JP2024514182A

JP2024514182A - 呼吸器ウイルス組み合わせワクチン

Info

Publication number: JP2024514182A
Application number: JP2023563061A
Authority: JP
Inventors: ラフェエル・ナハバガウアー; カロル・アンリ; ギヨーム・スチュアート－ジョーンズ; エリザベス・ナラヤナン; ハミルトン・ベネット; アンドレア・カーフィ
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2024-03-28
Also published as: WO2022221335A9; WO2022221335A8; AU2022258335A2; EP4322993A1; AU2022258335A1; WO2022221335A1; AU2022258335A9

Abstract

本開示は、呼吸器ウイルスのための組み合わせｍＲＮＡワクチン、ならびにワクチンを使用する方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、各々が、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年４月１３日出願の米国仮出願第６３／１７４，４６３号、２０２１年４月１４日出願の米国仮出願第６３／１７５，０１１号、２０２１年９月８日出願の米国仮出願第６３／２４１，９５９号、及び２０２２年３月２１日出願の米国仮出願第６３／３２２，１２１号の利益を米国特許法第１１９条の下で主張する。

テキストファイルとして提出された配列表への言及
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０２２年４月１２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｍ１３７８７０１７７ＷＯ００－ＳＥＱ－ＪＸＶと名付けられ、２，１８６バイトのサイズである。

呼吸器疾患は、高等生物においてガス交換を可能にする臓器及び組織に影響を及ぼす病理学的状態を包含する医学用語であり、上気道、気管、気管支、細気管支、肺胞、胸膜及び胸膜腔、ならびに呼吸の神経及び筋肉の状態を含む。呼吸器疾患は、一般的な風邪などの軽度及び自然に回復するものから、細菌性肺炎、肺塞栓症、急性喘息、及び肺癌などの生命を脅かすものまで様々である。呼吸器疾患は、世界中の病気及び死亡の一般的かつ顕著な原因である。米国では、毎年およそ１０億件の「一般的な風邪」が発生する。なかでも、呼吸器疾患は、小児が入院する最も頻繁な理由である。

季節性インフルエンザは、インフルエンザウイルス－オルトミクソウイルス科ファミリーのメンバーであるインフルエンザＡ及びインフルエンザＢウイルス－によって引き起こされる急性呼吸器感染症であり、世界中で循環する。季節性インフルエンザは、突然の発熱、（通常は乾燥した）咳、頭痛、筋肉及び関節の痛み、重度の倦怠感（気分が悪くなる）、咽喉の痛み、ならびに鼻水を特徴とする。先進国では、インフルエンザに関連付けられるほとんどの死亡は、６５歳以上の人々に発生している。流行は、高いレベルで、労働者／学校の欠勤／欠席ならびに生産性損失を生じ得る。診療所及び病院は、病気のピーク中に過剰に混雑する場合がある。発展途上国における季節性インフルエンザの流行の影響は、完全には知られていないが、インフルエンザに関連する下気道感染症を有する５歳未満の小児における死亡者のうちの９９％が、発展途上国で見られると、研究は推定している。

ヒトコロナウイルスは、コロナウイルス科の非常に伝染性の高い、エンベロープを持った一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルス科の２つのサブファミリーは、ヒトの疾患を引き起こすことが知られている。最も重要なのはβ－コロナウイルス（ベータコロナウイルス）である。β－コロナウイルスは、軽度から中等度の上気道感染症の一般的な病因である。しかしながら、２０１９年１２月に中国の武漢市で最初に同定されたコロナウイルスによって引き起こされる感染症などの新型コロナウイルス感染症の発生は、死亡率の高さに関連付けられている。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と称される（以前は「２０１９年新型コロナウイルス」または「２０１９－ｎＣｏＶ」と称されていた）、この最近同定されたコロナウイルスは、数十万人に急速に感染した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが引き起こすパンデミック疾患は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってＣＯＶＩＤ－１９（ＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＤｉｓｅａｓｅ２０１９）と名付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株（武漢－Ｈｕ－１；ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０分離株）の最初のゲノム配列は、２０２０年１月１０日に、北京の中国ＣＤＣから、ウイルス分子の進化及び疫学の分析及び解釈のための英国を拠点とするディスカッションフォーラムであるＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌで研究者によってリリースされた。配列は、次いで、２０２０年１月１２日にＧｅｎＢａｎｋに寄託され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＮ９０８９４７．１を有している。その後、いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株バリアントが同定されており、そのうちのいくつかは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離物よりも感染性が高い。

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。成人における症状は、典型的には、副鼻腔炎または一般的な風邪に似ているが、感染は、無症候性である場合がある。高齢者（例えば、６０歳超）では、ＲＳＶ感染症は、細気管支炎または肺炎へと進行する場合がある。小児の症状は、多くの場合、より重症であり、細気管支炎及び肺炎を含む。米国では、ほとんどの小児が、３歳までにＲＳＶに感染すると推定されている。ＲＳＶビリオンは、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、及び大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）に結合したウイルスＲＮＡで構成される、内部ヌクレオカプシドからなる。ヌクレオカプシドは、マトリックスタンパク質（Ｍ）によって囲まれており、ウイルス融合（Ｆ）及び結合（Ｇ）タンパク質、ならびに小さな疎水性タンパク質（ＳＨ）が組み込まれている脂質二重層によってカプセル化されている。また、ウイルスゲノムは、Ｉ型インターフェロン活性ならびにＭ－２タンパク質を阻害する、２つの非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）をコードする。

インフルエンザ、コロナウイルス、及びＲＳＶなどの呼吸器ウイルスに関連付けられる継続的な健康問題は、国際的に懸念されており、これらのウイルスに対する有効かつ安全なワクチン候補を開発することの重要性を強調している。

いくつかの態様では、本開示は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

本開示の別の態様は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

本開示の更なる態様は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

いくつかの態様では、本開示は、いくつかの態様では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第６のウイルスからの第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第６のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

本開示の別の態様は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第６のウイルスからの第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第６のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第７のウイルスからの第７の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第７のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

本開示の更なる態様は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第６のウイルスからの第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第６のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第７のウイルスからの第７の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第７のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第８のウイルスからの第８の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第８のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のウイルスは、インフルエンザウイルスファミリーオルトミクソウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のウイルスは、インフルエンザＡウイルス及びインフルエンザＢウイルスから選択される。

いくつかの実施形態では、第５及び第６のウイルスは、ウイルスファミリーコロナウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第５及び第６のウイルスは、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、第５及び第６のウイルスは、コロナウイルスである。

いくつかの実施形態では、第７及び第８のウイルスは、非インフルエンザ、非コロナウイルス、呼吸器ウイルスである。いくつかの実施形態では、第７及び第８のウイルスは、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第７及び第８のウイルスは、ウイルスサブファミリーニューモウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、第７及び第８のウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、及び／または第７及び第８のウイルスが、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）からである。

いくつかの実施形態では、第７及び第８のウイルスは、パラミクソウイルスの属またはサブファミリーからである。いくつかの実施形態では、第７及び第８のウイルスは、パラインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、第７及び第８のウイルスは、モルビリウイルスの属またはサブファミリーからである。

いくつかの実施形態では、第２のウイルスと第３のウイルスとは、互いに異なり、インフルエンザウイルスからである。

いくつかの実施形態では、第２のウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルスである。

いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、ならびにＰＩＶ１ウイルスからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスＢからである。いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスＡからである。

いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、細胞表面糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ヘマグルチニン抗原（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）である。

いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ベータ－コロナウイルスからである。いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶからである。いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ＨＣｏＶからである。

いくつかの実施形態では、第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）からである。いくつかの実施形態では、第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）からである。いくつかの実施形態では、第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、ヘンドラウイルス、またはニパウイルスから選択される。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原をコードするＯＲＦを含む少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原をコードするＯＲＦを含む２～４つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、第２のウイルスからの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、第３のウイルスからの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、１５個未満のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、３～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、４～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、５～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、８～９個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも３つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも４つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも８つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、コロナウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドと、パラミクソウイルス科抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む。

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドは、１：１：１の比で組み合わせワクチン中に存在する。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの４：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの３：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの５：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの４：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの１：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの１：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの８：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、第１のウイルスの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ＨＡ及びＮＡを４：４の比で含む。

いくつかの実施形態では、組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々は、組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドと互いに補完的であり、干渉しない。

いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、天然に存在する抗原に由来する。いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、天然に存在する抗原の安定化バージョンである。いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、天然に存在しない抗原である。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、構造的に改変されたバリアント呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含み、構造的に改変されたバリアントは、第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちのいずれか１つの構造的に改変されたバリアントである。

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、ポリシストロン性である。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々は、ポリシストロン性である。

いくつかの態様では、本開示は、第１のウイルスからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む、多価ＲＮＡ組成物であって、多価ＲＮＡ組成物が、４０％超のポリＡテールＲＮＡを含み、及び／または第１、第２、及び／または第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、互いに少なくとも１００ヌクレオチドだけ長さが異なる、多価ＲＮＡ組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子、第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第３のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることであって、第１のＤＮＡ分子、第２のＤＮＡ分子、及び第３のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる、組み合わせることと、（ｂ）線状化された第１のＤＮＡ分子、線状化された第２のＤＮＡ分子、及び線状化された第３のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法によって生成される。

いくつかの実施形態では、異なる供給源は、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物であり、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物は、共培養されない。

いくつかの実施形態では、反応混合物中に存在する第１、第２、及び第３のＤＮＡ分子の量は、ＩＶＴの開始前に正規化されている。

いくつかの実施形態では、第１のウイルスは、ウイルスファミリーオルトミクソウイルス科インフルエンザウイルスからである。いくつかの実施形態では、第１のウイルスは、インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、第２のウイルスは、ウイルスファミリーコロナウイルス科からである。

いくつかの実施形態では、第２のウイルスは、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、第２のウイルスは、コロナウイルスである。いくつかの実施形態では、第２のウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルスである。

いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、ウイルスサブファミリーニューモウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、パラミクソウイルスの属またはサブファミリーからである。いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、モルビリウイルスの属またはサブファミリーからである。いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、及び／またはパラインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、ならびにＰＩＶ１ウイルスからなる群から選択される。

いくつかの態様では、本開示は、各々が呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードする別個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、２～１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、多価ＲＮＡ組成物であって、各ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、任意選択で５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに１つ以上の非コード配列を含む、多価ＲＮＡ組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、ｍＲＮＡのポリＡテールの下流に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのＯＲＦの最後のコドンとｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間の、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、１～１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、非コード配列は、１つ以上のＲＮＡｓｅ切断部位を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ切断部位は、ＲＮａｓｅＨ切断部位である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ウイルスファミリーオルトミクソウイルス科インフルエンザウイルスからである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ウイルスファミリーコロナウイルス科、任意選択で、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、コロナウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルス抗原である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科から、任意選択で、ウイルスサブファミリーニューモウイルス亜科、パラミクソウイルス、またはモルビリウイルスからである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、及び／またはパラインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、ならびにＰＩＶ１からなる群から選択される。

いくつかの態様では、本開示は、第１のウイルスからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む、多価ＲＮＡ組成物であって、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在する抗原または天然に存在する抗原の安定化バージョンに由来し、構造的に改変された呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含み、構造的に改変されたバリアントが、第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちのいずれか１つの構造的に改変されたバリアントである、多価ＲＮＡ組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、第２のウイルスと第３のウイルスとは、互いに異なり、インフルエンザウイルスからである。いくつかの実施形態では、第１のウイルスは、インフルエンザウイルスである。

いくつかの実施形態では、第３のウイルスは、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、構造的に改変されたバリアントは、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントである。いくつかの実施形態では、構造的に改変されたバリアントは、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントである。いくつかの実施形態では、構造的に改変されたバリアントは、第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントである。

いくつかの態様では、本開示は、各々が別個の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、５～１５個のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、３つの異なるウイルスファミリーに由来する、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、多価ＲＮＡ組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、３つのウイルスファミリーは、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、及びパラミクソウイルス科を含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、インフルエンザ抗原をコードするＯＲＦを含む３～６つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、コロナウイルス抗原をコードするＯＲＦを含む１～５つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及び／またはＭＥＶに由来する抗原をコードするＯＲＦを含む１～４つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを有する。

本開示の別の態様は、各々が第１、第２、または第３のウイルスからの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、少なくとも６つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドのセットを含む、多価ＲＮＡ組成物であって、組成物が、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの４：１：１、４：２：２、４：２：１、４：３：２、４：３：３、４：３：２、または４：２：２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、多価ＲＮＡ組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドは、１：１：１の比で組み合わせワクチン中に存在する。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの４：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの３：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの５：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの４：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの１：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの１：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの８：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。

いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、融合（Ｆ）タンパク質、スパイク（Ｓ）タンパク質、及びヘマグルチニン抗原（ＨＡ）を含む。

いくつかの実施形態では、多価組成物は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、２０～６０％のイオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を含む：

いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、細胞表面糖タンパク質を含む。

いくつかの態様では、本開示は、対象をワクチン接種するための方法であって、組み合わせワクチンを対象に投与することを含み、組み合わせワクチンが、第１のウイルスからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含み、第１、第２、及び第３のウイルスファミリーの各々が、互いに異なる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、対象は、６５歳以上である。いくつかの実施形態では、対象は、１８歳未満である。いくつかの実施形態では、方法は、対象における呼吸器感染症を予防する。いくつかの実施形態では、方法は、対象における呼吸器感染症の重症度を低減する。

いくつかの実施形態では、対象は、抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陰性である。いくつかの実施形態では、対象は、抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陰性である。いくつかの実施形態では、対象は、抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陽性である。いくつかの実施形態では、対象は、抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陽性である。

いくつかの実施形態では、方法は、ブースターワクチンを投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、組み合わせワクチンの３週間～１年後の間に投与される。

いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１、第２、及び第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの各々をコードするＯＲＦを含む少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントをコードするＯＲＦを含む少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、季節性ブースターワクチンである。

いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、本明細書に記載のワクチンのうちのいずれかである。

更なる態様では、本開示は、単回用量またはブースターを伴う単回用量に基づいて、対象における感染症を予防するか、または呼吸器感染症の重症度を低減する有効量で、本明細書に記載のワクチンを対象に投与することによって、呼吸器感染症を予防するか、または重症度を低減する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、５０μｇの用量で対象に投与される。

本開示の別の態様は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスファミリーオルトミキソウイルス科からのインフルエンザウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドであって、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からの抗原である、第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

別の態様では、本開示は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーコロナウイルス科からのコロナウイルス抗原である、第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドであって、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からの抗原である、第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、組み合わせワクチンを提供する。

いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、第３、第４、第５、及び第６のウイルスｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、インフルエンザＡウイルス及びインフルエンザＢウイルスからである。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、コロナウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、コロナウイルスからである。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、非インフルエンザ、非コロナウイルス、呼吸器ウイルスからである。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ファミリーパラミクソウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、サブファミリーニューモウイルス亜科からである。

いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、インフルエンザＡウイルス及びインフルエンザＢウイルスからである。いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、コロナウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、コロナウイルスからである。

いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ファミリーパラミクソウイルス科からである。いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、サブファミリーニューモウイルス亜科からである。いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及び／またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）からである。いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、パラミクソウイルスの属またはサブファミリーからである。いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、パラインフルエンザウイルスからである。いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、モルビリウイルスの属またはサブファミリーからである。

いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルスからである。

いくつかの実施形態では、第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、及びＰＩＶ１ウイルスからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスＢからである。いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスＡからである。いくつかの実施形態では、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ヘマグルチニン抗原（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）である。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、４０％超のポリＡテールＲＮＡを含む、及び／または第１、第２、及び／または第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々は、互いに少なくとも１００ヌクレオチドだけ長さが異なる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、（ａ）第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子及び第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることであって、第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる、組み合わせることと、（ｂ）線状化された第１のＤＮＡ分子及び線状化された第２のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法によって生成される。

いくつかの実施形態では、反応混合物中に存在する第１及び第２のＤＮＡ分子の量は、ＩＶＴの開始前に正規化されている。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々は、非翻訳領域（ＵＴＲ）、任意選択で５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに１つ以上の非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、ｍＲＮＡのポリＡテールの下流に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのＯＲＦの最後のコドンとｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間の、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。

いくつかの実施形態では、非コード配列は、１～１０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、非コード配列は、１つ以上のＲＮＡｓｅ切断部位を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ切断部位は、ＲＮａｓｅＨ切断部位である。

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、２０～６０％のイオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を含む：

別の態様では、本開示は、対象をワクチン接種するための方法であって、本明細書に記載の組み合わせワクチンのうちのいずれかを対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、対象は、６５歳以上である。いくつかの実施形態では、対象は、１８歳未満である。

いくつかの実施形態では、方法は、対象における呼吸器感染症を予防する。いくつかの実施形態では、方法は、対象における呼吸器感染症の重症度を低減する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ブースターワクチンを投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、組み合わせワクチンの３週間～１年後の間に投与される。

いくつかの態様では、本開示は、単回用量またはブースターを伴う単回用量に基づいて、対象における感染症を予防するか、または呼吸器感染症の重症度を低減する有効量で、本明細書に記載の組み合わせワクチンを対象に投与することによって、呼吸器感染症を予防するか、または重症度を低減する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ワクチンの各ＲＮＡポリヌクレオチドは、別々のＬＮＰ中に製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＬＮＰ中に共製剤化される。

示される製剤の１回用量の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対するヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対するヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、４つのＮＡ抗原の各々に対するＮＡ反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、ＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量（高用量）の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量（高用量）の２１日後の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量（高用量）の２１日後の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量（高用量）の２１日後の、４つのＮＡ抗原の各々に対する正規化されたノイラミニダーゼ（ＮＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量（高用量）の２１日後の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量（高用量）の２１日後の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量（低用量）の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量（低用量）の２１日後の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量（低用量）の２１日後の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量（低用量）の２１日後の、４つのＮＡ抗原の各々に対する正規化されたノイラミニダーゼ（ＮＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の１回用量（低用量）の２１日後の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量（低用量）の２１日後の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤（高用量）の３６日目（用量２の後）の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤（高用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤（高用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤（高用量）の３６日目（用量２の後）の、４つのＮＡ抗原の各々に対する正規化されたノイラミニダーゼ（ＮＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤（高用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤（高用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤（低用量）の３６日目（用量２の後）の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤（低用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤（低用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の１回用量の２１日後の、４つのＨＡ抗原の各々に対する正規化されたヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤（低用量）の３６日目（用量２の後）の、４つのＮＡ抗原の各々に対する正規化されたノイラミニダーゼ（ＮＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤（低用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤（低用量）の３６日目（用量２の後）の、正規化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の３６日目（用量２の後）の、４つのＨＡ抗原の各々に対するヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の３６日目（用量２の後）の、４つのＨＡ抗原の各々に対するヘマグルチニン（ＨＡ）反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の３６日目（用量２の後）の、４つのＮＡ抗原の各々に対するＮＡ反応性ＩｇＧ抗体力価を示す一連のグラフである。示される製剤の３６日目（用量２の後）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤の３６日目（用量２の後）の、ＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。Ａ～Ｂは、示される製剤の２８日目（用量１の後）及び５６日目（用量２の後）の、ＲＳＶ融合前Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価（図３３Ａ）及びＲＳＶ融合後Ｆ特異的ＩｇＧ抗体価（図３３Ｂ）を示す一連のグラフである。示される製剤の２８日目（用量１の後）及び５６日目（用量２の後）の４つのＨＡ抗原の各々に対するヘマグルチニン（ＨＡ）特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。組み合わせワクチンの２８日目（用量１の後）及び５６日目（用量２の後）の、ＰＢＳと比較した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ２Ｐ特異的ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。示される製剤を用いたワクチン接種後５６日目の、産生されたＲＳＶ中和抗体価のレベルを示すグラフである。Ａ～Ｂは、示される製剤を用いたワクチン接種後６１日目の、産生された肺ウイルス力価（図３７Ａ、下気道を表す）及び鼻ウイルス力価（図３７Ｂ、上気道を表す）を示すグラフである。

呼吸器ウイルスは、ヒトにおいて最も一般的な疾患因子であり、世界中の罹患率及び死亡率に顕著な影響を有する。いくつかのウイルスファミリーからのある特定の呼吸器因子は、効率的な人から人への伝達に非常に適しており、世界的な循環に至る。コミュニティベースの研究は、これらのウイルスが、急性呼吸器感染症の最も一般的な病因であることを確認した。これらのウイルスのうちのほとんどに対する有効なワクチン及び抗ウイルス薬は、未だに利用可能ではない。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも３つの異なる呼吸ウイルスからの少なくとも３つの呼吸抗原性ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、組み合わせワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、３つの異なるウイルスは、オルトミクソウイルス科、コロナウイルス科（任意選択で、オルトコロナウイルス亜科）、及びパラミクソウイルス科（任意選択で、ニューモウイルス亜科）ファミリーからである。いくつかの実施形態では、呼吸器抗原性ポリペプチドは、アルファインフルエンザウイルス属、ベータインフルエンザウイルス属、ベータコロナウイルス属、パラミクソウイルス属、モルビリウイルス属、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、及び／またはパラインフルエンザウイルスからである。

合成、製剤化、及び送達の制限の結果として、組み合わせＲＮＡワクチンを作製することは、困難であった。本明細書では、脂質ナノ粒子担体中の呼吸器抗原をコードする２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドの組み合わせが開示されている。本明細書では、非常に有効な組み合わせワクチンを生成するための、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの機能的な組み合わせを首尾よく生成するための方法が開示されている。組み合わせワクチンの１つの制限は、ワクチン中の抗原の全てに対して完全かつロバストな免疫応答が生成されないような抗原間の干渉に関連する。複数の抗原、すなわち、８～１０個の抗原をコードする組み合わせワクチンを生成し、依然として完全な免疫応答を産生することができることが実証されている。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々は、組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドと互いに補完的であり、干渉しない。したがって、組み合わせワクチンの投与から産生される抗原は、互いの免疫応答に干渉しない。実施例に記載のデータに表されるように、オルトミクソウイルス科ファミリー（例えば、インフルエンザ抗原）、パラミクソウイルス科ファミリー（例えば、ＲＳＶ）、及びコロナウイルス科ファミリー（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）からの抗原をコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む組み合わせワクチンの投与は、非常に驚くべきことに、各単一の抗原をコードするｍＲＮＡの別々の投与と比較して、各それぞれの抗原に対する中和抗体価を阻害または低減しなかった。

