JP2024503699A

JP2024503699A - バリアント株ベースのコロナウイルスワクチン

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Publication number: JP2024503699A
Application number: JP2023543035A
Authority: JP
Inventors: アンドレア・カーフィ; ギヨーム・スチュアート－ジョーンズ; ハミルトン・ベネット; カイ・ウー; ダリン・エドワーズ; デイヴィッド・リード; グオ－ユ・チュアン
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2024-01-26
Also published as: WO2022155530A1; WO2022155530A8; CA3208303A1; EP4277653A1; US20240139309A1; AU2022207495A1

Abstract

本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つ以上のバリアント株のスパイクタンパク質に対して指向されたワクチンを含む、コロナウイルスｍＲＮＡワクチン、ならびにワクチンを使用する方法を提供する。【選択図】図４０

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０２１年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１３８，２２８号に対する優先権を主張する。本出願はまた、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、それらの各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／１４０，９２０号、２０２１年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１６１，４３３号、２０２１年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１７３，９７９号、２０２１年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１９３，５４７号、２０２１年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２２２，９２５号、２０２１年９月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２４１，９６３号、２０２１年１１月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２８３，９０５号、及び２０２１年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２８４，５７０号に対する優先権を主張する。

ヒトコロナウイルスは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科の非常に伝染性の高い、エンベロープを持った一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅの２つの亜科は、ヒトの疾患を引き起こすことが知られている。最も重要なのは、β－コロナウイルス（ベータコロナウイルス）である。β－コロナウイルスは、軽度から中等度の上気道感染症の一般的な病因である。しかしながら、２０１９年１２月に中国の武漢市で最初に同定されたコロナウイルスによって引き起こされる感染症などの新型コロナウイルス感染症の発生は、死亡率の高さに関連付けられている。この最近同定されたコロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と呼ばれ（元は「２０１９新型コロナウイルス」または「２０１９－ｎＣｏＶ」と呼ばれていた）、数十万人に急速に感染した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが引き起こすパンデミック疾患は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってＣＯＶＩＤ－１９（ＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＤｉｓｅａｓｅ２０１９）と名付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離物（武漢－Ｈｕ－１；ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物）の最初のゲノム配列は、ウイルス分子進化及び疫学の分析及び解釈の、ウイルス学的な英国に本拠を置くディスカッションフォーラムで、２０２０年１月１０日に北京の中国ＣＤＣからの調査員によって発表された。配列は、次いで、２０２０年１月１２日にＧｅｎＢａｎｋに寄託され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＮ９０８９４７．１を有している。その後、いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株バリアントが同定されており、そのうちのいくつかは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離物よりも感染性が高い。

承認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸ベースのワクチンの世界的な緊急使用承認の時点では、最近発見されたバリアント、及び後に出現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の懸念されるバリアント（ＶＯＣ）と戦うための戦略は未だ存在しない。コロナウイルス感染症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックと関連付けられる継続的な健康問題及び死亡率は、国際的に大きな懸念事項である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそのバリアントによって引き起こされる公衆衛生上の危機は、これらのウイルスに対する効果的かつ安全なワクチン候補を急速に開発することの重要性を強調している。

ウイルスＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）に置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの出現は、科学者及び保健当局者の間で懸念が高まっている。宿主細胞へのコロナウイルスの進入は、ウイルスＳタンパク質のＲＢＤと宿主アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との間の相互作用によって媒介される。ワクチン開発は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質のこの領域に対する抗体応答を誘導することに焦点を当ててきた。より最近では、また、ＮＴＤにおける中和「スーパーサイト」が同定されている。ワクチン有効性の有意な減少は、Ｓタンパク質のＲＢＤ（例えば、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙ）及びＮＴＤ（例えば、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、及びΔ２４２－２４４）におけるアミノ酸置換と相関している。英国（Ｂ．１．１．７、アルファ）、南アフリカ共和国（Ｂ．１．３５１、ベータ）、ブラジル（Ｐ．１系譜、ガンマ）、ニューヨーク（Ｂ．１．５２６、イオタ）、及びカリフォルニア（Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９またはＣＡＬ．２０Ｃ系譜、イプシロン）からのこれらの置換を含有する最も最近の循環単離物のうちのいくつかは、擬似ウイルス中和（ＰｓＶＮ）アッセイにおいて回復期血清からの中和、及びある特定のモノクローナル抗体に対する耐性の低減を示した。特に、ＮＴＤサブドメイン、具体的には中和スーパーサイトにおける変異は、Ｂ．１．３５１系譜ウイルスにおいて最も広範囲に及んでいる。ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌｄｏｍａｉｎａｎｔｉｇｅｎｉｃｍａｐｐｉｎｇｒｅｖｅａｌｓａｓｉｔｅｏｆｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙｆｏｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２１．０３．０２８（２０２１）を参照されたい。

２つの直交型水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ならびに２０Ｅ（ＥＵ１）、２０Ａ．ＥＵ２、Ｄ６１４Ｇ－Ｎ４３９Ｋ、ミンククラスター５、Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．１．７＋Ｅ４８４Ｋ、及びＢ．１．３５１のＳバリアントを発現するレンチウイルスＰｓＶＮアッセイを使用して、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を受けた第１相参加者及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）からの血清の中和能力の評価が報告された。Ｗｕ，Ｋ．ｅｔａｌ．ＳｅｒｕｍＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙＥｌｉｃｉｔｅｄｂｙｍＲＮＡ－１２７３Ｖａｃｃｉｎｅ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｃ２１０２１７９（２０２１）を参照されたい。その後の研究は、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチン接種後に完全なＢ．１．３５１バリアントに対する中和力価の低減を実証したが、レベルは依然として有意であり、保護的であると予測される。この重要な懸念されるバリアントに対するｍＲＮＡ－１２７３の継続的な有効性のこの予測にもかかわらず、ワクチンが媒介する保護の持続時間は、依然として不明である。

Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ａ６７Ｖ、Δ６９－７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ／Δ１４３－１４５、Δ２１１／Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ、及びそれらの任意の組み合わせを含む、バリアントに存在する重要な変異を組み込んだ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の前融合安定化Ｓタンパク質をコードする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対するさらなるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの開発及び評価に対する必要性が依然として存在する。複数の循環バリアントならびに依然として世界的に循環している先祖の野生型ウイルスに対する網羅範囲を拡大するための、追加のワクチンが必要である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン、（ＭｏｄｅｒｎａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発された）ｍＲＮＡ－１２７３は、第１相試験のヒト参加者において高いウイルス中和力価を誘発することが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎｅｔａｌ，２０２０、Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ，２０２０）、症状を示すＣＯＶＩＤ－１９疾患及び重篤な疾患予防に非常に有効である（Ｂａｄｅｎｅｔａｌ．，２０２０）。しかしながら、英国（Ｂ．１．１．７系譜、アルファ）及び南アフリカ（Ｂ．１．３５１系譜、ベータ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの最近の出現は、それらの伝播速度の増加、ならびに自然感染またはワクチン接種によって誘発される免疫を回避する潜在性に起因して、懸念が高まっている（Ｖｏｌｚｅｔａｌ．，２０２１、Ｔｅｇａｌｌｙｅｔａｌ．，２０２０、Ｗｉｂｍｅｒｅｔａｌ．，２０２１、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０２１、Ｃｏｌｌｉｅｒｅｔａｌ．，２０２１）。

南英国で２０２０年９月に最初に検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．１．７バリアント（アルファバリアント）は、急速に広がり、伝播の増加及びより高いウイルス負荷に関連付けられている（Ｒａｍｂａｕｔｅｔａｌ．，２０２０）。このバリアントは、ウイルスゲノムに１７個の変異を有する。中でも、６９－７０ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、及びＤ１１１８Ｈを含む、８つの変異が、スパイク（Ｓ）タンパク質に位置する。このバリアントの２つの重要な特徴である、Ｓタンパク質における６９－７０欠失及びＮ５０１Ｙ変異は、伝播の増加及び死亡率の潜在的な増加に基づいて、英国の科学者及び政策立案者の間で懸念を生じており、さらなるシャットダウンをもたらしている。６９－７０欠失は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヒト回復期血清試料による中和に対する感受性の低減に関連付けられている（Ｋｅｍｐｅｔａｌ，２０２１）。Ｎ５０１は、ＡＣＥ－２受容体と相互作用する６つの重要なアミノ酸のうちの１つであり（Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．２０２０）、チロシン置換は、ＡＣＥ－２受容体に対する結合親和性が増加していることが示されている（Ｃｈａｎｅｔａｌ．，２０２０）。

Ｂ．１．３５１バリアント（ベータバリアント）は、過去数ヶ月にわたって南アフリカで出現し、Ｂ．１．１．７バリアントと同様に、伝播速度の増加及び感染後のより高いウイルス負荷が報告されている（Ｔｅｇａｌｌｙｅｔａｌ．，２０２０）。Ｓタンパク質に位置する変異は、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、及びＡ７０１Ｖの変化を伴うＢ．１．１．７バリアントよりも広範であり、これらの変異のうちの３つ（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）は、ＲＢＤに位置する。Ｂ．１．３５１は、ブラジルで報告されたバリアントとＲＢＤの重要な変異を共有している（Ｔｅｇａｌｌｙｅｔａｌ．，２０２０、Ｎａｖｅｃａｅｔａｌ．，２０２１）。ＲＢＤが、抗体を中和するための主要な標的であるので、これらの変異は、既に承認されており、先に開発中のモノクローナル抗体、ならびに感染またはウイルスを中和することにおけるワクチン接種によって誘発されるポリクローナル抗体の有効性に影響を与え得る（Ｇｒｅａｎｅｙｅｔａｌ．，２０２１、Ｗｉｂｍｅｒｅｔａｌ．，２０２１）。

最近のデータは、Ｂ．１．３５１バリアント、Ｅ４８４Ｋに存在する重要な変異が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に対する耐性を付与し、モノクローナル抗体療法の治療有効性を潜在的に制限することを示唆している（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０２１、Ｇｒｅａｎｅｙｅｔａｌ．，２０２０、Ｗｅｉｓｂｌｕｍｅｔａｌ．，２０２０、Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０２０、Ｗｉｂｍｅｒｅｔａｌ．，２０２１）。さらに、Ｅ４８４Ｋ変異は、回復期血清のパネルに対して中和を低減することが示された（Ｗｅｉｓｂｌｕｍｅｔａｌ．，２０２０、Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０２０、Ｗｉｂｍｅｒｅｔａｌ．，２０２１）。ワクチン接種の観点では、ｍＲＮＡ－１２７３が、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物に対して、回復期血清よりも有意に高い中和力価を誘導することは明らかである（Ｊａｃｋｓｏｎｅｔａｌ，２０２０）。組換えＶＳＶＰｓＶＮアッセイを使用した最近の研究は、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンを接種した参加者の血清が、Ｅ４８４ＫまたはＫ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０Ｙの組み合わせに対する中和力価を低減したことを示した（Ｗａｎｇｅｔａｌ，２０２１）が、しかしながら、Ｂ．１．１．７またはＢ．１．３５１バリアントに見出されるＳ変異の完全なコンステレーションに対するｍＲＮＡ－１２７３臨床試験参加者からの血清の評価は行われなかった。

元のＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物、Ｄ６１４Ｇバリアント、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１バリアント、ならびに以前に出現したバリアント（２０Ｅ、２０Ａ．ＥＵ２、Ｄ６１４Ｇ－Ｎ４３９Ｋ、及びミンククラスター５バリアント）からのＳタンパク質を用いる組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＰｓＶＮアッセイに対して、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンを接種した第１相臨床試験参加者からの血清の中和を調べた（データは、実施例に論じられる）。Ｓタンパク質のＲＢＤ領域に存在する単一の変異及び変異の組み合わせの両方の効果を評価した。加えて、ワクチンが誘導する免疫原性及び保護についての有用な前臨床モデルであったので、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンを２つの異なる用量レベルで受けたＮＨＰからの血清に対して、ＶＳＶ及び擬似型レンチウイルス中和アッセイで直交型評価を実施した。これらのアッセイの両方を使用することによって、擬似ウイルス中和に関する確認データが提供された。全体として、ｍＲＮＡ－１２７３を受けたヒト及び非ヒト霊長類におけるこの包括的な擬似ウイルス中和分析は、ワクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントによってどのように影響を受け得るかを解明するのに必要な、重要な実証を提供する。

本発明は、とりわけ、（ｍＲＮＡ－１２７３によってコードされる）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原とは少なくとも１つのアミノ酸変異が変動する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むワクチンに関する。そのようなワクチンは、任意選択で、本明細書ではバリアントワクチンと称され、血清陽性または血清陰性の対象に投与することができる。例えば、対象は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがあるか、または以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を誘導する用量のワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を投与されたことがあり得るので、ナイーブであってもよいか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と反応する抗体を有していなくてもよいか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する既存の抗体を有していてもよい。バリアントワクチンは、対象が受けるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含む唯一のワクチンであり得る。あるいは、バリアントワクチンは、初回免疫及び／または追加免疫用量として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含む他のワクチンと組み合わせて投与され得る。

したがって、いくつかの態様では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、対象が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを以前に投与されたことがあり、第１及び第２の２Ｐ安定化スパイク抗原の各々が、第１の抗原及び第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、方法を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを対象に投与することと、を含み、第１及び第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸の各々が、それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを対象に投与することと、を含み、第１及び第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸の各々が、それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのものであり、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのものである、方法を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを対象に投与することと、を含み、第１及び第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸の各々が、それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表し、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表す、方法を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを対象に投与することと、を含み、第１及び第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸の各々が、それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、複数の第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表し、及び／または第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第２の複数の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表す、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが対象集団に存在する期間中に検出された、免疫優性出現株である。いくつかの実施形態では、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、少なくとも１年以内に対象集団において検出可能である。いくつかの実施形態では、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、同じ季節中に対象集団において検出可能である。いくつかの実施形態では、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、同じパンデミックまたはエンデミックの間、対象集団において検出可能である。

いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸である。

いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸は、第２の核酸であり、かつメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ以上の追加のスパイクタンパク質をコードする核酸と組み合わせて、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、スパイクタンパク質をコードする核酸ではない１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする１つ以上の追加の核酸と組み合わせて、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸を含む。

いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体応答である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞応答である。

いくつかの実施形態では、第１のコードされた抗原は、１つ以上の初回免疫または初回刺激免疫化で構成される第１のワクチンとして対象に投与され、第２のコードされた抗原は、追加免疫として対象に投与される。

いくつかの実施形態では、第２のコードされた抗原は、１つ以上の初回免疫または初回刺激免疫化で構成される第１のワクチンとして対象に投与され、第１のコードされた抗原は、追加免疫として対象に投与される。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のコードされた抗原は、追加免疫として一緒に対象に投与される。

いくつかの実施形態では、第１のコードされた抗原は、初回免疫または初回刺激免疫化として、及び追加免疫として対象に投与されて、ワクチン接種を完了する。

いくつかの実施形態では、第１のコードされた抗原は、初回免疫または初回刺激免疫化として、及び初回ワクチン接種の追加免疫として対象に投与され、第２のコードされた抗原は、初回ワクチン接種の３ヶ月超後に追加免疫として対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１のコードされた抗原は、初回免疫または初回刺激免疫化として、及び初回ワクチン接種の追加免疫として対象に投与され、第２のコードされた抗原は、初回ワクチン接種の６ヶ月超後に追加免疫として対象に投与される。いくつかの実施形態では、追加免疫は、季節的追加免疫またはパンデミックシフト追加免疫である。いくつかの実施形態では、追加免疫用量は、５０μｇである。

いくつかの実施形態では、第１の抗原は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードするｍＲＮＡであり、スパイク抗原が、配列番号２０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードするｍＲＮＡであり、スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である。

いくつかの態様では、本開示は、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第２のｍＲＮＡであって、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する、第２のｍＲＮＡと、を含み、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、互いに異なる、組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第３のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である。

いくつかの実施形態では、組成物は、第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第４のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である。

いくつかの実施形態では、組成物は、第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第５のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である。

いくつかの実施形態では、組成物は、第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第６のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のウイルス株、ならびに任意選択で、第３、第４、第５、及び第６のウイルス株は、１年間の少なくとも一部分の間、集団内で拡散している。

いくつかの態様では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイクタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を提供し、２Ｐ安定化スパイクタンパク質が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、２Ｐ安定化スパイクタンパク質が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株からのスパイクタンパク質の２Ｐ安定化バージョンであり、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株が、配列番号３６のスパイクタンパク質を含む。

本開示のいくつかの態様では、配列番号５、８、１１、１４、１７、３０、３３、３６、３９、及び４２のうちのいずれか１つのタンパク質に対し少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡが提供される。

本開示のいくつかの態様では、配列番号１、６、９、１２、１５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４５のうちのいずれか１つのＲＮＡに対し少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するｍＲＮＡが提供される。

本開示のいくつかの態様では、配列番号１、６、９、１２、１５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４５のうちのいずれか１つのＲＮＡに対し少なくとも９８％の配列同一性を有するｍＲＮＡが提供される。

本開示のいくつかの態様では、配列番号１、６、９、１２、１５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４５のうちのいずれか１つを含むｍＲＮＡが提供される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、完全に修飾される。いくつかの実施形態では、化学修飾は、１－メチルシュードウリジンである。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にあり、脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。

いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有する：

いくつかの実施形態では、ステロールは、コレステロールまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、中性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）である。

いくつかの態様では、本開示は、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のアミノ酸配列を有する、第１のメッセンジャーリボ核酸と、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第２のｍＲＮＡであって、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する、第２のｍＲＮＡと、を含み、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原及び第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、互いに異なる、組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である。

いくつかの態様では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、対象が、配列番号２１または２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陽性である、方法を提供する。

本開示の別の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、対象が、配列番号２１または２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陰性である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、対象は、第１の用量のワクチンが投与された後、２週間～１年の間に第２の用量のワクチンを投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ワクチンが投与された後、２週間～１年の間に第２のワクチンを投与され、第２のワクチンが、配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２のワクチンは、第１及び第２の核酸の混合物を含み、第１の核酸及び第２の核酸が、第２のワクチン中に１：１の比で存在する。

いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、第３の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む、５０μｇのワクチンが、対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、有効用量のワクチンを投与される。いくつかの実施形態では、有効用量は、２０μｇ～５０μｇである。いくつかの実施形態では、有効用量は、２０μｇである。いくつかの実施形態では、有効用量は、２５μｇである。いくつかの実施形態では、有効用量は、３０μｇである。いくつかの実施形態では、有効用量は、４０μｇである。いくつかの実施形態では、有効用量は、５０μｇである。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号１１に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号９に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号９を含む核酸を含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号３０に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２８に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２８を含む核酸を含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２６に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２４を含む核酸を含む。

いくつかの実施形態では、第１のワクチンまたは第２のワクチンは、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号１１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のワクチンまたは第２のワクチンは、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号２６を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のワクチンまたは第２のワクチンは、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号３０を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、（ａ）対（ｂ）の比は、１：１、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、または４：１である。

いくつかの実施形態では、第２のワクチンは、（ａ）第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原をコードする核酸と、を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）対（ｂ）の比は、１：１、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、または４：１である。

いくつかの態様では、本開示は、５０μｇ～２５０μｇの、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化スパイク（Ｓ）タンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化スパイク（Ｓ）タンパク質をコードする第２のＯＲＦを含む、第２のｍＲＮＡと、イオン化可能なアミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ修飾脂質を含む脂質の混合物を含む脂質ナノ粒子と、を含む、組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、合計で５０μｇのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡとの比は、１：１である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ類似体、任意選択で、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐキャップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、任意選択で、５０～１５０ヌクレオチド（例えば、１００ヌクレオチド）の長さを有するポリ（Ａ）テールをさらに含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有する：

いくつかの実施形態では、組成物は、Ｔｒｉｓ緩衝液、スクロース、及び酢酸ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、３０～４０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、８０～９５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び５～１５ｍＭの酢酸ナトリウムをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、６～８、任意選択で、７．５のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物をヒト対象に投与することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、筋肉内、任意選択で、ヒト対象の三角筋領域に投与される。

いくつかの実施形態では、ヒト対象は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、ｍＲＮＡワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化Ｓタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化Ｓタンパク質は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化Ｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、以前に少なくとも１回用量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、以前に２回用量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与されたことがある。

いくつかの実施形態では、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの直近の投与の少なくとも６ヶ月後に、組成物をヒト対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト対象において中和抗体力価を誘導する。いくつかの実施形態では、単回用量後２９日目にセロコンバージョンを有する対象のパーセンテージは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。いくつかの実施形態では、単回用量後２９日目にセロコンバージョンを有する対象のパーセンテージは、１００％である。

本開示のさらなる態様は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むブースターワクチンを対象に投与することを含み、対象が、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む第１のワクチンの少なくとも１つの初回免疫用量を以前に投与されたことがあり、ブースターワクチンが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和免疫応答を誘導するための有効量で投与され、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含み、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、ブースターワクチンが、第１のワクチンの第１の用量の少なくとも６ヶ月後に２５～１００μｇの投薬量で投与され、第１の抗原が、２Ｐ変異を有する完全長安定化スパイクタンパク質である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、５０μｇの投薬量で投与される。

いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１のワクチンの第２の用量の少なくとも約６ヶ月後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１のワクチンの第２の用量の６～１２ヶ月後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１のワクチンの第２の用量の少なくとも約８ヶ月後に投与される。

いくつかの実施形態では、追加免疫用量は、複数の懸念されるバリアントに対する中和免疫応答を提供するための季節的追加免疫またはパンデミックシフト追加免疫である。

いくつかの実施形態では、第１のワクチンまたは第２のワクチンは、２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、配列番号３３を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、第１のワクチンまたは第２のワクチンは、２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、配列番号３６を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、第１のワクチンまたは第２のワクチンは、２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、配列番号３９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、第１のワクチンまたは第２のワクチンは、２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、配列番号４２を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４０に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４０を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４３に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４３を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４５に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４５を含む核酸を含む。

