユニットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力な免疫応答を誘導し得るので、効果的かつ強力なｍＲＮＡワクチン／ブースターを生成すると、もとのウイルス及びその後の株を排除するのに必須の多様性が得られる。ＬＮＰ中の種々の抗原をコードするｍＲＮＡの筋肉内投与は、免疫組織及び免疫系の細胞へのｍＲＮＡの送達をもたらし、そこでｍＲＮＡは迅速にタンパク質抗原に翻訳される。次に、他の免疫細胞、例えばＢ細胞及びＴ細胞がコードされたタンパク質に対する免疫応答を認識してマウントし得、最終的にコロナウイルスに対する長期的な防御応答を生み出し得る。免疫原性の低さ、免疫系への不十分な提示または抗原の誤った折り畳みに起因するタンパク質ワクチン開発の欠点は、本明細書に開示されるスパイクタンパク質、サブユニット及びそのドメインをコードする非常に効果的なｍＲＮＡワクチンの使用によって回避される。
ウイルスは常に進化する性質があるため、科学者はヒトで流行しているウイルスの配列と株を継続的にモニターしている。これらの様々な流行株は、本明細書に開示されるブーストまたは個別ワクチンとして、あるいはさらに多価ｍＲＮＡワクチンを設計するために使用され得る。ウイルスサーベイランスを使用すると、ｍＲＮＡワクチンの基礎として使用する正確なウイルス株を選択するために、年次または季節（またはその他の計画された）情報を提供できる。流行している株が一旦、特定されたら、それらの株に基づいて、流行している２つまたは３つ（またはそれ以上）の最も代表的なウイルスタイプを標的とするワクチンの組成を開発し得る。新しい株由来の抗原をワクチンに追加するこの作業は、集団内のウイルス免疫を維持するために必要に応じて、毎年または他の期間で繰り返してもよい。本明細書に記載されるｍＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、単一の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に複数の流行株に由来する複数の抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、それぞれがコロナウイルスの特有の株に由来する少なくとも２つの抗原の組み合わせを含む。
従って、本開示は、対象においてコロナウイルス抗原に対する強力な中和抗体を誘発する組成物（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を提供する。このような組成物は、いくつかの実施形態では、血清陽性の対象に投与されても、または血清陰性の対象に投与されてもよい。血清陰性の対象はナイーブであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応する抗体を持っていない場合がある。血清陽性の対象は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがある、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を誘導するワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）の用量を以前に投与されたことがある可能性があるので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する既存の抗体を持っている場合がある。いくつかの実施形態では、組成物は、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体株（本明細書では変異型とも呼ぶ）由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、またはそれ以上）のコロナウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、単一の脂質ナノ粒子中に異なる変異型由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする複数のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型からの１つ以上の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする（例えば、Ｂ．１．１．７及び５０２１．Ｖ２変異型に見られる変異及び／または欠失の組み合わせをコードする）ｍＲＮＡを含む。以下の表２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型におけるスパイクタンパク質変異の例を示している。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型の少なくとも４つのグループが、有病率の増大、より高いｈＡＣＥ２結合親和性、またはｍＡｂ及び回復期血清からの逃避の報告により、現在懸念されている。コロナウイルスの例示的な流行株（ＵＫ）の１つは、Ｎ５０１Ｙ－ＵＫ、またはＢ．１．１．７（アルファ変異型）であり、以下の変異を有する：ΔＨ６９－ΔＶ７０－ΔＹ１４４－Ｎ５０１Ｙ－Ａ５７０Ｄ－Ｐ６８１Ｈ－Ｔ７１６Ｉ－Ｓ９８２Ａ－Ｄ１１１８Ｈ。この株は、ある領域を通じて急速に広がることが観察された。Ｎ５０１Ｙは、ｈＡＣＥ２への結合親和性を増大させ、ウイルスの取り込みをより可能にする。ΔＨ６９－ΔＶ７０は、回復期血清に対する感受性が低下していることが示されており、Ｐ６８１Ｈはフリン切断部位のすぐ隣に位置している。
Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ変異を有する別の株（南アフリカ）、Ｎ５０１Ｙ－ＳＡ（Ｂ．１．３５１）（ベータ変異型）も、急速な地域拡散及び患者のウイルス量の増大を示している。Ｅ４８４Ｋは、回復期血清に対する感受性が低下していることが示されている。Ｎ５０１ＹとＥ４８４Ｋは両方とも受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に位置しており、これらの変異によりｈＡＣＥ２に対するＲＢＤ結合親和性が増大する。
ブラジルからの旅行者４人から日本で確認された追加の株、Ｐ．１（Ｂ１．１．２４８；２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１）（ガンマ変異型）が出現した。この変異型には、Ｎ５０１Ｕ及びＥ４８４Ｋなど、スパイクタンパク質に１２個の変異が含まれている。さらなる変異は抗体による認識能力に影響を与える可能性があると考えられ、野生型ウイルス（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株）よりも感染力が高いと考えられている。
Ｂ．１．４２９（ＣＡＬ．２０Ｃまたは５４２Ｒ．Ｖ１とも呼ばれる）株（イプシロン変異型）は、ロサンゼルスのＣｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（シーダーズサイナイメディカルセンター）で発見された。この変異型には、Ｉ４２０５Ｖ（ＯＲＦ１ａ）、Ｄ１１８３Ｙ（ＯＲＦ１ｂ）、及びＳ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、及びＬ４５２Ｒ（スパイクタンパク質）の５つの変異が含まれている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｍｅｄＲｘｉｖ 査読前原稿、２０２１年１月２０日）。Ｌ４５２Ｒ変異は、ＲＢＤ内に位置しており、スパイクタンパク質に対する特定のモノクローナル抗体に対して耐性があることがわかっている。
Ｂ．１．１．２４８の追加サブクレードがブラジルのアマゾナス州で発生し、以前に感染した人々の再感染に対する懸念が生じている。Ｂ．１．１．２８の２つのサブクレードは、Ｐ．２（Ｂ．１．１．２８．２のエイリアス）及びＰ．１（Ｂ．１．１．２８．１のエイリアス）と呼ばれる。明確にするために、懸念される変異株（ＶＯＣ）は、以前に感染し、以前に回復した女性に注目すべき再感染を引き起こしたＰ．１（別名 Ｂ．１．１．２８．１）と指定されたサブクレードである。再感染は、最初の感染で誘導された限定的または一過性の免疫の結果である場合があるか、または、以前の免疫応答を回避する新しい株の優れた能力を反映している場合もある。この新しい株には、ＲＢＤの３つ（Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）とＴ２０Ｎの１つの新しいＮ－グリコシル化部位を含む１２個のスパイクタンパク質変異が含まれている。Ｓタンパク質変異には次の１２の変異が含まれる：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆ（Ｎａｖｅｃａ ｅｔ ａｌ．，ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｗ Ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｒｎ（ＶＯＣ） Ｐ．１ ｉｎ Ａｍａｚｏｎａｓ，Ｂｒａｚｉｌ，２０２１を参照のこと）。再感染では、最初の感染と同様の中程度の症状が引き起こされたが、鼻咽頭及び咽頭サンプルではより高いウイルス量が記録された。再感染は、スパイクタンパク質のＥ４８４Ｋ変異、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 中和抗体の回避を促進するスパイクタンパク質の能力の結果であり得る。
ドイツでは、ガルミッシュ・パルテンキルヘン（Ｇａｒｍｉｓｃｈ－Ｐａｒｔｅｎｋｉｒｃｈｅｎ）の新規患者７３人のうち３５人から新たな変異型が検出された。この変異型は現在配列決定中であるが、スパイクタンパク質に少なくとも１つの点突然変異が検出されている。
インドでは、どちらも Ｂ．１．６１７．１サブクレードに属する ２つの関連する変異型が出現した。ｖ１またはＢ．１．６１７．１ ｖ１（カッパ変異型）と呼ばれる １つのＢ．１．６１７．１変異型のゲノムは、次の８つの置換を有するスパイクタンパク質をコードする：Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、及びＱ１０７１Ｈ。ｖ２またはＢ．１．６１７．１ ｖ２と呼ばれるもう１つのＢ．１．６１７．１変異型のゲノムは、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｑ１０７１Ｈ、及びＨ１１０１Ｄという８つの置換を有するスパイクタンパク質をコードする。
インドでも、Ｂ．１．６１７．２ サブクレードに属する別の変異型が出現した。Ｂ．１．６１７．２（デルタ）変異型のゲノムは、２つの欠失：Ｆ１５７ｄｅｌ及びＲ１５８ｄｅｌに加えて、次の１０個の置換：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Ｇ、Ｆ１５７、Ｒ１５８、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎを有するスパイクタンパク質をコードする。
アンゴラでは、ゲノムサーベイランスを通じて、複数のスパイクタンパク質変異を有するＡ．ＶＯＩ．Ｖ２と呼ばれる新しい変異型が検出された。Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２変異型のゲノムは、１０個の置換と５個のアミノ酸欠失を含む、以下の１５個の変異を有するスパイクタンパク質をコードする：Ｄ８０Ｙ、ΔＹ１４４、ΔＩ２１０、Ｄ２１５Ｇ、ΔＲ２４６、ΔＳ２４７、ΔＹ２４８、Ｌ２４９Ｍ、Ｗ２５８Ｌ、Ｒ３４６Ｋ、Ｔ４７８Ｒ、Ｅ４８４Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｑ９５７Ｈ。
目的の変異型（ＶＯＩ）、ラムダ（Ｃ．３７）を調査した。このバリアントはペルーで最初に記録され、南米で最も頻繁に発見されている。主にＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）の欠失数が多いせいで、リスクスコアが比較的高く、ＲＳＹＬＴＰＧＤ２４６－２５３Ｎ変異により中和抗体を回避する能力が増大するし得る可能性がある。
目的の別の変異型（ＶＯＩ）、ｍｕ（Ｂ．１６２１）がコロンビアで報告され、最初に文書化された。この変異型は、スパイクタンパク質の挿入、１４６Ｎ、及びいくつかのアミノ酸置換（Ｙ１４４Ｔ、Ｙ１４５Ｓ、Ｒ３４６Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＰ６８１Ｈ）を含む。
さらに２つの関連する変異型、Ｂ．１．２４３及びＢ．１．２４３．１が主に北米（アリゾナ）で発見されている。Ｂ．１．２４３．１変異型には、さらなるスパイクタンパク質変異（Ｖ２１３Ｇ）に加えて、Ｅ４８４Ｋ変異があり、これにより中和抗体に対する耐性が高まる可能性がある。
複数のスパイクタンパク質変異を有する、懸念される変異株、オミクロン（Ｂ．１．１．５２９）は、ボツワナで最初に検出された。この変異型で観察された変異としては、デルタ変異型で見られ、伝染性と変異を増大させると考えられている変異と、ベータ変異型及びデルタ変異型で見られ、免疫逃避を促進すると考えられている変異が挙げられる。特に、オミクロン変異型のゲノムは、以下の変異を有するスパイクタンパク質をコードしている：Ａ６７Ｖ、Δ６９－７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ／Δ１４３－１４５、Δ２１１／Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、及びＬ９８１Ｆ。
これらの例示的な株及び他の新たに出現した株（例えば、さらなる懸念される変異株）は、本明細書に開示される方法及び製剤の候補である。これら及び他のコロナウイルス株の抗原をコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡワクチン用に設計されている。いくつかの実施形態では、これらの変異型は、親株と比較してコロナウイルス株のＳ１またはＳ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、これらの変異型は、親株と比較してコロナウイルス株のＳ１またはＳ２ドメインに１つ以上のアミノ酸欠失を含む。本明細書で使用される親株は、参照ウイルス株である。変異型株は、親株と比較して、少なくとも １つの構造的差異（少なくとも １つのアミノ酸が置換、欠失、修飾、または追加）及び少なくとも １つの機能的相違（機能の種類、機能の程度または強度に関して）を有する。親とバリアント（変異型）という用語は、どちらかが互いより前に存在していたことを意味するものではなく、構造／機能についての言及として機能する。機能とは、例えば、ウイルスの元の株または他の変異型と比較して、伝染性の増大、罹患率の増大、死亡率の増大、「ロング（ｌｏｎｇ）ＣＯＶＩＤ」（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の急性期後の後遺症）のリスクの増大、診断検査による検出を回避する能力、抗ウイルス薬に対する感受性の低下、中和抗体に対する感受性の低下、自然免疫を回避する能力、ワクチン接種を受けた個体に感染する能力、特定の状態（例えば、多系統炎症性症候群）のリスクの増大、及び特定の人口統計または臨床群（例えば、小児、免疫不全患者など）に対する親和性の増大を意味し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡワクチンは、プライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫（例えば、対象へのコロナウイルスワクチンの初回投与）として投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、ブースター、すなわち、本明細書に記載のプライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫の後に投与される用量として投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ブースター及びプライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫は、同じｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡを含む。他の実施形態では、ブースター及びプライム免疫（初回免疫）またはプライミング免疫は、異なるｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡを含む。他の実施形態では、異なる抗原（それぞれが１つの株または複数の株を対象とする）をコードする複数のｍＲＮＡワクチンを一緒にまたは並行して投与して、複数のコロナウイルス株に対する広域中和プラットフォームを提供し得る。
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２
本開示は、コロナウイルス抗原に対する強力な中和抗体を誘発する組成物（例えば、ｍＲＮＡワクチン）及びワクチン接種法を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは一本鎖プラス鎖ＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）であり、約９８６０アミノ酸をコードする２９．８～３０ｋｂのサイズである（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０００，ｓｕｐｒａ；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０２０ Ｃｅｌｌ，Ｍａｙ １４；１８１（４）：９１４－９２１．ｅ１０．）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、５’キャップ及び３’－ポリＡテールを有するポリシストロン性ｍＲＮＡである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、構造タンパク質及び非構造タンパク質（Ｎｓｐｓ）をコードする特定の遺伝子に編成されている。ゲノム内の構造タンパク質の順序は、５’－レプリカーゼ（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１／ａｂ）－構造的タンパク質［スパイク（Ｓ）－エンベロープ（Ｅ）－メンブレン（Ｍ）－ヌクレオカプシド（Ｎ）］－３’である。コロナウイルスのゲノムとしては、アクセサリータンパク質、非構造タンパク質、及び構造タンパク質をコードするさまざまな数のオープンリーディングフレームが挙げられる（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９Ｖｉｒｕｓｅｓ；１１（１）：ｐ．５９）。ほとんどの抗原ペプチドは構造タンパク質に位置する（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；１７（３）：１８１－１９２）。スパイク表面糖タンパク質（Ｓ）、小さなエンベロープタンパク質（Ｅ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）が、４つの主要な構造タンパク質である。Ｓタンパク質は、細胞指向性及びウイルス進入に寄与して、中和抗体（ＮＡｂ）及び防御免疫を誘導し得るので、他の全ての構造タンパク質の中でコロナウイルスワクチン開発における最も重要な標的の１つと見なされ得る。さらに、アミノ酸配列分析によって、Ｓタンパク質がコロナウイルスの中で保存された領域を含むことが示され、これが、普遍的なワクチン開発の基礎となり得る。
抗原
本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、目的の抗原、例えば、ベータコロナウイルス構造タンパク質に由来する抗原、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に由来する抗原をコードするように設計された核酸、特に、ｍＲＮＡを特徴とする。本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、それ自体が抗原を含まず、むしろ、細胞、組織、または対象に一旦送達された抗原または抗原配列をコードする核酸、特にｍＲＮＡ（複数可）を含む。核酸、特にｍＲＮＡ（複数可）の送達は、細胞、組織または対象への投与時に核酸が細胞によって取り込まれ、次に、この細胞が、核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（複数可）を発現するように、適切な担体または送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）中に前記核酸を製剤化することによって達成される。
抗原とは、免疫応答を誘導する（例えば、抗原に対する抗体を免疫系に産生させる）ことが可能なタンパク質である。本開示のワクチンは、タンパク質抗原がインビトロで精製または産生される従来のタンパク質ベースのワクチン接種アプローチ、例えば、組換えタンパク質産生技術に対して独特の利点を提供する。本開示のワクチンは、所望の抗原をコードするｍＲＮＡを特徴とし、これが体内に導入されると、すなわちインビボで哺乳類対象（例えばヒト）に投与されると、体の細胞に所望の抗原を発現させる。本開示のｍＲＮＡの身体細胞への送達を促進するために、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内にカプセル化される。体の細胞に送達されて取り込まれると、ｍＲＮＡはサイトゾルで翻訳され、宿主細胞機構によってタンパク質抗原が生成される。タンパク質抗原が提示され、適応的な体液性及び細胞性免疫応答が引き起こされる。中和抗体は発現されたタンパク質抗原に対するものであるため、タンパク質抗原はワクチン開発に関連する標的抗原と考えられる。本明細書では、「抗原」という用語の使用は、別段の明記がない限り、免疫原性タンパク質及び免疫原性フラグメント（（少なくとも１つの）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型に対する免疫応答を誘導する（または誘導することが可能な）免疫原性フラグメント）を包含する。「タンパク質」という用語がペプチドを包含し、「抗原」という用語が抗原フラグメントを包含することを理解されたい。他の分子は、細菌多糖類またはタンパク質と多糖構造との組み合わせなどの抗原性である場合もあるが、本明細書に含まれるウイルスワクチンの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質のフラグメント、ならびに設計及び／または変異されたタンパク質が本明細書に提供される抗原である。
多くのタンパク質は、オリゴマー分子に会合する複数のポリペプチドまたはいくつかのポリペプチド鎖からなる四次構造または三次元構造を有する。本明細書で使用される場合、「サブユニット」という用語は、単一のタンパク質分子、例えば、発生期のタンパク質分子のプロセシングから生じるポリペプチドまたはポリペプチド鎖を指し、このサブユニットは、他のタンパク質分子（例えば、サブユニットまたは鎖）とアセンブル（または「同時アセンブル」して）タンパク質複合体を形成する。タンパク質は、比較的少数のサブユニットを有し得るので、「オリゴマー」として説明されてもよく、または多数のサブユニットからなり、したがって「マルチマー」として記述されてもよい。オリゴマーまたはマルチマータンパク質のサブユニットは、同一、相同、または完全に異なって、異なるタスク専用である場合もある。
タンパク質またはタンパク質サブユニットは、さらにドメインを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質内の別個の機能及び／または構造単位を指す。通常、「ドメイン」とは特定の機能または相互作用に関与し、タンパク質の全体的な役割に貢献する。ドメインは、さまざまな生物学的状況で存在し得る。類似のドメイン（すなわち、構造的、機能的及び／または配列相同性を共有するドメイン）は、単一のタンパク質内に存在してもよく、または類似もしくは異なる機能を有する別個のタンパク質内に存在してもよい。タンパク質ドメインは、多くの場合、所定のタンパク質の三次構造または配列の保存された部分であり、残りのタンパク質またはそのサブユニットとは独立して機能し、存在し得る。
構造生物学及び分子生物学では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノム配列の公開直後に行われたように、同一、相同、または類似のサブユニットまたはドメインが、新たに同定されたタンパク質または新規タンパク質の分類に役立ち得る。
本明細書で使用される場合、抗原という用語は、抗原の下部構造、例えば、抗原結合部位によって認識され得るが免疫応答を誘導するには不十分である、７～１０アミノ酸などのポリペプチドまたは炭水化物構造である「エピトープ」という用語とは異なる。当該技術分野は、単離された形態で対象または免疫細胞に送達されるタンパク質抗原、例えば、単離されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド抗原を記載しているが、タンパク質抗原の設計、試験、検証、及び産生は、特にタンパク質を大規模に生産する場合、費用及び時間がかかる場合がある。対照的に、ｍＲＮＡテクノロジーは、さまざまな抗原をコードするｍＲＮＡ構築物の迅速な設計及び試験に適している。さらに、適切な送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）での製剤と組み合わせたｍＲＮＡの迅速な産生は、迅速に進行し得、大規模でｍＲＮＡワクチンを迅速に産生し得る。本発明のｍＲＮＡによってコードされる抗原が対象の細胞によって発現され、例えば、人体によって発現され、したがって、対象、例えば、人体は、「工場」として機能して、抗原を生成し、それが次に、所望の免疫応答を誘発するという事実からも潜在的な利益が生じる。
本明細書で提供する組成物は、同じまたは異なるウイルス株の２つ以上の抗原をコードする１つのＲＮＡを含んでも、または複数のＲＮＡを含んでもよい。１つ以上のコロナウイルス抗原及び異なる生物の１つ以上の抗原（複数可）をコードするＲＮＡを含む併用ワクチンも本明細書で提供される。したがって、本開示のワクチンは、同じ株／種の１つ以上の抗原、または異なる株／種の１つ以上の抗原、例えば、コロナウイルス感染のリスクが高い同じ地理的地域に見られる生物体、またはコロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に曝露されたときに個体が曝露される可能性が高い生物体に対する免疫を誘導する抗原、を標的とする併用ワクチンであり得る。
コードされたコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質抗原
公知のベータコロナウイルスのエンベロープスパイク（Ｓ）タンパク質は、ウイルスの宿主指向性及び宿主細胞への侵入を決定する。コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、中和抗体及び防御免疫を誘導し得るので、ワクチン設計用のえり抜きの抗原である。Ｓタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に重要である。Ｓタンパク質の構成は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ－ＣｏＶ、及びＮＬ６３－ＣｏＶなどのベータコロナウイルス間で類似している。
本明細書で使用される場合、「スパイクタンパク質」という用語は、ベータコロナウイルスを含むウイルスのエンベロープ（ウイルス表面）から突出するホモ三量体を形成する糖タンパク質を指す。三量体化したスパイクタンパク質は、宿主細胞の表面にある受容体に結合し、続いてウイルス膜と宿主細胞膜を融合させることにより、ビリオンの宿主細胞への侵入を促進する。Ｓタンパク質は、ウイルスの種類に応じて１，１６０～１，４００のアミノ酸で構成される、高度にグリコシル化された大きなＩ型膜貫通型融合タンパク質である。ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質は、約１１００～１５００個のアミノ酸を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質は、中和抗体及び防御免疫を誘導し得るので、ワクチン設計に最適な抗原である。本発明のｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパクを産生するように（すなわち、ｍＲＮＡが細胞または組織、例えば対象の細胞または組織に送達されるときにスパイクタンパク質が発現されるようにスパイクタンパク質をコードする）、同様にその抗原変異型を産生するように、設計されている。当業者は、ウイルス、例えばベータコロナウイルスが宿主細胞へのウイルス侵入を促進するという意図された機能を実行するために、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質が必要であり得るが、スパイクタンパク質の構造及び／または配列におけるある量の変動が、主にスパイクタンパク質に対する免疫応答を誘発しようとする場合、許容されることを理解するであろう。例えば、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端からの、例えば、１～数個、おそらく最大５または最大１０のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原のうち１～数個、おそらく最大５または最大１０アミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）が、タンパク質の抗原特性を変えることなく許容され得る。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は安定化されたスパイクタンパク質ではなく、例えば、スパイクタンパク質は２つのプロリン置換（２Ｐ変異）によって安定化される。
いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、異なるウイルス株に由来する。株とは、微生物（例えば、ウイルス）の遺伝的変異型である。新しいウイルス株は、自然界で２つ以上のウイルスが同じ細胞に感染するとき、例えば抗原ドリフトまたは抗原シフトなどの突然変異または遺伝子成分の交換に起因して作成され得る。
抗原ドリフトはウイルスの遺伝的変異の一種であり、宿主の抗体が認識するウイルス表面タンパク質をコードするウイルス遺伝子の変異の蓄積によって生じる。これにより、以前の株による感染を防止した抗体によって効果的に阻害されない新しい株のウイルス粒子が生じる。これにより、変化したウイルスが部分的に免疫のある集団全体に広がりやすくなる。
抗原シフトとは、２つ以上の異なるウイルス株、または２つ以上の異なるウイルスの株が結合して、２つ以上の元の株の表面抗原の混合物を有する新しいサブタイプを形成するプロセスである。この用語は、インフルエンザが最もよく知られた例であるので、特にインフルエンザに適用されることが多いが、このプロセスは他のウイルスでも発生することが公知である。抗原シフトは、表現型の変化をもたらす再集合またはウイルスシフトの特殊なケースである。抗原シフトは、抗原ドリフトと対比され、抗原ドリフトとは、免疫の喪失またはワクチンの不一致につながり得る、既知のウイルス株の時間の経過による自然な変異である。抗原性シフトは、多くの場合、ウイルス表面抗原の主要な再構成と関連しており、その結果、ウイルスの表現型が大幅に再集合して変化する。
本明細書で使用されるウイルス株は、ウイルスの遺伝的変異型、またはウイルスの１つ以上の表面タンパク質の異なるアイソフォームを特徴とするウイルスの株である。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の異なるアミノ酸配列により、新しい株に対する個体の免疫応答が、個体に免疫または最初に感染するのに使用された株に対する免疫応答よりも効果が低くなる。新しいウイルス株は、免疫化された個体または以前に感染した個体における進行中の免疫応答に起因する自然変異、または自然変異と免疫選択との組み合わせから発生し得る。新しいウイルス株は、受容体結合または標的細胞とのウイルス融合などのウイルス機能を担うスパイクタンパク質の領域で、１、２、３つ以上のアミノ酸変異が異なる場合がある。新しい株由来のスパイクタンパク質は、通常、アミノ酸レベルにおいて親株と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、または９９．８％を超える配列同一性を有する。新しい株由来のスパイクタンパク質は、アミノ酸レベルで親株と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もの同一性が異なる場合がある。
天然ウイルス株とは、自然条件下で安定した「固有の表現型特性」（安定した遺伝性の生物学的、血清学的、及び／または分子的特性など）を有するため、認識可能な特定のウイルスの変異型である。このような「固有の表現型特性」とは、比較した参照ウイルスとは異なる生物学的特性、例えば、独特の抗原特性、宿主範囲（例えば、異なる種類の宿主に感染する）、株によって引き起こされる疾患の症状、この株によって引き起こされる異なる種類の疾患（例えば、異なる手段で伝播される）などである。「固有の表現型の特徴」は、臨床的に（例えば、その株に感染した宿主で検出される臨床症状）検出されてもよいし、またはウイルス学の専門家の当業者が、どの動物がどのウイルスに感染したかを知らず、また２つのウイルスの違いについての情報を持たずに、参照対照ウイルスに感染した動物と、新型株に感染した動物とを区別し得る比較動物実験内で検出し得る。重要なのは、ウイルス変異型はゲノム配列に単純な違いがあっても、認識できる明確なウイルス表現型が存在しない場合、別個の株ではないということである。ゲノム配列の変異の程度は、少数の変異から異なる表現型が生じる場合があるので、株としての変異型の分類には無関係である。
一例として、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのウイルス株変異型由来の抗原をコードするか、または野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではない少なくとも１つのウイルス株由来の変異を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｂ．１．１．７系統（英国）変異型（２０Ｂ／５０１Ｙ．Ｖ１ ＶＯＣ ２０２０１２／０１）に関連するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。Ｂ．１．１．７系統変異型は、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の５０１位に変異があり、アミノ酸のアスパラギン（Ｎ）がチロシン（Ｙ）に置き換えられている；Ｎ５０１Ｙ変異。さらに、この変異型には６９／７０欠失があり、これは自然発生的に何度も発生し、スパイクタンパク質の立体構造変化、Ｓ１／Ｓ２フューリン切断部位近くのＰ６８１Ｈ変異、及びＯＲＦ８の変異によって生じるＯＲＦ８終止コドン（Ｑ２７終止）を引き起こす。５０１．Ｖ２（南アフリカ、ＳＡ）変異型は、Ｎ５０１Ｙ及びＥ４８４Ｋを含むスパイクタンパク質に複数の変異を含むが、６９／７０に欠失はない。Ｅ４８４Ｋ変異は、ウイルスの抗原性を変化し得るように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体の少なくとも１つの形態と比較して「エスケープ」変異であると考えられている。発見された他の変異には、ウイルスの感染率を高めると考えられているＤ６１４Ｇ変異、及びＮ５４３Ｙ変異（オランダとデンマークのミンク農場から出現）が挙げられる。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、２つ以上の変異型に由来する変異（例えば、Ｂ．１．１．７及び５０２Ｙ．Ｖ２変異型に見られる変異の組み合わせ）を含む。