また、本明細書で提供されるのは、ワクチンを投与する方法、ワクチンを生成する方法、ワクチンを含む組成物、及びワクチンをコードする核酸である。本明細書に記載されるように、本明細書に記載のワクチンは、ＤＮＡワクチン接種に関連付けられるリスクのうちの多くを伴わずに、細胞性免疫及び液性免疫の両方を含む、バランスのとれた免疫応答を誘導するために使用され得る。任意選択で、本明細書では多価ワクチンまたは組み合わせワクチンと称されるそのようなワクチンは、血清陽性または血清陰性の対象に投与することができる。例えば、対象は、以前に呼吸器ウイルスに感染したことがあるか、または以前に呼吸器ウイルスに対する抗体を誘導する用量のワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を投与されたことがあり得るので、ワクチンを受けたことがなくても、ワクチンの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに反応する抗体を有さなくてもよいか、またはワクチンの呼吸器ウイルス抗原のうちの少なくとも１つに対する既存の抗体を有してもよい。いくつかの実施形態では、対象は、ワクチンの呼吸器ウイルス抗原の全てに対する既存の抗体を有してもよい。

抗原
抗原とは、免疫応答を誘導する（例えば、抗原に対する抗体を免疫系に産生させる）ことが可能なタンパク質である。本開示のワクチンは、タンパク質抗原がインビトロで精製または産生される従来のタンパク質ベースのワクチン接種アプローチ、例えば、組換えタンパク質産生技術に対して独特の利点を提供する。本開示のワクチンは、所望の抗原をコードするｍＲＮＡを特徴とし、これが体内に導入されると、すなわちインビボで哺乳類対象（例えばヒト）に投与されると、身体の細胞に所望の抗原を発現させる。本開示のワクチンは、所望のウイルス表面抗原、例えば、糖タンパク質抗原をコードするｍＲＮＡを特徴とし、これが体内に導入されると、すなわちインビボで哺乳類対象（例えば、ヒト）に投与されると、任意選択でヒトグルコシル化パターンに自然に折り畳まれた状態での所望のペプチドの発現を身体の細胞に引き起こす。したがって、一連の病原性ウイルスからのウイルス表面抗原をコードする組み合わせワクチンは、適切に折り畳まれ、任意選択でグリコシル化されたウイルス抗原を、実際の感染中に生成されたかのように同じ様式で全て提示する。したがって、ｍＲＮＡワクチンは、したがって、呼吸器ウイルスに対するワクチンを作製するための最良のビヒクルを提供し、弱毒化されたウイルスを使用することなく、関連付けられるリスクを伴わずに生成することができる。本開示のｍＲＮＡの身体細胞への送達を促進するために、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内にカプセル化される。送達され、身体の細胞によって取り込まれると、ｍＲＮＡは、サイトゾルで翻訳され、タンパク質または糖タンパク質抗原は、折り畳まれ、宿主細胞機構によって処理される。タンパク質及び／または糖タンパク質抗原は、提示され、獲得液性及び細胞性免疫応答を誘発する。中和抗体は、発現されたウイルス受容体結合タンパク質及び糖タンパク質抗原に対して指向されるので、したがって、これらのウイルスタンパク質抗原は、ワクチン開発に最も関連する標的抗原とみなされる。簡単に言えば、中和抗体は、一般に、細胞への結合を担うウイルス表面タンパク質、例えば、糖タンパク質に指向され、特異的抗体によって遮断されると、ウイルスは中和される。本明細書では、「抗原」という用語の使用は、別段記載されない限り、免疫原性ウイルス表面タンパク質、例えば、糖タンパク質、及び免疫原性断片（（少なくとも１つの）呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘導する（または誘導することが可能である）免疫原性断片）を包含する。いくつかの実施形態では、抗原は、天然に存在する抗原である（例えば、呼吸ウイルス抗原性ポリペプチドは、天然に存在する抗原をコードする）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、天然に存在しない抗原、または組み合わせワクチンで使用するためのタンパク質もしくは糖タンパク質抗原の操作されたバージョンである。いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、天然に存在する抗原（例えば、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失、例えば、２つのプロリン置換によって安定化されたコロナウイルススパイクタンパク質）の安定化バージョンである。別の実施形態では、タンパク質プロセシングまたはコンフォメーション安定性を促進するために、細胞質尾部の欠失または変異などの他の修飾が、ウイルス表面タンパク質、例えば、糖タンパク質に操作される。

「タンパク質」という用語が、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、及びそれらの断片を包含し、「抗原」という用語が、免疫応答を誘発するそのような分子の抗原性部分を包含することが理解されるべきである。本明細書に含まれるウイルスワクチンでは、「抗原」という用語は、ウイルス表面タンパク質、例えば、糖タンパク質、ウイルスタンパク質（例えば、糖タンパク質）の断片、ならびに呼吸器ウイルスに由来するウイルスタンパク質（例えば、糖タンパク質）の設計バージョン及び／または変異バージョンを含む。

オルトミクソウイルス科ファミリー
オルトミクソウイルス科ファミリーは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのファミリーであり、アルファインフルエンザウイルス、ベータインフルエンザウイルス、デルタインフルエンザウイルス、ガンマインフルエンザウイルス、アイサウイルス、トゴトウイルス、及びクアランジャウイルスを含む。本明細書に記載のワクチンは、アルファインフルエンザウイルスまたはベータインフルエンザウイルスからのウイルス抗原性ポリペプチドを含み得る。どちらもヒトインフルエンザに関連付けられる。

全てのインフルエンザウイルスは、セグメント化ゲノムを有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスは、表面タンパク質のヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む１０個のタンパク質をコードする８つの遺伝子を有する。インフルエンザＡ型ウイルスの場合、これらの２つの表面タンパク質の差に従って、異なるサブタイプへと更に細分化することができる。現在までに、１６個のＨＡサブタイプ及び９つのＮＡサブタイプが同定されている。しかしながら、２０世紀中に、ヒトにおいて広く循環したインフルエンザＡサブタイプは、Ａ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ（Ｈ１Ｎ２）、Ａ（Ｈ２Ｎ２）、及びＡ（Ｈ３Ｎ２）のみであった。インフルエンザＡ型ウイルスの全ての既知のサブタイプは、鳥類から単離されており、様々な哺乳類種に影響を及ぼし得る。ヒトと同様に、他の哺乳類種から単離されたインフルエンザＡサブタイプの数は、限定される。ほぼ全てのインフルエンザＡのパンデミックは、「ドリフト」Ｈ１Ｎ１ウイルス、ならびに再集合体Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２ウイルスを含む、１９１８年のウイルスの子孫によって引き起こされている。インフルエンザＡは、そのウイルスエンベロープの表面にＨＡ及びＮＡタンパク質を含む。ＨＡは、ウイルスの認識及び標的細胞への結合を可能にし、また、細胞にウイルスＲＮＡを感染させる。ＮＡは、感染した細胞内に作製された娘ウイルス粒子が他の細胞に拡散することができるので、その後の放出に重要である。

インフルエンザＢ型ウイルスは、ほとんどがヒトにだけ感染する。インフルエンザＢウイルスは、サブタイプに分類されないが、系統に分類することができる。現在循環しているインフルエンザＢ型ウイルスは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様）またはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）系統のいずれかに属する。インフルエンザウイルスＢは、Ａ型よりも２～３倍遅い速度で変異するが、しかしながら、毎年、小児及び若年成人に顕著に影響を及ぼす。インフルエンザＢウイルスカプシドは、そのビリオンが、エンベロープ、マトリックスタンパク質、核タンパク質複合体、ヌクレオカプシド、及びポリメラーゼ複合体からなる間は、カプセル化されている。それは、球状または糸状であり得る。その５００ほどの表面突起は、ＨＡ及びＮＡで作製されている。インフルエンザＢウイルスゲノムは、１４，５４８ヌクレオチド長であり、線状マイナス鎖一本鎖ＲＮＡの８つのセグメントからなる。分節ゲノムは、カプセル化されており、各セグメントは、別々のヌクレオカプシド内にあり、ヌクレオカプシドは、１つのエンベロープによって囲まれている。

本発明のｍＲＮＡワクチンは、ＨＡをコードするｍＲＮＡ、及び任意選択で、ワクチンの設計時に循環しているインフルエンザウイルスのＮＡ抗原を含む。本発明の例示的なワクチンは、ＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、及び任意選択で、循環しているＨ１Ｎ１ウイルス及びＨ３Ｎ２ウイルスのＮＡ抗原を含む。本発明のワクチンは、各々循環しているインフルエンザＡサブタイプのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、または各々循環しているインフルエンザＢ系統（または各々優勢なインフルエンザ系統）のＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡと組み合わせた各々優勢なインフルエンザＡサブタイプのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含み得る。例示的な実施形態では、ワクチンはまた、選択されたＨＡ抗原に対応するＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。優勢なウイルス、または循環中の優勢なウイルスは、流行の頻度で、または当業者によって理解されるある特定の閾値を超える頻度でヒト集団において検出されるものであり、それらの株（複数可）が集団内、例えば、北半球または南半球を表す集団内で循環しているという証拠が必須である。

本発明のｍＲＮＡワクチンは、複数のｍＲＮＡを含めることが可能であり、したがって、例えば、ＨＡ抗原、ならびに任意選択でまた、最も一般的なＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統、及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統の対応するＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含み得るが、ＨＡ抗原、ならびに任意選択でまた、２番目に一般的なＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統、及び／またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統の対応するＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡを更に含み得る。例示的な実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、Ａ（Ｈ１Ｎ１）サブタイプのインフルエンザＡウイルス株のＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、Ａ（Ｈ３Ｎ２）サブタイプのインフルエンザＡウイルス株のＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザｂウイルス株のＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株のＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、抗原は、インフルエンザ抗原である。インフルエンザ抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、ＨＡもしくはＮＡの断片、ＨＡもしくはＮＡの誘導体、または修飾されたＨＡもしくはＮＡである。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＡは、野生型ＮＡである（例えば、酵素的に活性である）。いくつかの実施形態では、ＮＡは、酵素的に不活性なＮＡなどの修飾されたＮＡである。本明細書で使用される場合、「酵素的に不活性なＮＡ」は、全くまたは最小限の触媒活性を有するように変異させたＮＡを指す（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＶｉｒｏｌ．，２００８，４１（１）：２０－２４、Ｙｅｎｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ．，２００６，８０（１７）：８７８７－８７９５を参照されたい）。例えば、いくつかの実施形態では、酵素的に不活性なＮＡは、（例えば、当該技術分野において既知であるように、酵素活性アッセイにおいて）野生型ＮＡの触媒活性の３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満、または０％を有する。いくつかの実施形態では、Ａｒｇ１１８、Ａｓｐ１５１、Ａｒｇ１５２、Ａｒｇ２２４、Ｇｌｕ２７６、Ａｒｇ２９２、Ａｒｇ３７１、及びＴｙｒ４０６のうちの少なくとも１つが変異している。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８つ全てのアミノ酸が変異している。いくつかの実施形態では、変異は、Ｒ１１８Ｋ、Ｄ１５１Ｇであり、Ｅ２２７Ｄである。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、任意選択で、ＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、またはその断片、誘導体、もしくは修飾されたバージョンと組み合わせた、ＨＡをコードするｍＲＮＡの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、ＨＡをコードするｍＲＮＡと、ＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、またはその断片、誘導体、もしくは修飾されたバージョンとの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、及び／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のＮＡ抗原（例えば、４つのＨＡ抗原、または４つのＨＡ抗原と４つのＮＡ抗原）をコードするｍＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、３つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、４つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、５つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、６つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、１つのＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、２つのＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、３つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、３つのＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、４つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、４つのＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、５つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、５つのＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、６つのＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、６つのＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡと、を含む。

複数のｍＲＮＡフォーマットによって、本発明のワクチンは、ＨＡ抗原、及び任意選択で、複数の別個のインフルエンザ分岐群及び部分分岐群を表す循環している株／系統の対応するＮＡ抗原をコードすることができ、次のまたは今後のインフルエンザシーズンとの戦いにおいてより効果的なワクチンを生成する。

コロナウイルス科ファミリー
コロナウイルス科ファミリーは、哺乳類、両生類、及び鳥類に感染するエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスを含む。コロナウイルス科サブファミリーであるオルトコロナウイルス亜科としては、哺乳類及び鳥類に疾患を引き起こし、一般的な風邪からより致命的な疾患（例えば、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＣＯＶＩＤ－１９）に至るまでの呼吸器系感染症を引き起こすＲＮＡウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ベータコロナウイルスの属、例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、またはＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からである。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のゲノムは、約９８６０個のアミノ酸をコードする２９．８～３０ｋｂのサイズを有する一本鎖プラス鎖ＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）である（Ｃｈａｎｅｔａｌ．２０００、上記、Ｋｉｍｅｔａｌ．２０２０Ｃｅｌｌ，Ｍａｙ１４；１８１（４）：９１４－９２１．ｅ１０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、５’キャップ及び３’－ポリＡテールを有するポリシストロン性ｍＲＮＡである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、構造タンパク質及び非構造タンパク質（Ｎｓｐ）をコードする特定の遺伝子に編成されている。ゲノム内の構造タンパク質の順序は、５’－レプリカーゼ（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１／ａｂ）－構造的タンパク質［スパイク（Ｓ）－エンベロープ（Ｅ）－膜（Ｍ）－ヌクレオカプシド（Ｎ）］－３’である。コロナウイルスのゲノムとしては、アクセサリータンパク質、非構造タンパク質、及び構造タンパク質をコードする様々な数のオープンリーディングフレームが挙げられる（Ｓｏｎｇｅｔａｌ．２０１９Ｖｉｒｕｓｅｓ；１１（１）：ｐ．５９）。抗原性ペプチドのうちのほとんどは、構造タンパク質に位置する（Ｃｕｉｅｔａｌ．２０１９Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；１７（３）：１８１－１９２）。スパイク表面糖タンパク質（Ｓ）、小さなエンベロープタンパク質（Ｅ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）が、４つの主要な構造タンパク質である。Ｓタンパク質は、細胞指向性及びウイルス侵入に寄与して、中和抗体（ＮＡｂ）及び防御免疫を誘導し得るので、他の全ての構造タンパク質の中でコロナウイルスワクチン開発における最も重要な標的の１つとみなされ得る。

本明細書で使用される場合、「スパイクタンパク質」という用語は、ベータコロナウイルスを含むウイルスのエンベロープ（ウイルス表面）から突出するホモ三量体を形成する糖タンパク質を指す。三量体化したスパイクタンパク質は、宿主細胞の表面にある受容体に結合し、続いてウイルス膜と宿主細胞膜を融合させることにより、ビリオンの宿主細胞への侵入を促進する。Ｓタンパク質は、ウイルスの種類に応じて１，１６０～１，４００のアミノ酸で構成される、高度にグリコシル化された大きなＩ型膜貫通型融合タンパク質である。ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質は、約１１００～１５００個のアミノ酸を含む。

本発明のｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（すなわち、ｍＲＮＡが、細胞または組織、例えば、対象における細胞または組織に送達されると、スパイクタンパク質を発現するように、スパイクタンパク質をコードする）、ならびにその構造的に改変された抗原性バリアントを産生するように設計されている。当業者は、ウイルス、例えばベータコロナウイルスが宿主細胞へのウイルス侵入を促進するという意図された機能を実行するために、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質が必要であり得るが、スパイクタンパク質の構造及び／または配列におけるある特定の量の変動が、主にスパイクタンパク質に対する免疫応答を誘発しようとする場合、許容されることを理解するであろう。例えば、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端からの、例えば、１～数個、おそらく最大５または最大１０のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原のうち１～数個、おそらく最大５または最大１０アミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）が、タンパク質の抗原特性を変えることなく許容され得る。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、安定化されたスパイクタンパク質ではなく、例えば、スパイクタンパク質は、２つのプロリン置換（２Ｐ変異）によって安定化されている。

いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、異なるウイルス株からのものである。株は、微生物（例えば、ウイルス）の遺伝的バリアントである。新しいウイルス株は、自然界で２つ以上のウイルスが同じ細胞に感染するとき、例えば抗原ドリフトまたは抗原シフトなどの突然変異または遺伝子構成要素の交換に起因して作成され得る。

抗原ドリフトは、宿主抗体を認識するウイルス表面タンパク質をコードするウイルス遺伝子の変異の蓄積によって生じる、ウイルスにおける一種の遺伝的変異である。これにより、以前の株による感染を防止した抗体によって効果的に阻害されない新しい株のウイルス粒子が生じる。これにより、変化したウイルスが部分的に免疫のある集団全体に広がりやすくなる。

抗原シフトは、ウイルスの２つ以上の異なる株、または２つ以上の異なるウイルスの株が結合して、２つ以上の元の株の表面抗原の混合物を有する新しいサブタイプを形成するプロセスである。この用語は、インフルエンザが最もよく知られた例であるので、特にインフルエンザに適用されることが多いが、このプロセスは他のウイルスでも発生することがよく知られている。抗原シフトは、表現型の変化をもたらす再集合またはウイルスシフトの特殊なケースである。抗原シフトは、抗原ドリフトとは対照的であり、これは、ウイルスの既知の株の経時的な天然変異であり、免疫の喪失またはワクチンのミスマッチをもたらし得る。抗原シフトは、多くの場合、ウイルス表面抗原の大規模な再編成に関連付けられ、ウイルスの表現型を大幅に変化させる再集合を生じる。

本明細書で使用されるウイルス株は、ウイルスの１つ以上の表面タンパク質または他のタンパク質の変異を特徴とする、遺伝子バリアントまたはウイルスのものである。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質における異なるアミノ酸配列である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合、新しい株に対する個体における免疫応答が、個体を免疫化するか、または最初に感染させるために使用される株に対するよりも効果が低い場合。新しいウイルス株は、免疫化されたか、または以前に感染した個体における継続的な免疫応答に起因する、天然変異、または天然変異と免疫選択との組み合わせから生じ得る。新しいウイルス株は、標的細胞との受容体結合またはウイルス融合などのウイルス機能を担うスパイクタンパク質の領域における１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸変異によって異なり得る。新しい株からのスパイクタンパク質は、アミノ酸レベルで親株とは８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％ほど同一性が異なり得る。

天然ウイルス株は、天然条件下で安定なままである（例えば、生物学的、血清学的、及び／または分子的特徴が、安定でありかつ遺伝可能である）いくつかの「固有の表現型特徴」を有するので、認識可能である所与のウイルスのバリアントである。そのような「固有の表現型特徴」とは、比較した参照ウイルスとは異なる生物学的特性、例えば、固有の抗原特性、宿主範囲（例えば、異なる種類の宿主に感染する）、株によって引き起こされる疾患の症状、この株によって引き起こされる異なる種類の疾患（例えば、異なる手段で伝播される）などである。「固有の表現型特徴」は、臨床的に（例えば、その株に感染した宿主で検出される臨床症状）検出されてもよいし、またはウイルス学の専門家の当業者が、どの動物がどのウイルスに感染したかを知らず、また２つのウイルスの違いについての情報を持たずに、参照対照ウイルスに感染した動物と、新型株に感染した動物とを区別し得る比較動物実験内で検出し得る。重要なことに、ゲノム配列に単純な違いを有するウイルスバリアントは、認識可能な別個のウイルス表現型がない場合、別々の株ではない。別個の表現型が少数の変異から生じることがあるので、ゲノム配列の変異の程度は、株としてのバリアントの分類とは無関係である。

一例として、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのウイルス株バリアントからの抗原をコードするか、または野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではない少なくとも１つのウイルス株からの変異を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｂ．１．１．７系譜（ＵＫ）バリアント（２０Ｂ／５０１Ｙ．Ｖ１ＶＯＣ２０２０１２／０１）に関連付けられるスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。Ｂ．１．１．７系譜バリアントは、アミノ酸アスパラギン（Ｎ）が、チロシン（Ｙ）に置き換えられている、Ｎ５０１Ｙ変異である、５０１位のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に変異を有する。更に、バリアントは、自発的に何度も生じる６９／７０欠失を有し、スパイクタンパク質のコンフォメーション変化、Ｓ１／Ｓ２フリン切断部位付近のＰ６８１Ｈ変異、及びＯＲＦ８の変異によって引き起こされるＯＲＦ８ストップコドン（Ｑ２７ストップ）をもたらす。５０１．Ｖ２（南アフリカ、ＳＡ）バリアントは、スパイクタンパク質に、Ｎ５０１Ｙ及びＥ４８４Ｋを含む複数の変異を含むが、６９／７０に欠失を有さない。Ｅ４８４Ｋ変異は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体の少なくとも１つの形態と比較して、「脱出」変異であるとみなされるので、ウイルスの抗原性を変化させ得る。発見された他に変異としては、ウイルスの伝播速度を増加させると考えられているＤ６１４Ｇ変異、及びＮ５４３Ｙ変異（オランダ及びデンマークのミンク農場から出現した）が挙げられる。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、２つ以上のバリアントからの変異（例えば、Ｂ．１．１．７及び５０２Ｙ．Ｖ２バリアントで見出される変異の組み合わせ）を含み、複数の変異を有する構造的に改変されたバリアントである。