Ａ～Ｂは、免疫化された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）または第１相参加者からの血清によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスの中和を示す。Ａは、初回免疫－追加免疫スケジュールで、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする３０μｇのｍＲＮＡで免疫化したアカゲザル（ＮＨＰ）からの、追加免疫後４週間に回収した血清からのデータを示す。Ｂは、初回免疫－追加免疫スケジュールで、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１００μｇのｍＲＮＡで免疫化した第１相試験参加者からの、追加免疫後１週間に回収した血清からのデータを示す。中和は、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物（Ｄ６１４）または示されているスパイクバリアント（左から右へ：Ｄ６１４Ｇ、Ａ２２２Ｖ－Ｄ６１４Ｇ、Ｓ４７７Ｎ－Ｄ６１４Ｇ、Ｎ４３９Ｋ－Ｄ６１４Ｇ、ミンククラスター５バリアント）の完全長スパイクタンパク質を組み込んだ、組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルス中和アッセイによって測定した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｄ＝ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物のＤ６１４、Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。Ａ～Ｂは、元の（Ｄ６１４）、Ｄ６１４Ｇ、及びスパイクバリアントに対するＮＨＰにおける中和抗体を示す。初回免疫－追加免疫スケジュールで、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１００または３０μｇのｍＲＮＡでアカゲザル（ＮＨＰ）を免疫化し、追加免疫４週間後に血清を回収した。組換えＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイによって、中和を測定した（Ａ～Ｂ）。アッセイは、元のＤ６１４（Ｄ）、Ｄ６１４Ｇ（Ｇ）、またはＢ．１．１．７バリアント（Ａ）もしくはＢ．１．３５１バリアント（Ｂ）に存在する示されているスパイクバリアントの完全長スパイクタンパク質を組み込んだ。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｄ＝ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物のＤ６１４、Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。ＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイにおける、ＮＨＰ試料の中和曲線を示す。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１００μｇ用量のｍＲＮＡからのデータを示す。研究からの個々の動物番号を、各グラフの上に示す。Ｇ＝Ｄ６１４Ｇ。ＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイにおける、ＮＨＰ試料の中和曲線を示す。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１００μｇ用量のｍＲＮＡからのデータを示す。研究からの個々の動物番号を、各グラフの上に示す。Ｇ＝Ｄ６１４Ｇ。ＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイにおける、ＮＨＰ試料の中和曲線を示す。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする３０μｇ用量のｍＲＮＡからのデータを示す。研究からの個々の動物番号を、各グラフの上に示す。Ｇ＝Ｄ６１４Ｇ。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与後にヒトから回収したヒト血清からの、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１に対する中和アッセイの結果を示す。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与からの第１相試験参加者血清を、追加免疫後の７日後、３６日目に回収した。Ｄ６１４Ｇ（Ｇ）、またはＢ．１．１．７バリアンに存在する示されているスパイク変異を組み込んだ、組換えＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイによって、中和を測定した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｄ＝Ｄ６１４ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物、Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与後にヒトから回収したヒト血清からの、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１に対する中和アッセイの結果を示す。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与からの第１相試験参加者血清を、追加免疫後の７日後、３６日目に回収した。Ｄ６１４Ｇ（Ｇ）、またはＢ．１．３５１バリアントに存在する示されているスパイク変異を組み込んだ、組換えＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイによって、中和を測定した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｄ＝Ｄ６１４ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物、Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与後にヒトから回収したヒト血清からの、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１に対する中和アッセイの結果を示す。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与からの第１相試験参加者血清を、追加免疫後の７日後、３６日目に回収した。Ｄ６１４Ｇ（Ｇ）、またはＢ．１．１．７バリアントに存在する示されているスパイク変異を組み込んだ、組換えＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイによって、中和を測定した。個々の参加者の血清からの結果を、Ｄ６１４Ｇ及びバリアント中和力価を線で接続したドットとして各図上に表す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｄ＝Ｄ６１４ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物、Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与後にヒトから回収したヒト血清からの、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１に対する中和アッセイの結果を示す。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与からの第１相試験参加者血清を、追加免疫後の７日後、３６日目に回収した。Ｄ６１４Ｇ（Ｇ）、またはＢ．１．３５１バリアントに存在する示されているスパイク変異を組み込んだ、組換えＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイによって、中和を測定した。個々の参加者の血清からの結果を、Ｄ６１４Ｇ及びバリアント中和力価を線で接続したドットとして各図上に表す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｄ＝Ｄ６１４ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物、Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。ＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイにおける、ヒト血清試料の中和曲線を示す。各臨床試験参加者からの血清を、別々のグラフとして表す。Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。ＶＳＶベースの擬似ウイルス中和アッセイにおける、ヒト血清試料の中和曲線を示す。各臨床試験参加者からの血清を、別々のグラフとして表す。Ｇ＝Ｄ６１４Ｇバリアント。マウス血清試料の中和力価を示す。血清は、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡを投与しているマウスからであった。Ｇ＝Ｄ６１４バリアント。マウス血清試料の中和力価を示す。血清は、Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡを投与されたマウスからであった。Ｇ＝Ｄ６１４バリアント。マウス血清試料の中和力価を示す。ＰＢＳ（陰性対照）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡの投与の１５日後に、マウスから血清を得た。２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから得た血清の中和力価を示す。マウス血清試料の中和力価を示す。ＰＢＳ（陰性対照）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡの投与の１５日後に、マウスから血清を得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１（ＲＳＡ）バリアントのスパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を投与したマウスから得た血清の中和力価を示す。マウス血清試料の中和力価を示す。ＰＢＳ（陰性対照）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡの投与の１５日後に、マウスから血清を得た。ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物（各ｍＲＮＡ５μｇ、総ｍＲＮＡ１０μｇ）を投与したマウスから得た血清の中和力価を示す。マウス血清試料の中和力価を示す。ＰＢＳ（陰性対照）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡの投与の１５日後に、マウスから血清を得た。ＰＢＳを投与したマウスから得た血清の中和力価を示す。マウス血清試料の中和力価を示す。ＰＢＳ（陰性対照）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡの投与の１５日後に、マウスから血清を得た。１０μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから得た血清を使用した、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質及びＤ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対する中和力価の比較を示す。マウス血清試料の中和力価を示す。ＰＢＳ（陰性対照）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡの投与の１５日後に、マウスから血清を得た。１０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を投与したマウスから得た血清を使用した、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質及びＤ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対する中和力価の比較を示す。マウス血清試料の中和力価を示す。ＰＢＳ（陰性対照）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１０μｇのｍＲＮＡの投与の１５日後に、マウスから血清を得た。ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物（各ｍＲＮＡ５μｇ、総ｍＲＮＡ１０μｇ）を投与したマウスから得た血清を使用した、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質及びＤ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対する中和力価の比較を示す。２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的なＩｇＧの力価を示す。ＰＢＳ、１μｇまたは１０μｇの、２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（Ｍｒｎａ－１２７３．３５１）をコードするｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物（０．５μｇまたは５μｇの各ｍＲＮＡ、１μｇまたは１０μｇの総ｍＲＮＡ）を投与したマウスから、血清を得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡで免疫化したマウスによって誘発された血清の能力を示す。２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合を示す。ＰＢＳ、１μｇまたは１０μｇの、２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ＲＳＡ－ｆｕｌｌ）、２つのプロリン置換及びＤ６１４Ｇ変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＷＨ２０２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿００１＿Ｄ６１４Ｇ）をコードするｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物（０．５μｇまたは５μｇの各ｍＲＮＡ、１μｇまたは１０μｇの総ｍＲＮＡ）を投与したマウスから、血清を得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡで免疫化したマウスによって誘発された血清の能力を示す。２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１（ＲＳＡ）バリアントスパイクタンパク質に対する結合を示す。ＰＢＳ、１μｇまたは１０μｇの、２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ＲＳＡ－ｆｕｌｌ）、２つのプロリン置換及びＤ６１４Ｇ変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＷＨ２０２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿００１＿Ｄ６１４Ｇ）をコードするｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物（０．５μｇまたは５μｇの各ｍＲＮＡ、１μｇまたは１０μｇの総ｍＲＮＡ）を投与したマウスから、血清を得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡで免疫化したマウスによって誘発された血清の能力を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎタンパク質に対する結合を示す。ＰＢＳ、１μｇまたは１０μｇの、２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ＲＳＡ－ｆｕｌｌ）、２つのプロリン置換及びＤ６１４Ｇ変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＷＨ２０２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿００１＿Ｄ６１４Ｇ）をコードするｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物（０．５μｇまたは５μｇの各ｍＲＮＡ、１μｇまたは１０μｇの総ｍＲＮＡ）を投与したマウスから、血清を得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡで免疫化したマウスによって誘発された血清の能力を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１（ＲＳＡ）バリアントスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する結合を示す。ＰＢＳ、１μｇまたは１０μｇの、２つのプロリン置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ＲＳＡ－ｆｕｌｌ）、２つのプロリン置換及びＤ６１４Ｇ変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＷＨ２０２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿００１＿Ｄ６１４Ｇ）をコードするｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物（０．５μｇまたは５μｇの各ｍＲＮＡ、１μｇまたは１０μｇの総ｍＲＮＡ）を投与したマウスから、血清を得た。１、２、または３回用量のワクチン接種後のマウスにおける中和抗体力価を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１または０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３で免疫化し、研究２１３日目に１または０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１で追加免疫した。個々のマウス血清からの結果を、各図にドットとして表し、線は、各群の平均である。水平点線は、検出限界（ＬＯＤ）を示す。１、２、または３回用量のワクチン接種後のマウスにおける中和抗体力価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを１または０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）で免疫化し、２１３日目に１または０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１で追加免疫した。個々のマウス血清（ｎ＝群当たり５匹）からの結果を、各図にドットとして表し、線は、各群の平均である。水平点線は、１．６０２でのｌｏｇ１０ＩｇＧ力価のＬＬＯＤを示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。野生型配列と比較して、Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質（左バー）、Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質（中央バー）、及びＰ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスの中和に基づく、ブースター用量の投与前に得た血清の中和アッセイ力価を示す。バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、バーの上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。図１３Ａで試験した同じスパイクタンパク質を発現している同じ擬似ウイルスに対する、ブースター用量の投与の１４日後に得た血清の中和アッセイ力価を示す。バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、バーの上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスに対する、１日目（ブースター用量の投与前）から１５日目（ブースター用量の投与の１４日後）までの中和抗体力価の変化を示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスに対する、１日目（ブースター用量の投与前）から１５日目（ブースター用量の投与の１４日後）までの中和抗体力価の変化を示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。Ｐ．１スパイクタンパク質を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスに対する、１日目（ブースター用量の投与前）から１５日目（ブースター用量の投与の１４日後）までの中和抗体力価の変化を示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。野生型配列と比較して、Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質（左バー）、Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質（中央バー）、及びＰ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスの中和に基づく、ブースター用量の投与前に得た血清の中和アッセイ力価を示す。バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、バーの上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。図１４Ａで試験した同じスパイクタンパク質を発現している同じ擬似ウイルスに対する、ブースター用量の投与の１４日後に得た血清の中和アッセイ力価を示す。バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、バーの上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスに対する、１日目（ブースター用量の投与前）から１５日目（ブースター用量の投与の１４日後）までの中和抗体力価の変化を示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスに対する、１日目（ブースター用量の投与前）から１５日目（ブースター用量の投与の１４日後）までの中和抗体力価の変化を示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（１日目に用量１、及び２２日目に用量２）、及び１日目から６．２～６．７ヶ月後に５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１での第３の用量（ブースター用量）後の、ヒトにおける中和抗体力価を示す。Ｐ．１スパイクタンパク質（図１４Ｅ）を発現しているＶＳＶ擬似ウイルスに対する、１日目（ブースター用量の投与前）から１５日目（ブースター用量の投与の１４日後）までの中和抗体力価の変化を示す。１５日目／１日目の倍数増加を、バーの上に示す。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定による。全てのプロットでは、個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を投与し、第３の用量のｍＲＮＡ－１２７３、またはＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３．３５１のいずれかで追加免疫した、ヒト参加者からの血清の、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３を含有するブースター用量の投与前に得た血清中のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質と比較した、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価の低減を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を投与し、第３の用量のｍＲＮＡ－１２７３、またはＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３．３５１のいずれかで追加免疫した、ヒト参加者からの血清の、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３を含有するブースター用量の１５日目、すなわちブースター用量投与の１４日後に得た血清中のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質と比較した、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価の低減を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を投与し、第３の用量のｍＲＮＡ－１２７３、またはＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３．３５１のいずれかで追加免疫した、ヒト参加者からの血清の、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を含有するブースター用量の投与前に得た血清中のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質と比較した、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価の低減を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を投与し、第３の用量のｍＲＮＡ－１２７３、またはＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３．３５１のいずれかで追加免疫した、ヒト参加者からの血清の、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を含有するブースター用量の１５日目、すなわちブースター用量投与の１４日後に得た血清中のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質と比較した、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価の低減を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を投与し、第３の用量のｍＲＮＡ－１２７３、またはＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３．３５１のいずれかで追加免疫した、ヒト参加者からの血清の、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３（円）または５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（菱形）の投与の１４日後の、ブースター用量の投与前にＤ６１４Ｇスパイクタンパク質を発現している擬似ウイルスに対する中和抗体力価（破線の左側、正方形）、及びＤ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、またはＰ．１スパイクタンパク質を発現している擬似ウイルスのパネルに対する中和抗体力価を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与し、任意選択で、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質をコードする５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１、または５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物）（図１６Ｃ）のブースター用量を投与したヒト参加者から得た血清の、バリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現している擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．６１７．１－ｖ１、Ｂ．１．６１７．１－ｖ２、またはＡ．ＶＯＩ－Ｖ２スパイクタンパク質を発現している擬似ウイルスに対する血清の中和力価を示す。水平バーは、１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３の２回用量のみを投与した対象からの血清と比較した、ブースター用量の投与後のＢ．１．６１７．１－ｖ１に対する中和力価の増加を表す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与し、任意選択で、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質をコードする５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１、または５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物）（図１６Ｃ）のブースター用量を投与したヒト参加者から得た血清の、バリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現している擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質と比較した、Ｂ．１．６１７．１－ｖ１、Ｂ．１．６１７．１－ｖ２、またはＡ．ＶＯＩ－Ｖ２スパイクタンパク質に対する中和の相対的な低減を示す。水平バーは、１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３の２回用量のみを投与した対象からの血清と比較した、ブースター用量の投与後のＢ．１．６１７．１－ｖ１に対する中和力価の増加を表す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（図１６Ａ～１６Ｂ）を投与し、任意選択で、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質をコードする５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１、または５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物）のブースター用量を投与したヒト参加者から得た血清の、バリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現している擬似ウイルスに対する中和抗体力価を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３（左バー）の２回用量、続いて５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３（第２のバー）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（第３のバー）、または５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（第４のバー）のブースター用量を投与したヒト対象から得た血清の、Ｂ．１．６１７．１－ｖ１スパイクタンパク質に対する中和力価を示す。水平バーは、１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３の２回用量のみを投与した対象からの血清と比較した、ブースター用量の投与後のＢ．１．６１７．１－ｖ１に対する中和力価の増加を表す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異（左バー）または南アフリカＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む擬似ウイルスの中和に基づく、各時点における中和抗体力価を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。図１７Ａで試験した各スパイクタンパク質の、２１２日目から２４８日目までの中和力価の動態を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異のみを含むスパイクタンパク質と比較した、各時点における、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価の相対変化を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。３６日目、すなわち第２の用量の２週間後の血清のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。０．１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異（左バー）または南アフリカＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む擬似ウイルスの中和に基づく、各時点における中和抗体力価を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。０．１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。図１８Ａで試験した各スパイクタンパク質の、２１２日目から２４８日目までの中和力価の動態を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。０．１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異のみを含むスパイクタンパク質と比較した、各時点における、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価の相対変化を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。０．１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。２１２日目（第３の用量の投与前）、２３３日目（第４の用量の投与前）、及び２４８日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。３６日目、すなわち第２の用量の２週間後の血清のＤ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。５８日目（第３の用量）及び７８日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。５７日目（第３の用量の投与前）、７７日目（第４の用量の投与前）、及び９２日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異（左バー）または南アフリカＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む擬似ウイルスの中和に基づく、各時点における中和抗体力価を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。５８日目（第３の用量）及び７８日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。５７日目（第３の用量の投与前）、７７日目（第４の用量の投与前）、及び９２日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。図１９Ａで試験した各スパイクタンパク質の、５７日目から９２日目までの中和力価の動態を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。５８日目（第３の用量）及び７８日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。５７日目（第３の用量の投与前）、７７日目（第４の用量の投与前）、及び９２日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異のみを含むスパイクタンパク質と比較した、各時点における、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価の相対変化を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。５８日目（第３の用量）及び７８日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。５７日目（第３の用量の投与前）、７７日目（第４の用量の投与前）、及び９２日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異（左バー）または南アフリカＢ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む擬似ウイルスの中和に基づく、各時点における中和抗体力価を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。５８日目（第３の用量）及び７８日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。５７日目（第３の用量の投与前）、７７日目（第４の用量の投与前）、及び９２日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。図２０Ａで試験した各スパイクタンパク質の、５７日目から９２日目までの中和力価の動態を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料の中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）及び２２日目（ブースター用量）に再び０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスから、血清を得た。５８日目（第３の用量）及び７８日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質をコードする０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、マウスに投与した。５７日目（第３の用量の投与前）、７７日目（第４の用量の投与前）、及び９２日目（第４の用量の投与の１４日後）に、試料を採取した。Ｄ６１４Ｇ変異のみを含むスパイクタンパク質と比較した、各時点における、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価の相対変化を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。ＥＬＩＳＡによって測定した、野生型２Ｐ安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な総ＩｇＧを示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）Ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）Ｂ．１．１．７バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、及び５）Ｂ．１．１．７バリアントに関連付けられる変異ならびにＥ４８４Ｋ変異を有するスパイクタンパク質、を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対する、２回用量の１μｇのｍＲＮＡ－１２７３を投与したマウスからの３６日目の血清試料の中和力価を示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する中和力価のベースラインと比較した、図２１Ｂで試験したウイルスの各々に対する、血清の中和力価の相対的な低減を示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）Ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、及び４）Ｂ．１．１．７バリアントに関連付けられる変異ならびにＥ４８４Ｋ変異を有するスパイクタンパク質、を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対する、２回用量の１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１を投与したマウスからの３６日目の血清試料の中和力価を示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する中和力価のベースラインと比較した、図２１Ｄで試験したウイルスの各々に対する、血清の中和力価の相対的な低減を示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）Ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）Ｂ．１．１．７バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、及び５）Ｂ．１．１．７バリアントに関連付けられる変異ならびにＥ４８４Ｋ変異を有するスパイクタンパク質、を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対する、２回用量の１μｇのｍＲＮＡ－１２７３．１１７を投与したマウスからの３６日目の血清試料の中和力価を示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する中和力価のベースラインと比較した、図２１Ｆで試験したウイルスの各々に対する、血清の中和力価の相対的な低減を示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。マウス血清試料のスパイクタンパク質特異的ＩｇＧ及び中和力価を示す。１日目（初回免疫用量）、及び再び２２日目（第２の用量）に、野生型スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１）、またはＢ．１．１．７スパイクタンパク質（ｍＲＮＡ－１２７３．１１７）からの安定化された２Ｐをコードする、１０、１、または０．１μｇのｍＲＮＡを投与したマウスから、血清を回収した。３６日目（第２の用量の１４日後）に、血清を回収した。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（各々０．５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物）のいずれかを１日目及び２２日目に投与し、血清を３６日目に回収した、マウスの参照中和抗体力価を示す。１）Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、３）ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質、４）ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質を含む、スパイクタンパク質のパネルのうちの１つを含有する擬似ウイルスに対して、マウスの各群からの血清を試験した。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。棒プロットでは、バーの上に示される幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、誤差バーによって示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのパネルに対する、誘発された中和抗体力価（ｌｏｇ_１０）を示すグラフである。Ａ～Ｂは、ヒト第１相参加者から採取した血清試料の中和力価を示す。Ａは、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．６１７．１－ｖ１、Ｂ．１．６１７．１－ｖ２、及びＢ．１．６１７．２に対する、ヒト第１相参加者血清の中和力価を示す。Ｂは、Ａで試験したウイルスの各々に対する、血清の中和力価の相対的な低減を示す。ｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１を含むワクチンの第３の用量（ブースター）の２週間後に採取した血清試料の中和力価を示す。Ｄ６１４Ｇ、ならびにバリアントＢ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２に対して、血清試料を試験した。中和力価を示す。ｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１を含むワクチンの第３の用量（ブースター）の２週間後に採取した血清試料の中和力価を示す。Ｄ６１４Ｇ、ならびにバリアントＢ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２に対して、血清試料を試験した。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質の中和力価と比較した、異なるバリアントに対する中和力価の倍数低減を示す。レンチウイルスの擬似ウイルス中和アッセイを使用した、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＤ６１４及びＢ．１．３５１中和データを示す。Ｄ６１４Ｇの時間的研究を示す。レンチウイルスの擬似ウイルス中和アッセイを使用した、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＤ６１４及びＢ．１．３５１中和データを示す。Ｂ．１．３５１の時間的研究を示す。レンチウイルスの擬似ウイルス中和アッセイを使用した、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＤ６１４及びＢ．１．３５１中和データを示す。レンチウイルスの擬似ウイルス中和を使用して、各群について中和抗体の低減を分析した。レンチウイルスの擬似ウイルス中和アッセイを使用した、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＤ６１４及びＢ．１．３５１中和データを示す。ＶＳＶ擬似ウイルス中和を使用して、各群について中和抗体の低減を分析した。レンチウイルスの擬似ウイルス中和アッセイを使用した、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＤ６１４及びＢ．１．３５１中和データを示す。生ウイルス中和を使用して、各群について中和抗体の低減を分析した。Ａ～Ｂは、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３後の２０２０ＮＨＰチャレンジ研究及びＵＳＡ－ＷＡ１／２０でのチャレンジからの結果を示す。グラフは、肺試料（気管支肺胞洗浄液、ＢＡＬ、流体；Ａ）中及び鼻スワブ（Ｂ）からのウイルスのゲノムコピーの数を示す。Ａ～Ｂは、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３後の２０２１ＮＨＰチャレンジ研究及びＵＳＡ－ＷＡ１／２０でのチャレンジからの結果を示す。グラフは、肺試料（気管支肺胞洗浄液、ＢＡＬ、液体；Ａ）中及び鼻スワブ（Ｂ）からのウイルスのＲＮＡゲノムコピーの数を示す。Ａ～Ｂは、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３後の２０２１ＮＨＰチャレンジ研究及びＤ６１４ＧまたはＢ．１．３５１でのチャレンジからの結果を示す。Ａは、生ウイルス中和を使用した２つのウイルス間の中和力価の低減を示す。Ｂは、擬似ウイルス中和を使用した２つのウイルス間の中和力価の低減を示す。Ａ～Ｂは、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３後の２０２１ＮＨＰチャレンジ研究及びＤ６１４ＧまたはＢ．１．３５１でのチャレンジからの結果を示す。グラフは、２つの時点における、肺試料（気管支肺胞洗浄、ＢＡＬ、流体；Ａ）中及び鼻スワブ（Ｂ）からのウイルスのＲＮＡゲノムコピーの数を示す。Ａ～Ｂは、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３後の２０２１ＮＨＰチャレンジ研究及びＵＳＡ－ＷＡ１／２０でのチャレンジからの結果を示す。グラフは、３つの異なる時点における、肺試料（気管支肺胞洗浄液、ＢＡＬ、液体；Ａ）チュ及び鼻スワブ（Ｂ）からのウイルスのＲＮＡゲノムコピーの数を示す。Ａ～Ｂは、初回シリーズ（２回用量のｍＲＮＡ－１２７３）の１ヶ月後及び６～８ヶ月後の参加者からの血清による、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶＳＶベースの擬似ウイルス（Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１）の中和を示す。幾何平均中和抗体力価を、四角の上部によって示し、９５％信頼区間を、括弧によって示す。個々の参加者の力価を、円によって示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。ブースターショットの投与が、野生型（Ｄ６１４）及び懸念されるバリアント（Ｂ．１．３５１及びＰ．１）に対する中和抗体力価を増加させることを示す、３つのグラフを含む。３つの追加免疫戦略：ｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１を試験した。ブースターショットの投与後の中和力価を示す。３つの異なる追加免疫戦略：ｍＲＮＡ－１２７３（図３３Ａ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３３Ｂ）、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３３Ｃ）を試験した。調査した懸念されるバリアント／目的のバリアントは、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２であった。ブースターショットの投与後の中和力価を示す。３つの異なる追加免疫戦略：ｍＲＮＡ－１２７３（図３３Ａ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３３Ｂ）、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３３Ｃ）を試験した。調査した懸念されるバリアント／目的のバリアントは、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２であった。ブースターショットの投与後の中和力価を示す。３つの異なる追加免疫戦略：ｍＲＮＡ－１２７３（図３３Ａ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３３Ｂ）、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３３Ｃ）を試験した。調査した懸念されるバリアント／目的のバリアントは、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２であった。懸念される２つのバリアント：Ｂ．１．３５１及びＰ．１に関する、異なる追加免疫戦略間のコホート比較である。Ｄ６１４Ｇは、比較対象として示す。Ａ～Ｂは、臨床的に検証された組換えレンチウイルスベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスアッセイ（Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１）を使用した、ブースターの直前及び直後の参加者血清による、野生型（Ａ）及びＢ．１．３５１（Ｂ）レンチウイルスベースの擬似ウイルスの中和を示す。ブースターを受け取る直前（Ｄ１）、ならびにブースター用量の５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３、５０もしくは２０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１、または５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１の後１５日目（Ｄ１５）及び２９日目（Ｄ２９）に、血清を回収した。９５％信頼区間を用いた幾何平均中和抗体力価を示す。個々の参加者の力価を、円によって示す。追加免疫前に回収した試料に対する、測定した力価に対する倍数増加を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｎ＝ブースターコホート当たり２０人の参加者。Ａ～Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの探索的分析に使用した、臨床的に検証された擬似ウイルスアッセイ及びＶＳＶベースの擬似ウイルスアッセイからの結果の相関を示す。臨床的に検証された組換えレンチウイルスベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスアッセイにおける参加者血清からの中和Ａｂ力価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント（Ｄ６１４Ｇ（Ａ）及びＢ．１．３５１（Ｂ））の探索的分析に使用したＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスアッセイと相関した。ブースターを受け取る直前（Ｄ１）、及びブースター用量の５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１の２週間後（Ｄ１５）に、血清を回収した。個々の参加者の力価を、円によって示す。野生型アッセイでは、利用可能なパートＢ（Ｄ１）及びパートＣ（Ｄ１及びＤ１５）データポイントを相関分析に使用した。Ｂ．１．３５１アッセイでは、利用可能なパートＣ（Ｄ１及びＤ１５）データポイントを使用した。両方のアッセイの相関分析について、Ｓｐｅａｒｍａｎノンパラメトリック分析を実施した。参加者血清による、野生型及びバリアントＶＳＶベースの擬似ウイルスの中和の探索的分析を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、すなわちブースターを投与する直前、及びブースター用量の５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３（図３７Ａ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｂ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３７Ｃ）、または２０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｄ）の２週間後の参加者からの血清による、組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルス（Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１）の中和。（図３７Ｃに示されるように）各群において、左から右への群は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１である。９５％信頼区間を用いた幾何平均中和抗体力価を示す。個々の参加者の力価を、円によって示す。初回ワクチン接種シリーズ後の野生型Ｄ６１４Ｇウイルスに対する、ピーク力価に対するＧＭＴ倍数変化を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｎ＝ブースターコホート当たり２０人の参加者。参加者血清による、野生型及びバリアントＶＳＶベースの擬似ウイルスの中和の探索的分析を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、すなわちブースターを投与する直前、及びブースター用量の５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３（図３７Ａ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｂ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３７Ｃ）、または２０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｄ）の２週間後の参加者からの血清による、組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルス（Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１）の中和。（図３７Ｃに示されるように）各群において、左から右への群は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１である。９５％信頼区間を用いた幾何平均中和抗体力価を示す。個々の参加者の力価を、円によって示す。初回ワクチン接種シリーズ後の野生型Ｄ６１４Ｇウイルスに対する、ピーク力価に対するＧＭＴ倍数変化を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｎ＝ブースターコホート当たり２０人の参加者。参加者血清による、野生型及びバリアントＶＳＶベースの擬似ウイルスの中和の探索的分析を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、すなわちブースターを投与する直前、及びブースター用量の５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３（図３７Ａ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｂ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３７Ｃ）、または２０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｄ）の２週間後の参加者からの血清による、組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルス（Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１）の中和。（図３７Ｃに示されるように）各群において、左から右への群は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１である。９５％信頼区間を用いた幾何平均中和抗体力価を示す。個々の参加者の力価を、円によって示す。初回ワクチン接種シリーズ後の野生型Ｄ６１４Ｇウイルスに対する、ピーク力価に対するＧＭＴ倍数変化を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｎ＝ブースターコホート当たり２０人の参加者。参加者血清による、野生型及びバリアントＶＳＶベースの擬似ウイルスの中和の探索的分析を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、すなわちブースターを投与する直前、及びブースター用量の５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３（図３７Ａ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｂ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３７Ｃ）、または２０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３７Ｄ）の２週間後の参加者からの血清による、組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルス（Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１）の中和。（図３７Ｃに示されるように）各群において、左から右への群は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１である。９５％信頼区間を用いた幾何平均中和抗体力価を示す。個々の参加者の力価を、円によって示す。初回ワクチン接種シリーズ後の野生型Ｄ６１４Ｇウイルスに対する、ピーク力価に対するＧＭＴ倍数変化を示す。水平点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。Ｎ＝ブースターコホート当たり２０人の参加者。中和に対するＢ．１．６１７の効果、ならびに初回シリーズ後のピークＤ６１４Ｇ力価に対する追加免疫後の野生型Ｄ６１４Ｇ及びＶＯＣの中和を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、ブースター投与の直前、及び５０μｇのブースターの２週間後に、試験参加者から血清を回収した。図３８Ａは、ブースターの直前に１１人のパートＢ個体から回収した血清からのＤ６１４Ｇ、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２の中和を示す。初回シリーズの後、またはｍＲＮＡ－１２７３（図３８Ｂ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３８Ｃ）、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３８Ｄ）での追加免疫の２週間後に回収した血清を、ＰｓＶＮアッセイで分析した。ブースターの２週間後にブースター試験参加者において測定した野生型ウイルスまたはバリアントに対するＧＭＴ力価を、初回シリーズワクチン接種後の野生型ウイルスに対して測定したピーク力価に対して評価し、各ウイルスの倍数変化を示す。各バリアントウイルスのＧＭＴを、各グラフの上に列挙する。Ｄ５７ＧＭＴ力価を、灰色の線によって示す。個々の参加者からの結果を、各図上の点として表す。Ｎ＝Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１アッセイでは２０。Ｎ＝Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２では１１、影付きドットがこれらの参加者を示す。中和に対するＢ．１．６１７の効果、ならびに初回シリーズ後のピークＤ６１４Ｇ力価に対する追加免疫後の野生型Ｄ６１４Ｇ及びＶＯＣの中和を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、ブースター投与の直前、及び５０μｇのブースターの２週間後に、試験参加者から血清を回収した。図３８Ａは、ブースターの直前に１１人のパートＢ個体から回収した血清からのＤ６１４Ｇ、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２の中和を示す。初回シリーズの後、またはｍＲＮＡ－１２７３（図３８Ｂ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３８Ｃ）、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３８Ｄ）での追加免疫の２週間後に回収した血清を、ＰｓＶＮアッセイで分析した。ブースターの２週間後にブースター試験参加者において測定した野生型ウイルスまたはバリアントに対するＧＭＴ力価を、初回シリーズワクチン接種後の野生型ウイルスに対して測定したピーク力価に対して評価し、各ウイルスの倍数変化を示す。各バリアントウイルスのＧＭＴを、各グラフの上に列挙する。Ｄ５７ＧＭＴ力価を、灰色の線によって示す。個々の参加者からの結果を、各図上の点として表す。Ｎ＝Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１アッセイでは２０。Ｎ＝Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２では１１、影付きドットがこれらの参加者を示す。中和に対するＢ．１．６１７の効果、ならびに初回シリーズ後のピークＤ６１４Ｇ力価に対する追加免疫後の野生型Ｄ６１４Ｇ及びＶＯＣの中和を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、ブースター投与の直前、及び５０μｇのブースターの２週間後に、試験参加者から血清を回収した。図３８Ａは、ブースターの直前に１１人のパートＢ個体から回収した血清からのＤ６１４Ｇ、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２の中和を示す。初回シリーズの後、またはｍＲＮＡ－１２７３（図３８Ｂ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３８Ｃ）、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３８Ｄ）での追加免疫の２週間後に回収した血清を、ＰｓＶＮアッセイで分析した。ブースターの２週間後にブースター試験参加者において測定した野生型ウイルスまたはバリアントに対するＧＭＴ力価を、初回シリーズワクチン接種後の野生型ウイルスに対して測定したピーク力価に対して評価し、各ウイルスの倍数変化を示す。各バリアントウイルスのＧＭＴを、各グラフの上に列挙する。Ｄ５７ＧＭＴ力価を、灰色の線によって示す。個々の参加者からの結果を、各図上の点として表す。Ｎ＝Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１アッセイでは２０。Ｎ＝Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２では１１、影付きドットがこれらの参加者を示す。中和に対するＢ．１．６１７の効果、ならびに初回シリーズ後のピークＤ６１４Ｇ力価に対する追加免疫後の野生型Ｄ６１４Ｇ及びＶＯＣの中和を示す。１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３での初回シリーズワクチン接種の１ヶ月後、ブースター投与の直前、及び５０μｇのブースターの２週間後に、試験参加者から血清を回収した。図３８Ａは、ブースターの直前に１１人のパートＢ個体から回収した血清からのＤ６１４Ｇ、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２の中和を示す。初回シリーズの後、またはｍＲＮＡ－１２７３（図３８Ｂ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図３８Ｃ）、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（図３８Ｄ）での追加免疫の２週間後に回収した血清を、ＰｓＶＮアッセイで分析した。ブースターの２週間後にブースター試験参加者において測定した野生型ウイルスまたはバリアントに対するＧＭＴ力価を、初回シリーズワクチン接種後の野生型ウイルスに対して測定したピーク力価に対して評価し、各ウイルスの倍数変化を示す。各バリアントウイルスのＧＭＴを、各グラフの上に列挙する。Ｄ５７ＧＭＴ力価を、灰色の線によって示す。個々の参加者からの結果を、各図上の点として表す。Ｎ＝Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１アッセイでは２０。Ｎ＝Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２では１１、影付きドットがこれらの参加者を示す。Ａ～Ｂは、ＣＯＶＥ研究ＧＭＴベンチマークに対する、追加免疫後の野生型Ｄ６１４Ｇ及びＶＯＣのＧＭＴ中和を示す。中和抗体について、組換えＶＳＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２擬似ウイルスアッセイを使用して、ｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１を使用する、５０μｇの追加免疫の２週間後の試験参加者からの血清を分析した。Ａは、野生型ウイルス（Ｄ６１４Ｇ）またはバリアント（Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．２、Ｂ．１．６１７．１、Ｂ．１．６１７．２）に対するＧＭＴ中和力価を示す。ピボタルＰ３０１ｍＲＮＡ－１２７３有効性試験（ｎ＝５９）において、Ｄ５７で測定した野生型Ｄ６１４ＧウイルスＣＯＶＥ研究ベンチマークのうちの１つのＧＭＴを、黒い点線によって示す。Ｂは、ピボタルＰ３０１ｍＲＮＡ－１２７３有効性試験において、Ｄ５７で測定した第３相ＧＭＴ力価比較対象に対するＧＭＴ比を示す。ブースターの２週間後にブースター試験参加者において測定した野生型またはバリアントウイルスまたはバリアントに対するＧＭＴ力価を、初回シリーズワクチン接種後の野生型Ｄ６１４Ｇウイルスに対して測定したピーク力価に対して評価した。１のＧＭＴを、点線によって示す。Ｎ＝Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１では２０。Ｎ＝Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２では１１。ブースターショット（ｍＲＮＡ－１２７３、５０μｇ）の投与が、ワクチンの第２回の投与後の２つの時点と比較して、野生型（Ｄ６１４）及び懸念されるバリアント（Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｐ．１（ガンマ）、及びＢ．１．６１７．２（デルタ））に対する中和抗体力価を増加させることを示すグラフである。ブースター（第３回）ワクチン製剤の投与前及び投与後のマウスにおける、異なるワクチン製剤によって誘発された中和抗体を示すグラフである。５６日目（ブースター用量の投与前）に２回用量のワクチンを投与した後のマウスにおける、異なるワクチン製剤によって誘発された中和抗体を示すグラフである。５６日目（ブースター用量の投与前）に２回用量のワクチンを投与した後のマウスにおける、異なるワクチン製剤によって誘発された中和抗体を示すグラフである。２回用量のワクチンの投与及びブースター用量の投与後の、７７日目のマウスにおける、異なるワクチン製剤によって誘発された中和抗体を示すグラフである。２回用量のワクチンの投与及びブースター用量の投与後の、７７日目のマウスにおける、異なるワクチン製剤によって誘発された中和抗体を示すグラフである。２回用量のワクチンの投与及びブースター用量の投与後の、７７日目のマウスにおける、異なるワクチン製剤によって誘発された中和抗体を示すグラフである。各群において、投与された３回用量は、同じワクチン製剤（投薬量及び抗原をコードするｍＲＮＡ）であった。２回用量のワクチンの投与及びブースター用量の投与後の、７７日目のマウスにおける、異なるワクチン製剤によって誘発された中和抗体を示すグラフである。各群において、投与された３回用量は、同じワクチン製剤（投薬量及び抗原をコードするｍＲＮＡ）であった。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、罹患率及び死亡率が高い、新たに出現した呼吸器ウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２００２年に出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び２０１２年に出現した中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と比較して、世界中に急速に伝播している。世界保健機関（ＷＨＯ）の報告によると、２０２１年３月現在、ＣＯＶＩＤ－１９の現在の流行は、世界中で１億２０００万人を上回る確定症例があり、２６５万人超が死亡している。ＣＯＶＩＤ－１９感染の新しい症例は増加しており、依然として急速に増加している。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９を予防及び治療し、ＣＯＶＩＤ－１９が世界中に及ぼす深刻な影響を低減するために、さまざまな安全かつ効果的なワクチン及び薬物を開発することが重要である。さまざまなモダリティを使用して製造されたワクチンと薬物、及び安全性と有効性が改善されたワクチンが不可欠である。コロナウイルス疾患、特にコロナウイルス２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチン及び治療薬の高度な設計及び開発を加速する必要性が依然として残っている。

２０２０年１月７日、中国湖北省武漢市で２０１９年１２月に出現した新規の肺炎の病原体として、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が同定された（ＬｕＨ．ｅｔａｌ．（２０２０）ＪＭｅｄＶｉｒｏｌ．Ａｐｒ；９２（４）：４０１－４０２．）。その後まもなく、このウイルスは中国でアウトブレイクを引き起こし、世界中に伝播した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム構造の分析によれば、それは、β－コロナウイルス（ＣｏＶ）に属している（Ｃｈａｎｅｔａｌ．２０２０ＥｍｅｒｇＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔ．；９（１）：２２１－２３６）。

その後、いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントが出現し、特定の最初の地理的領域で優勢となっている。しかしながら、１つの地理的領域で急速に優勢であるいくつかのバリアントは、世界中に急速に広がり得る。これらのバリアントは、懸念されるバリアント（ＶＯＣ）として知られている。２０２０年秋以降、英国のもの（２０Ｂ／５０１Ｙ．Ｖ１、ＶＯＣ２０２０１２／０１、またはＢ．１．１．７系譜、またはアルファバリアント）及び南アフリカのもの（２０Ｃ／５０１Ｙ．Ｖ２、またはＢ．１．３５１系譜、またはベータバリアント）を含む、２つの主なバリアントが見出されている。２つのバリアントは、互いに別々に出現したが、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物と比較して、伝播性が向上したように見える。さらに、これらのバリアント、ならびに他の循環株及び任意の将来のバリアントが、既存のワクチン及び抗体などの治療モダリティによる中和を回避するためにさらに変異し得るという懸念がある。この方式で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、及び他の出現する変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、国際的な健康上の懸念である。

ウイルスの変異株の出現についての脅威は、ワクチン開発に重大な困難を提示する。本明細書に開示の組成物は、世界的な健康上の懸念をもたらす、出現するウイルス株との闘いにおいて有意な進歩を提供する。本明細書に開示されるのは、異なる株からの抗原の同じかまたは異なる組み合わせの単回または複数回の投与を通じて、２つ以上のウイルス株からの感染の脅威を低減する、広範なウイルス中和能力を有するワクチン及びワクチンプロトコルである。例えば、本明細書に開示のワクチン接種戦略は、いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイクタンパク質抗原のワクチン接種の「初回シリーズ」及び後続の追加免疫（複数可）を含む。初回シリーズ（本明細書では初回の、元の、または第１のワクチン、ワクチン接種とも称される）は、元の同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイクタンパク質抗原の１回以上のワクチンの投与（例えば、２回のワクチン投与）を伴う。ワクチンの初回シリーズは、配列番号２０のアミノ酸配列を有する抗原をコードするｍＲＮＡワクチンであり得る。次いで、その後のブースターまたはブースターシリーズのワクチンは、例えば、元のワクチンの直後、またはワクチン接種プロトコルのかなり後の時点で（例えば、中和Ａｂ力価が低下した後、または新しい株ワクチンの承認後）投与される。

本明細書に開示の態様では、以前に投与されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの補足としてｍＲＮＡ「追加免疫」を設計するために、出現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株を使用し、従来の追加免疫、季節的追加免疫、及びパンデミックシフト追加免疫を含む。本明細書で使用される追加免疫は、任意のその後の用量を指す。従来の追加免疫は、２１～２８日、またはさらには２週間～６ヶ月などの期間の後に対象に投与される第２の用量の抗原である。従来の追加免疫は、同じウイルス株を表す同じ抗原を対象に投与して、そのウイルス株及び任意選択で他のバリアント株に対する強力な免疫応答を生成することを伴う。

パンデミックまたはエンデミックの間、元の株に対して設計されたワクチンでの中和に効果的に影響を受けにくい、ウイルス株の出現が発生し得る。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の出現するウイルス株は、放射状の進化を通じて生じるように見える、すなわち、ウイルスが進化するにつれて変異が互いに蓄積する線形進化と比較して、さまざまな異なる変異を有する。そのような例では、出現するウイルス株に対する免疫保護を提供するために、パンデミックシフト追加免疫が使用され得る。パンデミックシフト追加免疫は、第１のワクチンの完全な経過後に対象に投与されるその後のワクチンである。第１のワクチンの完全な経過は、第１のワクチンの１回以上の投与を含み得る。パンデミックシフト追加免疫は、ウイルス感染のパンデミックまたはエンデミックの間に出現したバリアントウイルス株に由来する抗原を含むワクチンで構成される。パンデミックシフト追加免疫は、第１のワクチンの投与後の任意の時点で投与され得る。第１のワクチンは、パンデミックシフト追加免疫が第１のワクチンとは異なるウイルスのバリアント株に対するワクチンを含む限り、ウイルスの検出された元の株、ウイルスの元の株及びウイルスのバリアント株（複数可）の組み合わせ、またはウイルスのバリアント株に対するワクチンであり得る。

加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントウイルス株は、パンデミックまたはエンデミックの外で時々出現し得る。これらの株は、例えば、季節的に出現し得る。そのようなバリアント株は、季節的追加免疫として送達される季節的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを設計するために使用され得る。季節的追加免疫は、バリアント株が生じた際に、パンデミックまたはエンデミックの外で起こる第１のワクチンの完全な経過後に、対象に投与されるその後のワクチンである。ウイルスサーベイランス法は、従来のワクチンの設計に使用されている。しかしながら、従来のワクチンの開発時間が遅いことに起因して、抗原設計決定は、多くの場合、ワクチンが投与されるときに循環しているウイルス株とワクチンが一致しないほど事前に行われる。開発期間中、ウイルスが変異し得るか、または他の株がより流行し得るので、従来のワクチンの効果は低くなる。従来のワクチンはすでに生産されているので適応することができず、新しいワクチンの設計及び製造にはさらなる時間がかかるであろう。対照的に、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、これらの課題を克服することが可能である。それらはものの数週間で生産されるので、より接種日近くで循環しているコロナウイルスに対して設計することができる。例えば、ワクチン接種時に循環しているウイルス株に応答して、コロナウイルスワクチンを迅速に開発する季節的または年次的なコロナウイルスワクチン接種プログラムを開発することができる。すなわち、コロナウイルスの季節または他のアウトブレイクにより近いウイルスの予測は、季節またはアウトブレイクが始まる数ヶ月前からの予測よりも正確であると考えられ、したがって、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、コロナウイルスの季節または予定された予防接種により近くで循環しているウイルスを標的とするように設計されるので、より効果的である。したがって、例示的な態様では、本開示のワクチンは、季節的なコロナウイルス株と戦うように設計され得、したがって、次のまたは今後の北半球の季節または南半球の季節で使用するためのワクチンである。所与の時点での循環するコロナウイルスの理解に基づいて、ワクチンは、それらが次のまたは今後のウイルス季節に循環または流行するであろうと予測されるようなウイルスと戦うように設計される。ｍＲＮＡワクチンは、ものの数日で設計することができ、出願人によって開発された最近のワクチンは、わずか５週間で設計からワクチンの製造まで先行した。どのウイルスが循環しており、どのような有病率であるかについてのデータを捕捉し、分析することができ、季節的ワクチン接種などの接種プログラムの開始までが非常に近い。

本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び変異株を含む、コロナウイルスの表面上の重要なタンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質である。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較して、２つのプロリン変異を有するスパイクタンパク質の安定化バージョンが開発されており、これは配列番号２０のアミノ酸配列を有する。２Ｐ安定化スパイク抗原は、２Ｐを含む完全長スパイクタンパク質である。本明細書に記載のワクチン接種プロトコルは、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株及び／または出現するバリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株からの完全長２Ｐ安定化スパイクタンパク質のさまざまなワクチンを含み、各抗原が、２Ｐ変異を含む。

さまざまなｍＲＮＡ構築物が設計され、本明細書に開示されている。出現しているバリアント株のスパイク抗原の２Ｐ安定化バージョンをコードするｍＲＮＡを適切な送達ビヒクル中に製剤化すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力な免疫応答を誘導することが可能であり、したがって、元のウイルスならびにその後の株を根絶するのに不可欠な多様性を提供するのに有効かつ強力なｍＲＮＡワクチン／ブースターが生産される。ＬＮＰ内のさまざまなスパイクタンパク質抗原、特にスパイクタンパク質サブユニット及びドメイン抗原をコードするｍＲＮＡの筋肉内投与は、免疫組織及び免疫系の細胞へのｍＲＮＡの送達をもたらし、ここでタンパク質抗原へと急速に翻訳される。他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞は、次いで、コードされたタンパク質に対して免疫応答を認識し、マウントすることが可能であり、最終的に、コロナウイルスに対する長期的な保護応答を生成する。免疫原性の低さ、免疫系への不十分な提示または抗原の誤った折り畳みに起因するタンパク質ワクチン開発の欠点は、本明細書に開示されるスパイクタンパク質、サブユニット及びそのドメインをコードする非常に効果的なｍＲＮＡワクチンの使用によって回避される。

ウイルスの絶え間ない進化の性質に起因して、科学者は、ヒトにおいて循環しているウイルスの配列及び株を継続的に監視している。これらのさまざまな循環株は、本明細書に開示の追加免疫もしくは個々のワクチンとして、または追加的に、多価ｍＲＮＡワクチンを設計するために使用され得る。ウイルスサーベイランスは、ｍＲＮＡワクチンの基礎として使用される正確なウイルス株を選択するために、年次的または季節的な（または他の予定される）情報を提供するために使用され得る。循環株が同定されると、それらの株に基づいて、循環中の２つまたは３つ（またはそれ以上）の最も代表的なウイルスの種類を標的とするワクチンの組成物を開発することができる。新しい株からの抗原をワクチンに添加するこの演習は、集団におけるウイルス免疫を維持するために、必要に応じて、年単位または他の時間枠で繰り返すことができる。本明細書で使用される場合、「集団」または「対象集団」は、世界的な集団、地域集団、または国内集団を指す。例えば、いくつかの新しい株は、世界のある特定の地域、大陸、または国でより流行であり得るので、地域的な集団は、地理的に別個の集団（例えば、半球、大陸）または国の地域を指し得る。いくつかの実施形態では、対象集団は、国内集団（例えば、米国の集団）である。本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、単一の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内で複数の循環株からの複数の抗原をコードする。ｍＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、各々がコロナウイルスの独自の株に由来する、少なくとも２つの抗原の組み合わせを含む。

したがって、本開示は、対象におけるコロナウイルス抗原に対する強力な中和抗体を誘発する組成物（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を提供する。そのような組成物は、血清陽性または血清陰性の対象に投与することができる。血清陽性の対象は、ナイーブであってもよく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と反応する抗体を有していなくてもよい。血清陰性の対象は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがあるか、または以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を誘導する用量のワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を投与されたことがあり得るので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する既存の抗体を有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株（本明細書ではバリアントとも称される）からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、またはそれ以上）のコロナウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、単一の脂質ナノ粒子内に、異なるバリアントからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする複数のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントからの１つ以上の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする（例えば、Ｂ．１．１．７及び５０２１．Ｖ２バリアントに見出される変異及び／または欠失の組み合わせをコードする）ｍＲＮＡを含む。

有病率の増加、より高いｈＡＣＥ２結合親和性、またはｍＡｂ及び回復期血清からの脱出の報告に起因して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の少なくとも４つの群が、現在懸念されている。コロナウイルスの１つの例示的な循環株（ＵＫ）は、Ｎ５０１Ｙ－ＵＫまたはＢ．１．１．７（アルファバリアント）であり、これは、以下の変異を有する：ΔＨ６９－ΔＶ７０－ΔＹ１４４－Ｎ５０１Ｙ－Ａ５７０Ｄ－Ｐ６８１Ｈ－Ｔ７１６Ｉ－Ｓ９８２Ａ－Ｄ１１１８Ｈ．この株は、地域を通じて急速に広がることが観察されている。Ｎ５０１Ｙは、ｈＡＣＥ２への結合親和性の増加を引き起こし、ウイルス取り込みの可能性を高める。ΔＨ６９－ΔＶ７０は、回復期血清に対する感受性が低減していることが示されており、Ｐ６８１Ｈは、フリン切断部位に直接隣接して位置する。

別の株（南アフリカ）、Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ変異を有するＮ５０１Ｙ－ＳＡ（Ｂ．１．３５１）（ベータバリアント）もまた、患者において速い地域的な広がり及びより高いウイルス負荷を示している。Ｅ４８４Ｋは、回復期血清に対する感受性が低減していることが示されている。Ｎ５０１Ｙ及びＥ４８４Ｋの両方は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に位置し、これらの変異は、ｈＡＣＥ２へのＲＢＤ結合親和性を増加させる。

ブラジルからの旅行客４人から日本で同定された追加の株、Ｐ．１（Ｂ１．１．２４８；２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１）（ガンマバリアント）が出現している。このバリアントは、そのスパイクタンパク質にＮ５０１Ｕ及びＥ４８４Ｋを含む１２個の変異を含有する。抗体によって認識される能力に影響を及ぼし得るさらなる変異と考えられ、野生型ウイルス（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物）よりも伝播性が高いと考えられる。