例示的な実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、５７、６０、及び６３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、５７、６０及び６３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質と比較した場合（それと配列した場合）１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、または５以下のアミノ酸の置換及び／または欠失を有する。コードされたスパイクタンパク質配列にわずかな変化が生じる場合、変異型は、好ましくは、参照スパイクタンパク質配列と同じ活性を有するか、及び／または例えば、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ））で決定されるとおり、参照スパイクタンパク質と同じ免疫特異性を有する。
コロナウイルスのＳタンパク質は、２つの重要な機能サブユニットに分けられ得、そのうち、Ｓタンパク質の球状頭部を形成するＮ末端Ｓ１サブユニット、及びタンパク質の茎を形成するＣ末端Ｓ２領域があり、ウイルスエンベロープに直接埋め込まれている。潜在的な宿主細胞と相互作用すると、Ｓ１サブユニットは、宿主細胞上の受容体、特にアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体を認識して結合するが、Ｓタンパク質の最も保存された成分であるＳ２サブユニットは、ウイルスのエンベロープを宿主細胞膜と融合させることを担う。（例えば、Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０２０ Ｍａｒ；１６（３）：ｅ１００８３９２．を参照のこと）。三量体Ｓタンパク質三量体の各モノマーには、付着及び膜融合をそれぞれ媒介する２つのサブユニットＳ１及びＳ２が含まれている。インビボでの感染プロセスの一部として、２つのサブユニットは酵素的切断プロセスによって互いに分離される。Ｓタンパク質は、感染細胞のＳ１／Ｓ２部位で、インビボで、フューリンを介した切断によって最初に切断され、その後のセリンプロテアーゼ媒介性切断事象が、Ｓ１内のＳ２’部位で起こる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２では、Ｓ１／Ｓ２切断部位は、アミノ酸６７６－ＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲ／ＳＶＡ－６８８にある（配列番号３５を参照のこと）。Ｓ２’切断部位は、アミノ酸８１１－ＫＰＳＫＲ／ＳＦＩ－８１８（配列番号６６）にある。
本明細書で使用される場合、例えば、本発明の核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質抗原を設計する文脈において、「Ｓ１サブユニット」（例えば、Ｓ１サブユニット抗原）という用語は、Ｓタンパク質のＮ末端で始まり、Ｓ１／Ｓ２ 切断部位で終わるスパイクタンパク質のＮ末端サブユニットを指し、一方で「Ｓ２サブユニット」（例えば、Ｓ２サブユニット抗原）という用語は、Ｓ１／Ｓ２切断部位で開始し、スパイクタンパク質のＣ末端で終わるスパイクタンパク質のＣ末端サブユニットを指す。上記のように、当業者は、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質Ｓ１またはＳ２サブユニットがそれぞれ受容体結合または膜融合に必要であるが、Ｓ１またはＳ２の構造及び／または配列において、特定量の変動が、スパイクタンパク質サブユニットに対する免疫応答を主に誘発しようとする場合、許容されることを理解する。例えば、コードされたサブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端由来の、例えば、１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質サブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原の１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）は、タンパク質（複数可）の抗原特性を変えることなく許容され得る。例示的な実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原は、配列番号２０、２３、２６、２９または３２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットは、構造及び機能によって容易に識別可能なドメインをさらに含み、これは、次に、核酸ワクチン、特に本発明のｍＲＮＡワクチンによってコードされる抗原を設計する際に特徴づけられ得る。Ｓ１サブユニット内のドメインには、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が挙げられ、このＲＢＤドメインはさらに、Ｓ２サブユニット内に受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を含み、ドメインには、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質テール（ＣＴ）としても公知の細胞質ドメインが挙げられる（Ｌｕ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． Ｍａｒ ２０２０，９４（７）ｅ００１２７－２０）。ＨＲ１及びＨＲ２ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の「融合コア領域」と呼ばれることもある（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２０２０ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｊａｎ；１７（１）：１－１２．）。Ｓ１サブユニットには、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、リンカー領域、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、第１のサブドメイン（ＳＤ１）、及び第２のサブドメイン（ＳＤ２）を含む。Ｓ２サブユニットには、とりわけ、第１のヘプタッドリピート（ＨＲ１）、第２のヘプタッドリピート（ＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質テールを含む。Ｓ１のＮＴＤ及びＲＢＤは、これらのドメインがベータコロナウイルス感染個体における中和抗体の標的であることが示されているので、本発明のワクチン設計アプローチのための優れた抗原である。本明細書で使用される場合、例えば、抗原設計（本発明のｍＲＮＡによってコードされ、例えば、本発明のｍＲＮＡワクチンから発現される前記抗原）の文脈において、「Ｎ末端ドメイン」または「ＮＴＤ」という用語は、配列番号３６として示されるアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質のＳ１サブユニットのアミノ酸１～２９０と同一性を有する、長さが約２９０アミノ酸を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット内のドメインを指す。本明細書で使用される場合、例えば、抗原設計（本発明のｍＲＮＡによってコードされ、例えば、本発明のｍＲＮＡワクチンから発現される前記抗原）の文脈において、「受容体結合ドメイン」または「ＲＢＤ」という用語は、配列番号３６として示されるアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質のＳ１サブユニットのアミノ酸３１６～５１７と同一性を有する、長さが約１７５～２２５のアミノ酸を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１サブユニット内のドメインを指す。本明細書で使用される場合、「受容体結合モチーフ」という用語は、ＡＣＥ２受容体に直接接触するＲＢＤの部分を指す。発現したＲＢＤは、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に対してその受容体として特異的に結合するか、及び／またはＲＢＤ結合及び／または中和抗体、例えば、ＣＲ３０２２と特異的に反応すると予測されている。いくつかの実施形態では、これらの抗原は、安定化２Ｐ変異を含む。
本明細書で提供される組成物は、いずれか１つ以上の全長または部分的（配列の短縮または他の欠失）Ｓタンパク質サブユニット（例えば、Ｓ１またはＳ２サブユニット）、Ｓタンパク質サブユニットの１つ以上のドメインまたはドメインの組み合わせ（例えば、ＮＴＤ、ＲＢＤ、またはＮＴＤ－ＲＢＤ融合体、ＳＤ１及び／またはＳＤ２が有無）、または全長もしくは部分的及びＳ２タンパク質サブユニットのキメラ、をコードし得るｍＲＮＡを含む。その他のＳタンパク質サブユニット及び／またはドメイン構成は、本明細書で企図されている。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（配列番号３６）と比較して以下の変異のうちの少なくとも１つを有する抗原をコードする：Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ５０１Ｙ、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ａ７０１Ｖ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ８６１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、列挙された変異の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４すべてを有する抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質配列（配列番号３６）に対して１つ以上の欠失を有する抗原をコードする。欠失の例としては、限定するものではないが、位置６９、７０、１４４、及び２４２～２４４が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１、２、３、４、５、または６個の欠失を有する抗原をコードする。いくつかの実施形態では、抗原をコードするｍＲＮＡは、１、２、３、４、５、または６個の欠失、及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個、もしくは１４個の変異、またはそれらの任意の組み合わせを有する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、異なる抗原をコードする１、２、３、４、５、または６個のｍＲＮＡを含み、各抗原は少なくとも１つの変異及び／または少なくとも１つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質抗原またはその抗原性フラグメントをコードするｍＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子中にある（すなわち、脂質ナノ粒子は、異なる抗原をコードする１、２、３、４、５、または６個のｍＲＮＡを含む）。
いくつかの態様では、本開示の組成物は、少なくとも以下を含む：第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１のｍＲＮＡ、及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のｍＲＮＡ。いくつかの実施形態では、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸の変異、欠失、またはアミノ酸変異と欠失の両方を有するアミノ酸配列を有し、ここで、この第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない。いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。いくつかの実施形態では、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。本明細書で使用される「流行ウイルス」とは、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月間、９か月、１０か月、１１か月、一年の一部、１年、１年半、２年、３年以上、集団内で伝播している流行下にあるウイルスを指す。本明細書で使用される場合、「集団」とは、対象の群を指す。いくつかの実施形態では、集団とは、世界的な集団である。いくつかの実施形態では、集団は地理的に限定される（例えば、アフリカの集団、ヨーロッパの集団）、または地域的に限定される（例えば、南半球の集団）。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第３のｍＲＮＡを含み、ここでこの第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１及び／または第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第４のｍＲＮＡを含み、ここでこの第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１、第２及び／または第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第５のｍＲＮＡを含み、ここでこの第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１、第２、第３及び／または第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第６のｍＲＮＡを含み、ここでこの第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、第１、第２、第３、第４及び／または第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この第１の抗原及び第２の抗原、ならびに任意選択で第３、第４、第５及び第６の抗原は、それぞれ、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を互いに共有する抗原である。
いくつかの実施形態では、第１の抗原と第２の抗原はスパイクタンパク質の抗原である。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び／または第６の抗原は、スパイクタンパク質の抗原である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、組成物中に等しい量（例えば、１：１の重量／重量比または１：１のモル比）、例えば、１：１（：１：１：１：１）という異なるコロナウイルス抗原をコードするｍＲＮＡの比で存在する。本明細書で使用される場合、「重量／重量比」または重量／重量比または重量：重量比とは、異なる成分の重量（質量）間の比を指す。「モル比」とは、異なる成分間の比（例えば、各抗原をコードするｍＲＮＡの数）を指す。いくつかの実施形態では、比率は１：１、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、または４：１（第１のｍＲＮＡ：第２のｍＲＮＡ）である。本発明の各実施形態または態様において、特徴的なワクチンには、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡが含まれることが理解される。それぞれの固有のｍＲＮＡを独自のＬＮＰにカプセル化することは可能であるが、ｍＲＮＡワクチン技術では、単一のＬＮＰ生成物に複数のｍＲＮＡをカプセル化できるという大きな技術的利点を享受する。他の実施形態では、ワクチンは、同時製剤化されない別個のワクチンであるが、投与前に別々に混合してもよいし、または単に別々に投与してもよい。
第２のｍＲＮＡ（及び／または第３、第４、第５、または第６のｍＲＮＡ）によってコードされる変異されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、いくつかの実施形態では、第１のウイルス中の対応する機能とは量または種類が異なるウイルスの機能と関連している。例示的な機能としては、限定するものではないが、ＡＣＥ２受容体結合、ウイルス伝播性、ウイルス取り込み、ウイルス病因、フリン切断の変化、またはウイルス複製が挙げられる。これらの機能はウイルスの病原性に関係する。
本開示の組成物のコロナウイルス抗原及びコロナウイルス抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型抗原）をコードするＲＮＡの例示的な配列を表１に示す。一部の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、配列番号１８、２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１及び６４から選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、５７、６０、及び６３から選択される配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、２番目またはその後に流行するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、新興株に由来する免疫優性抗原である。新興株の免疫優性抗原は、元の株またはその他の変異型などのウイルスの異なる株と比較して、抗原が由来する株に関して評価される。新興株の免疫優勢抗原は、別の株に対するよりも新興株に対してより強い免疫応答を誘導する。
いくつかの実施形態では、２回目以降の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、懸念される変異株（ＶＯＣ）に由来する免疫優性抗原である。ＶＯＣの免疫優性抗原を、元の株またはその他の変異型などのウイルスの異なる株と比較して、抗原が由来する株に関して評価する。いくつかの実施形態では、ＶＯＣとは、例えば、ウイルスの元の株または他の変異型と比較して、伝染性の増大、罹患率の増大、死亡率の増大、「ロング（ｌｏｎｇ）ＣＯＶＩＤ」（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の急性期後の後遺症）のリスクの増大、診断検査による検出を回避する能力、抗ウイルス薬に対する感受性の低下、中和抗体に対する感受性の低下、自然免疫を回避する能力、ワクチン接種を受けた個体に感染する能力、特定の状態（例えば、多系統炎症性症候群）のリスクの増大、及び特定の人口統計または臨床群（例えば、小児、免疫不全患者など）に対する親和性の増大を示し得る。
核酸
本開示の組成物は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（少なくとも１つの）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはさらに、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、及び／または５’キャップアナログを含む。
本開示のコロナウイルスワクチンは、任意の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３’ＵＴＲを含み得ることも理解されたい。例示的なＵＴＲ配列は、配列番号２、４、３３及び３４を含む；しかし、他のＵＴＲ配列を使用しても、本明細書に記載の任意のＵＴＲ配列と交換してもよい。いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号３３（ＧＧＧＡＡＡＵＡ ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）及び配列番号２（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号３４（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵ ＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）及び配列番号４（ＵＧＡＵＡＡ ＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）から選択される配列を含む。また、ＵＴＲは、本明細書で提供するＲＮＡポリヌクレオチドから省いてもよい。
核酸は、ヌクレオチド（ヌクレオチド単量体）のポリマーを含む。したがって、核酸はポリヌクレオチドとも呼ばれる。核酸は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡであって、例としては、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、及び／またはこれらのキメラ及び／または組み合わせであってもよく、これらを含んでもよい。
「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、（少なくとも１つの）タンパク質（アミノ酸の天然、非天然、または修飾ポリマー）をコードする任意のＲＮＡであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｅｘ ｖｉｖｏで翻訳されてコードされたタンパク質を産生し得る。別段の記載がある場合を除き、本出願に記載の核酸配列が代表的なＤＮＡ配列内で「Ｔ」を列挙し得るが、配列が、ｍＲＮＡに相当する場合、「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられることを、当業者であれば理解しよう。したがって、本明細書で開示され、特定の配列識別番号によって特定される任意のＤＮＡは、そのＤＮＡに相補的な対応するｍＲＮＡ配列も開示しており、その場合、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられる。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧ、もしくはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続的なストレッチである。ＯＲＦは、典型的にはタンパク質をコードする。本明細書に開示する配列はさらに、追加のエレメント（例えば、５’及び３’ＵＴＲ）を含んでもよいが、これらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のＲＮＡポリヌクレオチドには必ずしも存在する必要はないことが理解されよう。
変異型（変異株）
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原変異型をコードするＲＮＡを含む。抗原変異型または他のポリペプチド変異型は、野生型、ネイティブ、または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。抗原／ポリペプチド変異型は、ネイティブ配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原変異型の例は、表１に示される。通常、変異型は、野生型、ネイティブ、または参照配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、変異型は、野生型、ネイティブ、または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
本開示の核酸によってコードされる変異型抗原／ポリペプチドは、多数の望ましい特性、例えば、その免疫原性を強化する、その発現を強化する、及び／または対象におけるその安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する特性のうちのいずれかを付与するアミノ酸変化を含んでもよい。変異型抗原／ポリペプチドは、慣用的な変異誘発技術を用いて作製し、適宜アッセイして、所望の特性を有するか否かを決定し得る。発現レベル及び免疫原性を決定するためのアッセイは、当技術分野で周知であり、そのようなアッセイの例は実施例のセクションに記載されている。同様に、タンパク質変異型のＰＫ／ＰＤ特性も、当該技術分野で認識されている技術を用いて（例えば、ワクチン接種した対象内の抗原の発現を経時的に評価することにより、及び／または誘導された免疫応答の持続性を確認することにより）測定し得る。変異型核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性時の安定性を分析することによって測定してもよいし、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を用いて測定してもよい。このような実験及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価のための方法は、当技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供する配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡもしくはＲＮＡ ＯＲＦを含むか、または本明細書で提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係であって、この配列を比較することにより決定される関係を指す。同一性とはまた、配列間または配列同士の配列関連性の程度も指し、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の鎖間の一致数によって決定される。同一性とは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって対処される、ギャップアラインメント（もしあれば）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全な一致の割合を測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、公知の方法によって容易に計算され得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）」とは、当該配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成した後の第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一の、アミノ酸または核酸の候補配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージと定義される。該アラインメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当技術分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、該計算に導入されるギャップ及びペナルティによって値が異なり得ることが理解される。概して、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）の変異型は、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対し、本明細書に記載され当業者に知られている配列アラインメントプログラム及びパラメーターによる決定において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であり、ただし１００％未満の配列同一性を有する。このようなアラインメント用のツールとしては、ＢＬＡＳＴスイート（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のものが挙げられる。別のよく知られたローカルアラインメント技術は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）を基にしている。動的計画法に基づく一般的なグローバルアラインメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。より最近では、Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されており、これは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含めた他の最適グローバルアラインメント法よりも速く、ヌクレオチド及びタンパク質配列の全体的なアラインメントを意図的に生成する。
そのため、参照配列、特に本明細書で開示するポリペプチド（例えば、抗原）配列に関する置換、挿入、及び／または付加、欠失、及び共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸（例えば、１つ以上のリジン）をペプチド配列に（例えば、そのＮ末端またはＣ末端に）付加してもよい。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在のために使用され得る。リジンは、ペプチドの溶解性を増大させるために、またはビオチン化を可能にするために使用され得る。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、短縮配列をもたらしてもよい。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、代替的に、配列の用途に応じて欠失させてもよい（例えば、溶解性である、より大きな配列の一部としてのまたは固体支持体に結合した配列の発現）。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）などのための（またはこれらをコードする）配列は、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置き換えてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することにより、充填して安定性を改善してもよい。他の実施形態では、埋もれた水素結合ネットワークを疎水性残基により置き換えて、安定性を改善し得る。また他の実施形態では、グリコシル化部位を除去し、適切な残基で置き換えてもよい。このような配列は、当業者には容易に識別可能である。また、本明細書で提供する配列のいくつかは、例えば、ｍＲＮＡワクチンの調製で使用する前に、欠失させ得る配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含むことも理解されたい。
当業者には認識されるように、タンパク質フラグメント、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、目的コロナウイルス抗原の範囲内であると考えられる。例えば、本明細書では、参照タンパク質の任意のタンパク質フラグメント（参照抗原配列より少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）であって、ただし、このフラグメントは、免疫原性であり、コロナウイルスに対する防御免疫応答を付与することを条件とする、タンパク質フラグメントを提供する。参照タンパク質と同一であるが短縮されている変異型に加えて、いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書で提供または言及する任意の配列に示されるように２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。抗原／抗原ポリペプチドの長さは、約４、６、または８アミノ酸から全長タンパク質までの範囲をとり得る。
安定化エレメント
天然真核生物ｍＲＮＡ分子は、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）テールなどの他の構造的特徴に加えて、限定されるものではないが、その５’末端（５’ＵＴＲ）及び／または３’末端（３’ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、安定化エレメントを含み得る。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲは両方とも、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾を有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、少なくとも１つの５’末端キャップを含み、脂質ナノ粒子内で製剤化される。ポリヌクレオチドの５’－キャップは、以下の化学ＲＮＡキャップアナログ：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応中に同時に完了させて、製造業者のプロトコールに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成してもよい（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’－キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了させて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成し得る（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を用いて生成して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて終わりから３番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて終わりから４番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。酵素は、組み換え供給源に由来し得る。
３’－ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドの連なりである。いくつかの場合において、最長約４００のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。
いくつかの実施形態では、組成物は安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａのタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと関連している。その発現レベルは細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、ヒストンのステムループとの結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対し少なくとも３つのヌクレオチド５’及び２つのヌクレオチド３’を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域と、少なくとも１つのヒストンステムループと、任意選択でポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルとを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを強化するはずである。コードされたタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）でもなく、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））でもない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組合せであって、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的にも作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増大させる組み合わせを含む。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組合せによる相乗効果は、エレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、天然に存在するステムループの３’にある約１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドのストレッチを含み、これはヒストンプレｍＲＮＡから成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ ｓｎＲＮＡの結合部位に相当する。いくつかの実施形態では、この核酸はイントロンを含まない。
