CN102548578A - 疫苗 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含至少两种选自人间质肺炎病毒(hMPV)、副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的副粘病毒F蛋白抗原的免疫原性组合物。被公开组合物中的抗原是重组F蛋白多肽，其经过修饰以求稳定三聚体融合前构象。还提供了编码所述抗原的核酸，以及它们的生产和使用方法。

Description

疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月24日提交的美国临时申请61/219,958的申请日的权利，该申请的公开内容通过引用并入本文。

依照37C.F.R.§1.71(E)的版权通告

本专利文件的部分公开内容含有受到版权保护的材料。版权所有者不反对专利文件或专利公开中使用的提交到Patent and Trademark Office的专利文件或记录中出现的任何复制件，但除此之外保留所有版权利。

背景

本公开涉及免疫性领域。更具体来说，本公开涉及引发免疫反应的组合物和方法，所述免疫反应能够减少由下呼吸道感染的主要致病原因导致的感染和/或感染症状。

人呼吸道合胞病毒(RSV)、人间质肺炎病毒(hMPV)和副流感病毒(PIV1-4)是1岁以下婴儿下呼吸道感染(LRI)的最常见病因。这些病毒引起的疾病谱包括多种呼吸道症状，从鼻炎和中耳炎到肺炎及毛细支气管炎，后两种疾病引起相当的发病率和死亡率。

人呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科、肺炎病毒亚科、肺病毒属的病原性病毒。RSV的基因组是编码11个蛋白的负链RNA分子。RNA基因组与病毒N蛋白紧密关联形成包裹在病毒包膜内的核衣壳。根据G糖蛋白的抗原性的不同，已有两组人RSV株被描述，A和B组。

人间质肺炎病毒(hMPV)，与人呼吸道合胞病毒(RSV)一样，被划分到副粘病毒科中的肺炎病毒亚科。但是hMPV在遗传学上最接近的是禽间质肺炎病毒(以前被称为火鸡鼻气管炎病毒)。这两种病毒分类到间质肺炎病毒属，其中hMPV是该属中第一个在人中引起疾病的病毒。hMPV首次由荷兰研究者在2001年描述，已在除南极洲的所有大陆的国家鉴定到。hMPV是单负链RNA包被的病毒。到目前为止，已鉴定到hMPV的两个主要组(A和B)和4个亚组。

人副流感病毒是一组副粘病毒，是仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的引起幼童呼吸道疾病的原因。人副流感病毒被划分到副粘病毒亚科，呼吸道病毒属。和RSV一样，人副流感病毒(HPIVs)可能导致一生中反复感染。这些感染常表现为上呼吸道疾病(如感冒或咽喉痛)。HPIVs也可能导致严重的带有反复感染的下呼吸道疾病(包括肺炎、支气管炎和细支气管炎)，特别是在老人、在免疫系统缺损的患者中。四种HPIVs(血清型1-4)中的每一种具有不同的临床和流行病学特性。HPIV-1和HPIV-2的最鲜明的临床特征是哮吼(喉气管支气管炎)。HPIV-3经常与严重的下呼吸道疾病相关，包括支气管炎和肺炎。HPIV-4很少与严重的疾病关联。

已尝试了各种方法希望产生抗这些呼吸道病毒的安全有效疫苗，能够在健康和有风险的群体中引发持久和保护性免疫反应。但是目前为止，评估过的候选物中没有一个被证明作为疫苗是安全有效的，可以预防感染和/或减少或预防疾病，包括这些病毒导致的下呼吸道感染(LRIs)。

发明概述

本公开涉及包含至少两种副粘病毒F蛋白抗原的免疫原性组合物，所述F蛋白抗原选自人类下呼吸道感染的主要致病病毒。本文公开的免疫原性组合物包含选自间质肺炎病毒(hMPV)、副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的至少两种F蛋白抗原。组合物中的抗原是经过改造使三聚体融合前(prefusion)构象稳定的重组F蛋白。还公开了编码所述重组抗原的核酸，以及制备抗原并利用抗原引发对至少两种所述病毒特异的免疫反应的方法，从而例如免于感染和/或感染这些病原体所导致的疾病。