コロナウイルスのＳタンパク質は、２つの重要な機能サブユニットに分けられ得、そのうち、Ｓタンパク質の球状頭部を形成するＮ末端Ｓ１サブユニット、及びタンパク質の茎を形成するＣ末端Ｓ２領域があり、ウイルスエンベロープに直接埋め込まれている。潜在的な宿主細胞と相互作用すると、Ｓ１サブユニットは、宿主細胞上の受容体、特にアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体を認識して結合するが、Ｓタンパク質の最も保存された構成要素であるＳ２サブユニットは、ウイルスのエンベロープを宿主細胞膜と融合させることを担う。（例えば、Ｓｈａｎｇｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ．２０２０Ｍａｒ；１６（３）：ｅ１００８３９２を参照されたい）。三量体Ｓタンパク質三量体の各モノマーには、付着及び膜融合をそれぞれ媒介する２つのサブユニットＳ１及びＳ２が含有されている。インビボでの感染プロセスの一部として、２つのサブユニットは酵素的切断プロセスによって互いに分離される。Ｓタンパク質は、感染細胞のＳ１／Ｓ２部位で、インビボで、フューリンを介した切断によって最初に切断され、その後のセリンプロテアーゼ媒介性切断事象が、Ｓ１内のＳ２’部位で起こる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２では、Ｓ１／Ｓ２切断部位は、アミノ酸６７６－ＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲ／ＳＶＡ－６８８にある（配列番号１を参照されたい）。Ｓ２’切断部位は、アミノ酸８１１－ＫＰＳＫＲ／ＳＦＩ－８１８（配列番号２）にある。

本明細書で使用される場合、例えば、本発明の核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質抗原を設計する文脈において、「Ｓ１サブユニット」（例えば、Ｓ１サブユニット抗原）という用語は、Ｓタンパク質のＮ末端で始まり、Ｓ１／Ｓ２切断部位で終わるスパイクタンパク質のＮ末端サブユニットを指し、一方で「Ｓ２サブユニット」（例えば、Ｓ２サブユニット抗原）という用語は、Ｓ１／Ｓ２切断部位で開始し、スパイクタンパク質のＣ末端で終了するスパイクタンパク質のＣ末端サブユニットを指す。上記のように、当業者は、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質Ｓ１またはＳ２サブユニットがそれぞれ受容体結合または膜融合に必要であるが、Ｓ１またはＳ２の構造及び／または配列において、ある特定の量の変動が、スパイクタンパク質サブユニットに対する免疫応答を主に誘発しようとする場合、許容されることを理解する。例えば、コードされたサブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端からの、例えば、１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質サブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原の１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）は、タンパク質（複数可）の抗原特性を変えることなく許容され得る。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットは、構造及び機能によって容易に識別可能なドメインを更に含み、これは、ひいては、核酸ワクチン、特に本発明のｍＲＮＡワクチンによってコードされる抗原を設計する際に特徴となり得る。Ｓ１サブユニット内のドメインとしては、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が挙げられ、当該ＲＢＤドメインは、Ｓ２サブユニット内に受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を更に含み、ドメインとしては、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質テール（ＣＴ）としても知られている細胞質ドメインが挙げられる（ＬｕＲ．ｅｔａｌ．，上記、Ｗａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍａｒ２０２０，９４（７）ｅ００１２７－２０）。ＨＲ１及びＨＲ２ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の「融合コア領域」と呼ばれることもある（Ｘｉａｅｔａｌ．，２０２０ＣｅｌｌＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．Ｊａｎ；１７（１）：１－１２．）。Ｓ１サブユニットには、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、リンカー領域、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、第１のサブドメイン（ＳＤ１）、及び第２のサブドメイン（ＳＤ２）を含む。Ｓ２サブユニットには、とりわけ、第１のヘプタッドリピート（ＨＲ１）、第２のヘプタッドリピート（ＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質テールを含む。Ｓ１のＮＴＤ及びＲＢＤは、これらのドメインがベータコロナウイルス感染個体における中和抗体の標的であることが示されているので、本発明のワクチン設計アプローチのための優れた抗原である。

本明細書で提供される組成物は、いずれか１つ以上の全長もしくは部分的（配列の短縮または他の欠失）Ｓタンパク質サブユニット（例えば、Ｓ１またはＳ２サブユニット）、Ｓタンパク質サブユニットの１つ以上のドメインもしくはドメインの組み合わせ（例えば、ＳＤ１及び／またはＳＤ２の有無に関係なくＮＴＤ、ＲＢＤ、またはＮＴＤ－ＲＢＤ融合体）、または全長もしくは部分的及びＳ２タンパク質サブユニットのキメラをコードし得る、ｍＲＮＡを含む。その他のＳタンパク質サブユニット及び／またはドメイン構成は、本明細書で企図されている。

また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）のゲノムは、およそ２９，７００ヌクレオチド長の単一のプラス鎖ＲＮＡを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶの全体的なゲノム構成は、他のコロナウイルスのものと同様である。参照ゲノムは、少なくとも１４個のタンパク質をコードする１３個の遺伝子を含む。２つの大きなオーバーラップリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ゲノムの７１％を包含する。残りは、構造タンパク質Ｓ（スパイク）、Ｅ（小さなエンベロープ）、Ｍ（膜）、及びＮ（ヌクレオカプシド）の遺伝子を含む、１２個の潜在的なＯＲＦを有する。他の潜在的なＯＲＦは、既知のタンパク質との明らかな配列同一性を欠く、固有の想定されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的ポリペプチドをコードする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノムの詳細な分析は、ＪＭｏｌＢｉｏｌ２００３；３３１：９９１－１００４において刊行されている。

いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質のＳ１サブユニットをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質のＳ２サブユニットをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＥタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＮタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＭタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶタンパク質：Ｓタンパク質（Ｓ、Ｓ１、及び／またはＳ２）、Ｅタンパク質、Ｎタンパク質、及びＭタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、属ベータコロナウイルスのプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムは、２つの分岐群、分岐群Ａ及び分岐群Ｂに系統的に分類される。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのゲノムは、３、４ａ、４ｂ、及び５などの少なくとも４つの固有のアクセサリータンパク質、２つのレプリカーゼタンパク質（オープンリーディングフレーム１ａ及び１ｂ）、ならびにスパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、及び膜（Ｍ）タンパク質を含む４つの主要な構造タンパク質をコードする（ＡｌｍａｚａｎＦｅｔａｌ．ＭＢｉｏ２０１３；４（５）：ｅ００６５０－１３）。Ｓタンパク質は、Ｓ１サブユニット内の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を通じて受容体ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）を発現する細胞へのウイルス結合を媒介するのに特に重要である一方で、Ｓ２サブユニットは、その後、ウイルスと標的細胞膜との融合を介してウイルス侵入を媒介する（ＬｉＦ．ＪＶｉｒｏｌ２０１５；８９（４）：１９５４－６４、ＲａｊＶＳｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２０１３；４９５（７４４０）：２５１－４）。

いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質のＳ１サブユニットをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質のＳ２サブユニットをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶＥタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶＮタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶＭタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のＭＥＲＳ－ＣｏＶタンパク質：Ｓタンパク質（Ｓ、Ｓ１、及び／またはＳ２）、Ｅタンパク質、Ｎタンパク質、及びＭタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

ヒトコロナウイルスＯＣ４３は、種ベータコロナウイルス－１（属ベータコロナウイルス、サブファミリーコロナウイルス亜科、ファミリーコロナウイルス科、階級目ニドウイルス）におけるエンベローププラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。４つのＨＣｏＶ－ＯＣ４３遺伝子型（Ａ～Ｄ）は、組換えから生じる可能性が最も高い遺伝子型Ｄによって同定されている。アルファコロナウイルス属の種であるＨＣｏＶ－２２９Ｅとともに、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３は、一般的な風邪を引き起こす既知のウイルスの中にある。両方のウイルスは、乳児、高齢者、ならびに化学療法を受けている個人及びＨＩＶ－ＡＩＤＳを有する個人などの免疫不全の個人における肺炎を含む、重度の下気道感染症を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）は、ＨＥ遺伝子を有するプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスであり、これは、グループ２またはベータコロナウイルスとして区別される。ゲノム構成は、他のＩＩ群コロナウイルスのものと同じであり、特徴的な遺伝子順序１ａ、１ｂ、ＨＥ、Ｓ、Ｅ、Ｍ、及びＮを有する。更に、アクセサリータンパク質遺伝子は、ＳとＥ遺伝子との間（ＯＲＦ４）、ならびにＮ遺伝子の位置（ＯＲＦ８）に存在する。ＴＲＳは、おそらく、Ｅを除く各ＯＲＦに先行するＡＡＵＣＵＡＡＡＣ配列内に位置する。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＫＵ１ＨＥタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＫＵ１Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＫＵ１Ｅタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＫＵ１Ｍタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＫＵ１Ｎタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のＨＫＵ１タンパク質：ＨＥタンパク質、Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、Ｎタンパク質、及びＭタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスは、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３またはＨＣｏＶ－ＮＬ）である。ヒトニューヘイブンコロナウイルス、ＨＣｏＶ－ＮＨは、ヒトコロナウイルスＮＬ６３の株である。Ｓ、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質をコードすると予測される遺伝子は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３ゲノムの３’部分に見出される。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＮＬ６３Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＮＬ６３Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＮＬ６３ＫＵ１Ｅタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＮＬ６３Ｍタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＮＬ６３Ｎタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のＮＬ６３タンパク質：Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、Ｎタンパク質、及びＭタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）は、階級目ニドウイルスのファミリーコロナウイルス科のサブファミリーコロナウイルス亜科のアルファコロナウイルス属の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス種である。ヒトコロナウイルスＯＣ４３とともに、それは、一般的な風邪の原因となっている。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ抗原性タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

パラミクソウイルス科ファミリー
いくつかの実施形態では、ワクチンは、パラミクソウイルス科ファミリーからの少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。最近、ウイルスのパラミクソウイルス科ファミリーは、部分的に再分類され、名前が変更されている。本明細書で使用される「パラミクソウイルス科ファミリー」という用語は、ＶｉｒｕｓＴａｘｏｎｏｍｙ：２０１４Ｒｅｌｅａｓｅ；ＥＣ４６，ＫｉｎｇｓｔｏｎａｎｄＭｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ，Ｊｕｌｙ２０１４，Ｅｍａｉｌｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ２０１５（ＭＳＬ＃２９）（ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｔａｘｏｎｏｍｙ）において同定されている分類に記載のウイルスの群の範囲内である任意のウイルスを指す。この分類では、パラミクソウイルス科ファミリーは、サブファミリー内の全てのウイルス：パラミクソウイルス亜科（すなわち、属：アクアパラミクソウイルス、アブラウイルス、フェラウイルス、ヘニパウイルス、モルビリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス）及びニューモウイルス科（すなわち、属：メタニューモウイルス、ニューモウイルス）内の全てのウイルスを含む。これらは、パラミクソウイルス科ファミリーであると分類されるウイルス、ならびにニューモウイルス亜科のファミリーまたはサブファミリーを含む。パラミクソウイルス科ファミリーメンバーは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、１５～１９キロ塩基長である。いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、ニューモウイルス亜科（例えば、呼吸器合胞体ウイルスまたはヒトメタニューモウイルス）のサブファミリーからである。いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドは、パラミクソウイルスの属（例えば、パラインフルエンザウイルス）からである。いくつかの実施形態では、呼吸ウイルス抗原性ポリペプチドは、モルビリウイルスの属（例えば、はしか）からである。

ＲＳＶ（ヒトオルトニューモウイルスとしても知られている）は、主に表面Ｇ糖タンパク質の差から生じる、群Ａ及び群Ｂとして知られている少なくとも２つの抗原性サブグループに存在する。２つのＲＳＶ表面糖タンパク質－Ｇ及びＦ－は、呼吸器上皮の細胞との付着及びそれへの付着を媒介する。Ｆ表面糖タンパク質は、隣接する細胞の癒着を媒介する。これは、合胞体細胞の形成を生じる。ＲＳＶのゲノムは、Ｆ、Ｇ、及びＳＨを含む少なくとも３つの表面糖タンパク質、Ｌ、Ｐ、Ｎ、及びＭ２を含む４つのヌクレオカプシドタンパク質、ならびに１つのマトリックスタンパク質Ｍをコードする。糖タンパク質Ｆは、ビリオンと宿主膜との間の融合によってウイルス貫通を指示する。糖タンパク質Ｇは、ＩＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、主要な付着タンパク質である。ＳＨは、短い一体型膜タンパク質である。マトリックスタンパク質Ｍは、脂質二重層の内層に見出され、ビリオン形成を補助する。ヌクレオカプシドタンパク質Ｌ、Ｐ、Ｎ、及びＭ２は、ＲＳＶゲノムの複製及び転写を調節する。

いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＲＳＶＦタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＲＳＶＧタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＲＳＶＬタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＲＳＶＰタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＲＳＶＮタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＲＳＶＭ２タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＲＳＶＭタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のＲＳＶタンパク質：Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、Ｌタンパク質、Ｐタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍ２タンパク質、及びＭタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）は、その表面糖タンパク質においてＲＳＶと実質的な相同性を共有する。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ｈＭＰＶ融合タンパク質（Ｆ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ｈＭＰＶＦタンパク質のＦ１またはＦ２サブユニットをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ｈＭＰＶ糖タンパク質（Ｇ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ｈＭＰＶマトリックスタンパク質（Ｍ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ｈＭＰＶリンタンパク質（Ｐ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ｈＭＰＶ核タンパク質（Ｎ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ｈＭＰＶＳＨタンパク質（ＳＨ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のｈＭＰＶタンパク質：Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、Ｍタンパク質、Ｐタンパク質、Ｎタンパク質、及びＳＨタンパクのうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

パラインフルエンザウイルスは、マイナス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。パラインフルエンザウイルスは、サブファミリーパラミクソウイルス科に属し、３つの属：レスピロウイルス（ＰＩＶ－１、ＰＩＶ－３（現在は、ヒトレスピロウイルス１及び３として知られている）、ならびにセンダイウイルス（ＳｅＶ））、ルブラウイルス（ＰＩＶ－２、ＰＩＶ－４、及びおたふく風邪ウイルス）、及びモルビリウイルス（麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、及びイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ））に細分化されている。約１５，５００ヌクレオチド長のマイナス鎖ＲＮＡ分子であるそれらのゲノムは、２つのエンベロープ糖タンパク質、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、Ｆ１及びＦ２サブユニットへと切断される融合タンパク質（ＦまたはＦ０）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、ならびにウイルスレプリカーゼ（Ｌ）を含むいくつかの非構造タンパク質をコードする。ＰＩＶ－１を除く全てのパラインフルエンザウイルスは、感染した細胞においてＩＦＮシグナル伝達を遮断し、したがって、毒性因子として作用する非構造Ｖタンパク質を発現する（例えば、ＮｉｓｈｉｏＭｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ．２００８；８２（１３）：６１３０－３８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、パラインフルエンザウイルスは、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）である。

いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＰＩＶ３融合タンパク質（Ｆ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＰＩＶ３Ｆタンパク質のＦ１またはＦ２サブユニットをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＰＩＶ３ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ｖａｎＷｙｋｅＣｏｅｌｉｎｇｈＫＬｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ．１９８７；６１（５）：１４７３－７７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＰＩＶ３マトリックスタンパク質（Ｍ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＰＩＶ３リンタンパク質（Ｐ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＰＩＶ３核タンパク質（Ｎ）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のＰＩＶ３タンパク質：Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、Ｍタンパク質、Ｐタンパク質、及びＮタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

麻疹ウイルス（ＭｅＶ）は、一本鎖マイナス鎖エンベロープＲＮＡウイルスである。ウイルスの糖タンパク質複合体は、受容体結合及び膜融合を媒介する。特に、ＭｅＶ融合（Ｆ）タンパク質は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質による受容体結合後、膜融合を実行する（ＭｕｈｌｅｂａｃｈＭＤｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ２００８；８２（２２）：１１４３７－４５）。ＭｅＶＰ遺伝子は、３つのタンパク質：必須ポリメラーゼ補因子であるＰ、ならびに複数の機能を有するが、培養細胞におけるウイルス増殖に厳密には必要とされないＶ及びＣをコードする。Ｖは、アミノ末端ドメインをＰと共有するが、亜鉛結合カルボキシル末端ドメインを有する一方で、Ｃは、オーバーラップリーディングフレームから翻訳される。ＭｅＶＣタンパク質は、感染因子である。複製中、Ｐタンパク質は、入ってくる単量体ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質をそのアミノ末端ドメインと結合させ、それらを組み立てるために発生期のリボヌクレオカプシドへと配置する。Ｐタンパク質アミノ末端ドメインは、自然にアンフォールディングされる（ＤｅｖｅａｕｘＰｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ２００４；７８（２１）：１１６３２－４０）。

いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭｅＶＨＡタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭｅＶＦタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭｅＶＰタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭｅＶＶタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＭｅＶＣタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、以下のＭｅＶタンパク質：ＨＡタンパク質、Ｆタンパク質、Ｐタンパク質、Ｖタンパク質、及びＣタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。

ヘニパウイルスは、ファミリーパラミクソウイルス科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスの別の種類であり、ニパ及びヘンドラウイルスを含む。これらのウイルスは、その中に埋め込まれたＦ（融合）タンパク質三量体及びＧ（付着）タンパク質四量体のスパイクを有する脂質膜を有する。脂質の下には、Ｎ（ヌクレオカプシド）タンパク質に密接に結合し、Ｌ（大）及びＰ（リンタンパク質）タンパク質に会合しているゲノムＲＮＡの単一の螺旋鎖で構成されるウイルスマトリックスタンパク質シェルがある。

ライノウイルスは、ウイルスのファミリーピコルナウイルス科の別のメンバーである。ライノウイルスは、ヒトにおいて最も一般的なウイルス感染因子であり、一般的な風邪の原因となる因子である。ライノウイルスは、７２００～８５００ｎｔ長の一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有する。ゲノムの５’末端には、ウイルスがコードするタンパク質があり、哺乳類のｍＲＮＡと同様に、３’ポリＡテールがある。ウイルス粒子は、封入化されておらず、構造が二十面体である。ヒトライノウイルスは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＶＰ４の４つのウイルスタンパク質を含有するカプシドを有する。より小さなＶＰ４タンパク質は、カプシドとＲＮＡゲノムとの間の界面に位置する。ＶＰ１－ＶＰ３は、ウイルスの外部に位置するので、多くの場合、ライノウイルスのエピトープ標的である。ヒトライノウイルスの主要な受容体は、上気道であり、ＣＤ５４（分化クラスター５４）としても知られているＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）である。

更なるウイルスが同定及び配列決定されるにつれて、ウイルス分類が進化することは、当業者には理解されるであろう。ヒト疾患に関与する呼吸器ウイルスの具体的な例が、本明細書に記載され、例示されているが、本発明のｍＲＮＡワクチンは、他のヒト呼吸器ウイルス、例えば、これらのファミリーのウイルス、または具体的に記載されていない関連するヒト呼吸器ウイルスを含み得る。ウイルスが、特定のファミリーまたはサブファミリーに属するものとして本明細書で具体的に同定される範囲まで、それらのウイルスは、後に再分類されるか、または他の刊行物もしくは供給源において異なってもしくは一貫せずに同定される場合でさえも、それらのファミリー／サブファミリー内であると明示的に示される。過去、現在、または将来に、ウイルスが、本明細書に記載されるかまたは特許請求されるファミリー、サブファミリー、もしくは属のうちの１つの下に分類される場合、本明細書で定義され使用される際には、それらの用語は、そのウイルスファミリー、サブファミリー、または属の範囲内にあるとみなされることが理解されるであろう。

組み合わせワクチン
本開示の実施形態は、組み合わせワクチン（例えば、組み合わせｍＲＮＡワクチン）を提供する。本開示の「組み合わせワクチン」は、各々が少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む少なくとも３つのポリヌクレオチドを含む、ワクチンを指す。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、最良の中和抗体応答を誘導することをもたらすので、ウイルス表面受容体結合糖タンパク質、または含まれるウイルスのタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、３～１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１１、３～１２、３～１３、３～１４、３～１５、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、４～１１、４～１２、４～１３、４～１４、４～１５、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１１、５～１２、５～１３、５～１４、５～１５、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１１、６～１２、６～１３、６～１４、６～１５、７～８、７～９、７～１０、７～１１、７～１２、７～１３、７～１４、７～１５、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、８～１３、８～１４、８～１５、９～１０、９～１１、９～１２、９～１３、９～１４、９～１５、１０～１１、１０～１２、１０～１３、１０～１４、１０～１５、１１～１２、１１～１３、１１～１４、１１～１５、１２～１３、１２～１４、１２～１５、１３～１４、１３～１５、または１４～１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、全てのＲＮＡは、宿主細胞へのウイルス侵入を促進するための受容体結合に関与するウイルス表面タンパク質、例えば、糖タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも３つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも４つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、コロナウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コロナウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも３、４、５、または６つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、パラミクソウイルス科抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、パラミクソウイルス科抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも３、４、５、または６つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原をコードするｍＲＮＡは、製剤中に等しい量（例えば、１：１の比）、例えば、１：１の比の別個のＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ、または１：１の比の別個のＨＡ及びＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡが存在する。４つの異なるＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む例示的なワクチンでは、「１：１の比」のｍＲＮＡは、１：１：１：１の比の第１、第２、第３、及び第４のｍＲＮＡでｍＲＮＡを含むであろう。４つの異なるＨＡ抗原及び４つの異なるＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む例示的なワクチンでは、「１：１の比」のｍＲＮＡは、１：１：１：１の比の第１、第２、第３、及び第４のｍＲＮＡで異なるＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含み、１：１：１：１の比の第１、第２、第３、及び第４のｍＲＮＡで異なるＮＡ抗原をコードする複数のｍＲＮＡを含むであろう。