ブラジルのアマゾナス州では、以前に感染した人々の再感染に関する懸念を引き起こす，Ｂ．１．１．２４８の追加のサブクレードが出現している。Ｂ．１．１．２８の２つのサブクレードは、Ｐ．２（Ｂ．１．１．２８．２の別名）及びＰ．１（Ｂ．１．１．２８．１の別名）と指定されている。明確にするために、懸念されるバリアント（ＶＯＣ）は、以前に感染し、以前に回復した女性の留意される再感染を引き起こした、Ｐ．１（Ｂ．１．１．２８．１の別名）と指定されたサブクレードである。再感染は、最初の感染で誘導された限定的もしくは一時的な免疫の結果であり得るか、または、以前の免疫応答を回避する新しい株の優れた能力を反映し得る。この新しい株は、ＲＢＤにおける３つ（Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）及びＴ２０Ｎにおける１つの新しいＮ－グリコシル化部位を含む、１２個のスパイクタンパク質変異を含有する。Ｓタンパク質変異としては、以下の１２個の変異：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆが挙げられる（Ｎａｖｅｃａｅｔａｌ．，ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅｎｅｗＶａｒｉａｎｔｏｆＣｏｎｃｅｒｎ（ＶＯＣ）Ｐ．１ｉｎＡｍａｚｏｎａｓ，Ｂｒａｚｉｌ，２０２１）。再感染は、最初の感染と同様の中等度の症状を引き起こしたが、鼻咽頭及び咽頭試料でより高いウイルス負荷を記録した。再感染は、スパイクタンパク質におけるＥ４８４Ｋ変異及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の回避を促進するその能力の結果であり得る。

Ｂ．１．４２９（ＣＡＬ．２０Ｃまたは５４２Ｒ．Ｖ１とも呼ばれる）株（イプシロンバリアント）は、ロサンゼルスのＣｅｄａｒｓ－ＳｉｎａｉＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒで見出された。バリアントは、５つの変異：Ｉ４２０５Ｖ（ＯＲＦ１ａ）、Ｄ１１８３Ｙ（ＯＲＦ１ｂ）、及びＳ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、及びＬ４５２Ｒ（スパイクタンパク質）を含有する（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ｍｅｄＲｘｉｖｐｒｅｐｒｉｎｔ，Ｊａｎｕａｒｙ２０、２０２１）。Ｌ４５２Ｒ変異は、ＲＢＤ内に位置し、スパイクタンパク質に対するある特定のモノクローナル抗体に耐性であることが見出されている。

ドイツのＧａｒｍｉｓｃｈ－Ｐａｒｔｅｎｋｉｒｃｈｅｎでは、新しいバリアントが、７３人の新しい患者のうち３５人で検出されている。バリアントは現在配列決定されているが、スパイクタンパク質中で少なくとも１つの点変異が検出されている。

インドでは、両方ともＢ．１．６１７．１サブクレードに属する２つの関連するバリアントが出現している。ｖ１またはＢ．１．６１７．１ｖ１（カッパバリアント）と称される１つのＢ．１．６１７．１バリアントのゲノムは、以下の８つの置換：Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、及びＱ１０７１Ｈを有するスパイクタンパク質をコードする。ｖ２またはＢ．１．６１７．１ｖ２と称される他のＢ．１．６１７．１バリアントのゲノムは、以下の８つの置換：Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｑ１０７１Ｈ、及びＨ１１０１Ｄを有するスパイクタンパク質をコードする。

インドではまた、Ｂ．１．６１７．２サブクレードに属する別のバリアントが出現している。Ｂ．１．６１７．２（デルタ）バリアントのゲノムは、以下の１０個の置換：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Ｇ、Ｆ１５７、Ｒ１５８、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎに加えて、２つの欠失：Ｆ１５７ｄｅｌ及びＲ１５８ｄｅｌを有するスパイクタンパク質をコードする。

アンゴラでは、ゲノムサーベイランスを通じて、複数のスパイクタンパク質変異を有するＡ．ＶＯＩ．Ｖ２と称される新しいバリアントが検出されている。Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２バリアントのゲノムは、１０個の置換及び５つのアミノ酸欠失を含む以下の１５個の変異：Ｄ８０Ｙ、ΔＹ１４４、ΔＩ２１０、Ｄ２１５Ｇ、ΔＲ２４６、ΔＳ２４７、ΔＹ２４８、Ｌ２４９Ｍ、Ｗ２５８Ｌ、Ｒ３４６Ｋ、Ｔ４７８Ｒ、Ｅ４８４Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、及びＱ９５７Ｈを有するスパイクタンパク質をコードする。

目的のバリアント（ＶＯＩ）、ラムダ（Ｃ．３７）が調査されている。バリアントは、ペルーで最初に記録され、南米で最も頻繁に見出されている。これは、主にＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）における欠失の数の多差に起因して、そのＲＳＹＬＴＰＧＤ２４６－２５３Ｎ変異が中和抗体を回避する能力を増加させ得る可能性があるので、比較的高いリスクスコアを有する。

別の目的のバリアント（ＶＯＩ）、ｍｕ（Ｂ．１６２１）が報告されており、コロンビアで最初に記録されている。バリアントは、スパイクタンパク質における挿入、１４６Ｎ、及びいくつかのアミノ酸置換（Ｙ１４４Ｔ、Ｙ１４５Ｓ、Ｒ３４６Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＰ６８１Ｈ）を含む。

Ｂ．１．２４３及びＢ．１．２４３．１の２つの追加の関連するバリアントは、主に北米（アリゾナ）で見出されている。Ｂ．１．２４３．１バリアントは、さらなるスパイクタンパク質変異（Ｖ２１３Ｇ）に加えて、Ｅ４８４Ｋ変異を有し、これは、中和抗体に対してより耐性にすることができる。

複数のスパイクタンパク質変異を有する懸念されるバリアントであるオミクロン（Ｂ．１．１．５２９）は、ボツワナで最初に検出された。バリアントにおいて観察される変異としては、伝播性及び変異を増加させると考えられるデルタバリアントにおいて見出されるもの、ならびに免疫回避を促進すると考えられるベータ及びデルタバリアントにおいて見られるものが挙げられる。特に、オミクロンバリアントのゲノムは、以下の変異：Ａ６７Ｖ、Δ６９－７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ／Δ１４３－１４５、Δ２１１／Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、及びＬ９８１Ｆを有するスパイクタンパク質をコードする。

これらの例示的な株及び他の新たに出現している株は、本明細書に開示の方法及び製剤の候補である。これら及び他のコロナウイルス株からの抗原をコードするｍＲＮＡが、ｍＲＮＡワクチン用に設計されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、初回免疫または初回刺激免疫化（例えば、対象へのコロナウイルスワクチンの最初の投与）として投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、本明細書に記載のブースター、すなわち、初回免疫または初回刺激免疫化後に投与される用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、ブースター及び初回免疫または初回刺激免疫化は、同じｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡを含む。他の実施形態では、ブースター及び初回免疫または初回刺激免疫化は、異なるｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡを含む。他の実施形態では、異なる抗原をコードする複数のｍＲＮＡワクチン（各々、株または複数の株に指向されている）が、複数のコロナウイルス株に対して幅広い中和プラットフォームを提供するように、一緒にまたは並行して投与され得る。ｍＲＮＡの組み合わせは、インビボで特に有効であることが実証されており、非常に驚くべきことに、ワクチンの一部ではないバリアント株に対してさえ強力な免疫応答を生じる。例えば、多価ｍＲＮＡワクチンをブースターとして投与すると、初回免疫または追加免疫に含まれないウイルスの両方のバリアント株に対して、強力かつ同等の中和力価を誘発することが示された。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）であり、約９８６０のアミノ酸をコードする２９．８～３０ｋｂのサイズを有する（Ｃｈａｎｅｔａｌ．２０００、前述、Ｋｉｍｅｔａｌ．２０２０Ｃｅｌｌ，Ｍａｙ１４；１８１（４）：９１４－９２１．ｅ１０．）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、５’キャップ及び３’－ポリＡテールを有するポリシストロン性ｍＲＮＡである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、構造タンパク質及び非構造タンパク質（Ｎｓｐｓ）をコードする特定の遺伝子に編成されている。ゲノム内の構造タンパク質の順序は、５’－レプリカーゼ（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１／ａｂ）－構造的タンパク質［スパイク（Ｓ）－エンベロープ（Ｅ）－メンブレン（Ｍ）－ヌクレオカプシド（Ｎ）］－３’である。コロナウイルスのゲノムとしては、アクセサリータンパク質、非構造タンパク質、及び構造タンパク質をコードするさまざまな数のオープンリーディングフレームが挙げられる（Ｓｏｎｇｅｔａｌ．２０１９Ｖｉｒｕｓｅｓ；１１（１）：ｐ．５９）。ほとんどの抗原ペプチドは、構造タンパク質に位置する（Ｃｕｉｅｔａｌ．２０１９Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；１７（３）：１８１－１９２）。スパイク表面糖タンパク質（Ｓ）、小さなエンベロープタンパク質（Ｅ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）は、４つの主要な構造タンパク質である。Ｓタンパク質は、細胞向性及びウイルス進入に寄与し、また中和抗体（ＮＡｂ）及び保護免疫を誘導することが可能であるので、全ての他の構造タンパク質の中でも、コロナウイルスワクチン開発における最も重要な標的のうちの１つとみなすことができる。さらに、アミノ酸配列分析は、Ｓタンパク質がコロナウイルスの中で保存された領域を含有することを示しており、これは、普遍的なワクチン開発の基礎となり得る。

本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、目的の抗原、例えば、ベータコロナウイルス構造タンパク質に由来する抗原、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に由来する抗原をコードするように設計された核酸、特に、ｍＲＮＡを特徴とする。本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、それ自体が抗原を含まず、むしろ、細胞、組織、または対象に一旦送達された抗原または抗原配列をコードする核酸、特にｍＲＮＡ（複数可）を含む。核酸、特にｍＲＮＡ（複数可）の送達は、ひいては、核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（複数可）を発現する細胞によって、細胞、組織、または対象への投与の際に核酸が取り込まれるように、適切な担体または送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）内で当該核酸を製剤化することによって達成される。

本明細書で使用される場合、抗原は、免疫応答を誘導する（例えば、免疫系による抗原に対する抗体の産生を引き起こす）ことが可能なタンパク質である。本開示のワクチンは、タンパク質抗原がインビトロで精製または生産される従来のタンパク質ベースのワクチン接種アプローチ、例えば、組換えタンパク質生産技術を上回る、独自の利点を提供する。本開示のワクチンは、所望の抗原をコードするｍＲＮＡを特徴とし、これは、体内に導入されると、すなわち、インビボで哺乳類対象（例えば、ヒト）に投与されると、体の細胞によって所望の抗原の発現が引き起こされる。本開示のｍＲＮＡを体の細胞に送達することを容易にするために、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内にカプセル化される。ｍＲＮＡが送達され、体の細胞によって取り込まれると、細胞質において翻訳され、タンパク質抗原が、宿主細胞機構によって生成される。タンパク質抗原は、提示され、適応性液性及び細胞性免疫応答を誘発する。中和抗体は、発現されたタンパク質抗原に対して指向され、したがって、タンパク質抗原は、ワクチン開発にとっての関連する標的抗原とみなされる。本明細書では、「抗原」という用語の使用は、別段述べない限り、免疫原性タンパク質及び免疫原性断片（（少なくとも１つの）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する免疫応答を誘導する（または誘導することが可能である）免疫原性断片）を包含する。「タンパク質」という用語がペプチドを包含し、「抗原」という用語が抗原フラグメントを包含することが理解されるべきである。他の分子は、細菌多糖類またはタンパク質と多糖構造との組み合わせなどの抗原性であり得るが、本明細書に含まれるウイルスワクチンでは、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質の断片、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する設計タンパク質及び／または変異タンパク質が、本明細書で提供される抗原である。

多くのタンパク質は、オリゴマー分子に会合する２つ以上のまたはいくつかのポリペプチド鎖からなる四次構造または三次構造を有する。本明細書で使用される場合、「サブユニット」という用語は、単一のタンパク質分子、例えば、発生期のタンパク質分子のプロセシングから生じるポリペプチドまたはポリペプチド鎖を指し、このサブユニットは、他のタンパク質分子（例えば、サブユニットまたは鎖）とアセンブル（または「同時アセンブル」して）タンパク質複合体を形成する。タンパク質は、比較的少数のサブユニットを有し得るので、「オリゴマー」として説明されてもよく、または多数のサブユニットからなり、したがって「マルチマー」として記述されてもよい。オリゴマーまたはマルチマータンパク質のサブユニットは、同一、相同、または完全に異なって、異なるタスク専用である場合もある。

タンパク質またはタンパク質サブユニットは、さらにドメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質内の別個の機能及び／または内の構造単位を指す。通常、「ドメイン」は特定の機能または相互作用に関与し、タンパク質の全体的な役割に貢献する。ドメインは、さまざまな生物学的状況で存在し得る。類似のドメイン（すなわち、構造的、機能的及び／または配列相同性を共有するドメイン）は、単一のタンパク質内に存在してもよく、または類似もしくは異なる機能を有する別個のタンパク質内に存在してもよい。タンパク質ドメインは、多くの場合、特定のタンパク質の三次構造または配列の保存された部分であり、残りのタンパク質またはそのサブユニットとは独立して機能し、存在し得る。

構造生物学及び分子生物学では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノム配列の公開直後に行われたように、同一、相同、または類似のサブユニットまたはドメインが、新たに同定されたタンパク質または新規タンパク質の分類に役立ち得る。

本明細書で使用される場合、抗原という用語は、抗原結合部位によって認識され得るが、免疫応答を誘導するには不十分である抗原、例えば、７～１０アミノ酸などのポリペプチド、または炭水化物構造の下位構造である「エピトープ」という用語とは別個である。当該技術分野は、単離された形態で対象または免疫細胞に送達されるタンパク質抗原、例えば、単離されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド抗原を記載しているが、タンパク質抗原の設計、試験、検証、及び産生は、特にタンパク質を大規模に生産する場合、費用及び時間がかかる場合がある。対照的に、ｍＲＮＡテクノロジーは、さまざまな抗原をコードするｍＲＮＡ構築物の迅速な設計及び試験に適している。さらに、適切な送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）での製剤と組み合わせたｍＲＮＡの迅速な産生は、迅速に進行し得、大規模でｍＲＮＡワクチンを迅速に産生し得る。本発明のｍＲＮＡによってコードされる抗原が対象の細胞によって発現され、例えば、人体によって発現され、したがって、対象、例えば、人体は、「工場」として機能して、抗原を生成し、それが次に、所望の免疫応答を誘発するという事実からも潜在的な利益が生じる。

本明細書で提供される組成物は、同じかまたは異なるウイルス株の２つ以上の抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得る。また本明細書で提供されるのは、１つ以上のコロナウイルス抗原及び異なる生物の１つ以上の抗原（複数可）をコードするＲＮＡを含む併用ワクチンである。したがって、本開示のワクチンは、同じ株／種の１つ以上の抗原、または異なる株／種の１つ以上の抗原、例えば、コロナウイルス感染のリスクが高い同じ地理的領域で見出される生物に対する免疫を誘導する抗原、またはコロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に曝露すると、個体が曝露する可能性が高い生物を標的とする併用ワクチンであり得る。

いくつかの実施形態では、第２のまたはその後の循環しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、出現株からの免疫優性抗原である。出現株の免疫優性抗原は、元の株または他のそのバリアントなどのウイルスの異なる株と比較して、抗原が由来する株に関して評価される。出現株の免疫優性抗原は、異なる株に対するよりも、出現株に対してより強い免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、出現株の免疫優性抗原は、元の株または他のそのバリアントなどのウイルスの異なる株よりも感染性が高い。

コードされたコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質抗原
既知のベータコロナウイルスのエンベロープスパイク（Ｓ）タンパク質は、ウイルスの宿主指向性及び宿主細胞への進入を決定する。コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、中和抗体及び防御免疫を誘導し得るので、ワクチン設計用のえり抜きの抗原である。Ｓタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に重要である。Ｓタンパク質の構成は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ－ＣｏＶ、及びＮＬ６３－ＣｏＶなどのベータコロナウイルス間で類似している。

本明細書で使用される場合、「スパイクタンパク質」という用語は、ベータコロナウイルスを含むウイルスのエンベロープ（ウイルス表面）から突出するホモ三量体を形成する糖タンパク質を指す。三量体化したスパイクタンパク質は、宿主細胞の表面にある受容体に結合し、続いてウイルス膜と宿主細胞膜を融合させることにより、ビリオンの宿主細胞への進入を促進する。Ｓタンパク質は、ウイルスの種類に応じて１，１６０～１，４００のアミノ酸で構成される、高度にグリコシル化された大きなＩ型膜貫通型融合タンパク質である。ベータコロナウイルススパイクタンパク質は、約１１００～１５００アミノ酸を含む。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質は、中和抗体及び防御免疫を誘導し得るので、ワクチン設計に最適な抗原である。本発明のｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパクを産生するように（すなわち、ｍＲＮＡが細胞または組織、例えば対象の細胞または組織に送達されると、スパイクタンパク質が発現されるようにスパイクタンパク質をコードする）、同様にその抗原バリアント質を産生するように、設計されている。当業者であれば、ウイルス、例えばベータコロナウイルスが宿主細胞へのウイルス進入を促進するという意図された機能を実行するために、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質が必要であり得るが、スパイクタンパク質の構造及び／または配列におけるある量の変動が、主にスパイクタンパク質に対する免疫応答を誘発しようとする場合、許容されることを理解するであろう。例えば、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端からの、例えば、１～数個、おそらく最大５または最大１０のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原の１～数個、おそらく最大５または最大１０アミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）は、タンパク質の抗原特性を変えることなく許容され得る。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、安定化スパイクタンパク質であり、例えば、スパイクタンパク質は、２つのプロリン置換（２Ｐ変異）によって安定化される。

いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、異なるウイルス株からのものである。株は、微生物（例えば、ウイルス）の遺伝的バリアントである。２つ以上のウイルスが天然の同じ細胞に感染すると、例えば、抗原ドリフトまたは抗原シフトによる、遺伝的構成要素の変異またはスワッピングに起因して、新しいウイルス株が創出され得る。

抗原ドリフトは、宿主抗体を認識するウイルス表面タンパク質をコードするウイルス遺伝子の変異の蓄積によって生じる、ウイルスにおける一種の遺伝的変異である。これは、以前の株による感染を予防した抗体によって効果的に阻害されないウイルス粒子の新しい株をもたらす。これによって、変化したウイルスが部分的な免疫集団全体に広がりやすくなる。

抗原シフトは、ウイルスの２つ以上の異なる株、または２つ以上の異なるウイルスの株が結合して、２つ以上の元の株の表面抗原の混合物を有する新しいサブタイプを形成するプロセスである。この用語は、最もよく知られている例であるので、多くの場合、インフルエンザに特異的に適用されるが、このプロセスは、他のウイルスでも発生することが知られている。抗原シフトは、表現型の変化を付与する再アソートまたはウイルスシフトの特定の事例である。抗原シフトは、抗原ドリフトとは対照的であり、これは、ウイルスの既知の株の経時的な天然変異であり、免疫の喪失またはワクチンのミスマッチをもたらし得る。抗原シフトは、多くの場合、ウイルス表面抗原の大規模な再編成に関連付けられ、ウイルスの表現型を大幅に変化させる再アソートをもたらす。

本明細書で使用されるウイルス株は、ウイルスの１つ以上の表面タンパク質の異なるアイソフォームを特徴とする遺伝子バリアントまたはウイルスのものである。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質における異なるアミノ酸配列である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合、新しい株に対する個体における免疫応答が、個体を免疫化するか、または最初に感染させるために使用される株に対するよりも効果が低い場合。新しいウイルス株は、免疫化されたか、または以前に感染した個体における継続的な免疫応答に起因する、天然変異、または天然変異と免疫選択との組み合わせから生じ得る。新しいウイルス株は、標的細胞との受容体結合またはウイルス融合などのウイルス機能を担うスパイクタンパク質の領域における１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸変異によって異なり得る。新しい株からのスパイクタンパク質は、アミノ酸レベルで９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性で親株と異なり得る。

天然ウイルス株は、天然条件下で安定なままである（例えば、生物学的、血清学的、及び／または分子的特徴が、安定でありかつ遺伝可能である）いくつかの「独自の表現型特徴」を有するので、認識可能である所与のウイルスのバリアントである。そのような「独自の表現型特徴」は、独自の抗原特性、宿主範囲（例えば、異なる種類の宿主に感染する）、株によって引き起こされる疾患の症状、株によって引き起こされる異なる種類の疾患（例えば、異なる手段によって伝播される）などの、比較される参照ウイルスとは異なる生物学的特性である。「独自の表現型特徴」は、臨床的に（例えば、株に感染した宿主で検出された臨床症状）または比較動物実験内で検出することができ、皮革動物実験では、ウイルス学の分野で熟練した研究者は、どの動物がどのウイルスを受けたのかを知ることなく、また２つのウイルス間の違いについての情報を有することなく、参照対照ウイルスに感染した動物と新しい株に感染したことが疑われる動物とを区別することができる。重要なことに、ゲノム配列に単純な違いを有するウイルスバリアントは、認識可能な別個のウイルス表現型がない場合、別々の株ではない。別個の表現型が少数の変異から生じることがあるので、ゲノム配列の変異の程度は、株としてのバリアントの分類とは無関係である。

一例として、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのウイルス株バリアントからの抗原をコードするか、または野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではない少なくとも１つのウイルス株からの変異を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｂ．１．１．７系譜（ＵＫ）バリアント（２０Ｂ／５０１Ｙ．Ｖ１ＶＯＣ２０２０１２／０１）に関連付けられるスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。Ｂ．１．１．７系譜バリアントは、アミノ酸アスパラギン（Ｎ）が、チロシン（Ｙ）に置き換えられている、Ｎ５０１Ｙ変異である、５０１位のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に変異を有する。さらに、バリアントは、自発的に何度も生じる６９／７０欠失を有し、スパイクタンパク質のコンフォメーション変化、Ｓ１／Ｓ２フリン切断部位付近のＰ６８１Ｈ変異、及びＯＲＦ８の変異によって引き起こされるＯＲＦ８ストップコドン（Ｑ２７ストップ）をもたらす。５０１．Ｖ２（南アフリカ、ＳＡ）バリアントは、スパイクタンパク質に、Ｎ５０１Ｙ及びＥ４８４Ｋを含む複数の変異を含むが、６９／７０に欠失を有さない。Ｅ４８４Ｋ変異は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体の少なくとも１つの形態と比較して、「脱出」変異であるとみなされるので、ウイルスの抗原性を変化させ得る。発見された他に変異としては、ウイルスの伝播速度を増加させると考えられているＤ６１４Ｇ変異、及びＮ５４３Ｙ変異（オランダ及びデンマークのミンク農場から出現した）が挙げられる。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、２つ以上のバリアントからの変異（例えば、Ｂ．１．１．７及び５０２Ｙ．Ｖ２バリアントで見出される変異の組み合わせ）を含む。以下の表２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントにおけるスパイクタンパク質変異の例を提示する。

例示的な実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされるスパイクタンパク質抗原は、配列番号５、８、１１、１４、１７、２３、２６、３０、３３、３６、３９、及び４２のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされるスパイクタンパク質抗原は、配列番号５、８、１１、１４、１７、２３、２６、３０、３３、３６、３９、及び４２のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質と比較して（と並べると）、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、または５以下のアミノ酸置換及び／または欠失を有する。コードされるスパイクタンパク質配列にわずかな変動が生じる場合、バリアントは、好ましくは、参照スパイクタンパク質配列と同じ活性を有し、及び／または例えば、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ））で決定して、参照スパイクタンパク質と同じ免疫特異性を有する。

コロナウイルスのＳタンパク質は、２つの重要な機能サブユニットに分けられ得、そのうち、Ｓタンパク質の球状頭部を形成するＮ末端Ｓ１サブユニット、及びタンパク質の茎を形成するＣ末端Ｓ２領域があり、ウイルスエンベロープに直接埋め込まれている。潜在的な宿主細胞と相互作用すると、Ｓ１サブユニットは宿主細胞上の受容体、特にアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体を認識して結合するが、Ｓタンパク質の最も保存された構成要素であるＳ２サブユニットは、ウイルスのエンベロープを宿主細胞膜と融合させることを担う。（例えば、Ｓｈａｎｇｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ．２０２０Ｍａｒ；１６（３）：ｅ１００８３９２．を参照されたい）。三量体Ｓタンパク質三量体の各モノマーには、付着及び膜融合をそれぞれ媒介する２つのサブユニットＳ１及びＳ２が含有されている。インビボでの感染プロセスの一部として、２つのサブユニットは酵素的切断プロセスによって互いに分離される。Ｓタンパク質は、最初に、感染細胞のＳ１／Ｓ２部位でのフリン媒介性切断によって切断される。インビボでは、その後のセリンプロテアーゼ媒介性切断事象は、Ｓ１内のＳ２’部位で生じる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２では、Ｓ１／Ｓ２切断部位は、アミノ酸６７６
～６８８（配列番号４７）にある。Ｓ２’切断部位は、アミノ酸８１１－ＫＰＳＫＲ／ＳＦＩ－８１８（配列番号４８）にある。

本明細書で使用される場合、例えば、本発明の核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質抗原を設計する文脈において、「Ｓ１サブユニット」（例えば、Ｓ１サブユニット抗原）という用語は、Ｓタンパク質のＮ末端で始まり、Ｓ１／Ｓ２切断部位で終わるスパイクタンパク質のＮ末端サブユニットを指し、一方で「Ｓ２サブユニット」（例えば、Ｓ２サブユニット抗原）という用語は、Ｓ１／Ｓ２切断部位で開始し、スパイクタンパク質のＣ末端で終了するスパイクタンパク質のＣ末端サブユニットを指す。上記のように、当業者であれば、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質Ｓ１またはＳ２サブユニットがそれぞれ受容体結合または膜融合に必要であるが、Ｓ１またはＳ２の構造及び／または配列におけるある程度の変動は、スパイクタンパク質サブユニットに対する免疫応答を主に誘発しようとする場合、許容されることを理解するであろう。例えば、コードされたサブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端からの、例えば、１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質サブユニット、例えば、コードされるＳ１またはＳ２タンパク質抗原の１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）は、タンパク質（複数可）の抗原特性を変えることなく許容され得る。例示的な実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされるスパイクタンパク質抗原は、配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３０、３２、３３、３６、３９、及び４２のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物と比較して、以下の変異：Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ５０１Ｙ、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ａ７０１Ｖ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ８６１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈのうちの少なくとも１つを有する抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質（ＷＴの２Ｐ変異バージョン）と比較して、以下の変異：Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ５０１Ｙ、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ａ７０１Ｖ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ８６１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈのうちの少なくとも１つを有する抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、列挙される変異のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個全てを有する抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質と比較して、１つ以上の欠失を有する抗原をコードする。例示的な欠失としては、限定されないが、位置６９、７０、１４４、及び２４２～２４４が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１、２、３、４、５、または６つの欠失を有する抗原をコードする。いくつかの実施形態では、抗原をコードするｍＲＮＡは、１、２、３、４、５、もしくは６つの欠失、及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の変異、またはそれらの任意の組み合わせを有する。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、異なる抗原をコードする１、２、３、４、５、または６つのｍＲＮＡを含み、各抗原が、少なくとも１つの変異及び／または少なくとも１つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質抗原またはその抗原断片をコードするｍＲＮＡをさらに含む。ｍＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子内にある（すなわち、脂質ナノ粒子は、異なる抗原をコードする１、２、３、４、５、または６つのｍＲＮＡを含む）。

いくつかの態様では、本開示の組成物は、少なくとも、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第１のｍＲＮＡであって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異、欠失、もしくはアミノ酸変異及び欠失の両方を有するアミノ酸配列を有する第１のｍＲＮＡと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第２のｍＲＮＡであって、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異、欠失、またはアミノ酸変異及び欠失の両方を有するアミノ酸配列を有する、第２のｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。いくつかの実施形態では、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｍＲＮＡは、１：１、１：２、１：３、または１：４の比で組成物中に存在する。別の実施形態では、第１及び第２のｍＲＮＡは、組成物中に２：１、３：１または４：１の比で存在する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｍＲＮＡは、組成物中に１：１の比で存在する。一実施形態では、第１のｍＲＮＡは、配列番号２０（ＷＴの２Ｐ変異バージョン）をコードし、第２のｍＲＮＡは、配列番号１１（ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｌ１８Ｆ＿Ｄ８０Ａ＿Ｄ２１５Ｇ＿Ｌ２４２＿２４４ｄｅｌ＿Ｒ２４６Ｉ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ａ７０１Ｖ）をコードする。一実施形態では、第１のｍＲＮＡは、配列番号２０（ＷＴの２Ｐ変異バージョン）をコードし、第２のｍＲＮＡは、配列番号２６（Ｓ２Ｐ＿ＩＮ＿Ｂ．１．６１７．２、現在はデルタバリアントとして知られており、以下の変異：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Ｇ、Ｆ１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８ｄｅｌ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、及びＤ９５０Ｎを含む）をコードする。一実施形態では、第１のｍＲＮＡは、配列番号２０（ＷＴの２Ｐ変異バージョン）をコードし、第２のｍＲＮＡは、配列番号３０（Ｓ２Ｐ＿ＩＮ＿Ｂ．１．６１７．２、以下の変異：Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Ｇ、Ｆ１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８ｄｅｌ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎを含む）をコードする。「循環ウイルス」は、本明細書で使用される場合、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年のうちの一部、１年、１．５年、２年、３年、またはそれ以上の間循環しているウイルスを指す。

いくつかの実施形態では、組成物は、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第３のｍＲＮＡをさらに含み、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第４のｍＲＮＡをさらに含み、第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第５のｍＲＮＡをさらに含み、第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第６のｍＲＮＡをさらに含み、第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗原は、スパイクタンパク質の抗原である。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び／または第６の抗原は、スパイクタンパク質の抗原である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、組成物中に等しい量（例えば、１：１の重量／重量比または１：１のモル比）、例えば、別個のコロナウイルス抗原をコードするｍＲＮＡが１：１（：１：１：１：１）の比で存在する。本明細書で使用される場合、「重量／重量比（ｗｅｉｇｈｔ／ｗｅｉｇｈｔｒａｔｉｏ）」、または重量／重量比（ｗｔ／ｗｔｒａｔｉｏ）、または重量：重量比（ｗｔ：ｗｔｒａｔｉｏ）は、異なる構成要素の重量（質量）間の比を指す。「モル比」は、異なる構成要素（例えば、各抗原をコードするｍＲＮＡの数）間の比を指す。いくつかの実施形態では、比は、１：１、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、または４：１である。本発明の各実施形態または態様では、特徴とされるワクチンは、ＬＮＰ内にカプセル化されたｍＲＮＡを含むことが理解される。各々独自のｍＲＮＡをそれ自体のＬＮＰにカプセル化することが可能であるが、ｍＲＮＡワクチン技術は、単一のＬＮＰ生成物にいくつかのｍＲＮＡをカプセル化することが可能であるという有意な技術的利点を享受する。他の実施形態では、ワクチンは、同時製剤化されていないが、投与前に別々に混合されても、または単に別々に投与されてもよい、別々のワクチンである。

本開示の組成物のコロナウイルス抗原及びコロナウイルス抗原をコードするＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント抗原）の例示的な配列を、表１に提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、配列番号１、６、９、１２、１５、２１、２４、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４５から選択される配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、配列番号５、８、１１、１４、１７、２３、２６、３０、３３、３６、３９、及び４２から選択される配列に対し９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるポリペプチドをコードする。

核酸
本開示の組成物は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（少なくとも１つの）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、及び／または５’キャップ類似体をさらに含む。

また、本開示のコロナウイルスワクチンは、任意の５つの’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３つの’ＵＴＲを含み得ることが理解されるべきである。例示的なＵＴＲ配列としては、配列番号２、４、５０、及び５１が挙げられるが、しかしながら、他のＵＴＲ配列は、本明細書に記載のＵＴＲ配列のうちのいずれかとして使用または交換され得る。いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号５０（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）及び配列番号２（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号５１（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）及び配列番号４（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）から選択される配列を含む。ＵＴＲはまた、本明細書で提供されるＲＮＡポリヌクレオチドから省略され得る。

核酸は、ヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）のポリマーを含む。したがって、核酸はまた、ポリヌクレオチドとも称される。核酸は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２′－アミノ機能化を有する２´－アミノ－ＬＮＡ、及び２′－アミノ機能化を有する２´－アミノ－α－ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、及び／またはキメラ、及び／またはそれらの組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。

「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）タンパク質（天然に存在するか、天然に存在しないか、またはアミノ酸の修飾ポリマー）をコードする任意のＲＮＡを指し、これは、翻訳されて、インビトロで、インビボで、インサイチュで、またはエクスビボでコードされたポリペプチドを産生し得る。当業者であれば、別段明記しない限り、本出願に記載の核酸配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を挙げることができるが、その配列がｍＲＮＡを表す場合、「Ｔ」は、「Ｕ」に置換されることを理解するであろう。したがって、本明細書で特定の配列同定番号によって開示及び同定されるＤＮＡのうちのいずれも、ＤＮＡに相補的な対応するｍＲＮＡ配列についても開示しており、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」が、「Ｕ」で置換される。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続的なストレッチである。ＯＲＦは、典型的にはタンパク質をコードする。本明細書に開示の配列は、追加のエレメント、例えば、５’及び３’ＵＴＲをさらに含み得るが、それらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のＲＮＡポリヌクレオチドに必ずしも存在する必要はないことが理解されるであろう。

バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原バリアントをコードするＲＮＡを含む。抗原バリアントまたは他のポリペプチドバリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。抗原／ポリペプチドバリアントは、ネイティブ配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原バリアントの例を表１に提供する。通常、バリアントは、野生型、天然、または参照配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型、天然、または参照配列に対し少なくとも９０％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、参照配列と比較して、１、２、３、４つ、またはそれ以上の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、参照配列と比較して、２０、１８、１５、１２、または１０個未満の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、１～５０１～４０、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、５～５０、５～４０、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、２０～５０、２０～４０、２０～３０、２０～２５、２５～５０、２５～４０、２５～３０、３０～５０、３０～４０、４０～５０個の変異（例えば、置換）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントをコードする。本明細書で使用される場合、「変異」は、アミノ酸の置換、挿入、または欠失を指す。参照配列は、天然に存在する株、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然に存在する循環株を指す。

本開示の核酸によってコードされるバリアント抗原／ポリペプチドは、例えば、その免疫原性を向上する、その発現を向上する、及び／または対象におけるその安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する、多数の望ましい特性のうちのいずれかを付与する、アミノ酸変化を含有し得る。バリアント抗原／ポリペプチドは、通例の変異誘発技法を使用して作製し、適宜アッセイして、所望の特性を有するかどうかを評価することができる。発現レベル及び免疫原性を決定するアッセイは、当該技術分野で周知であり、例示的なそのようなアッセイは、実施例セクションに記載されている。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性は、当該技術分野で認識されている技法を使用して、例えば、ワクチン接種した対象における抗原の発現を経時的に評価することによって、及び／または誘導された免疫応答の持続性を確認することによって測定することができる。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性時の安定性を分析することによって測定することができ、またはｉｎｓｉｌｉｃｏ予測を使用して測定することができる。そのような実験及びｉｎｓｉｌｉｃｏ評価のための方法は、当技術分野で既知である。

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか、または本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡまたはＲＮＡＯＲＦを含む。

「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定した、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係を指す。同一性はまた、配列間の配列関連性の程度も指し、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の鎖間の一致数によって決定される。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一の一致のパーセントを測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）」は、当該配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成した後の第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一の、アミノ酸または核酸の候補配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージと定義される。整列のための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されたギャップ及びペナルティにより価値が異なる場合があることが理解される。概して、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に既知である配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定して、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものに対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールには、ＢＬＡＳＴスイートのツールが含まれる（ＳｔｅｐｈｅｎＦ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ（１９９７），「ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ」，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。別の普及しているローカルアラインメント技法は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７を参照されたい）。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアラインメント技法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）″Ａｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄａｐｐｌｉｃａｂｌｅｔｏｔｈｅｓｅａｒｃｈｆｏｒｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３を参照されたい）。より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアラインメント方法よりも速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアラインメントを生成すると言われる高速最適グローバルシーケンスアラインメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。

したがって、参照配列、特に本明細書に開示のポリペプチド（抗原）配列と比較して、置換、挿入及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つ以上のリジンが、ペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加され得る。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在のために使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性を増大させるために、またはビオチン化を可能にするために使用することができる。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、短縮配列をもたらしてもよい。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、あるいは、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるか、または固体支持体に連結された、より大きな配列の一部としての配列の発現に応じて欠失され得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）などのための（またはこれらをコードする）配列は、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置換され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することによって、充填して安定性を改善してもよい。他の実施形態では、埋もれた水素結合ネットワークを疎水性残基により置き換えて、安定性を改善することができる。また他の実施形態では、グリコシル化部位を除去し、適切な残基で置き換えてもよい。そのような配列は、当業者には容易に同定可能である。本明細書で提供される配列のうちのいくつかは、例えば、ｍＲＮＡワクチンの調製で使用する前に欠失され得る、配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含有することも理解されるべきである。

当業者には認識されるように、タンパク質フラグメント、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、目的コロナウイルス抗原の範囲内であると考えられる。例えば、本明細書では、参照タンパク質の任意のタンパク質フラグメント（参照抗原配列より少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）であって、免疫原性であり、コロナウイルスに対する防御免疫応答を付与することを条件とする、タンパク質フラグメントを提供する。参照タンパク質と同一であるが短縮されているバリアントに加えて、いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書で提供または言及するいずれかの配列に対し２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。抗原／抗原ポリペプチドの長さは、約４、６、または８アミノ酸から完全長タンパク質までの範囲をとり得る。

