JP2023513073A - 呼吸器系ウイルス免疫化組成物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、呼吸器系ウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン、ならびにこのワクチンを使用する方法及びこのワクチンを含む組成物に関する。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０２０年１月３０日に提出された米国仮出願第６２／９６７，８８８号の提出日の利益を主張しており、当該仮出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
呼吸器疾患とは、高等生物でガス交換を可能にする臓器及び組織に影響を与える病的状態を含む医学用語であり、上気道、気管、気管支、細気管支、肺胞、胸膜及び胸膜腔、ならびに呼吸に関する神経及び筋肉の状態を含む。呼吸器疾患は、風邪などの軽度で自己制限的なものから、細菌性肺炎、肺塞栓症、急性喘息、及び肺癌などの生命を脅かすものまでにおよぶ。呼吸器疾患は、世界中で一般的であり、かつ疾病及び死亡の重大な原因である。米国では、毎年約１０億件の「風邪」が発生している。呼吸器状態は、子供の入院の最も高頻度の理由の１つである。
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）は、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ属のネガティブセンスの一本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである。このウイルスは、主に表面Ｇ糖タンパク質の違いに起因する、Ａ群及びＢ群として知られる少なくとも２つの抗原性サブグループに存在する。２つのｈＲＳＶ表面糖タンパク質（Ｇ及びＦ）は、呼吸器上皮の細胞との付着及び細胞への付着を媒介する。Ｆ表面糖タンパク質は、隣接する細胞の合着を媒介する。これにより、合胞体細胞が形成される。ｈＲＳＶは細気管支炎の最も一般的な原因である。ほとんどの感染した成人は、うっ血、軽度の発熱、及び喘鳴などの軽度の風邪のような症状を発症する。乳児及び小さな子供は、細気管支炎及び肺炎などのより重篤な症状に苦しむ場合がある。この疾患は、呼吸分泌物との接触を介してヒトの間で伝染し得る。
ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）は、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ属、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスであり、トリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）サブグループＣと密接に関連している。これは、培養細胞で増殖する未知のウイルスを同定するためのＲＡＰ－ＰＣＲ（ＲＮＡ任意プライムＰＣＲ）技術を使用することによりオランダで２００１年に初めて単離された。ｈＭＰＶは、幼児のウイルス性下気道疾患（ＬＲＩ）の重要な原因として、ｈＲＳＶに次ぐものである。ｈＭＰＶの季節的疫学は、ｈＲＳＶのそれと類似しているように見えるが、感染と疾患の発生率はかなり低いようである。
パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）もまた、ｈＭＰＶと同様に、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ属、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のネガティブセンス、一本鎖センスＲＮＡウイルスであり、乳児期及び幼児期の遍在する急性呼吸器感染症の主な原因である。その発生率は生後４～１２か月でピークに達し、ウイルスは入院の３～１０％、主に細気管支炎と肺炎の原因となる。ＰＩＶ３は致命的である可能性があり、場合によっては、熱性発作などの神経疾患に関連している。また、罹患率の重大な原因である気道のリモデリングを引き起こす可能性もある。世界の発展途上地域では、乳児及び幼児は、一次ＰＩＶ３ウイルス感染または細菌感染などの二次的結果のいずれかにより、死亡のリスクが最も高くなる。ヒトパラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ）１、２、及び３型（それぞれ、ｈＰＩＶ１、ｈＰＩＶ２、及びｈＰＩＶ３）も、ｈＭＰＶと同様に、幼児のウイルスＬＲＩの重要な原因としてｈＲＳＶに次ぐものである。
ｈＭＰＶ、ｈＰＩＶ３、及びｈＲＳＶに関連する継続的な健康問題は国際的に懸念されており、これらのウイルスに対する効果的かつ安全なワクチン候補を開発することの重要性が強調されている。
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態では、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）抗原、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）抗原、及び／またはヒトパラインフルエンザウイルス３（ｈＰＩＶ３）抗原などの呼吸ウイルス抗原に対する強力な中和抗体応答を誘発し得る高度に免疫原性の抗原をコードするＲＮＡを含む免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン及び他の免疫原性組成物）である。驚くべきことに、本明細書で提供されるデータでは、細胞質テールを欠く、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の安定化された融合前形態をコードするｈＲＳＶ ＲＮＡを含む免疫化組成物が、動物に投与された場合、対照組成物よりも約５倍低い用量においてさえ、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に対する高度な中和抗体応答を誘導するということが示されている。
本開示のいくつかの態様は、細胞質テールを欠いており、かつ野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の同一性を有する、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む組成物（例えば、免疫化組成物、免疫原性組成物、及び／またはワクチン組成物）を提供する。
本開示の他の態様は、細胞質テールを欠くＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）リボ核酸（ＲＮＡ）を提供し、ここで、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、全長の野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質；ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質をコードするヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）ＲＮＡ；及びｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質をコードするヒトパラインフルエンザウイルス３（ｈＰＩＶ３）ＲＮＡに対して、少なくとも８５％の同一性を有する。
本開示のさらに他の態様は、配列番号７の配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を提供する。本開示のさらなる態様は、配列番号１５の配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞質テールを欠くヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）リボ核Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化融合前形態をコードし、ここで、このＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、全長の野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、このオープンリーディングフレームは、配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に製剤化される。
いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントのＣ末端２０～３０、２０～２５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、５～３０、５～２５、５～２０、または５～１５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントのＣ末端の２５アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸、または１０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの以下のＣ末端アミノ酸を含む：
ＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２５）；ＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２６）；ＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２７）；またはＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２８）。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、Ｐ１０２Ｘ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｘ置換、Ｓ１５５Ｘ置換、Ｓ１９０Ｘ置換、Ｖ２０７Ｘ置換、Ｓ２９０Ｘ置換、Ｌ３７３Ｘ置換、Ｉ３７９Ｘ置換、Ｍ４４７Ｘ置換、及びＹ４５８Ｘ置換からなる群より選択される修飾をさらに含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換からなる群より選択される修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾をさらに含む：Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換。
いくつかの実施形態では、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質は、配列番号１の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、配列番号８の配列に対して少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、配列番号８の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡは、配列番号７の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡは、配列番号７の配列を含むＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡは、配列番号２の配列を含む５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡは、配列番号４の配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡは、配列番号１５の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡは、配列番号１５の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質は、配列番号１１の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質は、配列番号１１の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ ＲＮＡは、配列番号１０の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ ＲＮＡは、配列番号１０の配列を含むＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ ＲＮＡは、配列番号２の配列を含む５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ ＲＮＡは、配列番号４の配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ ＲＮＡは、配列番号１６の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ ＲＮＡは、配列番号１６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質は、配列番号１４の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質は、配列番号１４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、配列番号１３の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、配列番号１３の配列を含むＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、配列番号２の配列を含む５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、配列番号４の配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、配列番号１７の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、配列番号１７の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡ、ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／またはｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐキャップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡ、ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／またはｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、ポリ（Ａ）テール（任意選択で５０から１５０ヌクレオチドの長さを有する）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡ、ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／またはｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、１－メチルシュードウリジンである。
いくつかの実施形態では、組成物は、２５μｇ～２００μｇのｈＲＳＶ ＲＮＡ、ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／またはｈＰＩＶ３ ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＥＧ修飾脂質、非カチオン性脂質、ステロール、イオン化可能なカチオン性脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質の混合物をさらに含む。
いくつかの実施形態では、脂質の混合物は、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質；５～２５％の非カチオン性脂質；２５～５５％のステロール；及び２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールはコレステロールであり；かつイオン化可能なカチオン性脂質は、化合物１の構造：
Figure 2023513073000001
 を有する。
いくつかの実施形態では、脂質の混合物は、脂質ナノ粒子を形成する。
いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ ＲＮＡ、ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及びｈＰＩＶ３ ＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に製剤化される。
本開示のいくつかの態様は、対象において、ｈＲＳＶ、ｈＭＰＶ、及び／またはｈＰＩＶ３に対する中和抗体応答を誘導するのに有効な量で、先行請求項のいずれか１つの組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象は免疫無防備状態である。いくつかの実施形態では、対象は肺疾患を有する。
いくつかの実施形態では、対象は５歳以下である。他の実施形態では、対象は６５歳以上である。
いくつかの実施形態では、方法は、対象に少なくとも２用量の組成物を投与することを含む。
国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２７号（公開番号第ＷＯ２０１７／０７０６２号）及び国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６５４０８号（公開番号第ＷＯ２０１８／１０７０８８号）の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアント（ｍＲＮＡ－１３４５によってコードされる）及び野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の概略図を示す。 ２つの時点でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞において異なる特徴を有するｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを示す。フローサイトメトリー分析には、融合前の形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体であるＡＭ１４を使用した。トップリードは、トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後に示されている。特徴１は最適化された５’ＵＴＲを指し、特徴２は野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のＦ１領域内の６つのアミノ酸点変異を指す（図１）。 ２つの時点でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞において異なる特徴を有するｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを示している。フローサイトメトリー分析には、融合前の形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体であるＡＭ１４を使用した。特徴１は最適化された５’ＵＴＲを指し、特徴２は野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のＦ１領域内の６つのアミノ酸点変異を指す（図１）。図２Ｂは、候補構築物の３つの異なる用量後の発現レベルを示している。「ｄＣＴ」は、細胞質テールが短縮されているＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡを表す。 マウスにおける、異なる特徴を有するｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを示す。ｍＲＮＡの２回の投与に続いて、融合後の形態のＲＳＶ Ｆタンパク質レベルを測定した。 マウスにおける、異なる特徴を有するｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを示す。ｍＲＮＡの２回の投与に続いて、ＲＳＶ－Ａ中和力価を測定した。 細胞質テールが短縮されているＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡを使用した、融合前形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルを示す。図は、３つの異なる時点での結果を示している。ＡＭ１４及びＤ２５は、２つの融合前ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質特異的抗体である。モタビズマブは、融合前と融合後の両方のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質を検出する。 細胞質テールが短縮されているＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡを使用した、融合前形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルを示す。図は、両方の特徴（コドン最適化及び細胞質テール短縮）の組み合わせを、各特徴を個別に有するｍＲＮＡと比較する。ＡＭ１４及びＤ２５は、２つの融合前ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質特異的抗体である。モタビズマブは、融合前と融合後の両方のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質を検出する。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、細胞質テールが短縮されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡを使用した、融合前形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルを示す。 ＴＨＰ－１細胞（図５Ｂ）において、細胞質テールが短縮されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡを使用した、融合前形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルを示す。 細胞質テールが短縮されているＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の融合前形態をコードするコドン最適化ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏデータを示す。ｍＲＮＡの投与に起因する融合後の形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質ＩｇＧ力価レベルを、１回目の投与後（図６Ａ）及び２回目の投与後（図６Ｂ）について示す。 細胞質テールが短縮されているＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の融合前形態をコードするコドン最適化ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏデータを示す。ｍＲＮＡの投与に起因する融合後の形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質ＩｇＧ力価レベルを、１回目の投与後（図６Ａ）及び２回目の投与後（図６Ｂ）について示す。 示されたｍＲＮＡ（対照（代替ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）、ＲＳＶ Ｆバリアント、またはｍＲＮＡなし）との２４時間（左）及び４８時間（右）のインキュベーション後の融合前形態のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質陽性ＣＤ１４＋単球の頻度を示す２つのグラフを示す。 示されているｍＲＮＡ及び濃度（対照（代替のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）、コドン最適化ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質ｍＲＮＡ、細胞質テールが短縮されているＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ、組み合わせＲＳＶ Ｆ糖タンパク質（細胞質テール短縮でコドン最適化）をコードするｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡなし）との２４時間（左）及び４８時間（右）のインキュベーション後のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質陽性ＣＤ１４＋単球の融合前形態の頻度を示すグラフである。 顕微鏡実験後の細胞あたりの平均強度（平均）を示すグラフである。ＨｅＬａ細胞を、２００ｎｇの示されたｍＲＮＡ（対照（ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードする代替ｍＲＮＡ）、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡ、細胞質テールが短縮されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ、組み合わせＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ（細胞質テール短縮でコドン最適化）、またはｍＲＮＡなし）とともに２４時間または４８時間インキュベートし、平均強度を測定した。 ワクチン接種後５６日目のＲＳＶ抗体力価を示す。Ａは、ＲＳＶ中和力価を示し、Ｂは、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質ＩｇＧ力価を示している。アスタリスク（＊）が付いている群は、示された組成物を１回だけ投与された群である。「Ｌｏｔ１００」とは、１：１００のホルマリン不活化ＲＳＶ群（ＦＩ－ＲＳＶ）を指す。 ＲＳＶチャレンジ後の肺ウイルス量（Ａ）及び鼻ウイルス量（Ｂ）を示す（実施例４を参照）。アスタリスク（＊）が付いている群は、示された組成物を１回だけ投与された群である。「Ｌｏｔ１００」とは、１：１００のホルマリン不活化ＲＳＶ群（ＦＩ－ＲＳＶ）を指す。