附图说明

图1A的示意图突出了RSV F蛋白结构特点。图1B是示范性RSVPrefusion F (PreF)抗原的示意图。

图2是RSV、hMPV和PIV的示范性F蛋白多肽的序列比对。

图3A的系统发生树显示几例hMPV病毒株的相关性。图3B的表总结了％同一性的逐对比较。

图4A的系统发生树显示几例PIV-3病毒株的相关性。图4B的表总结了％同一性的逐对比较。

图5A的系统发生树显示几例RSV病毒株的相关性。图5B的表总结了％同一性的逐对比较。

图6A和B的条形图展示了PreF抗原引发的IgG和RSV特异性中和抗体的效价。

图7显示了RSV PreF抗原给小鼠提供的抗攻击保护作用。

图8A和B的条形图展示了IgG和对免疫原性组合物的成分特异的中和抗体的效价，其中所述组合物包含副粘病毒F蛋白抗原的组合。

发明详述

简介

婴幼儿中下呼吸道感染(包括诸如细支气管炎和肺炎的严重表现)的三个主要原因按降序排列是呼吸道合胞病毒(RSV)、人间质肺炎病毒(hMPV)和副流感病毒(PIV)家族的成员。本公开描述了抗副粘病毒家族病毒病原体的组合疫苗，并提供了对免疫方案的优化从而按照与常规免疫相容的接种方案协助对非常小的婴儿的保护。

PCT/CA2008/002277公开了包含重组RSV F蛋白的新抗原的设计、产生和利用，其中所述重组RSV F蛋白已经过改造以便稳定三聚体融合前构象。所述申请中公开的重组抗原表现出极佳的免疫原性，尤其适合作为用于抗RSV感染和/或疾病的免疫原性组合物(例如疫苗)的成分。本公开将这些教导推广到引起人呼吸道感染和疾病的其他副粘病毒。更具体地说，本公开提供了三聚体融合前构象被类似地稳定了的重组hMPV和PIV(例如PIV-3)蛋白。这些抗原尤其适用于含有抗原组合的组合物中，用于引发能够对抗或减少感染两种或以上副粘病毒造成的影响的免疫反应。

本公开的一个方面涉及免疫原性组合物，其包含选自人间质肺炎病毒(hMPV)、副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的至少两种副粘病毒F蛋白抗原。副粘病毒F蛋白抗原是包含副粘病毒F蛋白多肽的F2结构域和F1结构域而缺少跨膜结构域的重组F蛋白多肽，并且通过异源三聚体化结构域，其三聚体融合前构象得以稳定。例如，异源三聚体化结构域可以包含SEQ ID NO：15所示范的卷曲螺旋(coiled-coil)结构域，比如异亮氨酸拉锁。一经表达，F蛋白多肽即组装成多聚体，优选三聚体。

F蛋白多肽一般包含F2结构域和F1结构域，之间没有弗林蛋白酶(furin)切割位点。这样F2和F1结构域在加工过程中不会被切割，成熟形式的F蛋白多肽保留了F2和F1结构域之间的完整融合肽。一般来说，异源三聚体化结构域位于F1结构域的C端(例如，代替了天然副粘病毒F蛋白中跨膜结构域存在的位置，或者在这个位置的N端大约20个氨基酸以内)。

一般来说，F蛋白多肽包含信号肽(可以从成熟抗原中切割下来)。信号肽可以来自相同的副粘病毒F蛋白、不同的副粘病毒F蛋白或者来自完全不同的蛋白。例如，实施人员可以酌情选择信号肽来协助在选定宿主细胞中的产生。

F蛋白多肽稳定地组装成经过基因工程可以保持融合前构象的三聚体。任选地，F蛋白多肽还包含增强融合前构象稳定性的一或多个修饰。例如，有益的修饰包括：在F蛋白胞外结构域的疏水结构域(例如，HRA和/或HRB)中取代或添加亲水氨基酸；和改变糖基化的氨基酸取代。任选地，F蛋白多肽包含多聚组氨酸序列或其他标签来协助纯化。