安定化エレメント
天然真核生物ｍＲＮＡ分子は、５′－キャップ構造または３′－ポリ（Ａ）テールなどの他の構造的特徴に加えて、限定されるものではないが、その５′末端（５′ＵＴＲ）及び／または３′末端（３′ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、安定化エレメントを含有し得、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲはいずれも、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾、少なくとも１つの５’末端キャップを有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含み、脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用するインビトロ転写反応中に同時に完了して、製造業者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成することができる：３´－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、転写後に完了されて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成してもよい（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生成して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して３番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して４番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。酵素は、組換え供給源に由来し得る。

３′－ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３′末端に付加されるアデニンヌクレオチドの連なりである。いくつかの場合において、約４００のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。

いくつかの実施形態では、組成物は安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと関連している。その発現レベルは細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、ヒストンのステムループとの結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対し少なくとも３つのヌクレオチド５’及び２つのヌクレオチド３’を含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び任意選択で、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを向上すべきである。コードされるタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせであって、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的に作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増大させる組み合わせを含む。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせによる相乗効果は、エレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、天然に存在するステムループの３’にあるおよそ１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドのストレッチを含み、これはヒストンプレｍＲＮＡから成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ｓｎＲＮＡの結合部位に相当する。いくつかの実施形態では、この核酸はイントロンを含まない。

ｍＲＮＡは、エンハンサー及び／またはプロモータ配列を含有しても含有しなくてもよく、これらは、修飾されても修飾されなくてもよく、活性化されても活性化されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、概してヒストン遺伝子に由来し、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または全体的に逆相補的な配列の分子内塩基対を含み、これがこの構造のループを形成する。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれとも塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡに存在する場合が多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、概して、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対（非ワトソン・クリック型塩基対）が生じることがある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５ヌクレオチドの長さを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のＡＵリッチな配列が除去されている。これらの配列（ＡＵＲＥＳと称されることがある）は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチン中に残存していてもよい。

シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、組成物は、コロナウイルス抗原と融合したシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有するｍＲＮＡを含む。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端側の１５～６０アミノ酸を含み、典型的には、分泌経路上の膜を横断した転位に必要であるので、真核生物及び原核生物の両方でほとんどのタンパク質が分泌経路に進入するのを普遍的に制御している。真核生物において、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、プロセシングのために、成長ペプチド鎖の膜横断輸送を開始する。ＥＲ処理は、典型的には、宿主細胞のＥＲに存在するシグナルペプチダーゼによって前駆体タンパク質からシグナルペプチドが切断されるか、または未切断のままであり、膜アンカーとして機能する、成熟タンパク質を産生する。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化も促進することができる。

シグナルペプチドの長さは、１５～６０アミノ酸の長さであり得る。例えば、シグナルペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長を有する。

異種遺伝子由来のシグナルペプチド（事実上コロナウイルス抗原以外の遺伝子の発現を調節する）が当該技術分野で既知であり、これを所望の特性について試験し、次いで本開示の核酸に組み込んでもよい。

足場部分
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡワクチンは、互いに連結されたコロナウイルス抗原または足場部分を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのような足場部分は、開示の核酸によってコードされる抗原に所望の特性を付与する。例えば、足場タンパク質は、例えば、抗原の構造を変更すること、抗原の取り込み及び処理を改変すること、及び／または結合パートナーへの抗原の結合を引き起こすことによって、抗原の免疫原性を改善し得る。

いくつかの実施形態では、足場部分は、１０～１５０ｎｍの直径、すなわち、免疫系のさまざまな細胞との最適な相互作用に非常に好適なサイズ範囲を有する、非常に対称であり、安定であり、かつ構造的に組織化されているタンパク質ナノ粒子へと自己組織化することができる、タンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質またはウイルス様粒子を使用して、安定なナノ粒子構造を形成することができる。そのようなウイルスタンパク質の例は、当該技術分野で既知である。例えば、いくつかの実施形態では、足場部分は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは、約２２ｎｍの平均直径を有し、核酸を欠く、球状粒子を形成し、したがって非感染性である（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ１４（２０１６）５８－６８）。いくつかの実施形態では、足場部分は、ＨＢＶに感染したヒト肝臓から得られるウイルスコアに類似する、２４～３１ｎｍの直径の粒子へと自己組織化する、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。１８０または２４０のプロトマーに対応する、３００Å及び３６０Åの直径の異なるサイズのナノ粒子の２つのクラスへと自己組織化する、生成されたＨＢｃＡｇ。いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原は、コロナウイルス抗原を表示するナノ粒子の自己組織化を容易にするために、ＨＢｓＡＧまたはＨＢｃＡＧに融合される。

いくつかの実施形態では、細菌タンパク質プラットフォームが使用され得る。これらの自己組織化タンパク質の非限定的な例としては、フェリチン、ルマジン、及びエンカプスリンが挙げられる。

フェリチンは、主な機能が細胞内の鉄貯蔵であるタンパク質である。フェリチンは、４つのアルファヘリックスバンドルで各々構成される２４個のサブユニットで作製され、これらは、八面体対称性を有する四次構造で自己組織化する（ＣｈｏＫ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８）。フェリチンのいくつかの高分解能構造が決定されており、ヘリコバクターピロリフェリチンが２４個の同一のプロトマーで作製されていることが確認されているが、動物において、単独で組織化することができるか、または異なる比の２４個のサブユニットの粒子へと組み合わせることができる、フェリチン軽鎖及び重鎖が存在する（ＧｒａｎｉｅｒＴ．ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＩｎｏｒｇＣｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１、ＬａｗｓｏｎＤ．Ｍ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、強力な熱的及び化学的安定性を備えたナノ粒子に自己集合する。したがって、フェリチンナノ粒子は、抗原を担持及び曝露するのに非常に好適である。

ルマジンシンターゼ（ＬＳ）はまた、抗原表示のためのナノ粒子プラットフォームとして非常に好適である。リボフラビンの生合成における最後から２番目の触媒ステップを担うＬＳは、古細菌、細菌、真菌、植物、及び真性細菌を含む多種多様な生物に存在する酵素である（ＷｅｂｅｒＳ．Ｅ．ＦｌａｖｉｎｓａｎｄＦｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｒｉｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．２０１４）。ＬＳモノマーは、１５０アミノ酸長であり、その側面に隣接するタンデムアルファヘリックスとともにベータシートからなる。ホモペンタマーから直径１５０Åのカプシドを形成する１２個のペンタマーの対称組織化物までのその形態的汎用性を示す、いくつかの異なる四次構造がＬＳについて報告されている。１００超のサブユニットのＬＳケージについてさえ、記載されている（ＺｈａｎｇＸ．ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００６；３６２：７５３－７７０）。

熱親和性Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａから単離された新規のタンパク質ケージナノ粒子であるエンカプスリンはまた、自己組織化ナノ粒子の表面上に抗原を提示するためのプラットフォームとして使用され得る。エンカプスリンは、それぞれ２０ｎｍ及び２４ｎｍの内径及び外径を有する薄い二十面体Ｔ＝１対称ケージ構造を有する同一の３１ｋＤａのモノマーの６０個のコピーから組織化される（ＳｕｔｔｅｒＭ．ｅｔａｌ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２００８，１５：９３９－９４７）。Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａにおけるエンカプスリンの正確な機能は未だ明確に理解されていないが、その結晶構造が最近解明されており、その機能は、酸化ストレス応答に関与するＤｙＰ（染料脱色ペルオキシダーゼ）及びＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）などのタンパク質をカプセル化する細胞コンパートメントとして仮定された（ＲａｈｍａｎｐｏｕｒＲ．ｅｔａｌ．ＦＥＢＳＪ．２０１３，２８０：２０９７－２１０４）。

いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、フォールドンドメインに融合したコロナウイルス抗原をコードする。フォールドンドメインは、例えば、バクテリオファージＴ４フィブリチンから得ることができる（例えば、ＴａｏＹ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９７Ｊｕｎ１５；５（６）：７８９－９８を参照されたい）。

リンカー及び切断可能なペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、本明細書では融合タンパク質と称される、２つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも１つにまたは各ドメインの間に位置するリンカーをさらにコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと称される自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳＯＮＥ６：ｅ１８５５６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号４９）リンカーである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメインの構造を有する、介在するリンカーを有する３つのドメインを含有する。

本開示と関連して、当該技術分野で既知の切断可能なリンカーが使用され得る。そのような例示的なリンカーとしては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカーが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１７／１２７７５０を参照されたい）。当業者であれば、他の当業者が認識するリンカーが、（例えば、本開示の核酸によってコードされる）本開示の構築物での使用に好適であり得ることを理解するであろう。当業者であれば、同様に、他のポリシストロン構築物（同じ分子内で別々に２つ以上の抗原／ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）が、本明細書で提供される使用に好適であり得ることを理解するであろう。

配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化方法は、当該技術分野で既知である。例えば、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つ以上のＯＲＦが、コドン最適化され得る。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的生物及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にするために；ＧＣ含量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増加させるか、または二次構造を低減するために；遺伝子の構築または発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化するために；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするために；タンパク質トラフィッキング配列を挿入または除去するために；コードされたタンパク質（例えばグリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加するために；タンパク質ドメインの追加、除去またはシャッフルのために；制限サイトを挿入または削除するために；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するために；タンパク質のさまざまなドメインが適切に折り畳まれることを可能にするように翻訳速度を調節するために；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減もしくは排除するために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋＣＡ）からのサービス及び／または専有の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列ＯＲＦ（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し７５％未満の配列同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされるコロナウイルス抗原と免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）抗原をコードする。

修飾ｍＲＮＡは、哺乳類宿主細胞にトランスフェクションされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞による発現が可能である。

いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃのレベルが向上されたものであってもよい。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を与え得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するＲＮＡより機能的に安定していると考えられる。例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示している。遺伝暗号には縮退があるため、該修飾は、得られるアミノ酸を変更することなく、既存のコドンをＲＮＡの安定性をさらに高めるコドンに置換することによってなされる。このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。

化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、転写ＲＮＡ内に存在するもの（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）などの標準的なヌクレオシド残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、ＤＮＡ内に存在するもの（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）などの標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。

化学修飾
本開示の組成物は、いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含み、核酸が、標準（非修飾）であり得るか、または当該技術分野で既知であるように修飾され得るヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよく、または天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよい。そのような修飾は、当技術分野で認識されているヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、概して知られているか、または当該技術分野で認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、特に、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。

いくつかの実施形態では、本開示の非天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、概して知られているか、または当該技術分野で認識されているものである。そのような非天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、特に、公開されている米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１号、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７に見出すことができ、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、非天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、さまざまな（２つ以上の）異なる種類の標準的な及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択で異なる）種類の標準的な及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含有する。

いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ細胞または生物における低減された分解を呈する。

いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ細胞または生物における低減された免疫原性（例えば、低減された生得的応答）を呈し得る。

核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、核酸の合成または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成によって導入されてもよいし、またはポリメラーゼ酵素を用いて鎖の末端もしくは鎖中の任意の場所に導入することもできる。核酸のいずれの領域も化学修飾することができる。

本開示は、核酸の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせた、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）を含有する化合物またはその誘導体を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組換え的に合成され得る。核酸は、ヌクレオシドが連結した領域（複数可）を含み得る。そのような領域は、さまざまな骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。

修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準的なまたは修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸の場合のように、非標準的な塩基と標準的な塩基間、または２つの相補的非標準的な塩基構造間の水素結合が可能になる。そのような非標準的な塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、化学修飾を含む前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかのうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にプソイドウリジン（ψ）置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、核酸は、１－メチル－プソイドウリジンで一様に修飾され得、つまり、当該ｍＲＮＡ配列の全てのウリジン残基が１－メチル－プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基を、上記のものなどの修飾残基で置き換えることによって一様に修飾することができる。

本開示の核酸は、分子の完全長に沿って部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。例えば、１つ以上または全てまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）は、本開示の核酸、またはその所定の配列領域（例えば、ポリＡテールを含むか、または除外するｍＲＮＡ）において均一に修飾され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）内の全てのヌクレオチドＸが、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つであってもよく、または以下の組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであってもよい。

核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体のヌクレオチド含有量に関して、または１つ以上の種類のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上に関して）あるいは任意の介在するパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含有し得る。任意の残りのパーセンテージは、修飾されていないＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって決まることが理解されよう。

ｍＲＮＡは、１％以上１００％までの修飾ヌクレオチド、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチド）を含有し得る。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含有し得る。いくつかの実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の独自の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の独自の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。

非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが、少なくとも１つの目的の抗原をコードするように設計される場合、核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンのすぐ後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳の観点から、ＵＴＲによって果たされる調節的役割に関する証拠が増えている。ＵＴＲの調節特徴は、特に分子の安定性を高めるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない臓器部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方調節の制御を確保するための特定の特徴も組み込むことができる。さまざまな５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が当技術分野で知られており、利用可能である。

５’ＵＴＲは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす特徴を有する。これらは、Ｋｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを有し、この配列は、多くの遺伝子の翻訳をリボソームが開始するプロセスに関与することが一般的に知られている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号５２）を有し、Ｒが、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、それに別の「Ｇ」が続く。５′ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。

本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連付けられる天然に見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲであり、すなわち、天然には存在しない。合成ＵＴＲとしては、例えば、遺伝子発現を増加させる、その特性を改善するために変異させたＵＴＲ、ならびに完全に合成されたものが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（８２７８０６３、９０１２２１９）、ヒトシトクロムｂ－２４５ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（ＵＳ８２７８０６３、９０１２２１９）が挙げられる。ＣＭＶ即時早期１（ＩＥ１）遺伝子（ＵＳ２０１４／０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号２４）（ＷＯ２０１４／１４４１９６）も使用され得る。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ／２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６７；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。

いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号２及び配列番号２１から選択される配列を含む。

３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然または野生型の３′ＵＴＲは、一連のアデノシン及びウリジンが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。それらの配列特徴及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を３つのクラスに分離することができる（Ｃｈｅｎｅｔａｌ，１９９５）：クラスＩＡＲＥは、Ｕリッチ地域内のＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含有する。Ｃ－ＭｙｃとＭｙｏＤには、クラスＩＡＲＥが含有される。クラスＩＩＡＲＥは２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種類のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩＡＲＥＳは、あまりよく定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎは、このクラスのなかでも十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合する大部分のタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが報告されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３′ＵＴＲに操作することは、ＨｕＲ結合をもたらし、故に、インビボでのメッセージの安定化をもたらす。

３’ＵＴＲＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性を調節してもよい。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって、翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去または変異させて、細胞内安定性を増加させ、故に、結果として生じるタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、関連細胞株において実施することができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後のさまざまな時点でアッセイすることができる。たとえば、細胞にさまざまなＡＲＥエンジニアリング分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを使用して関連タンパク質にトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に生成されたタンパク質をアッセイすることができる。

当業者であれば、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列とともに使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲは、異種３’ＵＴＲを有する合成３’ＵＴＲとともに使用され得る。

非ＵＴＲ配列はまた、核酸内の領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロン配列またはイントロン配列の部分は、本開示の核酸の領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびに核酸レベルを増加させ得る。

特徴の組み合わせをフランキング領域に含めることも、他の特徴の中に含有することもできる。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５´ＵＴＲ及び／またはポリＡテールのテンプレート化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３´ＵＴＲによって隣接され得る。５’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号及びその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５’ＵＴＲなどの、同じ及び／または異なる遺伝子からの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る。

任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが、核酸の領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。さらに、任意の既知遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも、本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置されてもよいし、または向きもしくは位置が改変されてもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで逆転、短縮、延長、作製されてもよい。本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、ＵＴＲ配列に関するものであり、ＵＴＲが参照配列に関して何らかの形で変化したことを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上に教示されるように、配向もしくは位置の変化によって野生型もしくは天然ＵＴＲと比較して、改変され得るか、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位によって改変されてもよい。「改変された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）を産生する任意のこれらの変化はバリアントＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重、または四重のＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用する「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列にコード化されているものである。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１０／０１２９８７７号に記載の二重ベータ－グロビン３′ＵＴＲが使用され得る。

パターン化されたＵＴＲを有することも本開示の範囲内である。本明細書で使用される「パターン化ＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントが１回、２回、または３回以上反復されるような反復パターンまたは交互パターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。

いくつかの実施形態では、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する、転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織または発達中のある時期に発現されるタンパク質のファミリーに属する場合がある。これらの遺伝子のいずれかに由来するＵＴＲは、同じかまたは異なるファミリーのタンパク質の任意の他のＵＴＲとスワッピングして、新しいポリヌクレオチドを作製してもよい。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」とは、最も広い意味において使用され、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指す。

非翻訳領域は、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含んでもよい。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野で既知のＴＥＥを含み得る。

非コード配列
本開示の態様は、ｍＲＮＡ、例えば、コロナウイルス抗原ポリペプチドをコードする別個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を各々含む２～１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、多価ＲＮＡ組成物に関し、各ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、独自の識別子配列（非コード配列）を有する非翻訳領域（ＵＴＲ）に１つ以上の非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、非コード配列は、独自の非コード配列である。いくつかの実施形態では、多価ワクチン組成物中の各ｍＲＮＡは、それ自体の独自の非コード配列を含む。本明細書で使用される場合、「非コード配列」は、その配列と組み合わせられると、別の生物学的分子が他の生物学的分子を同定するように機能する生物学的分子（例えば、核酸、タンパク質など）の配列を指す。典型的には、非コード配列は、標的の生物学的分子の配列内に組み込まれるか、またはその配列に付加され、目的の標的分子を同定するための参照として利用される、異種配列である。いくつかの実施形態では、非コード配列は、標的核酸内に組み込まれるか、または標的核酸に付加され、標的核酸を同定するための参照として利用される、核酸（例えば、異種または合成核酸）の配列である。いくつかの実施形態では、非コード配列は、式（Ｎ）ｎのものである。いくつかの実施形態では、ｎは、５～２０、５～１０、１０～２０、７～２０、または７～３０の範囲の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、各Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、及びＣ、またはそれらの類似体から独立して選択されるヌクレオチドである。したがって、いくつかの実施形態は、（ｉ）目的の標的配列（例えば、（例えば、抗原タンパク質または抗原ポリペプチドをコードする）コード配列）を有し、（ｉｉ）独自の非コード配列を含む、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のインビトロ転写ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの非翻訳領域（ＵＴＲ）に１つ以上の非コード配列を含む。ｍＲＮＡのＵＴＲに非コード配列を含めることによって、非コード配列がペプチドに翻訳されるのが防止される。いくつかの実施形態では、非コード領域は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールの下流（例えば、後）に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのＯＲＦの最後のコドンと、ｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間に位置する。いくつかの実施形態では、ＵＴＲに位置するポリヌクレオチド非コード配列は、１～１０個のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド非コード配列を含むＵＴＲは、ＲＮａｓｅＨ切断部位などの１つ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）のＲＮＡｓｅ切断部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物の各々の異なるＲＮＡは、異なる（例えば、独自の）非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物のＲＮＡは、ＲＮＡのポリヌクレオチド非コード配列に従って検出及び／または精製される。いくつかの実施形態では、試料（例えば、反応産生物または薬物産生物）中のｍＲＮＡの存在を同定するか、または異なるｍＲＮＡの相対比を決定するために、ｍＲＮＡ非コード配列が使用される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ非コード配列は、ディープシーケンシング、ＰＣＲ、及びサンガーシーケンシングのうちの１つ以上を使用して検出される。例示的な非コード配列としては、ＡＡＣＧＵＧＡＵ、ＡＡＡＣＡＵＣＧ、ＡＴＧＣＣＵＡＡ、ＡＧＵＧＧＵＣＡ、ＡＣＣＡＣＵＧＵ、ＡＣＡＵＵＧＧＣ、ＣＡＧＡＵＣＵＧ、ＣＡＵＣＡＡＧＵ、ＣＧＣＵＧＡＵＣ、ＡＣＡＡＧＣＵＡ、ＣＵＧＵＡＧＣＣ、ＡＧＵＡＣＡＡＧ、ＡＡＣＡＡＣＣＡ、ＡＡＣＣＧＡＧＡ、ＡＡＣＧＣＵＵＡ、ＡＡＧＡＣＧＧＡ、ＡＡＧＧＵＡＣＡ、ＡＣＡＣＡＧＡＡ、ＡＣＡＧＣＡＧＡ、ＡＣＣＵＣＣＡＡ、ＡＣＧＣＵＣＧＡ、ＡＣＧＵＡＵＣＡ、ＡＣＵＡＵＧＣＡ、ＡＧＡＧＵＣＡＡ、ＡＧＡＵＣＧＣＡ、ＡＧＣＡＧＧＡＡ、ＡＧＵＣＡＣＵＡ、ＡＵＣＣＵＧＵＡ、ＡＵＵＧＡＧＧＡ、ＣＡＡＣＣＡＣＡ、ＧＡＣＵＡＧＵＡ、ＣＡＡＵＧＧＡＡ、ＣＡＣＵＵＣＧＡ、ＣＡＧＣＧＵＵＡ、ＣＡＵＡＣＣＡＡ、ＣＣＡＧＵＵＣＡ、ＣＣＧＡＡＧＵＡ、ＡＣＡＧＵＧ、ＣＧＡＵＧＵ、ＵＵＡＧＧＣ、ＡＵＣＡＣＧ、及びＵＧＡＣＣＡが挙げられる。

いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物は、
（ａ）第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子、第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子、及び任意選択で、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることであって、第１のＤＮＡ分子、第２のＤＮＡ分子、及び第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる、組み合わせることと、
（ｂ）線形化された第１のＤＮＡ分子、線形化された第２のＤＮＡ分子、及び任意選択で、線形化された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法によって生産される。異なる供給源は、細菌細胞培養物であり得、これは共培養されない場合がある。いくつかの実施形態では、反応混合物中に存在する第１、第２、及び第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のＤＮＡ分子の量は、ＩＶＴの開始前に正規化されている。

ＲＮＡのインビトロ転写
本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して転写され得る。ＲＮＡのインビトロ転写は、当該技術分野で既知であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１５２０２７号に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０５３２０９及びＷＯ２０１９／０３６６８２（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法のいずれか１つ以上に従って調製される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡ転写産物を生成するためのインビトロ転写反応で、増幅されていない直鎖化されたＤＮＡテンプレートを使用して生成される。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡは、単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、例えば、限定されないが、コロナウイルスｍＲＮＡのＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ－１細胞に、プラスミドＤＮＡテンプレートを用いてトランスフェクションする。いくつかの実施形態では、形質移入細胞は、プラスミドＤＮＡを複製するために培養され、次いで単離及び精製される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、例えば、５’に位置し、目的の遺伝子に操作可能に連結されたＴ７プロモータを含む。

いくつかの実施形態では、インビトロ転写テンプレートは、５′非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３′ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。特定の核酸配列組成物及びインビトロ転写テンプレートの長さは、テンプレートによってコードされるｍＲＮＡに依存する。

「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されたｍＲＮＡ転写物の最初のコドン）から直接上流（すなわち、５’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写産物が生成されている場合、５’ＵＴＲはプロモータ配列を含み得る。そのようなプロモータ配列が、当該技術分野で既知である。本開示のワクチンには、そのようなプロモータ配列が存在しないことが理解されるべきである。

「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない終止コドン（すなわち、翻訳終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）から直接下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。

「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続ストレッチであり、ポリペプチドをコードする。

「ポリ（Ａ）テール」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にある、ｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、インビボ）において、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質での酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終結、及び／または核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助する。

いくつかの実施形態では、核酸は、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。

インビトロの転写系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。

ＮＴＰは、社内で製造してもよいか、供給業者から選択してもよいか、または本明細書に記載されるように合成してもよい。ＮＴＰは、限定されないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択され得る。

任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本開示の方法で使用され得る。ポリメラーゼは、限定されないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、及び／または限定されないが、化学修飾核酸及び／またはヌクレオチドを含む、修飾核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込むことが可能なポリメラーゼなどの変異体ポリメラーゼから選択され得る。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を排除する。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介しキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。

化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造してもよい。核酸の固相化学合成は、分子を固体支持体上に固定し、反応溶液中で段階的に合成する自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。

液相化学合成。モノマービルディングブロックの連続付加による本開示の核酸の合成は、液相で実行され得る。

合成方法の組み合わせ。上記で考察した合成方法には、それぞれ独自の利点及び制限がある。その制限を克服するために、これらの方法を組み合わせる試みが行われている。そのような方法の組み合わせは、本開示の範囲内である。酵素ライゲーションと組み合わせた、固相または液相化学合成の使用は、化学合成単独では得ることができない長鎖核酸を生成する効率的な方式が提供される。

核酸領域または部分領域のライゲーション
リガーゼによる核酸の組み立ても使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介して、ポリヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチド及び／または環状核酸などの核酸は、１つ以上の領域または部分領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡフラグメントをリガーゼ触媒反応によって結合させて、異なる機能を有する組換えＤＮＡを生成することができる。２つのオリゴデオキシヌクレオチド（５’ホスホリル基を含むもの及び遊離３’ヒドロキシル基を含むもの）がＤＮＡリガーゼの基質として機能する。

精製
本明細書に記載の核酸の精製には、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣベースの精製方法、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などの当技術分野で知られている方法によって実施することができる。「精製された」という用語は、「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」とは、別の不適切なもの、不純なもの、または粗悪なものに変えてしまう任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれに処理もしくは精製方法を施す前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。

品質保証及び／または品質管理のチェックは、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣなどの方法を使用して行うことができる。

いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法によって配列決定され得る。

定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑膜液、痰性体液、羊膜液、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から取得され得る。

アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを使用して実施することができ、エクソソームは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫組織化学を使用して単離することができる。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離することができる。

これらの方法により、研究者は、核酸の残留レベルまたは送達レベルをリアルタイムでモニターすることができる。これは、本開示の核酸が、いくつかの実施形態では、構造的または化学的修飾により内因性形態とは異なることから可能である。

いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸は、核酸が適切なサイズであるかどうか決定し、核酸の分解が生じていないか確認するために分析され得る。核酸の分解は、限定するものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認され得る。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」は、単一のＬＮＰまたはＬＮＰの集団を指すと理解されたい。脂質ナノ粒子は、典型的には、イオン化可能なアミノ（カチオン性）脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質構成要素を、目的核酸カーゴとともに含む。本開示の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で概して既知である構成要素、組成物、及び方法を使用して生成することができ、例えば、それら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照されたい。

本開示のワクチンは、典型的には、脂質ナノ粒子内に製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なアミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０ｍｏｌ％、２０～４０ｍｏｌ％、２０～３０ｍｏｌ％、３０～６０ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、４０～６０ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、または５０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１０～２０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１５～２５ｍｏｌ％、１５～２０ｍｏｌ％、または２０～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、または２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５～５５ｍｏｌ％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０ｍｏｌ％、２５～４５ｍｏｌ％、２５～４０ｍｏｌ％、２５～３５ｍｏｌ％、２５～３０ｍｏｌ％、３０～５５ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４５ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、３０～３５ｍｏｌ％、３５～５５ｍｏｌ％、３５～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％、３５～４０ｍｏｌ％、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４０～４５ｍｏｌ％、４５～５５ｍｏｌ％、４５～５０ｍｏｌ％、または５０～５５ｍｏｌ％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のステロールを含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０ｍｏｌ％、０．５～５ｍｏｌ％、１～１５ｍｏｌ％、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、２～１５ｍｏｌ％、２～１０ｍｏｌ％、２～５ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、２０～４０ｍｏｌ％のコレステロール、及び０．５～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、９～１３ｍｏｌ％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％のコレステロール、及び２～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１ｍｏｌ％の中性脂質、６８．５ｍｏｌ％のコレステロール、及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物を含む：
の化合物またはその塩もしくは異性体であり得、式中：
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４は、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６は、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）_２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４、もしくは５である場合に－Ｎ（Ｒ）_２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合に５、６、または７員のヘテロシクロアルキルではない化合物が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、Ｃ_３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳ、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノまたはジアルキルアミノ、及びＣ_１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されるＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎが、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６は、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ_３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５～１４員の複素環である場合、ならびに（ｉ）Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱである（ここでｎは、１もしくは２である）、または（ｉｉ）Ｒ_４が－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲである（ここでｎは、１である）、または（ｉｉｉ）Ｒ_４が、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）_２である場合、Ｑは、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ_５が、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６は、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、Ｃ_３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６は、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_２－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子とともに複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱまたは－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが－Ｎ（Ｒ）_２であり、ｎが３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が、独立して、Ｃ_１～３アルキル、Ｃ_２～３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６は、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子とともに複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）_２からなる群から選択され、ここで、Ｑが－Ｎ（Ｒ）_２であり、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６が、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）：
またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ_１は、結合またはＭ´であり、Ｒ_４は、非置換Ｃ_１－３アルキルまたは－（ＣＨ_２）_ｎＱであり、ここでＱは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ´は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、及びＣ_２－１４アルケニルからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）：
またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ_１が、結合またはＭ’であり、Ｒ_４が、非置換Ｃ_１－３アルキルまたは－（ＣＨ_２）_ｎＱであり、ｎが、２、３、または４であり、Ｑが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、
－ＮＨＣ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ_２及びＲ_３が、独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル及びＣ_２－１４アルケニルからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、もしくは（ＩＩｅ）：
のもの、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、Ｒ_４は、本明細書に記載の通りである。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩｄ）：
のもの、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｎは、２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ_２～Ｒ_６は、本明細書に記載の通りである。例えば、Ｒ_２及びＲ_３の各々は、独立して、Ｃ_５－１４アルキル及びＣ_５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む：

いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。

いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なアミノ脂質を含み、非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣであり、構造脂質が、コレステロールであり、ＰＥＧ脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）である。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５モルパーセント（ｍｏｌ％）のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、４５～４７、４５～４８、４５～４９、４５～５０、４５～５２、４６～４８、４６～４９、４６～５０、４６～５２、４６～５５、４７～４８、４７～４９、４７～５０、４７～５２、４７～５５、４８～５０、４８～５２、４８～５５、４９～５０、４９～５２、４９～５５、または５０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１１、５～１２、５～１３、５～１４、５～１５、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１１、６～１２、６～１３、６～１４、６～１５、７～８、７～９、７～１０、７～１１、７～１２、７～１３、７～１４、７～１５、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、８～１３、８～１４、８～１５、９～１０、９～１１、９～１２、９～１３、９～１４、９～１５、１０～１１、１０～１２、１０～１３、１０～１４、１０～１５、１１～１２、１１～１３、１１～１４、１１～１５、１２～１３、１２～１４、１３～１４、１３～１５、または１４～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３５～４０ｍｏｌ％のステロール（例えば、コレステロール）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、３５～３６、３５～３７、３５～３８、３５～３９、３５～４０、３６～３７、３６～３８、３６～３９、３６～４０、３７～３８、３７～３９、３７～４０、３８～３９、３８～４０、または３９～４０ｍｏｌ％のコレステロールを含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５または４０ｍｏｌ％のコレステロールを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３．ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、１、１．５、２、２．５、または３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含み得る。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、３８．５ｍｏｌ％のコレステロール、及び１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、３８．５ｍｏｌ％のコレステロール、及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡの重量／重量比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２０：１のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡの重量／重量比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡの重量／重量比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約５０ｎｍ～約１５０ｎｍである。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約７０ｎｍ～約１２０ｎｍである。

多価ワクチン
本明細書で提供される組成物は、同じかまたは異なる種の２つ以上の抗原をコードする、ＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のコロナウイルス抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個、またはそれ以上のコロナウイルス抗原をコードし得る。

いくつかの実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるｍＲＮＡを、同じ脂質ナノ粒子内に製剤化してもよい。他の実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡが、別々の脂質ナノ粒子内に製剤化されてもよい（各ＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。次いで、脂質ナノ粒子を組み合わせ、（例えば、複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含む）単一のワクチン組成物として投与され得るか、または別々に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物が抗原をコードする２つの異なるＲＮＡを含む場合、抗原をコードするＲＮＡの比は、１：１、１：２、１：４、４：１、または２：１である。

初回または第１のワクチン接種
いくつかの実施形態では、第１または初回ワクチンは、２Ｐ安定化スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡワクチンである。例えば、初回または第１のワクチンは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するスパイク抗原をコードするｍＲＮＡであり得る。他の実施形態では、第１のワクチンは、２Ｐ安定化スパイクタンパク質を含む任意のワクチンモダリティであり得る。非限定的な例として、第１のワクチン組成物は、組換えワクチンであり得る。本明細書で使用される場合、「組換えワクチン」は、遺伝子工学、生物の遺伝物質を操作するプロセス及び方法によって作製されるワクチンを指す。ほとんどの場合、組換えワクチンは、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生及び精製されたか、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原をコードする１つ以上の核酸を包含する。投与後、ワクチン接種された人は、１つ以上のタンパク質抗原に対する抗体を産生し、したがって、疾患から彼／彼女を保護する。いくつかの実施形態では、組換えワクチンは、ベクターワクチンである。ウイルスベクターワクチンは、ウイルス由来ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ウイルスに異種のポリヌクレオチド）を含み、ベクターと接触した宿主において免疫応答を誘発することが可能なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。ポリヌクレオチドの発現は、中和抗体応答及び／または細胞媒介性応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成をもたらす。ウイルスベクターワクチンの例としては、限定されないが、Ｏｘｆｏｒｄ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＣａｎＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．／ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＧａｍａｌｅｙａＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＺｙｄｕｓＣａｄｉｌａ、ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ／Ｔｈｅｍｉｓ／ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＶａｃｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｏｎｇＫｏｎｇ、及びＡｌｔｉｍｍｕｎｅ（ＮａｓｏＶＡＸ）によって開発されたものが挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えワクチンは、核酸ベースの（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）コロナウイルスワクチンである。例示的なＤＮＡワクチンとしては、ＩｎｏｖｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＩＮＯ－４８００）、ＧｅｎｅｘｉｎｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＧＸ－１９）、ＯｎｃｏＳｅｃａｎｄｔｈｅＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＯＲＶａｘ１２及びＴＡＶＯ（商標））、ＫａｒｏｌｉｎｓｋａＩｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＣｏｂｒａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＯｓａｋａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ａｎｇｅｓ／ＴａｋａｒａＢｉｏ、及びＴａｋｉｓ／ＡｐｐｌｉｅｄＤＮＡＳｃｉｅｎｃｅｓ／Ｅｖｖｉｖａｘによって開発されているものが挙げられる。例示的なｍＲＮＡワクチンとしては、ＢｉｏＮＴｅｃｈ／Ｐｆｉｚｅｒ、ＩｍｐｅｒｉａｌＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ、Ｃｕｒｅｖａｃ、及びＷａｌｖａｘＢｉｏｔｅｃｈ／Ｐｅｏｐｌｅ’ｓＬｉｂｅｒａｔｉｏｎＡｒｍｙ（ＰＬＡ）ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＳｃｉｅｎｃｅによって開発されているものが挙げられる。

医薬製剤
本明細書で提供されるのは、例えば、ヒト及び他の哺乳類におけるコロナウイルスの予防及び／または治療のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬である。本明細書で提供される組成物は、治療剤または予防剤として使用され得る。これらは、コロナウイルス感染を予防及び／または治療するための医薬で使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与され得、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて、抗原ポリペプチド（抗原）を産生する。

（例えば、ＲＮＡを含む）組成物の「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞の種類、投与手段、ＲＮＡの物理的特徴（例えば、長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾ヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、ならびに対象の年齢、体重、身長、性別、及び全体的な健康状態などの他の決定因子に基づく。典型的には、組成物の有効量は、対象の細胞内での抗原産生の関数として、誘導または追加免疫された免疫応答を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含有する組成物の有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的である。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクションの増大（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増大によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。

「医薬組成物」という用語は、活性薬剤と、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断的または療法的使用に特に好適なものにする不活性または活性の担体との組み合わせを指す。「医薬的に許容される担体」は、対象への投与後または投与時に、望ましくない生理学的作用を引き起こさないものである。医薬組成物中の担体は、有効成分に適合性であり、それを安定化させることが可能であるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を活性薬剤の送達のための医薬担体として利用してもよい。医薬的に許容される担体の例としては、限定されるものではないが、剤形として使用可能な組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤が挙げられる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の好適な医薬用担体及び希釈剤、ならびにそれらを使用するための医薬的必需品については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。

いくつかの実施形態では、本開示に従う組成物（ポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチドを含む）は、コロナウイルス感染症の治療または予防のために使用され得る。ある組成物は、健康な個体または潜伏期間中の感染初期または症状発現後の活動性感染中に、積極的な免疫化スキームの一環として予防的に投与されても、または治療的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。