いくつかの実施形態では、異なるＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡの比は、互いに等価であり（例えば、１：１：１：１）、異なるＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡの比は、互いに等価である（例えば、１：１：１：１）が、しかしながら、ＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡ対ＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡの比は、１：１ではない。４つの異なるＨＡ抗原及び４つの異なるＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含む例示的なワクチンでは、「３：１の比」のｍＲＮＡは、３：３：３：３の比の第１、第２、第３、及び第４のｍＲＮＡで異なるＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含み、１：１：１：１の比の第１、第２、第３、及び第４のｍＲＮＡで異なるＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含むであろう。いくつかの実施形態では、ＨＡ：ＮＡの比は、１：１、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、または４：１である。

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドは、１：１：１の比で組み合わせワクチン中に存在する。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス（例えば、インフルエンザ）対第２のウイルス対第３のウイルスからの４：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス（例えば、インフルエンザ）対第２のウイルス対第３のウイルスからの３：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス（例えば、インフルエンザ）対第２のウイルス対第３のウイルスからの５：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス（例えば、インフルエンザ）対第２のウイルス対第３のウイルスからの４：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス（例えば、インフルエンザ）対第２のウイルス対第３のウイルスからの１：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、第１のウイルス（例えば、インフルエンザ）対第２のウイルス対第３のウイルスからの１：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチン（例えば、多価ＲＮＡ組成物）は、第１のウイルス対第２のウイルス対第３のウイルスからの８：２：２、４：１：１、４：２：２、４：２：１、４：３：２、４：３：３、４：３：２、または４：２：２の、呼吸ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む。

いくつかの実施形態では、組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々は、組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドと互いに補完的であり、干渉しない。すなわち、組み合わせワクチンの投与から産生される抗原は、対象における防御免疫応答を誘発する抗原の能力を減少させであろうような様式で、ワクチンに応答して産生される任意の他の抗原に対する免疫応答を顕著に干渉しない。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、ワクチン中の各個々の抗原に対する、中和抗体に関する添加剤である。図１～４に示されるように、インフルエンザ抗原、ＲＳＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む組み合わせワクチンの投与は、各単一の抗原をコードするｍＲＮＡの別々の投与と比較して、各それぞれの抗原に対する中和抗体価を阻害または低減しなかった。

本発明の各実施形態または態様では、特徴とされるワクチンは、ＬＮＰ内にカプセル化されたｍＲＮＡを含むことが理解される。各々の固有のｍＲＮＡを独自のＬＮＰにカプセル化することは可能であるが、ｍＲＮＡワクチン技術では、単一のＬＮＰ生成物に複数のｍＲＮＡをカプセル化できるという大きな技術的利点を享受する。

核酸
本開示の組成物は、呼吸器ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（少なくとも１つの）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、及び／または５’キャップ類似体を更に含む。

いくつかの実施形態では、組成物中の第１、第２、及び／または第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドは、互いに少なくとも１００ヌクレオチド（例えば、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはそれ以上のヌクレオチド）だけ長さが異なる。

また、本開示の呼吸器ウイルスワクチンは、任意の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３’ＵＴＲを含み得ることが理解されるべきである。例示的なＵＴＲ配列としては、配列番号３～６が挙げられるが、しかしながら、他のＵＴＲ配列は、本明細書に記載のＵＴＲ配列のうちのいずれかとして使用または交換され得る。いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号３（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）及び配列番号４（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号５（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）及び配列番号６（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）から選択される配列を含む。また、ＵＴＲは、本明細書で提供するＲＮＡポリヌクレオチドから省いてもよい。

核酸は、ヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）のポリマーを含む。したがって、核酸はポリヌクレオチドとも呼ばれる。核酸は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、及び／またはこれらのキメラ及び／またはその組み合わせであってもよく、これらを含んでもよい。

「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）タンパク質（天然に存在するか、天然に存在しないか、またはアミノ酸の修飾ポリマー）をコードする任意のＲＮＡを指し、これは、翻訳されて、インビトロで、インビボで、インサイチュで、またはエクスビボでコードされたポリペプチドを産生し得る。当業者であれば、別段明記しない限り、本出願に記載の核酸配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を挙げることができるが、その配列がｍＲＮＡを表す場合、「Ｔ」は、「Ｕ」に置換されることを理解するであろう。したがって、本明細書で特定の配列同定番号によって開示及び同定されるＤＮＡのうちのいずれも、ＤＮＡに相補的な対応するｍＲＮＡ配列についても開示しており、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」が、「Ｕ」で置換される。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続的なストレッチである。ＯＲＦは、典型的にはタンパク質をコードする。本明細書に開示の配列は、追加のエレメント、例えば、５’及び３’ＵＴＲを更に含み得るが、それらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のＲＮＡポリヌクレオチドに必ずしも存在する必要はないことが理解されるであろう。

バリアント（変異株）
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、呼吸器ウイルス抗原及び複数のウイルス抗原を表す構造的に改変されたバリアントをコードする、ＲＮＡを含む。抗原性バリアントまたは構造的に改変されたバリアントは、野生型（天然に存在する）、ネイティブ、または参照タンパク質配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。抗原／構造的に改変されたバリアントは、ネイティブまたは参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。

本開示の核酸によってコードされるバリアント抗原／ポリペプチドは、例えば、それらの免疫原性を向上する、それらの免疫原性、すなわち、生成される免疫応答の幅に関する幅を変動させる、それらの発現を向上する、及び／または対象におけるそれらの安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する、多数の望ましい特性のうちのいずれかを付与する、アミノ酸変化を含有し得る。バリアント抗原／ポリペプチドは、慣用的な変異誘発技術を用いて作製し、適宜アッセイして、所望の特性を有するか否かを決定し得る。発現レベル及び免疫原性を決定するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、そのようなアッセイの例は実施例のセクションに記載されている。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性は、当該技術分野において認識されている技法を使用して、例えば、ワクチン接種した対象における抗原の発現を経時的に評価することによって、及び／または誘導された免疫応答の持続性を確認することによって測定することができる。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性時の安定性を分析することによって測定してもよいし、またはｉｎｓｉｌｉｃｏ予測を用いて測定してもよい。そのような実験及びｉｎｓｉｌｉｃｏ評価のための方法は、当該技術分野において既知である。

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡもしくはＲＮＡＯＲＦを含むか、または野生型（天然に存在する）もしくはバリアント抗原のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む。

「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定した、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係を指す。同一性とはまた、配列間または配列同士の配列関連性の程度も指し、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の鎖間の一致数によって決定される。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一の一致のパーセントを測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）」とは、当該配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成した後の第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一の、アミノ酸または核酸の候補配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージと定義される。整列のための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されたギャップ及びペナルティにより価値が異なる場合があることが理解される。概して、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に既知である配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定して、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものに対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールとしては、ＢＬＡＳＴスイートのツールが挙げられる（ＳｔｅｐｈｅｎＦ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ（１９９７），「ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ」，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。別の普及しているローカルアラインメント技法は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）である。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアラインメント技法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）″Ａｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄａｐｐｌｉｃａｂｌｅｔｏｔｈｅｓｅａｒｃｈｆｏｒｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアラインメント方法よりも速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアラインメントを生成すると言われる高速最適グローバルシーケンスアラインメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。

したがって、参照配列、特に本明細書に開示のポリペプチド（例えば、抗原）配列と比較して、置換、挿入、及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するタンパク質または糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つ以上のリジンが、ペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加され得る。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在のために使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性を増加させるために、またはビオチン化を可能にするために使用され得る。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、短縮配列をもたらしてもよい。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、あるいは、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるか、または固体支持体に連結された、より大きな配列の一部としての配列の発現に応じて欠失され得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）などのための（またはこれらをコードする）配列は、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置換され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することによって、充填して安定性を改善してもよい。他の実施形態では、埋もれた水素結合ネットワークを疎水性残基により置き換えて、安定性を改善することができる。また他の実施形態では、グリコシル化部位を除去し、適切な残基で置き換えてもよい。そのような配列は、当業者には容易に同定可能である。本明細書で提供される配列のうちのいくつかは、例えば、ｍＲＮＡワクチンの調製で使用する前に欠失され得る、配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含有することも理解されるべきである。

当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、目的の呼吸器ウイルス抗原の範囲内であるとみなされる。例えば、本明細書で提供されるのは、その断片が、免疫原性であり、呼吸器ウイルスに対する防御免疫応答を付与することを条件として、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照抗原配列よりも少なくとも１アミノ酸残基短いが、それ以外は同一である、ポリペプチド配列を意味する）である。

参照タンパク質と同一であるが短縮されている構造的に改変されたバリアントに加えて、いくつかの実施形態では、構造的に改変されたバリアントは、参照抗原と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を有する抗原を含む。構造的に改変されたバリアントのいくつかの例は、本明細書で提供されるかまたは参照される配列に示される。抗原／抗原性ポリペプチドの長さは、約４、６、または８アミノ酸から全長タンパク質までの範囲をとり得る。

安定化エレメント
天然に存在する真核生物ｍＲＮＡ分子は、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）テールなどの他の構造的特徴に加えて、限定されるものではないが、その５’末端（５’ＵＴＲ）及び／または３’末端（３’ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、安定化エレメントを含有し得る。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲは両方とも、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾、少なくとも１つの５’末端キャップを有する少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含み、脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用するインビトロ転写反応中に同時に完了して、製造業者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成することができる：３´－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、転写後に完了されて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成し得る（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を用いて生成して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて終わりから３番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて終わりから４番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。酵素は、組換え供給源に由来し得る。

３’－ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドの連なりである。いくつかの場合では、最長約４００のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチン（例えば、多価ＲＮＡ組成物）は、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％超のポリＡテールＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、組成物は安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａのタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと会合する。その発現レベルは細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、ヒストンのステムループとの結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して少なくとも３つのヌクレオチド５’及び２つのヌクレオチド３’を含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び任意選択で、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを向上すべきである。コードされるタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせであって、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的にも作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増大させる組み合わせを含む。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせによる相乗効果は、エレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、天然に存在するステムループの３’にあるおよそ１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドのストレッチを含み、これはヒストンプレｍＲＮＡから成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ｓｎＲＮＡの結合部位に相当する。いくつかの実施形態では、この核酸はイントロンを含まない。

ｍＲＮＡは、エンハンサー及び／またはプロモータ配列を含有しても含有しなくてもよく、これらは、修飾されても修飾されなくてもよく、活性化されても活性化されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、概してヒストン遺伝子に由来し、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または全体的に逆相補的な配列の分子内塩基対を含み、これがこの構造のループを形成する。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれとも塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡに存在する場合が多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、概して、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対（非ワトソン・クリック型塩基対）が生じることがある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５ヌクレオチドの長さを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のＡＵリッチな配列が除去されている。これらの配列（ＡＵＲＥＳと称されることがある）は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチン中に残存していてもよい。

シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、組成物は、呼吸器ウイルス抗原に融合したシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有するｍＲＮＡを含む。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端側の１５～６０アミノ酸を含み、典型的には、分泌経路上の膜透過に必要であるため、真核生物及び原核生物の両方でほとんどのタンパク質が分泌経路に侵入するのを普遍的に制御している。真核生物において、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、プロセシングのために、成長ペプチド鎖の膜横断輸送を開始する。ＥＲプロセシングにより成熟タンパク質が生成され、シグナルペプチドは、典型的には、宿主細胞のＥＲ常駐シグナルペプチダーゼにより、前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されないまま保たれ、膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化も促進し得る。

シグナルペプチドの長さは、１５～６０アミノ酸であり得る。例えば、シグナルペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドの長さは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長である。

（本来、呼吸器ウイルス抗原以外の遺伝子の発現を調節する）異種遺伝子からのシグナルペプチドは、当該技術分野において既知であり、これを所望の特性について試験し、次いで本開示の核酸に組み込んでもよい。

融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、抗原性融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。したがって、コードされた抗原（複数可）は、一緒に結合された２つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質断片）を含み得る。あるいは、タンパク質抗原が融合されるタンパク質は、それ自体に対する強力な免疫応答を促進しないが、むしろ、呼吸器ウイルス抗原に対する強力な免疫応答を促進する。抗原性融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、各々の起源のタンパク質からの機能的特性を保持している。

足場部分
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡワクチンは、足場部分に連結された呼吸器ウイルス抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのような足場部分は、本開示の核酸によってコードされる抗原に所望の特性を付与する。例えば、足場タンパク質は、例えば、抗原の構造を改変すること、抗原の取り込み及び処理を改変すること、及び／または結合パートナーへの抗原の結合を引き起こすことによって、抗原の免疫原性を改善し得る。

いくつかの実施形態では、足場部分は、１０～１５０ｎｍの直径、すなわち、免疫系の様々な細胞との最適な相互作用に非常に好適なサイズ範囲を有する、非常に対称であり、安定であり、かつ構造的に組織化されているタンパク質ナノ粒子へと自己組織化することができる、タンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質またはウイルス様粒子を使用して、安定なナノ粒子構造を形成し得る。そのようなウイルスタンパク質の例は、当該技術分野において既知である。例えば、いくつかの実施形態では、足場部分は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは、約２２ｎｍの平均直径を有し、核酸を欠く、球状粒子を形成し、したがって非感染性である（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ１４（２０１６）５８－６８）。いくつかの実施形態では、足場部分は、ＨＢＶに感染したヒト肝臓から得られるウイルスコアに類似する、２４～３１ｎｍの直径の粒子へと自己組織化する、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。１８０または２４０のプロトマーに対応する、３００Å及び３６０Åの直径の異なるサイズのナノ粒子の２つのクラスへと自己組織化する、生成されたＨＢｃＡｇ。いくつかの実施形態では、呼吸器ウイルス抗原は、呼吸器ウイルス抗原を表示するナノ粒子の自己組織化を促進にするために、ＨＢｓＡＧまたはＨＢｃＡＧに融合される。

いくつかの実施形態では、細菌タンパク質プラットフォームが使用され得る。これらの自己組織化タンパク質の非限定的な例としては、フェリチン、ルマジン、及びエンカプスリンが挙げられる。

フェリチンはタンパク質であり、その主な機能は細胞内の鉄の貯蔵である。フェリチンは、４つのアルファヘリックスバンドルで各々構成される２４個のサブユニットで作製され、これらは、八面体対称性を有する四次構造で自己組織化する（ＣｈｏＫ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８）。フェリチンのいくつかの高分解能構造が決定されており、ヘリコバクターピロリフェリチンが２４個の同一のプロトマーで作製されていることが確認されているが、動物では、単独で組織化することができるか、または異なる比の２４個のサブユニットの粒子へと組み合わせることができる、フェリチン軽鎖及び重鎖が存在する（ＧｒａｎｉｅｒＴ．ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＩｎｏｒｇＣｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１、ＬａｗｓｏｎＤ．Ｍ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、ロバストな熱的及び化学的安定性を備えたナノ粒子に自己アセンブルする。したがって、フェリチンナノ粒子は、抗原を運び、抗原を露出させるのによく適している。

ルマジンシンターゼ（ＬＳ）も、抗原ディスプレイ用のナノ粒子プラットフォームとしてよく適している。リボフラビンの生合成における最後から２番目の触媒ステップを担うＬＳは、古細菌、細菌、真菌、植物、及び真性細菌を含む多種多様な生物に存在する酵素である（ＷｅｂｅｒＳ．Ｅ．ＦｌａｖｉｎｓａｎｄＦｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｒｉｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．２０１４）。ＬＳ（ルマジンシンテターゼ）モノマーは１５０アミノ酸の長さであり、隣接するタンデムアルファヘリックスのベータシートからなる。ホモペンタマーから直径１５０Åのカプシドを形成する１２個のペンタマーの対称組織化物までのその形態的汎用性を示す、いくつかの異なる四次構造がＬＳについて報告されている。１００超のサブユニットのＬＳケージについてさえ、記載されている（ＺｈａｎｇＸ．ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００６；３６２：７５３－７７０）。

熱親和性Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａから単離された新規のタンパク質ケージナノ粒子であるエンカプスリンはまた、自己組織化ナノ粒子の表面上に抗原を提示するためのプラットフォームとして使用され得る。エンカプスリンは、それぞれ２０及び２４ｎｍの内径及び外径を有する薄い二十面体Ｔ＝１対称ケージ構造を有する同一の３１ｋＤａのモノマーの６０個のコピーから組織化される（ＳｕｔｔｅｒＭ．ｅｔａｌ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２００８，１５：９３９－９４７）。Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａにおけるエンカプスリンの正確な機能は未だ明確に理解されていないが、その結晶構造が最近解明されており、その機能は、酸化ストレス応答に関与するＤｙＰ（染料脱色ペルオキシダーゼ）及びＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）などのタンパク質をカプセル化する細胞コンパートメントとして仮定された（ＲａｈｍａｎｐｏｕｒＲ．ｅｔａｌ．ＦＥＢＳＪ．２０１３，２８０：２０９７－２１０４）。

いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、フォールドンドメインに融合した呼吸器ウイルス抗原をコードする。フォールドンドメインは、例えば、バクテリオファージＴ４フィブリチンから得ることができる（例えば、ＴａｏＹ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９７Ｊｕｎ１５；５（６）：７８９－９８を参照されたい）。

リンカーと切断可能なペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、本明細書では融合タンパク質と呼ばれる、２つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも１つまたは各ドメインの間に位置するリンカーを更にコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーであっても、またはプロテアーゼ感受性リンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと称される自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当該技術分野において記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳＯＮＥ６：ｅ１８５５６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号７）リンカーである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、介在リンカーを有する３つのドメインを含有し、ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメインの構造を有する。

当該技術分野において既知である切断可能なリンカーを本開示に関連して使用してもよい。そのような例示的なリンカーとしては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、及びＥ２Ａリンカーが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１７／１２７７５０を参照されたい）。当業者は、他の当該技術分野において認識されているリンカーが、本開示の構築物（例えば、本開示の核酸によってコードされる）での使用に好適である場合があることを理解するであろう。当業者は同様に、他のポリシストロン性構築物（同じ分子内で複数の抗原／ポリペプチドを別々にコードするｍＲＮＡ）が、本明細書に提供される使用に好適である場合があることを理解するであろう。

配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化方法は、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つ以上のＯＲＦが、コドン最適化され得る。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的生物及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にするために；ＧＣ含量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増加させるか、または二次構造を低減するために；遺伝子の構築または発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化するために；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするために；タンパク質トラフィッキング配列を挿入または除去するために；コードされたタンパク質（例えばグリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加するために；タンパク質ドメインの追加、除去またはシャッフルのために；制限サイトを挿入または削除するために；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するために；タンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれることを可能にするように翻訳速度を調節するために；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減もしくは排除するために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野において既知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋＣＡ）からのサービス及び／または専有の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、該オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列ＯＲＦ（例えば、呼吸器ウイルス抗原をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して、９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、呼吸器ウイルス抗原をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して、９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、呼吸器ウイルス抗原をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して、８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、呼吸器ウイルス抗原をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して、８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、呼吸器ウイルス抗原をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して、７５％未満の配列同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、呼吸器ウイルス抗原をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して、６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、呼吸器ウイルス抗原をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して、６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされる呼吸器ウイルス抗原と免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）抗原をコードする。

修飾ｍＲＮＡは、哺乳類宿主細胞にトランスフェクションされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞による発現が可能である。

いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃのレベルが向上されたものであり得る。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するＲＮＡより機能的に安定していると考えられる。一例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示している。遺伝暗号の縮退のため、該修飾は、得られるアミノ酸を変更することなくＲＮＡの安定性を更に高めるものに既存のコドンを置換することによって機能する。該方法は、該ＲＮＡのコード領域に限定される。

化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、転写ＲＮＡ内に存在するもの（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）などの標準的なヌクレオシド残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、ＤＮＡ内に存在するもの（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）などの標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。

化学修飾
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、呼吸器ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含み、核酸が、標準（非修飾）であり得るか、または当該技術分野において既知であるように修飾され得る、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオシド、または天然に存在しない修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオシドであり得る。そのような修飾としては、当該技術分野において認識されているように、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖部分、主鎖部分または核酸塩基部分における修飾を挙げられ得る。

いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、概して既知であるか、または当該技術分野において認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、特に、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。

いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在しない修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、概して既知であるか、または当該技術分野において認識されているものである。そのような天然に存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、特に、公開されている米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３６７７３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３６７５９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３６７７１号、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７に見出すことができ、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（１つより多くの）異なる種類の標準的な及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つまたは２つ以上の（任意に異なる）種類の標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、及び／または修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオシドを含有する。

いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における分解の減少を示す。

いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ細胞または生物における低減された免疫原性（例えば、低減された生得的応答）を呈し得る。

核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、核酸の合成または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然修飾ヌクレオチドを含む。その修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基もしくはピリミジン塩基、または糖に存在してよい。修飾は、化学合成によって導入されてもよいし、またはポリメラーゼ酵素を用いて鎖の末端もしくは鎖中の任意の場所に導入することもできる。核酸の領域のいずれかが化学修飾されていてよい。

本開示は、核酸の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせた、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）を含有する化合物またはその誘導体を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組換え的に合成され得る。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。そのような領域は、可変骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。

修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準的なまたは修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有するこれらの核酸における、非標準的な塩基と標準的な塩基との間、または２つの相補的な非標準的塩基構造間の水素結合が可能になる。そのような非標準的な塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドのイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルプソイドウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、化学修飾を含む前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかのうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、核酸は、１－メチル－プソイドウリジンで一様に修飾され得、つまり、当該ｍＲＮＡ配列の全てのウリジン残基が１－メチル－プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、その配列に存在するいずれかの種類のヌクレオシド残基を、上に示した残基のような修飾残基に置き換えることによって、一様に修飾することができる。

本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的にも完全にも修飾することができる。例えば、１つ以上または全てまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）は、本開示の核酸、またはその所定の配列領域（例えば、ポリＡテールを含むか、または除外するｍＲＮＡ）において均一に修飾され得る。いくつかの実施形態において、本開示の核酸（またはその配列領域）内の全てのヌクレオチドＸが修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または以下の組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであり得る。