在某些实施方案中，免疫原性组合物还包含至少一个副粘病毒G蛋白多肽或其免疫原性片段。所述G蛋白多肽可以是全长重组G蛋白，或者分离的免疫原性片段或嵌合(或“融合”)蛋白(与F蛋白多肽或另一个融合伙伴形成的)。当选中的是片段时，片段通常保留至少一个免疫优势表位，例如RSV G蛋白的氨基酸184-198。

在某些实施方案中，免疫原性组合物包含两个副粘病毒F蛋白抗原。例如，在一个特定实施方案中，免疫原性组合物包含与hMPV F蛋白对应的F蛋白多肽和与PIV(例如PIV-3)F蛋白对应的F蛋白多肽。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含与hMPV F蛋白多肽、或与PIV蛋白多肽、或者与hMPV和PIV蛋白多肽两者组合的RSV F蛋白多肽。其他实施方案中，免疫原性组合物除了至少两种副粘病毒F蛋白抗原，还包括至少一种另外的抗原。例如除了对应RSV、hMPV和/或PIV的F蛋白多肽，免疫原性组合物还包括其他副粘病毒抗原，比如对应不同RSV株的F蛋白多肽。替代地，免疫原性组合物可以包含第二(或更多)PIV F蛋白抗原，比如对应PIV不同血清型的F蛋白多肽，例如组合物包含PIV-3和PIV-1的抗原。其他实施方案中，免疫原性组合物包含来自病毒，比如也会导致呼吸道感染的流感(正粘病毒)、腺病毒或SARS的第三或后续的抗原。例如，免疫原性组合物除了hMPV F蛋白多肽和PIV蛋白多肽和/或RSV F蛋白多肽，还包含流感HA抗原。

某些优选实施方案中，免疫原性组合物还包含至少一种载体或赋形剂(例如，缓冲液)。免疫原性组合物优选与佐剂，优选是引发Th1型免疫反应的佐剂一起成剂。所述佐剂一般挑选能够增强保护性免疫反应而不会在目标群体(例如新生儿和婴儿)中造成过度反应的那些。

当给予受试对象或受试对象群体时，本文公开的免疫原性组合物能够减少或防止感染hMPV、PIV和RSV中的两个或多个以及任选的一或多个其他呼吸道病原体，和/或减少或防止hMPV、PIV和RSV中的两个或多个以及任选的一或多个其他呼吸道病原体导致的病理反应。因此，本公开提供了通过将本文公开的免疫原性组合物给予受试对象(例如人受试对象)来引发抗hMPV、PIV和RSV中的一或多个的免疫反应。给予本文公开的免疫原性组合物优选引发能够减少或防止感染hMPV、PIV和RSV中的至少两个的Th1型免疫反应。相应地，本公开涉及副粘病毒F蛋白抗原在制备治疗(例如预防)hMPV、PIV和RSV中的两个或多个所引起的感染的药物中的用途。例如，F蛋白抗原(或核酸)被用于制备预防性治疗hMPV、PIV和RSV中的一或多个引起的感染的药物。

本公开的另一方面涉及重组核酸，所述重组核酸包含编码本文公开的重组副粘病毒F蛋白抗原的多核苷酸序列。这种核酸的密码子经常被优化以便在选定宿主细胞中表达。核酸可以被插入到载体中，比如原核细胞或真核细胞表达载体。某些实施方案中，核酸被导入宿主细胞。宿主细胞优选选自细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。

术语

除非另有说明，本文使用的所有科技术语与本公开所属领域的技术人员通常理解的意义相同。分子生物学常见术语的定义可以在Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrewet al.(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biologyand Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。

除非上下文明确另有说明，单数术语“一个”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。类似地，单词“或”意味着包含“和”，除非上下文明确另有说明。术语“复数”是指两个或以上。还应当明白，给出的核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量数值都是近似值，仅用于描述目的。此外，就物质(比如抗原)浓度或水平给出的数值限制是近似的。因此，浓度被指明是至少(例如)200pg的情况中，是指浓度应理解为至少接近(或者“大约”或“～”)200pg。

虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本公开的实践或测试，以下描述了合适的方法和材料。术语“包含”意味着“包括”。因此，除非上下文另有要求，单词“包含”(“comprises”及其变形，比如“comprise”和“comprising”)理解为表示含有所陈述的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或者步骤，或者一组化合物或步骤；但不排除含有其他化合物、组合物、步骤或一组化合物、组合物或步骤。缩写“e.g.”来自拉丁文exempli gratia，用于本文表示非限制性例子。因此，缩写“e.g.”是术语“forexample(例如)”的同义词。

为了协助对本发明各种实施方案的审核，特提供以下术语解释。根据本公开的语境可以提供其他术语和解释。

术语“F蛋白”或“Fusion蛋白”或“F蛋白多肽”或“Fusion蛋白多肽”是指具有副粘病毒Fusion蛋白多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。类似地，术语“G蛋白”或“G蛋白多肽”是指具有副粘病毒Attachment蛋白多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。已有许多副粘病毒Fusion和Attachment蛋白被描述，是本领域技术人员一直的。WO2008114149提出了示范性的RSV F和G蛋白变体(例如，天然变体)，至本公开提交日仍是公开的。示范性的hMPV F蛋白的病毒株在Boivin et al.Emerg.Infect.Dis.10：1154-1157(2004)中进行了总结，所述总结通过引用并入本文用于hMPV序列的公开，附在文中作为附录1。示范性PIV(例如PIV-3)F蛋白的序列在Prinoski et al.Virus Research 22：55-69(1991)中有提供，该序列通过引用并入本文用于PIV序列的公开，并附在文中作为附录2。这些文献每个都通过引用并入本文以公开示范性F蛋白序列。此外，这些序列中许多在GenBank数据库(就2009年6月24日)中有公开。

当“变体”是指核酸或多肽(例如副粘病毒F或G蛋白的核酸或多肽或类似物)时，它是与参照核酸或多肽不同的核酸或多肽。通常，变体和参照核酸或多肽之间的差别与参照物相比，是构成比例上来说很少的差别。

多肽或蛋白的“结构域”是多肽或蛋白内结构确定的元件。例如，“三聚体化结构域”是多肽内促进多肽组装成三聚体的氨基酸序列。例如，三聚体化结构域可以通过关联(氨基酸序列相同或不同的其他多肽的)其他三聚体化结构域促进三聚体的组装。该术语还指编码这类肽或多肽的多核苷酸。

术语“天然”和“天然存在”是指其存在状态和在自然界中是一样的元件，比如蛋白、多肽或核酸。即，元件未被人工改造过。应当理解，在本公开的语境中，有许多RSV蛋白或多肽的天然/天然存在变体，例如从RSV的不同的天然存在株或分离物中获得的。

术语“多肽”是指一种聚合物，其中的单体是通过酰胺键连接起来的氨基酸残基。术语“多肽”或“蛋白”用于本文意图涵盖任何氨基酸序列，并且包括修饰过的序列，比如糖蛋白。术语“多肽”特别要包含天然存在的蛋白，以及那些重组或合成产生的蛋白。提到多肽时的术语“片段”是指多肽的一部分(即亚序列)。术语“免疫原性片段”是指保留了全长参照蛋白或多肽的至少一个优势免疫原性表位的所有多肽片段。多肽内的方向通常按照各个氨基酸的氨基和羧基部分所定义的N端到C端叙述。多肽从N或氨基端向C或羧基端翻译。

“信号肽”是这样的短氨基酸序列(例如大约18-25个氨基酸长)，这类序列能够将新合成的分泌蛋白或膜蛋白引导到膜或引导着跨膜，例如内质网膜。信号肽常常但并不永远位于多肽的N端，经常在蛋白跨膜后被信号肽酶切割下来。信号序列一般含有三个常见的结构特征：N-端极性碱性区(n区)、疏水中心和亲水c区)。