組成物は、他の予防または治療化合物とともに投与され得てもよい。非限定的な例として、予防または治療化合物は、アジュバントまたはブースターであってもよい。本明細書で使用される場合、ワクチンなどの予防組成物を指す場合、「ブースター」という用語は、ワクチン組成物の追加投与を指し、従来の追加免疫、季節的追加免疫、またはパンデミックシフト追加免疫を含み得る。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物の先の投与後に投与することができる。予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、限定されないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、少なくとも６ヶ月である。例示的な実施形態では、予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、限定されないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月であり得る。本明細書に記載されるように、ブースターは、先の投与の予防組成物と比較して、同じかまたは異なるｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ブースターは、先の投与の予防組成物からの同じｍＲＮＡと、少なくとも１つの異なるｍＲＮＡとの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、先の投与の予防組成物からのｍＲＮＡと少なくとも１つの異なるｍＲＮＡとの比は、１：１、１：２、１：４、４：１、または２：１である。一実施形態では、比は、１：１である。いくつかの実施形態では、ブースターは、先の投与の予防組成物と比較して、異なるｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなブースターは、予防組成物に存在しなかった１、２、３、４つ、またはそれ以上のｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ブースター中の２つのｍＲＮＡポリヌクレオチド（いずれも予防組成物中にはなかった）の比は、１：１、１：２、１：４、４：１、または２：１である。一実施形態では、比は、１：１である。追加免疫用量またはブースター用量は、初回予防（初回免疫）用量後に２回以上、例えば、２、３、４、５、６回、またはそれ以上投与され得る。いくつかの実施形態では、その後の追加免疫は、第１の（または以前の）追加免疫の数週間以内、例えば、３～４週間以内に投与される。いくつかの実施形態では、第２の追加免疫は、第１の（または以前の）追加免疫の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間、またはそれ以上後に投与される。ブースターは、いくつかの実施形態では、一価である（例えば、ｍＲＮＡは、単一の抗原をコードする）。いくつかの実施形態では、ブースターは、多価である（例えば、ｍＲＮＡは、２つ以上の抗原をコードする）。

いくつかの実施形態では、ブースター用量は、５μｇ－３０μｇ、５μｇ～２５μｇ、５μｇ～２０μｇ、５μｇ～１５μｇ、５μｇ～１０μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１０μｇ～１５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２５μｇ～３０μｇ、または２５μｇ～３００μｇである。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、１０μｇ～６０μｇ、１０μｇ～５５μｇ、１０μｇ～５０μｇ、１０μｇ～４５μｇ、１０μｇ～４０μｇ、１０μｇ～３５μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１５μｇ～６０μｇ、１５μｇ～５５μｇ、１５μｇ～５０μｇ、１５μｇ～４５μｇ、１５μｇ～４０μｇ、１５μｇ～３５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～６０μｇ、２０μｇ～５５μｇ、２０μｇ～５０μｇ、２０μｇ～４５μｇ、２０μｇ～４０μｇ、２０μｇ～３５μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２０μｇ～２５μｇ、２５μｇ～６０μｇ、２５μｇ～５５μｇ、２５μｇ～５０μｇ、２５μｇ～４５μｇ、２５μｇ～４０μｇ、２５μｇ～３５μｇ、２５μｇ～３０μｇ、３０μｇ～６０μｇ、３０μｇ～５５μｇ、３０μｇ～５０μｇ、３０μｇ～４５μｇ、３０μｇ～４０μｇ、３０μｇ～３５μｇ、３５μｇ～６０μｇ、３５μｇ～５５μｇ、３５μｇ～５０μｇ、３５μｇ～４５μｇ、３５μｇ～４０μｇ、４０μｇ～６０μｇ、４０μｇ～５５μｇ、４０μｇ～５０μｇ、４０μｇ～４５μｇ、４５μｇ～６０μｇ、４５μｇ～５５μｇ、４５μｇ～５０μｇ、５０μｇ～６０μｇ、５０μｇ～５５μｇ、または５５μｇ～６０μｇである。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、少なくとも１０μｇかつ２５μｇ未満の組成物である。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、少なくとも５μｇかつ２５μｇ未満の組成物である。例えば、ブースター用量は、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、または３００μｇである。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、５０μｇである。

いくつかの実施形態では、組成物は、当該技術分野で既知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、経鼻、または皮内に投与され得る。

組成物は、感染の有病率または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、さまざまな設定で利用され得る。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、さまざまな感染性疾患を治療及び／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、市販のワクチンよりもはるかに大きな抗体力価、より良好な中和免疫をもたらし、より持続性のある免疫応答を生じるか、及び／またはより早期の応答をもたらすという点において優れた特性を有する。

本明細書で提供されるのは、ＲＮＡ及び／または任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む医薬組成物である。

ＲＮＡは、単独で、または１つ以上の他の構成要素と組み合わせて、製剤化されても、または投与されてもよい。例えば、免疫化組成物は、限定されないが、アジュバントを含む、他の構成要素を含み得る。

いくつかの実施形態では、免疫化組成物はアジュバントを含まない（それはアジュバントフリーである）。

ＲＮＡは、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化されてもまたは投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の活性物質（例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組み合わせ）を含む。ワクチン組成物は、無菌、パイロジェンフリー、または無菌及びパイロジェンフリーの両方であり得る。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ２１ｓｔｅｄ．，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は、概して、ＲＮＡワクチンまたはその中に含有されるポリヌクレオチド、例えば抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。

本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって、調製することができる。概して、そのような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と会合させること、次いで、必要であれば及び／または望ましい場合には、所望の単回投与単位または複数回投与単位に製品を分割、形成及び／または包装することを含む。

本開示に従う医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療する対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、また当該組成物の投与に用いる経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでよい。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化されて、（１）安定性を増加する、（２）細胞トランスフェクションを増加する、（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポー製剤から）を可能にする、（４）生体内分布を改変する（例えば、特定の組織または細胞型を標的とする）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加する、及び／または（６）コードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルをインビボで改変することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

投与量／投与
本明細書で提供されるのは、ヒト及び他の哺乳類におけるコロナウイルス感染の予防及び／または治療のための免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）、方法、キット、及び試薬である。免疫化組成物は、治療剤または予防薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、コロナウイルス感染症からの予防的保護を提供するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、コロナウイルス感染症を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、実施形態、免疫化組成物は、例えばエクスビボで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性化する、免疫エフェクター細胞の初回刺激に使用され、次いで対象に注入（再注入）される。

対象は、任意の哺乳類（非ヒト霊長類及びヒトを含む）であってもよい。典型的には、対象とはヒト対象である。

いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、抗原特異的免疫応答を誘導するために有効量で対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与される。コロナウイルススパイクタンパク質抗原をコードするＲＮＡは、発現され、インビボで翻訳されて、抗原が産生され、次いで、対象における免疫応答が刺激される。

コロナウイルスからの予防的保護は、本開示の免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の投与後に達成され得る。免疫化組成物は１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与されてもよいが、ワクチンを１回投与するだけで十分な場合がある（任意選択で１回の追加免疫が続く）。それほど望ましくはないが、感染した個体に免疫化組成物を投与して治療応答を達成することは、可能である。用量設定を適宜調整する必要がある場合がある。

コロナウイルス抗原（または多重抗原）に対する対象における免疫応答を誘発する方法を、本開示の態様で提供する。いくつかの実施形態では、方法は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む免疫化組成物を対象に投与し、それによって対象においてコロナウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導することを伴い、対象における抗抗原抗体力価が、抗原に対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象における抗抗原抗体力価と比較して、ワクチン接種後に増加する。「抗抗原抗体」とは、抗原に特異的に結合する血清抗体である。

予防有効用量は、臨床的に許容可能なレベルでウイルスによる感染症を予防する有効用量である。いくつかの実施形態では、有効用量とは、ワクチンの添付文書に列記されている用量である。本明細書で使用される場合、従来のワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、限定されるものではないが、微生物生ワクチン、微生物不活化ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどが挙げられる。例示的な実施形態では、従来のワクチンは、国の薬物規制機関（例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ））によって規制上の承認を達成し、及び／または登録されているワクチンである。

いくつかの実施形態では、対象における抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、コロナウイルスに対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗抗原抗体力価よりも、１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態では、対象における抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価と比較して１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増大している。

対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘発する方法は、本開示の他の態様で提供される。本方法は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含み、それによって、対象においてコロナウイルスに特異的な免疫応答を誘導し、この対象での免疫応答は、この組成物に対し２倍～１００倍の投薬量レベルで、コロナウイルスに対する従来のワクチンを接種した対象での免疫応答と同等である。

いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物と比較して、２倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し３倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１０倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１００倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。

他の実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。他の実施形態では、免疫化された対象由来の血清または抗体の能力を、ウイルス取込みを中和する能力またはヒトＢリンパ球のコロナウイルス形質転換を低減する能力に対して試験する。他の実施形態では、強力なＴ細胞応答（複数可）を促進する能力は、当該技術分野で認識されている技法を使用して測定される。

本開示の他の態様は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与して、対象においてコロナウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導することによって、対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この対象における免疫応答は、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効量を接種した対象において誘導される免疫応答と比較して２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し２倍～１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンの予防有効用量を接種した対象において誘導される。

いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来のワクチンを予防有効用量でワクチン接種した対象において誘導される免疫応答と比較して、２日、３日、１週間、２週間、３週間、５週間、または１０週間早く誘導される。

また、本明細書では、第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを対象に投与することにより、コロナウイルスに対する対象における免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡが安定化エレメントを含まず、アジュバントがワクチンと同時製剤化または同時投与されない、方法を提供する。

組成物は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路で投与され得る。このような経路としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／または皮下の投与が挙げられる。本開示は、ＲＮＡワクチンを投与することをそれを必要とする対象に行うことを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び概況、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なる。ＲＮＡは、典型的には、投与しやすさ及び投薬量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。しかしながら、ＲＮＡの１日合計使用量は妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されよう。いかなる特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切なイメージング用量レベルも、治療する障害及び障害の重症度、用いる具体的化合物の活性、用いる具体的組成物、患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別、及び食事、用いる具体的化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率、治療の期間、用いる具体的化合物と組み合わせでまたは同時に使用する薬物、ならびに医学分野で周知されている類似の因子を含めたさまざまな因子に依存する。

本明細書で提供されるＲＮＡの有効量（例えば、有効用量）は、２０μｇ程度に低い場合がり、例えば、単回用量または２回の１０μｇ用量として投与される。いくつかの実施形態では、有効量（例えば、有効用量）は、２０μｇ～３００μｇ５μｇ～３０μｇ、５μｇ～２５μｇ、５μｇ～２０μｇ、５μｇ～１５μｇ、５μｇ～１０μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１０μｇ～１５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２５μｇ～３０μｇ、または２５μｇ～３００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効用量（例えば、有効量）は、少なくとも１０μｇかつ２５μｇ未満の組成物である。いくつかの実施形態では、有効用量（例えば、有効量）は、少なくとも５μｇかつ２５μｇ未満の組成物である。例えば、有効量は、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、または３００μｇの総用量であり得る。いくつかの実施形態では、有効量（例えば、有効用量）は、１０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２０μｇの総用量（例えば、２回の１０μｇ用量）である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、６０μｇの総用量（例えば、２回の３０μｇ用量）である。いくつかの実施形態では、有効量は、７５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３００μｇの総用量である。上に提供される用量のうちのいずれかは、ブースター用量の有効量であり得、例えば、いくつかの実施形態では、ブースター用量は、５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み、有効量は、２０μｇ（例えば、１０μｇの第１のｍＲＮＡ及び１０μｇの第２のｍＲＮＡ）の総用量である。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み、有効量は、５０μｇ（例えば、２５μｇの第１のｍＲＮＡ及び２５μｇの第２のｍＲＮＡ）の総用量である。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み、有効量は、１００μｇ（例えば、５０μｇの第１のｍＲＮＡ及び５０μｇの第２のｍＲＮＡ）の総用量である。

本明細書に記載のＲＮＡは、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）などの、本明細書に記載の剤形で製剤化され得る。

ワクチン有効性
本開示のいくつかの態様は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の製剤であって、ＲＮＡが、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、コロナウイルス抗原に特異的な抗体の産生）をもたらすのに有効な量で製剤化される、製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なＲＮＡの用量である。また、本明細書では、対象内の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も提供する。

本明細書で使用される場合、本開示のワクチンまたはＬＮＰに対する免疫応答とは、ワクチン中に存在する（１つ以上の）コロナウイルスタンパク質（複数可）に対する対象における液性及び／または細胞性免疫応答の発生である。本開示の目的では、「液性」免疫応答は、例えば、分泌（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を含む抗体分子によって媒介される免疫応答を指す一方で、「細胞性」免疫応答は、Ｔ－リンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパー及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）及び／または他の白血球）によって媒介されるものを指す。細胞性免疫における１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたタンパク質とともに提示され細胞表面に発現するペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子とともにその表面に提示した細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせる一助となるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化Ｔ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞由来のものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のそのような分子の産生も引き起こす。

いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供される組成物を投与された対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価を測定することにより、特徴評価される。抗体力価とは、対象内にある抗体、例えば、特定の抗原または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、例えば、抗体力価を定量化するための一般的なアッセイである。

コードされる目的の抗原、例えば、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲ－ＣｏＶ－２ウイルス抗原、例えば、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクまたはＳタンパク質のそのドメインに対する抗体を測定するために、さまざまな血清学的検査が使用され得る。これらの試験には、赤血球凝集阻害試験、補体結合試験、蛍光抗体試験、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、及びプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）が含まれる。これらの各試験は、さまざまな抗体活性を測定する。例示的な実施形態では、プラーク減少中和試験、またはＰＲＮＴ（例えば、ＰＲＮＴ５０またはＰＲＮＴ９０）は、保護の血清学的相関物として使用される。ＰＲＮＴは、インビトロウイルス中和の生物学的パラメータを測定し、特定のクラスのウイルスの中で最も血清学的にウイルス特異的な試験であり、ウイルス感染からの保護の血清レベルとよく相関する。

ＰＲＮＴの基本設計では、試験管またはマイクロタイタープレートでウイルスと抗体の相互作用を行うことを可能にし、これによってウイルス感受性細胞、好ましくは哺乳類由来の細胞に混合物をプレーティングすることで、ウイルス感染性に対する抗体の影響を測定する。細胞は、子孫ウイルスの伝播を制限する半固体培地で覆われている。生産的な感染を開始する各ウイルスは、さまざまな方式で検出され得る局所的な感染領域（プラーク）を生成する。プラークを数え、ウイルスの開始濃度に戻って比較して、ウイルスの総感染力の低下率を決定する。ＰＲＮＴでは、通常、試験される血清試料は、標準化された量のウイルスと混合する前に段階希釈される。ウイルスの濃度は一定に保たれているため、感受性の高い細胞に添加して半固形培地をかぶせると、個々のプラークを識別して数えることができる。このようにして、ＰＲＮＴエンドポイント力価は、ウイルス活性の任意の選択されたパーセント減少で各血清試料に対して計算され得る。

ワクチンの免疫原性を評価することを目的とした機能アッセイでは、抗体滴定の血清試料希釈系列は、理想的には「血清防御」閾値力価未満で開始する必要がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に関しては、「血清防御」閾値力価は不明のままであるが、１：１０という血清陽性の閾値は、特定の実施形態では、血清保護閾値とみなすことができる。

いくつかの実施形態では、中和免疫応答は、血清保護閾値を満たすかまたは超えるレベルの抗体を産生する、免疫応答である。

ＰＲＮＴエンドポイント力価は、プラーク数の望ましい減少率を示す最後の血清希釈の逆数として表される。ＰＲＮＴ力価は、プラーク数の５０％以上の減少（ＰＲＮＴ５０）に基づいて計算できる。ＰＲＮＴ５０力価は、ワクチン血清に対してより高いカットオフを使用する力価（例えば、ＰＲＮＴ９０）よりも優先され、滴定曲線の線形部分からより正確な結果を提供する。

ＰＲＮＴ力価を計算する方式にはいくつかある。力価を計算するための最も簡単で最も広く使用されている方式は、プラークを数え、最後の血清希釈の逆数として力価を報告して、入力プラークの逆滴定に基づく入力プラーク数の５０％超の減少を示すことである。いくつかの血清希釈からのカーブフィッティング法を使用すると、より正確な結果を計算できる場合がある。これに利用可能なさまざまなコンピューター分析プログラムがある（例えば、ＳＰＳＳまたはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ）。

いくつかの実施形態では、抗体力価は、対象が感染症に罹ったか否かを評価するため、または免疫化が必要か否かを判断するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体力価は、自己免疫応答の強さを定量するため、ブースター免疫化が必要か否かを判断するため、以前のワクチンが有効だった否かを判断するため、及び最近または過去の感染を確認するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）によって対象において誘導された免疫応答の強さを定量するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、または少なくとも３ｌｏｇ増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して１、１．５、２、２．５、または３ｌｏｇ増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して１～３ｌｏｇ増大される。例えば、対象に産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３ｌｏｇ増大され得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生された抗コロナウイルス抗原ｎ抗体力価は、対照と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増加され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して２～１０倍増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０倍増大され得る。

いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、コロナウイルスに対する血清中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）の比（幾何平均比（ＧＭＲ）と称される）として測定される。幾何平均力価（ＧＭＴ）は、全ての値を掛け合わせ、その数値のｎ乗根（ｎは利用可能なデータを有する対象数である）をとることによって算出される、対象の群における平均抗体力価である。

いくつかの実施形態では対照は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を投与されていない対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗コロナウイルス抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、典型的には、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたタンパク質抗原、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。

いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）が有効となる能力は、マウスモデルで測定される。例えば、組成物を、マウスモデルに投与してもよく、マウスモデルを中和抗体力価の誘導について評価してもよい。また、ウイルスチャレンジ研究も、本開示のワクチンの有効性を評価するために使用してもよい。例えば、組成物をマウスモデルに投与し、そのマウスモデルをウイルスでチャレンジし、そのマウスモデルを生存及び／または免疫応答（例えば、中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン応答））について評価してもよい。

いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効量は、組換えタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して、低減された用量である。本明細書で使用する「標準治療」とは、医学的または心理学的な治療ガイドラインを指し、一般的であっても、特定的であってもよい。「標準治療」は、科学的根拠及び所与の状態の治療に携わる医療従事者間の協力に基づいた適切な治療を指す。これは、特定の種類の患者、病気または臨床環境について医師／臨床医が従うべき診断及び治療プロセスである。本明細書で使用する「標準治療用量」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、コロナウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するための標準治療ガイドラインに従いながら、コロナウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するために対象に投与する、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの用量を指す。

いくつかの実施形態では、有効量の組成物を投与された対象において産生された抗コロナウイルス抗原抗体力価は、組換えもしくは精製されたタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活性化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの標準的なケア用量を投与された対照対象において産生された抗コロナウイルス抗原抗体力価と同等である。

ワクチン有効性は、標準的な分析を使用して評価することができる（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２０１０Ｊｕｎ１；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。例えば、ワクチン有効性は、二重盲検ランダム化対照臨床試験で測定することができる。ワクチン有効性は、ワクチン非接種研究コホートの罹患率（ＡＲＵ）とワクチン接種研究コホートの罹患率（ＡＲＶ）との間の疾患罹患率（ＡＲ）の比例的減少として表すことができ、以下の式を使用してワクチン接種群の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出することができる。
有効性＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００、及び
有効性＝（１－ＲＲ）×１００

同様に、ワクチン有効性は、標準的な分析を使用して評価することができる（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２０１０Ｊｕｎ１；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。ワクチン有効性とは、ワクチン（高いワクチン有効性を有することが既に判明している場合もある）が集団の中でどのように疾患を低減するかを評価するものである。この尺度は、対照臨床試験ではなく、自然現場条件下で、ワクチン自体だけでなく、ワクチン接種プログラムの利益と副作用との正味のバランスを評価することができる。ワクチン有効性は、ワクチン有効性（効力）に比例するがまた、集団内の標的群の免疫化の程度、ならびに入院、外来訪問、または費用の「現実世界」の結果に影響を与える他の非ワクチン関連因子によって影響を受ける。例えば、後ろ向きケースコントロール分析を使用して、感染症例のセット及び適切な対照におけるワクチン接種率を比較することができる。ワクチン有効性は、ワクチン接種したにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）の使用により、割合の差として表すことができる。
有効性＝（１－ＯＲ）×１００

いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効性は、ワクチン未接種の対照対象と比較して、少なくとも６０％である。例えば、組成物の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であり得る。

殺菌免疫。殺菌免疫とは、宿主への有効な病原体感染を防止する独自の免疫状態を指す。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、少なくとも１年間、対象における殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、本開示の組成物の有効量は、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間、対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、対照と比較して少なくとも５倍低い用量で対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、有効量は、対照と比較して、少なくとも１０倍、１５倍、または２０倍低い用量で、対象における殺菌免疫を提供するのに十分であり得る。

検出可能な抗原。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与の１～７２時間後の対象の血清において測定して、検出可能なレベルのコロナウイルス抗原を産生するのに十分である。

力価。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗コロナウイルス抗原）に特異的である抗体の数の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、例えば、抗体力価を定量化するための一般的なアッセイである。

中和免疫応答は、免疫応答であり、中和抗体応答及び／または有効な中和Ｔ細胞応答である。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、血清保護閾値を満たすかまたは超えるレベルの抗体を産生する。

有効なＴ細胞応答は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔヘルパー１型細胞を含む、ベースラインレベルのウイルス活性化またはウイルス特異的Ｔ細胞を産生する応答である。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、典型的には、細胞内ウイルスコンパートメントをクリアにし、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ及び他のＴ細胞を助け、記憶生成及び間接的または直接的な細胞傷害活性を促進するなど、体内でさまざまな機能を発揮する。いくつかの実施形態では、有効Ｔ細胞は、ベースラインレベル（ナイーブ対象）と比較して、高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、これらのＴ細胞は、ＣＤ２７及びＣＤ２８の共発現を伴い、早期分化記憶表現型へと分化される。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。

いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００ＮＴ_５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＴ_５０であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＴ_５０である。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、ミリリットル当たり少なくとも１００中和単位（ＮＵ／ｍＬ）である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｌｏｇ増大され得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２倍増加される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。

いくつかの実施形態では、ｎ個の数の積のｎ乗根である幾何平均を、比例増殖を説明するために一般的に使用する。幾何平均は、いくつかの実施形態では、対象において産生される抗体力価を特徴評価するために使用される。

対照は、例えば、ワクチン未接種の対象、または生弱毒化ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、またはタンパク質サブユニットワクチンを投与された対象であり得る。

さらなる実施形態
１．方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、前記対象が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを以前に投与されたことがあり、前記第１及び前記第２の２Ｐ安定化スパイク抗原の各々が、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、前記第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、前記方法。

２．方法であって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを前記対象に投与することと、を含み、前記第１及び前記第２の安定化スパイク抗原をコードする前記核酸の各々が、前記それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、前記方法。

３．方法であって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを前記対象に投与することと、を含み、前記第１及び前記第２の安定化スパイク抗原をコードする前記核酸の各々が、前記それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、前記第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのものであり、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのものである、前記方法。

４．方法であって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを前記対象に投与することと、を含み、前記第１及び前記第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸の各々が、前記それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、前記第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表し、第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表す、前記方法。

５．方法であって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを前記対象に投与することと、を含み、前記第１及び前記第２の安定化スパイク抗原をコードする核酸の各々が、前記それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、前記第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、複数の第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表し、及び／または前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第２の複数の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表す、前記方法。

６．前記第１の抗原が、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードするｍＲＮＡであり、前記スパイク抗原が、配列番号２０のアミノ酸配列を有する、段落１～５のいずれか１項に記載の方法。

７．前記第２の抗原が、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードするｍＲＮＡであり、前記スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、段落１～６のいずれか１項に記載の方法。

８．組成物であって、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第２のｍＲＮＡであって、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する、前記第２のｍＲＮＡと、を含み、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原及び前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、互いに異なる、前記組成物。

９．前記組成物が、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第３のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、前記第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、段落８に記載の組成物。

１０．前記組成物が、第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第４のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、前記第４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、段落９に記載の組成物。

１１．前記組成物が、第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第５のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、前記第５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、段落１０に記載の組成物。

１２．前記組成物が、第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第６のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をさらに含み、前記第６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、段落１１に記載の組成物。

１３．前記第１及び前記第２のウイルス株、ならびに任意選択で、前記第３、前記第４、前記第５、及び前記第６のウイルス株が、１年間の少なくとも一部分の間、集団内で拡散している、段落８～１２のいずれか１項に記載の組成物。

１４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイクタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、前記２Ｐ安定化スパイクタンパク質が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記２Ｐ安定化スパイクタンパク質が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株からのスパイクタンパク質の２Ｐ安定化バージョンであり、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株が、配列番号１１のスパイクタンパク質を含む、前記メッセンジャーリボ核酸。

１５．ｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡが、配列番号５、８、１１、１４、１７、２３、３６、３０、３３、３６、３９、及び４２のうちのいずれか１つのタンパク質に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、前記ｍＲＮＡ。

１６．ｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡが、配列番号１、６、９、１２、１５、２１、２４、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４５のうちのいずれか１つのＲＮＡに対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記ｍＲＮＡ。

１７．ｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡが、配列番号１、６、９、１２、１５、２１、２４、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４５のうちのいずれか１つのＲＮＡに対し少なくとも９８％の配列同一性を有する、前記ｍＲＮＡ。

１８．ｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡが、配列番号１、６、９、１２、１５、２１、２４、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４５のうちのいずれか１つのＲＮＡを含む、前記ｍＲＮＡ。

１９．前記ｍＲＮＡが、化学修飾を含む、段落１４～１８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

２０．前記ｍＲＮＡが、完全に修飾されている、段落１９に記載のｍＲＮＡ。

２１．前記化学修飾が、１－メチルシュードウリジンである、段落１９または２０に記載のｍＲＮＡ。

２２．前記ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子内にあり、前記脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む、段落１４～２１のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

２３．前記脂質ナノ粒子が、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、段落２２に記載のｍＲＮＡ。

２４．前記脂質ナノ粒子が、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、段落２２または２３に記載のｍＲＮＡ。

２５．前記脂質ナノ粒子が、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む、段落２２～２４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

２６．前記イオン化可能なアミノ脂質が、化合物１の構造を有する、段落２２～２５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ：

２７．前記ステロールが、コレステロールまたはその誘導体である、段落２２～２６のいずれか１項のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

２８．前記中性脂質が、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、段落２２～２７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

２９．前記ＰＥＧ修飾脂質が、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）である、段落２２～２８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

３０．方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、前記スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記対象が、配列番号２１または２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陽性である、前記方法。

３１．方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、前記スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記対象が、配列番号２１または２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陰性である、前記方法。

３２．前記対象が、前記第１の用量のワクチンが投与された後、２週間～１年の間に第２の用量の前記ワクチンを投与される、段落３０または３１に記載の方法。

３３．前記対象が、前記ワクチンが投与された後、２週間～１年の間に第２のワクチンを投与され、前記第２のワクチンが、配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第２の核酸を含む、段落３１または３２に記載の方法。

３４．前記第２のワクチンが、前記第１及び前記第２の核酸の混合物を含み、前記第１の核酸及び前記第２の核酸が、前記第２のワクチン中に１：１の比で存在する、段落３３に記載の方法。

３５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、第３の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む、５０μｇの前記ワクチンが、前記対象に投与される、段落３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

３６．前記ワクチンが、配列番号１１に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸を含む、段落３０～３５のいずれか１項に記載の方法。

３７．前記ワクチンが、配列番号９に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む、段落３０～３６のいずれか１項に記載の方法。

３８．前記ワクチンが、配列番号９を含む核酸を含む、段落３７に記載の方法。

３９．前記第１のワクチンまたは前記第２のワクチンが、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号１１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

４０．前記第１のワクチンまたは前記第２のワクチンが、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号２６を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

４１．前記第１のワクチンまたは前記第２のワクチンが、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号３０を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

４２．前記（ａ）対前記（ｂ）の比が、１：１、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、または４：１である、段落３９～４１のいずれか１項に記載の方法。

４３．前記第２のワクチンが、（ａ）第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原をコードする前記核酸と、（ｂ）第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐスパイク抗原をコードする前記核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

４４．（ａ）対（ｂ）の前記比が、１：１、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、または４：１である、段落４３に記載の方法。

４５．方法であって、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むブースターワクチンを対象に投与することを含み、前記対象が、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む第１のワクチンの少なくとも１つの初回免疫用量を以前に投与されたことがあり、前記ブースターワクチンが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含み、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記ブースターワクチンが、前記第１のワクチンの第１の用量の少なくとも６ヶ月後に２５～１００μｇの投薬量で投与され、前記第１の抗原が、２Ｐ変異を有する完全長安定化スパイクタンパク質である、前記方法。

４６．前記ブースターワクチンが、５０μｇの投薬量で投与される、段落４５に記載の方法。

４７．前記ブースターワクチンが、前記第１のワクチンの第２の用量の少なくとも約６ヶ月後に投与される、段落４５または４６に記載の方法。

４８．前記ブースターワクチンが、前記第１のワクチンの第２の用量の６～１２ヶ月後に投与される、段落４５または４６に記載の方法。

４９．前記ブースターワクチンが、前記第１のワクチンの第２の用量の少なくとも約８ヶ月後に投与される、段落４５または４６に記載の方法。

５０．前記追加免疫用量が、複数の懸念されるバリアントに対する中和免疫応答を提供するための季節的追加免疫またはパンデミックシフト追加免疫である、段落４５～４９のいずれか１項に記載の方法。

５１．前記第１のワクチンまたは前記第２のワクチンが、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号３３を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

５２．前記第１のワクチンまたは前記第２のワクチンが、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号３６を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

５３．前記第１のワクチンまたは前記第２のワクチンが、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号３９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

５４．前記第１のワクチンまたは前記第２のワクチンが、（ａ）２つのプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、（ｂ）配列番号４２を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする核酸と、を含む、段落１～７及び３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

５５．少なくとも１つのｍＲＮＡが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、任意選択で、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに１つ以上の非コード配列をさらに含む、段落１～７及び３０～５４のいずれか１項に記載の方法、ならびに段落８～２９のいずれか１項に記載の組成物。

５６．前記ｍＲＮＡの全てが、ＵＴＲ、任意選択で、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに１つ以上の非コード配列をさらに含む、段落５５に記載の方法または組成物。

５７．前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する、段落５６に記載の方法または組成物。

５８．前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡの前記ポリＡテールの下流に位置する、段落５６に記載の方法または組成物。

５９．前記非コード配列が、前記ｍＲＮＡのＯＲＦの最後のコドンと、前記ｍＲＮＡの前記ポリＡテールの第１の「Ａ」との間の前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、段落５６に記載の方法または組成物。

６０．前記非コード配列が、１～１０個のヌクレオチドを含む、段落５６に記載の方法または組成物。

６１．前記非コード配列が、１つ以上のＲＮＡｓｅ切断部位を含む、段落５５～６０のいずれか１項に記載の方法または組成物。

６２．前記ＲＮＡｓｅ切断部位が、ＲＮａｓｅＨ切断部位を含む、請求項６１に記載の方法または組成物。

実施例１．ｍＲＮＡワクチンは、全体的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントからのスパイク変異体に対するヒト中和抗体を誘導する。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、世界中で２００万人超の死者をもたらした世界的なパンデミックの原因となる感染症である。ＭｏｄｅｒｎａｍＲＮＡ－１２７３ワクチンは、第３相研究で約９４％の有効性を実証し、緊急使用許可の下で承認されている。英国（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ共和国（Ｂ．１．３５１）、ブラジル（Ｐ．１系譜）、ニューヨーク（Ｂ．１．５２６）、及びカリフォルニア（Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９またはＣＡＬ．２０Ｃ系譜）からのこれらの置換を含有する最も最近の循環単離物である、スパイクタンパク質に変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの出現は、擬似ウイルス中和（ＰｓＶＮ）アッセイによって、回復期血清からの中和及びある特定のモノクローナル抗体に対する耐性の低下をもたらしている。ここで、２０Ｅ．（ＥＵ１）、２０Ａ．ＥＵ２、Ｄ６１４Ｇ－Ｎ４３９、ミンククラスター５、Ｂ．１．１．７（ＵＫ）、及びＢ．１．３５１（ＲＳＡ）バリアントのスパイクバリアントを発現する２つの直交型ＶＳＶ及びレンチウイルスＰｓＶＮアッセイを使用して、ｍＲＮＡ－１２７３を受けたヒト対象または非ヒト霊長類からの血清の中和能力を評価した。いずれの場合も、Ｂ．１．１．７バリアントに対する中和に対して有意な影響は検出されなかったが、しかしながら、Ｂ．１．３５１に存在する変異に対して低減された中和を測定した。Ｄ６１４Ｇスパイクを使用するＶＳＶＰｓＶＮアッセイにおける、臨床試験参加者からのヒト血清の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、１／１８５２であった。Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ及び完全なＢ．１．３５１変異を含有するスパイクを有するＶＳＶ擬似ウイルスは、Ｄ６１４ＧＶＳＶ擬似ウイルスと比較すると、それぞれ、２．７倍及び６．４倍の低減をもたらした。重要なことに、完全なＢ．１．３５１スパイクバリアントに対するこれらのヒト血清のＶＳＶＰｓＶＮＧＭＴは、依然として１／２９０であり、評価された全ての血清が、完全に中和することが可能であった。同様に、３０または１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３で免疫化したＮＨＰからの血清は、完全なＢ．１．３５１スパイクバリアントに対して、それぞれ約１／３２３または１／４０４のＶＳＶＰｓＶＮＧＭＴを有し、Ｄ６１４Ｇと比較して、約５～１０倍低減した。さまざまな擬似ウイルスに対するワクチン免疫血清を試験すると、Ｂ．１．３５１バリアントは、Ｄ６１４Ｇ擬似ウイルスに対する中和活性と比較すると、ＰｓＶＮ活性に最大の減少を示した。それにもかかわらず、Ｂ．１．３５１バリアントに対するヒトワクチン血清中のＶＳＶＰｓＶＮ力価のＧＭＴは、約１／３００に留まった。これらの研究は、より詳細に以下に説明する。

この研究では、擬似ウイルス中和（ＰｓＶＮ）アッセイにおいて、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡワクチン」）でワクチン接種された第１相臨床試験参加者からの血清の中和を、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物、Ｄ６１４Ｇバリアント、Ｂ．１．１．７、及びＢ．１．１．３５１バリアントを含む後に生じたバリアント、ならびに以前出現したバリアント（２０Ｅ．ＥＵ１、２０Ａ．ＥＵ２、Ｄ６１４Ｇ－Ｎ４３９Ｋ、及びミンククラスター５バリアント）からのスパイクタンパク質で評価した。Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域内に存在する単一の変異及び変異の組み合わせの両方の効果を調べた。また、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡワクチンを２つの異なる用量で受けた非ヒト霊長類（ＮＨＰ）からの血清で、ＶＳＶ及び擬似型レンチウイルス中和アッセイにおける直交評価を実施した。

この広範なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する強力な中和抗体を誘発するｍＲＮＡワクチンの能力を評価するために、３０μｇを２回投与されたｍＲＮＡ免疫化ＮＨＰからの血清、及び１００μｇの承認された用量を２回受けたｍＲＮＡワクチンで免疫化された第１相臨床研究の参加者を分析した。ＰｓＶＮアッセイにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２完全長スパイク擬似型組換えＶＳＶ－ΔＧ－ホタルルシフェラーゼウイルスを用い、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物（Ｄ６１４）、Ｄ６１４Ｇバージョンのスパイクタンパク質、または２０Ａ．ＥＵ１、２０Ａ．ＥＵ２、及びミンククラスター５バリアントからのスパイクタンパク質を含有する、ホモタイプＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿Ｄ６１４に対する免疫血清の中和活性を測定した（表２）。

結果は、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンによって誘発された抗体応答が、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（Ｄ６１４）株に対するように、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１系譜より前に出現したこれらのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントに対して同様のレベルの中和を提供することを実証した。この観察は、レンチウイルス擬似ウイルス中和アッセイにおいてより高い中和力価を有することが示されているＧ６１４バリアントを含む（図１Ａ～１Ｂ）。これらのスパイクバリアントのうちの１つは、他の変異（Ｙ４５３Ｆ－Ｉ６９２Ｖ－Ｍ１２２９Ｉ）に加えて６９－７０ｄｅｌを含有するデンマークのミンククラスター５バリアントからのものである。

次に、３０または１００μｇのｍＲＮＡワクチンで１日目及び２９日目にワクチン接種したＮＨＰからの血清を分析した。レンチウイルス及びＶＳＶベースのＰｓＶＮアッセイの両方を用いた直交評価を使用して、中和抗体応答を測定した。両方のアッセイにおける擬似ウイルスは、完全長スパイクタンパク質を組み込み、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（Ｄ６１４）、Ｇ６１４、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１系譜に存在する変異の単離、部分的、または完全なセットを付与する（表３）。

Ｂ．１．１．７バリアントに存在する変異、スパイク変異または特異的変異の完全なセットのいずれか（表３）は、ＶＳＶ及びレンチウイルス中和アッセイの両方において、中和に対する最小限の効果を有した。ＶＳＶアッセイでは、Ｄ６１４ウイルスとＧ６１４ウイルスとの間に差は観察されず、両方に対して強力な中和が測定された（図２Ａ）。さらに、Ｂ．１．１．７変異から中和力価の減少は測定されなかった。