本開示は、呼吸器系ウイルス抗原に対する強力な中和抗体を誘発する免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を提供する。本明細書における「呼吸器系ウイルス抗原」という用語は、本開示のＲＮＡによってコードされる、ｈＲＳＶ抗原（例えば、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質）、ｈＭＰＶ抗原（例えば、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質）、ｈＰＩＶ３抗原（例えば、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質）、及びそれらの任意の組み合わせ（例えば、ｈＲＳＶ及びｈＭＰＶ、ｈＲＳＶ及びｈＰＩＶ３、ｈＭＰＶ及びｈＰＩＶ３、またはｈＲＳＶ、ｈＭＰＶ、及びｈＰＩＶ３）を包含する。「ＲＮＡ」及び「ＲＮＡ構築物」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得ることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、融合前形態のｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を含む。他の実施形態では、免疫化組成物は、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆ糖タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫化組成物は、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ｈＰＩＶ３）Ｆ糖タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫化組成物は、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の融合前形態をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、及びｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質、及びｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質の融合前形態は、同じ（単一の）ＲＮＡによってコードされ、一方、他の実施形態では、それらは、複数のＲＮＡ（１つは融合前ｈＲＳＶ Ｆをコードし、１つはｈＭＰＶ Ｆをコードし、１つはｈＰＩＶ３ Ｆをコードする）によって独立してコードされる。いくつかの実施形態では、１つのＲＮＡ（例えば、５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）テールを有する）は、融合前ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードし、別のＲＮＡは、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質及びｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質の両方をコードする。
ｈＲＳＶのエンベロープには、Ｆ、Ｇ、及びＳＨの３つの表面糖タンパク質が含まれている。Ｇ及びＦタンパク質は、防御抗原であり、中和抗体の標的である。しかし、Ｆタンパク質は、ｈＲＳＶの系統及びタイプ（Ａ及びＢ）全体で、より保存されている。ｈＲＳＶ Ｆタンパク質は、ｈＲＳＶ－ＡとｈＲＳＶ－Ｂの抗原性サブグループの間を含む、臨床分離株間でよく保存されているＩ型融合糖タンパク質である。Ｆタンパク質は、融合前と融合後のより安定した状態の間を移行し、それによって標的細胞への侵入を促進する。ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質は、最初はＦ０前駆体タンパク質として合成される。ｈＲＳＶ Ｆ０は、三量体に折りたたまれ、Ｆ１及びＦ２サブユニットを含む成熟した融合前タンパク質へのフーリン切断によって活性化される（Ｂｏｌｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６８：２５，２０００）。中和モノクローナル抗体の標的は、Ｆタンパク質の融合後の高次構造に存在するが、中和Ａｂ応答は、主にｈＲＳＶに自然感染した人々のＦタンパク質の融合前の高次構造を標的とする（Ｍａｇｒｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１２；１０９（８）：３０８９－９４；Ｎｇｗｕｔａ ＪＯ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１５；７（３０９）：３０９ｒａ１６２）。これと一致して、融合前の高次構造で安定化されたｈＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合後の高次構造で安定化されたｈＲＳＶ Ｆタンパク質で観察されたものよりも、動物モデルでより大きな中和免疫応答を生じる（ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４２：５９２－５９８，２０１３）。したがって、安定化された融合前のｈＲＳＶ Ｆタンパク質は、ｈＲＳＶワクチンに含めるための優れた候補である。
本明細書で使用されるように、不安定な高エネルギー状態で存在する、安定化された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、タンパク質の融合後高次構造への移行を防ぐための変異（例えば、安定化変異）を含むタンパク質である。例えば、いくつかの実施形態では、安定化された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、プロリン残基（例えば、Ｓ２１５Ｐ置換）及び／またはイソロイシン（例えば、Ｎ６７Ｉ置換）置換を含む。例として、安定化された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質であるＤＳ－Ｃａｖ１バリアントには、追加のジスルフィド結合（Ｓ１５５Ｃ／Ｓ２９０Ｃ）と２つの空洞充填変異（Ｓ１９０Ｆ／Ｖ２０７Ｌ）が含まれている。別の安定化された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質はＰＲ－ＤＭであり、これは１つのプロリン置換（Ｓ２１５Ｐ）及びＦ２サブユニットの１つの変異（Ｎ６７Ｉ）を含む。
本明細書に記載されているｈＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、いくつかの点で現在のワクチンよりも優れている。例えば、本明細書で使用される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系は、文献に記載されているプロタミンベースのアプローチを含む、他の製剤と比較して、ＲＮＡワクチンの有効性を高める。このＬＮＰ送達系を使用すると、治療結果（産生中和抗体力価など）を得るために追加のアジュバントを必要とせずに、化学修飾ＲＮＡワクチンまたは非修飾ＲＮＡワクチンの効果的な送達が可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｈＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）投与された場合、従来のワクチンよりも少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１，０００倍優れている。これらの結果は、他のクラスの脂質ベースの製剤で使用されるＲＮＡ用量と比較して、有意に低い用量のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）が投与された場合でも達成され得る。
さらに、免疫原性応答を生成するのに十分なＲＮＡを細胞に送達するためにウイルス複製経路に依存する自己複製ＲＮＡワクチンとは異なり、本開示の組成物は、強力な免疫応答をもたらすのに十分なタンパク質を生成するのにウイルス複製を必要としない。したがって、本開示の組成物は、自己複製ＲＮＡを含まず、かつウイルス複製に必要な構成要素も含まない。
本明細書で提供されるＲＮＡは、特定のウイルス株（例えば、ｈＲＳＶ、ｈＭＰＶ、及び／またはｈＰＩＶ３）によって制限されない。ｍＲＮＡの基になるウイルスの株は、任意のウイルスの株であってもよい。
本開示の免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、天然に存在するものではないことを理解されたい。すなわち、本明細書で提供される呼吸器系ウイルス抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドは、自然界では存在しない。本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドは、それらが自然界に存在するので、ウイルスタンパク質及びウイルス脂質から単離されることも理解されるべきである。したがって、本明細書で提供されるように、脂質ナノ粒子中に製剤化されたＲＮＡを含む免疫化組成物は、例えば、ウイルスを除外する（すなわち、この組成物は、ウイルスではなく、ウイルスを含むこともない）。
抗原
抗原とは、免疫応答を誘導し得る（例えば、免疫系に抗原に対する抗体を産生させる）タンパク質である。本明細書において、「抗原」という用語の使用は、特に明記されていない限り、免疫原性タンパク質及び免疫原性フラグメント（（少なくとも１つの）呼吸器系ウイルス、例えば、ｈＲＳＶ、またはｈＲＳＶ、ｈＭＰＶ及びｈＰＩＶ３）に対する免疫応答を誘発する（または誘発し得る）免疫原性フラグメント）を包含する。「タンパク質」という用語はペプチドを含み、「抗原」という用語は抗原性フラグメントを含むことを理解されたい。
本開示の組成物の呼吸器系ウイルス抗原及びこの呼吸器系ウイルス抗原をコードするＲＮＡの例示的な配列を表１に示す。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８の配列を含むｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の融合前形態をコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１１の配列を含む、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質の融合前形態をコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１４の配列を含む、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質の融合前形態をコードするＲＮＡを含む。
本明細書に記載のＲＮＡによってコードされる抗原は、いずれもシグナル配列を含む場合も含まない場合もあることを理解されたい。
核酸
本開示の組成物は、呼吸器系ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（少なくとも１つの）ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール及び／または５’キャップ類似体をさらに含む。
本開示のｈＭＰＶ／ｈＰＩＶ３ ｍＲＮＡワクチンは、任意の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３’ＵＴＲを含み得ることも理解されるべきである。例示的なＵＴＲ配列は、配列表に示されている（例えば、配列番号２～５）。ただし、他のＵＴＲ配列を使用してもよいし、本書に記載されているＵＴＲ配列のいずれかと交換してもよい。本明細書で提供されるＲＮＡポリヌクレオチドからＵＴＲを省略してもよい。
核酸は、ヌクレオチド（ヌクレオチド単量体）のポリマーを含む。したがって、核酸はポリヌクレオチドとも呼ばれる。核酸は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、例としては、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、ならびに／または、これらのキメラ及び／もしくは組合せであってもよく、これらを含んでもよい。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）タンパク質（天然に存在するか、天然に存在しないか、または修飾されたアミノ酸のポリマー）をコードする任意のＲＮＡであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおいてコードされたタンパク質を生成するために翻訳され得る。当業者は、特に断りのない限り、本出願に記載の核酸配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を記載し得るが、配列がＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を表す場合、「Ｔ」は、「Ｕ」で置き換えられると理解される。したがって、本明細書の特定の配列識別番号によって開示及び識別される任意のＤＮＡはまた、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」が「Ｕ」で置換されている、ＤＮＡに相補的な対応するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列も開示する。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））で始まり、停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧ、もしくはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続ストレッチである。ＯＲＦは通常、タンパク質をコードする。本明細書に開示される配列は、追加のエレメント、例えば、５’及び３’ＵＴＲをさらに含み得るが、これらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のＲＮＡポリヌクレオチドに必ずしも存在する必要はないことが理解される。
バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、呼吸器系ウイルス抗原バリアントをコードするＲＮＡを含む。抗原バリアントまたは他のポリペプチドバリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。抗原／ポリペプチドバリアントは、ネイティブ配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
本開示の核酸によってコードされるバリアント抗原／ポリペプチドは、多数の望ましい特性、例えば、その免疫原性を強化する、その発現を強化する、及び／または対象におけるその安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する特性のいずれかを付与するアミノ酸変化を含んでもよい。バリアント抗原／ポリペプチドは、慣用的な変異誘発技法を用いて作製し、適宜アッセイして、所望の特性を有するか否かを評価し得る。発現レベル及び免疫原性を決定するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例示的なそのようなアッセイは実施例のセクションに記載されている。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性も、当該技術分野で認識されている技法を用いて（例えば、ワクチン接種した対象内の抗原の発現を経時的に評価することにより、及び／または誘導された免疫応答の持続性を確認することにより）測定し得る。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性時の安定性を分析することによって測定してもよく、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を用いて測定してもよい。このような実験及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価のための方法は、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供する配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む（例えば、配列表及び表１を参照）ＲＮＡもしくはＲＮＡ ＯＲＦを含むか、または本明細書で提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係であって、これらの配列を比較することにより決定される関係を指す。また、同一性とは、配列間のまたは配列内の配列関連性の程度であって、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の鎖間のマッチ数により決定される配列関連性の程度を指す。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって対処される、ギャップアラインメント（もしあれば）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全な一致の割合を測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）」とは、候補アミノ酸または核酸の配列内で、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列内の残基と同一である残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージであって、その配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成した後のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野では周知されている。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、この計算に導入されるギャップ及びペナルティーのために値が異なる場合があることが理解されている。概して、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され当業者に公知である配列アラインメントプログラム及びパラメーターによる定量において、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対し、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ただし１００％未満の配列同一性を有する。このようなアラインメント用のツールとしては、ＢＬＡＳＴスイート（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のツールが挙げられる。別のよく知られたローカルアラインメント技法は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）に基づく。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアラインメント技法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。より最近では、Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されており、これは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含めた他の最適グローバルアラインメント法よりも速く、ヌクレオチド及びタンパク質配列を網羅的にアラインメントするとされている。
そのため、参照配列、とりわけ本明細書で開示するポリペプチド（例えば、抗原）配列に関する置換、挿入、及び／または付加、欠失、及び共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸（例えば、１つ以上のリジン）をペプチド配列に（例えば、そのＮ末端またはＣ末端に）付加してもよい。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または局在化に使用し得る。リジンを使用して、ペプチド溶解性を増大してもよいし、またはビオチン化を可能にしてもよい。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、短縮配列をもたらしてもよい。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、代替的に、配列の用途に応じて欠失させてもよい（例えば、溶解性である、より大きな配列の一部としてのまたは固体支持体に結合した配列の発現）。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）などのための（またはこれらをコードする）配列は、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置き換えてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することにより、充填して安定性を改善してもよい。他の実施形態では、埋没した（ｂｕｒｉｅｄ）水素結合ネットワークは、安定性を改善するために疎水性残基で置き換えてもよい。また他の実施形態では、グリコシル化部位を除去し、適切な残基で置き換えてもよい。このような配列は、当業者には容易に識別可能である。また、本明細書で提供する配列のいくつかは、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの調製で使用する前に、欠失させ得る配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含むことも理解されたい。
当業者には認識されるように、タンパク質フラグメント、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、目的の呼吸器系ウイルス抗原の範囲内であると考えられる。例えば、本明細書では、参照タンパク質の任意のタンパク質フラグメント（参照抗原配列より少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）であって、免疫原性であり、呼吸器系ウイルスに対する防御免疫応答を付与することを条件とする、タンパク質フラグメントを提供する。参照タンパク質と同一であるが短縮されているバリアントに加えて、いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書で提供または言及するいずれかの配列に対し２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。抗原／抗原ポリペプチドの長さは、約４、６、または８アミノ酸から全長タンパク質までの範囲をとり得る。
ｈＲＳＶ抗原バリアント
いくつかの実施形態では、組成物は、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントのＣ末端２０～３０、２０～２５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、５～３０、５～２５、５～２０、または５～１５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のＣ末端２５アミノ酸（例えば、ＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２５））を含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のＣ末端２０アミノ酸（例えば、ＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２６））を含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のＣ末端１５アミノ酸（例えば、ＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２７））を含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールは、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のＣ末端１０アミノ酸（例えば、ＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２８））を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするＲＮＡを含み、ここで、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質（例えば、配列番号１の配列を含む野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質）または細胞質テールを欠く野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするＲＮＡを含み、ここで、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、配列番号８の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８の配列を含むｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするＲＮＡを含み、ここで、ＲＮＡは、配列番号７の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有するＯＲＦ配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするＲＮＡを含み、ここで、ＲＮＡは、配列番号１５の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、以下：Ｐ１０２Ｘ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｘ置換、Ｓ１５５Ｘ置換、Ｓ１９０Ｘ置換、Ｖ２０７Ｘ置換、Ｓ２９０Ｘ置換、Ｌ３７３Ｘ置換、Ｉ３７９Ｘ置換、Ｍ４４７Ｘ置換、及びＹ４５８Ｘ置換からなる群より選択される修飾をさらに含み、Ｘは任意のアミノ酸である（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶ）。
いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下からなる群より選択される修飾をさらに含む：Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｐ１０２Ａ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ａ１４９Ｃ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｓ１５５Ｃ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｓ１９０Ｆ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｖ２０７Ｌ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｓ２９０Ｃ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｌ３７３Ｒ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｉ３７９Ｖ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｍ４４７Ｖ置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、Ｙ４５８Ｃ置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、細胞質テールを欠くｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントは、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾をさらに含む：Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換。
ｈＭＰＶ抗原バリアント