核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体のヌクレオチド含有量に関して、または１つ以上の種類のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上に関して）あるいは任意の介在するパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含有し得る。残りの割合にはいずれも、修飾されていないＡ、Ｇ、ＵまたはＣが存在することになることは分かるであろう。

ｍＲＮＡは、１％以上１００％までの修飾ヌクレオチド、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチド）を含有し得る。例えば、その核酸は、修飾ウラシルまたは修飾シトシンのような修飾ピリミジンを含有してもよい。いくつかの実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。

非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが、少なくとも１つの目的の抗原をコードするように設計される場合、核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンのすぐ後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳の観点から、ＵＴＲによって果たされる調節的役割に関する証拠が増えている。ＵＴＲの調節特徴は、特に分子の安定性を向上させるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない臓器部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方調節の制御を確保するための特定の特徴も組み込むことができる。様々な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が当該技術分野において既知であり、利用可能である。

５’ＵＴＲとは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす機能を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に既知であるコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号８）を有し、Ｒが、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、それに別の「Ｇ」が続く。５′ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。

本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連付けられる天然に見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲであり、すなわち、天然には存在しない。合成ＵＴＲとしては、例えば、遺伝子発現を増加させる、その特性を改善するために変異させたＵＴＲ、ならびに完全に合成されたものが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（８２７８０６３、９０１２２１９）、ヒトシトクロムｂ－２４５ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（ＵＳ８２７８０６３、９０１２２１９）が挙げられる。ＣＭＶ即時早期１（ＩＥ１）遺伝子（ＵＳ２０１４／０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号９７）（ＷＯ２０１４／１４４１９６）も使用され得る。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ／２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６７；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が使用される。

いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号３及び配列番号４から選択される配列を含む。

３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然または野生型の３′ＵＴＲは、一連のアデノシン及びウリジンが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャは、ターンオーバー率の高い遺伝子で特に一般的である。それらの配列特徴及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を３つのクラスに分離することができる（Ｃｈｅｎｅｔａｌ，１９９５）：クラスＩＡＲＥは、Ｕリッチ地域内のＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含有する。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩＡＲＥを含有する。クラスＩＩＡＲＥは２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種類のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩＡＲＥＳは、あまりよく定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎは、このクラスの中でも十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質はメッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、特にＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を高めることが報告されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３′ＵＴＲに操作することは、ＨｕＲ結合をもたらし、故に、インビボでのメッセージの安定化をもたらす。

３’ＵＴＲＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性を調節することができる。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去または変異させて、細胞内安定性を増加させ、故に、結果として生じるタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞に様々なＡＲＥエンジニアリング分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを使用して関連タンパク質にトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に生成されたタンパク質をアッセイしてもよい。

当業者であれば、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列とともに使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲを、合成３’ＵＴＲと、異種３”ＵＴＲとともに使用することができる。

非ＵＴＲ配列はまた、核酸内の領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロン配列またはイントロン配列の部分は、本開示の核酸の領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびに核酸レベルを増加させ得る。

特徴の組み合わせをフランキング領域に含めてもよいし、他の特徴の中に含有してもよい。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５´ＵＴＲ及び／またはポリＡテールのテンプレート化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３´ＵＴＲによって隣接され得る。５’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１００／２９３６２５号及びその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５ＵＴＲなどの、同じ及び／または異なる遺伝子からの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る。

任意の遺伝子からの任意のＵＴＲを核酸の領域に組み込んでもよいことを理解されたい。更に、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも、本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置されてもよいし、または向きもしくは位置が改変されてもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで逆転、短縮、延長、作製されてもよい。本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、ＵＴＲ配列に関するものであり、ＵＴＲが参照配列に関して何らかの形で変化したことを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上に教示されるように、配向もしくは位置の変化によって野生型もしくは天然ＵＴＲと比較して、改変され得るか、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位によって改変されてもよい。「改変された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）を産生する任意のこれらの変化はバリアントＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重、または四重のＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用する「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列にコード化されているものである。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１０／０１２９８７７号に記載の二重ベータ－グロビン３′ＵＴＲが使用され得る。

パターン化されたＵＴＲを有することも本開示の範囲内である。本明細書で使用される「パターン化ＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントが１回、２回、または３回以上反復されるような反復パターンまたは交互パターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。

いくつかの実施形態では、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する、転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織または発達中のある時期に発現されるタンパク質のファミリーに属する場合がある。これらの遺伝子のいずれかからのＵＴＲは、同じかまたは異なるファミリーのタンパク質の任意の他のＵＴＲとスワッピングして、新しいポリヌクレオチドを作製してもよい。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」とは、最も広い意味において使用され、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指す。

非翻訳領域は、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含んでもよい。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野において既知であるＴＥＥが挙げられ得る。

ＲＮＡのインビトロ転写
本開示の態様は、ＲＮＡ転写物の産生を生じる条件下で、ＤＮＡテンプレート（例えば、第１の投入ＤＮＡ及び第２の投入ＤＮＡ）をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントなど）と接触させることを含む、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）を生成（合成）する方法を提供する。このプロセスは、「インビトロ転写」または「ＩＶＴ」と称される。ＩＶＴ条件は、通常、プロモータを含有する精製された線状ＤＮＡテンプレート、ヌクレオシド三リン酸、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、及びＲＮＡポリメラーゼを必要とする。転写反応で使用される正確な条件は、特定の用途に必要なＲＮＡの量に依拠する。典型的なＩＶＴ反応は、転写緩衝液中でＤＮＡテンプレートをＲＮＡポリメラーゼ及びＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（またはヌクレオチド類似体）を含むヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートすることにより行われる。５’末端グアノシン三リン酸を有するＲＮＡ転写物は、この反応から生成される。

いくつかの実施形態では、野生型Ｔ７ポリメラーゼは、ＩＶＴ反応で使用される。いくつかの実施形態では、修飾されたまたはバリアントＴ７ポリメラーゼは、ＩＶＴ反応で使用される。いくつかの実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、野生型Ｔ７（ＷＴＴ７）ポリメラーゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、国際出願公開第ＷＯ２０１９／０３６６８２号または同第ＷＯ２０２０／１７２２３９号によって記載されるＴ７ポリメラーゼバリアントであり、その各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、０．０１ｍｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌの濃度で反応（例えば、ＩＶＴ反応）において存在する。例えば、該ＲＮＡポリメラーゼは、反応中に、濃度０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌまたは１．０ｍｇ／ｍｌで含まれ得る。

投入デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼの核酸テンプレートとして機能するＤＮＡテンプレートは、目的のポリペプチド（例えば、抗原性ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから５’に位置し、機能的に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモータ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ）を含む。また、ＤＮＡテンプレートは、目的の遺伝子の３’末端に位置するポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、投入ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む。本明細書で使用される場合、「プラスミドＤＮＡ」または「ｐＤＮＡ」は、細胞内の染色体ＤＮＡから物理的に分離され、独立して複製することができる染色体外ＤＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡは、細胞から単離される（例えば、プラスミドＤＮＡ調製物として）。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡは、１つ以上の異種核酸、例えば、ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートとして機能し得る治療用タンパク質をコードする核酸を含有し得る複製起点を含む。プラスミドＤＮＡは、環化または線状であり得る（例えば、制限酵素消化によって線状化されたプラスミドＤＮＡ）。

多価ｍＲＮＡ構築物は、典型的には、一度に１つのｍＲＮＡ生成物を転写し、各ｍＲＮＡ生成物を精製し、次いで、製剤化前に精製されたｍＲＮＡ生成物を一緒に混合することによって生成される。この種類のプロセスは、特に適正製造基準（ＧＭＰ）スケールでは、かなりの時間及び金銭的投資を必要とする。

本開示の態様は、多価の異なるＲＮＡ（例えば、２つ以上の異なるＲＮＡ）を含む組成物を生成するための方法に関する。いくつかの態様では、本明細書に開示の多価転写の方法は、以前の方法を使用して生成されたＲＮＡ組成物よりも高い純度を有する多価ＲＮＡ組成物を生じる、ＩＶＴ反応のための投入ＤＮＡの量を選択する事に関与する。ＤＮＡ分子間の長さの差、ＤＮＡ分子のポリＡテール効率など、及び／または共ＩＶＴ反応混合物中に存在する他の試薬（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）など）などの、共転写される（例えば、インビトロで同時に転写される）ＤＮＡ分子のある特定の特徴または特性が、生じる多価ＲＮＡ組成物に組成バイアスを導入し得ることが観察された。驚くべきことに、そのような組成バイアスを低減する方法が、発見された。いくつかの実施形態では、投入ＤＮＡ量を修飾することは、以前の方法によって生成されたＲＮＡ組成物と比較して、増加した純度（例えば、ポリＡテールを含むＲＮＡのパーセンテージによって測定される）を有する多価ＲＮＡ組成物の生成を生じる。また、本明細書に記載の同時ＩＶＴ方法は、ＩＶＴ反応で使用される投入ＤＮＡの長さに大きな差（例えば、１００超のヌクレオチド）がある場合でも、高純度の多価ＲＮＡ組成物を生じることも驚くべき発見であった。

したがって、いくつかの態様では、本開示は、多価ＲＮＡ組成物を生成するための方法であって、方法が、第１のＲＮＡをコードするＤＮＡ分子の第１の集団、及び第１のＲＮＡとは異なる第２のＲＮＡをコードするＤＮＡ分子の第２の集団を含む、反応混合物中の少なくとも２つのＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写することと、ＩＶＴによって生成される第１のＲＮＡ対第２のＲＮＡの所定の比を有する多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法を提供する。

本明細書で使用される場合、「多価ＲＮＡ組成物」という用語は、２つを超える異なるｍＲＮＡを含む組成物を指す。多価ＲＮＡ組成物は、２つ以上の異なるＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物は、１０を超える異なるＲＮＡを含む。「異なるＲＮＡ」という用語は、多価ＲＮＡ組成物中の別のＲＮＡと同じではない任意のＲＮＡを指す。例えば、２つのＲＮＡは、ｉ）（２つの長さのうちの短い方の全体にわたってＲＮＡが同一であるか否かにかかわらず）異なる長さ、ｉｉ）異なるヌクレオチド配列、ｉｉｉ）異なる化学修飾パターン、またはｉｖ）前述の任意の組み合わせを有する場合、異なる。

いくつかの実施形態では、同時ＩＶＴ反応における各投入ＤＮＡ（例えば、投入ＤＮＡ分子の集団）は、異なる供給源（例えば、異なる細胞または細胞集団において、例えば、別々に合成される）から得られる。いくつかの実施形態では、各投入ＤＮＡ（例えば、投入ＤＮＡの集団）は、異なる細菌細胞または細菌細胞の集団から得られる。例えば、投入ＤＮＡの３つの集団を有する同時ＩＶＴ反応では、第１の投入ＤＮＡは、細菌細胞集団Ａで産生され、第２の投入ＤＮＡは、細菌細胞集団Ｂで産生され、第３の投入ＤＮＡは、細菌集団Ｃで産生され、Ａ、Ｂ、及びＣの各々は、同じ細菌培養物ではない（例えば、同じ容器またはプレートで共培養される）。投入ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）の集団を得る方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊｏｓｅｐｈ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２００１によって記載されるように既知である。

いくつかの態様は、多価同時ＩＶＴ反応で使用されるＤＮＡの量を正規化することを含む。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡのモル質量に基づく。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡの分解速度に基づく。いくつかの実施形態では、正規化は、得られるｍＲＮＡの分解速度に基づいている（例えば、反応混合物中に存在するポリＡバリアント、またはＴ７ポリメラーゼ不全転写物または切断された転写物に基づいて測定される）。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡのヌクレオチド含有量（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはそれらの任意の組み合わせの量）に基づく。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡの純度に基づく。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡのポリＡテール効率に基づく。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡの長さに基づく。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、所定のｍＲＮＡ比であり、（例えば、組成物中の異なるＲＮＡの数に応じて）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるＲＮＡの比を含み得る。いくつかの実施形態では、所定の比は、１０超のＲＮＡ間の比を含む。本明細書で使用される場合、「所定のｍＲＮＡ比」は、多価ＲＮＡ組成物中のＲＮＡ分子の所望の最終的な比を指す。ＲＮＡ組成物の所望の最終的な比は、ＲＮＡによってコードされる最終的なペプチド（複数可）またはポリペプチド産物（複数可）に応じて異なる。例えば、多価ＲＮＡ混合物は、２つのＲＮＡ（例えば、第１の抗原をコードするＲＮＡ及び第２の抗原をコードするＲＮＡ）を含み得、この例では、ＲＮＡ分子の望ましい最終的な比は、１（第１の抗原ＲＮＡ）：１（第２の抗原ＲＮＡ）であり得る。別の例では、多価ＲＮＡ組成物は、（例えば、ワクチンとして使用する場合）異なる抗原性ペプチドをコードするいくつかの（例えば、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の）ＲＮＡを含み得、その場合、望ましい比は、３～１０個のＲＮＡ（例えば、ａ：ｂ：ｃ、ａ：ｂ：ｃ：ｄ、ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ、ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ、ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ：ｇ、ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ：ｇ：ｈ、ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ：ｇ：ｈ：ｉ、ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ：ｇ：ｈ：ｉ：ｊなど、式中、ａ～ｊの各々が、１～１０の数である）を含み得る。

いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡ中に存在する最低レベル（例えば、最低モル質量、（例えば、投入ＤＮＡ及び／または産出ＲＮＡの）分解速度、ヌクレオチド含有量、純度、及び／またはポリＡテール効率）に基づく。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡに存在する最高レベル（例えば、最高モル質量、（例えば、投入ＤＮＡ及び／または産出ＲＮＡの）分解速度、ヌクレオチドコンテキスト、純度、及び／またはポリＡテール効率）に基づく。いくつかの実施形態では、正規化は、投入ＤＮＡのＲＮＡ産生の速度（例えば、反応混合物中の投入ＤＮＡのＲＮＡ産生の最高速度または投入ＤＮＡのＲＮＡ産生の最低速度）に基づく。

いくつかの態様では、本開示は、投入ＤＮＡ（例えば、第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡ）の量が、事前に定義された構成要素のｍＲＮＡ比を有する多価ＲＮＡ組成物の産生を改善するために調整または正規化されるＩＶＴ方法に関する。

本明細書に記載の、投入ＤＮＡ間のサイズにおける大きな差（例えば、長さが１００、２００、５００、１０００個、またはそれ以上のヌクレオチドの差）及び／またはＩＶＴ中の所与のＤＮＡのポリＡテール効率などの多価ＲＮＡ組成物純度に影響を及ぼすある特定の因子は、それらの因子のうちの１つ以上に基づいて、投入ＤＮＡの量を正規化することによって、ＩＶＴの前に対処され得る。

ＩＶＴ反応で使用される投入ＤＮＡ（例えば、投入ＤＮＡ分子の集団）の数は、多価ＲＮＡ組成物に含まれることを望む異なるＲＮＡ分子の数に応じて変動し得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、２つ以上の異なる投入ＤＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の異なる投入ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、１５超の異なる投入ＤＮＡを含む。「異なる投入ＤＮＡ」という用語は、異なるＲＮＡをコードする、例えば、ｉ）異なる長さ（２つの長さのうちの短い方の全体にわたってＲＮＡが同一であるか否かにかかわらず）、ｉｉ）異なるヌクレオチド配列、ｉｉｉ）異なる化学修飾パターン、またはｉｖ）前述の任意の組み合わせを有する、投入ＤＮＡを包含する。

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応で使用される投入ＤＮＡ分子のうちの２つ以上は、異なる長さを有する（例えば、異なる数のヌクレオチドを含む）ｍＲＮＡ分子をコードする。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物中の異なる投入ＤＮＡ分子によってコードされるｍＲＮＡ分子のうちの２つ以上の間の長さの差は、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドよりも大きい（例えば、組成物中の２つの投入ＤＮＡは、互いに長さが７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド以内ではないｍＲＮＡ分子をコードする）。いくつかの実施形態では、異なる投入ＤＮＡ分子によってコードされるｍＲＮＡ分子のうちの２つ以上の間の長さの差は、１００ヌクレオチド、例えば、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、またはそれ以上よりも大きい。

特定の実施形態では、組み合わせワクチン（例えば、多価ＲＮＡ組成物）は、第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子、第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第３のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることによって生成され、第１のＤＮＡ分子、第２のＤＮＡ分子、及び第３のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる。いくつかの実施形態では、異なる供給源は、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物であり、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物は、共培養されない。いくつかの実施形態では、異なる供給源は、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物であり、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物は、共培養される。いくつかの実施形態では、反応混合物中に存在する第１、第２、及び第３のＤＮＡ分子の量は、インビトロ転写の開始前に正規化されている。

いくつかの実施形態では、線状化された第１のＤＮＡ分子、線状化された第２のＤＮＡ分子、及び線状化された第３のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得る。

いくつかの実施形態では、インビトロ転写テンプレートは、５′非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３′ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。特定の核酸配列組成物及びインビトロ転写テンプレートの長さは、テンプレートによってコードされるｍＲＮＡに依存する。

「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されたｍＲＮＡ転写物の最初のコドン）から直接上流（すなわち、５’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写産物が生成されている場合、５’ＵＴＲはプロモータ配列を含み得る。そのようなプロモータ配列が、当該技術分野において既知である。本開示のワクチンには、そのようなプロモータ配列が存在しないことが理解されるべきである。

「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない終止コドン（すなわち、翻訳終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）から直接下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。

「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続ストレッチであり、ポリペプチドをコードする。

「ポリ（Ａ）テール」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にある、ｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、インビボ）において、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質での酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終結、及び／または核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助する。

いくつかの実施形態では、核酸は、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。

インビトロの転写系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。

ＮＴＰは、社内で製造してもよいか、供給業者から選択してもよいか、または本明細書に記載されるように合成してもよい。ＮＴＰは、限定されないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択され得る。

任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本開示の方法で使用され得る。ポリメラーゼは、限定されないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに／または限定されないが、化学修飾核酸及び／またはヌクレオチドを含む、修飾核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込むことが可能なポリメラーゼなどの変異体ポリメラーゼから選択され得る。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を排除する。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介しキャッピングされる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。

非コード配列
本開示の態様は、ｍＲＮＡ、例えば、各々が呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードする別個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、２～１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、多価ＲＮＡ組成物に関し、各ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、固有の識別子配列を有する非翻訳領域（ＵＴＲ）に１つ以上の非コード配列を含む。本明細書で使用される場合、「非コード配列」とは、別の生体分子がその配列と結合したときに他の生体分子を識別するように機能する、生体分子（例えば、核酸、タンパク質など）の配列を指す。典型的には、非コード配列は、標的の生物学的分子の配列内に組み込まれるか、またはその配列に付加され、目的の標的分子を同定するための参照として利用される、異種配列である。いくつかの実施形態では、非コード配列は、標的核酸内に組み込まれるか、または標的核酸に付加され、標的核酸を同定するための参照として利用される、核酸（例えば、異種または合成核酸）の配列である。いくつかの実施形態では、非コード配列は、式（Ｎ）ｎのものである。いくつかの実施形態では、ｎは、５～２０、５～１０、１０～２０、７～２０、または７～３０の範囲の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、及びＣ、またはそれらの類似体から独立して選択される各ヌクレオチドである。したがって、いくつかの実施形態は、（ｉ）目的の標的配列（例えば、（例えば、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質をコードする）コード配列）を有し、（ｉｉ）固有の非コード配列を含む、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のインビトロ転写されたｍＲＮＡは、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの非翻訳領域（ＵＴＲ）に１つ以上の非コード配列を含む。ｍＲＮＡのＵＴＲに非コード配列を含めることによって、非コード配列がペプチドへと翻訳されるのが防止される。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールの下流（例えば、後ろ）に位置する。いくつかの実施形態では、非コード配列は、ｍＲＮＡのＯＲＦの最後のコドンとｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間に位置する。いくつかの実施形態では、ＵＴＲに位置するポリヌクレオチド非コード配列は、１～１０個のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド非コード配列を含むＵＴＲは、ＲＮａｓｅＨ切断部位などの１つ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）のＲＮＡｓｅ切断部位を更に含む。いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物の各々の異なるＲＮＡは、異なる（例えば、固有の）非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物のＲＮＡは、ＲＮＡのポリヌクレオチド非コード配列に従って検出及び／または精製される。いくつかの実施形態では、試料（例えば、反応産生物または薬物産生物）中のｍＲＮＡの存在を同定するか、または異なるｍＲＮＡの相対比を決定するために、ｍＲＮＡ非コード配列が使用される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ非コード配列は、ディープシーケンシング、ＰＣＲ、及びサンガーシーケンシングのうちの１つ以上を使用して検出される。例示的な非コード配列としては、ＡＡＣＧＵＧＡＵ、ＡＡＡＣＡＵＣＧ、ＡＴＧＣＣＵＡＡ、ＡＧＵＧＧＵＣＡ、ＡＣＣＡＣＵＧＵ、ＡＣＡＵＵＧＧＣ、ＣＡＧＡＵＣＵＧ、ＣＡＵＣＡＡＧＵ、ＣＧＣＵＧＡＵＣ、ＡＣＡＡＧＣＵＡ、ＣＵＧＵＡＧＣＣ、ＡＧＵＡＣＡＡＧ、ＡＡＣＡＡＣＣＡ、ＡＡＣＣＧＡＧＡ、ＡＡＣＧＣＵＵＡ、ＡＡＧＡＣＧＧＡ、ＡＡＧＧＵＡＣＡ、ＡＣＡＣＡＧＡＡ、ＡＣＡＧＣＡＧＡ、ＡＣＣＵＣＣＡＡ、ＡＣＧＣＵＣＧＡ、ＡＣＧＵＡＵＣＡ、ＡＣＵＡＵＧＣＡ、ＡＧＡＧＵＣＡＡ、ＡＧＡＵＣＧＣＡ、ＡＧＣＡＧＧＡＡ、ＡＧＵＣＡＣＵＡ、ＡＵＣＣＵＧＵＡ、ＡＵＵＧＡＧＧＡ、ＣＡＡＣＣＡＣＡ、ＧＡＣＵＡＧＵＡ、ＣＡＡＵＧＧＡＡ、ＣＡＣＵＵＣＧＡ、ＣＡＧＣＧＵＵＡ、ＣＡＵＡＣＣＡＡ、ＣＣＡＧＵＵＣＡ、ＣＣＧＡＡＧＵＡ、ＡＣＡＧＵＧ、ＣＧＡＵＧＵ、ＵＵＡＧＧＣ、ＡＵＣＡＣＧ、及びＵＧＡＣＣＡが挙げられる。