ｍＲＮＡは、エンハンサー及び／またはプロモーター配列を含んでも含まなくてもよく、これらは、修飾されても修飾されなくてもよく、活性化されても活性化されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、概してヒストン遺伝子に由来し、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または全体的に逆相補的な配列の分子内塩基対を含み、これがこの構造のループを形成する。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれとも塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡに存在する場合が多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、概して、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対（非ワトソン・クリック型塩基対）が生じることがある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５ヌクレオチドの長さを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のＡＵリッチの配列が除去されている。これらの配列（ＡＵＲＥＳと称されることがある）は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチン中に残存していてもよい。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、組成物は、コロナウイルス抗原と融合したシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有するｍＲＮＡを含む。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端側の１５～６０アミノ酸を含み、典型的には、分泌経路上の膜を横断した転位に必要であるので、真核生物及び原核生物の両方でほとんどのタンパク質が分泌経路に侵入するのを普遍的に制御している。真核生物において、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、プロセシングのために、成長ペプチド鎖の膜横断輸送を開始する。ＥＲプロセシングにより成熟タンパク質が生成され、シグナルペプチドは、典型的には、宿主細胞のＥＲ常駐シグナルペプチダーゼにより、前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されないまま保たれ、膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化も促進し得る。
シグナルペプチドの長さは、１５～６０アミノ酸であり得る。例えば、シグナルペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドの長さは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長である。
異種遺伝子由来のシグナルペプチド（事実上コロナウイルス抗原以外の遺伝子の発現を調節する）が当該技術分野で公知であり、これを所望の特性について試験し、次いで本開示の核酸に組み込んでもよい。
融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、抗原性融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。したがって、コードされた抗原（複数可）は、リンカーが有無で一緒に結合された２つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質フラグメント）を含み得る。あるいは、タンパク質抗原が融合しているタンパク質は、それ自体に対する強力な免疫応答を促進するのではなく、コロナウイルス抗原に対する強力な免疫応答を促進する。抗原融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、各々の起源のタンパク質由来の機能的特性を保持している。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質由来の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質由来のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではないウイルスに由来し得る。例えば、膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞表面に効果的に固定することが実証されている、インフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインに由来し得る。
足場部分
本明細書で提供されるｍＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、お互いに、または足場ドメインに連結されたコロナウイルス抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような足場部分は、本開示の核酸によってコードされる抗原に所望の特性を付与する。例えば、足場タンパク質は、例えば、抗原の構造を変更すること、抗原の取り込み及びプロセシングを変更すること、及び／または抗原を結合パートナーに結合させることによって、抗原の免疫原性を改善し得る。
いくつかの実施形態では、足場部分は、高度に対称性、安定性、構造的に組織化されたタンパク質ナノ粒子に自己集合し得るタンパク質であり、直径は１０～１５０ｎｍであり、免疫系の種々の細胞との最適な相互作用に非常に適したサイズ範囲である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質またはウイルス様粒子を使用して、安定なナノ粒子構造を形成し得る。このようなウイルスタンパク質の例は当技術分野で公知である。例えば、いくつかの実施形態では、足場部分はＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは、平均直径が約２２ｎｍの球状粒子を形成するが、この粒子には核酸が含まれていないため、非感染性である（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（２０１６）５８－６８）。いくつかの実施形態では、足場部分は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）であり、自己集合して直径２４～３１ｎｍの粒子となり、ＨＢＶ感染ヒト肝臓から得られるウイルスコアに似ている。生成されたＨＢｃＡｇは自己集合して、１８０または２４０個のプロトマーに相当する、直径３００Å及び３６０Åの２種類の異なるサイズのナノ粒子になる。いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原を、ＨＢｓＡＧまたはＨＢｃＡＧに融合させて、コロナウイルス抗原を表示するナノ粒子の自己集合を促進する。
いくつかの実施形態では、細菌タンパク質プラットフォームが使用され得る。これらの自己組織化タンパク質の非限定的な例としては、フェリチン、ルマジン、及びエンカプスリンが挙げられる。
フェリチンはタンパク質であり、その主な機能は細胞内の鉄の貯蔵である。フェリチンは二十四（２４）個のサブユニットで構成されており、各サブユニットは、正八面体対称性を有する四次構造に自己組織化する４つのアルファヘリックスバンドルで構成されている（Ｃｈｏ Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８）。フェリチンのいくつかの高分解能構造が決定されており、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のフェリチンは２４個の同一のプロトマーで構成されていることが確認されており、一方、動物ではフェリチンの軽鎖と重鎖が存在し、それらが単独でアセンブルし得るか、または、異なる比率で結合して２４個のサブユニットの粒子を形成し得る（Ｇｒａｎｉｅｒ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１；Ｌａｗｓｏｎ Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、ロバストな熱的及び化学的安定性を備えたナノ粒子に自己アセンブルする。したがって、フェリチンナノ粒子は、抗原を運び、抗原を露出させるのによく適している。
ルマジンシンターゼ（ＬＳ）も、抗原ディスプレイ用のナノ粒子プラットフォームとしてよく適している。ＬＳ（ルマジンシンテターゼ）とは、リボフラビンの生合成の最後から２番目の触媒ステップを担う、古細菌、細菌、真菌、植物、及び真正細菌などの広範な種々の生物体に存在する、酵素である（Ｗｅｂｅｒ Ｓ．Ｅ．Ｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４）． ＬＳ（ルマジンシンテターゼ）モノマーは１５０アミノ酸の長さであり、隣接するタンデムアルファヘリックスのベータシートからなる。ＬＳについては、多数の異なる四次構造が報告されており、その形態学的多様性を示している（ホモ五量体から、直径１５０Åのキャプシドを形成する１２個の五量体の対称アセンブリまで）。１００を超えるサブユニットのＬＳケージさえも記載されている（Ｚｈａｎｇ Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００６；３６２：７５３－７７０）。
好熱菌サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）から単離された新規タンパク質ケージナノ粒子であるエンカプスリンも、自己集合ナノ粒子の表面に抗原を提示するためのプラットフォームとして使用され得る。エンカプスリンは、薄い正二十面体のＴ＝１対称ケージ構造（内径及び外径がそれぞれ２０ｎｍと２４ｎｍを有する）を有する同一の３１ｋＤａモノマーの６０コピーからアセンブルされる（Ｓｕｔｔｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８，１５：９３９－９４７）。Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａにおけるエンカプスリンの正確な機能はまだ明確に理解されていないが、その結晶構造は最近解明され、その機能は、ＤｙＰ（色素脱色ペルオキシダーゼ）及びＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）（酸化ストレス応答に関与している）などのタンパク質をカプセル化する細胞内コンパートメントとして仮定された（Ｒａｈｍａｎｐｏｕｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１３；２８０：２０９７－２１０４）。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、フォールドンドメインに融合されたコロナウイルス抗原をコードする。フォールドンドメインは、例えば、バクテリオファージＴ４フィブリチンから得てもよい（例えば、Ｔａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９７ Ｊｕｎ １５；５（６）：７８９－９８を参照のこと）。
リンカーと切断可能なペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、本明細書では融合タンパク質と呼ばれる、２つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも１つまたは各ドメインの間に位置するリンカーをさらにコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーであっても、またはプロテアーゼ感受性リンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと呼ばれる自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当技術分野で記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１８５５６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳリンカーである（配列番号６７）。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、介在リンカーを有する３つのドメインを含み、ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメインの構造を有する。
当技術分野で公知である切断可能なリンカーを本開示に関連して使用してもよい。このようなリンカーの例としては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカーが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１７１２７７５０を参照のこと）。当業者は、他の当技術分野で認識されているリンカーが、本開示の構築物（例えば、本開示の核酸によってコードされる）での使用に適している場合があることを理解するであろう。当業者は同様に、他のポリシストロン性構築物（同じ分子内で複数の抗原／ポリペプチドを別々にコードするｍＲＮＡ）が、本明細書に提供される使用に適している場合があることを理解するであろう。
配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化の方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本明細書で提供する配列のいずれか１つ以上のＯＲＦがコドン最適化されてもよい。いくつかの実施形態では、コドン最適化を用いて、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確保するか；ＧＣ含量にバイアスをかけてｍＲＮＡの安定性を増大するか、もしくは二次構造を低減するか；遺伝子構成もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンもしくは塩基の連続を最小にするか；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするか；タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去するか；コードされるタンパク質内の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加するか；タンパク質ドメインを付加、除去、もしくはシャッフルするか；制限酵素認識部位を挿入もしくは欠失させるか；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するか；翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれるようにするか；またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは取り除いてもよい。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）からのサービス、及び／または独自方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列ＯＲＦ（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされるコロナウイルス抗原と免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）抗原をコードする。
修飾ｍＲＮＡは、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞による発現が可能である。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡとは、Ｇ／Ｃのレベルが増強されたＲＮＡであってもよい。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増大したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含むＲＮＡより機能的に安定し得る。例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含む医薬組成物を開示している。遺伝暗号には縮重があるため、この修飾は、得られるアミノ酸を変更することなく、既存のコドンをＲＮＡの安定性をさらに高めるコドンに置換することによってなされる。このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。
化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なヌクレオシド残基、例えば、転写ＲＮＡ内に存在する残基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なデオキシリボヌクレオシド、例えば、ＤＮＡ内に存在するデオキシリボヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ））を含む。
化学修飾
本開示の組成物は、いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含み、この核酸は、標準的（非修飾）であっても当該技術分野で知られているように修飾されてもよいヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。このような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよく、または天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよい。このような修飾は、当技術分野で認識されているヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、当技術分野で一般に公知であるか、または認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、とりわけ、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の非天然の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、当技術分野で一般的に公知であるか、または認識されているものである。このような非天然の修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、とりわけ、公開された米国特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１号、または第ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７号（これらの全てが参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（２つ以上の）異なるタイプの標準及び／または修飾のヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意に異なる）タイプの標準的及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物において分解の減少を示す。
いくつかの実施形態では、細胞または生物内に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準のヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸に比べて、それぞれ細胞または生物内での免疫原性が低減し得る（例えば、自然応答が低減する）。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、核酸の合成中または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成によって導入してもよいし、またはポリメラーゼ酵素を用いて鎖の末端もしくは鎖中の任意の場所に導入してもよい。核酸のいずれの領域も化学的に修飾されてもよい。
本開示は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸のようなＲＮＡ核酸）の修飾のヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、ヌクレオシドが連結した領域（複数可）を含み得る。そのような領域は、様々な骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾の塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸の場合のような、非標準塩基と標準塩基との間、または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合が可能になる。このような非標準的塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）中の修飾された核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）中の修飾された核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、前述の任意の修飾核酸塩基（限定されるものではないが、化学修飾を含む）のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、核酸は、１－メチル－シュードウリジンで一様に修飾され得、つまり、このｍＲＮＡ配列の全てのウリジン残基が１－メチル－シュードウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、配列中に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基を、上記のものなどの修飾残基で置き換えることによって一様に修飾され得る。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。例えば、本開示の核酸内、またはその所定の配列領域内（例えば、ポリ（Ａ）テールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つ以上または全てまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）が一様に修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）内の全てのヌクレオチドＸが、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つであってもよく、または以下の組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであってもよい。
核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含量に関して、または１つ以上のタイプのヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣの１つ以上）に関して）、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含んでもよい。任意の残りのパーセンテージは、修飾されていないＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって決まることが理解されよう。
ｍＲＮＡは、最小１％から最大１００％までの修飾ヌクレオチド、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸内のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよいし、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、核酸内のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよいし、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが少なくとも１つの目的抗原をコードするように設計されている場合、核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含んでもよい。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始点から始まり開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない。一方、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節的な役割について、多くの証拠が相次いでいる。ＵＴＲの調節機能は、特に分子の安定性を高めるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない臓器部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方調節の制御を確保するための特定の機能も組み込んでもよい。様々な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が当技術分野において知られており、利用可能である。
５’ＵＴＲとは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（ノンコーディングである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす機能を有する。これらは、Ｋｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを保有し、この配列は、多くの遺伝子の翻訳をリボソームが開始するプロセスに関与することが一般的に公知である。Ｋｏｚａｋ配列は、共通のＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号３７）を有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、開始コドンの後には別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連する自然界で見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲであり、すなわち、自然界には存在しない。合成ＵＴＲとしては、その特性を改善する（例えば、遺伝子発現を増大する）ために変異させたＵＴＲ、及び完全に合成のＵＴＲが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号）、ヒトシトクロムｂ－２４５ ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号）が挙げられる。ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子（米国特許第２０１４０２０６７５３号、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号３８）（ＷＯ２０１４１４４１９６）も使用してもよい。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ／２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０２４６６７；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。
いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号２及び配列番号３３から選択される配列を含む。
３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（ノンコーディングである）。天然または野生型の３’ＵＴＲは、アデノシン及びウリジンのストレッチがそこに埋め込まれていることが公知である。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。配列の特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は３つのクラスに分類することができ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）、クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含む。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤには、クラスＩのＡＲＥが含まれている。クラスＩＩのＡＲＥは２つ以上重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを保有する。このタイプのＡＲＥを含む分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩのＡＲＥはそれほど十分には定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含まない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎは、このクラスのなかでも十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合する大部分のタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増大させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに組み込むと、ＨｕＲ結合が生じ、これによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのメッセージが安定になる。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性を調節してもよい。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少させ得る。同様に、ＡＲＥを同定し、除去または変異させることで細胞内の安定性を高め、結果として得られるタンパク質の翻訳及び生産を高め得る。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して関連する細胞株で行ってもよく、トランスフェクション後の様々な時点でタンパク質産生をアッセイし得る。例えば、細胞にさまざまなＡＲＥエンジニアリング分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを使用して関連タンパク質にトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に生成されたタンパク質をアッセイしてもよい。
当業者であれば、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列と共に使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲを、合成３’ＵＴＲと、異種３”ＵＴＲと共に使用してもよい。
非ＵＴＲ配列も核酸内の領域またはサブ領域として使用してもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を本開示の核酸に組み込んでもよい。イントロン配列を組み込むと、タンパク質の産生及び核酸の発現レベルを高めることができる。
機構の組み合わせを隣接領域に含めてもよく、他の機構の中に含めてもよい。例えば、ＯＲＦには、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含み得る５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールを鋳型的に付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲが隣接してもよい。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なる遺伝子由来の第１のポリヌクレオチドフラグメント及び第２のポリヌクレオチドフラグメントを含み得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５’ＵＴＲ）。
任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲを核酸の領域に組み込んでもよいことを理解されたい。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域の変異型ではない人工ＵＴＲを提供することも本開示の範囲内である。ＵＴＲまたはその一部は、それらが選択された転写産物と同じ方向に配置されてもよく、方向または位置を変更されてもよい。したがって、５’及び／または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長、または１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと組み合わされてもよい。本明細書で使用される場合、ＵＴＲ配列に関して「変更された」という用語は、このＵＴＲが参照配列に対して何らかの形で変更されていることを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上記で教示される方向もしくは位置の変化によって、野生型もしくは天然のＵＴＲに対して変更されてもよいし、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの削除、ヌクレオチドの交換または転置によって変更されてもよい。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）を生成するこれらの変化はいずれも、変異型ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重または四重ＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用される場合、「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが連続して、または実質的に連続してコードされるものである。例えば、二重ベータグロビン３’ＵＴＲは、米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載されているように使用してもよく、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
パターン化されたＵＴＲを有することも本開示の範囲内である。本明細書で使用される場合、「パターン化されたＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、またはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、または３回を超えて繰り返されるそれらの変形などの、繰り返しまたは交互のパターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字 Ａ、Ｂ、またはＣはヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