いくつかの実施形態では、組成物は、野生型ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有するｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１１の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１１の配列を含むｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含み、このＲＮＡは、配列番号１０の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有するＯＲＦ配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含み、ここで、ＲＮＡは、配列番号１６の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
ｈＰＩＶ３抗原バリアント
いくつかの実施形態では、組成物は、野生型ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有するｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１４の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１４の配列を含むｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含み、このＲＮＡは、配列番号１３の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有するＯＲＦ配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質バリアントをコードするＲＮＡを含み、ここで、このＲＮＡは配列番号１７の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
安定化エレメント
天然の真核ｍＲＮＡ分子は、他の構造的特徴（例えば、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）テール）に加えて、安定化エレメント（限定されるものではないが、その５’末端（５’ＵＴＲ）及び／またはその３’末端（３’ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む）を含み得る。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲはいずれも、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾を有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、少なくとも１つの５’末端キャップを含み、脂質ナノ粒子内で製剤化される。ポリヌクレオチドの５’－キャップは、以下の化学ＲＮＡキャップアナログ：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応中に同時に完了させて、製造業者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成してもよい（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’－キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了させて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成し得る（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を用いて生成して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から、次に２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて５’末端から３番目のヌクレオチドを２’－Ｏメチル化することにより、生成し得る。キャップ３構造は、キャップ２構造から、次に２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて５’末端から４番目のヌクレオチドを２’－Ｏメチル化することにより、生成し得る。酵素は、組換え供給源に由来し得る。
３’－ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドのストレッチである。これは、場合によっては最大約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。
いくつかの実施形態では、組成物は安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａのタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと関連している。その発現レベルは細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、ヒストンのステムループとの結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対し少なくとも３つのヌクレオチド５’及び２つのヌクレオチド３’を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、コード領域と、少なくとも１つのヒストンステムループと、任意選択でポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルとを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを強化するはずである。コードされたタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）でもなく、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））でもない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組合せであって、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的に作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増大させる組み合わせを含む。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組合せによる相乗効果は、エレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、天然に存在するステムループの３’にある約１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドのストレッチを含み、これはヒストンプレｍＲＮＡから成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ ｓｎＲＮＡの結合部位に相当する。いくつかの実施形態では、この核酸はイントロンを含まない。
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、エンハンサー及び／またはプロモーター配列を含んでも含まなくてもよく、これらは、修飾されても修飾されなくてもよく、活性化されても活性化されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、概してヒストン遺伝子に由来し、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または全体的に逆相補的な配列の分子内塩基対を含み、これがこの構造のループを形成する。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれとも塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡに存在する場合が多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、概して、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対（非ワトソン・クリック塩基対）が結果的に生じ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５ヌクレオチドの長さを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ以上のＡＵリッチの配列が除去されている。これらの配列（ＡＵＲＥＳと称されることがある）は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチン中に残存していてもよい。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、組成物は、呼吸器系ウイルス抗原と融合したシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端側の１５～６０アミノ酸を含み、典型的には、分泌経路上の膜を横断した転位に必要であるので、真核生物及び原核生物の両方でほとんどのタンパク質が分泌経路に侵入するのを普遍的に制御している。真核生物においては、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドが、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、プロセシングのために、成長ペプチド鎖の膜横断輸送を開始する。ＥＲプロセシングにより成熟タンパク質が生成され、シグナルペプチドは、典型的には、宿主細胞のＥＲ常駐シグナルペプチダーゼにより、前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されないまま保たれ、膜アンカーとして機能する。また、シグナルペプチドは、タンパク質を細胞膜に標的化するのも促進し得る。
シグナルペプチドは１５～６０アミノ酸の長さであってもよい。例えば、シグナルペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドの長さは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長である。
異種遺伝子由来のシグナルペプチド（事実上呼吸器系ウイルス抗原以外の遺伝子の発現を調節する）が当該技術分野で公知であり、これを所望の特性について試験し、次いで本開示の核酸に組み込んでもよい。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、以下の配列のうちの１つを含んでもよい：
ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＰＱＧＶＶＧ（配列番号１８）、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号１９）；ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２０）；ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ（配列番号２１）；ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ（配列番号２２）；ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ（配列番号２３）。
融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、抗原性融合タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。したがって、コードされた抗原または複数の抗原は、一緒に結合された２つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質フラグメント）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質に融合されたｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質をコードする。あるいは、タンパク質抗原が融合しているタンパク質は、それ自体に対する強力な免疫応答を促進するのではなく、呼吸器系ウイルス抗原に対する強力な免疫応答を促進する。抗原性融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、各々の元のタンパク質由来の機能特性を保持している。
足場部分
本明細書で提供されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、いくつかの実施形態では、足場部分に連結された呼吸器系ウイルス抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのような足場部分は、本開示の核酸によってコードされる抗原に所望の特性を付与する。例えば、足場タンパク質は、例えば、抗原の構造を変更すること、抗原の取り込み及びプロセシングを変更すること、及び／または抗原を結合パートナーに結合させることによって、抗原の免疫原性を改善し得る。
いくつかの実施形態では、足場部分とは、高度に対称で、安定で、構造的に組織化され、直径が１０～１５０ｎｍであり、免疫系の様々な細胞との最適な相互作用に非常に適したサイズ範囲であるタンパク質ナノ粒子に自己集合し得るタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質またはウイルス様粒子を使用して、安定したナノ粒子構造を形成し得る。そのようなウイルスタンパク質の例は、当該技術分野で公知である。例えば、いくつかの実施形態では、足場部分は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは、平均直径が約２２ｎｍの球状粒子を形成し、核酸を欠いているため非感染性である（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（２０１６）５８－６８）。いくつかの実施形態では、足場部分は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）であり、ＨＢＶに感染したヒト肝臓から得られるウイルスコアに類似した、直径２４～３１ｎｍの粒子に自己集合する。自己組織化で生成されたＨＢｃＡｇは、１８０または２４０のプロトマーに対応する、直径３００Å及び３６０Åの異なるサイズのナノ粒子の２つのクラスに自己集合される。いくつかの実施形態では、呼吸器系ウイルス抗原は、呼吸器系ウイルス抗原を提示するナノ粒子の自己集合を容易にするために、ＨＢｓＡＧまたはＨＢｃＡＧに融合される。
いくつかの実施形態では、細菌タンパク質プラットフォームを使用してもよい。これらの自己組織化タンパク質の非限定的な例としては、フェリチン、ルマジン、及びエンカプスリンが挙げられる。
フェリチンは、その主な機能が細胞内鉄貯蔵であるタンパク質である。フェリチンは２４個のサブユニットで構成されており、それぞれが４つのアルファヘリックスバンドルで構成されており、八面体対称の４次構造に自己集合する（Ｃｈｏ Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８）。フェリチンのいくつかの高解像度構造が決定されており、ヘリコバクターピロリフェリチンは、２４個の同一のプロトマーでできているのに対し、動物には、単独で集合するか、または異なる比率で組み合わせて２４個のサブユニットの粒子になり得るフェリチンの軽鎖及び重鎖がある（Ｇｒａｎｉｅｒ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１；Ｌａｗｓｏｎ Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、ロバストな熱的及び化学的安定性を備えたナノ粒子に自己集合する。したがって、フェリチンナノ粒子は、抗原を運び、露出するのに非常に適している。
ルマジンシンターゼ（ＬＳ）は、抗原提示用のナノ粒子プラットフォームとしても適している。リボフラビンの生合成における最後から２番目の触媒ステップに関与するＬＳは、古細菌、細菌、真菌、植物、及び真正細菌など、広範な生物に存在する酵素である（Ｗｅｂｅｒ Ｓ．Ｅ．Ｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４）。ＬＳモノマーは、１５０アミノ酸の長さで、ベータシートとその側面に隣接するタンデムアルファヘリックスとで構成されている。ＬＳについては、ホモペンタマーから直径１５０Åのカプシドを形成する１２ペンタマーの対称アセンブリまで、その形態の多様性を示す、多数の異なる４次構造が報告されている。１００を超えるサブユニットのＬＳケージでさえも報告されている（Ｚｈａｎｇ Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００６；３６２：７５３－７７０）。
好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから単離された新規タンパク質ケージナノ粒子であるエンカプスリンはまた、自己集合ナノ粒子の表面に抗原を提示するためのプラットフォームとしても使用され得る。エンカプスリンは、内径と外径がそれぞれ２０ｎｍと２４ｎｍの薄い正二十面体のＴ＝１対称ケージ構造を有する同一の３１ｋＤａモノマーの６０コピーから組み立てられる（Ｓｕｔｔｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８，１５：９３９－９４７）。Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａにおけるエンカプスリンの正確な機能はまだ明確に理解されていないが、その結晶構造は、最近解明され、その機能は、酸化ストレス応答に関与している、ＤｙＰ（色素脱色ペルオキシダーゼ）及びＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）などのタンパク質をカプセル化する細胞区画として仮定された（Ｒａｈｍａｎｐｏｕｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳＪ．２０１３，２８０：２０９７－２１０４）。
リンカー及び切断可能なペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、本明細書において融合タンパク質と呼ばれる２つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも１つまたはそれぞれのドメインの間に位置するリンカーをさらにコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーであっても、またはプロテアーゼ感受性リンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。２Ａペプチドと呼ばれるこの自己切断ペプチドリンカーのファミリーは、当該技術分野で説明されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１８５５６を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーはＦ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＧＳリンカーである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造：ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメインを有する、介在するリンカーを有する３つのドメインを含む。
当該技術分野で公知の切断可能なリンカーを、本開示に関連して使用してもよい。例示的なそのようなリンカーとしては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカーが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１７１２７７５０を参照）。当業者は、他の当該技術分野で認識されているリンカーが、本開示のＲＮＡ（例えば、本開示の核酸によってコードされるもの）での使用に適し得ることを理解するであろう。当業者は同様に、他のポリシストロン性ＲＮＡ（例えば、同じ分子内で別々に２つ以上の抗原／ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）が、本明細書で提供される使用に適し得ることを理解するであろう。
配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化されている。コドン最適化の方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本明細書で提供する配列のいずれか１つ以上のＯＲＦがコドン最適化されてもよい。いくつかの実施形態では、コドン最適化を用いて、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確保するか；ＧＣ含量にバイアスをかけてｍＲＮＡの安定性を増加するか、もしくは二次構造を低減するか；遺伝子構成もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンもしくは塩基の連続を最小にするか；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズし：タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去するか；コードされるタンパク質内の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加するか；タンパク質ドメインを付加、除去、もしくはシャッフルするか；制限酵素認識部位を挿入もしくは欠失させるか；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するか；翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれるようにするか；またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは取り除いてもよい。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で公知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）のサービス、及び／または独自方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列ＯＲＦ（例えば、呼吸器系ウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、呼吸器系ウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、呼吸器系ウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、呼吸器系ウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、呼吸器系ウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、呼吸器系ウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、呼吸器系ウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされる呼吸器系ウイルス抗原と免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）抗原をコードする。
修飾ｍＲＮＡは、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞による発現が可能である。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃレベルが強化されたＲＮＡであり得る。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含むＲＮＡより機能的に安定している場合がある。例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含む医薬組成物を開示している。遺伝子コードの縮退に起因して、この修飾は、既存のコドンを、得られるアミノ酸を変更することなく、より高いＲＮＡ安定性を促進するコドンに置き換えることによって機能する。このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。
化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なヌクレオシド残基、例えば、転写ＲＮＡ内に存在する残基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なデオキシリボヌクレオシド、例えば、ＤＮＡ内に存在するデオキシリボヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ））を含む。
化学修飾
本開示の組成物は、いくつかの実施形態では、呼吸器系ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含み、当該核酸は、標準的（非修飾）であっても当該技術分野で知られているように修飾されてもよいヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。このような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよく、または天然には存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよい。このような修飾としては、当該技術分野で認識されているヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、当該技術分野で一般に知られているかまたは認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、とりわけ、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の非天然の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、当該技術分野で一般的に公知であるか、または認識されているものである。このような天然には存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、とりわけ、公開された米国特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７（これらの全てが参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（２つ以上の）異なるタイプの標準ならびに／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択で異なる）タイプの標準的及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における分解の減少を示す。