いくつかの実施形態では、多価ＲＮＡ組成物は、
（ａ）第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子、第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子、及び第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることであって、第１のＤＮＡ分子、第２のＤＮＡ分子、及び第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる、組み合わせることと、
（ｂ）線状化された第１のＤＮＡ分子、線状化された第２のＤＮＡ分子、及び線状化された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法によって生成される。異なる供給源は、共培養され得ない細菌細胞培養物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＶＴの開始前に反応混合物中に存在する第１、第２及び第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０のＤＮＡ分子の量は正規化されている。

化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造してもよい。核酸の固相化学合成は、分子を固体支持体上に固定し、反応溶液中で段階的に合成する自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。

液相化学合成。モノマービルディングブロックの連続付加による本開示の核酸の合成は、液相で実行され得る。

合成方法の組み合わせ。上記で考察した合成方法には、各々独自の利点及び制限がある。その制限を克服するために、これらの方法を組み合わせる試みが行われている。そのような方法の組み合わせは、本開示の範囲内である。酵素ライゲーションと組み合わせた、固相または液相化学合成の使用は、化学合成単独では得ることができない長鎖核酸を生成する効率的な方式が提供される。

核酸領域または部分領域のライゲーション
リガーゼによる核酸の組み立ても使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介して、ポリヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチド及び／または環状核酸などの核酸は、１つ以上の領域または部分領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡ断片をリガーゼ触媒反応によって結合させて、異なる機能を有する組換えＤＮＡを生成することができる。２つのオリゴデオキシヌクレオチド（５’ホスホリル基を含むもの及び遊離３’ヒドロキシル基を含むもの）がＤＮＡリガーゼの基質として機能する。

精製
本明細書に記載の核酸の精製には、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣベースの精製方法、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などの当該技術分野において既知である方法によって実施することができる。「精製された」という用語は、「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」とは、別の不適切なもの、不純なもの、または粗悪なものに変えてしまう任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれに処理もしくは精製方法を施す前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。

品質保証及び／または品質管理のチェックは、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣなどの方法を使用して行うことができる。

いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法によって配列決定され得る。

定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑膜液、痰性体液、羊膜液、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から取得され得る。

アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを使用して実施することができ、エクソソームは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫組織化学を使用して単離することができる。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離することができる。

これらの方法により、研究者は、核酸の残留レベルまたは送達レベルをリアルタイムでモニターすることができる。これは、本開示の核酸が、いくつかの実施形態では、構造的または化学的修飾により内因性形態とは異なることから可能である。

いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓスペクトロメーターの非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）というスペクトロメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸は、核酸が適切なサイズであるか否か決定し、核酸の分解が生じていないか確認するために分析され得る。核酸の分解は、限定するものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認され得る。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には、イオン化可能なアミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質構成要素を、目的の核酸カーゴとともに含む。本開示の脂質ナノ粒子は、当該技術分野において一般的に既知であるような構成要素、組成物、及び方法（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２１１７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１（これらは全てその全体が参照により本明細書に援用される）を参照）を使用して生成し得る。

本開示のワクチンは、典型的には、脂質ナノ粒子内に製剤化される。ワクチンは、例えば、マイクロ流体及び２つの流体の流れのＴ型混合（一方がｍＲＮＡを含有し、他方が脂質構成要素を有する）などの混合プロセスを用いて製造することができる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、イオン化可能なアミノ脂質、リン脂質（ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなど）、ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ－ＤＭＧとしても知られている１，２－ジミリストイル－ＯＴ－グリセロールメトキシポリエチレングリコールなど）、及び構造脂質（コレステロールなど）をアルコール（例えば、エタノール）中で合わせることによって調製される。脂質は、所望のモル比が得られるように組み合わせ、水及びアルコール（例えば、エタノール）で希釈して、例えば、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭの最終脂質濃度にすることができる。

ｍＲＮＡ及び脂質構成要素を含むワクチンは、例えば、脂質溶液を、約５：１～約５０：１の脂質構成要素対ｍＲＮＡの重量：重量比でｍＲＮＡ溶液と組み合わせることによって調製され得る。脂質溶液は、マイクロ流体ベースのシステム（例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ）を使用して、例えば、約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の流速で、ｍＲＮＡ溶液中に急速に注入して、懸濁液を産生してもよい（例えば、約１：１～約４：１の水対アルコール比で）。

ワクチンは、透析による処理を行い、アルコール（例えば、エタノール）を除去し、緩衝液交換を実施することができる。製剤は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して、例えば、一次生成物よりも大きな容量で（例えば、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の使用）、例えば、１０ｋＤの分子量カットオフを用いて、透析することができる。前述の例示的な方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。限定されるものではないが、Ｔ型及び直接注入を含む代替プロセスを使用して同じナノ沈殿を達成することもできる。

本開示のワクチンは、典型的には、脂質ナノ粒子内で製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なアミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０ｍｏｌ％、２０～４０ｍｏｌ％、２０～３０ｍｏｌ％、３０～６０ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、４０～６０ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、または５０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能アミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１０～２０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１５～２５ｍｏｌ％、１５～２０ｍｏｌ％、または２０～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、または２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５～５５ｍｏｌ％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０ｍｏｌ％、２５～４５ｍｏｌ％、２５～４０ｍｏｌ％、２５～３５ｍｏｌ％、２５～３０ｍｏｌ％、３０～５５ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４５ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、３０～３５ｍｏｌ％、３５～５５ｍｏｌ％、３５～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％、３５～４０ｍｏｌ％、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４０～４５ｍｏｌ％、４５～５５ｍｏｌ％、４５～５０ｍｏｌ％、または５０～５５ｍｏｌ％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のステロールを含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０ｍｏｌ％、０．５～５ｍｏｌ％、１～１５ｍｏｌ％、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、２～１５ｍｏｌ％、２～１０ｍｏｌ％、２～５ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び約０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、２０～４０ｍｏｌ％のコレステロール、及び約０．５～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、９～１３％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％のコレステロール、及び約２～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１ｍｏｌ％の中性脂質、６８．５ｍｏｌ％のコレステロール、及び約２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体を含み、式中：
Ｒ_１が、Ｃ_５～３０アルキル、Ｃ_５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子と一緒になって複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
各Ｒ_５が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ_６が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１～１２アルキル及びＣ_２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）_２である場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４、もしくは５である場合、－Ｎ（Ｒ）_２ではなく、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２である場合、５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではないものを含む。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５～３０アルキル、Ｃ_５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子と一緒になって複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換のＣ_１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱが、Ｃ_３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、これは、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノ－またはジ－アルキルアミノ、及びＣ_１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されており、各ｎが１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
各Ｒ_５が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ_６が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１～１２アルキル及びＣ_２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５～３０アルキル、Ｃ_５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子と一緒になって複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ_３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２から選択され、各ｎが、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、Ｑが５～１４員の複素環である場合、ならびに（ｉ）Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱである（ここでｎは、１もしくは２である）、または（ｉｉ）Ｒ_４が－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲである（ここでｎは、１である）、または（ｉｉｉ）Ｒ_４が、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）_２である場合、Ｑは、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ_５が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ_６が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１～１２アルキル及びＣ_２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５～３０アルキル、Ｃ_５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子と一緒になって複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換のＣ_１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱが、Ｃ_３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２から選択され、各ｎが、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
各Ｒ_５が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ_６が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３～６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１～１２アルキル及びＣ_２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５～３０アルキル、Ｃ_５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_２－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子と一緒になって複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱまたは－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが－Ｎ（Ｒ）_２であり、ｎが３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ_６が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５～３０アルキル、Ｃ_５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが結合している原子とともに複素環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）_２からなる群から選択され、ここでＱが、－Ｎ（Ｒ）_２であり、かつｎが、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ_６が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ”が、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）：
またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍが、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ_１が、結合またはＭ’であり、Ｒ_４が、非置換のＣ_１－３アルキル、または－（ＣＨ_２）_ｎＱであり、ここでＱが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、及びＣ_２－１４アルケニルからなる群から独立して選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）：
またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ_１が、結合またはＭ’であり、Ｒ_４が、非置換のＣ_１－３アルキル、または－（ＣＨ_２）_ｎＱであり、ここでｎが、２、３、または４であり、Ｑが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、及びＣ_２－１４アルケニルからなる群から独立して選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、もしくは（ＩＩｅ）：
のもの、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、Ｒ_４は、本明細書に記載の通りである。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩｄ）：
のもの、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｎは、２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ_２～Ｒ_６は、本明細書に記載の通りである。例えば、Ｒ_２及びＲ_３の各々は、Ｃ_５－１４アルキル及びＣ_５－１４アルケニルからなる群から独立して選択され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む：

いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。

いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なアミノ脂質を含み、ここで、非カチオン性脂質はＤＳＰＣであり、構造脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＤＭＧ－ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）である。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５モルパーセント（ｍｏｌ％）のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、４５～４７、４５～４８、４５～４９、４５～５０、４５～５２、４６～４８、４６～４９、４６～５０、４６～５２、４６～５５、４７～４８、４７～４９、４７～５０、４７～５２、４７～５５、４８～５０、４８～５２、４８～５５、４９～５０、４９～５２、４９～５５、または５０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１１、５～１２、５～１３、５～１４、５～１５、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１１、６～１２、６～１３、６～１４、６～１５、７～８、７～９、７～１０、７～１１、７～１２、７～１３、７～１４、７～１５、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、８～１３、８～１４、８～１５、９～１０、９～１１、９～１２、９～１３、９～１４、９～１５、１０～１１、１０～１２、１０～１３、１０～１４、１０～１５、１１～１２、１１～１３、１１～１４、１１～１５、１２～１３、１２～１４、１３～１４、１３～１５、または１４～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３５～４０ｍｏｌ％のステロール（例えば、コレステロール）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、３５～３６、３５～３７、３５～３８、３５～３９、３５～４０、３６～３７、３６～３８、３６～３９、３６～４０、３７～３８、３７～３９、３７～４０、３８～３９、３８～４０、または３９～４０ｍｏｌ％のコレステロールを含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５または４０ｍｏｌ％のコレステロールを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２，１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３．ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、１、１．５、２、２．５、または３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧとを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２０：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約５０ｎｍ～約１５０ｎｍである。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約７０ｎｍ～約１２０ｎｍである。

多価ワクチン
本明細書で提供される組成物は、同じかまたは異なる種の２つ以上の抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得、すなわち、組成物は、多価組成物（例えば、ワクチン）であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の呼吸器ウイルス抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個、またはそれ以上の呼吸器ウイルス抗原をコードし得る。

いくつかの実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるｍＲＮＡは、同じ脂質ナノ粒子内に製剤化され得る（例えば、４つのＮＡ抗原及び４つのＨＡ抗原が、単一の脂質ナノ粒子内に製剤化されるか、またはインフルエンザ抗原及びコロナウイルス抗原が、単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。他の実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡが、別々の脂質ナノ粒子内に製剤化されてもよい（各ＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。脂質ナノ粒子は、次に、組み合わされて単一のワクチン組成物（例えば、複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含むワクチン組成物）として投与され得るか、または別々に投与され得る。

医薬製剤
本明細書で提供されるのは、例えば、ヒト及び他の哺乳類における呼吸器ウイルスの予防または治療のための組成物（例えば、薬学的組成物）、方法、キット、及び試薬である。本明細書で提供される組成物は、治療剤または予防剤として使用され得る。それらは、呼吸器ウイルス感染症を予防及び／または治療するための医薬品において使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡを含有する呼吸器ウイルスワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与され得、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて、抗原性ポリペプチド（抗原）を産生する。

組成物（例えば、ＲＮＡを含む）の「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞種類、投与手段、ＲＮＡの物理的特性（例えば、長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾ヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、ならびに他の決定因子、例えば、対象の年齢、体重、身長、性別、及び全体的健康状態に基づく。典型的には、組成物の有効量は、対象の細胞内での抗原産生の関数として、誘導または追加免疫された免疫応答を提供する。いくつかの実施形態では、有効量は、組み合わせワクチンの単回用量またはブースター用量を伴う組み合わせワクチンの単回用量に基づいて、対象における感染症を予防するか、または呼吸器感染症の重症度を低減するために必要な量である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含有する組成物の有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的である。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクションの増大（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増大によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。

「薬学的組成物」という用語は、活性薬剤と、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断的または療法的使用に特に好適なものにする不活性または活性の担体との組み合わせを指す。「医薬的に許容される担体」とは、対象への投与後または投与時に、望ましくない生理学的作用を引き起こさないものである。医薬組成物中の担体は、有効成分に適合性であり、それを安定化させることが可能であるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を活性薬剤の送達のための医薬担体として利用してもよい。医薬的に許容される担体の例としては、限定されるものではないが、剤形として使用可能な組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤が挙げられる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の好適な医薬用担体及び希釈剤、ならびにそれらを使用するための医薬的必需品は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。

いくつかの実施形態では、本開示による（ポリヌクレオチド及びそれらのコードされたポリペプチドを含む）組成物は、呼吸器ウイルス感染症の治療または予防のために使用され得る。ある組成物は、健康な個体または潜伏期間中の感染初期または症状発現後の活動性感染中に、積極的な免疫化スキームの一環として予防的に投与されても、または治療的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。

本明細書に開示のワクチンは、組み合わせワクチン（すなわち、抗原をコードする両方のｍＲＮＡが同じ製剤中に含まれる）として、または別々のワクチン（すなわち、第１の抗原をコードするｍＲＮＡ及び第２の抗原をコードするｍＲＮＡが、別々に投与される）として、抗原特異的免疫応答を誘導するために、対象に投与され得る。ワクチンが別々のワクチンとして投与される場合、２つのｍＲＮＡは、同時に（すなわち、互いの１時間以内に）または異なる時間に（すなわち、１時間、１２時間、２４時間、２日、７日、２週間を超えて別々に）対象に投与され得る。ワクチンが別々のワクチンとして投与される場合、２つのｍＲＮＡは、同じ部位または異なる部位で（すなわち、別々の腕への注射として）対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、対象が受ける第１の抗原（例えば、インフルエンザ抗原）または第２の抗原（例えば、ＰＩＶ３抗原）をコードする核酸を含む、唯一のワクチンであり得る。あるいは、ワクチンは、プライム及び／またはブースター用量として、様々な組み合わせで投与され得る。

ワクチンは、血清陽性または血清陰性の対象に投与することができる。例えば、対象は、治療を受けたことがなくても、抗原を有するウイルスと反応する抗体を有していなくてもよく、抗原が、ワクチンのｍＲＮＡによってコードされるウイルス抗原またはその断片である。そのような対象は、そのワクチンに対して血清陰性であると言われる。あるいは、対象は、以前に抗原を担持するウイルスに感染したことがあるか、または以前に抗原に対する抗体を誘導する用量のワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を投与されたことがあり得るので、ワクチンのｍＲＮＡによってコードされるウイルス抗原に対する既存の抗体を有し得る。そのような対象は、そのワクチンに対して血清陽性であると言われる。いくつかの場合では、対象は、以前にウイルスに曝露したことがある場合があるが、ウイルスの特定のバリアントもしくは株、またはそのバリアントもしくは株に関連付けられる特定のワクチンに曝露したことがない場合がある。そのような対象は、特定のバリアントまたは株に対して血清陰性であるとみなされる。

したがって、本開示は、対象における第１の抗原（例えば、インフルエンザ抗原）及び第２の抗原（例えば、ＰＩＶ３抗原）に対する強力な中和抗体を誘発する組成物（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を提供する。そのような組成物は、いくつかの実施形態では、血清陽性の対象に投与されても、または血清陰性の対象に投与されてもよい。血清陰性の対象は、治療を受けたことがない場合があり、対象が免疫化されている特定のウイルスと反応する抗体を有していない場合がある。血清陰性の対象は、以前にそのウイルス、バリアント、もしくは株に感染したことがあるか、または以前にそのウイルス、バリアント、もしくは株に対する抗体を誘導する用量のワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を投与されたことがあり得るので、特定のウイルスに対する既存の抗体を有し得る。

いくつかの実施形態では、組成物は、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体株（本明細書ではバリアントとも呼ぶ）からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、またはそれ以上）のコロナウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、単一の脂質ナノ粒子内に、異なるバリアントからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする複数のｍＲＮＡを含む。

組成物は、他の予防または治療化合物とともに投与され得てもよい。非限定的な例として、予防または治療化合物は、アジュバントであっても、またはブースターであってもよい。本明細書で使用される場合、「ブースター」または「ブースターワクチン」という用語は、ワクチンなどの予防組成物について言及する場合、予防組み合わせ（ワクチン）組成物の追加投与を指す。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１、第２、及び第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの各々をコードするＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブースターワクチンは、第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのバリアントをコードするＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

ブースター（追加免疫）（またはブースターワクチン）は、予防組成物の早期投与後に投与してもよい。いくつかの実施形態では、組み合わせワクチンは、季節性ブースターワクチンである（例えば、組み合わせワクチンは、毎年秋または冬など、毎年投与される）。予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、限定されないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月であり得る。例示的な実施形態では、予防的組成物の最初の投与とブースターとの間の投与時間は、限定するものではないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月であってもよい。一実施形態では、ブースターワクチンは、組み合わせワクチンの３週間～１年後の間に投与される。

いくつかの実施形態では、組成物は、当該技術分野において周知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、経鼻、または皮内に投与され得る。

組成物は、感染の有病率または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な設定で利用され得る。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、様々な感染性疾患を治療及び／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、市販のワクチンよりもはるかに大きな抗体力価、より良好な中和免疫をもたらし、より持続性のある免疫応答を生じるか、及び／またはより早期の応答をもたらすという点において優れた特性を有する。

本明細書で提供されるのは、ＲＮＡ及び／または任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む医薬組成物である。

ＲＮＡは、単独で、または１つ以上の他の構成要素と組み合わせて、製剤化されても、または投与されてもよい。例えば、免疫化組成物は、限定するものではないが、アジュバントを含む他の構成要素を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、免疫化組成物はアジュバントを含まない（アジュバントフリーである）。

ＲＮＡは、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化されてもまたは投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の活性物質（例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組み合わせなど）を含む。ワクチン組成物は、無菌、パイロジェンフリー、または無菌及びパイロジェンフリーの両方であり得る。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ２１ｓｔｅｄ．，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、ヒト、ヒトの患者または対象に投与される。本開示の目的において、「有効成分」という表現は、概して、ＲＮＡワクチンまたはそれに含有されるポリヌクレオチド、例えば、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。

本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野において既知のまたは今後開発される任意の方法によって、調製され得る。概して、そのような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を、賦形剤及び／または１つ以上の補助成分と会合させるステップと、次に必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単回または多回用量単位に分割、成形、及び／またはパッケージングするステップとを含む。

本開示に従う医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意の更なる成分の相対量は、治療される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、また更にはその組成物が投与される経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化されて、（１）安定性を増加する、（２）細胞トランスフェクションを増加する、（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポー製剤から）を可能にする、（４）生体内分布を改変する（例えば、特定の組織または細胞型を標的とする）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加する、及び／または（６）コードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルをインビボで改変することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。

投与量／投与
本明細書で提供されるのは、ヒト及び他の哺乳類における、少なくとも１つの呼吸器ウイルス感染症の予防及び／または治療のための免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）、方法、キット、及び試薬である。免疫化組成物は、治療剤または予防薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、呼吸器ウイルス感染症からの予防的保護を提供するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、呼吸器ウイルス感染症を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、対象における呼吸器ウイルス感染症の重症度を低減するために使用される。いくつかの実施形態では、実施形態、免疫化組成物は、例えばエクスビボで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性化する、免疫エフェクター細胞の初回刺激に使用され、次いで対象に注入（再注入）される。

対象は、任意の哺乳類（非ヒト霊長類及びヒト対象を含む）であってもよい。典型的には、対象とはヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は、６０歳以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９歳、またはそれ以上）である。いくつかの実施形態では、対象は、１８歳未満（例えば、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１歳未満）である。

いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、抗原特異的免疫応答を誘導する有効量で対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与される。呼吸器ウイルス抗原をコードするＲＮＡは、発現され、インビボで翻訳されて、抗原が産生され、次いで、対象における免疫応答が刺激される。

呼吸器ウイルスからの予防的保護は、本開示の免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の投与後に達成され得る。免疫化成物は１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与されてもよいが、ワクチンを１回投与するだけで十分な場合がある（任意選択で１回のブースターが続く）。望ましいものではないが、感染した個体にある免疫化組成物を投与して治療応答を達成することも可能である。用量設定を適宜調整する必要がある場合がある。

呼吸器ウイルス抗原（または多重抗原）に対する対象における免疫応答を誘発する方法が、本開示の態様で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、呼吸器ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む免疫化組成物を対象に投与し、それによって、対象において呼吸器ウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導することに関与し、対象における抗抗原抗体力価が、抗原に対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象における抗抗原抗体力価と比較して、ワクチン接種後に増加する。「抗抗原抗体」とは、抗原に特異的に結合する血清抗体である。

予防有効用量とは、臨床的に許容されるレベルでウイルス感染を予防する有効用量である。いくつかの実施形態では、有効用量とは、ワクチンの添付文書に列記されている用量である。本明細書で使用される場合、従来のワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、限定されるものではないが、微生物生ワクチン、微生物不活化ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどが挙げられる。例示的な実施形態では、従来のワクチンは、国の薬物規制機関（例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ））によって規制上の承認を達成し、及び／または登録されているワクチンである。