表３に列挙されているＢ．１．３５１バリアントにおけるスパイク変異の完全なパネル及び特異的変異の両方に対して、中和力価に有意な低下が測定された。ＶＳＶアッセイでは、それぞれ、部分的または完全な変異パネルに対して、３０μｇ投与した動物から回収した血清からの中和力価に４．３倍及び４．８倍の低下、ならびに１００μｇ投与した動物からの血清からの中和力価に９．６倍及び１０倍超の低下が測定された（図２Ｂ）。ＷＡ株による高用量ウイルスチャレンジから保護された中和力価は、１０μｇ用量のｍＲＮＡワクチンでのＮＨＰのワクチン接種によって誘発されるレベル以上で、高いままであった（Ｃｏｒｂｅｔｔｅｔａｌ，２０２０，ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍＲＮＡ－１２７３ＶａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｎＮｏｎｈｕｍａｎＰｒｉｍａｔｅｓ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３８３，１５４４－１５５５）。アッセイからの中和曲線によって示されるように、より低い希釈ではあるが、全ての試料は依然としてウイルスを完全に中和することが可能であった（図３Ａ～３Ｃ）。

次に、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１に対するｍＲＮＡ第１相ヒト血清の中和を調べた。Ｂ．１．１．７バリアントに存在する変異、スパイク変異の完全なパネルまたは特異的変異のいずれか（表３）は、ヒトｍＲＮＡワクチン第１相参加者血清の中和に対する最小限の効果を有した（図４Ａ）。ＶＳＶアッセイでは、Ｂ．１．１．７変異である、変異の部分的なセット（Ｄ６１４Ｇ＿Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ＿ΔＨ６９ΔＶ７０＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｐ６８１Ｈ）または完全なＢ．１．１．７バリアントのいずれからも、中和力価に有意な減少は測定されなかった（図４Ｃ）。

対照的に、表３に列挙されているＢ．１．３５１バリアントにおけるスパイク変異の完全なパネル及び特異的変異の両方に対して、中和力価に有意な低下が測定された。ＶＳＶアッセイでは、第１相追加免疫１週間後臨床試験試料を使用して、それぞれ、部分的または完全な変異のパネルに対する中和力価に２．７倍及び６．４倍の低減が検出された（図４Ｂ）。Ｂ．１．３５１バリアントに対する中和応答の減少にもかかわらず、中和力価は、依然として概して高く、全ての血清試料は、中和アッセイ曲線によって示されるように、より低い希釈ではあるが、ＶＳＶ擬似ウイルスを完全に中和した（図５Ａ～５Ｂ）。研究からの個々の動物番号を、各群の上に示す。

考察
本研究では、２回の１００μｇ用量のｍＲＮＡワクチンを受けた８人の第１相臨床試験参加者（１８～５５歳）、及び２回の３０μｇまたは１００μｇ用量のｍＲＮＡワクチンで免疫化されたＮＨＰからの血清の中和能力を評価した。元のＤ６１４スパイク、優勢なＤ６１４Ｇスパイクバリアント、２０Ａ．ＥＵ１、２０Ａ．ＥＵ２、ミンククラスター５バリアント、Ｎ４３９Ｋ－Ｄ６１４Ｇにおける変異、ならびにＢ．１．１．７及びＢ．１．３５１バリアント株に見出される完全なパネルまたは重要な変異のいずれかに対して、中和を測定した。２回の１００μｇ用量のｍＲＮＡワクチンを受けているヒトのものと同様のＤ６１４及びＤ６１４ＧＶＳＶ擬似ウイルスの両方に対する中和力価を誘発するので、ＮＨＰでは３０μｇ用量を選択した。ＮＨＰで３０μｇ用量を評価することは、新しいスパイクバリアントに対する中和応答についての用量依存的効果を解明する一助となり得る。

Ｂ．１．１．７またはＢ．１．３５１バリアントに見出される目的の単一及び組み合わせた変異の両方を、ＶＳＶ－擬似ウイルスレポーター系を利用して、インビトロで評価した。ヒト及びＮＨＰ血清の両方の分析では、元のＤ６１４及びＤ６１４Ｇスパイクバリアントに対する中和応答をまず決定して、より新しく、より捕捉しにくいバリアントとの比較のためのベースラインを提供した。以前の分析と一致して、第１相参加者からの８つの試料全てが、Ｄ６１４及びＤ６１４ＧＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの両方に対する強力な中和応答を実証した。加えて、ｍＲＮＡ免疫化ＮＨＰは、確立された有効性報告（Ｃｏｒｂｅｔｔｅｔａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｄｅｓｉｇｎｅｎａｂｌｅｄｂｙｐｒｏｔｏｔｙｐｅｐａｔｈｏｇｅｎｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２０２０），５８６，５６７－５７１）に沿った中和抗体力価を示した。

Ｂ．１．１．７バリアントまたはＮ５０１Ｙ及び６９－７０欠失に見出される変異の完全なセットのいずれからも、中和に対する有意な影響は観察されなかった。これらの変異は、回復期血清からの中和を低下させ、感染性を増加させることが報告されているが、ｍＲＮＡ－１２７３で免疫化された第１相参加者及びＮＨＰからの血清は、Ｂ．１．１．７バリアントをＤ６１４Ｇウイルスと同じレベルまで中和することが可能であった。

Ｂ．１．３５１に見出される変異のうちのいくつかの中和を評価している他の最近の報告（Ｗａｎｇｅｔａｌ．（２０２１）ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅ－ｅｌｉｃｉｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｖａｒｉａｎｔｓ．ＢｉｏＲｘｉｖ２０２１．０１．１５．４２６９１１）と一致して、ＲＢＤに見出される３つの変異（Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ）を組み込んだ後、中和が２．７倍低減し、変異の完全なパネルを含めると、中和が６．４倍低減した。変異の完全なパネルに対するＶＳＶベースの擬似ウイルス中和力価は、約１／３００に留まり、全ての試料は、変異体ウイルスを完全に中和することが可能であった。ＮＨＰのデータは、Ｄ６１４Ｇと比較して、１００及び３０μｇ用量群からそれぞれ１０超または４．８倍の低減を示したが、しかしながら、両方の用量での変異の完全なパネルに対するＶＳＶベースのＰｓＶＮ力価は、約１／３００であった。臨床試験対象及びＮＨＰからの全ての試料は、より低い希釈の血清でバリアントウイルスを完全に中和し、中和力価の低減にもかかわらず、ポリクローナル血清が、依然としてウイルスを完全に中和することが可能であったことを実証している。真のＩＤ_５０シフトが観察され、全ての血清が、ＩＤ５０力価に低減を示したが、中和の欠如を示したものはなかったことを意味する。

この試料セットからのデータは、ヒト及びＮＨＰにおいて、Ｂ．１．１．７バリアントに対するＰｓＶＮアッセイ擬似ウイルス中和力価に低減はなく、Ｂ．１．３５１バリアントに対して約５倍の低減があることを示している。それにもかかわらず、ヒト及びＮＨＰの両方におけるＢ．１．３５１に対する擬似ウイルス中和力価は、依然として約１／３００である。以前の研究は、Ｄ６１４Ｇに対する擬似ウイルス中和力価が、ウイルス中和力価と相関することを示している。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３後のヒトにおけるＶＳＶ擬似ウイルス中和力価は、ＶＳＶＰｓＶＮアッセイにおいて１／１８５２であり、保護は約９５％であった。

また、はるかに低い中和力価を有する単回免疫化後でさえも保護が観察され、現在のｍＲＮＡワクチンレジメンが、保護閾値をはるかに上回る可能性が高い免疫応答を誘導していることを示唆している。これはまた、１０μｇのｍＲＮＡのみを含むＮＨＰのワクチン接種が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから動物を保護することがＮＨＰデータ（Ｃｏｒｂｅｔｔ，ＮＥＪＭ２０２０ｂ）によって支持されているが、免疫応答及び中和力価は、本明細書に示される３０または１００ｕｇのｍＲＮＡ－１２７３の投与後に測定されるものよりもはるかに低い。

３０μｇのｍＲＮＡワクチンで２回ワクチン接種したＮＨＰからの、または１００μｇのｍＲＮＡワクチンでワクチン接種したヒト第１相試験参加者からの血清によるＥ４８４Ｋ及びＢ．１．３５１に対する中和力価は、これらのバリアントによるウイルスチャレンジに対する保護を媒介するのに十分であろうと思われる。総合すると、これらのデータは、Ｂ．１．３５１バリアントに対する中和効力の減少にもかかわらず、ｍＲＮＡワクチンによるワクチン接種が、Ｂ．１．３５１バリアントから保護する可能性が高いことを示している。現在のワクチンによって誘導されるこれらの抗体中和応答から逃れることが可能であり得る任意のバリアントの出現に備え、さらに出現するバリアントを抑制するためのより広範な中和能力を誘導する準備をすることが重要である。

方法
動物研究。初回免疫－追加免疫スケジュールで２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１０または３０μｇのｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡワクチン」）でアカゲザル（ＮＨＰ）を免疫化し、追加免疫用量の４週間後（５６日目）に血清を回収した。

臨床試験。初回免疫－追加免疫スケジュールで２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードする１００μｇのｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡワクチン」）でヒトを免疫化し、追加免疫１週間後（３６日目）に血清を回収した。研究プロトコル及び結果は、Ｊａｃｋｓｏｎ，ｅｔａｌ．（２０２０）に報告されている。ＡｎｍＲＮＡＶａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＲｅｐｏｒｔ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０２０；３８３：１９２０－１９３１を参照されたい。

組換えＶＳＶベースの擬似ウイルス中和。ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物（Ｄ６１４）、Ｄ６１４Ｇ、または表２及び３に列挙される示されるスパイクバリアントのコドン最適化完全長スパイクタンパク質を、ｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２完全長スパイク擬似型組換えＶＳＶ－ΔＧ－ホタルルシフェラーゼウイルスを作製するために、ＢＨＫ－２１／ＷＩ－２細胞（Ｋｅｒａｆａｓｔ、ＥＨ１０１１）をスパイク発現プラスミドでトランスフェクトし、その後、以前に記載されているように、ＶＳＶΔＧ－ホタルルシフェラーゼに感染させた（Ｗｈｉｔｔ，２０１０，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ１６９，３６５－３７４）。中和アッセイのために、連続的に希釈した血清試料を擬似ウイルスと混合し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後、ウイルス－血清ミックスを使用して、Ａ５４９－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞に３７℃で１８時間感染させた後、ルシフェラーゼシグナル（相対発光単位、ＲＬＵ）の測定のためにＯＮＥ－Ｇｌｏ試薬（ＰｒｏｍｅｇａＥ６１２０）を添加した。中和のパーセンテージを、ウイルスのみ対照のＲＬＵに基づいて計算し、その後、４パラメータロジスティック曲線（Ｐｒｉｓｍ８）を使用して分析した。

実施例２：コロナウイルス株チャレンジ
本研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などのコロナウイルス抗原（例えば、スパイク（Ｓ）タンパク質、スパイクタンパク質のＳ１サブユニット（Ｓ１）、またはスパイクタンパク質のＳ２サブユニット（Ｓ２）、ドメインなど）をコードする本明細書に開示のｍＲＮＡを含む候補コロナウイルスワクチンの、ハムスター、マウス、及び／またはウサギにおけるコロナウイルスによる致死的なチャレンジに対する有効性を試験するように設計している。致死用量（１０×ＬＤ９０；約１００プラーク形成単位；ＰＦＵ）のコロナウイルスで動物をチャレンジする。

使用する動物は、約１０の群における約６～８週齢の動物である。ＩＭ、ＩＤ、またはＩＶ投与経路を介して、０及び３週目に動物をワクチン接種する。候補ワクチンは、化学修飾されているか、または非修飾である。マイクロ中和について、動物血清を試験する。次いで、ＩＮ、ＩＭ、ＩＤ、またはＩＶ投与経路を介して、約６～８週目に約１ＬＤ９０のコロナウイルスで動物をチャレンジする。エンドポイントは、感染後約１３～１５日目、死亡、または安楽死である。３０％超の体重減少、極度の嗜眠、または麻痺によって決定して、重篤な病状を示す動物は、安楽死させる。体温及び体重を、毎日評価及び記録する。

実施例３－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡワクチン構築物のインビボ発現
２μｇまたは１０μｇのＣＯＶＩＤ－１９構築物またはＴｒｉｓ緩衝液（対照として）のいずれかを、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの各後肢に筋肉内投与する。構築物は、カチオン性（アミノ）脂質ナノ粒子、１０．７ｍＭの酢酸ナトリウム、８．７％のスクロース、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に本明細書に開示の抗原をコードするｍＲＮＡのうちのいずれかを含む。１日後、脾臓及びリンパ節を回収して、フローサイトメトリーを使用してタンパク質発現を検出する。

実施例４－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡは、ヒト化マウスを致死的なチャレンジから保護する
０週目及び３週目に０．０１、０．１、または１μｇの抗原をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡで、ヒト化ＤＰＰ４２８８／３３０^＋／＋マウスを免疫化する。ＰＢＳで、モック免疫化マウスを免疫化する。追加免疫の４週間後、致死用量のマウス適応ＳＡＲＳ－ＣｏＶでマウスをチャレンジする。チャレンジに続いて、体重減少及びウイルス感染の徴候についてマウスを監視する。チャレンジ後３及び５日目に、ウイルス力価及び出血の分析のために５匹のマウス／群から肺を採取する。

実施例５－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡ株バリアント免疫原性
１日目及び２２日目に、１μｇまたは１０μｇの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするｍＲＮＡまたはＰＢＳ（対照として）のいずれか（５０μＬ用量として製剤化）を、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。１７個の群（ｎ＝１０匹のマウス／群）：ＰＢＳ、次いで２つのプロリン置換（配列番号１８）、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｄ６１４Ｇ（配列番号１）、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇ（配列番号６）、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｌ１８Ｆ＿Ｄ８０Ａ＿Ｄ２１５Ｇ＿Ｌ２４２＿２４４ｄｅｌ＿Ｒ２４６Ｉ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ａ７０１Ｖ（配列番号９）、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｈ６９ｄｅｌ＿Ｖ７０ｄｅｌ＿Ｙ１４４ｄｅｌ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ａ５７０Ｄ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ｐ６８１Ｈ＿Ｔ７１６Ｉ＿Ｓ９８２Ａ＿Ｄ１１１８ｈ（配列番号１２）、配列番号１と配列番号６との１：１ミックス（５μｇ＋５μｇ、または０．５μｇ＋０．５μｇ）、配列番号１と配列番号９との１：１ミックス（５μｇ＋５μｇ、または０．５μｇ＋０．５μｇ）、及びＤ６１４Ｇのバリアントを有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの両方の投薬量レベルを試験した。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有した。この投与スケジュールの概要を、表４に提供する。

１５日目及び３６日目にマウスから血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡ及び本明細書に記載の中和アッセイによって分析した。簡潔に述べると、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離物及びＤ６１４Ｇ変異（野生型またはＤ６１４Ｇ）、または本明細書に列挙されるスパイクタンパク質バリアント（例えば、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、ＣＡＬ．２０Ｃ）のコドン最適化完全長スパイクタンパク質を、ｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２完全長スパイク擬似型組換えＶＳＶ－ΔＧ－ホタルルシフェラーゼウイルスを作製するために、ＢＨＫ－２１／ＷＩ－２細胞（Ｋｅｒａｆａｓｔ、ＥＨ１０１１）をスパイク発現プラスミドでトランスフェクトし、その後、以前に記載されているように、ＶＳＶΔＧ－ホタルルシフェラーゼに感染させた（Ｗｈｉｔｔ，２０１０）。中和アッセイのために、連続的に希釈した血清試料を擬似ウイルスと混合し、３７Ｃで４５分間インキュベートした。その後、ウイルス－血清ミックスを使用して、Ａ５４９－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞に３７Ｃで１８時間感染させた後、ルシフェラーゼシグナル（相対発光単位、ＲＬＵ）の測定のためにＯＮＥ－Ｇｌｏ試薬（ＰｒｏｍｅｇａＥ６１２０）を添加した。中和のパーセンテージを、ウイルスのみ対照のＲＬＵに基づいて計算し、その後、４パラメータロジスティック曲線（Ｐｒｉｓｍ８）を使用して分析した。これらの免疫原性調査の結果を、図８Ａ～１０Ｄに示す。

表４に列挙される組成物で免疫化したマウスの血清を、第１の用量の投与後１５日目に回収し、上記の擬似ウイルス中和アッセイで評価した。２Ｐ置換を有する安定な野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質よりも、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質を有するＶＳＶＰＳＶに対して４．４倍高い中和力価を誘発した（図８Ａ、８Ｅ）。逆に、２Ｐ安定化置換及び表４に列挙されるバリアントを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対してよりも、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対して５．９倍高い中和力価を誘発した（図８Ｂ、８Ｆ）。さらに、ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１（５μｇの各ｍＲＮＡ）との両方の１：１ミックスは、両方のスパイクタンパク質に対して同様の中和力価を誘発し、有意差はなかった（図８Ｃ、８Ｇ）。

表４に列挙される組成物で免疫化したマウスの血清を、第１の用量の投与後１５日目及び第２の用量の投与後３６日目に回収し、ＥＬＩＳＡによって評価して、２Ｐ安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的なＩｇＧの力価を定量化した（図９）。ｍＲＮＡ－１２７３と比較して、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、ＷＡ．１Ｓ－２Ｐタンパク質に特異的なより低いＩｇＧ力価を誘発したが、ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物は、１５日目の測定でのｍＲＮＡ－１２７３の総ＲＮＡの観点で、同等の用量と同様の力価を誘発した（図９）。第２の用量（３６日目）の後に、増加したＳ－２Ｐ結合力価が測定された。これらの結果は、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１の両方が活性であり、免疫原性であることを実証した。ｍＲＮＡ－１２７３と比較して、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１ではわずかに低い抗体レベルが見られ、これは、ＥＬＩＳＡで使用されるコーティングＳ－２Ｐタンパク質がｍＲＮＡ－１２７３と相同であることに起因する潜在性がある。

表４に列挙される１μｇの組成物で免疫化したマウスの血清を、第２の用量の投与後３６日目に回収し、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質バリアントに対する中和抗体力価を評価した。データを以下の表５に示し、ｍＲＮＡ－１２７３は、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｌ１８Ｆ＿Ｄ８０Ａ＿Ｄ２１５Ｇ＿Ｌ２４２＿２４４ｄｅｌ＿Ｒ２４６Ｉ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ａ７０１Ｖであり、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１は、１：１の比のｍＲＮＡ－１２７３：ｍＲＮＡ－１２７３．３５１である。

データは、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１が、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質バリアント（Ｄ６１４ＧからＢ．１．３５１への１．３倍の変化）に対して、強力かつ同等の中和力価を誘発することを実証している。その応答は、Ｄ６１４Ｇバリアントに対するｍＲＮＡ－１２７３のものと非常に一致した。同様に、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質バリアントに対して強力な中和力価を誘発したが、しかしながら、その中和抗体力価は、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１のものよりも１．６倍低かった。Ｄ６１４Ｇに対するｍＲＮＡ－１２７３．３５１の中和活性は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質バリアントに対するものよりもおよそ４倍低いことが見出された。ｍＲＮＡ－１２７３は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質バリアントと比較して、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質バリアントに対して２．１倍低い中和活性を有することが見出された。

実験は、１０μｇ用量でも実施した。研究からの結果を、以下の表６に示す。

データは、主に１μｇ用量群からの傾向に従う。Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質バリアントに対するｍＲＮＡ－１２７３．２１１の力価は、ｍＲＮＡ－１２７３のものよりも約２倍低い。２つのバリアント間のｍＲＮＡ－１２７３のギャップも、両方の用量レベルでおよそ２倍である。とりわけ、１０μｇ用量での２つのバリアントに対するｍＲＮＡ－１２７３．３５１中和抗体力価レベルのギャップは、１μｇ用量（およそ４倍）よりも（２倍）小さくなる。

表４に列挙される１μｇの組成物で免疫化したマウスの血清を、第２の用量の投与後３６日目に回収し、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質、ＣＡＬ．２０Ｃスパイクタンパク質バリアント、及びＰ．１スパイクタンパク質バリアントに対する中和抗体力価に関して評価した。データを以下の表７に示す。

データは、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１が、Ｄ６１４Ｇ及びＰ．１スパイクタンパク質バリアントに対して同様の中和力価を誘発することを実証している。ｍＲＮＡ－１２７３．３５１免疫化マウスは、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質バリアントに対する中和力価と比較すると、Ｐ．１、Ｄ６１４Ｇ、及びＣＡＬ．２０Ｃスパイクタンパク質バリアントに対して４～６倍の中和抗体力価の低下を有することが見出された。理論に拘束されることを望むものではないが、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質における広範なＮ末端ドメイン変異によって、その免疫原性がＤ６１４Ｇ及びＰ．１バリアントとは異なり得ると考えられる。ｍＲＮＡ－１２７３及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１の両方が、ＣＡＬ．２０Ｃに対する中和力価において同様の３倍の低下を有する（Ｄ６１４ＧバリアントとＣＡＬ．２０Ｃバリアントとの間の相対力価変化は、ｍＲＮＡ－１２７３では２．４倍（ｐ＝０．００７８）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１では１．４倍、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１では３．２倍（ｐ＝０．００７８）であった）。Ｄ６１４Ｇバリアントとｐ．１バリアントとの間の相対力価変化は、ｍＲＮＡ－１２７３では２．０倍、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１では０．８倍、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１では１．２倍であった。

ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｄ６１４Ｇ（配列番号１）、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇ（配列番号６）、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｌ１８Ｆ＿Ｄ８０Ａ＿Ｄ２１５Ｇ＿Ｌ２４２＿２４４ｄｅｌ＿Ｒ２４６Ｉ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ａ７０１Ｖ（配列番号１０）、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｈ６９ｄｅｌ＿Ｖ７０ｄｅｌ＿Ｙ１４４ｄｅｌ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ａ５７０Ｄ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ｐ６８１Ｈ＿Ｔ７１６Ｉ＿Ｓ９８２Ａ＿Ｄ１１１８ｈ（配列番号１２）、及び配列番号１０と配列番号６との１：１ミックス（０．５μｇ＋０．５μｇ）を含む、追加のスパイクバリアント抗原設計を同様に試験した。１μｇの上記のｍＲＮＡワクチンで免疫化したマウスの血清を、第２の用量の投与後３６日目に回収し、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質バリアントに対する中和抗体力価に関して評価した。データを以下の表８に示す。

Ｓ２Ｐ－Ｅ４８４Ｋ－Ｄ６１４Ｇ及びＳ２Ｐ－Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇワクチンは、Ｄ６１４Ｇバリアントウイルスを良好に中和し、各々が、Ｂ．１．３５１ウイルスに対してわずかな低下（１．５～２倍）を有したことが見出された。ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１ミックス）で観察された結果と同様に、ｍＲＮＡ－１２７３とＳ２Ｐ－Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇとの１：１混合物は、一貫して高い中和力価を有した。しかしながら、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１ワクチンとは対照的に、ｍＲＮＡ－１２７３とＳ２Ｐ－Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇとの１：１混合物は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質バリアントに対してそれほど強力ではない応答を有した。

Ｓ２Ｐ－Ｄ６１４Ｇ（配列番号１８）ｍＲＮＡワクチン（１μｇ用量）で、研究を繰り返した。表９に示される異なるウイルスバリアントに対する中和抗体力価を決定するために、３６日目（２回用量後）に血清をアッセイした。

データは、試験した他のｍＲＮＡワクチンと比較して、ワクチンＳ２Ｐ－Ｄ６１４Ｇが、バリアントに対するより高い中和抗体力価を誘発したことを実証している。さらに、試験した他のｍＲＮＡワクチンよりも一貫した抗体力価を示した。例えば、Ｄ６１４Ｇバリアントに対して測定された中和抗体力価は、Ｂ．１．３５１バリアントに対するものよりも１．７倍高かった。Ｄ６１４Ｇバリアントに対する中和力価は、ＣＡＬ．２０Ｃバリアントに対して１．２倍高く、Ｄ６１４Ｇバリアント及びＰ．１バリアントに対して１．１倍高かった。最後に、Ｄ６１４Ｇバリアントに対する中和力価は、Ｂ．１．１．７＋Ｅ４８４Ｋバリアントに対するものよりも１．５倍高かった。

実施例６－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡＢ．１．３５１バリアント免疫原性（１０個の変異対８つの変異）
１日目及び２２日目に、０．１μｇ、１μｇ、または１０μｇの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードするｍＲＮＡまたはＰＢＳ（対照として）のいずれか（５０μＬ用量として製剤化）を使用して、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。試験したｍＲＮＡは、２つのプロリン置換、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ、（配列番号１８）と、ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｌ１８Ｆ＿Ｄ８０Ａ＿Ｄ２１５Ｇ＿Ｌ２４２＿２４４ｄｅｌ＿Ｒ２４６Ｉ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ａ７０１Ｖ（配列番号９）またはＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ＿Ｈ６９ｄｅｌ＿Ｖ７０ｄｅｌ＿Ｙ１４４ｄｅｌ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ａ５７０Ｄ＿Ｄ６１４Ｇ＿Ｐ６８１Ｈ＿Ｔ７１６Ｉ＿Ｓ９８２Ａ＿Ｄ１１１８ｈ（配列番号１２）とを有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡをコードする。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化する。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有する。

２１日目及び３６日目にマウスから血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡ及び本明細書に記載の中和アッセイによって血清を分析する。肺及び脾臓を取り出し、さらに分析する。

実施例７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡＢ．１．３５１バリアント第３の用量の免疫原性
１日目及び２２日目に、０．１μｇまたは１μｇの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするｍＲＮＡまたはＰＢＳ（対照として）のいずれか（５０μＬ用量として製剤化）を、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。次いで、８週目（５７日目）に第３の用量をマウスに投与した。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有した。投与スケジュールを、以下の表１０に提供する（注：ｍＲＮＡ－３５１は、以下の変異：Ｌ１８Ｆ－Ｄ８０Ａ－Ｄ２１５Ｇ－Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ－Ｒ２４６Ｉ－Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ－Ａ７０１Ｖを有する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をコードする）。

２１、３６、５６、及び７７日目に血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡ及び本明細書に記載の中和アッセイによって分析した。中和力価が図４１に示されており、５６日目～７７日目の間に４．６から３７．２までの倍数増加を実証している。

全体として、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３（ｎ＝４０）は、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．６１７－２－ｖ１、ＣＡＬ．２０Ｃに対する中和抗体力価の減少を一貫して示した（図４２Ａ～４２Ｂ）。対照的に、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（ｎ＝８）は、Ｐ．１、Ｂ．１．６１７．２－ｖ１、ＣＡＬ．２０Ｃに対する中和抗体力価が１．５～３倍増加した（図４２Ａ～４２Ｂ）。試験した異なる比、１：２及び１：３のｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（ｎ＝８）は、Ｂ．１．３５１に対してｍＲＮＡ－１２７３．３５１と等しく良好に機能することが見出されたが、しかしながら、１：２のｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１ワクチン（ｎ＝８）は、Ｄ６１４Ｇに対して最高の中和抗体力価を有することが見出された（図４２Ａ～４２Ｂ）。

第３の用量（ブースター）の３週間後、全てのワクチン製剤は、Ｄ６１４Ｇと比較して、中和抗体力価に低減を有することが見出されたが、全てのワクチン製剤は、ウイルスの完全なパネルにわたってｍＲＮＡ－１２７３と等しく良好に挙動するように思われた（図４３Ａ～４３Ｂ）。特に、ｍＲＮＡ－１２７３は、ウイルスの完全なパネルに対する中和抗体力価に１．５～３倍の低減を有することが見出された。加えて、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１及び１：２のｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１に対して等しく良好に機能したが、１：３のｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、わずかに低い中和抗体力価を有するように思われる（図４４Ａ～４４Ｂ）。最終的に、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、Ｂ．１．３５１に対する最高の中和抗体力価を得た。

要約すると、第３の用量（ブースター）として、全てのワクチン製剤は、１：３のｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１製剤よりもわずかに良好であるが、等しくに良好に機能するように見えた。

実施例８－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡの免疫原性（第３及び第４の用量）
１日目及び２２日目に、１μｇの配列番号１８（ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ）でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した（ｎ＝８匹／群）。その後、５８日目に第１のブースター用量（用量３、１μｇ）及び７８日目に第２のブースター用量（用量４、１μｇ）、または２１３日目に第１のブースター用量（用量３、０．１μｇまたは１μｇ）及び２３４日目に第２のブースター用量（用量４、０．１μｇまたは１μｇ）を、マウスに投与した。第１及び第２のブースター用量は、以下の変異：Ｌ１８Ｆ－Ｄ８０Ａ－Ｄ２１５Ｇ－Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ－Ｒ２４６Ｉ－Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ－Ａ７０１Ｖを有する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をコードするｍＲＮＡを含んでいた。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有した。

第１のブースター用量の１日前、第２のブースター用量の１日前、及び第２のブースター用量の２週間後に血液を採取し、ＥＬＩＳＡ及び本明細書に記載の中和アッセイによって分析した。簡潔に述べると、スパイク変異Ｄ６１４Ｇ（コンパレータバリアント）及びＢ．１．３５１（Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖ）を有する擬似ウイルスを構築した。検証されたレンチウイルスベースのスパイク擬似型ウイルスアッセイを使用して中和アッセイを実施し、２９３Ｔ細胞は、Ｓｈｅｎｅｔａｌ．（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｖａｒｉａｎｔＢ．１．１．７ｉｓｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｔｏｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｅｌｉｃｉｔｅｄｂｙａｎｃｅｓｔｒａｌＳｐｉｋｅｖａｃｃｉｎｅｓ．ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ，ｉｎｐｒｅｓｓ２０２１）に記載のＡＣＥ２を過剰発現するように安定的に形質導入された。

２１３日目及び２３４日目にブースター用量を受けた群に関しては、中和抗体力価が、６ヶ月の期間にわたり約２倍低下することが見出された。すなわち、３６日目には、中和力価は９９４０であり、２１２日目（第１のブースター用量の前日）には、中和抗体力価は、６７２９であった。

Ｄ６１４Ｇバリアント及びＢ．１．３５１バリアントに対する中和抗体力価を、２１２日目（第３の用量前、１μｇ）及び２３３日目（第３の用量後）に測定した。データを以下の表１１に示す。

表１１に示されるように、中和抗体力価は、Ｄ６１４バリアントスパイクタンパク質に対して２１２日目から２３３日目まで増加し、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質に対してより劇的に増加した。２１２日目と２３３日目との間のＤ６１４Ｇバリアントに対する相対力価変化は、４．５倍であり、２１２日目と２３３日目との間のＢ．１．３５１バリアントに対する相対力価変化は、１５倍であった。中和抗体力価は、２１２日目（ブースターの投与前）のＢ．１．３５１バリアントに対するよりも、Ｄ６１４Ｇバリアントに対して６．６倍高かったが、しかしながら、ブースター用量後（２３３日目）には、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対して誘発された中和力価は、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質によって誘発されたものの２倍であった。

同様の傾向が、０．１μｇ用量で見られた。Ｄ６１４Ｇバリアント及びＢ．１．３５１バリアントに対する中和抗体力価を、２１２日目（第３の用量前、０．１μｇ）及び２３３日目（第３の用量後）に測定した。データを以下の表１２に示す。

表１２に示されるように、中和抗体力価は、Ｄ６１４バリアントスパイクタンパク質及びＢ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質に対して２１２日目から２３３日目まで増加した。２１２日目と２３３日目との間のＤ６１４Ｇバリアントに対する相対力価変化は、３．６倍であり、２１２日目と２３３日目との間のＢ．１．３５１バリアントに対する相対力価変化は、４．２倍であった。中和抗体力価は、２１２日目（ブースターの投与前）のＢ．１．３５１バリアントに対するよりも、Ｄ６１４Ｇバリアントに対して８．３倍高かったが、しかしながら、ブースター用量後（２３３日目）には、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対して誘発された中和力価は、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質によって誘発されたものの７．２倍であった。

研究の要約を図１１～１２に提示する。

これらの同じ傾向はまた、５８日目及び７８日目にブースター用量を受けた群において観察された。１日目及び２２日目に、１μｇの配列番号１８（ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ）でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した（ｎ＝８匹／群）。その後、５８日目に第１のブースター用量（用量３、１μｇ）をマウスに投与した。第１のブースター用量は、以下の変異：Ｌ１８Ｆ－Ｄ８０Ａ－Ｄ２１５Ｇ－Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ－Ｒ２４６Ｉ－Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ－Ａ７０１Ｖを有する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をコードするｍＲＮＡを含んでいた。５７日目（第１のブースター用量の投与前）及び７７日目（１μｇのブースター用量の投与後）に、血清試料を回収した。データを以下の表１３に示す。

表１３に示されるように、中和抗体力価は、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質及びＢ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質に対して５７日目から７７日目まで増加した。５７日目と７７日目との間のＤ６１４Ｇバリアントに対する相対力価変化は、４．９倍であり（ｐ＝０．０１５６）、５７日目と７７日目との間のＢ．１．３５１バリアントに対する相対力価変化は、１７倍であった（ｐ＝０．０１５６）。中和抗体力価は、５７日目（ブースターの投与前）のＢ．１．３５１バリアントに対するよりも、Ｄ６１４Ｇバリアントに対して４．９倍高かった（ｐ＝０．０１５６）が、しかしながら、ブースター用量後（７７日目）には、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対して誘発された中和力価は、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質によって誘発されたものの１．８倍であった。

同様の傾向が、０．１μｇ用量で見られた。Ｄ６１４Ｇバリアント及びＢ．１．３５１バリアントに対する中和抗体力価を、５７日目（第３の用量前、０．１μｇ）及び７７日目（第３の用量後）に測定した。データを以下の表１４に示す。

表１４に示されるように、中和抗体力価は、Ｄ６１４バリアントスパイクタンパク質及びＢ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質に対して５７日目から７７日目まで増加した。５７日目と７７日目との間のＤ６１４Ｇバリアントに対する相対力価変化は、５．２倍であり（ｐ＝０．０３１３）、５７日目と７７日目との間のＢ．１．３５１バリアントに対する相対力価変化は、６．９倍であった（ｐ＝０．０３１３）。中和抗体力価は、５７日目（ブースターの投与前）のＢ．１．３５１バリアントに対するよりも、Ｄ６１４Ｇバリアントに対して１．７倍高かったが、しかしながら、ブースター用量後（７７日目）には、Ｄ６１４Ｇバリアントスパイクタンパク質に対して誘発された中和力価は、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質によって誘発されたものの１．３倍であった。

考察
この実施例では、ｍＲＮＡ－１２７３で以前にワクチン接種した動物におけるブースターとして、マウスにおけるｍＲＮＡ－１２７３．３５１及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１を評価した。初回ワクチン接種シリーズとして、両方のワクチンは、用量１の後に強力に免疫原性であり、第２の用量後に、Ｓ－２Ｐ結合及び中和抗体力価の両方が有意に増加した。ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、Ｂ．１．３５１に対する強力な中和力価を誘発した。しかしながら、Ｄ６１４Ｇウイルスに対するｍＲＮＡ－１２７３．３５１の中和活性は、Ｂ．１．３５１ウイルスに対するものよりも４倍低く、ｍＲＮＡ－１２７３と比較して、Ｄ６１４Ｇに対するものよりも６．３倍低かった。対照的に、多価ｍＲＮＡ－１２７３．２１１ワクチンは、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ウイルスの両方に対して、強力かつ同等の中和力価を誘発した。加えて、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１でのワクチン接種は、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチン接種後にＤ６１４Ｇウイルスに対して観察されたものと非常に一致する、Ｂ．１．３５１バリアントに対する中和力価を誘発した。

追加免疫レジメンであるｍＲＮＡ－１２７３．３５１を、およそ７ヶ月前にｍＲＮＡ－１２７３でワクチン接種した動物において評価した。ｍＲＮＡ－１２７３の初回シリーズによって駆動される免疫をさらに増強する能力に関する懸念にもかかわらず、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１の第３の用量は、Ｓ－２Ｐ結合抗体力価、ならびにＤ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ＰＳＶ中和価の両方を劇的に増強した。Ｂ．１．３５１ＰＳＶに対する中和力価は、第２の用量のｍＲＮＡ－１２７３後に、Ｄ６１４Ｇに対するピーク中和力価をはるかに上回るレベルまで増加し、後者は、マウスにおけるマウス適応ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物に対して完全に保護する。加えて、追加免疫はまた、Ｄ６１４Ｇに対する中和力価を増加させたが、予想されるように、倍数増加は、Ｂ．１．３５１に対するものよりも低かった。全体として、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１での追加免疫は、第３の用量前と比較すると、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１の両方の中和力価を劇的に増加させ、力価は、以前の３６日目のピークよりもはるかに高く、Ｄ６１４Ｇウイルスと比較して、Ｂ．１．３５１に対する低減の倍数が減少した。