いくつかの実施形態では、細胞または生物体に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸に比べて、それぞれ細胞または生物体において免疫原性の低減を呈し得る（例えば、生得的応答の低減）。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、核酸の合成中または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成により導入されてもよく、または鎖の末端もしくは鎖の他の箇所にあるポリメラーゼ酵素により、導入されてもよい。核酸の任意の領域を化学的に修飾してもよい。
本開示は、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸））の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、任意の有用な方法によって（例えば、化学的に、酵素的に、または組換え的に）合成して、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めてもよい。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含んでもよい。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、この場合、この核酸はヌクレオチドの領域を含む。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準的アデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準的または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、このとき、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置により、例えば、少なくとも１つの化学的修飾を有する核酸内で、非標準的塩基と標準的塩基との間、または２つの相補的な非標準的塩基構造間の水素結合が可能となる。このような非標準的塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せを本開示のポリヌクレオチドに組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）中の修飾された核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）中の修飾された核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、前述の任意の修飾核酸塩基（限定されるものではないが、化学修飾を含む）のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、核酸は１－メチル－シュードウリジンで一様に修飾されてもよく、これは、ｍＲＮＡ配列内の全てのウリジン残基が１－メチル－シュードウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、核酸は、修飾残基（例えば、上記の残基）で置き換えることにより、配列内に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基について一様に修飾されてもよい。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。例えば、本開示の核酸内、またはその所定の配列領域内（例えば、ポリ（Ａ）テールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つ以上または全てまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）が一様に修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）内の全てのヌクレオチドＸが、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つであってもよく、または以下の組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであってもよい。
核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含量に関して、または１つ以上のタイプのヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上）に関して）、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含み得る。任意の残りのパーセンテージが、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明されることが理解されよう。
ｍＲＮＡは、１％以上１００％までの修飾ヌクレオチド、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチド）を含み得る。例えば、核酸は、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシルまたはシトシン）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸内のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよいし、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、核酸内のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよいし、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが少なくとも１つの目的抗原をコードするように設計されている場合、核酸はこれらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡでは、５’ＵＴＲは転写開始点で開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後から開始して転写終結シグナルまで続く。ＵＴＲが核酸分子の安定性及び翻訳に関して調節的役割を担っていることについてのエビデンスが増えている。ＵＴＲの調節機能は、特に分子の安定性を高めるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない臓器部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方調節の制御を確保するための特定の機能も組み込むことができる。様々な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が公知であり、当該技術分野で利用可能である。
５’ＵＴＲは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（ノンコーディングである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす機能を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているＫｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを有する。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２９）を有し、Ｒは開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、この後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連する自然界で見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲであり、すなわち、自然界には存在しない。合成ＵＴＲとしては、その特性を改善する（例えば、遺伝子発現を増大する）ために変異させたＵＴＲ、及び完全に合成のＵＴＲが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号）、ヒトシトクロムｂ－２４５ ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号）が挙げられる。ＣＭＶ早初期１（ＩＥ１）遺伝子（米国特許出願公開第２０１４０２０６７５３号、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号３０）（ＷＯ２０１４１４４１９６）も使用してもよい。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ／２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０２４６６７；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。
いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号３及び配列番号４から選択される配列を含む。
３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（ノンコーディングである）。天然または野生型の３’ＵＴＲには、アデノシン及びウリジンのストレッチが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。配列の特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は３つのクラスに分類することができ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）、クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含む。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤはクラスＩ ＡＲＥを含む。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（配列番号３１）九量体を有する。このタイプのＡＲＥを含む分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩ ＡＲＥはそれほど十分には定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含まない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎはこのクラスで十分に研究されている２つの例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質はメッセンジャーを不安定にすることが公知であり、一方ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲはｍＲＮＡの安定性を増大させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに組み込むと、ＨｕＲ結合が生じ、これによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのメッセージが安定する。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性を調節してもよい。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少し得る。同様に、ＡＲＥを特定して除去または変異させることで、細胞内の安定性を増大し、これによって、結果として得られるタンパク質の翻訳及び産生を増大し得る。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、関連する細胞株で実施し得、タンパク質産生は、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイされ得る。例えば、細胞にさまざまなＡＲＥエンジニアリング分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを関連タンパク質に使用して、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に生成されたタンパク質をアッセイしてもよい。
３’ＵＴＲは、異種であっても合成であってもよい。３’ＵＴＲについては、グロビンＵＴＲ（Ｘｅｎｏｐｕｓ β－グロビンＵＴＲ及びヒトβ－グロビンＵＴＲを含む）が当該技術分野で公知である（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号、米国特許出願公開第２０１１００８６９０７号）。２つの連続したヒトβグロビン３’ＵＴＲをヘッドトゥーテールでクローニングすることにより、いくつかの細胞タイプでの安定性が強化された修飾βグロビンをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が開発されており、当該技術分野で周知である（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号、ＷＯ２０１４／０７１９６３）。さらに、ａ２－グロビン、ａ１－グロビン、ＵＴＲ及びこれらの変異体も当該技術分野で公知である（ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ２０１５０２４６６７）。非特許文献においてｍＲＮＡで説明されている他の３’ＵＴＲとしては、ＣＹＢＡ（Ｆｅｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びアルブミン（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられる。他の例示的な３’ＵＴＲとしては、ウシまたはヒト成長ホルモン（野生型または修飾）（ＷＯ２０１３／１８５０６９、米国特許出願公開第２０１４０２０６７５３号、ＷＯ２０１４１５２７７４）、ウサギβグロビン及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＵＴＲが挙げられ、αグロビン３’ＵＴＲ及びウイルスＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ配列も当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、配列ＵＵＵＧＡＡＵＵ（ＷＯ２０１４１４４１９６）が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト及びマウスリボソームタンパク質の３’ＵＴＲが使用される。他の例としては、ｒｐｓ９ ３’ＵＴＲ（ＷＯ２０１５１０１４１４）、ＦＩＧ４（ＷＯ２０１５１０１４１５）、及びヒトアルブミン７（ＷＯ２０１５１０１４１５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号５及び配列番号６から選択される配列を含む。
当業者であれば、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列と共に使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲを、合成３’ＵＴＲと、異種３”ＵＴＲと共に使用してもよい。
非ＵＴＲ配列はまた、核酸内の領域またはサブ領域として使用されてもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を本開示の核酸の領域に組み込んでもよい。イントロン配列を組み込むと、タンパク質の産生と核酸の発現レベルを増大し得る。
特徴の組合せを隣接する領域に含めてもよく、他の特徴の中に含めてもよい。例えば、ＯＲＦには、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含み得る５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールを鋳型的に付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲが隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なる遺伝子からの第１のポリヌクレオチドフラグメント及び第２のポリヌクレオチドフラグメントを含み得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５’ＵＴＲ）。
任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲが核酸の領域に組み込まれ得ることを理解されたい。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部は、それらが選択された転写産物と同じ方向に配置してもよく、または方向もしくは位置を変更してもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長されても、または１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで作成されてもよい。本明細書で使用される場合、ＵＴＲ配列に関連する「変更された」という用語は、ＵＴＲが参照配列に関連して何らかの方法で変更されたことを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上記のように配向もしくは位置の変化によって野生型またはネイティブＵＴＲと比較して変化されてもよいし、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換または転位によって変化されてもよい。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’）を生成するこれらの変更のいずれかは、バリアントＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重または四重ＵＴＲを使用してもよい。本明細書で使用される場合、「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列のいずれかでコードされているＵＴＲである。例えば、二重ベータグロビン３’ＵＴＲは、米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載されているように使用してもよく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
パターン化されたＵＴＲを有することもまた、本開示の範囲内である。本明細書で使用される場合「パターン化ＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントが１回、２回、または３回を超えて繰り返されるような繰り返しパターンまたは交互のパターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
いくつかの実施形態では、隣接する領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織、または発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属し得る。任意のこれらの遺伝子由来のＵＴＲを、同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新しいポリヌクレオチドを作成してもよい。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」とは、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドのグループを指すために最も広い意味で使用される。
非翻訳領域には、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含まれてもよい。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野で公知のＴＥＥを含み得る。
ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）システムを用いて転写され得る。ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は当該技術分野で公知であり、国際公開第ＷＯ／２０１４／１５２０２７号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡ転写産物を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で、増幅されていない直鎖化されたＤＮＡ鋳型を用いて生成される。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、呼吸器系ウイルスのｍＲＮＡの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ－１細胞に、プラスミドＤＮＡ鋳型を用いてトランスフェクションする。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞を、プラスミドＤＮＡを複製するために培養し、次いで単離及び精製する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、目的遺伝子の５’側に位置し、目的遺伝子に作用可能に連結されているＴ７プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）テールをコードする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写産物が生成されている場合、５’ＵＴＲはプロモーター配列を含んでもよい。このようなプロモーター配列は、当該技術分野で公知である。本開示のワクチンにはこのようなプロモーター配列が存在しないことを理解されたい。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない終止コドン（すなわち、翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のからすぐ下流（すなわち３’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続的なストレッチであり、ポリペプチドをコードする。
「ポリ（Ａ）テール」とは、複数の連続したアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ポリ（Ａ）テールは、（例えば、細胞質での）酵素分解からｍＲＮＡを保護し、転写終結、及び／または核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助するように機能する。
いくつかの実施形態では、核酸は２００～３０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。
ＮＴＰは、社内で製造されてもよく、供給業者から選択されてもよく、または本明細書に記載されるように合成されてもよい。ＮＴＰは、限定するものではないが、天然及び非天然（改変）ＮＴＰを含む、本明細書に記載されているものから選択されてもよい。
本開示の方法では、多数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを使用してもよい。ポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ及び／または変異型ポリメラーゼ、例えば、限定するものではないが、化学的に修飾された核酸及び／またはヌクレオチドを含む修飾された核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介しキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。
化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造してもよい。核酸の固相化学合成は、分子が固体支持体に固定化され、反応物溶液中で段階的に合成される自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。
液相化学合成。モノマービルディングブロックの連続添加による本開示の核酸の合成は、液相で実施され得る。
合成法の組み合わせ。上記で考察した合成方法には、それぞれ独自の利点及び制限がある。これらの方法を組み合わせて制限を克服する試みが行われてきた。このような組み合わせ方法もまた本開示の範囲内である。固相または液相の化学合成を酵素的ライゲーションと組み合わせて使用すると、化学合成だけでは得られない長鎖核酸が効率的に生成される。
核酸領域またはサブ領域のライゲーション
リガーゼによる核酸のアセンブリもまた使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を通じて、ポリヌクレオチド鎖の５’及び３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチドなどの核酸及び／または環状核酸は、１つ以上の領域またはサブ領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡフラグメントは、リガーゼ触媒反応によって結合され、さまざまな機能を有する組換えＤＮＡを作成し得る。一方は５’ホスホリル基を有し、もう一方は遊離３’ヒドロキシル基を有する、２つのオリゴデオキシヌクレオチドがＤＮＡリガーゼの基質として機能する。
精製
本明細書に記載の核酸の精製には、限定するものではないが、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得る。クリーンアップは、当該技術分野で公知の方法、例えば、限定するものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ｐｏｌｙ－Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などで実施され得る。「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合の「精製された」という用語は、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。「汚染物質、混入物」とは、別の物質を不適合、不純、または劣悪にする任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが自然界に見られるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
品質保証及び／または品質管理チェックは、限定するものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣなどの方法を使用して実施され得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、逆転写酵素－ＰＣＲを含むがこれに限定されない方法によって配列決定され得る。
定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑膜液、痰性体液、羊膜液、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群より選択される器官から回収され得る。
アッセイは、抗原特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組み合わせを使用して実行してもよく、一方、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学的方法を使用して単離され得る。エクソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノメンブレン限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによっても単離され得る。