いくつかの実施形態では、対象における抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、呼吸器ウイルスに対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗抗原抗体力価と比較して、１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態では、対象における抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、呼吸器ウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗抗原抗体力価と比較して、１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増加する。

対象における呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発する方法が、本開示の他の態様で提供される。方法は、呼吸器ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡを含む組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を対象に投与し、それによって、対象において呼吸器ウイルスに特異的な免疫応答を誘導することに関与し、対象における免疫応答が、免疫化組成物と比較して２倍～１００倍の投薬量レベルで呼吸器ウイルスに対する従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と等価である。

いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物と比較して２倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と等価である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物と比較して３倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と等価である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物と比較して４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と等価である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物と比較して１０倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と等価である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物と比較して１００倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と等価である。

他の実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。他の実施形態では、ロバストなＴ細胞応答（複数可）を促進する能力は、当該技術分野において認識されている技法を用いて測定される。

本開示の他の態様は、呼吸器ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含む免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を対象に投与し、それによって、対象において呼吸器ウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導することによって、対象において呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、対象における免疫応答が、予防有効量の呼吸器ウイルスに対する従来のワクチンを接種した対象において誘導される免疫応答と比較して、２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物と比較して２倍～１００倍の投薬量レベルで、予防有効用量の従来のワクチンを接種した対象において誘導される。

いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来のワクチンを予防有効用量でワクチン接種した対象において誘導される免疫応答と比較して、２日、３日、１週間、２週間、３週間、５週間、または１０週間早く誘導される。

また、本明細書で提供されるのは、第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを対象に投与することによって、呼吸器ウイルスに対する対象における免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡが、安定化エレメントを含まず、アジュバントが、ワクチンと同時製剤化または同時投与されない、方法である。

免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、治療的に有効な転帰を生じる任意の経路によって投与され得る。そのような経路としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／または皮下の投与が挙げられる。本開示は、ＲＮＡワクチンを投与することをそれを必要とする対象に行うことを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なる。ＲＮＡは、典型的には、投与しやすさ及び投薬量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。ただし、ＲＮＡの１日合計使用量は妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切なイメージング用量レベルは、治療する障害及び障害の重症度；用いる具体的化合物の活性；用いる具体的組成物；患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別、及び食事；用いる具体的化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率；治療の期間；用いる具体的化合物と組み合わせでまたは同時に使用する薬物；ならびに医学分野において周知の類似の因子を含めた様々な因子に依存する。

本明細書で提供されるＲＮＡの有効量は、５０μｇ程度（総ｍＲＮＡ）に低い場合がり、例えば、単回用量または２回の２５μｇ用量として投与される。本明細書で使用される「用量」は、組成物中のＲＮＡの総合計（例えば、製剤中のＮＡ抗原及び／またはＨＡ抗原の全てを含む）を表す。いくつかの実施形態では、有効量は、５０μｇ～３００μｇ、１００μｇ～３００μｇ、１５０μｇ～３００μｇ、２００μｇ～３００μｇ、２５０μｇ～３００μｇ、１５０μｇ～２００μｇ、１５０μｇ～２５０μｇ、１５０μｇ～３００μｇ、２００μｇ～２５０μｇ、または２５０μｇ～３００μｇの総用量である。例えば、有効量は、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２１０μｇ、２２０μｇ、２３０μｇ、２４０μｇ、２５０μｇ、２６０μｇ、２７０μｇ、２８０μｇ、２９０μｇ、または３００μｇの総用量であり得る。いくつかの実施形態では、有効量は、６６μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、６７μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、６８μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１３２μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１３３μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１３４μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２６６μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２６７μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２６８μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３００μｇの総用量である。

本明細書に記載のＲＮＡは、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）などの、本明細書に記載の剤形で製剤化され得る。

ワクチン効果
本開示のいくつかの態様は、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の製剤であって、ＲＮＡが、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、呼吸器ウイルス抗原に特異的な抗体の産生）を生成する有効量で製剤化される、製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なＲＮＡの用量である。また、本明細書では、対象内の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も提供する。

本明細書で使用される場合、本開示のワクチンまたはＬＮＰに対する免疫応答は、ワクチン中に存在する（１つ以上の）呼吸器ウイルスタンパク質（複数可）に対する対象における液性及び／または細胞性免疫応答の発生である。本開示の目的では、「液性」免疫応答は、例えば、分泌（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を含む抗体分子によって媒介される免疫応答を指す一方で、「細胞性」免疫応答は、Ｔ－リンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパー及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）及び／または他の白血球）によって媒介されるものを指す。細胞性免疫における１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答に関与する。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたタンパク質とともに提示され細胞表面に発現するペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子とともにその表面に提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせる一助となるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化Ｔ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞由来のものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のそのような分子の産生も引き起こす。

いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供される免疫化組成物を投与された対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価を測定することによって特徴評価される。抗体力価とは、対象内にある抗体、例えば、特定の抗原または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とは、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。

いくつかの実施形態では、抗体力価は、対象が感染症に罹ったか否かを評価するため、または免疫化が必要か否かを判断するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体力価は、自己免疫応答の強さを定量するため、ブースター免疫が必要か否かを判断するため、以前のワクチンが有効だった否かを判断するため、及び最近または過去の感染を確認するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）によって対象において誘導された免疫応答の強さを決定するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、または少なくとも３ｌｏｇ増加し得る。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、１、１．５、２、２．５、または３ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、１～３ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３ｌｏｇ増加し得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２倍増加する。例えば、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増加し得る。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増加する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、２～１０倍増加する。例えば、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０倍増加し得る。

いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、呼吸器ウイルスに対する血清中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）の比（幾何平均比（ＧＭＲ）と称される）として測定される。幾何平均力価（ＧＭＴ）は、全ての値を掛け合わせ、その数値のｎ乗根（ｎは利用可能なデータを有する対象数である）をとることによって算出される、対象の群における平均抗体力価である。

いくつかの実施形態では、対照は、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を投与されていない対象において産生される抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、典型的には、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたタンパク質抗原、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。

いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）が有効となる能力は、マウスモデルで測定される。例えば、免疫化組成物は、マウスモデルに投与され得、中和抗体力価の誘導について、マウスモデルが評価される。また、ウイルスチャレンジ試験も、本開示のワクチンの効果を評価するために使用することができる。例えば、免疫化組成物をマウスモデルに投与し、そのマウスモデルをウイルスでチャレンジし、そのマウスモデルを生存及び／または免疫応答（例えば、中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン応答））について評価してもよい。

本明細書で使用する「標準治療」とは、医学的または心理学的な治療ガイドラインを指し、一般的であっても、特定的であってもよい。「標準治療」は、科学的根拠及び所与の状態の治療に関与する医療従事者間の協力に基づいた適切な治療を指す。それは、医師／臨床医がある特定の種類の患者、病気、または臨床状況に対し従うべき診断及び治療のプロセスである。本明細書で提供される「標準的なケア用量」は、医師／臨床医または他の医療専門家が、呼吸器ウイルス感染または関連する状態を治療または予防するための標準的な治療ガイドラインに従いながら、呼吸器ウイルス感染または関連する状態を治療または予防するために対象に投与する、組換えもしくは精製されたタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの用量を指す。

いくつかの実施形態では、有効量の免疫化組成物を投与された対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、組換えもしくは精製されたタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活性化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの標準的なケア用量を投与された対照対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価と等価である。

ワクチン有効性は、標準的な解析を使用して評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２０１０Ｊｕｎ１；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。例えば、ワクチン効果は、二重盲検ランダム化対照臨床試験で測定され得る。ワクチン効果は、ワクチン非接種試験コホートの罹患率（ＡＲＵ）とワクチン接種試験コホートの罹患率（ＡＲＶ）との間の疾患罹患率（ＡＲ）の比例的減少として表してもよく、以下の式を用いてワクチン接種群の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出し得る。
有効性＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００、及び
効果＝（１－ＲＲ）×１００。

同様に、ワクチン有効性は標準的な解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２０１０Ｊｕｎ１；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。ワクチンの有効性とは、ワクチン（高いワクチン効果を有することが既に判明している場合もある）が集団の中でどのように疾患を低減するかを評価するものである。この尺度は、対照臨床試験ではなく、自然現場条件下で、ワクチン自体だけでなく、ワクチン接種プログラムの利益と副作用との正味のバランスを評価することができる。ワクチン有効性は、ワクチン有効性（効力）に比例するがまた、集団内の標的群の免疫化の程度、ならびに入院、外来訪問、または費用の「現実世界」の結果に影響を与える他の非ワクチン関連因子によって影響を受ける。例えば、後ろ向きケースコントロール解析を使用して、感染症例のセット及び適切な対照におけるワクチン接種率を比較してもよい。ワクチン有効性は、ワクチン接種したにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）の使用により、割合の差として表すことができる。
有効性＝（１－ＯＲ）×１００

いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効性は、ワクチン未接種対照対象と比較して、少なくとも６０％である。例えば、免疫化組成物の有効性は、ワクチン未接種対照対象と比較して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であり得る。

殺菌免疫。殺菌免疫とは、宿主への有効な病原体感染を防止する固有の免疫状態を指す。いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、少なくとも１年間の間、対象における殺菌免疫を提供するのに十分である。例えば、本開示の免疫化組成物の有効量は、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間の間、対象における殺菌免疫を提供するのに十分である。いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、対照と比較して少なくとも５倍低い用量で、対象における殺菌免疫を提供するのに十分である。例えば、有効量は、対照よりも少なくとも１０倍、１５倍、または２０倍低い用量で対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分であり得る。

検出可能な抗原。いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、投与の１～７２時間後の対象の血清において測定して、検出可能なレベルの呼吸器ウイルス抗原を産生するのに十分である。

力価。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗呼吸器ウイルス抗原）に特異的である抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とは、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。

いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、投与の１～７２時間後の対象の血清において測定して、呼吸器ウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与の１～７２時間後の対象の血清において測定して、呼吸器ウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与の１～７２時間後の対象の血清において測定して、呼吸器ウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。

いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００ＮＴ_５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＴ_５０であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＴ_５０である。

いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００中和単位／ミリリットル（ＮＵ／ｍＬ）である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｌｏｇ増加し得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２倍増加する。例えば、対象において産生された抗呼吸器ウイルス抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増加する。

いくつかの実施形態では、ｎ個の数の積のｎ乗根である幾何平均を、比例増殖を説明するために一般的に使用する。幾何平均は、いくつかの実施形態では、対象において産生される抗体力価を特性評価するために使用される。

対照は、例えば、ワクチン未接種の対象、または生弱毒化ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、またはタンパク質サブユニットワクチンを投与された対象であり得る。

実施例１．三重組み合わせワクチン（インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＲＳＶ）の免疫原性
この実施例では、インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＲＳＶ抗原をコードするｍＲＮＡを含むワクチンの異なる組み合わせを、高用量（ＨＤ）及び低用量（ＬＤ）で試験した。この研究では、抗原を別々に異なるＬＮＰ中に製剤化し、投与前に混合した。以下の表１に示されるように実験を行った。０日目に用量をマウスに筋肉内投与し、２１日目（用量１の３週間後）及び３６日目（用量２の２週間後）に、血清試料を採取した。個々のＨＡ抗原、ＮＡ抗原、ＲＳＶＦ融合前、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓｐ２組換えタンパク質に対するＥＬＩＳＡによって、ＩｇＧ抗体力価を測定した。以下に記載されるように、プライム及びブースト用量後に、二重及び三重の組み合わせで、全ての抗原に対する良好な抗体価が観察された。ＮＡ（ｍＲＮＡ－１０２０）を組み合わせに添加した場合、干渉は見出されなかった。

図１～４に示されるように、組み合わせワクチン中の他の抗原の存在は、２１日目に、ワクチン中の個々の抗原の各々に対する中和力価を低減しなかった（例えば、組み合わせワクチンと個々の抗原ワクチンとの間で同様の中和力価が観察された）。図２９～３３に示されるように、３６日目（用量２の後）に同様の傾向が観察された。

図５～７は、ＩｇＧ抗体の正規化された幾何平均力価を使用した結果を示し、高用量でのＲＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／インフルエンザ（４×ＨＡ）（群２０）が、（２１日目の高用量レベルの）他の組み合わせ及び個々の抗原投与と比較して、ワクチン中の全ての構成要素に対するロバストな抗体応答を誘導したことを実証している。結果は、２１日目の低用量レベルで同様であった（図１１～１３）。２１日目の高用量（図８Ａ、８Ｂ、９、及び１０）及び２１日目の低用量（図１４Ａ、１４Ｂ、１５、及び１６）でのＲＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／インフルエンザ（４×ＨＡ、４×ＮＡ）組成物で同様の結果が見られたので、ノイラミニダーゼを添加することは、組成物の免疫原性に干渉しなかった。

また、３６日目（投与２の後）の結果は同様であり、異なる抗原をコードするｍＲＮＡを添加することは、実質的に免疫原性に影響を与えなかった。図１７～１９は、ＩｇＧ抗体の正規化された幾何平均力価を使用した結果を示し、高用量でのＲＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／インフルエンザ（４×ＨＡ）（群２０）が、（３６日目の高用量レベルの）他の組み合わせ及び個々の抗原投与と比較して、ワクチン中の全ての構成要素に対するロバストな抗体応答を誘導したことを実証している。結果は、２１日目の低用量レベルで同様であった（図２３～２５）。３６日目の高用量（図２０Ａ、２０Ｂ、２１、及び２２）及び２１日目の低用量（図２６Ａ、２６Ｂ、２７、及び２８）でのＲＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／インフルエンザ（４×ＨＡ、４×ＮＡ）組成物で同様の結果が見られたので、ノイラミニダーゼを添加することは、組成物の免疫原性に干渉しなかった。

実施例２．コットンラットにおける三重組み合わせワクチン（インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＲＳＶ）の免疫原性
この実施例では、インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＲＳＶ抗原をコードするｍＲＮＡを含むワクチンの免疫原性をコットンラットで試験した。この研究では、抗原を別々に異なるＬＮＰ中に製剤化し、投与前に混合した。以下の表２に示されるように実験を行った。０日目及び２８日目に、用量をコットンラットに筋肉内投与した。５６日目にＲＳＶＡ２（１０^５ｐｆｕ）で、対象をチャレンジした。２８日目、５６日目、６１日目に血清試料を採取し、６１日目に肺及び鼻の力価を測定した。５６日目に更なるＥＬＩＳＡを実施して、中和力価を決定した。

図３３Ａ、３３Ｂ、３４、及び３５に実証されるように、組み合わせワクチンは、免疫原性であり、組み合わせワクチン中の他の抗原の存在は、２８日目及び５６日目に、ワクチン中の個々の抗原の各々に対する中和力価を低減しなかった（例えば、組み合わせワクチンと個々の抗原ワクチンとの間で同様の中和力価が観察された）。

５６日目にＲＳＶＡ中和力価を測定し、結果を図３６に示す。組み合わせワクチン（ＳＡＲＳ／Ｆｌｕ／ＲＳＶ）は、ＲＳＶのみのｍＲＮＡワクチンでのワクチン接種から生成されるものと同様のレベルのＲＳＶ中和抗体を誘導した。ウイルス力価に関して、組み合わせワクチンは、下気道ＲＳＶ複製に対して対象を完全に保護した（肺ウイルス力価によって示されるように、図３７Ａ）が、上気道複製及び脱落に対して対象を部分的にのみ保護した（鼻ウイルス力価によって示されるように、図３７Ｂ）。

実施形態
１．組み合わせワクチンであって、
第１のウイルスファミリーからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスファミリーからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスファミリーからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
前記第１、第２、及び第３のウイルスファミリーの各々が、互いに異なる、前記組み合わせワクチン。

２．前記第１のウイルスファミリーが、オルトミクソウイルス科である、実施形態１に記載のワクチン。

３．第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、アルファインフルエンザウイルスの属からである、実施形態２に記載のワクチン。

４．前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ベータインフルエンザウイルスの属からである、実施形態２に記載のワクチン。

５．前記第２のウイルスファミリーが、コロナウイルス科、任意選択で、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科である、実施形態１～４のいずれか１項に記載のワクチン。

６．前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ベータコロナウイルスの属からである、実施形態５に記載のワクチン。

７．前記第３のウイルスファミリーが、パラミクソウイルス科である、実施形態１～６のいずれか１項に記載のワクチン。

８．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ニューモウイルス亜科のサブファミリーからである、実施形態７に記載のワクチン。

９．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）からである、実施形態８に記載のワクチン。

１０．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）からである、実施形態８に記載のワクチン。

１１．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、パラミクソウイルスの属からである、実施形態７に記載のワクチン。

１２．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、パラインフルエンザウイルスからである、実施形態１１に記載のワクチン。

１３．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、モルビリウイルスの属からである、実施形態７に記載のワクチン。

１４．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、パラインフルエンザウイルスからである、実施形態１３に記載のワクチン。

１５．前記ワクチンが、第１のウイルスファミリーからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１に記載のワクチン。

１６．前記ワクチンが、第２のウイルスファミリーからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１に記載のワクチン。

１７．前記ワクチンが、第３のウイルスファミリーからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１に記載のワクチン。

１８．前記ワクチンが、１５個未満のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１～１７のいずれか１項に記載のワクチン。

１９．前記ワクチンが、３～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１８に記載のワクチン。

２０．前記ワクチンが、４～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１８に記載のワクチン。

２１．前記ワクチンが、５～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１８に記載のワクチン。

２２．前記ワクチンが、８～９個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１８に記載のワクチン。

２３．前記第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、前記組み合わせワクチン中に１：１：１の比で存在する、実施形態１～２２のいずれか１項に記載のワクチン。

２４．前記ワクチンが、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１～２３のいずれか１項に記載のワクチン。

２５．前記ワクチンが、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも３つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１～２４のいずれか１項に記載のワクチン。

２６．前記ワクチンが、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも４つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１～２５のいずれか１項に記載のワクチン。

２７．前記ワクチンが、コロナウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１～２６のいずれか１項に記載のワクチン。

２８．前記ワクチンが、パラミクソウイルス科抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態１～２７のいずれか１項に記載のワクチン。

２９．前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルスファミリー対前記第２のウイルスファミリー対前記第３のウイルスファミリーからの４：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載のワクチン。

３０．前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルスファミリー対前記第２のウイルスファミリー対前記第３のウイルスファミリーからの３：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載のワクチン。

３１．前記組み合わせワクチンが、第１のウイルスファミリー対第２のウイルスファミリー対第３のウイルスファミリーからの５：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載のワクチン。

３２．前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルスファミリー対前記第２のウイルスファミリー対前記第３のウイルスファミリーからの４：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載のワクチン。

３３．前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルスファミリー対前記第２のウイルスファミリー対前記第３のウイルスファミリーからの１：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載のワクチン。

３４．前記組み合わせワクチンが、第１のウイルスファミリー対第２のウイルスファミリー対第３のウイルスファミリーからの１：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載のワクチン。

３５．前記組み合わせワクチンが、
（ａ）前記第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子、前記第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子、及び前記第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第３のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることであって、前記第１のＤＮＡ分子、前記第２のＤＮＡ分子、及び前記第３のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる、前記組み合わせることと、
（ｂ）前記線状化された第１のＤＮＡ分子、前記線状化された第２のＤＮＡ分子、及び前記線状化された第３のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法によって生成される、多価ＲＮＡ組成物である、実施形態１～３４のいずれか１項に記載のワクチン。

３６．前記異なる供給源が、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物であり、前記第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物が、共培養されない、実施形態３５に記載のワクチン。

３７．前記反応混合物中に存在する前記第１、第２、及び第３のＤＮＡ分子の量が、前記ＩＶＴの開始前に正規化されている、実施形態３５に記載のワクチン。

３８．前記組み合わせワクチンが、多価ＲＮＡ組成物であり、前記多価ＲＮＡ組成物が、４０％超のポリＡテールＲＮＡを含む、実施形態１～３７のいずれか１項に記載のワクチン。

３９．前記組み合わせワクチンが、多価ＲＮＡ組成物であり、前記第１のｍＲＮＡポリヌクレオチド、前記第２のｍＲＮＡポリヌクレオチド、及び前記第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、互いに少なくとも１００ヌクレオチドだけ長さが異なる、実施形態１～３８のいずれか１項に記載のワクチン。

４０．前記組み合わせワクチンが、多価ＲＮＡ組成物であり、前記第１、第２、及び第３（及び任意選択で、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、または第１５の）ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々、非翻訳領域（ＵＴＲ）、任意選択で、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに１つ以上の非コード配列を含む、実施形態１～３９のいずれか１項に記載のワクチン。

４１．前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する、実施形態４０に記載のワクチン。

４２．前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの下流に位置する、実施形態４０に記載のワクチン。

４３．前記非コード配列が、前記ｍＲＮＡの前記ＯＲＦの最後のコドンと前記ｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間の、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、実施形態４０に記載のワクチン。

４４．前記非コード配列が、１～１０個のヌクレオチドを含む、実施形態４０に記載のワクチン。

４５．前記非コード配列が、１つ以上のＲＮＡｓｅ切断部位を含む、実施形態４０～４４のいずれか１項に記載のワクチン。

４６．前記ＲＮＡｓｅ切断部位が、ＲＮａｓｅＨ切断部位である、実施形態４５に記載のワクチン。

４７．前記組み合わせワクチン中の前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、前記組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドと互いに補完的であり、干渉しない、実施形態１～４６のいずれか１項に記載のワクチン。

４８．前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在する抗原に由来する、実施形態１～４７のいずれか１項に記載のワクチン。

４９．前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在する抗原の安定化バージョンである、実施形態１～４７のいずれか１項に記載のワクチン。

５０．前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在しない抗原である、実施形態１～４７のいずれか１項に記載のワクチン。

５１．前記ワクチンが、バリアント呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含み、前記バリアントが、前記第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちのいずれか１つのバリアントである、実施形態１～４８のいずれか１項に記載のワクチン。