いくつかの実施形態では、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織、または発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属している場合がある。任意のこれらの遺伝子由来のＵＴＲを、同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新しい核酸を作成してもよい。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味では、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起源、または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドのグループを指すために使用される。
非翻訳領域には、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）も含まれてもよい。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野で公知のＴＥＥが挙げられる。
非コード配列
本開示の態様は、ｍＲＮＡ、例えば、それぞれがコロナウイルス抗原ポリペプチドをコードする別個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む２～１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む多価ＲＮＡ組成物に関し、各ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、固有の識別子配列（非コード配列）を有する非翻訳領域（ＵＴＲ）に１つ以上の非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、非コード配列は、固有の非コード配列である。いくつかの実施形態では、多価ワクチン組成物中の各ｍＲＮＡは、それ自体の固有の非コード配列を含む。本明細書で使用する場合、「非コード配列」とは、別の生体分子がその配列と結合したときに他の生体分子を識別するように機能する、生体分子（例えば、核酸、タンパク質など）の配列を指す。典型的には、非コード配列は、標的生体分子の配列内に組み込まれるか、またはそれに付加され、目的の標的分子を同定するための参照として利用される異種配列である。いくつかの実施形態では、非コード配列は、標的核酸内に組み込まれるか、標的核酸に付加され、標的核酸を同定するための参照として利用される核酸（例えば、異種核酸または合成核酸）の配列である。いくつかの実施形態では、非コード配列は、式（Ｎ）ｎの配列である。いくつかの実施形態では、ｎは、５～２０、５～１０、１０～２０、７～２０、または７～３０の範囲の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、各Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、及びＣまたはそのアナログから独立して選択されるヌクレオチドである。したがって、いくつかの実施形態は、（ｉ）目的の標的配列（例えば、コード配列（例えば、抗原タンパク質または抗原ポリペプチドをコードする））を有する核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含み；及び（ｉｉ）固有の非コード配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のインビトロ転写されたｍＲＮＡは、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの非翻訳領域（ＵＴＲ）に１つ以上の非コード配列を含む。ｍＲＮＡのＵＴＲに非コード配列が含まれると、非コード配列がペプチドに翻訳されることが防止される。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールの下流（例えば、後ろ）に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのＯＲＦの最後のコドンとｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間に位置する。いくつかの実施形態では、ＵＴＲに位置するポリヌクレオチド非コード配列は、１～１０ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド非コード配列を含むＵＴＲは、ＲＮａｓｅ Ｈ切断部位などの１つ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）のＲＮＡｓｅ切断部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物のそれぞれの異なるＲＮＡは、異なる（例えば、固有の）非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物のＲＮＡは、ＲＮＡのポリヌクレオチド非コード配列に従って検出及び／または精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ非コード配列を使用して、ｍＲＮＡの存在を同定するか、またはサンプル（例えば、反応生成物または医薬品）中の異なるｍＲＮＡの相対比を決定する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ非コード配列は、ディープシーケンシング、ＰＣＲ、及びサンガーシーケンシングのうちの１つ以上を使用して検出される。非コード配列の例としては、以下が挙げられる：ＡＡＣＧＵＧＡＵ；ＡＡＡＣＡＵＣＧ；ＡＴＧＣＣＵＡＡ；ＡＧＵＧＧＵＣＡ；ＡＣＣＡＣＵＧＵ；ＡＣＡＵＵＧＧＣ；ＣＡＧＡＵＣＵＧ；ＣＡＵＣＡＡＧＵ；ＣＧＣＵＧＡＵＣ；ＡＣＡＡＧＣＵＡ；ＣＵＧＵＡＧＣＣ；ＡＧＵＡＣＡＡＧ；ＡＡＣＡＡＣＣＡ；ＡＡＣＣＧＡＧＡ；ＡＡＣＧＣＵＵＡ；ＡＡＧＡＣＧＧＡ；ＡＡＧＧＵＡＣＡ；ＡＣＡＣＡＧＡＡ；ＡＣＡＧＣＡＧＡ；ＡＣＣＵＣＣＡＡ；ＡＣＧＣＵＣＧＡ；ＡＣＧＵＡＵＣＡ；ＡＣＵＡＵＧＣＡ；ＡＧＡＧＵＣＡＡ；ＡＧＡＵＣＧＣＡ；ＡＧＣＡＧＧＡＡ；ＡＧＵＣＡＣＵＡ；ＡＵＣＣＵＧＵＡ；ＡＵＵＧＡＧＧＡ；ＣＡＡＣＣＡＣＡ；ＧＡＣＵＡＧＵＡ；ＣＡＡＵＧＧＡＡ；ＣＡＣＵＵＣＧＡ；ＣＡＧＣＧＵＵＡ；ＣＡＵＡＣＣＡＡ；ＣＣＡＧＵＵＣＡ；ＣＣＧＡＡＧＵＡ；ＡＣＡＧＵＧ；ＣＧＡＵＧＵ；ＵＵＡＧＧＣ；ＡＵＣＡＣＧ；及びＵＧＡＣＣＡ。
いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物は、以下：
（ａ）第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子、第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコード化する線状化された第２のＤＮＡ分子、及び任意選択で、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０のＤＮＡ分子を単一の反応容器に組み合わせることであって、この第１のＤＮＡ分子、第２のＤＮＡ分子、及び第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０番目のＤＮＡ分子は異なる供給源から得られることと；と
（ｂ）線状化された第１のＤＮＡ分子、線状化された第２のＤＮＡ分子、及び任意の線状化された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０のＤＮＡ分子を同時にインビトロ転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む方法によって生成される。異なる供給源は、共培養され得ない細菌細胞培養物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＶＴの開始前に反応混合物中に存在する第１、第２及び第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０のＤＮＡ分子の量は正規化されている。
ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）システムを用いて転写され得る。ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は当該技術分野で公知であり、国際公開第ＷＯ／２０１４／１５２０２７号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０５３２０９及びＷＯ ２０１９／０３６６８２（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法のいずれか１つ以上に従って調製される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡ転写産物を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で、増幅されていない直鎖化されたＤＮＡ鋳型を用いて生成される。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、限定されるものではないが、コロナウイルスｍＲＮＡ）の逆転写によって形成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ－１細胞を、プラスミドＤＮＡ鋳型を用いてトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞を、プラスミドＤＮＡを複製するために培養して、次いで単離及び精製する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、目的遺伝子の５’側に位置し、目的遺伝子に作動可能に連結されているＴ７プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、この鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。
「５’非翻訳領域」ＵＴＲとは、ポリペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写産物が生成されている場合、５’ＵＴＲはプロモーター配列を含み得る。このようなプロモーター配列は、当技術分野で知られている。本開示のワクチンにはこのようなプロモーター配列が存在しないことを理解されたい。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない終止コドン（すなわち、翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のからすぐ下流（すなわち３’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
オープンリーディングフレームとは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続的なストレッチであり、ポリペプチドをコードする。
「ポリ（Ａ）テール」とは、複数の連続したアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ポリ（Ａ）テールは、（例えば、細胞質での）酵素分解からｍＲＮＡを保護し、転写終結、及び／または核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助するように機能する。
いくつかの実施形態では、核酸は、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮＡｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。
ＮＴＰは社内で製造してもよく、供給業者から選択してもよく、あるいは本明細書に記載されるように合成してもよい。ＮＴＰは、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択してもよいが、これらに限定されない。
多数のＲＮＡポリメラーゼまたは変異型を本開示の方法で使用し得る。ポリメラーゼは、限定するものではないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及び／または変異体ポリメラーゼ、例えば、限定するものではないが、化学的に修飾された核酸及び／またはヌクレオチドを含む、修飾された核酸及び／または修飾されたヌクレオチドを組み込み得るポリメラーゼから選択され得る。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介しキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。
化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造してもよい。核酸の固相化学合成は、分子を固体支持体上に固定し、反応溶液中で段階的に合成する自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。
液相化学合成。モノマービルディングブロックの連続添加による本開示の核酸の合成は、液相で実施され得る。
合成法の組み合わせ。上記で考察した合成方法には、それぞれ独自の利点及び制限がある。その制限を克服するために、これらの方法を組み合わせる試みが行われている。そのような方法の組み合わせは、本開示の範囲内である。固相または液相化学合成と酵素ライゲーションを併用すると、化学合成だけでは得ることができない長鎖核酸を精製する効率的な方法が提供される。
核酸領域または部分領域のライゲーション
リガーゼによる核酸の組み立ても使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介して、ポリヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチド及び／または環状核酸などの核酸は、１つ以上の領域または部分領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡフラグメントをリガーゼ触媒反応によって結合させて、異なる機能を有する組み換えＤＮＡを生成し得る。２つのオリゴデオキシヌクレオチド（５’ホスホリル基を含むもの及び遊離３’ヒドロキシル基を含むもの）がＤＮＡリガーゼの基質として機能する。
精製
本明細書に記載の核酸の精製には、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣベースの精製方法、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などの当技術分野で知られている方法によって実施し得る。「精製された」という用語は、「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」とは、別の不適切なもの、不純なもの、または粗悪なものにしてしまう任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが自然界に見られるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
品質保証及び／または品質管理のチェックは、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣなどの方法を用いて行うことができる。
いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法によって配列決定され得る。
定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑膜液、痰性体液、羊膜液、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から取得され得る。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを用いて実施し得、一方、エクソソームは、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学法を用いて単離し得る。エキソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離し得る。
これらの方法により、研究者は、核酸の残留レベルまたは送達レベルをリアルタイムでモニターし得る。これは、本開示の核酸が、いくつかの実施形態では、構造的または化学的修飾により内因性形態とは異なることから可能である。
いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を用いて定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸は、核酸が適切なサイズであるか否かを決定し、核酸の分解が生じていないか確認するために分析され得る。核酸の分解は、限定するものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認され得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」とは、単一のＬＮＰまたはＬＮＰの集団を指すことが理解されるべきである。脂質ナノ粒子は、典型的には、イオン化可能なアミノ（カチオン性）脂質、非カチオン性脂質、ステロール及びＰＥＧ脂質構成要素を、目的核酸カーゴと共に含む。本開示の脂質ナノ粒子は、当技術分野で一般的に知られている構成要素、組成物、及び方法（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１（これらは全てその全体が参照により本明細書に援用される）を参照）を用いて生成し得る。
本開示のワクチンは、典型的には、脂質ナノ粒子内で製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なアミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０ｍｏｌ％、２０～４０ｍｏｌ％、２０～３０ｍｏｌ％、３０～６０ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、４０～６０ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、または５０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能アミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％ ４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１０～２０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１５～２５ｍｏｌ％、１５～２０ｍｏｌ％、または２０～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、または２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５～５５ｍｏｌ％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０ｍｏｌ％、２５～４５ｍｏｌ％、２５～４０ｍｏｌ％、２５～３５ｍｏｌ％、２５～３０ｍｏｌ％、３０～５５ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４５ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、３０～３５ｍｏｌ％、３５～５５ｍｏｌ％、３５～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％、３５～４０ｍｏｌ％、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４０～４５ｍｏｌ％、４５～５５ｍｏｌ％、４５～５０ｍｏｌ％、または５０～５５ｍｏｌ％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のステロールを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０ｍｏｌ％、０．５～５ｍｏｌ％、１～１５ｍｏｌ％、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、２～１５ｍｏｌ％、２～１０ｍｏｌ％、２～５ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び約０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、２０～４０ｍｏｌ％のコレステロール、及び約０．５～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、９～１３％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％のコレステロール、及び約２～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１ｍｏｌ％の中性脂質、６８．５ｍｏｌ％のコレステロール、及び約２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体を含み、式中：
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子とともに複素環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、
－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、１、２、３、４、及び５から独立して選択され；
各Ｒ５は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
各Ｒは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ＊は、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり；
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるならば、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５の場合、Ｑが－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２の場合、Ｑが５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－
－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、
－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ，－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、
－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有し、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノアルキルアミノもしくはジアルキルアミノ及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
各Ｒが、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ’が、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ”が、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ＊が、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり；
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱはＣ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、
－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、及び各ｎが、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、及びＱが５～１４員の複素環であり、（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１または２である場合、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲである場合、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員の複素環式アルキルであり、
各Ｒ５が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
各Ｒが、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ’が、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ”が、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ＊が、Ｃ１～１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｙが、独立して、Ｃ３～６炭素環であり；
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ，－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
各Ｒが、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ”が、Ｃ３～１４アルキル及びＣ３～１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ＊が、Ｃ１～１２アルキル及びＣ２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｙが、独立して、Ｃ３～６炭素環であり；
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ２～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子とともに複素環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが３、４、及び５から選択され；
各Ｒ５が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ６が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
各Ｒが、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ’が、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ”が、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ＊が、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり；
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３が、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子とともに複素環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑが－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され；
各Ｒ５が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ６が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
各Ｒが、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ’が、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各Ｒ”が、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ＊が、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり；
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）：
のもの、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；かつ各Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）：
またはその塩または異性体であって、式中Ｉは、１、２、３、４、及び５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは、２、３、または４であり、かつＱは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、
－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、もしくは（ＩＩｅ）：
のもの、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩｄ）：
のもの、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｎは、２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載の通りである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む：
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む：
いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なアミノ脂質を含み、ここで、非カチオン性脂質はＤＳＰＣであり、構造脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＤＭＧ－ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５モルパーセント（ｍｏｌ％）のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、４５～４７、４５～４８、４５～４９、４５～５０、４５～５２、４６～４８、４６～４９、４６～５０、４６～５２、４６～５５、４７～４８、４７～４９、４７～５０、４７～５２、４７～５５、４８～５０、４８～５２、４８～５５、４９～５０、４９～５２、４９～５５、または５０～５５ ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１１、５～１２、５～１３、５～１４、５～１５、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１１、６～１２、６～１３、６～１４、６～１５、７～８、７～９、７～１０、７～１１、７～１２、７～１３、７～１４、７～１５、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、８～１３、８～１４、８～１５、９～１０、９～１１、９～１２、９～１３、９～１４、９～１５、１０～１１、１０～１２、１０～１３、１０～１４、１０～１５、１１～１２、１１～１３、１１～１４、１１～１５、１２～１３、１２～１４、１３～１４、１３～１５、または１４～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３５～４０ｍｏｌ％のステロール（例えば、コレステロール）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、３５～３６、３５～３７、３５～３８、３５～３９、３５～４０、３６～３７、３６～３８、３６～３９、３６～４０、３７～３８、３７～３９、３７～４０、３８～３９、３８～４０、または３９～４０ｍｏｌ％のコレステロールを含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５または４０ｍｏｌ％のコレステロールを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２，１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３．ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、１、１．５、２、２．５、または３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧとを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２０：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約５０ｎｍ～約１５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約７０ｎｍ～約１２０ｎｍである。
多価ワクチン
本明細書で提供する組成物は、同じまたは異なる種の２つ以上の抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のコロナウイルス抗原をコードする１つのＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上のコロナウイルス抗原をコードし得る。
いくつかの実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるｍＲＮＡを、同じ脂質ナノ粒子内に製剤化してもよい。他の実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡが、別々の脂質ナノ粒子内に製剤化されてもよい（各ＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。脂質ナノ粒子は、次に、組み合わされて単一のワクチン組成物（例えば、複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含むワクチン組成物）として投与されてもよく、または別々に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物が抗原をコードする２つの異なるＲＮＡを含む場合、抗原をコードするＲＮＡの比は１：１、１：２、１：４、４：１、または２：１である。
初回または１回目のワクチン