これらの方法により、研究者は、残っているかまたは送達された核酸のレベルをリアルタイムでモニターする能力が得られる。本開示の核酸は、いくつかの実施形態では、構造的または化学的修飾に起因して内因性形態とは異なるので、これが可能である。
いくつかの実施形態では、核酸は、限定するものではないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸を分析して、核酸が適切なサイズであるか否かを決定し、核酸の分解が起こっていないことを確認してもよい。核酸の分解は、限定するものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認され得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には、イオン化可能なカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質構成要素を、目的の核酸カーゴと共に含む。本開示の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般的に公知である構成要素、組成物、及び方法（例えば、全てその全体が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照）を用いて生成され得る。
本開示のワクチンは、通常は、脂質ナノ粒子内に製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０ｍｏｌ％、２０～４０ｍｏｌ％、２０～３０ｍｏｌ％、３０～６０ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、４０～６０ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、または５０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１０～２０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１５～２５ｍｏｌ％、１５～２０ｍｏｌ％、または２０～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、または２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５～５５ｍｏｌ％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０ｍｏｌ％、２５～４５ｍｏｌ％、２５～４０ｍｏｌ％、２５～３５ｍｏｌ％、２５～３０ｍｏｌ％、３０～５５ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４５ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、３０～３５ｍｏｌ％、３５～５５ｍｏｌ％、３５～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％、３５～４０ｍｏｌ％、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４０～４５ｍｏｌ％、４５～５５ｍｏｌ％、４５～５０ｍｏｌ％、または５０～５５ｍｏｌ％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のステロールを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０ｍｏｌ％、０．５～５ｍｏｌ％、１～１５ｍｏｌ％、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、２～１５ｍｏｌ％、２～１０ｍｏｌ％、２～５ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％を含んでもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なカチオン性脂質は、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2023513073000002
 またはその塩もしくは異性体を有し、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－Ｙ－Ｒ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、
－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及び
Ｃ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるならば（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５の場合、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または、（ｉｉ）ｎが１もしくは２の場合、Ｑは５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない、化合物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ，－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有し、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノアルキルアミノもしくはジアルキルアミノ及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して 、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、
－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱはＣ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、及び各ｎが、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、及びＱが５～１４員の複素環であり、（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１または２である場合、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１である場合、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員の複素環式アルキルであり、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、
－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ，－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、
－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルから選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－Ｙ－Ｒ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱは－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊ が、独立して、Ｃ１～１２アルキル及びＣ１～１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、式中、Ｑ が－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ１－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＡ）：
Figure 2023513073000003
 の化合物、またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中、Ｉは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩ）：
Figure 2023513073000004
 の化合物またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中Ｉは、１、２、３、４、及び５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルであるか、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは、２、３、または４であり、かつＱは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；かつＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）：
Figure 2023513073000005
 またはその塩もしくは異性体が挙げられ、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩｄ）：
Figure 2023513073000006
 の化合物、またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中、ｎは、２、３、または４であり、かつｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群より選択され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能カチオン性脂質は、以下の構造
Figure 2023513073000007
 を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なカチオン性脂質は、以下の構造
Figure 2023513073000008
 を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なカチオン性脂質を含み、このとき、非カチオン性脂質はＤＳＰＣであり、構造脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＤＭＧ－ＰＥＧである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５モルパーセントのイオン化可能なカチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５モルパーセントのイオン化可能なカチオン性脂質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は５～１５モルパーセントのＤＳＰＣを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５モルパーセントのＤＳＰＣを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３５～４０モルパーセントのコレステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、３５、３６、３７、３８、３９、または４０モルパーセントのコレステロールを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～２モルパーセントのＤＭＧ－ＰＥＧを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１、１．５または２モルパーセントのＤＭＧ－ＰＥＧを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０モルパーセントのイオン化可能なカチオン性脂質と、１０モルパーセントのＤＳＰＣと、３８．５モルパーセントのコレステロールと、１．５モルパーセントのＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰが含むイオン化可能なカチオン性脂質構成要素、対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は約１０：１～約１００：１である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰが含むイオン化可能なカチオン性脂質構成要素、対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は約２０：１である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰが含むイオン化可能なカチオン性脂質構成要素、対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は約１０：１である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約５０ｎｍ～約１５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約７０ｎｍ～約１２０ｎｍである。
多価ワクチン
本明細書で提供する組成物は、同じまたは異なる種の２つ以上の抗原をコードするＲＮＡを含んでも、または複数のＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の呼吸器系ウイルス抗原をコードする１つのＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の呼吸器系ウイルス抗原をコードし得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするＲＮＡ、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質をコードするＲＮＡ、及びｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質抗原を含む。
いくつかの実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を、同じ脂質ナノ粒子内に製剤化してもよい。他の実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡが、別々の脂質ナノ粒子内に製剤化されてもよい（各ＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。脂質ナノ粒子は、次に、組み合わせて単一のワクチン組成物（例えば、複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含むワクチン組成物）として投与されてもよく、または別々に投与されてもよい。
併用ワクチン
本明細書で提供する組成物は、同じまたは異なるウイルス株の２つ以上の抗原をコードする１つのＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含んでもよい。１つ以上のｈＲＳＶ抗原（複数可）及び異なる生物（例えば、ｈＭＰＶ及び／またはｈＰＩＶ３）の１つ以上の抗原（複数可）をコードするＲＮＡを含む併用ワクチンも本明細書で提供される。したがって、本開示のワクチンは、同じ株／種の１つ以上の抗原、または異なる株／種の１つ以上の抗原、例えば、呼吸器系ウイルス感染のリスクが高い同じ地理的地域に見られる生物体、または呼吸器系ウイルスに曝露されたときに個人が曝露される可能性が高い生物体に対する免疫を誘導する抗原、を標的とする併用ワクチンであり得る。
医薬製剤
本明細書では、例えば、ヒト及び他の哺乳動物における呼吸器系ウイルスの予防及び／または処置のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬を提供する。本明細書で提供される組成物は、治療剤または予防剤として使用され得る。これらは、呼吸器系ウイルス感染を予防及び／または処置するための医薬で使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡを含む呼吸器系ウイルスワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与してもよく、ＲＮＡポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて抗原ポリペプチド（抗原）が産生される。
組成物（例えば、ＲＮＡを含む）の「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞タイプ、投与手段、ＲＮＡの物理的特性（例えば、長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾ヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、ならびに他の決定因子、例えば、対象の年齢、体重、身長、性別、及び全体的健康状態に基づく。典型的には、組成物の有効量は、対象の細胞内での抗原産生の関数として、誘導または追加免疫された免疫応答を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物の有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含む組成物よりも効率的である。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクションの増大（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増大によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。
「医薬組成物」という用語は、活性薬剤と、組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または治療用途に特に適したものにする不活性または活性の担体との組合せを指す。「医薬的に許容される担体」は、対象に投与した後でもまたは投与した際にも、望ましくない生理学的作用を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、有効成分に適合性であり、それを安定化させることが可能であるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を活性薬剤の送達のための医薬担体として利用してもよい。医薬的に許容される担体の例としては、限定されるものではないが、剤形として使用可能な組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤が挙げられる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の好適な医薬用担体及び希釈剤、ならびにそれらを使用するための医薬的必需品については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示に従う組成物（ポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチドを含む）は、呼吸器系ウイルス感染症の処置または予防のために使用され得る。ある組成物は、健康な個体または潜伏期間中の感染初期または症状発現後の活動性感染中に、積極的な免疫化スキームの一環として予防的に投与されても、または治療的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
組成物は、他の予防または治療化合物と共に投与され得てもよい。非限定的な例として、予防または治療化合物は、アジュバントであっても、または追加免疫（ブースター）であってもよい。本明細書で使用する場合、予防組成物（例えば、ワクチン）に言及する場合、「追加免疫（ブースター）」という用語は、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。追加免疫（ブースター）（またはブースターワクチン）は、予防組成物を先に投与した後に投与されてもよい。予防組成物の最初の投与と追加免疫との間の投与時間は、限定するものではないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分 ３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年超であってもよい。例示的な実施形態では、予防的組成物の最初の投与と追加免疫との間の投与時間は、限定するものではないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年であってもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、当該技術分野で公知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、経鼻、または皮内に投与され得る。
組成物は、感染の有病率または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な設定で利用され得る。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、様々な感染性疾患を治療及び／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、市販のワクチンよりもはるかに大きな抗体力価、より良好な中和免疫をもたらし、より持続性のある免疫応答を生じるか、及び／またはより早期の応答をもたらすという点において優れた特性を有する。
本明細書で提供されるのは、ＲＮＡ及び／または任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む医薬組成物である。
ＲＮＡは、単独で、または１つ以上の他の構成要素と組み合わせて、製剤化されても、または投与されてもよい。例えば、免疫化組成物は、限定するものではないが、アジュバントを含む他の構成要素を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物はアジュバントを含まない（アジュバントフリーである）。
ＲＮＡは、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化されてもまたは投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組み合わせなどの少なくとも１つの追加の活性物質を含む。ワクチン組成物は、無菌、パイロジェンフリーであっても、または無菌かつパイロジェンフリーの両方であってもよい。医薬薬剤、例えば、ワクチン組成物の製剤化及び／または製造における全般的考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照によりその全体が本明細書に援用される）に見出され得る。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、ヒト、ヒトの患者または対象に投与される。本開示の目的において、「有効成分」という表現は、概して、ＲＮＡワクチンまたはそれに含まれるポリヌクレオチド、例えば、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって、調製され得る。概して、このような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を、賦形剤及び／または１つ以上の補助成分と会合させるステップと、次いで必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単回または多回用量単位に分割、成形、及び／またはパッケージングするステップとを含む。
本開示に従う医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、またさらにはその組成物が投与される経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、（１）安定性を高めるために、（２）細胞トランスフェクションを増大するために、（３）（例えば、デポ剤からの）持続放出または遅延放出を可能にするために、（４）体内分布を変化させる（例えば、特定の組織もしくは細胞タイプに標的化する）ために、（５）コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳を増大するために、及び／または（６）ｉｎ ｖｉｖｏでのコードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルを変化させるために、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化される。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
投薬／投与
本明細書では、ヒト及び他の哺乳類における呼吸器系ウイルス感染症の予防及び／または治療のための免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）、方法、キット、及び試薬を提供する。免疫化組成物は、治療剤または予防薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、呼吸器系ウイルス感染からの予防的保護を提供するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、呼吸器系ウイルス感染を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、免疫エフェクター細胞のプライミングで、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をｅｘ ｖｉｖｏで活性化し、次にこれを対象に注入（再注入）するために、使用される。
対象は、任意の哺乳類（非ヒト霊長類及びヒトを含む）であってもよい。典型的には、対象とはヒト対象である。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、抗原特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与される。呼吸器系ウイルス抗原をコードするＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで発現及び翻訳されて抗原が産生され、次にこれが対象における免疫応答を刺激する。
呼吸器系ウイルスからの予防的保護は、本開示の免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の投与後に達成され得る。免疫化組成物は１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与されてもよいが、ワクチンを１回投与するだけで十分な場合がある（任意選択で１回の追加免疫が続く）。望ましいものではないが、感染した個体にある免疫化組成物を投与して治療応答を達成することも可能である。用量設定を適宜調整する必要がある場合がある。