５２．前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択される、実施形態１～５１のいずれか１項に記載のワクチン。

５３．前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶからなる群から選択される、実施形態１～５２のいずれか１項に記載のワクチン。

５４．前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザＨＡ及び／またはインフルエンザＮＡである、実施形態１～５３のいずれか１項に記載のワクチン。

５５．前記抗原性ポリペプチドが、融合（Ｆ）タンパク質、スパイク（Ｓ）タンパク質、及びヘマグルチニン抗原（ＨＡ）を含む、実施形態１～５４のいずれか１項に記載のワクチン。

５６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む、実施形態１～５５のいずれか１項に記載のワクチン。

５７．前記ＬＮＰが、２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、実施形態５６に記載のワクチン。

５８．対象をワクチン接種するための方法であって、
組み合わせワクチンを前記対象に投与することを含み、前記組み合わせワクチンが、第１のウイルスファミリーからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスファミリーからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスファミリーからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含み、前記第１、第２、及び第３のウイルスファミリーの各々が、互いに異なる、前記方法。

５９．前記対象が、６５歳以上である、実施形態５８に記載の方法。

６０．前記対象が、１８歳未満である、実施形態５８に記載の方法。

６１．前記方法が、前記対象における呼吸器感染症を予防する、実施形態５８に記載の方法。

６２．前記方法が、前記対象における呼吸器感染症の重症度を低減する、実施形態５８に記載の方法。

６３．前記対象が、前記抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陰性である、実施形態５８に記載の方法。

６４．前記対象が、前記抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陰性である、実施形態５８に記載の方法。

６５．前記対象が、前記抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陽性である、実施形態５８に記載の方法。

６４．前記対象が、前記抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陽性である、実施形態５８に記載の方法。

６５．ブースターワクチンを投与することを更に含む、実施形態５８～６４のいずれか１項に記載の方法。

６６．前記ブースターワクチンが、前記組み合わせワクチンの３週間～１年後の間に投与される、実施形態６５に記載の方法。

６７．前記ブースターワクチンが、前記第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態６５または６６に記載の方法。

６８．前記ブースターワクチンが、前記第１、第２、及び第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの各々をコードするＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態６５または６６に記載の方法。

６９．前記ブースターワクチンが、前記第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのバリアントをコードするＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、実施形態６５または６６に記載の方法。

７０．前記組み合わせワクチンが、季節性ブースターワクチンである、実施形態５８～６９のいずれか１項に記載の方法。

７１．前記組み合わせワクチンが、実施形態１～５８のいずれか１つに記載のワクチンである、実施形態５８～７０のいずれか１項に記載の方法。

７２．実施形態１～５７のいずれか１項に記載のワクチンを対象に投与することによって、呼吸器感染症を予防するか、または重症度を低減する方法であって、単回用量またはブースターを伴う単回用量に基づいて、前記対象における前記感染症を予防するか、または前記呼吸器感染症の重症度を低減する有効量で投与する、前記方法。

７３．前記組み合わせワクチンが、２０μｇまたは５０μｇの用量で前記対象に投与される、実施形態５８～７２のいずれか１項に記載の方法。

均等物
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が示される主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合において、それは書類の全体を包含し得る。

明細書、ならびに実施形態及び／または特許請求の範囲における、本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、明確に反対のことが示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解されるべきである。

また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されないことも理解されたい。

特許請求の範囲、ならびに上の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ）」などの全ての移行句は、無制限、すなわち、含むが限定されないと意味すると理解されたい。「～からなる」「～から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。

数値の手前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。

値の範囲が示される場合、範囲の上端と下端との間でかつそれを含む各値は、本明細書において具体的に企図され記載されている。

Claims

組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と、を含む、前記組み合わせワクチン。
組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
脂質ナノ粒子と、を含む、前記組み合わせワクチン。
組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
脂質ナノ粒子と、を含む、前記組み合わせワクチン。
組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第６のウイルスからの第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第６のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
脂質ナノ粒子と、を含む、前記組み合わせワクチン。
組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第６のウイルスからの第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第６のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第７のウイルスからの第７の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第７のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
脂質ナノ粒子と、を含む、前記組み合わせワクチン。
組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第４のウイルスからの第４の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第４のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第５のウイルスからの第５の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第５のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第６のウイルスからの第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第６のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第７のウイルスからの第７の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第７のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第８のウイルスからの第８の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第８のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
脂質ナノ粒子と、を含む、前記組み合わせワクチン。
前記第１、第２、第３、及び第４のウイルスが、インフルエンザウイルスファミリーオルトミクソウイルス科からである、請求項６に記載の組み合わせワクチン。
前記第１、第２、第３、及び第４のウイルスが、インフルエンザＡウイルス及びインフルエンザＢウイルスから選択される、請求項７に記載の組み合わせワクチン。
前記第５及び第６のウイルスが、ウイルスファミリーコロナウイルス科からである、請求項８に記載の組み合わせワクチン。
前記第５及び第６のウイルスが、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである、請求項９に記載の組み合わせワクチン。
前記第５及び第６のウイルスが、コロナウイルスである、請求項１０に記載の組み合わせワクチン。
前記第７及び第８のウイルスが、非インフルエンザ、非コロナウイルス、呼吸器ウイルスである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第７及び第８のウイルスが、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第７及び第８のウイルスが、ウイルスサブファミリーニューモウイルス亜科からである、請求項１３に記載の組み合わせワクチン。
前記第７及び第８のウイルスが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、及び／または前記第７及び第８のウイルスが、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）からである、請求項１４に記載の組み合わせワクチン。
前記第７及び第８のウイルスが、パラミクソウイルスの属またはサブファミリーからである、請求項１３に記載の組み合わせワクチン。
前記第７及び第８のウイルスが、パラインフルエンザウイルスである、請求項１６に記載の組み合わせワクチン。
前記第７及び第８のウイルスが、モルビリウイルスの属またはサブファミリーからである、請求項１３に記載の組み合わせワクチン。
前記第２及び第３のウイルスが、互いに異なり、前記インフルエンザウイルスからである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第２のウイルスが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルスである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第３のウイルスが、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、ならびにＰＩＶ１ウイルスからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスＢからである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスＡからである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ヘマグルチニン抗原（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ベータ－コロナウイルスからである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶからである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ＨＣｏＶからである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）からである、請求項１～６または２０～２７のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）からである、請求項１～６または２０～２７のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、ヘンドラウイルス、またはニパウイルスから選択される、請求項１～６または２０～２７のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、インフルエンザウイルス抗原をコードするＯＲＦを含む少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、インフルエンザウイルス抗原をコードするＯＲＦを含む２～４つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、第２のウイルスからの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、第３のウイルスからの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、１５個未満のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、１２個未満のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、３～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項３５または３６に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、４～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項３５または３６に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、５～１０個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項３５または３６に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、８～９個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項３５または３６に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも３つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、インフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも８つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、コロナウイルス抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドと、パラミクソウイルス科抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む、請求項４２に記載の組み合わせワクチン。
前記第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、前記組み合わせワクチン中に１：１：１の比で存在する、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの４：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの３：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの５：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの４：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの１：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの１：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの８：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第１のウイルスの前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ＨＡ及びＮＡを４：４の比で含む、請求項５１に記載の組み合わせワクチン。
前記組み合わせワクチン中の前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、前記組み合わせワクチン中のｍＲＮＡポリヌクレオチドと互いに補完的であり、干渉しない、請求項１～５２のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在する抗原に由来する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在する抗原の安定化バージョンである、請求項１～５２のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在しない抗原である、請求項１～５２のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、構造的に改変されたバリアント呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含み、前記構造的に改変されたバリアントが、前記第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちのいずれか１つの構造的に改変されたバリアントである、請求項１～５６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ポリシストロン性である、請求項１～５６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、ポリシストロン性である、請求項１～５６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
多価ＲＮＡ組成物であって、
第１のウイルスからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
を含み、前記多価ＲＮＡ組成物が、４０％超のポリＡテールＲＮＡを含む、及び／または前記第１、第２、及び／または第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、互いに少なくとも１００ヌクレオチドだけ長さが異なる、前記多価ＲＮＡ組成物。
前記組成物が、
（ａ）前記第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子、前記第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子、及び前記第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第３のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることであって、前記第１のＤＮＡ分子、前記第２のＤＮＡ分子、及び前記第３のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる、前記組み合わせることと、
（ｂ）前記線状化された第１のＤＮＡ分子、前記線状化された第２のＤＮＡ分子、及び前記線状化された第３のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法によって生成される、請求項６０に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記異なる供給源が、第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物であり、前記第１、第２、及び第３の細菌細胞培養物が、共培養されない、請求項６１に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記反応混合物中に存在する前記第１、第２、及び第３のＤＮＡ分子の量が、前記ＩＶＴの開始前に正規化されている、請求項６１に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第１のウイルスが、ウイルスファミリーオルトミクソウイルス科インフルエンザウイルスからである、請求項６０～６３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第１のウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項６４に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第２のウイルスが、ウイルスファミリーコロナウイルス科からである、請求項６５に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第２のウイルスが、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである、請求項６６に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第２のウイルスが、コロナウイルスである、請求項６７に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第２のウイルスが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルスである、請求項６８に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第３のウイルスが、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からである、請求項６０～６９のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第３のウイルスが、ウイルスサブファミリーニューモウイルス亜科からである、請求項７０に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第３のウイルスが、パラミクソウイルスの属またはサブファミリーからである、請求項７０に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第３のウイルスが、モルビリウイルスの属またはサブファミリーからである、請求項７０に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第３のウイルスが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、及び／またはパラインフルエンザウイルスである、請求項７０に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第３のウイルスが、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、ならびにＰＩＶ１ウイルスからなる群から選択される、請求項６０～７４のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
各々が呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードする別個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、２～１５個のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、多価ＲＮＡ組成物であって、各ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、任意選択で５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに１つ以上の非コード配列を含む、前記多価ＲＮＡ組成物。
前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する、請求項７６に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの下流に位置する、請求項７６に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記非コード配列が、前記ｍＲＮＡの前記ＯＲＦの最後のコドンと前記ｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間の、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、請求項７６に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記非コード配列が、１～１０個のヌクレオチドを含む、請求項７６に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記非コード配列が、１つ以上のＲＮＡｓｅ切断部位を含む、請求項７６～８０のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記ＲＮＡｓｅ切断部位が、ＲＮａｓｅＨ切断部位である、請求項８１に記載の多価ＲＮＡ組成物。
少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーオルトミクソウイルス科インフルエンザウイルスからである、請求項７６～８２のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルス抗原である、請求項８３に記載の多価ＲＮＡ組成物。
少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーコロナウイルス科、任意選択で、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである、請求項７６～８２のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、コロナウイルス抗原である、請求項８５に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルス抗原である、請求項８６に記載の多価ＲＮＡ組成物。
少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科から、任意選択で、ウイルスサブファミリーニューモウイルス亜科、パラミクソウイルス、またはモルビリウイルスからである、請求項７６～８２のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、及び／またはパラインフルエンザウイルスである、請求項８８に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記少なくとも１つの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、ならびにＰＩＶ１ウイルスからなる群から選択される、請求項７６～８２のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
多価ＲＮＡ組成物であって、
第１のウイルスからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、
を含み、前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然に存在する抗原または天然に存在する抗原の安定化バージョンに由来し、構造的に改変されたバリアント呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含み、前記構造的に改変されたバリアントが、前記第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドのうちのいずれか１つの構造的に改変されたバリアントであり、
前記第２と第３のウイルスとが、互いに異なり、前記インフルエンザウイルスからである、前記多価ＲＮＡ組成物。
前記第１のウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項９１に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第２のウイルスが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルスである、請求項９１または９２に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記第３のウイルスが、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶからなる群から選択される、請求項９１～９３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記構造的に改変されたバリアントが、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントである、請求項９１～９４のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記構造的に改変されたバリアントが、前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントである、請求項９１～９４のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記構造的に改変されたバリアントが、前記第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントである、請求項９１～９４のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
各々が別個の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、５～１５個のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、３つの異なるウイルスファミリーに由来する、前記メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、多価ＲＮＡ組成物。
前記３つのウイルスファミリーが、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、及びパラミクソウイルス科を含む、請求項９８に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組成物が、インフルエンザ抗原をコードするＯＲＦを含む３～６つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを有する、請求項９８に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組成物が、コロナウイルス抗原をコードするＯＲＦを含む１～５つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを有する、請求項９８～１００のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組成物が、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及び／またはＭＥＶに由来する抗原をコードするＯＲＦを含む１～４つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを有する、請求項９８～１０１のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
各々が第１、第２、または第３のウイルスからの呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、少なくとも６つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドのセットを含む、多価ＲＮＡ組成物であって、前記組成物が、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの４：１：１、４：２：２、４：２：１、４：３：２、４：３：３、４：３：２、または４：２：２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、前記多価ＲＮＡ組成物。
前記第１、第２、及び第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、前記組み合わせワクチン中に１：１：１の比で存在する、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの４：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの３：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの５：１：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの４：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの１：２：１の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの１：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記組み合わせワクチンが、前記第１のウイルス対前記第２のウイルス対前記第３のウイルスからの８：２：２の、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドの比を含む、請求項６０～１０３のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記抗原性ポリペプチドが、融合（Ｆ）タンパク質、スパイク（Ｓ）タンパク質、及びヘマグルチニン抗原（ＨＡ）を含む、請求項６０～１１１のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
少なくとも１つの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む、請求項６０～１１１のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記ＬＮＰが、２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、請求項１１３に記載の多価ＲＮＡ組成物。
前記イオン化可能なアミノ脂質が、化合物１の構造を含む、請求項１１４に記載の多価ＲＮＡ組成物：
前記抗原性ポリペプチドが、細胞表面糖タンパク質を含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載のバリアント、または請求項６０～１１１のいずれか１項に記載の多価ＲＮＡ組成物。
対象をワクチン接種するための方法であって、
組み合わせワクチンを前記対象に投与することを含み、前記組み合わせワクチンが、第１のウイルスからの第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、第３のウイルスからの第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、を含み、前記第１、第２、及び第３のウイルスファミリーの各々が、互いに異なる、前記方法。
前記対象が、６５歳以上である、請求項１１７に記載の方法。
前記対象が、１８歳未満である、請求項１１７に記載の方法。
前記方法が、前記対象における呼吸器感染症を予防する、請求項１１７に記載の方法。
前記方法が、前記対象における呼吸器感染症の重症度を低減する、請求項１１７に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陰性である、請求項１１７に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陰性である、請求項１１７に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陽性である、請求項１１７に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陽性である、請求項１１７に記載の方法。
ブースターワクチンを投与することを更に含む、請求項１１７～１２５のいずれか１項に記載の方法。
前記ブースターワクチンが、前記組み合わせワクチンの３週間～１年後の間に投与される、請求項１２６に記載の方法。
前記ブースターワクチンが、前記第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
前記ブースターワクチンが、前記第１、第２、及び第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの各々をコードするＯＲＦを含む少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
前記ブースターワクチンが、前記第１、第２、または第３の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドの構造的に改変されたバリアントをコードするＯＲＦを含む少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
前記組み合わせワクチンが、季節性ブースターワクチンである、請求項１１７～１３０のいずれか１項に記載の方法。
前記組み合わせワクチンが、請求項１～１１６のいずれか１項に記載のワクチンである、請求項１１７～１３１のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～１１６のいずれか１項に記載の組み合わせワクチンを対象に投与することによって、呼吸器感染症を予防するか、または重症度を低減する方法であって、単回用量またはブースターを伴う単回用量に基づいて、前記対象における前記感染症を予防するか、または前記呼吸器感染症の重症度を低減する有効量で投与する、前記方法。
前記組み合わせワクチンが、５０μｇの用量で前記対象に投与される、請求項１１７～１３３のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクチンの各ＲＮＡポリヌクレオチドが、別々のＬＮＰ中に製剤化される、請求項１１７～１３３のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクチンの前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＬＮＰ中で共製剤化される、請求項１１７～１３３のいずれか１項に記載の方法。
組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスファミリーオルトミキソウイルス科からのインフルエンザウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドであって、前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からの抗原である、前記第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子と、を含む、前記組み合わせワクチン。
組み合わせワクチンであって、
第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーコロナウイルス科からのコロナウイルス抗原である、前記第１のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、第２のウイルスからの第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドであって、前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ウイルスファミリーパラミクソウイルス科からの抗原である、前記第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と、を含む、前記組み合わせワクチン。
第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、第３、第４、第５、及び第６のウイルスｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザＡウイルス及びインフルエンザＢウイルスからである、請求項１３９に記載の組み合わせワクチン。
前記第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、コロナウイルス科からである、請求項１３９に記載の組み合わせワクチン。
前記第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである、請求項１３９に記載の組み合わせワクチン。
前記第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、コロナウイルスからである、請求項１３９に記載の組み合わせワクチン。
前記第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、非インフルエンザ、非コロナウイルス、呼吸器ウイルスからである、請求項１３９に記載の組み合わせワクチン。
前記第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ファミリーパラミクソウイルス科からである、請求項１３９に記載の組み合わせワクチン。
前記第３、第４、第５、及び第６の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、サブファミリーニューモウイルス亜科からである、請求項１３９に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザＡウイルス及びインフルエンザＢウイルスからである、請求項１３７に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、コロナウイルス科からである、請求項１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、サブファミリーオルトコロナウイルス亜科からである、請求項１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、コロナウイルスからである、請求項１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ファミリーパラミクソウイルス科からである、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、サブファミリーニューモウイルス亜科からである、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及び／またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）からである、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、パラミクソウイルスの属またはサブファミリーからである、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、パラインフルエンザウイルスからである、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、モルビリウイルスの属またはサブファミリーからである、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１からなる群から選択されるコロナウイルスからである、請求項１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第２の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、及びＭＥＶ、ヘンドラ、ニパ、ならびにＰＩＶ１ウイルスからなる群から選択される、請求項１３７または１３８に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスＢからである、請求項１３７に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスＡからである、請求項１３７に記載の組み合わせワクチン。
前記第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドが、ヘマグルチニン抗原（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）である、請求項１３７に記載の組み合わせワクチン。
前記ワクチンが、４０％超のポリＡテールＲＮＡを含む、及び／または前記第１、第２、及び／または第３のｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、互いに少なくとも１００ヌクレオチドだけ長さが異なる、請求項１３７～１６１のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記組成物が、
（ａ）前記第１のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第１のＤＮＡ分子及び前記第２のｍＲＮＡポリヌクレオチドをコードする線状化された第２のＤＮＡ分子を単一の反応容器内で組み合わせることであって、前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子が、異なる供給源から得られる、前記組み合わせることと、
（ｂ）前記線状化された第１のＤＮＡ分子及び前記線状化された第２のＤＮＡ分子を同時にインビトロで転写して、多価ＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法によって生成される、請求項１６２に記載の組み合わせワクチン。
前記反応混合物中に存在する前記第１及び第２のＤＮＡ分子の量が、前記ＩＶＴの開始前に正規化されている、請求項１６３に記載の組み合わせワクチン。
前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各々が、非翻訳領域（ＵＴＲ）、任意選択で５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに１つ以上の非コード配列を含む、請求項１３７～１６４のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの上流に位置する、請求項１６５に記載の組み合わせワクチン。
前記非コード配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、前記ｍＲＮＡのポリＡテールの下流に位置する、請求項１６５に記載の組み合わせワクチン。
前記非コード配列が、前記ｍＲＮＡの前記ＯＲＦの最後のコドンと前記ｍＲＮＡのポリＡテールの最初の「Ａ」との間の、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、請求項１６５に記載の組み合わせワクチン。
前記非コード配列が、１～１０個のヌクレオチドを含む、請求項１６５に記載の組み合わせワクチン。
前記非コード配列が、１つ以上のＲＮＡｓｅ切断部位を含む、請求項１６５～１６９のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記ＲＮＡｓｅ切断部位が、ＲＮａｓｅＨ切断部位である、請求項１７０に記載の組み合わせワクチン。
前記ＬＮＰが、２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、請求項１３７～１７１のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
前記イオン化可能なアミノ脂質が、化合物１の構造を含む、請求項１７２に記載の組み合わせワクチン：
前記抗原性ポリペプチドが、細胞表面糖タンパク質を含む、請求項１３７～１７３のいずれか１項に記載の組み合わせワクチン。
対象をワクチン接種するための方法であって、
請求項１３７～１７４のいずれか１項に記載の組み合わせワクチンを前記対象に投与することを含む、前記方法。
前記対象が、６５歳以上である、請求項１７５に記載の方法。
前記対象が、１８歳未満である、請求項１７５に記載の方法。
前記方法が、前記対象における呼吸器感染症を予防する、請求項１７５に記載の方法。
前記方法が、前記対象における呼吸器感染症の重症度を低減する、請求項１７５に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陰性である、請求項１７５に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陰性である、請求項１７５に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに対して血清陽性である、請求項１７５に記載の方法。
前記対象が、前記抗原性ポリペプチドの全てに対して血清陽性である、請求項１７５に記載の方法。
ブースターワクチンを投与することを更に含む、請求項１７５～１８３のいずれか１項に記載の方法。
前記ブースターワクチンが、前記組み合わせワクチンの３週間～１年後の間に投与される、請求項１８４に記載の方法。
請求項１３７～１７４のいずれか１項に記載の組み合わせワクチンを対象に投与することによって、呼吸器感染症を予防するか、または重症度を低減する方法であって、単回用量またはブースターを伴う単回用量に基づいて、前記対象における前記感染症を予防するか、または前記呼吸器感染症の重症度を低減する有効量で投与する、前記方法。
前記組み合わせワクチンが、５０μｇの用量で前記対象に投与される、請求項１７５～１８６のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクチンの各ＲＮＡポリヌクレオチドが、別々のＬＮＰ中に製剤化される、請求項１７５～１８６のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクチンの前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＬＮＰ中で共製剤化される、請求項１７５～１８６のいずれか１項に記載の方法。