いくつかの実施形態では、１回目または初回のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１の流行株に由来する抗原をコードするｍＲＮＡワクチンである。例えば、初回ワクチンまたは１回目のワクチンは、配列番号３６のアミノ酸配列、そのドメインまたはサブユニットを有するスパイク抗原をコードするｍＲＮＡであり得る。他の実施形態では、１回目のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２またはその後の流行株に由来する対応する抗原を含む任意のワクチン様式であり得る。非限定的な例として、１回目のワクチン組成物は組換えワクチンであってもよい。本明細書で使用される場合、「組換えワクチン」とは、遺伝子工学、生物の遺伝物質を操作するプロセス及び方法によって作られたワクチンを指す。ほとんどの場合、組換えワクチンは、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生され精製されたか、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原をコードする１つ以上の核酸を含む。投与後、ワクチン接種を受けた人は１つ以上のタンパク質抗原に対する抗体を産生し、それによって、その人を疾患から防御する。いくつかの実施形態では、組換えワクチンはベクター化ワクチンである。ウイルスベクター化ワクチンは、ベクターと接触した宿主において免疫応答を誘発し得るペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする、ウイルス起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ウイルスに対して異種のポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドの発現は、中和抗体応答及び／または細胞媒介性応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成を引き起こす。ウイルスベクター化ワクチンの例としては、限定するものではないが、オックスフォード／アストラゼネカ（ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン アストラゼネカ）、ＣａｎＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．／北京生物工学研究所、Ｇａｍａｌｅｙａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ガマレヤ研究所）、Ｚｙｄｕｓ Ｃａｄｉｌａ、パスツール／テミス／ピッツバーグ大学ワクチン研究センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、香港大学、及びＡｌｔｉｍｍｕｎｅ（ＮａｓｏＶＡＸ）によって開発されたワクチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えワクチンは、核酸ベース（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）コロナウイルスワクチンである。ＤＮＡワクチンの例としては、Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＩＮＯ－４８００）、Ｇｅｎｅｘｉｎｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＧＸ－１９）、ＯｎｃｏＳｅｃ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＯＲＶａｘ１２及びＴＡＶＯ（商標）、カロリンスカ研究所／Ｃｏｂｒａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、大阪大学／アンジェス／タカラバイオ、及びＴａｋｉｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＤＮＡ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｅｖｖｉｖａｘが開発したワクチンが挙げられる。例示的なｍＲＮＡワクチンとしては、ＢｉｏＮＴｅｃｈ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃｕｒｅｖａｃ、及びＷａｌｖａｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ／人民解放軍（ＰＬＡ）軍事科学アカデミーによって開発されているワクチンが挙げられる。
医薬製剤
本明細書では、例えば、ヒト及び他の哺乳動物におけるコロナウイルスの予防及び／または処置のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬を提供する。本明細書で提供される組成物は、治療剤または予防剤として使用され得る。これらは、コロナウイルス感染を予防及び／または処置するための医薬で使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与してもよく、ＲＮＡポリヌクレオチドがｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて抗原ポリペプチド（抗原）が産生される。
組成物（例えば、ＲＮＡを含む）の「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞タイプ、投与手段、ＲＮＡの物理的特性（例えば、長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾ヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、ならびに他の決定因子、例えば、対象の年齢、体重、身長、性別、及び全体的健康状態に基づく。典型的には、組成物の有効量は、対象の細胞内での抗原産生の関数として、誘導または追加免疫された免疫応答を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物の有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含む組成物よりも効率的である。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクションの増大（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増大によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。
「医薬組成物」という用語は、組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または治療用途に特に適したものにする、活性薬剤と不活性または活性の担体との組合せを指す。「医薬的に許容される担体」とは、対象への投与後または投与時に、望ましくない生理学的作用を引き起こさないものである。医薬組成物中の担体は、有効成分に適合性であり、それを安定化させることが可能であるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を活性薬剤の送達のための医薬担体として利用してもよい。医薬的に許容される担体の例としては、限定されるものではないが、剤形として使用可能な組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤が挙げられる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の好適な医薬用担体及び希釈剤、ならびにそれらを使用するための医薬的必需品は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示に従う組成物（ポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチドを含む）は、コロナウイルス感染症の処置または予防のために使用され得る。ある組成物は、健康な個体または潜伏期間中の感染初期または症状発現後の活動性感染中に、積極的な免疫化スキームの一環として予防的に投与されても、または治療的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
組成物は、他の予防または治療化合物と共に投与され得てもよい。非限定的な例として、予防または治療化合物は、アジュバントであっても、またはブースターであってもよい。本明細書で使用する場合、「ブースター、追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）」という用語は、ワクチンなどの予防組成物に関する場合、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（追加免疫）（またはブースターワクチン）は、予防組成物の早期投与後に投与してもよい。予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、限定されるものではないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、予防組成物の初回投与とブースターの間の投与期間は少なくとも６ヶ月である。例示的な実施形態では、予防的組成物の最初の投与とブースターとの間の投与時間は、限定するものではないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月であってもよい。本明細書に記載されるように、ブースターは、予防組成物の初期の投与と比較して、同じまたは異なるｍＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ブースターは、予防組成物の初期の投与からの同じｍＲＮＡと少なくとも１つの異なるｍＲＮＡとの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、予防組成物の早期投与からのｍＲＮＡと少なくとも１つの異なるｍＲＮＡとの比は、１：１、１：２、１：４、４：１、または２：１である。一実施形態では、この比率は１：１である。いくつかの実施形態では、ブースター（追加免疫）は一価である（例えば、ｍＲＮＡは単一の抗原をコードする）。いくつかの実施形態では、ブースターは多価である（例えば、ｍＲＮＡは複数の抗原をコードする）。
いくつかの実施形態では、ブースター用量は、５μｇ～３０μｇ、５μｇ～２５μｇ、５μｇ～２０μｇ、５μｇ～１５μｇ、５μｇ～１０μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１０μｇ～１５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２５μｇ～３０μｇ、または２５μｇ～３００μｇである。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、１０μｇ～６０μｇ、１０μｇ～５５μｇ、１０μｇ～５０μｇ、１０μｇ～４５μｇ、１０μｇ～４０μｇ、１０μｇ～３５μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１５μｇ～６０μｇ、１５μｇ～５５μｇ、１５μｇ～５０μｇ、１５μｇ～４５μｇ、１５μｇ～４０μｇ、１５μｇ～３５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～６０μｇ、２０μｇ～５５μｇ、２０μｇ～５０μｇ、２０μｇ～４５μｇ、２０μｇ～４０μｇ、２０μｇ～３５μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２０μｇ～２５μｇ、２５μｇ～６０μｇ、２５μｇ～５５μｇ、２５μｇ～５０μｇ、２５μｇ～４５μｇ、２５μｇ～４０μｇ、２５μｇ～３５μｇ、２５μｇ～３０μｇ、３０μｇ～６０μｇ、３０μｇ～５５μｇ、３０μｇ～５０μｇ、３０μｇ～４５μｇ、３０μｇ～４０μｇ、３０μｇ～３５μｇ、３５μｇ～６０μｇ、３５μｇ～５５μｇ、３５μｇ～５０μｇ、３５μｇ～４５μｇ、３５μｇ～４０μｇ、４０μｇ～６０μｇ、４０μｇ～５５μｇ、４０μｇ～５０μｇ、４０μｇ～４５μｇ、４５μｇ～６０μｇ、４５μｇ～５５μｇ、４５μｇ～５０μｇ、５０μｇ～６０μｇ、５０μｇ～５５μｇ、または５５μｇ～６０μｇである。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、組成物の少なくとも１０μｇであり、かつ２５μｇ未満である。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、組成物の少なくとも５μｇであり、かつ２５μｇ未満である。例えば、ブースター用量は、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、または３００μｇである。いくつかの実施形態では、ブースター用量は５０μｇである。
いくつかの実施形態では、組成物は、当該技術分野で公知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、経鼻、または皮内に投与され得る。
組成物は、感染の有病率または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な設定で利用され得る。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、様々な感染性疾患を治療及び／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、市販のワクチンよりもはるかに大きな抗体力価、より良好な中和免疫をもたらし、より持続性のある免疫応答を生じるか、及び／またはより早期の応答をもたらすという点において優れた特性を有する。
本明細書で提供されるのは、ＲＮＡ及び／または任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む医薬組成物である。
ＲＮＡは、単独で、または１つ以上の他の構成要素と組み合わせて、製剤化されても、または投与されてもよい。例えば、免疫化組成物は、限定するものではないが、アジュバントを含む他の構成要素を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物はアジュバントを含まない（アジュバントフリーである）。
ＲＮＡは、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化されてもまたは投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の活性物質（例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組み合わせなど）を含む。ワクチン組成物は、無菌、パイロジェンフリー、または無菌及びパイロジェンフリーの両方であり得る。医薬薬剤、例えば、ワクチン組成物の製剤化及び／または製造における全般的考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照によりその全体が本明細書に援用される）に見出され得る。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、ヒト、ヒトの患者または対象に投与される。本開示の目的において、「有効成分」という表現は、概して、ＲＮＡワクチンまたはそれに含まれるポリヌクレオチド、例えば、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって、調製され得る。概して、このような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を、賦形剤及び／または１つ以上の補助成分と会合させるステップと、次に必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単回または多回用量単位に分割、成形、及び／またはパッケージングするステップとを含む。
本開示に従う医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、さらにはこの組成物の投与経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、（１）安定性を高めるために、（２）細胞トランスフェクションを増大するために、（３）（例えば、デポ剤からの）持続放出または遅延放出を可能にするために、（４）体内分布を変化させる（例えば、特定の組織もしくは細胞タイプに標的化する）ために、（５）コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳を増大するために、及び／または（６）ｉｎ ｖｉｖｏでのコードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルを変化させるために、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化される。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
投与量／投与
本明細書では、ヒト及び他の哺乳類におけるコロナウイルス感染症の予防及び／または処置のための免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）、方法、キット、及び試薬を提供する。免疫化組成物は、治療剤または予防薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫化組成物を使用して、コロナウイルス感染からの予防的防御を提供する。いくつかの実施形態では、免疫化組成物を使用して、コロナウイルス感染を処置する。いくつかの実施形態では、免疫化組成物を使用して、免疫エフェクター細胞のプライミングで、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をｅｘ ｖｉｖｏで活性化し、次にこれを対象に注入（再注入）する。
対象は、任意の哺乳類（非ヒト霊長類及びヒト対象を含む）であってもよい。典型的には、対象とはヒト対象である。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、抗原特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与される。コロナウイルススパイクタンパク質抗原をコードするＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで発現及び翻訳されて抗原が産生され、次にこれが対象における免疫応答を刺激する。
コロナウイルスからの予防的防御は、本開示の免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の投与後に達成され得る。免疫化成物は１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与されてもよいが、ワクチンを１回投与するだけで十分な場合がある（任意選択で１回のブースターが続く）。望ましいものではないが、感染した個体にある免疫化組成物を投与して治療応答を達成することも可能である。用量設定を適宜調整する必要がある場合がある。
コロナウイルス抗原（または多重抗原）に対する対象における免疫応答を誘発する方法を、本開示の態様で提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、あるコロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む免疫化組成物を対象に投与することを含み、それにより、対象においてコロナウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導し、対象内の抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、その抗原に対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象における抗－抗原抗体力価よりも増大される。「抗抗原抗体」とは、抗原に特異的に結合する血清抗体である。
予防有効用量とは、臨床的に許容されるレベルでウイルス感染を予防する有効用量である。いくつかの実施形態では、有効用量とは、ワクチンの添付文書に列記されている用量である。本明細書で使用する場合、従来のワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、限定されるものではないが、微生物生ワクチン、微生物不活化ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどが挙げられる。例示的な実施形態では、従来のワクチンは、国の薬物規制機関（例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ））によって規制上の承認を達成し、及び／または登録されているワクチンである。
いくつかの実施形態では、対象内の抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価よりも１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増大している。いくつかの実施形態では、対象における抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価よりも１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増大している。
対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘発する方法は、本開示の他の態様で提供される。本方法は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含み、それにより、対象においてコロナウイルスに特異的な免疫応答を誘導し、この対象での免疫応答は、この組成物に対し２倍～１００倍の投薬量レベルで、コロナウイルスに対する従来のワクチンを接種した対象での免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し２倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し３倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１０倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１００倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。
他の実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。他の実施形態では、免疫化された対象由来の血清または抗体の能力を、ウイルス取込みを中和する能力またはヒトＢリンパ球のコロナウイルス形質転換を低減する能力に対して試験する。他の実施形態では、ロバストなＴ細胞応答（複数可）を促進する能力は、当該技術分野で認識されている技法を用いて測定される。
本開示の他の態様は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与して、対象においてコロナウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導することにより、対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を引き出す方法を提供し、ここで、この対象における免疫応答は、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効量を接種した対象において誘導される免疫応答よりも２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し２倍～１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンの予防有効用量を接種した対象において誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来のワクチンの予防有効用量でワクチン接種した対象において誘導される免疫応答よりも２日、３日、１週間、２週間、３週間、５週間、または１０週間早く誘導される。
また、本明細書では、第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを対象に投与することにより、コロナウイルスに対する対象における免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡが安定化エレメントを含まず、アジュバントがワクチンと同時製剤化または同時投与されない、方法を提供する。
組成物は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路で投与され得る。このような経路としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／または皮下の投与が挙げられる。本開示は、ＲＮＡワクチンを投与することをそれを必要とする対象に行うことを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なる。ＲＮＡは、典型的には、投与しやすさ及び投薬量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。ただし、ＲＮＡの１日合計使用量は妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切なイメージング用量レベルは、治療する障害及び障害の重症度；用いる具体的化合物の活性；用いる具体的組成物；患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別、及び食事；用いる具体的化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率；治療の期間；用いる具体的化合物と組み合わせでまたは同時に使用する薬物；ならびに医学分野で周知されている類似の因子を含めた様々な因子に依存する。
本明細書で示す場合、ＲＮＡの有効量（例えば、有効用量）は、例えば、単回投与または２回の１０μｇ投与として２０μｇ程度の低さで投与されてもよい（例えば、１回目の有効ワクチン用量及び２回目の有効ワクチン用量）。いくつかの実施形態では、１回目の有効ワクチン用量と２回目の有効ワクチン用量は同じ量である。いくつかの実施形態では、１回目の有効ワクチン用量と２回目の有効ワクチン用量は異なる量である。いくつかの実施形態では、有効量とは、５μｇ～３０μｇ、５μｇ～２５μｇ、５μｇ～２０μｇ、５μｇ～１５μｇ、５μｇ～１０μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１０μｇ～１５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２５μｇ～３０μｇ、または２５μｇ～３００μｇという総用量である。いくつかの実施形態では、この有効用量とは、１０μｇ～６０μｇ、１０μｇ～５５μｇ、１０μｇ～５０μｇ、１０μｇ～４５μｇ、１０μｇ～４０μｇ、１０μｇ～３５μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１５μｇ～６０μｇ、１５μｇ～５５μｇ、１５μｇ～５０μｇ、１５μｇ～４５μｇ、１５μｇ～４０μｇ、１５μｇ～３５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～６０μｇ、２０μｇ～５５μｇ、２０μｇ～５０μｇ、２０μｇ～４５μｇ、２０μｇ～４０μｇ、２０μｇ～３５μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２０μｇ～２５μｇ、２５μｇ～６０μｇ、２５μｇ～５５μｇ、２５μｇ～５０μｇ、２５μｇ～４５μｇ、２５μｇ～４０μｇ、２５μｇ～３５μｇ、２５μｇ～３０μｇ、３０μｇ～６０μｇ、３０μｇ～５５μｇ、３０μｇ～５０μｇ、３０μｇ～４５μｇ、３０μｇ～４０μｇ、３０μｇ～３５μｇ、３５μｇ～６０μｇ、３５μｇ～５５μｇ、３５μｇ～５０μｇ、３５μｇ～４５μｇ、３５μｇ～４０μｇ、４０μｇ～６０μｇ、４０μｇ～５５μｇ、４０μｇ～５０μｇ、４０μｇ～４５μｇ、４５μｇ～６０μｇ、４５μｇ～５５μｇ、４５μｇ～５０μｇ、５０μｇ～６０μｇ、５０μｇ～５５μｇ、または５５μｇ～６０μｇという総用量である。いくつかの実施形態では、有効用量（例えば、有効量）は、組成物の少なくとも１０μｇであり、かつ２５μｇ未満である。いくつかの実施形態では、有効用量（例えば、有効量）は、組成物の少なくとも５μｇであり、かつ２５μｇ未満である。例えば、有効量は、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、または３００μｇという総投与量であってもよい。いくつかの実施形態では、有効量（例えば、有効用量）は、１０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２０μｇの総用量（例えば、２回の１０μｇ用量）である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、６０μｇの総用量（例えば、２回の３０μｇ用量）である。いくつかの実施形態では、有効量は、７５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、組成物は２つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み、有効量は総用量２０μｇ（例えば、１０μｇの第１のｍＲＮＡ及び１０μｇの第２のｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、組成物は２つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み、有効量は総用量５０μｇ（例えば、２５μｇの第１のｍＲＮＡ及び２５μｇの第２のｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、組成物は２つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み、有効量は総用量１００μｇ（例えば、５０μｇの第１のｍＲＮＡ及び５０μｇ第２のｍＲＮＡ）である。
本明細書に記載のＲＮＡは、本明細書に記載の剤形、例えば、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）の剤形で製剤化され得る。
ワクチン有効性
本開示のいくつかの態様は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の製剤であって、ＲＮＡが、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、コロナウイルス抗原に特異的な抗体の産生）をもたらすのに有効な量で製剤化される、製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なＲＮＡの用量である。また、本明細書では、対象内の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も提供する。
本明細書で使用する場合、本開示のワクチンまたはＬＮＰに対する免疫応答とは、ワクチン中に存在する（１つ以上の）コロナウイルスタンパク質（複数可）に対する対象における液性及び／または細胞性免疫応答の発生である。本開示の目的において、「液性」免疫応答とは、抗体分子（例えば、分泌（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を含む）によって媒介される免疫応答を指し、一方、「細胞性」免疫応答とは、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパー及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）及び／または他の白血球）によって媒介される免疫応答を指す。細胞性免疫における１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたタンパク質と共に提示され細胞表面に発現するペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子と共にその表面に提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせる一助となるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化Ｔ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞由来のものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のこのような分子の産生も引き起こす。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供する組成物を投与された対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価を測定することにより、特性評価される。抗体力価とは、対象内にある抗体、例えば、特定の抗原または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
さまざまな血清学的検査を使用して、コードされた目的の抗原、例えば、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲ－ＣｏＶ－２ウイルス抗原、例えば、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクまたはＳタンパク質（そのドメインの）に対する抗体を測定し得る。これらの試験には、赤血球凝集阻害試験、補体結合試験、蛍光抗体試験、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、及びプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）が含まれる。これらの各試験は、さまざまな抗体活性を測定する。例示的な実施形態では、プラーク減少中和試験、またはＰＲＮＴ（例えば、ＰＲＮＴ５０またはＰＲＮＴ９０）は、防御の血清学的相関物として使用される。ＰＲＮＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス中和の生物学的パラメーターを測定し、特定のクラスのウイルスの中で最も血清学的にウイルス特異的な試験であり、ウイルス感染からの防御の血清レベルとよく相関する。ＰＲＮＴの基本設計では、試験管またはマイクロタイタープレートでウイルスと抗体の相互作用を行うことを可能にし、これによってウイルス感受性細胞、好ましくは哺乳類由来の細胞に混合物をプレーティングすることで、ウイルス感染性に対する抗体の影響を測定する。細胞は、子孫ウイルスの伝播を制限する半固体培地で覆われている。生産的な感染を開始する各ウイルスは、さまざまな方法で検出され得る局所的な感染領域（プラーク）を生成する。プラークを数え、ウイルスの開始濃度に戻って比較して、ウイルスの総感染力の低下率を決定する。ＰＲＮＴでは、通常、試験される血清試料は、標準化された量のウイルスと混合する前に段階希釈される。ウイルスの濃度は一定に保たれているため、感受性の高い細胞に添加して半固形培地をかぶせると、個々のプラークを識別して数えることができる。このようにして、ＰＲＮＴエンドポイント力価は、ウイルス活性の任意の選択されたパーセント減少で各血清試料に対して計算され得る。
ワクチンの免疫原性を評価することを目的とした機能アッセイでは、抗体滴定の血清試料希釈系列は、理想的には「血清防御」閾値力価未満で開始する必要がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に関しては、「血清防御」閾値力価は不明のままである。しかし、１：１０という血清陽性の閾値は、特定の実施形態では、血清防御閾値と見なすことができる。
いくつかの実施形態では、中和免疫応答とは、血清防御閾値を満たすか、またはそれを超えるレベルの抗体を産生する免疫応答である。
ＰＲＮＴエンドポイント力価は、プラーク数の望ましい減少率を示す最後の血清希釈の逆数として表される。ＰＲＮＴ力価は、プラーク数の５０％以上の減少（ＰＲＮＴ５０）に基づいて計算できる。ＰＲＮＴ５０力価は、ワクチン血清に対してより高いカットオフ（例えば、ＰＲＮＴ９０）を使用する力価よりも優先され、滴定曲線の線形部分からより正確な結果を提供する。
ＰＲＮＴ力価を計算する方法にはいくつかある。力価を計算するための最も簡単で最も広く使用されている方法は、プラークを数え、最後の血清希釈の逆数として力価を報告して、入力プラークの逆滴定に基づく入力プラーク数の５０％超の減少を示すことである。いくつかの血清希釈からのカーブフィッティング法を使用すると、より正確な結果を計算できる場合がある。これに利用可能なさまざまなコンピューター分析プログラムがある（例えば、ＳＰＳＳまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