呼吸器系ウイルス抗原（または多重抗原）に対する対象における免疫応答を誘発する方法を、本開示の態様で提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、呼吸器系ウイルス抗原（例えば、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質、ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質、及び／またはｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む免疫化組成物を対象に投与することを含み、それにより、対象において呼吸器系ウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導し、対象内の抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、その抗原に対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象における抗－抗原抗体力価よりも増大される。「抗－抗原抗体」とは、抗原に特異的に結合する血清抗体である。
予防有効用量とは、臨床的に許容されるレベルでウイルス感染を予防する有効用量である。いくつかの実施形態では、有効用量とは、ワクチンの添付文書に列記されている用量である。本明細書で使用する場合、従来のワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、限定されるものではないが、微生物生ワクチン、微生物不活化ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどが挙げられる。例示的な実施形態では、従来のワクチンは、国の薬物規制機関（例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ））によって規制上の承認を達成し、及び／または登録されているワクチンである。
いくつかの実施形態では、対象内の抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、呼吸器系ウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象、またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価よりも１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増大している。いくつかの実施形態では、対象における抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、呼吸器系ウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価よりも１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増大している。
対象における呼吸器系ウイルスに対する免疫応答を誘発する方法は、本開示の他の態様で提供される。本方法は、呼吸器系ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を対象に投与することを含み、それにより、対象において呼吸器系ウイルスに特異的な免疫応答を誘導し、この対象での免疫応答は、この免疫化組成物に対し２倍～１００倍の薬用量レベルで、呼吸器系ウイルスに対する従来のワクチンを接種した対象での免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物に対し２倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物に対し３倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物に対し４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物に対し１０倍～１０００倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物に対し１００倍～１０００倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。
他の実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。他の実施形態では、免疫化された対象由来の血清または抗体の能力を、ウイルス取込みを中和する能力またはヒトＢリンパ球の呼吸器系ウイルス形質転換を低減する能力に対して試験する。他の実施形態では、ロバストなＴ細胞応答（複数可）を促進する能力は、当該技術分野で認識されている技法を用いて測定される。
本開示の他の態様は、呼吸器系ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含む免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を対象に投与して、対象において呼吸器系ウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導することにより、対象において呼吸器系ウイルスに対する免疫応答を引き出す方法を提供し、この対象における免疫応答は、呼吸器系ウイルスに対する従来のワクチンの予防有効量を接種した対象において誘導される免疫応答よりも２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の免疫化組成物に対し２倍～１００倍の薬用量レベルで従来のワクチンの予防有効用量を接種した対象において誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来のワクチンの予防有効用量でワクチン接種した対象において誘導される免疫応答よりも２日、３日、１週間、２週間、３週間、５週間、または１０週間早く誘導される。
また、本明細書では、第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを対象に投与することにより、呼吸器系ウイルスに対する対象における免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡが安定化エレメントを含まず、アジュバントがワクチンと同時製剤化または同時投与されない、方法を提供する。
免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路で投与され得る。このような経路としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／または皮下の投与が挙げられる。本開示は、ＲＮＡワクチンを投与することを、それを必要とする対象に行うことを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び概況、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なる。ＲＮＡは、典型的には、投与しやすさ及び薬用量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。ただし、ＲＮＡの１日合計使用量は妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されよう。いかなる特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切なイメージング用量レベルも、治療する障害、障害の重症度、用いる具体的化合物の活性、用いる具体的組成物、患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別、及び食事、用いる具体的化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率、治療の期間、用いる具体的化合物と組み合わせでまたは同時に使用する薬物、ならびに医学分野で周知されている類似の因子を含めた様々な因子に依存する。
本明細書で提供されるように、ＲＮＡの有効量は、例えば、単回投与または２回の１０μｇ投与として投与される、２０μｇ程度の低さであり得る。いくつかの実施形態では、有効量は、２０μｇ～３００μｇまたは２５μｇ～３００μｇの総用量である。例えば、有効量は、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、または３００μｇの総投与量であってもよい。いくつかの実施形態では、有効量は、２５μｇ～３００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、７５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３００μｇの総用量である。
本明細書に記載のＲＮＡは、本明細書に記載の剤形、例えば、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）の剤形で製剤化され得る。
ワクチン有効性
本開示のいくつかの態様は、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の製剤であって、ＲＮＡが、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、呼吸器系ウイルス抗原に特異的な抗体の産生）をもたらすのに有効な量で製剤化される、製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なＲＮＡの用量である。また、本明細書では、対象内の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も提供する。
本明細書で使用する場合、本開示のワクチンまたはＬＮＰに対する免疫応答とは、ワクチン中に存在する（１つ以上の）呼吸器系ウイルスタンパク質（複数可）に対する対象における液性及び／または細胞性免疫応答の発生である。本開示の目的において、「液性」免疫応答とは、抗体分子（例えば、分泌（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を含む）によって媒介される免疫応答を指し、一方、「細胞性」免疫応答とは、Ｔ－リンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパー及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）及び／または他の白血球）によって媒介される免疫応答を指す。細胞性免疫における１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたタンパク質と共に提示され細胞表面に発現するペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子と共にその表面に提示した細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせる一助となるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化Ｔ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞由来のものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のこのような分子の産生も引き起こす。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供する免疫化組成物を投与された対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価を測定することにより、特性評価される。抗体力価とは、対象内にある抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質）または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態では、抗体力価は、対象が感染症に罹ったか否かを評価するため、または免疫化が必要か否かを判断するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体力価は、自己免疫応答の強さを定量するため、追加免疫が必要か否かを判断するため、以前のワクチンが有効だった否かを判断するため、及び最近または過去の感染を確認するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）によって対象において誘導された免疫応答の強さを定量するために使用してもよい。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、または少なくとも３ｌｏｇ増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１、１．５、２、２．５、または３ｌｏｇ増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１～３ｌｏｇ増大される。例えば、対象に産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２～１０倍増大される。例えば、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０倍増大され得る。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、ｈＲＳＶ、ｈＭＰＶ、及び／またはｈＰＩＶ３に対する血清中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）の比（幾何平均比（ＧＭＲ）と称される）として測定される。幾何平均力価（ＧＭＴ）とは、全ての値を掛け合わせ、その数値のｎ乗根（ｎは利用可能なデータを有する対象数である）をとることによって算出される、対象の群における平均抗体力価である。
いくつかの実施形態では対照は、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を投与されていない対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、通常、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたか、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）が有効となる能力は、マウスモデルで測定される。例えば、免疫化組成物を、マウスモデルに投与してもよく、マウスモデルを中和抗体力価の誘導について評価してもよい。また、ウイルスチャレンジ研究も、本開示のワクチンの効果を評価するために使用してもよい。例えば、免疫化組成物をマウスモデルに投与し、そのマウスモデルをウイルスでチャレンジし、そのマウスモデルを生存及び／または免疫応答（例えば、中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン応答））について評価してもよい。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効量は、組換えタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して低減された用量である。本明細書で使用する「標準治療」とは、医学的または心理学的な治療ガイドラインを指し、一般的であっても、特定的であってもよい。「標準治療」とは、科学的根拠に基づいた適切な治療及び所与の条件の治療に関与する医療従事者間の協力を規定する。それは、医師／臨床医がある特定のタイプの患者、疾患、及び臨床状況に対し従うべき診断及び治療のプロセスである。本明細書で使用する「標準治療用量」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、呼吸器系ウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するための標準治療ガイドラインに従いながら、呼吸器系ウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するために対象に投与する、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または弱毒生もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの用量を指す。
いくつかの実施形態では、有効量の免疫化組成物を投与された対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または弱毒生もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与された対照の対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価と同等である。
ワクチン有効性は、標準的な解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照）。例えば、ワクチン有効性は、二重盲検ランダム化対照臨床試験で測定することができる。ワクチン有効性は、ワクチン非接種試験コホートの罹患率（ＡＲＵ）とワクチン接種試験コホートの罹患率（ＡＲＶ）との間の疾患罹患率（ＡＲ）の比例的減少として表してもよく、以下の式を用いてワクチン接種群の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出することができる。
有効性＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００；及び
有効性＝（１－ＲＲ）×１００。
同様に、ワクチン有効性は標準的解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照）。ワクチンの有効性とは、ワクチン（高いワクチン効果を有することが既に判明している場合もある）が集団の中でどのように疾患を低減するかを評価するものである。この尺度は、対照臨床試験ではなく自然のフィールド条件下で、ワクチン自体にとどまらず、ワクチン接種プログラムの利益及び有害作用の本質的なバランスを評価し得る。ワクチン有効性はワクチンの有効性（効力）に比例するが、集団内の標的群がどの程度免疫化しているか、及び「実世界」の転帰に影響を及ぼすワクチンとは無関係な要因（例えば、入院、外来受診、または費用）による影響も受ける。例えば、レトロスペクティブなケースコントロール解析を使用して、感染症例のセット及び適切な対照におけるワクチン接種率を比較してもよい。ワクチン有効性は、ワクチン接種したにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）の使用により、割合の差として表すことができる。
有効性＝（１－ＯＲ）×１００。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６０％である。例えば、免疫化組成物の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であり得る。
殺菌免疫。殺菌免疫とは、宿主への有効な病原体感染を防止する固有の免疫状態を指す。いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、少なくとも１年間、対象における殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、本開示の免疫化組成物の有効量は、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間、対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、対照よりも少なくとも５倍低い用量で対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、有効量は、対照よりも少なくとも１０倍、１５倍、または２０倍低い用量でも対象における殺菌免疫をもたらすのに十分であり得る。
検出可能な抗原。いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、検出可能なレベルの呼吸器系ウイルス抗原を産生するのに十分である。
力価。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗呼吸器系ウイルス抗原）に特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫化組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、呼吸器系ウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、呼吸器系ウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、呼吸器系ウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００ＮＴ５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＴ５０であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＴ５０である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００中和単位／ミリリットル（ＮＵ／ｍＬ）である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗呼吸器系ウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。
いくつかの実施形態では、ｎ個の数の積のｎ乗根である幾何平均を、比例増殖を説明するために一般的に使用する。幾何平均は、いくつかの実施形態では、対象において産生される抗体力価を特性評価するために使用される。
対照とは、例えば、ワクチン接種されていない対象、または弱毒化生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、またはタンパク質サブユニットワクチンを投与された対象であってもよい。
実施例
野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に対する様々な特徴（修飾など）の影響を調べた。図１は、Ｆタンパク質をコードする野生型ｍＲＮＡと本明細書に記載のＲＳＶ Ｆバリアントとの間の違いを示す概略図である。ＲＳＶ Ｆバリアントは、細胞質テールの欠如に加えて、プロトマー間ジスルフィド安定化変異及び空洞充填変異を含む、コドン最適化された膜アンカー型の単鎖ｍＲＮＡである。
実施例１－ｍＲＮＡスクリーニング：独立した特徴
細胞上のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の融合前の形態の増大は、動物において免疫原性を増大させることがわかっている。本実施例では、異なる特徴（例えば、異なるコドン最適化戦略、変異、特定の修飾、構造変化）、及び結果として生じる発現レベルへの影響を試験するために、様々なｍＲＮＡを設計した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、様々な濃度の異なるｍＲＮＡでトランスフェクトした。細胞表面の融合前ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質は、融合前ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に特異的な抗体（ＡＭ１４）を使用したフローサイトメトリーによって２４時間及び４８時間後に検出された。図２Ａに示される結果は、試験された２つの特徴、コドン最適化及び細胞質テール短縮（「ｄＣＴ」）が、細胞表面融合前ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の最大の増加をもたらしたことを実証している。例えば、４８時間の群では、２つの特徴は２０ｎｇの濃度で対照（２つの特徴を含まないＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の１５～３１倍の増大を示した。この結果は、５ｎｇという低い濃度でも見られた（図２Ｂ）。
次に、コドン最適化されたｍＲＮＡ及び細胞質テール短縮ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングした。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝８）に、脂質ナノ粒子（例えば、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質；５～２５％の非カチオン性脂質；２５～５５％のステロール；及び２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質）中に製剤化された候補ｍＲＮＡを筋肉内（ＩＭ）投与した。ｍＲＮＡは、３週間間隔で投与し、各投与後に血清を収集した。Ｆ糖タンパク質に対する血清抗体価を、ＥＬＩＳＡで測定した。２回の投与（投与２後、「ＰＤ２」）に続いて、融合後のＦ特異的ＩｇＧ力価を測定した。コドン最適化されたｍＲＮＡ及び細胞質テール短縮ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡは、それぞれ、対照（２つの特徴を含まないＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の２～３倍及び２～４倍高い力価を示した（図３Ａ）。
ＲＳＶ中和力価も、マイクロ中和アッセイを使用して２回目の投与（ＰＤ２）後に測定した。個々のマウス血清は、以下の手順を使用してＲＳＶ－Ａ（Ｌｏｎｇ株）の中和について評価した。
１．全ての血清試料は、５６℃に設定されたドライバスインキュベーターに３０分間置くことにより、熱で不活性化した。次に、試料及び対照血清をウイルス希釈液（ＥＭＥＭ中の２％ＦＢＳ）で１：３に希釈し、試料を二重でアッセイプレートに添加して段階希釈した。
２．ＲＳＶ－Ｌｏｎｇのストックウイルスを冷凍庫から取り出し、３７℃の水浴ですばやく解凍した。ウイルスはウイルス希釈液で２０００ｐｆｕ／ｍＬに希釈した。
３．１列の細胞を除いて、希釈したウイルスを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。
４．ＨＥｐ－２細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ウイルス希釈液に１．５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁し、１００ｍＬの懸濁細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
５．７２時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに溶解した８０％アセトンを使用して、１６～２４℃で１０～２０分間固定した。固定液を取り除き、プレートを風乾させた。
６．次に、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで完全に洗浄した。検出モノクローナル抗体、１４３－Ｆ３－１Ｂ８及び３４Ｃ９を、２．５に希釈し、次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％で完全に洗浄し、次いで５０プレートをＰＢＳ＋０．を用いて９６ウェルプレートのウェルにおいて完全に洗浄した。次にプレートを１６～２４℃の加湿チャンバー内でロッカー上で６０～７５分間インキュベートした。
７．インキュベーション後、プレートを完全に洗浄した。
８．ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧを、アッセイ希釈液で１：２００に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを上記のようにインキュベートし、洗浄した。
９．ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン（１：１０００最終希釈）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ ７００（１：１０００希釈）、及び５ｍＭ ＤＲＡＱ５溶液（１：１０，０００希釈）のカクテルを、アッセイ希釈液で調製し、５０ｍＬのカクテルを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを上記のように暗所でインキュベートし、洗浄し、風乾させた。