术语“多核苷酸”和“核酸序列”是指至少10个碱基长的核苷酸聚合物形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者任何一种核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。“分离的多核苷酸”意味着所述多核苷酸和它所来源的生物体中天然存在的基因组中直接相接(一个在5’端，一个在3’端)的两个编码序列不再直接相接。在一个实施方案中，多核苷酸编码多肽。核酸的5′和3′方向参考各个核苷酸单元的连接而定义，并且按照脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置指定。多核苷酸序列的信息(编码)内容从5′向3′方向阅读。

“重组”核酸是这样的核酸，它含有不是天然存在的序列或者含有将两个本来分开的序列区段通过人工组合而制成的序列。这种人工组合可以通过化学合成，或者更常见的，通过对核酸分离区段借助例如基因工程技术进行人工操作而实现。“重组”蛋白是由被导入诸如细菌或真核细胞的宿主细胞的异源(例如重组)核酸编码的蛋白。核酸可以导入表达载体，所述载体含有能够表达被导入的核酸所编码的蛋白的信号；或者核酸可以整合到宿主细胞染色体中。

术语“异源”就核酸、多肽或另一种分子成份而言，表明该成分出现在自然界中通常找不到它的地方和/或它起源于不同的来源或物种。

术语“纯化”(例如就病原体或者含有病原体的组合物而言)是指从组合物中除去那些不希望有的成分的过程。纯化是一个相对术语，不要求不需要的成分全部都被从组合物中除去。在疫苗生产的语境中，纯化包括诸如离心、透析、离子交换层析和大小排阻层析、亲和纯化或沉淀。因此，术语“纯化的”不要求绝对纯；而是作为一个相对的术语。因此，例如，纯化的核酸制品是与产生该核酸的环境(例如在细胞内或者在生化反应室中)相比，指定的蛋白更为富集的那些制品。基本纯的核酸或蛋白制品可以被纯化成所需核酸代表制品中总核酸含量的至少50％。在某些实施方案中，基本纯的核酸代表制品中总核酸或蛋白含量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或以上。

“分离的”生物成分(比如核酸分子、蛋白或细胞器)已被与所述成分天然存在的生物体的细胞内的其他生物成分(比如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器)分开或者纯化出来。被“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸和蛋白。

“抗原”是可以在动物内刺激抗体产生和/或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括通过注射、吸收或其他方式引入动物的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞对其反应的位点。“优势抗原表位”或“优势表位”是那些进行功能重要的宿主免疫反应(例如，抗体反应或T细胞反应)的表位。因此，就抗病原体的保护性免疫反应而言，优势抗原表位是这样的抗原部分，它们被宿主免疫系统识别时导致对病原体引起的疾病的保护作用。术语“T细胞表位”是指当结合合适的MHC分子时被T细胞(经由T细胞受体)特异结合的表位。“B细胞表位”是被抗体(或B细胞受体分子)特异结合的表位。

“佐剂”是以非特异性方式增强免疫反应的产生的试剂。常见佐剂包括抗原吸附在上面的矿物质(明矾、氧化铝、磷酸铝)悬浮液；乳剂，包括油包水和水包油(及其变形，包括复乳剂和可逆乳剂)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸(比如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)和这些成分的各种组合。

“免疫原性组合物”是适合(在例如试验情景中)给予人或动物受试对象的物质组合物，其能够引发例如抗诸如hMPV、PIV(例如PIV-3、PIV-1)和/或RSV的病原体的特异免疫反应。这样，免疫原性组合物包含一或多种抗原(例如，多肽抗原)或抗原表位。免疫原性组合物还可以包含一或多种其他能够引发或增强免疫反应的成分，比如赋形剂、载体和/或佐剂。某些情况中，受试对象被给予免疫原性组合物以便引发免疫反应保护其抵抗病原体引起的症状或状况。某些情况中，在受试对象接触到病原体(例如hMPV、PIV和/或RSV)后，通过抑制病原体的复制来防止(或者减少或改善)病原体所导致的症状或疾病。在本公开的语境中，术语免疫原性组合物理解为涵盖这样的组合物，这些组合物是为了引发抗病原体(即疫苗组合物或疫苗)的保护性或缓解性免疫反应的目的被给予受试对象或受试对象群体。