実施例９：非ヒト霊長類におけるコロナウイルスワクチンの保護及び持続性
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を使用して、ワクチンの異なる組み合わせの持続性及び保護性を調べた。１つの研究では、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡワクチン」）で、ＮＨＰを２回ワクチン接種した。０週目に、１００μｇまたは３０μｇのｍＲＮＡワクチンで各ＮＨＰ（ｎ＝８匹／群）を免疫化した。４または５週目に、１００μｇのｍＲＮＡワクチンを以前に投与された動物に、別の１００μｇ用量のｍＲＮＡワクチンを投与する。３０μｇ用量のワクチンを受けた群の動物に、別の３０μｇ用量を投与するか、または第２の用量を投与しない。ｍＲＮＡワクチンを受けなかったナイーブ対照群があった。１２週目に、５×１０^５ＰＦＵのウイルス（Ｄ６１４ＧまたはＢ．１．３５１のいずれか）で、動物をチャレンジした。チャレンジの後、２、４、７、及び１４日目に血液試料を採取し、２、４、７、及び１４日目に鼻洗浄を実施し、２、４、及び７日目に鼻スワブを採取し、２、４、７、及び１４日目に気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を試料採取し、８及び１４日目に肺病理学を実施した（ｎ＝４匹／群／日）。

図２５Ａ及び２５Ｂに示されるように、中和力価を経時的に調べ、時間とともにわずかに減少する一貫した力価を実証している。Ｂ．１．３５１に対する中和抗体力価は、Ｄ６１４Ｇに対して生成されたものよりも低かった（図２５Ｃ～２５Ｅ）。図２６Ａ～２６Ｂに示されるように、ＮＨＰは、３０μｇ用量後に、鼻及び肺に完全な保護を実証した。後の研究では、３０μｇ用量は、下気道（ＢＡＬ、図２７Ａ）において保護的であることが見出されたが、ウイルスコピーが、鼻スワブ試料（図２７Ｂ）で検出された。強力なチャレンジにもかかわらず、上気道の感染は、短期間に伝播する潜在性を伴うが、迅速に制御され、動物は、保護されているとみなされる。ｍＲＮＡ－１２７３（図２８Ａ～２８Ｂ）でワクチン接種した動物において、Ｂ．１．３５１に対する中和抗体力価に低減があり、上気道でウイルス複製が検出された（図２９Ｂ）。下気道は、保護された（図２９Ａ）。さらに、ＷＡ．１及びＲＳＡに対する保護が見出された（図３０Ａ～３０Ｂ）が、上気道におけるウイルス複製は、伝播の潜在性を示唆している。

別の研究では、ｍＲＮＡワクチンを２回（用量当たり３０μｇ）動物にワクチン接種し、次いで、以下の変異：Ｌ１８Ｆ－Ｄ８０Ａ－Ｄ２１５Ｇ－Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ－Ｒ２４６Ｉ－Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ－Ａ７０１Ｖ（Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質）を有する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をコードするｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡワクチンとＢ．１．３５１のスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡとの組み合わせを含む、ワクチンを投与する。次いで、ＲＳＡ単離物で動物をチャレンジし、投与プロトコルが免疫を増強し、Ｂ．１．３５１（ＲＳＡ）単離物に対する保護を付与するかどうかを決定するために調べる。

さらなる研究では、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、１０μｇ、３０μｇ、または１００μｇのｍＲＮＡワクチンを動物に投与し、次いで、ＲＳＡ単離物でチャレンジして、ワクチンが、ＲＳＡチャレンジに対する保護を媒介するかどうか、及びワクチンの用量が、免疫及び保護に影響を与えるかどうかを決定する。

実施例１０：ハムスターモデルにおけるコロナウイルスワクチンの保護及び持続性
ハムスター（ゴールデンシリアンハムスター）を使用して、ワクチンの異なる組み合わせの持続性及び保護を調べる。１つの研究では、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡワクチン」）で２回、または以下の変異：Ｌ１８Ｆ－Ｄ８０Ａ－Ｄ２１５Ｇ－Ｌ２４２－２４４ｄｅｌ－Ｒ２４６Ｉ－Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ－Ａ７０１Ｖ（Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質）を有する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をコードするｍＲＮＡで２回、ハムスターをワクチン接種する。各動物は、２５μｇ、５μｇ、または１μｇの２回用量を受ける。次いで、生成された力価が、単離物に対して保護的であるかどうかを決定するために、ＲＳＡ単離物でハムスターをチャレンジする。

別の研究では、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡで２回、ハムスターをワクチン接種する。各動物は、２５μｇ、５μｇ、または１μｇの２回用量を受ける。次いで、ＲＳＡ単離物またはＷＡ１単離物でハムスターをチャレンジして、ワクチンが、両方の単離物に対して保護的であるかどうかを決定する。

さらなる研究では、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡと組み合わせて、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、２５μｇ、５μｇ、または１μｇのｍＲＮＡワクチンを動物に投与し、次いで、ＷＡ１単離物でチャレンジして、ワクチンが、チャレンジに対する保護を媒介するかどうか、及びワクチンの用量が、免疫及び保護に影響を与えるかどうかを決定する。

別の研究では、２回用量の、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡワクチンを動物に投与する。次いで、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む２５μｇのブースター用量のワクチンもしくは５μｇのワクチン、または２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ（０．５μｇ）及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ（０．５μｇ）の両方を含む１μｇのワクチンを動物に投与する。

実施例１２：インビトロ中和スクリーニング
Ｄ６１４Ｇバリアントのコドン最適化完全長スパイクタンパク質またはＢ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質を、ｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。中和アッセイのために、連続的に希釈した血清試料を擬似ウイルスと混合し、３７℃で４５分間インキュベートした。血清試料は、１μｇの、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＤ６１４Ｇ抗原をコードするｍＲＮＡを投与されたマウスからであった。その後、ウイルス－血清ミックスを使用して、Ａ５４９－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を３７℃で１８時間感染させ、その後、中和抗体力価を測定した。結果を図６及び７に示し、２つのプロリン置換を有するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡは、Ｄ６１４Ｇ擬似ウイルスから生じる力価と比較して、Ｂ．１．３５１バリアントに対する中和力価に５倍の減少を有した一方で、Ｄ６１４Ｇ抗原をコードするｍＲＮＡは、Ｄ６１４バリアントとＢ．１．３５１バリアントとの間で中和力価に１．９倍の減少をもたらしたことを実証している。

実施例１３：野生型または株が一致するブースター用量でのヒト対象の免疫化
実施例１に記載されるように、１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３を２回用量投与することによって、ヒト臨床試験参加者を免疫化した。第２の用量のｍＲＮＡ－１２７３を受けた約６ヶ月後、Ｂ．１．３５１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに関連付けられる変異を含む２Ｐ安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３（図１３Ａ～１３Ｅ）、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（図１４Ａ～１４Ｅ）のいずれかの第３の用量（ブースター用量）を参加者に投与した。ブースター用量の投与の直前（図１３Ａ～１５ＥのＤ１または１日目）、及び再びブースター用量の投与の２週間後（図１３Ａ～１５ＥのＤ１５または１５日目）に、参加者から血清を回収した。実施例１及び１２に記載の擬似ウイルス中和アッセイを使用して、各時点からの血清を評価して、１）Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質（Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質）、または３）Ｐ．１バリアントに関連付けられる変異を有するスパイクタンパク質（Ｐ．１スパイクタンパク質）のうちの１つを発現している擬似ウイルスに対する中和抗体力価を定量化した。これらの中和アッセイの結果及び各ブースター用量の効果を、図１３Ａ～１５Ｅに示す。

ｍＲＮＡ－１２７３の第２の用量の６ヶ月後、及びブースター用量の投与前に、全ての群は、依然として、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する中和抗体を実証したが、Ｂ．１．３５１またはＰ．１スパイクタンパク質を中和する能力は最小限であった（図１３Ａ、１４Ａ）。ｍＲＮＡ－１２７３またはｍＲＮＡ－１２７３．３５１ブースター用量のいずれかの投与（例えば、第３の総用量）は、ブースター用量投与前の力価と比較して、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価を最大４４倍、著しく増加させた（図１３Ｃ～１３Ｅ、１４Ｃ～１４Ｅ）。Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価は、ｍＲＮＡ－１２７３の代わりに、株が一致するｍＲＮＡ－１２７３．３５１ブースター用量（すなわち、第３の総用量）を投与された対象ではおよそ１．５倍高く、株が一致するｍＲＮＡワクチンが、コードされたタンパク質に対する強力な抗体応答を生成するのに有効であることを示唆している（図１３Ｂ、１４Ｂ）。ｍＲＮＡ－１２７３は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１スパイクタンパク質に対する中和抗体を誘発したが、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する力価よりも均一に低かった（１日目は７．３倍、１５日目は５．３倍）（図１５Ａ～１５Ｂ）。対照的に、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１の投与は、Ｄ６１４Ｇ中和力価と比較して、Ｂ．１．３５１中和力価のこの低減を改善し、ブースター（第３の用量）投与前の７．７倍の減少から、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１ブースター（第３の用量）投与後のわずか２．６倍の低減まで差を改善した（図１５Ｃ～１５Ｄ）。いずれかのブースター用量（第３の用量）の投与は、ｍＲＮＡ－１２７３の第２の用量の１週間後に、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対して観察されたものと同等である力価で、Ｂ．１．３５１及びＰ．１スパイクタンパク質に対する中和抗体を誘発し、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１が、Ｂ．１．３５１及びＤ６１４Ｇ株を含む他のスパイクタンパク質に対する強力な応答を誘発することが可能であることを示唆している（図１５Ｅ）。驚くべきことに、両方のブースターは、ｍＲＮＡ－１２７３の第２の用量の１週間後に同じタンパク質に対して観察されたものよりも２～３倍高い力価まで、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する中和力価を増加させ、ブースター用量が、以前に投与されたｍＲＮＡワクチンによってコードされた抗原に対する中和抗体応答を維持し、さらには増加させるのに有用であることを示唆している。

ｍＲＮＡ－１２７３．３５１によってコードされるＳ－２Ｐ．３５１タンパク質中の新しいエピトープに対する中和抗体応答の動態は、２つの免疫原の間で共有されるエピトープとは異なり得るので、２つのアッセイ間の差のさらなる低減が、後の時点でこれらの参加者から回収した試料において見出され得る。ワクチンで使用されたアッセイの同じ株によって評価した、絶対力価及び倍数上昇の両方の観点での強い相同応答が、ワクチン株にかかわらず見られた。野生型ウイルスに対する応答は、ｍＲＮＡ－１２７３の追加免疫で最も高く、Ｂ．１．３５１に対する応答は、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１で最も高かった。加えて、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１ブースターの後に、プロトタイプワクチンを使用して追加免疫したときのバリアントに対する、またはプロトタイプに対する異種応答も見られた。これは、バリアント株によって引き起こされる感染を予防するためのブースター用量としてのバリアントワクチンの開発を支持する。

実施例１４：２Ｐ安定化スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの２回用量後に誘発される、抗体によるバリアントスパイクタンパク質の中和
実施例１３に記載されるように、２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３で、ヒト対象を免疫化した。ｍＲＮＡ－１２７３での第２の用量の２週間後、３６日目に血清を回収し、Ｂ．１．６１７．１－ｖ１、Ｂ．１．６１７．１－ｖ２、及びＡ．ＶＯＩ－Ｖ２のバリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体力価について擬似ウイルス中和アッセイで評価した。これらの中和アッセイの結果を、図１６Ａ～１６Ｃに示す。いずれかのＢ．１．６１７バリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体力価は、参照Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する力価よりも約３倍低く、Ａ．ＶＯＩ－Ｖ２スパイクタンパク質に対しては、Ｄ６１４Ｇに対するものよりも６．７倍低かった（図１６Ａ～１６Ｂ）。

実施例１３に記載の５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物、各２５μｇ）のいずれかのブースター用量を投与し、１５日後に血清を回収し、Ｂ．１．６１７－ｖ１Ｓｐｉｋｅタンパク質に対する中和抗体力価について試験した。２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３で免疫化した対象からの３６日目の血清と比較して、これらの５０μｇのブースター用量は、Ｂ．１．６１７－ｖ１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価を１．７～２．１倍改善した（図１６Ｃ）。単独または組み合わせのいずれかで、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１を含有するブースター用量は、ｍＲＮＡ－１２７３単独よりも高い増加をもたらした。これらの結果は、中和抗体力価が、初回投与されたｍＲＮＡによってコードされるスパイクタンパク質よりも、バリアントスパイクタンパク質に対して低い場合があるが、ブースター用量は、異種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対するいくらかの保護を提供するためにバリアントスパイクタンパク質に対する抗体を誘発することが可能であることを示している。

実施例１５：６ヶ月でのバリアントスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの第３及び第４のブースター用量での免疫化
１日目（第１の用量、初回免疫）及び２２日目（第２の用量、ブースター）に、１μｇ（図１７Ａ～１７Ｄ）または０．１μｇ（図１８Ａ～１８Ｄ）のｍＲＮＡ－１２７３、またはＰＢＳ（対照として）のいずれか（５０μＬ用量として製剤化）を、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。２１３日目（第３の用量）及び２３４日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を含有する、１μｇ（図１７Ａ～１７Ｄ）または０．１μｇ（図１８Ａ～１８Ｄ）のｍＲＮＡ－１２７３．３５１のいずれかをマウスに投与した。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有する。２１２日目（第３の用量前）、２３３日目（第３の用量の２１日後、第４の用量前）、及び２４８日目（第４の用量の１４日後）にマウスから血清を採取し、１）ＷＨ２０２０完全長スパイクタンパク質の配列と比較したＤ６１４Ｇ変異、または２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異、のいずれかを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するＶＳＶベースの擬似ウイルスに対する中和力価について分析した。

各ワクチン中に１μｇ用量のｍＲＮＡを投与したマウスのこれらの中和アッセイの結果を、図１７Ａ～１７Ｄに示す。第３及び第４の用量の各々は、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質に対する血清の平均中和力価を増加させた（図１７Ａ）。各スパイクタンパク質に対する中和力価は、経時的に増加し、この増加は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価においてより顕著である（図１７Ｂ）。第３の用量前に、血清は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質よりもＤ６１４Ｇスパイクタンパク質を中和するのにおよそ５．２倍有効であった（図１７Ｃ）。しかしながら、第３及び第４の用量の各々の後、低減は、それほど顕著ではなく、血清によるＤ６１４Ｇスパイクタンパク質の中和は、第３の用量後にはＢ．１．３５１スパイクタンパク質と同様に２倍のみであり、第４の用量後には同様に１．６倍であった（図１７Ｃ）。加えて、第４の用量後のいずれかのスパイクタンパク質に対する中和力価は、第２の用量の１４日後の３６日目に、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価よりも３倍を上回って高かった（図１７Ａ、１７Ｄ）。これらの結果は、バリアントスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与が、バリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体を効果的に誘発し、以前に投与されたｍＲＮＡによってコードされたスパイクタンパク質に対する抗体応答を増強することを示している。

各ワクチン中に０．１μｇ用量のｍＲＮＡを投与したマウスのこれらの中和アッセイの結果を、図１８Ａ～１８Ｄに示す。第３及び第４の用量の各々は、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質に対する血清の平均中和力価を増加させた（図１８Ａ）。各スパイクタンパク質に対する中和力価は、経時的に増加し、この増加は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価においてより顕著である（図１８Ｂ）。第３の用量前に、血清は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質よりもＤ６１４Ｇスパイクタンパク質を中和するのにおよそ５．１倍有効であった（図１８Ｃ）。しかしながら、第４回の投与後、この低減は、それほど顕著ではなく、血清は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質ならびにＢ．１．３５１スパイクタンパク質を２．５倍のみ中和した（図１８Ｃ）。加えて、第４の用量後のいずれかのスパイクタンパク質に対する中和力価は、第２の用量の１４日後の３６日目に、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する参照中和力価よりも５倍を上回って高かった（図１８Ａ、１８Ｄ）。これらの結果は、バリアントスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与が、バリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体を効果的に誘発し、以前に投与されたｍＲＮＡによってコードされたスパイクタンパク質に対する抗体応答を増強することを示している。

実施例１６：２ヶ月でのバリアントスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの第３及び第４のブースター用量での免疫化
１日目（第１の用量、初回免疫）及び２２日目（第２の用量、ブースター）に、１μｇ（図１９Ａ～１９Ｃ）または０．１μｇ（図２０Ａ～２０Ｃ）のｍＲＮＡ－１２７３、またはＰＢＳ（対照として）のいずれか（５０μＬ用量として製剤化）を、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。５８日目（第３の用量）及び７８日目（第４の用量）に、Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異を含有する、１μｇ（図１９Ａ～１９Ｄ）または０．１μｇ（図２０Ａ～２０Ｄ）のｍＲＮＡ－１２７３．３５１のいずれかをマウスに投与した。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有する。５７日目（第３の用量前）、７７日目（第３の用量後１９日、第４の用量前）、及び９２日目（第４の用量後１４日）にマウスから血清を採取し、１）ＷＨ２０２０完全長スパイクタンパク質の配列と比較したＤ６１４Ｇ変異、または２）Ｂ．１．３５１バリアントに関連付けられる変異、のいずれかを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するＶＳＶベースの擬似ウイルスに対する中和力価について分析した。

各ワクチン中に１μｇ用量のｍＲＮＡを投与したマウスのこれらの中和アッセイの結果を、図１９Ａ～１９Ｃに示す。第３及び第４の用量の各々は、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質に対する血清の平均中和力価を増加させた（図１９Ａ）。各スパイクタンパク質に対する中和力価は、経時的に増加し、この増加は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価においてより顕著である（図１９Ｂ）。第３の用量前に、血清は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質よりもＤ６１４Ｇスパイクタンパク質を中和するのにおよそ４．３倍有効であった（図１９Ｃ）。しかしながら、第３及び第４の用量の各々の後、低減は、それほど顕著ではなく、血清によるＤ６１４Ｇスパイクタンパク質の中和は、第３の用量後にはＢ．１．３５１スパイクタンパク質と同様に１．４倍のみであり、第４の用量後には同様に１．５倍であった（図１９Ｃ）。これらの結果は、バリアントスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与が、バリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体を効果的に誘発し、以前に投与されたｍＲＮＡによってコードされたスパイクタンパク質に対する抗体応答を増強することを示している。

各ワクチン中に０．１μｇ用量のｍＲＮＡを投与したマウスのこれらの中和アッセイの結果を、図２０Ａ～２０Ｃに示す。第３及び第４の用量の各々は、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質に対する血清の平均中和力価を増加させた（図２０Ａ）。各スパイクタンパク質に対する中和力価は、経時的に増加し、この増加は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和力価においてより顕著である（図２０Ｂ）。第３の用量前に、血清は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質よりもＤ６１４Ｇスパイクタンパク質を中和するのにおよそ３倍有効であった（図２０Ｃ）。しかしながら、第３及び第４の用量の各々の後、この低減は、それほど顕著ではなく、血清によるＤ６１４Ｇスパイクタンパク質の中和は、第３の用量後にはＢ．１．３５１スパイクタンパク質と同様に１．３倍のみであり、第４の用量後には、両方のスパイクタンパク質に対する中和力価は、およそ同等であった（図２０Ｃ）。これらの結果は、バリアントスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与が、バリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体を効果的に誘発し、以前に投与されたｍＲＮＡによってコードされたスパイクタンパク質に対する抗体応答を増強することを示している。

実施例１７：マウスにおけるバリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するためのバリアントスパイクタンパク質をコードする２回用量のｍＲＮＡでの免疫化
１日目（第１の用量、初回免疫）及び２２日目（第２の用量、ブースター）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする０．１μｇ、１μｇ、または１０μｇのｍＲＮＡ、具体的には、Ｂ．１．１．７バリアントスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、もしくはｍＲＮＡ－１２７３．１１７、またはＰＢＳ（対照として）（５０μＬ用量として製剤化）を、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。２１日目（第１の用量の３週間後、第２の用量前）及び３６日（第２の用量の２週間後）に、マウスから血清を回収し、ＥＬＩＳＡによって試験して、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物アミノ酸配列を有する親ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な総ＩｇＧを定量化した。スパイクタンパク質抗原をコードするｍＲＮＡの各第１の用量は、強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的抗体応答を誘発し、第２の用量は、各用量群においてＩｇＧ力価を１０～１００倍増強した（図２１Ａ）。

２回の１μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．１１７でワクチン接種したマウスから３６日目に得た血清を、各々異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現しているＶＳＶベースの擬似ウイルスのパネルに対する中和活性についても評価した。試験したスパイクタンパク質のパネルを表１５に示し、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質、Ｐ．１スパイクタンパク質、Ｂ．１．１．７スパイクタンパク質、及びＥ４８４Ｋ変異を含むＢ．１．１．７スパイクタンパク質を含めた。これらの中和アッセイの結果を、図２１Ｂ～２１Ｄに示す。２回の１μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３は、試験したスパイクタンパク質の各々に対する強力な中和抗体応答を誘発した（図２１Ｂ）。バリアントスパイクタンパク質、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、及びＥ４８４Ｋ変異を有するＢ．１．１．７の各々に対する中和力価は、Ｄ６１４Ｇ参照スパイクタンパク質に対する中和力価よりも約２倍低かった（図２１Ｂ～２１Ｃ）。しかしながら、ｍＲＮＡ－１２７３は、Ｄ６１４Ｇ、及びＥ４８４Ｋ変異を含有しないＢ．１．１．７スパイクタンパク質の両方に対してほぼ同等な中和力価を誘発した（図２１Ｂ～２１Ｃ）。２回の１μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、試験した全てのスパイクタンパク質に対する強力な中和抗体応答を誘発し、参照Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する力価よりも、少なくとも同等であるか、または最大２．３倍高いバリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体力価を有した（図２１Ｄ～２１Ｅ）。２回の１μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、試験した全てのスパイクタンパク質に対する強力な中和抗体応答を誘発した（図２１Ｆ）。Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対する中和抗体力価は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する力価よりも１６．５倍低かったが、血清は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質を含有するものよりもＢ．１．１．７スパイクタンパク質含有擬似ウイルスの中和では２．５倍有効であった。Ｅ４８４Ｋ変異は、この増加を部分的に無効にしたが、Ｂ．１．１．７＋Ｅ８４８４Ｋスパイクタンパク質に対する力価は、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対する力価とほぼ同等であり、顕著に低くなかった（図２１Ｇ）。

別の実験では、１日目（第１の用量、初回免疫）及び２２日目（第２の用量、ブースター）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする１μｇのｍＲＮＡ、具体的にはｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１混合物、各々０．５μｇ）（５０μＬ用量として製剤化）を、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。３６日目（第２の用量の１４日後）に得た血清を、各々異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現しているＶＳＶベースの擬似ウイルスのパネルに対する中和活性について評価した。試験したスパイクタンパク質は、１）Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質、２）Ｂ．１．３．５１スパイクタンパク質、３）ＣＡＬ２０．Ｃスパイクタンパク質、及び４）Ｐ．１スパイクタンパク質を含んでいた。これらの中和アッセイの結果を、図２１Ｈに示す。

各ｍＲＮＡ組成物は、試験したスパイクタンパク質の各々に対する強力な中和抗体応答を誘発した。２回用量のｍＲＮＡ－１２７３によって誘発された抗体は、参照Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質に対して最高の中和効果を有したが、バリアント（Ｂ．１．３５１、ＣＡＬ２０．Ｃ、及びＰ．１）スパイクタンパク質に対する中和力価は、約２倍のみ低く、大きく低減しなかった。ｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質に対して最も集中した応答を誘発し、他の（Ｄ６１４Ｇ、ＣＡＬ２０．Ｃ、及びＰ．１）スパイクタンパク質に対する中和力価は、３～５倍低かった。しかしながら、ｍＲＮＡ－１２７３とｍＲＮＡ－１２７３．３５１との両方の１：１混合物であるｍＲＮＡ－１２７３．２１１は、ｍＲＮＡによってコードされるＤ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１スパイクタンパク質の両方、ならびに試験した他のスパイクタンパク質に対する強力な中和抗体応答を誘発した。これらの結果は、ｍＲＮＡの投与が、コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する強力な中和抗体応答を誘発し、複数のｍＲＮＡを含有する多価ｍＲＮＡ組成物が、多様なウイルス抗原群に対する広範な応答の誘発に有用であることを示している。

実施例１８：マウスにおけるバリアントスパイクタンパク質に対する中和抗体を生成するためのバリアントスパイクタンパク質をコードする２回用量のｍＲＮＡによる免疫化
１日目（第１の用量、初回免疫）及び２２日目（第２の用量、ブースター）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、具体的には、ｍＲＮＡ－１２７３もしくはｍＲＮＡ－１２７３．３５１をコードする１μｇのｍＲＮＡ、またはＰＢＳ（対照として）を（５０μＬ用量として製剤化）、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの後肢に筋肉内投与した。

２回の１μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１でワクチン接種したマウスから３６日目に得た血清を、各々異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現しているＶＳＶベースの擬似ウイルスのパネルに対する中和活性について評価した。試験したスパイクタンパク質のパネルは、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質、ＣＡＬ．２０Ｃスパイクタンパク質、Ｐ．１スパイクタンパク質、Ｂ．１．５２６スパイクタンパク質、Ａ．２３．１スパイクタンパク質、Ｂ．１．５２５スパイクタンパク質、Ｂ．１．１．７スパイクタンパク質、Ｅ４８４Ｋ変異を含むＢ．１．１．７スパイクタンパク質、及びＢ．１．６１７．１スパイクタンパク質を含んでいた。これらの中和アッセイの結果を、図２２に示す。２回の１μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３またはｍＲＮＡ－１２７３．３５１は、試験したスパイクタンパク質の各々に対する強力な中和抗体応答を誘発した。

実施例１９－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡバリアントの免疫原性（第３の用量）
１日目及び２２日目に、１μｇの配列番号１８（ＷＨ２０２０＿ＮａｔＳＰ＿２Ｐ）でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した（ｎ＝８匹／群）。その後、５７日目にブースター用量（用量３、１μｇ）をマウスに投与した。ブースター用量は、ｍＲＮＡ－１２７３（配列番号１８）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（配列番号９）、もしくはｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２（配列番号２８）（一価ワクチン）；またはｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２、ｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、ｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．１、ｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．アンゴラ、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．アンゴラ、ｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２、ｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．アンゴラ、ｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２＋ｍＲＮＡ－１２７３．アンゴラ、もしくはｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２＋ｍＲＮＡ－１２７３．アンゴラ（１：１または１：１：１または１：１：１：１の比の多価ワクチン）で構成されていた。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有した。

３６、５６、及び７７日目に血液を回収し、ＥＬＩＳＡ及び本明細書に記載の中和アッセイによって分析した。３６日目（第２の用量後）及び７７日目（ブースター用量後）の結果を、以下の表１６に示しており、一価ワクチンの中でも、第２の用量のワクチン（ｍＲＮＡ－１２７３）の２週間後と比較して、ブースター用量の投与の３週間後に劇的な力価の増加を実証している。

分析した時点にわたり、多価ワクチンに関して同様の傾向が見られた（表１７）。

Ｄ６１４Ｇバリアント、Ｂ．１．３５１（ベータ）バリアント（Ｌ１８Ｆ－Ｄ８０Ａ－Ｄ２１５Ｇ－ΔＬＡＬ２４２－２４４－Ｒ２４６Ｉ－Ｋ４１７Ｎ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ－Ａ７０１Ｖ）、Ｐ．１（ガンマ）バリアント（Ｌ１８Ｆ－Ｔ２０Ｎ－Ｐ２６Ｓ－Ｄ１３８Ｙ－Ｒ１９０Ｓ－Ｋ４１７Ｔ－Ｅ４８４Ｋ－Ｎ５０１Ｙ－Ｄ６１４Ｇ－Ｈ６５５Ｙ－Ｔ１０２７Ｉ－Ｖ１１７６Ｆ）、及びＢ．１．６１７．２（デルタ）バリアント（Ｔ１９Ｒ－Ｇ１４２Ｄ－Ｅ１５６Ｇ－Ｆ１５７ｄｅｌ－Ｒ１５８ｄｅｌ－Ｌ４５２Ｒ－Ｔ４７８Ｋ－Ｄ６１４Ｇ－Ｐ６８１Ｒ－Ｄ９５０Ｎ）に対する中和抗体力価を、上記の方法を使用して、５６日目（第３の用量前）及び７７日目に測定した。５６日目のデータを、以下の表１８に示す。

ワクチン接種の２週間後に観察されたものと比較して、Ｄ６１４Ｇ（ＷＴ）ウイルスに対する力価は、ｍＲＮＡ－１２７３初回シリーズの１ヶ月後に減少した（３６日目には、Ｄ６１４ＧＧＭＴは、およそ１５，０００であった）。Ｄ６１４Ｇ（ＷＴ）と比較すると、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２では、中和力価に最高の低減（１２．５倍）が観察された。

以下の表１９～２５に示されるように、ブースターワクチン接種が、中和力価を増加させることが観察された。

上に実証されたように、中和力価は、ワクチン接種の２週間後に通常観察されるものよりも、マウスにおける初回シリーズの１ヶ月後に低く（Ｄ３６、Ｄ６１４Ｇ：約１５０００ＧＭＴ）、最高の倍数低減が、初回シリーズの後にＡ．ＶＯＩ．Ｖ２バリアントに対して見られた。Ｄ６１４Ｇ（ＷＴ）と比較すると、ベータ（Ｂ．１．３５１）、ガンマ（Ｐ．１）、及びデルタ（Ｂ．１．６１７．２）バリアントで、それぞれ約２．７、２．３、及び３．９倍の低減が観察された。ｍｕ（Ｂ．１．６２１）に対しては、Ｄ６１４Ｇと比較すると、約３．１倍の低減が見られた。

第３のブースター用量後、全てのワクチン構築物は、５６日目に観察されたものと比較して、全てのバリアントに対する中和力価に増加を生じた。バリアントワクチン構築物は、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンブースターよりも高い力価をもたらした。全体として、バリアントに対する力価の最高の増加は、二価ｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７併用ワクチンで観察された。ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２を含むワクチン製剤は、マウスにおいて一致したＢ．１．６１７．２擬似ウイルスに対して高い中和力価を与えた。マウスに二価、三価、及び四価のワクチンを投与した場合、異なるワクチン構築物を組み合わせることからの干渉は、中和力価では観察されなかった。

加えて、初回シリーズ後にバリアントに対して観察されたＤ６１４Ｇ（ＷＴ）の倍数減少は、第３のブースター用量後に低かった。例えば、ｍＲＮＡ－１２７３＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２及びｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２製剤は、他の製剤よりも高い倍数低減を示したが、しかしながら、これらの２つの群はまた、試験した各バリアントに対して最高の力価を生じた。ほとんど全てのブースターワクチンは、目的のバリアントまたは懸念されるバリアントと、Ｄ６１４Ｇ（ＷＴ）擬似ウイルスとの間で観察された力価のギャップを最小限に抑えることが可能であった。いくつかのブースターワクチン接種は、初回シリーズの１ヶ月後の結果よりも高い倍数低減をもたらしたが、ブースター投与後のＧＭＴは、依然として高いことが見出された。全体として、マウスにおけるｍＲＮＡ－１２７３．３５１＋ｍＲＮＡ－１２７３．６１７．２ワクチンの投与は、ベータ、デルタ、及びｍｕバリアントに対する倍数低下を減少させることが見出された。

選択されたワクチン製剤で実験を繰り返し、同様の結果が得られた。結果を以下に示す。

実施例２０：バリアントに対する中和活性（２回用量のｍＲＮＡ－１２７３）
実施例１３に記載されるように、２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３で、ヒト対象を免疫化した。図２３Ａは、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．６１７．１－ｖ１、Ｂ．１．６１７．１－ｖ２、及びＢ．１．６１７．２に対する、参加者から採取した血清の中和抗体力価を示す。図２３Ｂは、Ｄ６１４Ｇと比較して、中和抗体力価に相対的な減少を示している。第２の用量の投与の１ヶ月及び６～８ヶ月後に、Ｄ６１４、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、及びＢ．１．６１７に対する中和抗体を測定した。図３１Ａに見ることができるように、プロトタイプ株に対する力価は、１ヶ月後に高く、Ｂ．１．３５１バリアント（１２．２倍）及びＰ．１バリアント（５．３倍）の両方に対して有意な低減が見られた。初回シリーズの６～８ヶ月後、中和抗体は、減少した－元のＤ６１４Ｇウイルスに対して６．６倍低く、Ｂ．１．３５１及びＰ．１に対する力価は、プロトタイプ株ウイルス（Ｄ６１４Ｇ）に対する初回シリーズの後に測定したピーク力価に対して、３０～５４倍低減した（図３１Ｂ）。

さらなる研究では、以下のウイルス株：Ｄ６１４Ｇ擬似ウイルス（２０２０年の優勢株）、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．１．７＋Ｅ４８４Ｋ、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｐ．１、Ｂ．１．３５１－ｖ１、Ｂ．１．３５１－ｖ２、Ｂ．１．３５１－ｖ３、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．６１７．１－ｖ１、Ｂ．１．６１７．１－ｖ２、Ｂ．１．６１７．２、Ａ．２３．１－ｖ１、Ａ．２３．１－ｖ２、Ｂ．１．５２５、及びＡ．ＶＯＩ．Ｖ２に対して、血清の中和活性を測定した。第１相ｍＲＮＡ－１２７３臨床試験からの血清（８人の参加者、用量２の１週間後）を、各バリアントに対して評価した。結果は、Ｄ６１４Ｇと比較して、Ｂ．１．１．７及びＡ．２３．１－ｖ１に対する中和力価に対する最小限の効果を示した（データは示さず）。対照的に、調べた全ての他のバリアントは、Ｄ６１４Ｇと比較して、減少した中和力価を示したが、全ては、ｍＲＮＡ－１２７３が誘発する血清中和に対して完全に感受性のままであったが、力価は低減した。これらのバリアントの中和力価の低減は、Ｄ６１４Ｇと比較して、２．１～８．４倍の範囲であり、Ａ．ＶＯＩ．Ｖ２及びＢ．１．３５１－ｖ３（それぞれＤ６１４Ｇと比較して、８．０倍及び８．４倍の低減）で観察された中和に対して最高の効果を有した。

実施例２１．第３の用量（ブースター）後のバリアントに対する中和
実施例１３に記載されるように、２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３で、ヒト対象を免疫化した。第３の用量を、初回ワクチン接種が完了した６～８ヶ月後に投与した。Ｂ．１．３５１及びＰ．１に対する中和力価を、経時的に測定した。結果を図３２に示す。ブースター用量（ｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１）は、野生型（Ｄ６１４Ｇ）及び試験した２つのバリアント（Ｂ．１．３５１及びＰ．１）の両方に対して驚くべき様式で中和抗体を増加させることが見出された。

さらなる懸念されるバリアント及び目的のバリアントをスクリーニングした。図３３Ａ～３３Ｃに見ることができるように、ブースターショットは、同様に、各バリアントを中和することが見出された。３つのブースターショットのうちの１つの投与からもたらされる中和力価の比較を、図３４に示す。ｍＲＮＡ－１２７３．２１１は、試験した全てのバリアントに対して、２つの他のブースターショット戦略を上回ることが見出された。

実施例２２．成人におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントｍＲＮＡブースターの安全性及び免疫原性
ＷＡ１／２０２０単離物の事前融合安定化Ｓタンパク質をコードする脂質ナノ粒子カプセル化メッセンジャーＲＮＡワクチンであるｍＲＮＡ－１２７３は、成人における第１相（ＮＣＴ０４２８３４６１）及び第２相（ＮＣＴ０４４０５０７６）試験での抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫応答、許容可能な安全性プロファイル、ならびに３０，０００人超の参加者における第３相コロナウイルス有効性（ＣＯＶＥ）（ＮＣＴ０４４７０４２７）試験における症候性Ｃｏｖｉｄ－１９疾患に対する９４％の有効性を実証した。ワクチンは、米国食品医薬品局を含むいくつかの世界的な規制機関から承認を受けた。ワクチンは、Ｃｏｖｉｄ－１９の症状及び重篤な合併症を低減するのに非常に有効であるが、Ｓタンパク質に変化を有するいくつかのウイルスバリアントが生じており、そのうちのいくつかは、懸念されるバリアント（ＶＯＣ）：アルファ［Ｂ．１．１．７］、ベータ［Ｂ．１．３５１］、ガンマ［Ｐ．１］、及びデルタ［Ｂ．１．６１７．２］として同定されている。いくつかのＣｏｖｉｄ－１９ワクチンに対する有効性の低減が、Ｂ．１．３５１及びより最近のＢ．１．６１７．２に対して報告されている。

本明細書に記載されるのは、第２相試験におけるｍＲＮＡ－１２７３（５０μｇ）、Ｂ．１．３５１（ベータバリアント）のスパイクタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（２０または５０μｇ）、及び多価ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（ｍＲＮＡ－１２７３［２５μｇ］とｍＲＮＡ－１２７３．３５１［２５μｇ］との１：１ミックス）の単一ブースター用量の予備安全性及び免疫原性である。

結果
試験集団
第２相試験は、合計６６０人の参加者で構成された。研究の盲検化及びパートＢの実施時に、元々２回の初回刺激用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３を受けた１８６人の参加者のうちの２０人を、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３の単回ブースター用量を受けるための来院評価の完了及び試料利用可能性に基づいてランダムに選択した。５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（パートＣ、コホート１）、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（パートＣ、コホート２）、または２０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１（パートＣ、コホート３）の単一ブースター用量を受ける、１４，７１１人の参加者のうちの６０人、１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３の２回の初回刺激用量を受けた１２人を選択した。