１０．次に、Ａｅｒｉｕｓ Ｉｍａｇｅｒを使用してプレートを読み取った。次に、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍの４パラメーターカーブフィットを使用して血清中和力価を計算した。
２投与後（ＰＤ２）に測定されたマウス免疫原性研究の血清中和抗体力価を図３Ｂに示す。コドン最適化ｍＲＮＡ及び細胞質テール短縮を有するＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡは、対照の１～３倍及び２～４０倍の力価レベルを有し、中和抗体力価がロバストであることを示している。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、２つのｍＲＮＡがＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の発現及びＲＳＶ－Ａ中和力価を増大し得ることができることが見出された。
実施例２－ｍＲＮＡスクリーニング：２つの特徴
コドン最適化及び細胞質テール短縮の両方がＲＳＶ Ｆタンパク質の発現及び結果として生じる免疫原性を改善することが示されたので、同じｍＲＮＡにおける両方の特徴の組み合わせを試験した（「ＲＳＶ Ｆバリアント」）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、試験した特徴の異なる組み合わせを有する２０ｎｇまたは２００ｎｇのｍＲＮＡをトランスフェクトした。各特徴を個別に含むｍＲＮＡもスクリーニングした。細胞表面の融合前ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質は、融合前ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に特異的な抗体（ＡＭ１４）を使用したフローサイトメトリーによって２４時間及び４８時間後に検出された。コドン最適化と細胞質テール短縮の組み合わせにより、対照（２つの特徴を含まないＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）と比較してＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の発現レベルが５～５０倍高くなることが判明した。他の特徴では、単独で、または互いに組み合わせて、この選択した組み合わせが生成したレベルまでＲＳＶ Ｆ糖タンパク質を生成するものはなかった（データは示していない）。
使用した対照のＲＳＶ Ｆによりコードされるタンパク質は以下の通り：Ｃｔｒｌ１は野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較してＦ１領域に４つのアミノ酸変異を含み（図１）、アミノ酸１０３と１４５の間の欠失を含まない。その結果、Ｃｔｒｌ１には野生型のフーリン切断部位が含まれ、細胞質ドメインを保持する。別の制御バリアントであるＣｔｒｌ２は、図１に示すＲＳＶ Ｆバリアントから派生しているが、Ｃ末端の欠失もその他のＲＮＡの最適化及び拡張も含まれていない。
次に、ＲＳＶ Ｆバリアントをさらにスクリーニングした。ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現は、５００ｎｇのｍＲＮＡ ＲＳＶ Ｆバリアント、対照ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡなし（陰性対照）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で測定した。次に、２４、４８、及び７２時間後、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のレベルをフローサイトメトリーで測定した。以下の３つの異なる抗体を使用してＲＳＶ Ｆ糖タンパク質を測定した：ＡＭ１４及びＤ２５（ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の融合前型に特異的な抗体）及びＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）／モタビズマブ（ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の融合前及び融合後型に共通のエピトープを指向）。図４Ａによって、ＲＳＶ Ｆバリアントが、融合前高次構造で正しく折りたたまれたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をもたらし、また、対照と比較してより高くより長い発現レベルをもたらしたことが示されている。さらに、図５Ａ及び５Ｂは、発現傾向がＨＥＫ２９３Ｔ細胞に限定されず、ＴＨＰ－１細胞（ヒト単球株）で実施された場合に維持されることを示している。
さらなる実験では、フローサイトメトリーによって測定した、２００ｎｇのｍＲＮＡ（ＲＳＶ Ｆバリアント、細胞質テールが短縮されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡ、Ｃｔｒｌ１及びＣｔｒｌ２ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡなし）でのトランスフェクションの４８時間後における、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を比較した。ＲＳＶ Ｆバリアントは、コドン最適化ｍＲＮＡ及び細胞質テール短縮を有するＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするｍＲＮＡと比較して、少なくとも相加的である発現レベルを示した（図４Ｂ）。
ヒト末梢血単核細胞（ｈｕＰＢＭＣ）におけるＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を調べた。ＨｕＰＢＭＣは、１×１０６細胞／ウェルの濃度で１２ウェルプレートにプレートした。次に、１０００ｎｇのｍＲＮＡ（ＲＳＶ Ｆバリアントまたは２つの特徴を含まないＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡのいずれか）をウェルに添加し、プレートを２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＡＭ１４－ＦＩＴＣ（ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前形態を標的とする）、Ｄ２５－ＰＥ（ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前形態を標的とする）、またはモタズビマブ－ＡＰＣ（ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前及び融合後の形態に共通のエピトープを標的とする）で染色した。使用した抗体に関係なく、２４時間の時点及び４８時間の時点の両方で、対照ｍＲＮＡ及びトランスフェクトされなかった細胞に関して、より高いレベルのＲＳＶ Ｆタンパク質が観察された（図７）。
ヒト肝細胞腫ＨｅＰ３Ｂ（ＨｅＰ３Ｂ）細胞におけるバリアントＲＳＶ Ｆ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を調べた。ＨｅＰ３Ｂ細胞を、２４ウェルプレートにプレートし、５００ｎｇ、１００ｎｇ、または２０ｎｇのｍＲＮＡをトランスフェクトした。プレートを２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前の形態を標的として、細胞をＡＭ１４－ＦＩＴＣで染色した。ＲＳＶ Ｆバリアント（コドン最適化及び細胞質テール短縮）とのインキュベーション後、個々の特徴を有するｍＲＮＡ（例えば、コドン最適化ｍＲＮＡ及び細胞質テールが短縮されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）に関して、より高いレベルのＲＳＶ Ｆタンパク質が観察された。対照ｍＲＮＡ（２つの特徴を含まないＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）、及びトランスフェクトされなかった細胞（「ｍＲＮＡなし」）は、特に４８時間及び試験した最低用量でＲＳＶ Ｆバリアントよりも低い発現レベルを示した（図８）。顕微鏡実験では、ＨｅＬａ細胞で発現傾向が一貫していることが判明した。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートにプレートして、２００ｎｇのｍＲＮＡ（ＲＳＶ Ｆバリアント、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡ、細胞質テールが短縮されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ、２つの特徴を含まない対照ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡを含まない（陰性対照として））をトランスフェクトした。そのプレートを２４時間または４８時間インキュベートした後、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで１５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、プレートの半分を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで５分間透過処理し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックした。次に、一次抗体である抗ＲＳＶ抗体（Ｄ２５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏ）（１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：１００に希釈）を１時間適用した後、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、プレートを１％ＢＳＡで１０分間ブロックした。二次抗体を３０分間適用し（ＢＳＡ／ＰＢＳで１：２０００に希釈）、次にプレートをＰＢＳで２回洗浄した。次に、ＮｕｃＢｌｕｅ Ｆｉｘｅｄ及びＣｅｌｌＭａｓｋ Ｒｅｄを、３０分間適用した後、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、得られたプレートを、ＡＬＥＸＡ４８８（商標）を使用してタンパク質発現について測定した。細胞質セグメンテーションに基づいて、１細胞あたりの平均蛍光強度を測定した。図９に示すように、ＲＳＶ Ｆバリアント（細胞質テール短縮を伴うＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡ）は、最も高いレベルのＲＳＶ Ｆタンパク質を産生した。対照とＲＳＶ Ｆバリアントとの間の差は約２倍であることが判明した。
実施例３－ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性研究（マウス）
次に、ＲＳＶ Ｆバリアント（細胞質テール短縮を伴うＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡ）をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝８）を、脂質ナノ粒子（例えば、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質；５～２５％の非カチオン性脂質；２５～５５％のステロール；及び２０～６０％のイオン化カチオン性脂質）中に製剤化したＲＳＶ Ｆバリアントまたは対照ｍＲＮＡの筋肉内（ＩＭ）投与により免疫した。ｍＲＮＡは３週間間隔で投与し、各免疫後に血清を収集した。Ｆ糖タンパク質に対する血清抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。１回目と２回目の投与に続いて、融合後のＦ特異的ＩｇＧ力価を測定した。ＲＳＶ Ｆバリアントは、低用量（２００ｎｇ）で、対照（ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードする代替ｍＲＮＡ）の少なくとも３～５倍の力価を有していた（図６Ａ及び６Ｂ）。
ＨＲＳＶ－Ａ Ｖｉｒｏｓｐｏｔアッセイを実施して、血清試料中のＨＲＳＶ特異的中和抗体を検出した。簡単に説明すると、５６℃で３０分間インキュベートすることにより、試料を不活性化した。続いて、試料の連続的な２倍希釈を、感染培地で１：８の希釈（１：１６の試験での最初の血清希釈）から始めて、９６ウェルプレートで３回繰り返して行った。次に、試料希釈液を一定量のＨＲＳＶ－Ａとともに３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウイルスと抗体の混合物を、ＨＥｐ－２細胞培養単層とともにプレートに移した。３７℃で１日間のインキュベーション期間の後、単層を固定して染色した。培養上清を除去し、単層をＰＢＳで１回洗浄した後、５０％／５０％のメタノール／エタノールで固定した。固定後、ＨＲＳＶ－Ａに対するマウスモノクローナル抗体、二次ＨＲＰ標識抗マウス抗体、及びＴｒｕｅＢｌｕｅを使用してプレートを染色した。ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）アナライザーを使用して染色プレートをスキャンし、Ｚｉｅｌｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ（Ｚｉｅｌｉｎｓｋａ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００５；２（８４）：１－５）によって記述された式を使用して５０％プラーク減少力価を計算した：
Ｘ＝（ａ－ｂ）（ｅ－ｃ）／（ｃ－ｄ）＋ａ
ここで：Ｘ＝中和結果
ａ＝５０％減少ポイントを超える希釈のｌｏｇ１０
ｂ＝５０％減少ポイントを下回る希釈のｌｏｇ１０
ｃ＝５０％減少ポイントを超える平均ＳＣ（ａに対応）
ｄ＝５０％減少ポイントを下回る平均ＳＣ（ｂに対応）
ｅ＝平均ウイルス対照数の５０％減少の値。
実施例４－ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性研究（ラット）
次に、ＲＳＶ Ｆバリアント（細胞質テール短縮を伴うＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡ）をコットンラットでｉｎ ｖｉｖｏで評価した。この研究は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）コットンラットモデルにおけるｍＲＮＡワクチンの免疫原性、有効性、及び安全性を評価することを目的としており、チャレンジ後に検出可能なウイルス複製を可能にする次善の中和抗体力価を誘発するものを含む、ある範囲の用量レベルにまたがるワクチン増強呼吸器疾患（ＥＲＤ）に対する可能性の評価を含む。
ＲＳＶ Ｆバリアントまたは対照ｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子（例えば、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化カチオン性脂質）中に製剤化した。脂質ナノ粒子の成分は、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（化合物１）；１，２－ジミリストイル－ｒａｃｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；及びコレステロールを含んだ。
雌のコットンラット（６～８週齢）を１０匹の動物の１４の群、及び４匹の動物の対照群に分けた。ラットは、以下の表２に示すスケジュールに従って免疫した。群１～１３は、動物１匹あたり１００μＬ用量のｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物で筋肉内免疫した；群１４は、動物１匹あたり１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）で１００μＬ用量のＲＳＶ／Ａ２を鼻腔内に感染させた。表２に示すように、一部の群は２回免疫し（０日目と２８日目）、他の群は０日目でのみ免疫した。５６日目に、マウスに０．１ｍＬの５．０ｌｏｇ１０ＲＳＶ／Ａ２の鼻腔内投与でチャレンジした。６１日目に、動物を屠殺し、ウイルス滴定測定のために鼻組織を採取し、肺をまとめて採取して３分割した。左側のセクションはウイルス滴定用、舌側葉は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析用、右側のセクションは膨らませて増強ＲＳＶ疾患（ＥＲＤ）と好酸球増加症の組織病理検査に使用した。
Figure 2023513073000009
分析のために、ＲＳＶ／Ａ２の肺及び鼻のウイルス滴定を行った。肺及び鼻のホモジネートを遠心分離によって清澄化し、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で希釈した。コンフルエントなＨｅｐ－２細胞単層を、２４ウェルプレート中で希釈ホモジネートで２回感染させた。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに０．７５％メチルセルロース培地をかぶせた。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを取り除き、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで１時間固定した後、すすぎ、風乾した。プラークを数え、ウイルス力価を組織１グラムあたりのプラーク形成単位として表した。ウイルス力価は、群内の全ての動物の幾何学的平均＋標準誤差として計算された。
ＨＲＳＶ－Ａ Ｖｉｒｏｓｐｏｔアッセイを実行して、実施例３に記載されているように、血清試料中のＨＲＳＶ特異的中和抗体を検出した。
動物の血清中に存在する抗体価を決定するために、ＲＳＶ－Ｆ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレートを１ｕｇ／ｍＬの融合前ＲＳＶ－Ｆタンパク質でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で４回洗浄し、３７℃で２時間ブロックした（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ－Ｐｉｅｒｃｅ＃３７５１５）。洗浄後、コットンラット血清の段階希釈液を添加した（アッセイ希釈液はＰＢＳ＋５％ヤギ血清）。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、ＨＲＰ結合ニワトリ抗コットンラットＩｇＧ（ＩＣＬ＃ＣＣＯＴ－２５Ｐ）をアッセイ希釈液で１：１０，０００に希釈して添加した。プレートを、３７℃で１時間インキュベートした後、洗浄した。結合した抗体は、ＴＭＢ基質（ＳｅｒａＣａｒｅ＃５１２０－００７７）で検出された。ＴＭＢ停止液（ＳｅｒａＣａｒｅ＃５１５０－００２１）を添加して反応を停止し、ＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定した。力価は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの４パラメーターロジスティックカーブフィットを使用して決定し、約ＯＤ４５０ｎｍ＝１．０での希釈逆数として定義した。
ＲＳＶ抗体力価を、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。ＲＳＶ Ｆバリアント（コドン最適化及び短縮された細胞質テール）は、用量依存性ＲＳＶ中和抗体（図１０Ａ）及びＲＳＶ融合前Ｆタンパク質特異的ＩｇＧ結合抗体（図１０Ｂ）を誘導することが見出された。さらに、チャレンジ後の肺（図１１Ａ）及び鼻（図１１Ｂ）のウイルス量によって、ＲＳＶ Ｆバリアントがコットンラットをチャレンジから保護したことが示された（特に、初回投与及び追加免疫投与でのより高い用量）。
配列表
野性型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質
ＭＥＬＬＩＨＲＳＳＡＩＦＬＴＬＡＩＮＴＬＹＬＴＳＳＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＦＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＩＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＨＮＶＮＴＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＫ （配列番号１）
本明細書に記載の任意のｍＲＮＡ配列が５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることを理解されたい。ＵＴＲ配列は、以下の配列から選択してもよいが、その他の既知のＵＴＲ配列を使用してもよい。また、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡはさらに、ポリＡテール及び／またはキャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含んでもよいことも理解のこと。さらに、本明細書に記載の多数のｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列がシグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されたシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが、異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグに置換されても、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグが省略されてもよいことを理解されたい。
本明細書に記載のｍＲＮＡ配列のいずれかが、完全にまたは部分的に化学的に修飾されてもよい（例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンによって）ことがさらに理解されるべきである。以下の表１では、配列番号は、非修飾／Ｎ１－メチルシュードウリジンによって完全に修飾されたものとして示されている。
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号２；Ｎ１－メチルシュードウリジンで完全に修飾、配列番号３３）
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号３；Ｎ１－メチルシュードウリジンで完全に修飾、配列番号４０）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣ ＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号４；Ｎ１－メチルシュードウリジンで完全に修飾、配列番号３５）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣ ＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号５；Ｎ１－メチルシュードウリジンで完全に修飾、配列番号４１）
Figure 2023513073000010
Figure 2023513073000011
Figure 2023513073000012
Figure 2023513073000013
等価物
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用されている主題に関し、参照によって本明細書に援用され、場合によってはそれが文書全体を包含することもある。
本明細書において、明細書中及び請求項中の「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解すべきである。また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されるとは限らない。
請求項及び上記明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「保有する」「有する」「含有する」「伴う」「保持する」「から構成される」などは非制限的であること、すなわち後に続くものを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。「～からなる」「～から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれ制限的または半制限的な移行句であるものとする。
数値の前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が示される場合、範囲の上端と下端とを含むそれらの間の各値は、本明細書において具体的に企図され記載されている。
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３４８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３３２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８２９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１９、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (101)

  1. 細胞質テールを欠き、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と少なくとも９０％の同一性を有するｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む組成物。
  2. 前記細胞質テールが、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントのＣ末端２０～３０、２０～２５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、５～３０、５～２５、５～２０、または５～１５アミノ酸を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記細胞質テールが、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントのＣ末端の２５アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸、または１０アミノ酸を含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記細胞質テールが、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの以下のＣ末端アミノ酸：
    ＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２５）；ＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２６）；ＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２７）；またはＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２８）