“免疫反应”是免疫系统细胞，比如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的反应。免疫反应可以是导致产生特异抗体(比如抗原特异性中和抗体)的B细胞反应。免疫反应也可以是T细胞反应，比如CD4+反应或CD8+反应。某些情况中，反应对特定抗原是特异的(即，“抗原特异性反应”)。如果抗原来源于病原体，抗原特异性反应是“病原体特异性反应”。“保护性免疫反应”是抑制病原体的有害功能或活性、减少病原体感染或者减轻病原体感染所造成的症状(包括死亡)的免疫反应。保护性免疫反应可以通过在噬斑减少试验或者ELISA中和分析法中对病毒复制或噬斑形成的抑制来测量，或者通过体内测量对病原体攻击的抗性。

“Th1”型免疫反应特征在于存在产生IL-2和IFN-γ的CD4+T辅助细胞，因此也是特征在于IL-2和IFN-γ的分泌或存在。相反，“Th2”型免疫反应特征在于占优势的产生IL-4、IL-5和IL-13的CD4+辅助细胞。

“免疫有效量”是组合物(一般是免疫原性组合物)的量，该量用于在受试对象中引发对组合物或组合物中的抗原的免疫反应。通常，希望的结果是产生抗原(例如病原体)-特异性免疫反应，所述免疫反应能够保护或者协助受试对象抵抗病原体。但是，获得抵抗病原体的保护性免疫反应可能需要多次给予免疫原性组合物。因此，在本公开的语境中，术语免疫有效量涵盖与先前或者之后给药组合达到保护性免疫反应的部分剂量。

形容词“药物可接受的”表明指示物适合给予受试对象(例如人或动物受试对象)。Remington’s Pharmaceutical Sciences，by E.W.Martin，MackPublishing Co.，Easton，PA，15th Edition(1975)描述了适用于治疗性和/或预防性组合物(包括免疫原性组合物)的药物递送的组合物和制剂(包括稀释剂)。

在提及反应，比如免疫反应时，术语“调整”意味着改动或改变反应的开始、反应量、持续时间或特点。能够调整免疫反应的试剂在给药后，能够改变免疫反应的开始、反应量、持续时间或特点中的至少一项，或者与参照试剂相比，能够改变免疫反应的开始、反应量、持续时间或特点中的至少一项。

术语“减轻”是一个相对术语，如果在给予试剂后，反应或者状况从量上缩小了；或者与参照试剂相比，给予试剂后，反应或状况从量上缩小了，则所述试剂能够减轻反应或状况。类似地，只要至少一个反应或状况特征被消除了，术语“防止”不一定表示试剂彻底消除了反应或状况。因此减轻或防止感染或反应(比如病理反应，例如疫苗增强型病毒疾病)的免疫原性组合物可以，但不一定彻底消除了这类感染或反应，只要感染或反应比没有所述试剂情况下的感染或反应或者与参照试剂相比，测量到缩小了例如至少大约50％，比如至少大约70％或大约80％或甚至大约90％(即达到原来的10％或更少)。

“受试对象”是活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开的语境中，受试对象可以是试验对象，比如非人动物，例如小鼠、棉田鼠或非人的灵长动物。替代地，受试对象是人受试对象。

PreF抗原

自然界中，副粘病毒F蛋白表达为命名为F0的单一多肽前体。在体内，F0在内质网中寡聚化，被弗林酶蛋白酶经蛋白水解加工形成由两个二硫键连接的片段构成的寡聚物。RSV F F0前体在两个弗林酶识别位点被切割，释放出中间称为pep27的肽，而其他副粘病毒的F蛋白(包括PIV和hMPV F蛋白)在单个位点被切割。弗林酶切割产生的两个片段中的较小片段被称为F2，其起源于F0前体的N末端部分。较大的C末端F1片段通过疏水氨基酸序列将F蛋白锚定在膜中，其中该疏水氨基酸序列邻接24个氨基酸的细胞质尾巴。本领域技术人员能够认识到缩写F0、F1和F2在科技文献中常被命名为F₀、F₁和F₂。