いくつかの実施形態では、抗体力価は、対象が感染症に罹ったか否かを評価するため、または免疫化が必要か否かを判断するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体力価は、自己免疫応答の強さを定量するため、ブースター免疫が必要か否かを判断するため、以前のワクチンが有効だった否かを判断するため、及び最近または過去の感染を確認するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）によって対象において誘導された免疫応答の強さを定量するために使用してもよい。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、または少なくとも３ｌｏｇ増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１、１．５、２、２．５、または３ｌｏｇ増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１～３ｌｏｇ増大される。例えば、対象に産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原・抗体力価は、対照よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２～１０倍増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０倍増大され得る。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、コロナウイルスに対する血清中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）の比（幾何平均比（ＧＭＲ）と称される）として測定される。幾何平均力価（ＧＭＴ）とは、全ての値を掛け合わせ、その数値のｎ乗根（ｎは利用可能なデータを有する対象数である）をとることによって算出される、対象の群における平均抗体力価である。
いくつかの実施形態では対照は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を投与されていない対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗コロナウイルス抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、通常、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたか、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）が有効となる能力は、マウスモデルで測定される。例えば、組成物を、マウスモデルに投与してもよく、マウスモデルを中和抗体力価の誘導について評価してもよい。また、ウイルスチャレンジ研究も、本開示のワクチンの効果を評価するために使用してもよい。例えば、組成物をマウスモデルに投与し、そのマウスモデルをウイルスでチャレンジし、そのマウスモデルを生存及び／または免疫応答（例えば、中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン応答））について評価してもよい。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効量は、組換えタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して低減された用量である。本明細書で使用する「標準治療」とは、医学的または心理学的な治療ガイドラインを指し、一般的であっても、特定的であってもよい。「標準治療」は、科学的根拠及び所与の状態の治療に携わる医療従事者間の協力に基づいた適切な治療を指す。それは、医師／臨床医がある特定のタイプの患者、疾患、及び臨床状況に対し従うべき診断及び治療のプロセスである。本明細書で使用する「標準治療用量」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、コロナウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するための標準治療ガイドラインに従いながら、コロナウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するために対象に投与する、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または弱毒生もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの用量を指す。
いくつかの実施形態では、有効量の組成物を投与された対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または弱毒生もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与された対照の対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価と同等である。
ワクチン効果は、標準的な解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照のこと）。例えば、ワクチン効果は、二重盲検ランダム化対照臨床試験で測定され得る。ワクチン効果は、ワクチン非接種試験コホートの罹患率（ＡＲＵ）とワクチン接種試験コホートの罹患率（ＡＲＶ）との間の疾患罹患率（ＡＲ）の比例的減少として表してもよく、以下の式を用いてワクチン接種群の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出し得る。
効果＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００；及び
効果＝（１－ＲＲ）×１００。
同様に、ワクチン有効性は標準的解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照のこと）。ワクチンの有効性とは、ワクチン（高いワクチン効果を有することが既に判明している場合もある）が集団の中でどのように疾患を低減するかを評価するものである。この尺度は、対照臨床試験ではなく自然のフィールド条件下で、ワクチン自体にとどまらず、ワクチン接種プログラムの利益と有害作用の正味のバランスを評価することができる。ワクチンの有効性は、ワクチンの効果（効力）に比例するが、集団内の標的群がどの程度免疫化しているか、及び「実世界」の転帰に影響を及ぼすワクチンとは無関係な要因（例えば、入院、外来受診、または費用）による影響も受ける。例えば、後ろ向きケースコントロール解析を使用して、感染症例のセット及び適切な対照におけるワクチン接種率を比較してもよい。ワクチン有効性は、ワクチン接種したにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）の使用により、割合の差として表すことができる。
有効性＝（１－ＯＲ）×１００
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６０％である。例えば、組成物の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であり得る。
殺菌免疫。殺菌免疫とは、宿主への有効な病原体感染を防止する固有の免疫状態を指す。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、少なくとも１年間、対象における殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、本開示の組成物の有効量は、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間、対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、対照よりも少なくとも５倍低い用量で対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、有効量は、対照よりも少なくとも１０倍、１５倍、または２０倍低い用量でも対象における殺菌免疫をもたらすのに十分であり得る。
検出可能な抗原。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中で測定した場合、検出可能なレベルのコロナウイルス抗原を産生するのに十分である。
力価。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗コロナウイルス抗原）に特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）とは、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
中和免疫応答は、中和抗体応答及び／または効果的な中和Ｔ細胞応答である免疫応答である。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、血清防御閾値を満たすか、またはそれを超えるレベルの抗体を生成する。
効果的なＴ細胞応答とは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔヘルパー１型細胞を含むウイルス活性化Ｔ細胞またはウイルス特異的Ｔ細胞のベースラインレベルを生み出す応答である。通常、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、細胞内ウイルスコンパートメントを除去し、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞及び他のＴ細胞の支援、記憶生成の促進、間接的または直接的な細胞傷害性活性など、体内でさまざまな機能を発揮する。いくつかの実施形態では、有効なＴ細胞は、ベースラインレベル（ナイーブ対象における）と比較して、高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、これらのＴ細胞は、ＣＤ２７及びＣＤ２８の共発現を伴う初期分化記憶表現型に向かって分化される。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中で測定した場合、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中で測定した場合、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中で測定した場合、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００ＮＴ５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＴ５０であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＴ５０である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００中和単位／ミリリットル（ＮＵ／ｍＬ）である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。
いくつかの実施形態では、ｎ個の数の積のｎ乗根である幾何平均を、比例増殖を説明するために一般的に使用する。幾何平均は、いくつかの実施形態では、対象において産生される抗体力価を特性評価するために使用される。
対照とは、例えば、ワクチン接種されていない対象、または弱毒化生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、またはタンパク質サブユニットワクチンを投与された対象であってもよい。
さらなる実施形態
１．第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸であって、ここで、前記抗原が、第１の流行するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株の抗原に関する少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異がアミノ酸の置換、欠失または挿入であり、前記抗原が、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではなく、前記核酸が脂質ナノ粒子内にある、前記核酸。
２．前記第１及び第２のウイルス株が少なくとも１年の一部の間流行している、段落１に記載の核酸。
３．前記第１及び第２のウイルス株が同じパンデミック期間または流行期間中に流行している、段落１に記載の核酸。
４．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株の抗原に対して第２のアミノ酸変異を有し、前記変異がアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記第２の変異は流行している第３のウイルス株に対応する、段落１～３のいずれか１項に記載の核酸。
５．前記脂質ナノ粒子がイオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む、段落１～４のいずれか１項に記載の核酸。
６．前記脂質ナノ粒子が、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、段落５に記載の核酸。
７．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である、段落１～６のいずれか１項に記載の核酸。
８．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）である、段落１～６のいずれか１項に記載の核酸。
９．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＲＢＤとＮＴＤの組み合わせである、段落１～６のいずれか１項に記載の核酸。
１０．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、リンカーによって結合されたＮＴＤ、ＲＢＤ、及び膜貫通ドメインである、段落１～６のいずれか１項に記載の核酸。
１１．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、リンカーによって連結されたＮＴＤ、ＲＢＤ、及びインフルエンザ赤血球凝集素膜貫通（ＨＡＴＭ）ドメイン（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）である、段落１０に記載の核酸。
１２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＮＴＤ－ＲＢＤ融合体である、段落１～６のいずれか１項に記載の核酸。
１３．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＳ１タンパク質サブユニットである、段落１～６のいずれか１項に記載の核酸。
１４．前記抗原における前記アミノ酸変異が、前記第１のウイルスにおける対応する構造または機能とは量または種類が異なるウイルスの構造または機能に関連する、段落１～１３のいずれか１項に記載の核酸。
１５．前記機能が、ＡＣＥ２受容体結合、ウイルス伝播性、ウイルス取り込み、ウイルス病因、フリン切断の変化、またはウイルス複製である、段落１４に記載の核酸。
１６．前記核酸が、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、５７、６０、及び６３のいずれか１つのタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、段落１～１５のいずれか１項に記載の核酸。
１７．配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、段落１～１６のいずれか１項に記載の核酸。
１８．前記核酸がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、段落１～１７のいずれか１項に記載の核酸。
１９．組成物：第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のｍＲＮＡとを含む組成物であって、ここで前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、ここで前記変異は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない、前記組成物。
２０．前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株であり、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株であり、前記第１及び第２のウイルス株が、１年間のうち少なくともある期間、人口に蔓延している、段落１９に記載の組成物。
２１．前記ｍＲＮＡが、組成物中に互いのｍＲＮＡに対して約１：１の比で存在する、段落１９～２０のいずれか１項に記載の組成物。
２２．前記ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子にあり、前記脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物。
２３．前記脂質ナノ粒子が４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ－修飾脂質を含む、段落２２に記載の組成物。
２４．前記脂質ナノ粒子が４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ－修飾脂質を含む、段落２２～２３のいずれか１項に記載の組成物。
２５．前記脂質ナノ粒子が、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン化可能アミノ脂質を含む、段落２２～２４のいずれか１項に記載の組成物。
２６．前記イオン化可能なアミノ脂質が化合物１の構造を有する、段落２２～２５のいずれか１項に記載の組成物：
２７．前記ステロールがコレステロールまたはその変異型である、段落２２～２６のいずれか１項に記載の組成物。
２８．前記中性脂質が１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、段落２２～２７のいずいれか１項に記載の組成物。
２９．前記ＰＥＧ修飾脂質が１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）である、段落２２～２８のいずれか１項に記載の組成物。
３０．配列番号２０、２３、２６、２９、３２、５７、６０、及び６３のいずれか１つのタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、ｍＲＮＡ。
３１．配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、ｍＲＮＡ。
３２．配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡに対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、ｍＲＮＡ。
３３．配列番号２１、２４、２７、３０、５５、５８、６１、及び６４のいずれか１つのＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ。
３４．第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２の核酸を含む第２のワクチンの第２の有効用量を対象に投与することを含む方法であって、ここで、前記対象は、事前に第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む１回目のワクチンの第１の有効用量を投与されており、前記第２のワクチンは、前記第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の対応するアミノ酸配列に関して、少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異はアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない、前記方法。
３５．前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原であり、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原である、段落３４に記載の方法。
３６．前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表しており、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの代表である、段落３４に記載の方法。
３７．前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が複数の第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表しているか、及び／または前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第２の複数の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの代表である、段落３４に記載の方法。
３８．前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原であり、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原である、段落３４に記載の方法。
３９．前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが対象集団に存在する期間中に検出される免疫優勢な新興株または懸念される変異株である、段落３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
４０．前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが少なくとも１年以内に対象集団において検出可能である、段落３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
４１．前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、同じシーズンの間に対象集団において検出可能である、段落３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、同じパンデミック期間または流行期の間に対象集団において検出可能である、段落３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
４３．前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸がＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、段落３４～４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、段落３４～４３のいずれか１項に記載の方法。
４５．前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第２の核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、段落３４～４３のいずれか１項に記載の方法。
４６．前記第２のワクチンが、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸をさらに含む、段落３４～４５のいずれか１項に記載の方法。
４７．第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第２の核酸は、１：１の比で前記第２のワクチン中に存在する、段落４６に記載の方法。
４８．前記第１及び／または第２のワクチンが一価ワクチンである、段落３４～４５のいずれか１項に記載の方法。
４９．前記第１及び／または第２のワクチンが、複数の懸念される変異株を代表する抗原をコードする複数の核酸を含む多価ワクチンである、段落３４～４７のいずれか１項に記載の方法。
５０．前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、１回以上の用量からなる１回目のワクチンとして対象に投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が１回以上の用量でブーストとして対象に投与される、段落３４～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１．前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、１回以上の用量からなる１回目のワクチンとして前記対象に投与され、前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が１回以上の用量でブーストとして対象に投与される、段落３４～４９のいずれか１項に記載の方法。
５２．前記第１及び第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がブースト用量として前記対象に一緒に投与され、任意選択で前記第１及び第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が１：１の比率でブースト用量で存在する、段落３４～４９のいずれか１項に記載の方法。
５３．前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がワクチン接種を完了するためのプライム用量及びブースト用量として対象に投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、前記１回目のワクチン接種が完了してから少なくとも３か月後に、ブースターレジメンとして前記対象に投与される、第３４～４９項のいずれか１項に記載の方法。
５４．第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が初回ワクチン接種におけるプライム用量及びブースト用量として前記対象に投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が初回のワクチン接種から６か月以上経過した後にブースト投与として前記対象に投与される、段落３４～４７のいずれか１項に記載の方法。
５５．前記ブースト用量が、複数の懸念される変異株に対する防御を提供するための季節的ブーストまたはパンデミックシフトブーストである、段落４８～５２のいずれか１項に記載の方法。
５６．前記ブースト用量が５０μｇである、段落５０～５５のいずれか１項に記載の方法。
５７．前記第１及び／または第２の有効用量が２０μｇ～５０μｇである、段落３４～５６のいずれか１項に記載の方法。
５８．前記第１及び／または第２の有効用量が２０μｇである、段落３４～５７のいずれか１項に記載の方法。
５９．前記第１及び／または第２の有効用量が２５μｇである、段落３４～５７のいずれか１項に記載の方法。
６０．前記第１及び／または第２の有効用量が３０μｇである、段落３４～５７のいずれか１項に記載の方法。
６１．前記第１及び／または第２の有効用量が５０μｇである、段落３４～５７のいずれか１項に記載の方法。
６２．前記第１及び／または第２の有効用量が３０μｇである、段落３４～５７のいずれか１項に記載の方法。
６３．前記第１及び／または第２の有効用量が１０μｇである、段落３４～５６のいずれか１項に記載の方法。
６４．前記第１及び／または第２の有効用量が１０μｇ～３０μｇである、段落３４～５６のいずれか１項に記載の方法。
６５．前記第１及び／または第２の有効用量が１０μｇ～２０μｇである、段落３４～５６のいずれか１項に記載の方法。
６６．前記第１及び／または第２の有効用量が少なくとも１０μｇ及び少なくとも２５μｇである、段落３４～５６のいずれか１項に記載の方法。
６７．前記第１及び／または第２の有効用量が５μｇ～３０μｇである、段落３４～５６のいずれか１項に記載の方法。
６８．前記第１及び／または第２の有効用量が少なくとも５μｇかつ２５μｇ未満である、段落３４～５６のいずれか１項に記載の方法。
６９．第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含む方法であって、ここで、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新興の変異型であり、前記抗原は、前記初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に関して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異はアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記対象は、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に関して血清陽性である、前記方法。
７０．第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含む方法であって、ここで、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新興の変異型であり、前記抗原は、前記初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に関して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異はアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記対象は、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に関して血清陰性である、前記方法。
７１．前記ワクチンの最初の用量が投与されてから２週間から１年の間に、前記対象にワクチンの２回目の用量が投与される、段落６９または７０に記載の方法。
７２．前記対象には、前記ワクチン投与後２週間から１年の間に第２のワクチンを投与し、前記第２のワクチンは、前記初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの前記対応するタンパク質抗原をコードする第２の核酸を含む、段落６９または７０に記載の方法。
７３．前記第２のワクチンが、前記第１及び第２の核酸の混合物を含み、前記第１の核酸及び第２の核酸が、前記第２のワクチン中に１：１の比で存在する、段落７２に記載の方法。
７４．第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに由来する第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むブースターワクチンを対象に投与することを含む方法であって、ここで、前記対象は、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む１回目のワクチンの少なくとも１つのプライム用量を以前に投与されており、前記ブースターワクチンが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、ここで前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含み、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記ブースターワクチンは、１回目のワクチンの初回投与後少なくとも６か月後に２５～１００μｇの用量で投与され、かつ、前記第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない、前記方法。
７５．前記ブースターワクチンが５０μｇの用量で投与される、段落７４に記載の方法。
７６．前記ブースターワクチンが、前記１回目のワクチンの２回目の用量の少なくとも約６ヶ月後に投与される、段落７４または７５に記載の方法。
７７．前記ブースターワクチンが、前記１回目のワクチンの２回目の用量の６～１２ヶ月後に投与される、段落７４または７５に記載の方法。
７８．前記ブースターワクチンが、前記１回目のワクチンの２回目の用量の少なくとも約８ヶ月後に投与される、段落７４または７５に記載の方法。
７９．前記ブースト用量が、複数の懸念される変異株に対する中和免疫応答を提供するための季節的ブーストまたはパンデミックシフトブーストである、段落７４～７８のいずれか１項に記載の方法。
８０．少なくとも１つのｍＲＮＡがさらに、非翻訳領域（ＵＴＲ）に１つ以上の非コード配列、任意選択で５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む、段落１～１８のいずれか１項に記載の核酸、段落１９～２９のいずれか１項に記載の組成物、段落３０～３３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ、または段落３４～７９のいずれか１項に記載の方法。
８１．前記、すべてのｍＲＮＡがＵＴＲ、任意選択で５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ中に１つ以上の非コード配列をさらに含む、段落８０に記載の核酸、組成物、ｍＲＮＡ、または方法。
８２．前記非コード配列が、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの上流のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、段落５６に記載の方法または組成物。
８３．前記非コード配列が、前記ｍＲＮＡの前記ポリＡテールの下流のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、段落８１に記載の核酸、組成物、ｍＲＮＡ、または方法。
８４．前記非コード配列が、前記ｍＲＮＡのＯＲＦの最後のコドンと前記ｍＲＮＡの前記ポリＡテールの最初の「Ａ」との間のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、段落８１に記載の核酸、組成物、ｍＲＮＡ、または方法。
８５．前記非コード配列が１～１０個のヌクレオチドを含む、段落８１に記載の核酸、組成物、ｍＲＮＡ、または方法。
８６．前記非コード配列が１つ以上のＲＮＡｓｅ切断部位を含む、段落８０～８５のいずれか１つに記載の核酸、組成物、ｍＲＮＡ、または方法。
８７．前記ＲＮＡｓｅ切断部位がＲＮａｓｅ Ｈ切断部位を含む、段落８６に記載の方法または組成物。
実施例１．ｍＲＮＡワクチンは、世界的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型のスパイク変異型に対するヒト中和抗体を誘導する
本研究で使用されるｍＲＮＡワクチンは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、及びリンカーで結合されたインフルエンザ血球凝集素膜貫通（ＨＡＴＭ）ドメイン（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）を含むタンパク質をコードしている。
コロナウイルスＳタンパク質のＮＴＤ及びＲＢＤは両方とも、中和ウイルス活性を示す抗体の結合部位であることが公知である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合のＲＢＤは、スパイクタンパク質の受容体結合部位であり、細胞への進入を獲得する受容体としてアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合する。アミノ（Ｎ）末端ドメインＮＴＤは、その機能が完全には理解されていないが、糖部分を結合すること、及びスパイクタンパク質の融合前から融合後の高次構造への高次構造変化を促進することに、役割を果たしているようである。Ｚｈｏｕ Ｈ，Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９；１０（１）：３０６８を参照のこと。最近では、中和「スーパーサイト」も ＮＴＤ で確認された。ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｓｉｔｅ ｏｆ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２１．０３．０２８（２０２１）を参照のこと。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いる実験では、その製剤は、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質と、５～２５％の非カチオン性脂質と、２５～５５％のステロールと、２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質とを含む。ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールはコレステロールであり、及びイオン化可能アミノ脂質は、例えば、化合物１の構造を有する。