プロトタイプまたは修飾ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンのブースター用量を受けた４群の参加者のベースライン人口統計学的特徴は、概して同様であった（表２６）。参加者のうちのほとんどは白人であり、ヒスパニックまたはラテン系ではなかった。ｍＲＮＡ－１２７３（５０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（２０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（５０μｇ）、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１のブースターを受けた参加者の平均年齢は、それぞれ６３．８歳、４７．５歳、５３．９歳、及び５５．６歳であった。初回シリーズにおけるｍＲＮＡ－１２７３の第２の用量と、ｍＲＮＡ－１２７３（５０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（２０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（５０μｇ）、またはｍＲＮＡ－１２７３．２１１（５０μｇ）のブースターとの間の持続期間（平均［ＳＤ］）は、それぞれ６．７［０．５］、６．２［０．３］、６．２［０．３］、及び６．２［０．４］ヶ月であった。

ブースター用量直前及び直後の野生型Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１に対する中和応答
ｍＲＮＡ－１２７３の初回シリーズの約６ヶ月後であるが、ブースター用量（Ｄ１）の直前に回収した試料において、ならびに臨床的に検証されたレンチウイルスＰｓＶＮアッセイにおいてブースター用量後の１５日目（Ｄ１５）または２９日目（Ｄ２９）に回収した試料において、野生型Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１の中和を測定した。野生型Ｄ６１４Ｇウイルスは、パートＢ及びパートＣコホート１、２、及び３の参加者からブースター前に回収した試料によって中和された（図３５Ａ）一方で、パートＣコホート１、２、及び３の参加者からのＢ．１．３５１の中和は、追加免疫前には低いかまたは検出不可能であった（図３５Ｂ）。

ブースター用量後、パートＢ参加者から２９日目（ｍＲＮＡ－１２７３ブースター）、またはパートＣコホート１、２、及び３から１５及び２９日目（それぞれ、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１、５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１、及び２０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１ブースター）に、参加者の血清を回収した。野生型Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ウイルスの中和は、各ブースター用量後に有意に増加した。ｍＲＮＡ－１２７３（５０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（５０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（５０μｇ）、及びｍＲＮＡ－１２７３．３５１（２０μｇ）コホートにおいてそれぞれ、Ｄ２９に、野生型Ｄ６１４Ｇウイルスに対して１６．７、１１．３、４６．４、及び９．２倍高いＧＭＴが測定された。ｍＲＮＡ－１２７３．３５１（５０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（５０μｇ）、及びｍＲＮＡ－１２７３．３５１（２０μｇ）コホートにおいてそれぞれ、Ｄ２９に、Ｂ．１．３５１バリアントに対して３４．９、６１．６、及び３３．７倍高いＧＭＴが測定された。加えて、野生型Ｄ６１４ＧまたはＢ．１．３５１ウイルスに対する測定可能な力価を有さなかった参加者は、初回シリーズの約６ヶ月後、追加免疫前に、全員が追加免疫後に有意な力価を回復した。

臨床的に検証されたレンチウイルスＰｓＶＮアッセイと研究グレードのＶＳＶベースのＰｓＶＮアッセイとの相関
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対するパートＢ及びパートＣコホート１及び２臨床試料の探索的分析を支持するために、以前にｍＲＮＡ－１２７３中和に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの影響を評価するために使用した研究グレードのＶＳＶベースのＰｓＶＮアッセイで、参加者試料を分析した。臨床的に検証された研究グレードの野生型Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．３５１ＰｓＶＮアッセイからの結果の分析は、Ｄ１及びＤ１５試料からの結果の分析において、野生型Ｄ６１４Ｇに対するｒ＝０．９１６０及びＢ．１．３５１に対する０．９４１１の有意な相関を実証している（図３６Ａ～３６Ｂ）。

野生型Ｄ６１４Ｇ及びＶＯＣ初回シリーズワクチン接種後の中和応答の動態の探索的分析
ＶＳＶベースのＰｓＶＮアッセイを使用して、初回ｍＲＮＡ－１２７３ワクチン接種シリーズの後に回収した試料の探索的分析を実施した。初回２回用量シリーズの２８日後、野生型Ｄ６１４Ｇ中和抗体ＧＭＴは、ｍＲＮＡ－１２７３では１２１０、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１では２２１３、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１コホートでは１３９７であり（図３７Ａ～３７Ｄ）、Ｂ．１．３５１（１３～１７倍）及びＰ．１バリアント（５～７倍）の両方に対して有意な低減が見られた。ｍＲＮＡ－１２７３の第２の用量のおよそ６ヶ月後、初回シリーズの１ヶ月後にＤ６１４Ｇウイルスに対して測定されたピーク力価と比較して、中和抗体ＧＭＴは、さらに減少した。野生型Ｄ６１４Ｇに対する力価は、６～７倍低かったが、Ｂ．１．３５１及びｐ．１バリアントに対する力価は、２４～６９倍低かった。パートＢ及びＣコホート１及び２からの組み合わせた試料のおよそ４４％及び３０％は、Ｂ．１．３５１及びＰ．１ウイルスバリアントに対するアッセイＬＬＯＱを下回っていた。

Ｂ．１．３５１及びＰ．１と同様に、Ｂ．１．６１７．２バリアントの中和は、初回シリーズの完了６ヵ月後に大幅に低減した。ｍＲＮＡ－１２７３のブースター用量前に回収したパートＢコホートのランダムサブセットからの血清は、同じ時点で測定された野生型Ｄ６１４Ｇ中和力価に対して、Ｂ．１．６１７．１及びＢ．１．６１７．２に対して５～６倍の低減を示し、１１試料中の５試料における中和は、Ｂ．１．６１７．２に対するアッセイＬＬＯＱを下回った（図３８Ａ）。

ブースターからの野生型Ｄ６１４Ｇウイルス及びＶＯＣに対する中和応答の探索的分析
ブースター用量の１５日後に回収した試料からの力価を、ｍＲＮＡ－１２７３初回シリーズの第２の用量の２８日後に回収した試料から測定されたピーク力価に対して比較するために、ＶＳＶベースのＰｓＶＮアッセイで野生型Ｄ６１４Ｇウイルス中和力価を測定した。追加免疫後、野生型ウイルス中和ＧＭＴは、初回シリーズワクチン接種の２８日後のピーク力価と比較して、ｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１ブースターからそれぞれ、３．８、１．７、及び４．４倍高かった（図３７Ａ～３７Ｄ）。ＶＯＣまたはＶＯＩに対して、ブースター戦略の各々は、初回シリーズの後に測定されたものと比較して、バリアント特異的中和力価を有意に増加させた。ｍＲＮＡ－１２７３．２１１は、初回シリーズの後に測定されたＤ６１４Ｇ株に対するＧＭＴレベルを上回ってＢ．１．３５１及びＰ．１の両方の中和力価を増加させ、ＧＭＴ力価は、ブースター用量の２週間後のパートＣコホート２の参加者において、Ｂ．１．３５１に対して１４６８、及びＰ．１に対して１９７３まで増加した。

初回シリーズＧＭＴベンチマークと比較したＶＯＣに対するブースター応答の探索的分析
ＶＳＶＰｓＶＮアッセイを使用して、初回シリーズの２８日後に回収したＣＯＶＥ研究試料を評価して、ＧＭＴベンチマークを確立した。このベンチマークを使用して、ブースターが、有効性が実証されたピボタル研究で示されたのと同じ中和レベル、すなわち、９４％の有効性が測定されたＤ６１４Ｇアッセイで見られた、ＧＭＴ比（ＧＭＴｒ）≧１．１２によって示されるレベルまで達するかどうかを決定した。パートＣでは、ＣＯＶＥ研究からの５７日目の初回シリーズ参加者試料（ｎ＝５９）では、２０４５のＧＭＴがＤ６１４Ｇ中和ベンチマークとして確立され、コホート当たりのＧＭＴは、１３９７～２７５８の範囲であった（図３７Ａ～３７Ｄ）。

バリアントのパネルに対して、それぞれのブースター用量の２週間後に回収した試料を評価すると（図２４Ａ～２４Ｂ、３８Ｂ～３８Ｄ）、各ｍＲＮＡブースターは、Ｂ．１．６１７．２及びＰ．１を含む評価された全てのバリアントに対して中和を有意に増加させ、バリアントのうちのいくつかに対する中和は、ＣＯＶＥ研究野生型Ｄ６１４ＧＧＭＴベンチマークに近づいたか、またはそれを超えた。評価した３つのブースターワクチンのうち、多価ｍＲＮＡ－１２７３．２１１ブースターは、ＶＯＣの大部分に対してＧＭＴに最大の増加を示した（図２４Ａ～２４Ｂ、３８Ａ～３８Ｄ）。

ＣＯＶＥ研究Ｄ６１４Ｇベンチマークと比較して、ブースターワクチンは、ＧＭＴｒ上昇≧１に基づく、野生型Ｄ６１４Ｇウイルス及びＢ．１．６１７．２を含むいくつかのＶＯＣまたはＶＯＩに対するより高いＧＭＴをもたらした（図３８Ｂ～３８Ｄ）。しかしながら、多価バリアントワクチンｍＲＮＡ－１２７３．２１１のみが、評価した全てのＶＯＣに対して１超のＧＭＴｒ上昇を達成した。３つのブースターのうち、多価ｍＲＮＡ－１２７３．２１１の５０μｇブースターはまた、Ｄ５７Ｄ６１４Ｇベンチマークに対して、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．６１７．１、及びＢ．１．６１７．２を含む最大数のバリアントに対して、より高いバリアントＧＭＴをもたらした。全体的なＣＯＶＥＧＭＴＤ６１４Ｇベンチマークに対するＧＭＴの比較を、図３９Ａ～３９Ｂに示す。

考察
この予備評価は、約６ヶ月前にｍＲＮＡ－１２７３の承認された用量及びスケジュールでワクチン接種を受けた８０人の参加者のサブセットにおける、ｍＲＮＡ－１２７３の抗体持続性、ならびにｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１のブースター用量の投与について記載する。野生型Ｄ６１４Ｇに対する抗体力価は、初回シリーズの第２の用量の１ヶ月後にピークに達し、その後、ブースター用量の送達前の次の５ヶ月にわたって減少した。これらの結果は、第２の用量のｍＲＮＡ－１２７３の最大６ヶ月後まで中和抗体レベルの監視を実施した、レンチウイルスＰｓＶＮアッセイで報告されたものと一致する。初回シリーズの７日後に回収した試料に対して測定したものよりも高いレベルまでの、初回シリーズワクチン接種の２８日後のＢ．１．３５１及びＰ．１に対する中和抗体の低減が明らかであり、Ｂ細胞のさらなる親和性成熟及び利用可能な抗体レパートリーの変化に起因する可能性が高い。初回ワクチン接種の約６ヶ月後の中和抗体の検出可能なレベルのさらなる低減または完全な喪失は、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、及びＢ．１．６１７．２に対して明らかであった。

５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３、２０または５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１、及び５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３．２１１ブースターの単回注射後の安全性プロファイルは、概して、以前に報告された第２相及び第３相研究におけるｍＲＮＡ－１２７３の第２の用量後に観察されたものと同様であった。

ｍＲＮＡ－１２７３、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１でのブースターワクチン接種が、強力な既往反応を誘導し、ｍＲＮＡワクチンによって生成される強力なＢ細胞記憶が迅速かつ強力に増強され得ることが確認された。ブースター用量後、野生型Ｄ６１４Ｇ株に対して高い中和力価が測定され、初回シリーズ後のピーク力価よりも最大４．４倍高かった。重要なＶＯＣ、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、及びＢ．１．６１７．２を含むバリアントウイルスに対して増加したＶＳＶＰｓＶＮ力価が測定され、いくつかのバリアントに対する力価は、野生型Ｄ６１４Ｇウイルスに対する初回シリーズ後、特にｍＲＮＡ－１２７３．２１１で追加免疫した後に測定されたものに近づいたか、またはそれを越えた（図３７Ｃ）。ＶＯＣに対する力価の増加は、ブースター用量の組成に関係なく、２回用量の初回シリーズのｍＲＮＡ－１２７３後に、抗体のさらなる成熟が実現可能であることを示唆している。加えて、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１及びｍＲＮＡ－１２７３．２１１での追加免疫は、ｍＲＮＡ－１２７３での追加免疫よりも、Ｂ．１．３５１バリアントに対する中和を増加させることにおいてより効果的であるように見えた。

有効性が確立された第３相ＣＯＶＥ研究で測定されたＧＭＴ力価と比較するために、追加の分析を支持するために使用した野生型Ｄ６１４Ｇアッセイ力価を用いるＶＳＶＰｓＶＮアッセイで、５９人のＣＯＶＥ参加者試料を評価した。ｍＲＮＡブースターは、各々、Ｂ．１．６１７．２及びＰ．１を含む評価された全てのバリアントに対して有意に中和が増加し、バリアントのうちのいくつかに対する中和は、ＣＯＶＥ研究ベンチマークに近づいたか、またはそれを超えた。多価ｍＲＮＡ－１２７３．２１１の５０μｇブースターは、全てのＶＯＣに対して１以上のＧＭＴｒ上昇をもたらし（図３８Ｄ）、ブースター後のバリアント中和ＧＭＴは、初回シリーズ後のピーク野生型ウイルスＧＭＴを超え、潜在的に、ＶＯＣまたはＶＯＩに対する網羅の幅が増加していることを示している。

方法
研究デザイン
５０または１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３の２回用量後の、米国予備安全性及び免疫原性結果における第２相ｍＲＮＡ－１２７３Ｐ２０１研究（ＮＣＴ０４４０５０７６）では、８つの施設に成人を登録した。Ｃｏｖｉｄ－１９に対するｍＲＮＡ－１２７３の初回有効性エンドポイントが第３相ＣＯＶＥ試験で満たされ、ＥＵＡが付与されると、第２相及び第３相試験プロトコルの両方が修正されて、研究が非盲検相へと移行した。第２相研究は、パートＡで２回用量（５０または１００μｇ）のｍＲＮＡ－１２７３で以前に初回免疫された参加者に、パートＢで５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３の単一ブースターを受ける選択肢を提供したが、しかしながら、この分析には、２回用量の１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３で初回免疫された２０人の個人のみが含まれた。パートＣを第２相研究に追加し、２０もしくは５０μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３．３５１または５０μｇの多価ｍＲＮＡ－１２７３．２１１のいずれかの単一のブースターを受ける、１００μｇのｍＲＮＡ－１２７３の２回用量シリーズを完了した第３相ＣＯＶＥ試験からの単一施設の参加者を登録した。

試験参加者
適格な参加者は、スクリーニング時に健康であると調査員によってみなされた１８歳以上の成人であり、８つの参加研究施設のうちの１つに登録した。パートＢでｍＲＮＡ－１２７３の５０μｇの単回ブースター用量を受けた２０人のパートＢ参加者を、このサブ研究分析のためにランダムに選択した。パートＣの参加者は、ｍＲＮＡ－１２７３第３相ＣＯＶＥ研究に以前に登録されており、その研究のパートＡで２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を受けており、Ｐ２０１研究のパートＣに登録される少なくとも６ヶ月前に第２の用量を受けていなければならない。６０人の参加者を順次登録して、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１を５０μｇ、ｍＲＮＡ－１２７３－２１１を５０μｇ、またはｍＲＮＡ－１２７３．３５１を２０μｇ（２０人／群）投与した。

試験ワクチン
ｍＲＮＡ－１２７３のように、ｍＲＮＡ－１２７３．３５１ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ．１．３５１バリアントのＳタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ－１２７３．２１１は、５０μｇのｍＲＮＡの総用量として、２５μｇのｍＲＮＡ－１２７３と２５μｇのｍＲＮＡ－１２７３．３５１との１：１ミックスであった。以前に記載されているように、全てのワクチンは、脂質ナノ粒子内に製剤化した。

安全性評価
参加者は、応答した全身及び局所有害反応、毎日の口腔体温、注射部位の紅斑及び腫れ／硬結を記録するために、ブースター後７日間、電子日記を完了した。訓練された施設担当者が、参加者を呼び出して、４週間ごとに安全性を評価した。

免疫原性評価
８０人の参加者のこのサブ研究分析では、ブースターワクチン接種の直前（１日目）、ならびにブースターワクチン接種後８、１５、２９、５７、及び１８１日目に、初回ワクチン接種シリーズの２８日後に試料を回収した。この予備分析では、初回シリーズの２８日後、ブースター用量直前、ならびにブースターの１５及び２９日後に回収した血清の中和結果が提供される。第２相及び第３相（ＣＯＶＥ）試験からの試料を試験するために使用した臨床的に検証されたレンチウイルスＰｓＶＮアッセイを使用して、それぞれ、ブースター直前（Ｄ１）、ならびにＤ１５及びＤ２９に回収した試料を分析した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのパネルにわたる探索的分析を可能にするために、ｍＲＮＡ－１２７３の第２の用量の７日後に回収した血清に対するバリアントからの中和の影響を評価するために以前使用した研究グレードの組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベースの擬似ウイルスアッセイを使用して、中和抗体力価について血清を分析した。このアッセイでは、Ｄ６１４Ｇ変異（野生型Ｄ６１４Ｇ）を有するプロトタイプＷＡ１／２０２０単離物のＳタンパク質またはバリアントからのＳタンパク質をコードする。ＶＳＶＰｓＶＮ中和アッセイは、臨床的に検証されたレンチウイルスＰｓＶＮアッセイとの強い相関及び一致を実証している（図３６Ａ～３６Ｂ）。

統計分析
幾何平均力価（ＧＭＴ）及び幾何平均倍数上昇（ＧＭＦＲ）は、対数変換された力価に基づいて、９５％信頼区間（ＣＩ）は、それぞれ、対数変換された力価のｔ分布またはＧＭＴ及びＧＭＦＲの対数変換された力価の差に基づいて計算し、次いで、元の尺度に変換した。初回シリーズの２８日後に回収したＣＯＶＥ研究参加者の血清の分析を使用して、追加免疫後のＧＭＴ比を導出するためにさらに使用するＧＭＴベンチマークを確立した。ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定を使用して、結果を比較した。アッセイ相関には、Ｓｐｅａｒｍａｎノンパラメトリック相関を使用した。

実施例２３－バリアントブースター研究
実施例１３に記載されるように２回用量のｍＲＮＡ－１２７３（各々、５０μｇの２回用量または１００μｇの２回用量のいずれか）を、対象に投与した。ブースター用量は、少なくとも６ヶ月後に投与した。試験したブースター用量は、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（５０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（１００μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３（１００μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．６１７、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１３（１００μｇ用量：５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３及び５０μｇの１２７３．６１７、配列番号２８）を含む。ブースター用量の安全性及び免疫原性を調べた。特に、２９日目（ブースター投与後）の結果を、実施例２２に記載の結果と比較した。２回の１００μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３（Ｐ３０１）のみを受けた対象に関する結果を以下の表２７に示し、ブースター用量が、２回の１００μｇ用量のｍＲＮＡ－１２７３（Ｐ３０１）のみを受けた対象と比較して、幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルが増加させたことを実証している。ブースター用量はまた、用量２の２９日目よりも有意に高い中和抗体を誘導した（例えば、ブースターは、ブースター前の力価を上回って１７倍の増加をもたらした）。ブースター力価は、若年成人コホートと高齢成人コホートとの間で同等であった。

上記のＶＳＶアッセイを使用して、より広範な懸念されるバリアントに対する中和力価を経時的に調べることによって、試料をさらに分析した。結果を図４０に示す。ブースター用量（ｍＲＮＡ－１２７３、５０μｇ）は、野生型（Ｄ６１４Ｇ）及び試験した３つのバリアント（Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｐ．１（ガンマ）、及びＢ．１．６１７．２（デルタ））に対する中和抗体を増加させることが見出された。祖先株（図４０の「ＷＴ」）に対する中和力価は、ＧＭＴを上回ったままであったが、ＧＭＴは、懸念されるバリアントに対して、用量２の６ヶ月後までに実質的に減少した。ブースターは、試験した全てのウイルスについてＧＭＴを増加させ、用量２からブースター用量（用量３）までの倍数上昇は、Ｄ６１４Ｇ（野生型）ウイルスに対して２３．２倍からガンマバリアントに対して４３．６倍までの範囲であった（図４０）。

実施例２４－第２／３相バリアントブースター研究
実施例１３に記載されるように、２回用量のｍＲＮＡ－１２７３を対象に投与する。ブースター用量を、６～８ヶ月後に投与する。試験したブースター用量は、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（５０μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．２１１（１００μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３（１００μｇ）、ｍＲＮＡ－１２７３．６１７、及びｍＲＮＡ－１２７３．２１３（１００μｇ用量：５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３及び５０μｇの１２７３．６１７、配列番号２８）を含む。いくつかの研究では、３つの異なる用量のｍＲＮＡ－１２７３．２１３：２５μｇ（１２．５μｇのｍＲＮＡ－１２７３＋１２．５μｇの１２７３．６１７）、５０μｇ（２５μｇのｍＲＮＡ－１２７３＋２５μｇの１２７３．６１７）、及び１００μｇ（５０μｇのｍＲＮＡ－１２７３＋５０μｇの１２７３．６１７）を試験する。エンドポイントは、免疫原性及び投薬の安全性である。

実施例２５－オミクロン関連ワクチンの免疫原性
１日目及び２２日目に、１μｇまたは０．１μｇのｍＲＮＡ－１２７３（配列番号１８）、ｍＲＮＡ－１２７３．５２９（ｍ－ｍｕ）（配列番号４０）、ｍＲＮＡ－１２７３．５２９（ＰＢＳｋｏ＿一致）（配列番号３７）、ｍＲＮＡ－１２７３．５２９．ＩＤＲ１４Ａ（配列番号４３）、またはｍＲＮＡ．５２９．ＩＤＲ１４Ｂ（配列番号４５）（ｎ＝８匹／群）で、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化した。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有した。

第２の用量の１日前（２１日目）に血液を回収し、血清及び脾臓試料を３６日目に採取し、ＥＬＩＳＡ及び本明細書に記載の中和アッセイによって分析する。ＥＬＩＳＡを実施して、２１日目に回収した試料からのＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０単離物アミノ酸配列を有する親ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な総ＩｇＧ、及びＢ．１．１．５２９（オミクロンバリアント）に特異的なＩｇＧを定量化した。

親ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及びＢ．１．５２９に関する抗体力価を、以下の表２８に示す。

表２８に示されるように、両方の投薬量レベルのｍＲＮＡ－１２７３群と比較して、Ｂ．１．５２９特異的ワクチンを投与した群では、Ｂ．１．５２９ＩｇＧ抗体力価が増加した。

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３６Ｗｕ，Ｋ．ｅｔａｌ．ＳｅｒｕｍＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙＥｌｉｃｉｔｅｄｂｙｍＲＮＡ－１２７３Ｖａｃｃｉｎｅ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｃ２１０２１７９（２０２１）．
３７Ｎｏｖａｖａｘ（２０２１）．ＮｏｖａｖａｘＣＯＶＩＤ－１９ＶａｃｃｉｎｅＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ８９．３％ＥｆｆｉｃａｃｙｉｎＵＫＰｈａｓｅ３Ｔｒｉａｌ．ＰｒｅｓｓＲｅｌｅａｓｅＪａｎｕａｒｙ２８，２０２１：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｒ．ｎｏｖａｖａｘ．ｃｏｍ／ｎｏｄｅ／１５５０６／ｐｄｆ
３８Ｋ，Ｅ．ｅｔａｌ．ＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＣｈＡｄＯｘ１ｎＣｏＶ－１９（ＡＺＤ１２２２）ｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｖａｒｉａｎｔｏｆｃｏｎｃｅｒｎ２０２０１２／０１（Ｂ．１．１．７）：ａｎｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｒａｎｄｏｍｉｓｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２１）００６２８－０（２０２１）．
３９Ｐｆｉｚｅｒ（２０２１）ＰｆｉｚｅｒａｎｄＢｉｏＮＴｅｃｈｃｏｎｆｉｒｍｈｉｇｈｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｎｏｓｅｒｉｏｕｓｓａｆｅｔｙｃｏｎｃｅｒｎｓｔｈｒｏｕｇｈｕｐｔｏｓｉｘｍｏｎｔｈｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｅｃｏｎｄｄｏｓｅｉｎｕｐｄａｔｅｄｔｏｐｌｉｎｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌａｎｄｍａｒｋＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｓｔｕｄｙ．ＰｒｅｓｓＲｅｌｅａｓｅＡｐｒｉｌ１，２０２１：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｆｉｚｅｒ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ－ｄｅｔａｉｌ／ｐｆｉｚｅｒ－ａｎｄ－ｂｉｏｎｔｅｃｈ－ｃｏｎｆｉｒｍ－ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃａｃｙ－ａｎｄ－ｎｏ－ｓｅｒｉｏｕｓ．
４０Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｋ．Ｓ．ｅｔａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｄｅｓｉｇｎｅｎａｂｌｅｄｂｙｐｒｏｔｏｔｙｐｅｐａｔｈｏｇｅｎｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ．Ｎａｔｕｒｅ５８６，５６７－５７１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２６２２－０（２０２０）．
４１Ｈｏ，Ｄ．ｅｔａｌ．ＩｎｃｒｅａｓｅｄＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶａｒｉａｎｔｓＢ．１．３５１ａｎｄＢ．１．１．７ｔｏＡｎｔｉｂｏｄｙＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＲｅｓＳｑ，ｄｏｉ：１０．２１２０３／ｒｓ．３．ｒｓ－１５５３９４／ｖ１（２０２１）．
４２Ｗｒｏｂｅｌ，Ａ．Ｇ．ｅｔａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ａｎｄｂａｔＲａＴＧ１３ｓｐｉｋｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｆｏｒｍｏｎｖｉｒｕｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｆｕｒｉｎ－ｃｌｅａｖａｇｅｅｆｆｅｃｔｓ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ２７，７６３－７６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９４－０２０－０４６８－７（２０２０）．
４３Ｌａｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｓｐｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｂｏｕｎｄｔｏｔｈｅＡＣＥ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ５８１，２１５－２２０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２１８０－５（２０２０）．
４４Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＩｍｐａｃｔｏｆｍＲＮＡｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｏｎｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＳｃｉＡｄｖ６，ｅａａｚ６８９３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｚ６８９３（２０２０）．
４５Ｈａｓｓｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｉｐｉｄＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒＩｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｍＲＮＡＶａｃｃｉｎｅｓ．ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ１５，１－１１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１９．０１．０１３（２０１９）．
４６Ｊｏｈｎ，Ｓ．ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉ－ａｎｔｉｇｅｎｉｃｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｓｔｈａｔｅｌｉｃｉｔｐｏｔｅｎｔｈｕｍｏｒａｌａｎｄｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ３６，１６８９－１６９９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１８．０１．０２９（２０１８）．
４７Ｂａｈｌ，Ｋ．ｅｔａｌ．ＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｂｙｍＲＮＡＶａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔＨ１０Ｎ８ａｎｄＨ７Ｎ９ＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓｅｓ．ＭｏｌＴｈｅｒ２５，１３１６－１３２７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０３．０３５（２０１７）．
４８Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｂ．ｅｔａｌ．Ｓｅｌｆ－ＡｍｐｌｉｆｙｉｎｇＲＮＡＶａｃｃｉｎｅｓＧｉｖｅＥｑｕｉｖａｌｅｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＩｎｆｌｕｅｎｚａｔｏｍＲＮＡＶａｃｃｉｎｅｓｂｕｔａｔＭｕｃｈＬｏｗｅｒＤｏｓｅｓ．ＭｏｌＴｈｅｒ２６，４４６－４５５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．１１．０１７（２０１８）．
４９Ｗｈｉｔｔ，Ｍ．Ａ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＶＳＶｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤｅｌｔａＧ－ＶＳＶｆｏｒｓｔｕｄｉｅｓｏｎｖｉｒｕｓｅｎｔｒｙ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｔｒｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ａｎｄｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｖａｃｃｉｎｅｓ．ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ１６９，３６５－３７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２０１０．０８．００６（２０１０）．

追加の配列
本明細書に記載のｍＲＮＡ配列のうちのいずれかが、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることが理解されるべきである。ＵＴＲ配列は、以下の配列から選択してもよいが、他の既知のＵＴＲ配列を使用してもよい。また、本明細書に記載のｍＲＮＡ構築物のうちのいずれかは、ポリ（Ａ）テール及び／またはキャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）をさらに含み得ることが理解されるべきである。さらに、本明細書に記載のｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列のうちの多くが、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されたシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが、異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグに置換されても、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグが省略されてもよいことが理解されるべきである。
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号５０）
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号２）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号５１）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号４）

同義語
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が示される主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合において、それは書類の全体を包含し得る。

本明細書において、明細書中及び請求項中の「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解すべきである。また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されないことも理解されたい。

特許請求の範囲、ならびに上の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ）」などの全ての移行句は、無制限、すなわち、含むが限定されないと意味すると理解されたい。「～からなる」「～から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。

数値の手前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。

値の範囲が提供される場合、範囲の上端と下端との間の、及びそれらを含む各値が具体的に企図され、本明細書に記載される。

Claims

方法であって、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、前記対象が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを以前に投与されたことがあり、
前記第１及び前記第２の２Ｐ安定化スパイク抗原の各々が、前記第１の抗原及び前記第２の抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、前記第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、前記方法。
方法であって、
第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチンを対象に投与することと、
第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを前記対象に投与することと、を含み、
前記第１及び第２の安定化スパイク抗原をコードする前記核酸の各々が、前記それぞれのコードされた抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１のコードされたスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、
前記第１のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表し、前記第２のコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表す、前記方法。
前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、前記第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが対象集団に存在する期間中に検出された、免疫優性出現株または懸念されるバリアントである、請求項１または２に記載の方法。
前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、少なくとも１年以内に対象集団において検出可能である、請求項１または２に記載の方法。
前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、同じ季節中に対象集団において検出可能である、請求項１または２に記載の方法。
前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及び前記第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、同じパンデミックまたはエンデミックの間、対象集団において検出可能である、請求項１または２に記載の方法。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする前記第１の核酸が、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１及び前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、パンデミックの翌年の間、対象集団において検出可能である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項７または８に記載の方法。
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項９に記載の方法。
第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする前記核酸が、第２の核酸であり、かつメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクチンが、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする前記核酸を、複数の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを表す１つ以上の追加のスパイクタンパク質をコードする核酸と組み合わせて含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクチンが、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする前記核酸を、スパイクタンパク質をコードする核酸ではない１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする１つ以上の追加の核酸と組み合わせて含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫応答が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体応答である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫応答が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞応答である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
２回用量の前記組成物を前記対象に投与することを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記第１及び前記第２の抗原が、初回免疫用量として一緒に前記対象に投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の抗原が、初回免疫用量として前記対象に投与され、前記第２の抗原が、追加免疫として前記対象に投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の抗原が、初回免疫用量として前記対象に投与され、前記第１の抗原が、追加免疫として前記対象に投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１及び前記第２の抗原が、追加免疫として一緒に前記対象に投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の抗原が、初回免疫用量として、及び追加免疫として前記対象に投与されて、ワクチン接種を完了する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の抗原が、初回免疫用量として、及び初回ワクチン接種の追加免疫として前記対象に投与され、前記第２の抗原が、前記初回ワクチン接種の３ヶ月超後に追加免疫として前記対象に投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の抗原が、前記初回ワクチン接種の６ヶ月超後に追加免疫として、前記第１の抗原と組み合わせて前記対象に投与される、請求項２２に記載の方法。
前記追加免疫が、季節的追加免疫またはパンデミックシフト追加免疫である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記追加免疫用量が、５０μｇである、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
組成物であって、
第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードする第２のｍＲＮＡであって、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有する、前記第２のｍＲＮＡと、を含み、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原及び前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原が、互いに異なる、前記組成物。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイクタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、前記２Ｐ安定化スパイクタンパク質が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記２Ｐ安定化スパイクタンパク質が、第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株からのスパイクタンパク質の２Ｐ安定化バージョンであり、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株が、配列番号１１のスパイクタンパク質を含む、前記メッセンジャーリボ核酸。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、第３の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含むワクチンを前記対象に投与することをさらに含み、前記対象が、第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第１のワクチン、及び第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む第２のワクチンを以前に投与されたことがあり、
前記第１、前記第２、及び前記第３の２Ｐ安定化スパイク抗原の各々が、前記第１の抗原及び前記第２の抗原及び前記第３の抗原に特異的な免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第３の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、前記第１の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質アミノ酸配列及び前記第２の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
方法であって、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、前記スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記対象が、配列番号２３または２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陽性である、前記方法。
方法であって、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第１の核酸を含むワクチンを対象に投与することを含み、前記スパイク抗原が、配列番号２０のタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記変異が、アミノ酸置換、欠失、または挿入であり、前記対象が、配列番号２３または２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して血清陰性である、前記方法。
前記対象が、前記第１の用量のワクチンが投与された後、２週間～１年の間に第２の用量の前記ワクチンを投与される、請求項２９または３０に記載の方法。
前記対象が、前記ワクチンが投与された後、２週間～１年の間に第２のワクチンを投与され、前記第２のワクチンが、配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする第２の核酸を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
前記第２のワクチンが、前記第１及び前記第２の核酸の混合物を含み、前記第１の核酸及び前記第２の核酸が、前記第２のワクチン中に１：１の比で存在する、請求項３２に記載の方法。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原、任意選択で、第３の循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの２Ｐ安定化スパイク抗原をコードする核酸を含む、５０μｇの前記ワクチンが、前記対象に投与される、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の方法。
組成物であって、
第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化スパイク（Ｓ）タンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化スパイク（Ｓ）タンパク質をコードする第２のＯＲＦを含む、第２のｍＲＮＡと、を含み、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化Ｓタンパク質及び前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化Ｓタンパク質が、互いに異なる、前記組成物。
前記組成物が、合計で５０μｇ～２５０μｇのｍＲＮＡを含む、請求項３５に記載の組成物。
前記第１のｍＲＮＡ対前記第２のｍＲＮＡの比が、１：１である、請求項３５または３６に記載の組成物。
前記ｍＲＮＡが、化学修飾を含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組成物。
前記ｍＲＮＡが、完全に修飾されている、請求項３８に記載の組成物。
前記化学修飾が、１－メチルシュードウリジンである、請求項３８または３９に記載の組成物。
前記ｍＲＮＡが、５’キャップ類似体、任意選択で、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐキャップをさらに含む、請求項３５～４０のいずれか１項に記載の組成物。
前記ｍＲＮＡが、任意選択で、５０～１５０ヌクレオチド長を有する、ポリ（Ａ）テールをさらに含む、請求項３５～４１のいずれか１項に記載の組成物。
前記組成物が、脂質ナノ粒子をさらに含み、任意選択で、前記脂質ナノ粒子が、４０～５５モル％のイオン化可能なアミノ脂質、３０～４５モル％のステロール、５～１５モル％の中性脂質、及び１～５モル％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の組成物。
前記脂質ナノ粒子が、４０～５０モル％のイオン化可能なアミノ脂質、３５～４５モル％のステロール、１０～１５モル％の中性脂質、及び２～４モル％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項３５～４３のいずれか１項に記載の組成物。
前記脂質ナノ粒子が、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の組成物。
前記イオン化可能なアミノ脂質が、化合物１の構造を有する、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の組成物：
前記ステロールが、コレステロールまたはその誘導体である、請求項３５～４６のいずれか１項に記載の組成物。
前記中性脂質が、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項３５～４７のいずれか１項に記載の組成物。
前記ＰＥＧ修飾脂質が、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ＤＭＧ）である、請求項３５～４８のいずれか１項に記載の組成物。
方法であって、
第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからの第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする核酸を含むブースターワクチンを対象に投与することを含み、前記対象が、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第１の核酸を含む第１のワクチンの少なくとも１つの初回免疫用量を以前に投与されたことがあり、前記ブースターワクチンが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和免疫応答を誘導するための有効量で投与され、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含み、前記第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、前記第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対応するタンパク質抗原と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有し、前記ブースターワクチンが、前記第１のワクチンの第１の用量の少なくとも５ヶ月後に２５～１００μｇの投薬量で投与され、前記第１の抗原が、２Ｐ変異を有する完全長安定化スパイクタンパク質である、前記方法。
前記ブースターワクチンが、５０μｇの投薬量で投与される、請求項５０に記載の方法。
前記ブースターワクチンが、前記第１のワクチンの第２の用量の少なくとも約６ヶ月後に投与される、請求項５０または５１に記載の方法。
前記ブースターワクチンが、前記第１のワクチンの第２の用量の６～１２ヶ月後に投与される、請求項５０または５１に記載の方法。
前記追加免疫用量が、複数の懸念されるバリアントに対する中和免疫応答を提供するための季節的追加免疫またはパンデミックシフト追加免疫である、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。