    を備える、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾：Ｐ１０２Ｘ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｘ置換、Ｓ１５５Ｘ置換、Ｓ１９０Ｘ置換、Ｖ２０７Ｘ置換、Ｓ２９０Ｘ置換、Ｌ３７３Ｘ置換、Ｉ３７９Ｘ置換、Ｍ４４７Ｘ置換、及びＹ４５８Ｘ置換からなる群より選択される修飾を含み、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾：Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換からなる群より選択される修飾を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾：Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換を含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質が、配列番号１の配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、配列番号８の配列に対して少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、配列番号８の配列を含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号７の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号７の配列を含むＯＲＦを含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号２の配列を含む５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
  14. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号４の配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号１５の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号１５の配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐキャップをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールをさらに含み、任意選択で前記ポリ（Ａ）テールが５０～１５０ヌクレオチドの長さを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが化学修飾を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが完全に修飾されている、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記化学修飾が１－メチルシュードウリジンである、請求項１９または請求項２０に記載の組成物。
  22. ２５μｇ～２００μｇの前記ｈＲＳＶ ＲＮＡを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  23. ＰＥＧ修飾脂質、非カチオン性脂質、ステロール、イオン化可能なカチオン性脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質の混合物をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記脂質の混合物が、０．５～１５モル％のＰＥＧ修飾脂質；５～２５モル％の非カチオン性脂質；２５～５５モル％のステロール；及び２０～６０モル％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記脂質の混合物が、１～５モル％のＰＥＧ修飾脂質；１０～２０モル％の非カチオン性脂質；３５～４５モル％のステロール；及び４０～５０モル％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記ＰＥＧ修飾脂質が、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、前記非カチオン性脂質が１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、前記ステロールがコレステロールであり、前記イオン化可能なカチオン性脂質が化合物１の構造：
    Figure 2023513073000014
     を有する、請求項２４または請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記脂質の混合物が脂質ナノ粒子を形成する、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが前記脂質ナノ粒子中に製剤化されている、請求項２７に記載の組成物。
  29. ｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に前記組成物を送達してから少なくとも２４時間後に、対照レベルよりも少なくとも５倍高いレベルで、融合前形態のｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の細胞表面発現をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  30. ｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に前記組成物を送達してから少なくとも４８時間後に、対照レベルよりも少なくとも５０倍高いレベルで、安定化された融合前形態のｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の細胞表面発現をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 対象において、ｈＲＳＶに対する中和抗体応答を誘導するのに有効な量の、請求項１～３０のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  32. 前記対象が免疫無防備状態である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記対象が肺疾患を有する、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 前記対象が５歳以下である、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記対象が６５歳以上である、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記対象に少なくとも２用量の前記組成物を投与することを含む、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、安定化された融合前高次構造に折り畳まれる、請求項３１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 投与後少なくとも２４時間で、前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、対照と比較して少なくとも５倍高いレベルで前記対象において発現される、請求項３１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 投与後少なくとも４８時間で、前記ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、対照と比較して少なくとも５０倍高いレベルで前記対象において発現される、請求項３１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、対照と比較して、前記対象において少なくとも２４時間長く発現される、請求項３１～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 対照と比較して少なくとも５倍低い前記組成物の用量を使用して、中和抗体応答が前記対象において誘導される、請求項３１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記対照が、ベースライン、野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質をコードするＲＳＶ ＲＮＡの投与、または細胞質テールを有するＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の安定化された融合前形態をコードするＲＳＶ ＲＮＡの投与である、請求項３１～４２のいずれか１項に記載の方法。
  43. 配列番号７の配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）。
  44. 配列番号１５の配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）。
  45. 前記ｍＲＮＡが、細胞質テールを欠くヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）リボ核Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードし、ここで、前記ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、全長の野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する、請求項４３または４４に記載のｍＲＮＡ。
  46. 前記オープンリーディングフレームが配列番号７の配列を含む、請求項４３～４５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。
  47. 前記ｍＲＮＡが、配列番号１５の配列を含む、請求項４３～４６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。
  48. 脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項４３～４７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。
  49. 前記脂質ナノ粒子が、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質；５～２５％の非カチオン性脂質；２５～５５％のステロール；及び２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、請求項４３～４８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。
  50. 前記脂質ナノ粒子が、１～５モル％のＰＥＧ修飾脂質；１０～２０モル％の非カチオン性脂質；３５～４５モル％のステロール；及び４０～５０モル％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、請求項４９に記載のｍＲＮＡ。
  51. 前記ＰＥＧ修飾脂質が１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、前記非カチオン性脂質が１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、前記ステロールがコレステロールであり、前記イオン化可能なカチオン性脂質が化合物１の構造：
    Figure 2023513073000015
     を有する、請求項４３～５０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。
  52. 細胞質テールを欠くＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの安定化された融合前形態をコードするヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）リボ核酸（ＲＮＡ）であって、ここでＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、全長野生型ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に対して少なくとも８５％の同一性を有する、ＲＮＡと；
    ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質をコードするヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）ＲＮＡと；
    ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質をコードするヒトパラインフルエンザウイルス３（ｈＰＩＶ３）ＲＮＡと、
    を含む組成物。
  53. 前記細胞質テールがｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントのＣ末端２０～３０、２０～２５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、５～３０、５～２５、５～２０、または５～１５アミノ酸を含む、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記細胞質テールが、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントのＣ末端の２５アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸、または１０アミノ酸を含む、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記細胞質テールが、ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントの以下のＣ末端アミノ酸：
    ＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２５）；ＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２６）；ＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２７）；またはＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２８）
    を含む、請求項５４に記載の組成物。
  56. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、前記野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾：Ｐ１０２Ｘ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｘ置換、Ｓ１５５Ｘ置換、Ｓ１９０Ｘ置換、Ｖ２０７Ｘ置換、Ｓ２９０Ｘ置換、Ｌ３７３Ｘ置換、Ｉ３７９Ｘ置換、Ｍ４４７Ｘ置換、及びＹ４５８Ｘ置換、からなる群より選択される修飾をさらに含み、Ｘが任意のアミノである、請求項５２～５５のいずれか１項に記載の組成物。
  57. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、前記野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾：Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換からなる群より選択される修飾をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
  58. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、前記野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質と比較して、以下の修飾：Ｐ１０２Ａ置換、リンカー分子によるアミノ酸１０４～１４４の置換、Ａ１４９Ｃ置換、Ｓ１５５Ｃ置換、Ｓ１９０Ｆ置換、Ｖ２０７Ｌ置換、Ｓ２９０Ｃ置換、Ｌ３７３Ｒ置換、Ｉ３７９Ｖ置換、Ｍ４４７Ｖ置換、及びＹ４５８Ｃ置換をさらに含む、請求項５７に記載の組成物。
  59. 前記野生型ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質が、配列番号１の配列を含む、請求項５２～５８のいずれか１項に記載の組成物。
  60. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、配列番号８の配列に対して少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項５２～５９のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 前記ｈＲＳＶ Ｆ糖タンパク質バリアントが、配列番号８の配列を含む、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号７の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項５２～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  63. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号７の配列を含むＯＲＦを含む、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号２の配列を含む５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項６２または６３に記載の組成物。
  65. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号４の配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の組成物。
  66. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号１５の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡが、配列番号１５の配列を含む、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質が、配列番号１１の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項５２～６７のいずれか１項に記載の組成物。
  69. ｈＭＰＶ Ｆ糖タンパク質が、配列番号１１の配列を含む、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記ｈＭＰＶ ＲＮＡが、配列番号１０の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む、請求項５２～６９のいずれか１項に記載の組成物。
  71. 前記ｈＭＰＶ ＲＮＡが、配列番号１０の配列を含むＯＲＦを含む、請求項７０に記載の組成物。
  72. 前記ｈＭＰＶ ＲＮＡが、配列番号２の配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項７０または７１に記載の組成物。
  73. 前記ｈＭＰＶ ＲＮＡが、配列番号４の配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の組成物。
  74. 前記ｈＭＰＶ ＲＮＡが、配列番号１６の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項７０～７３のいずれか１項に記載の組成物。
  75. 前記ｈＭＰＶ ＲＮＡが、配列番号１６の配列を含む、請求項７４に記載の組成物。
  76. 前記ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質が、配列番号１４の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項５２～７５のいずれか１項に記載の組成物。
  77. 前記ｈＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質が、配列番号１４の配列を含む、請求項７６に記載の組成物。
  78. 前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが、配列番号１３の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む、請求項５２～７７のいずれか１項に記載の組成物。
  79. 前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが、配列番号１３の配列を含むＯＲＦを含む、請求項７８に記載の組成物。
  80. 前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが、配列番号２の配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項７８または７９に記載の組成物。
  81. 前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが、配列番号４の配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項７８～８０のいずれか１項に記載の組成物。
  82. 前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが、配列番号１７の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項７８～８１のいずれか１項に記載の組成物。
  83. 前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが、配列番号１７の配列を含む、請求項８２に記載の組成物。
  84. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡ、前記ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／または前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐキャップをさらに含む、請求項５２～８３のいずれか１項に記載の組成物。
  85. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡ、前記ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／または前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡがポリ（Ａ）テールをさらに含み、任意選択で前記ポリ（Ａ）テールが５０～１５０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５２～８４のいずれか１項に記載の組成物。
  86. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡ、前記ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／または前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが化学修飾を含む、請求項５２～８３のいずれか１項に記載の組成物。
  87. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡ、前記ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／または前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが完全に修飾されている、請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記化学修飾が１－メチルシュードウリジンである、請求項８６または請求項８７に記載の組成物。
  89. ２５μｇ～２００μｇの前記ｈＲＳＶ ＲＮＡ、前記ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び／または前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡを含む、請求項５２～８８のいずれか１項に記載の組成物。
  90. ＰＥＧ修飾脂質、非カチオン性脂質、ステロール、イオン化可能なカチオン性脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質の混合物をさらに含む、請求項５２～８９のいずれか１項に記載の組成物。
  91. 前記脂質の混合物が、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質；５～２５％の非カチオン性脂質；２５～５５％のステロール；及び２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、請求項９０に記載の組成物。
  92. 前記脂質ナノ粒子が、１～５モル％のＰＥＧ修飾脂質；１０～２０モル％の非カチオン性脂質；３５～４５モル％のステロール；及び４０～５０モル％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、請求項９１に記載の組成物。
  93. 前記ＰＥＧ修飾脂質が１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、前記非カチオン性脂質が１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、前記ステロールがコレステロールであり、前記イオン化可能なカチオン性脂質が化合物１の構造：
    Figure 2023513073000016
     を有する、請求項９１または請求項９２に記載の組成物。
  94. 前記脂質の混合物が脂質ナノ粒子を形成する、請求項９０～９３のいずれか１項に記載の組成物。
  95. 前記ｈＲＳＶ ＲＮＡ、前記ｈＭＰＶ ＲＮＡ、及び前記ｈＰＩＶ３ ＲＮＡが脂質ナノ粒子中に製剤化されている、請求項９４に記載の組成物。
  96. 対象において、ｈＲＳＶ、ｈＭＰＶ、及び／またはｈＰＩＶ３に対する中和抗体応答を誘導するのに有効な量の、請求項５２～９５のいずれか１項に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
  97. 前記対象が免疫無防備状態である、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記対象が肺疾患を有する、請求項９６または９７に記載の方法。
  99. 前記対象が５歳以下である、請求項９６～９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. 前記対象が６５歳以上である、請求項９６～９８のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記対象に少なくとも２用量の前記組成物を投与することを含む、請求項９６～１００のいずれか１項に記載の方法。
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