中和研究
この研究では、疑似ウイルス中和（ＰｓＶＮ）アッセイにおいて、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、リンカーによって結合されたＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、及びインフルエンザ血球凝集素膜貫通（ＨＡＴＭ）ドメイン（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡワクチン（「ｍＲＮＡワクチン」）で免疫した臨床試験参加者からの血清の中和活性を、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株、Ｄ６１４Ｇ変異型、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．１．３５１変異型、ならびに以前に出現した変異型（２０Ｅ．ＥＵ１、２０Ａ．ＥＵ２、Ｄ６１４Ｇ－Ｎ４３９Ｋ、及びミンククラスター５変異型）由来のスパイクタンパク質を用いて評価される。Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域に存在する単一の変異、及び変異と欠失の組み合わせの両方の影響を調べる。ＶＳＶ及び偽型レンチウイルス中和アッセイにおける直交評価も、２つの異なる用量でｍＲＮＡワクチンを受けた非ヒト霊長類（ＮＨＰ）由来の血清に対して実行される。
新型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型に対する強力な中和抗体を誘発するｍＲＮＡワクチンの能力を評価するために、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に３０μｇのｍＲＮＡワクチンを３～４週間にわたって２回投与し、血清を採取する。同様に、ヒト参加者にはプライム－ブーストレジメンで１００μｇ用量のｍＲＮＡワクチンを２回投与し、それらの血清を収集する。収集した血清を中和特性について分析する。中和活性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長スパイク偽型組換えＶＳＶ－ΔＧホタルルシフェラーゼウイルスを用いて測定し、抗体レベルは、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株（Ｄ６１４）、Ｄ６１４Ｇバージョン、または２０Ａ．ＥＵ１、２０Ａ．ＥＵ２、及びミンククラスター５変異型由来のスパイクタンパク質（表２）のスパイクタンパク質を含む同型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿Ｄ６１４に対する疑似ウイルス中和アッセイで測定する。
ＮＨＰは１日目及び２９日目に３０または１００μｇのｍＲＮＡワクチンを接種され、分析される。中和抗体応答は、レンチウイルス及びＶＳＶベースのＰｓＶＮアッセイの両方を使用して測定される。両方のアッセイの疑似ウイルスには、全長Ｓｐｉｋｅタンパク質が組み込まれており、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（Ｄ６１４）、Ｇ６１４、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１系統に存在する単離された、部分的、または完全な変異セットを与える。
上記のように収集されたヒト血清は、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１に対する中和に関してさらに分析される。
方法
動物試験。アカゲザル（ＮＨＰ）は、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１０または３０μｇのｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡワクチン」）でプライム－ブーストスケジュールで免疫して、追加免疫投与の４週間後（５６日目）に血清を採取する。
ヒト試験。ヒトを、プライム－ブーストスケジュールで、リンカーで連結されたＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、及びインフルエンザヘマグルチニン膜貫通（ＨＡＴＭ）ドメインを含むタンパク質（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）をコードする１００μｇのｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡワクチン」）で免疫し、ブーストの１週間後に血清を回収する（３６日目）。
レンチウイルスベースの疑似ウイルスの中和。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 偽型レンチウイルスを生成するには、コドン最適化されたＣＭＶ／Ｒ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）プラスミドを構築し、その後、Ｄ６１４Ｇ変異を含むように部位特異的突然変異誘発によって改変する。追加のスパイク変異がＤ６１４Ｇバックボーンに実装されている（すなわち、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ４３９Ｋ、及びＢ．１．１．７及びＢ．１．３５１変異型の組み合わせに類似したその他の組み合わせ；表３）。疑似ウイルスは、以前に記載されているように、ルシフェラーゼレポーター、レンチウイルスバックボーン、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）に同時トランスフェクションすることによって産生される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６，７７１２）。さらに、ヒト膜貫通プロテアーゼ セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）プラスミドを同時トランスフェクトして、疑似ウイルスを生成する（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ ＨＡＴ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０，９８９６－９８９８（２００６））。血清中の中和抗体応答は、以前に記載されているように擬似中和アッセイによって評価される（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。簡単に説明すると、熱不活化血清を二連で連続希釈し、疑似ウイルスと混合し、３７℃で５％のＣＯ２でおよそ４５分間インキュベートする。２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２．ｍＦ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で７．５×１０４細胞／ｍＬの濃度に希釈し、血清－疑似ウイルス混合物に添加する。７２時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性（相対光単位（ＲＬＵ）で）を測定する。中和パーセントは、非感染細胞を１００％中和、及び疑似ウイルスのみに感染した細胞を０％中和として考慮して正規化されている。ＩＣ５０力価は、Ｐｒｉｓｍ ｖ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）における対数（アゴニスト）対正規化応答（可変傾き）非線形回帰モデルを使用して決定される。
組換えＶＳＶベースの疑似ウイルスの中和。ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株（Ｄ６１４）、Ｄ６１４Ｇ、または表２及び３に列挙されている指定のスパイク変異型のコドン最適化された全長スパイクタンパク質を、ｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長スパイク偽型組換えＶＳＶ－ΔＧ－ホタルルシフェラーゼウイルスを作成するには、以前に記載されているとおり、ＢＨＫ－２１／ＷＩ－２細胞（Ｋｅｒａｆａｓｔ、ＥＨ１０１１）にスパイク発現プラスミドをトランスフェクトし、その後ＶＳＶΔＧ－ホタル－ルシフェラーゼを感染させる（Ｗｈｉｔｔ，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９，３６５－３７４）。中和アッセイでは、段階希釈した血清サンプルを疑似ウイルスと混合し、３７℃で４５分間インキュベートする。続いて、ウイルスと血清の混合物を使用して Ａ５４９－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を３７℃で１８時間感染させた後、ルシフェラーゼシグナル（相対発光単位；ＲＬＵ）を測定するためにＯＮＥ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を添加する。中和のパーセンテージは、ウイルスのみの対照のＲＬＵに基づいて計算し、続いて４パラメーターロジスティック曲線（Ｐｒｉｓｍ ８）を使用して分析する。
実施例２．変異型スパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するための、変異型スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの２回用量による免疫
（実施例１に記載のような）ＬＮＰ中に配合された変異型スパイクタンパク質（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、マウス、ハムスター、アカゲザル、またはヒトなどの対象に投与する。３週間などの一定期間後、ブースター用量として対象に同じ組成物をワクチン接種する。ｍＲＮＡによってコードされる変異型スパイクタンパク質を表３に記載する。スパイクタンパク質特異的中和力価は、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス中和アッセイによって定量され、このアッセイでは、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスが、組成物中のｍＲＮＡによってコードされる同じ変異型スパイクタンパク質を発現する。
ブースター投与後３週間などの一定期間後、野生型または変異型スパイクタンパク質を発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を対象の鼻腔に導入することによって感染からの防御を評価する。次に、ウイルスチャレンジ後のモニタリング期間中に鼻腔内に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡまたはタンパク質の量を定量するために、対象を２週間などのある期間の経過にわたってモニタリングする。
実施例３．変異型スパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するための、野生型スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡのプライム用量及び変異型スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡのブースター用量による免疫
（実施例１に記載のような）ＬＮＰ中に配合されたスパイクタンパク質抗原融合体（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、マウス、ハムスター、アカゲザル、またはヒトなどの対象に投与する。３週間などの一定期間後、ブースター用量として、ＬＮＰ中に配合された変異型スパイクタンパク質（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を対象にワクチン接種する。ｍＲＮＡによってコードされる変異型スパイクタンパク質を表３に記載する。スパイクタンパク質特異的中和力価は、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス中和アッセイによって定量され、このアッセイでは、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスが、ブースター用量で用いられる組成物中のｍＲＮＡによってコードされる同じ変異型スパイクタンパク質を発現する。
ブースター投与後３週間などの一定期間後、野生型または変異型スパイクタンパク質を発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を対象の鼻腔に導入することによって感染からの防御を評価する。次に、ウイルスチャレンジ後のモニタリング期間中に鼻腔内に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡまたはタンパク質の量を定量するために、対象を２週間などの期間にわたってモニタリングする。
実施例４．変異型スパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するための、野生型スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡのプライム用量、及び変異型スパイクタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡのブースター用量による免疫
（実施例１に記載のような）ＬＮＰ中に配合されたスパイクタンパク質抗原融合体（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、マウス、ハムスター、アカゲザル、またはヒトなどの対象に投与する。３週間などの一定期間後、ブースター用量として、ＬＮＰ中に配合された種々の変異型スパイクタンパク質抗原融合体（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）を各々がコードする複数のｍＲＮＡを含む組成物を対象にワクチン接種する。ｍＲＮＡによってコードされる変異型スパイクタンパク質抗原融合体を表３に記載する。スパイクタンパク質特異的力価を、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス中和アッセイによって定量し、このアッセイでは、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスがスパイクタンパク質抗原融合タンパク質の野性型配列またはブースター用量の組成物によってコードされる変異型スパイクタンパク質抗原融合体を発現する。
ブースター投与後３週間などの一定期間後、野生型または変異型スパイクタンパク質を発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を対象の鼻腔に導入することによって感染からの防御を評価する。次に、ウイルスチャレンジ後のモニタリング期間中に鼻腔内に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡまたはタンパク質の量を定量するために、対象を２週間などの期間にわたってモニタリングする。
実施例５．変異型スパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するための、変異型スパイクタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡの２回用量による免疫
（実施例１に記載のような）ＬＮＰ中に配合された、種々の変異型スパイクタンパク質抗原融合体（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）を各々がコードする複数のｍＲＮＡを含む組成物を、マウス、ハムスター、アカゲザル、またはヒトなどの対象に投与する。ｍＲＮＡによってコードされる変異型スパイクタンパク質抗原融合体を、表３に記載する。３週間などの一定期間後、１回目のブースター用量として対象に同じ組成物をワクチン接種する。スパイクタンパク質特異的力価を、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス中和アッセイによって定量し、このアッセイでは、ＶＳＶΔＧベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスが、組成物によってコードされる野性型スパイクタンパク質または変異型スパイクタンパク質を発現する。
１回目のブースター投与後３週間などの一定期間後、野生型または変異型スパイクタンパク質を発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を対象の鼻腔に導入することによって感染からの防御を評価する。次に、ウイルスチャレンジ後のモニタリング期間中にわたって鼻腔内に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡまたはタンパク質の量を定量するために、対象を２週間などの期間にわたってモニタリングする。特定の集団では、３回目の投与が別のブースター投与として投与されてもよい。
実施例６：コロナウイルス株チャレンジ
本研究は、ハムスター、マウス及び／またはウサギにおける、コロナウイルスによる致死チャレンジに対する、コロナウイルス抗原（例えば、スパイク（Ｓ）タンパク質、スパイクタンパク質のＳ１サブユニット（Ｓ１）、またはスパイクタンパク質のＳ２サブユニット（Ｓ２）、ドメインなど）、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする、本明細書に開示されるｍＲＮＡを含む候補コロナウイルスワクチンの有効性を試験するように設計されている。動物は致死量（１０ｘＬＤ９０；約１００プラーク形成単位；ＰＦＵ）のコロナウイルスでチャレンジされる。
使用した動物は、約６～８週齢の動物が約１０匹の群である。動物は、０週目と３週目にＩＭ、ＩＤまたはＩＶ投与経路でワクチン接種される。候補ワクチンは化学的に修飾されているか、または未修飾のものである。動物血清を微量中和について試験する。次いで、動物に、約６～８週目に、ＩＮ、ＩＭ、ＩＤまたはＩＶ投与経路を介して、約１ ＬＤ９０のコロナウイルスをチャレンジする。エンドポイントは、感染、死亡、または安楽死後約１３～１５日目である。３０％を超える体重減少、極度の嗜眠または麻痺によって判断される重篤な症状を示す動物は安楽死させられる。体温と体重は毎日評価され、記録される。
実施例７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡワクチン構築物のｉｎ ｖｉｖｏ発現
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの各後肢に、２μｇまたは１０μｇのＣＯＶＩＤ－１９構築物またはトリス緩衝液（対照として）を筋肉内投与する。構築物は、カチオン性脂質ナノ粒子、１０．７ｍＭ酢酸ナトリウム、８．７％スクロース、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中に本明細書に開示される抗原をコードする任意のｍＲＮＡを含む。１日後、脾臓及びリンパ節を採取し、フローサイトメトリーを使用してタンパク質の発現を検出する。
実施例８－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡはヒト化マウスを致死的チャレンジから防御する
ヒト化ＤＰＰ４ ２８８／３３０＋／＋マウスを、０．０１、０．１、または１μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡコード抗原で０週目及び３週目に免疫する。ニセの免疫マウスをＰＢＳで免疫する。ブーストの４週間後、マウスに致死量のマウス適応型ＳＡＲＳ－ＣｏＶをチャレンジする。チャレンジ後、マウスの体重減少とウイルス感染の兆候をモニターする。チャレンジ後３日目及び５日目に、ウイルス力価及び出血の分析のために、１群あたり５匹のマウスから肺を採取する。
実施例９－Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質抗原をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡの免疫原性（１回目及び２回目のブースター用量）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１日目と２２日目に、スパイクタンパク質抗原融合体（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）をコードする０．１μｇまたは１μｇのｍＲＮＡで免疫した（ｎ＝８／群）。続いてマウスに、２１３日目に最初のブースター用量（用量３；０．１μｇまたは１μｇ）を投与し、２３４日目に２回目のブースター用量（用量４；０．１μｇまたは１μｇ）を投与した。１回目及び２回目のブースター用量には、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して次の変異を有するスパイクタンパク質抗原融合体をコードするｍＲＮＡが含まれる：Ｌ１８Ｆ、ΔＨ６９、ΔＶ７０、Ｄ８０Ａ、ΔＹ１４４、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２、Δ２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙ）。各ワクチンでは、ｍＲＮＡは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化アミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に製剤化された。ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールはコレステロールであり、及びイオン化可能アミノ脂質は、例えば、化合物１の構造を有した。
３６日目、２１２日目、及び２３３日目に血液を採取し、本明細書に記載の疑似ウイルス中和アッセイによって分析した。簡単に説明すると、変異Ｄ６１４Ｇ（Ｄ６１４Ｇとして知られるコンパレーター変異型）を含む武漢－Ｈｕ－１スパイクを単独で、またはＢ．１．３５１で見つかった追加の変異（Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖ）と組み合わせて用いて、疑似ウイルスを構築した。中和アッセイは、ＡＣＥ２４を過剰発現するように安定に形質導入された２９３Ｔ細胞において、検証済みのレンチウイルスベースのスパイク偽型ウイルスアッセイを使用して実行した。
図４Ａ～４Ｃは、２１２日目（３回目の投与、１μｇ前）及び２３３日目（３回目の投与後）におけるマウスの中和抗体力価を示す。図４Ａに示すように、中和抗体力価は、Ｄ６１４変異型スパイクタンパク質に対して２１２日目から２３３日目に増大し、Ｂ．１．３５１変異型スパイクタンパク質に対してはより劇的に増大した。どちらの場合も、２３３日目の抗体力価は、３６日目から２１２日目までの６か月間で約２分の１に低下した。例えば、Ｄ６１４Ｇに対する中和抗体力価（ＩＤ５０）は、３６日目では２９２４２、２１２日目では１５，４４４であった（データは示さず）。図４Ｂに示されるように、２３３日目の中和力価は、Ｄ６１４Ｇ変異型スパイクタンパク質に対して２１２日目よりも４．９倍高く、Ｂ．１．３５１変異型スパイクタンパク質に対して４１倍高かった。図４Ｃは、Ｄ６１４Ｇ変異型スパイクタンパク質が、Ｂ．１．３５１変異型スパイクタンパク質に対するものよりも４．４倍高い中和力価を誘発したことを示す。しかし、３回目の投与後（２３３日目）、Ｄ６１４Ｇ変異型スパイクタンパク質に対して誘発された中和力価は、Ｂ．１．３５１変異型スパイクタンパク質によって誘発された中和力価の０．５倍であった。
図５Ａ～５Ｃは、２１２日目（３回目の投与前、０．１μｇ）及び２３３日目（３回目の投与後）におけるマウスの中和抗体力価を示す。図５Ａに示すように、中和抗体力価は、Ｄ６１４変異型スパイクタンパク質に対して、及びＢ．１．３５１変異型スパイクタンパク質に対して２１２日目から２３３日目に増大した。どちらの場合も、２３３日目の抗体力価は３６日目（２回目の投与から１４日後）に測定した抗体力価よりも高かった。図５Ｂに示されるように、２３３日目の中和力価は、Ｄ６１４Ｇ変異型スパイクタンパク質に対して２１２日目よりも２２倍高く、Ｂ．１．３５１変異型スパイクタンパク質に対して４１倍高かった。図５Ｃは、Ｄ６１４Ｇ変異型スパイクタンパク質が、Ｂ．１．３５１変異型スパイクタンパク質に対するものよりも３．２倍高い中和力価を誘発したことを示す。しかし、３回目の投与後（２３３日目）、Ｄ６１４Ｇ変異型スパイクタンパク質に対して誘発された中和力価は、Ｂ．１．３５１変異型スパイクタンパク質によって誘発された中和力価よりも１．８倍高かった。
実施例１０．変異型スパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するための、変異型スパイクタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡの２回投与による免疫
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１日目と２２日目に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする１μｇまたは１０μｇのｍＲＮＡまたはＰＢＳ（対照として）を片方の後脚の筋肉内に投与する（５０μＬの用量として処方）。各ワクチンでは、ｍＲＮＡは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化アミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に製剤化する。ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールはコレステロールであり、及びイオン化可能アミノ脂質は、例えば、化合物１の構造を有する。試験した群を表４に示す。


血液サンプルを１４日目、２１日目、及び３６日目にマウスから採取し、本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡ及び中和アッセイによって分析する。
実施例１１：インビトロ中和スクリーニング
Ｄ６１４Ｇ変異型のコドン最適化全長スパイクタンパク質またはＢ．１．３５１変異型のスパイクタンパク質をｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。中和アッセイでは、段階希釈した血清サンプルを疑似ウイルスと混合し、３７℃で４５分間インキュベートした。血清サンプルは、１μｇのＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ、ＮＴＤ＿ｅｘｔ－ＲＢＤ＿ｅｘｔ－ＴＭまたはＲＢＤ＿＿ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿３１７＿５１６＿＿ＴＭ（ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）を投与されたマウス由来であった。続いて、ウイルスと血清の混合物を使用して、Ａ５４９－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を３７℃で１８時間感染させた後、中和抗体力価を測定した。その結果を図１～図３に示しており、ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭは、Ｄ６１４Ｇ疑似ウイルスから生じる力価と比較して、Ｂ．１．３５１変異型に対する中和力価が３．３分の１に減少し、ＮＴＤ＿ｅｘｔ－ＲＢＤ＿ｅｘｔ－ＴＭは、Ｄ６１４変異型とＢ．１．３５１変異型との間の中和力価が３．５分の１に減少し、ＲＢＤ＿＿ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿３１７＿５１６＿ＴＭでは、Ｄ６１４Ｇ疑似ウイルスに起因する力価と比較して、Ｂ．１．３５１変異型に対する中和力価の有意な低下はなかったことが実証される。
実施例１２．変異型スパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するための、変異型スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの４回用量による免疫
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、特にＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭをコードするｍＲＮＡを１μｇ（図６Ａ～図６Ｄ）もしくは０．１μｇ（図７Ａ～図７Ｄ）、またはＰＢＳ（対照として）を、片方の後脚に筋肉内に（５０μＬ用量として配合）、１日目（１回目の投与、プライム）及び２２日目（２回目の投与、ブースター）に投与した。２１３日目（３回目の用量）及び２３４日目（４回目の用量）に、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原（ｍＲＮＡ－１２８３．３５１）、ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ＿Ｌ１８Ｆ＿Ｄ８０Ａ＿Ｄ２１５Ｇ＿Ｌ２４２＿２４４ｄｅｌ＿Ｒ２４６Ｉ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ（Ｂ．１．３５１変異型に関連する変異が含まれている）をコードするｍＲＮＡの１μｇ（図６Ａ～図６Ｄ）または０．１μｇ（図７Ａ～図７Ｄ）のいずれかをマウスに投与した。各ワクチンでは、ｍＲＮＡを、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化アミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールはコレステロールであり、及びイオン化可能アミノ脂質は、例えば、化合物１の構造を有した。２１２日目（３回目の投与前）、２３３日目（３回目の投与後２１日、４回目の投与前）、及び２４８日目（４回目の投与後の１４日）にマウスから血清を採取し、１）ＷＨ２０２０全長スパイクタンパク質の配列に対するＤ６１４Ｇ変異、または２）Ｂ．１．３５１変異型に関連する変異のいずれかを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する、ＶＳＶベースの疑似ウイルスに対する中和力価を分析した。
各ワクチン中の１μｇ用量のｍＲＮＡを投与されたマウスについて、これらの中和アッセイの結果を図６Ａ～図６Ｄに示す。３回目及び４回目の用量のそれぞれは、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質に対する血清の平均中和力価を増大させた（図６Ａ）。各スパイクタンパク質を保有する疑似ウイルスに対する中和力価は、経時的に増大し、この増大はＢ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価においてより顕著であった（図６Ｂ）。３回目の投与前、血清は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質の中和において、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質よりも約４．４倍有効であった（図６Ｃ）。しかし、３回目及び４回目のそれぞれの投与後、中和力価は両方のスパイクタンパク質間でほぼ同等であり、血清はＤ６１４Ｇスパイクタンパク質及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質を約９０％中和した（図６Ｃ）。さらに、４回目の投与後のいずれかのスパイクタンパク質に対する中和力価は、２回目の投与から１４日後、３６日目のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価よりも３倍を超えて高かった（図６Ａ、６Ｄ）。これらの結果によって、変異型スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与により、変異型スパイクタンパク質に対する中和抗体が効果的に誘発され、以前に投与された初期ｍＲＮＡによってコードされるスパイクタンパク質に対する抗体応答が増強（追加免疫）されることが示される。
各ワクチン中の０．１μｇ用量のｍＲＮＡを投与されたマウスについて、これらの中和アッセイの結果を図７Ａ～図７Ｄに示す。３回目及び４回目の用量のそれぞれは、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質に対する血清の平均中和力価を増大させた（図７Ａ）。各スパイクタンパク質に対する中和力価は、経時的に増大し、この増大はＢ．１．３５１スパイクタンパク質を保有する疑似ウイルスに対する中和力価においてより顕著であった（図７Ｂ）。３回目の投与前、血清は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質の中和において、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質よりも約３．５倍有効であった（図７Ｃ）。しかし、３回目と４回目のそれぞれの投与後、中和力価はＢ．１．３５１スパイクタンパク質を保有する疑似ウイルスの方が大きく、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質を保有する疑似ウイルスは、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質を３回目の投与後約１．８倍、及び４回目の投与後２．５倍、血清を中和した（図７Ｃ）。さらに、４回目の投与後のいずれかのスパイクタンパク質を保有する疑似ウイルスに対する中和力価は、２回目の投与から１４日後、３６日目のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価よりも８倍を超えて高かった（図７Ａ、７Ｄ）。これらの結果によって、変異型スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与により、変異型スパイクタンパク質を担持する疑似ウイルスに対する中和抗体が効果的に誘発され、以前に投与されたｍＲＮＡによってコードされるスパイクタンパク質に対して特異的な抗体応答が増強（追加免疫）されることが示される。
実施例１３：ＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＴＭをコードするｍＲＮＡの２回用量による免疫
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、具体的にはＮＴＤ＿ｅｘｔ－ＲＢＤ＿ｅｘｔ－ＴＭ（ＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＴＭ）をコードするｍＲＮＡを０．１μｇ、１μｇ、もしくは１０μｇ、またはＰＢＳ（対照として）を１日目（１回目の投与、プライム）及び２２日目（２回目の投与、ブースター）に片方の後脚に筋肉注射（５０μＬ用量として処方）で投与した。２１日目（１回目の投与後３週間、２回目の投与前）と３６日目（２回目の投与の２週間後）にマウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡで試験してＷＨ２０２０アミノ酸配列を有する親ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な総ＩｇＧを定量した。ＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＴＭスパイク抗原をコードするｍＲＮＡの各１回目の投与は、強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的抗体反応を誘発し、２回目の投与の追加免疫ではＩｇＧ力価がそれぞれの用量群で１０～１００倍に上昇した（図８Ａ）。
ＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ＴＭをコードする１μｇ用量のｍＲＮＡを２回ワクチン接種したマウスから３６日目に得た血清も、それぞれ異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するＶＳＶベースの疑似ウイルスのパネルに対する中和活性について評価した。試験したスパイクタンパク質のパネルを表５に示す。これには、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質、Ｐ．１スパイクタンパク質、Ｂ．１．１．７スパイクタンパク質、及びＢ．１．１．７スパイクタンパク質（Ｅ４８４Ｋ変異を含む）が含まれた。これらの中和アッセイの結果を図８Ｂ～図８Ｄに示す。ＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＴＭをコードするｍＲＮＡの１μｇ用量を２回投与すると、試験した各Ｓｐｉｋｅタンパク質を保有する疑似ウイルスに対する強力な中和抗体応答が誘発された（図８Ｂ）。Ｅ４８４Ｋ変異を有する各変異型スパイクタンパク質、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、及びＢ．１．１．７に対する中和力価は、Ｄ６１４Ｇ参照スパイクタンパク質に対する中和力価よりも２～３分の１低かった（図８Ｃ）。しかし、２Ｐ安定化ＷＨ２０２０全長スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを１μｇ用量で２回投与したマウスから得た参照血清と比較して、ＮＴＤ－ｅｘｔ－ＲＢＤ－ｅｘｔ－ＴＭをコードするｍＲＮＡを１μｇ用量で２回投与したマウス由来の血清は試験した各スパイクタンパク質を保有する疑似ウイルスを中和するのに１．５～２倍以上効果的であった（図８Ｂ、８Ｄ）。これらの結果によって、拡張された受容体結合ドメインと膜貫通ドメインを備えたＮＴＤ－ＲＢＤ－ＴＭ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡが、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型スパイクタンパク質に対する強力な中和抗体応答を誘発することが示される。
実施例１４－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡの３回目の投与の免疫原性
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１日目と２２日目に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする１μｇのｍＲＮＡまたはＰＢＳ（対照として）を片方の後脚の筋肉内に投与した（５０μＬの用量として処方）。次いで、マウスに、スパイクタンパク質変異型（ｍＲＮＡ－１２８３、ｍＲＮＡ－１２８３．３５１、ｍＲＮＡ－１２８３．６１７．２、ｍＲＮＡ－１２８３＋ｍＲＮＡ－１２８３．３５１、ｍＲＮＡ－１２８３＋ｍＲＮＡ－１２８３．６１７．２、またはｍＲＮＡ－１２８３＋ｍＲＮＡ－１２８３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２８３．６１７．２）をコードするｍＲＮＡを含む３回目の用量を８週目（５７日目）に投与した。各ワクチンでは、ｍＲＮＡは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化アミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に製剤化された。ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールはコレステロールであり、及びイオン化可能アミノ脂質は、例えば、化合物１の構造を有した。
血液サンプルを２１日目、３６日目、および７８日目に採取し、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡおよび中和アッセイによって分析した。中和価を表５に示す。


上記に示すように、すべての３回目（ブースター）用量では、２１日目（２回目の用量の投与直前）及び３６日目（２回目の用量の投与後２週間）で観察されたものを上回る中和抗体産生の増大が生じた。Ｓ２Ｐ抗原（二重プロリン変異を含むスパイクタンパク質）でチャレンジしたサンプルでは、３回目のショット（ブースター）後にすべての群で力価レベルの増大が見られた。すべての力価は他の製剤の２倍以内であり、組み合わせ製剤が単一（一価）製剤と同等に機能することを示している。一価基の中で、ｍＲＮＡ－１２８３．６１７．２で最も高い力価が達成され、一方、ｍＲＮＡ－１２８３＋１２８３．６１７．２製剤が最も高い力価を達成した。ＮＴＤ抗原及びＲＢＤ抗原に関しては、ｍＲＮＡ－１２８３製剤が最大の抗体力価をもたらした。
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３６ Ｗｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｒｕｍ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｍＲＮＡ－１２７３ Ｖａｃｃｉｎｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｃ２１０２１７９（２０２１）．
３７ Ｎｏｖａｖａｘ（２０２１）． Ｎｏｖａｖａｘ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ８９．３％ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ＵＫ Ｐｈａｓｅ ３ Ｔｒｉａｌ．Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｊａｎｕａｒｙ ２８，２０２１：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｒ．ｎｏｖａｖａｘ．ｃｏｍ／ｎｏｄｅ／１５５０６／ｐｄｆ
３８ Ｋ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９（ＡＺＤ１２２２） ｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ ２０２０１２／０１（Ｂ．１．１．７）：ａｎ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２１）００６２８－０（２０２１）．
３９ Ｐｆｉｚｅｒ（２０２１） Ｐｆｉｚｅｒ ａｎｄ ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｃｏｎｆｉｒｍ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｎｏ ｓｅｒｉｏｕｓ ｓａｆｅｔｙ ｃｏｎｃｅｒｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｐ ｔｏ ｓｉｘ ｍｏｎｔｈｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｅｃｏｎｄ ｄｏｓｅ ｉｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｔｏｐｌｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌａｎｄｍａｒｋ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｕｄｙ． Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ（プレスリリース） Ａｐｒｉｌ １，２０２１：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｆｉｚｅｒ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ－ｄｅｔａｉｌ／ｐｆｉｚｅｒ－ａｎｄ－ｂｉｏｎｔｅｃｈ－ｃｏｎｆｉｒｍ－ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃａｃｙ－ａｎｄ－ｎｏ－ｓｅｒｉｏｕｓ．
４０ Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５８６，５６７－５７１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２６２２－０（２０２０）．
４１ Ｈｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｂ．１．３５１ ａｎｄ Ｂ．１．１．７ ｔｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｒｅｓ Ｓｑ，ｄｏｉ：１０．２１２０３／ｒｓ．３．ｒｓ－１５５３９４／ｖ１（２０２１）．
４２ Ｗｒｏｂｅｌ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ｂａｔ ＲａＴＧ１３ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｆｏｒｍ ｏｎ ｖｉｒｕｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｒｉｎ－ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７，７６３－７６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９４－０２０－０４６８－７（２０２０）．
４３ Ｌａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＡＣＥ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｎａｔｕｒｅ ５８１，２１５－２２０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２１８０－５（２０２０）．
４４ Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｓｃｉ Ａｄｖ ６，ｅａａｚ６８９３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｚ６８９３（２０２０）．
４５ Ｈａｓｓｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １５，１－１１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１９．０１．０１３（２０１９）．
４６ Ｊｏｈｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉ－ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｅｌｉｃｉｔ ｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｖａｃｃｉｎｅ ３６，１６８９－１６９９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１８．０１．０２９（２０１８）．
４７ Ｂａｈｌ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｂｙ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ１０Ｎ８ ａｎｄ Ｈ７Ｎ９ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５，１３１６－１３２７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０３．０３５（２０１７）．
４８ Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｆ－Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｇｉｖｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｏ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂｕｔ ａｔ Ｍｕｃｈ Ｌｏｗｅｒ Ｄｏｓｅｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６，４４６－４５５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．１１．０１７（２０１８）．
４９ Ｗｈｉｔｔ，Ｍ．Ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＳＶ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤｅｌｔａＧ－ＶＳＶ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９，３６５－３７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２０１０．０８．００６（２０１０）．
追加の配列
本明細書に記載の任意のｍＲＮＡ配列が５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることを理解されたい。ＵＴＲ配列は、以下の配列から選択してもよいが、その他の既知のＵＴＲ配列を使用してもよい。また、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡ構築物はさらに、ポリＡテール及び／またはキャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含んでもよいことも理解のこと。さらに、本明細書に記載の多数のｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列がシグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されたシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが、異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグに置換されても、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグが省略されてもよいことを理解されたい。
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３３）
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号２）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号３４）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号４）

等価物
本明細書に開示する全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用されている主題に関し、参照によって本明細書に援用され、場合によってはそれが文書全体を包含することもある。
本明細書において、明細書中及び請求項中の「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解すべきである。
また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されることも理解されたい。
請求項及び上記明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」「～から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などはオープンエンドであること、すなわち後に続くものを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。「～からなる」「～から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。
数値の手前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が示される場合、範囲の上端と下端との間でかつそれを含む各値は、本明細書において具体的に企図され記載されている。

Claims (59)

  1. 第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸であって、ここで、前記抗原が、第１の流行するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株の抗原に関する少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異がアミノ酸の置換、欠失または挿入であり、前記抗原が、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではなく、前記核酸が脂質ナノ粒子内にある、前記核酸。
  2. 前記第１及び第２のウイルス株が１年のうち少なくとも一部の間流行している、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記第１及び第２のウイルス株が同じパンデミック期間または流行期間中に流行している、請求項１に記載の核酸。
  4. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株の抗原に対して第２のアミノ酸変異を有し、前記変異がアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記第２の変異は流行している第３のウイルス株に対応する、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸。
  5. 前記脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸。
  6. 前記脂質ナノ粒子が、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項５に記載の核酸。
  7. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸。
  8. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸。
  9. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＲＢＤとＮＴＤの組み合わせである、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸。
  10. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、リンカーによって結合されたＮＴＤ、ＲＢＤ、及び膜貫通ドメインである、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸。
  11. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、リンカーによって連結されたＮＴＤ、ＲＢＤ、及びインフルエンザ赤血球凝集素膜貫通（ＨＡＴＭ）ドメイン（ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＨＡＴＭ）である、請求項１０に記載の核酸。
  12. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＮＴＤ－ＲＢＤ融合体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸。
  13. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＳ１タンパク質サブユニットである、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸。
  14. 前記抗原における前記アミノ酸変異が、前記第１のウイルスにおける対応する構造または機能とは量または種類が異なるウイルスの構造または機能に関連する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸。
  15. 前記アミノ酸変異の前記機能が、ＡＣＥ２受容体結合、ウイルス伝播性、ウイルス取り込み、ウイルス病因、フリン切断の変化、またはウイルス複製である、請求項１４に記載の核酸。
  16. 前記核酸がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の核酸。
  17. 組成物であって、
    第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のｍＲＮＡとを含み、ここで前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、ここで前記変異は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない、前記組成物。
  18. 前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株であり、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株であり、前記第１及び第２のウイルス株が、１年間のうち少なくともある期間、人口に蔓延している、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記ｍＲＮＡが、組成物中に互いのｍＲＮＡに対して約１：１の比で存在する、請求項１７～１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子にあり、前記脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記脂質ナノ粒子が４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ－修飾脂質を含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記脂質ナノ粒子が４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ－修飾脂質を含む、請求項２０～２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記脂質ナノ粒子が、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン化可能アミノ脂質を含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記イオン化可能なアミノ脂質が化合物１の構造を有する、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の組成物：
  25. 前記ステロールがコレステロールまたはその変異型である、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記中性脂質が１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項２０～２５のいずいれか１項に記載の組成物。
  27. 前記ＰＥＧ修飾脂質が１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）である、請求項２０～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 方法であって、
    第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２の核酸を含む第２のワクチンの第２の有効量を対象に投与することであって、前記対象は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む１回目のワクチンの第１の有効量を以前に投与されている、前記投与することを含み、
    ここで、前記第２のワクチンは、前記第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の対応するアミノ酸配列に関して少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異がアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記第１及び第２の抗原のそれぞれが、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない、前記方法。
  29. 前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原であり、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの抗原である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表しており、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの代表である、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が複数の第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを代表しているか、及び／または前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が第２の複数の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの代表である、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが対象集団に存在する期間中に検出される免疫優勢な新興株または懸念される変異株である、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが少なくとも１年以内に対象集団において検出可能である、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、同じシーズンの間に対象集団において検出可能である、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記第２の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の流行ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、同じパンデミック期間または流行期の間に対象集団において検出可能である、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸がＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２８～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２８～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第２の核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２８～３６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記第２のワクチンが、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸をさらに含む、請求項２８～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第１の核酸及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする前記第２の核酸は、１：１の比で前記第２のワクチン中に存在する、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記第１及び／または第２のワクチンが一価ワクチンである、請求項２８～３８のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記第１及び／または第２のワクチンが、複数の懸念される変異株を代表する抗原をコードする複数の核酸を含む多価ワクチンである、請求項２８～４０のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、１回以上の用量から構成される１回目のワクチンとして前記対象に投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が１回以上の用量でブーストとして前記対象に投与される、請求項２８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、１回以上の用量から構成される１回目のワクチンとして前記対象に投与され、前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が１回以上の用量でブーストとして前記対象に投与される、請求項２８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記第１及び第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がブースト用量として前記対象に一緒に投与され、任意選択で前記第１及び第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が１：１の比率で、前記ブースト用量に存在する、請求項２８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がワクチン接種を完了するためのプライム用量及びブースト用量として前記対象に投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、前記１回目のワクチン接種が完了してから少なくとも３か月後に、ブースターレジメンとして前記対象に投与される、請求項２８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、最初のワクチン接種におけるプライム用量及びブースト用量として前記対象に投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、前記最初のワクチン接種から６か月超経過した後にブースト投与として前記対象に投与される、請求項２８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ブースト用量が、複数の懸念される変異株に対する防御を提供するための季節的ブーストまたはパンデミックシフトブーストである、請求項４６～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 方法であって、
    第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、ここで、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新興の変異型であり、前記抗原は、前記初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に関して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異はアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記対象は、前記初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に関して血清陽性である、前記方法。
  50. 方法であって、
    第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、ここで、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新興の変異型であり、前記抗原は、前記初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に関して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異はアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり、前記対象は、前記初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に関して血清陰性である、前記方法。
  51. 前記ワクチンの第１の用量が投与されてから２週間から１年の間に、前記対象にワクチンの第２の用量が投与される、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 前記対象には、前記ワクチン投与後２週間から１年の間に第２のワクチンを投与し、前記第２のワクチンは、前記初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの前記対応するタンパク質抗原をコードする第２の核酸を含む、請求項４９または５０に記載の方法。
  53. 前記第２のワクチンが、前記第１及び第２の核酸の混合物を含み、前記第１の核酸及び第２の核酸が、前記第２のワクチン中に１：１の比で存在する、請求項５２に記載の方法。
  54. 方法であって、
    第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに由来する第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むブースターワクチンを対象に投与することを含み、ここで、前記対象は、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む１回目のワクチンの少なくとも１つのプライム用量を以前に投与されており、前記ブースターワクチンが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和免疫応答を誘導するのに有効な量で投与され、ここで前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含み、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記ブースターワクチンは、１回目のワクチンの初回投与後少なくとも６か月後に２５～１００μｇの用量で投与され、かつ、前記第１及び第２の抗原のそれぞれは、２Ｐ変異を有する全長安定化スパイクタンパク質ではない、前記方法。
  55. 前記ブースターワクチンが５０μｇの用量で投与される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ブースターワクチンが、前記１回目のワクチンの２回目の用量の少なくとも約６ヶ月後に投与される、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. 前記ブースターワクチンが、前記１回目のワクチンの２回目の用量の６～１２ヶ月後に投与される、請求項５４または５５に記載の方法。
  58. 前記ブースターワクチンが、前記１回目のワクチンの２回目の用量の少なくとも約８ヶ月後に投与される、請求項５４または５５に記載の方法。
  59. 前記ブースト用量が、複数の懸念される変異株に対する中和免疫応答を提供するための季節的ブーストまたはパンデミックシフトブーストである、段落５４～５８のいずれか１項に記載の方法。
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