三个F2-F1二聚体关联形成成熟的F蛋白，F蛋白处于次稳定的融合发生前(“融合前”)构象，在接触到靶细胞膜时被引发进行构象改变。这一构象改变使称为融合肽的疏水序列被暴露，该融合肽与宿主细胞膜联系促进病毒膜或者感染细胞与靶细胞膜的融合。

F1片段含有至少两个七肽重复结构域，命名为HRA和HRB，分别位于融合肽和跨膜锚定结构域附近。在融合前的构象中，F2-F1二聚体形成球状头部和茎部结构，其中HRA结构域在球状头部中处于分节段(延伸)的构象。相反，HRB结构域形成从头部区域伸出的三链卷曲螺旋茎部。在从融合前到融合后构象的转化过程中，HRA结构域瓦解并被带到HRB结构域附近形成反平行的6螺旋束。在融合后状态中，融合肽和跨膜结构域并列促进膜融合。

虽然以上提供的构象描述是基于晶体学数据的分子模型，融合前和融合后构象的结构差异不需要借助晶体学来进行监测。例如，可以按照Calder etal.，Virology，271：122-131(2000)and Morton et al.，Virology，311：275-288展示的，用电子显微镜来区分融合前和融合后(替代地称为融合发生前或融合)构象，为了技术教导的目的将所述文献通过引用并入本文。还可以通过如Connolly et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：17903-17908(2006)描述的脂质体关联分析法来区分融合前构象和融合(融合后)构象，为了技术教导的目的将所述文献通过引用并入本文。此外，融合前和融合构象的区分还可以利用抗体(例如单克隆抗体)，所述抗体特异识别副粘病毒F蛋白的融合前或融合形式中的一个上存在，而在另一种形式上不存在的构象表位。这种构象表位可能是由于分子表面上优先暴露的抗原决定簇。替代地，构象表位可以来自线性多肽中不相邻的氨基酸的排列。

本文公开的PreF抗原是设计用于稳定和维持副粘病毒F蛋白的融合前构象，这样在表达蛋白群体中，相当一部分处于融合发生前(融合前)构象(例如结构和/或热动力学模型预测的或者通过以上公开的一或多种方法评估的)。天然(或合成)F蛋白中被引入了稳定化修饰，比如SEQ ID NO：2的示范性RSV F蛋白、SEQ ID NO：6的示范性hMPV蛋白和/或SEQ ID NO：8的示范性PIV蛋白。引入本文公开的稳定修饰导致PreF抗原被导入细胞或胞外环境(例如体内，例如给予受试对象后)后，能够维持融合前构象中的主要免疫原表位。

首先，异源稳定结构域可以放置在构建体的C末端以便替代F0多肽的膜锚定结构域。所述稳定结构域预计能够补偿HRB的不稳定性，帮助稳定融合前构象。在示范性实施方案中，异源稳定结构域是蛋白多聚化结构域。这类蛋白多聚化结构域的一个特别优选的例子是三聚化结构域。示范性三聚化结构域折叠成卷曲螺旋，后者促进组装成含有该卷曲螺旋结构域的多个多肽的三聚体。三聚化结构域的一个优选例子是异亮氨酸拉锁。示范性的异亮氨酸拉锁结构域是Harbury et al.Science 262：1401-1407(1993)所描述的基因工程化的酵母GCN4异亮氨酸变体。SEQ ID NO：15代表了一个合适的异亮氨酸结构域的序列，虽然该序列的那些保留形成卷曲螺旋稳定结构域能力的变体同样适合。替代的稳定卷曲螺旋三聚化结构域包括：TRAF2(GENBANK

登录号Q12933[gi：23503103]；氨基酸299-348)；血小板反应蛋白1(登录号PO7996[gi：135717]；氨基酸291-314)；Matrilin-4(登录号O95460[gi：14548117]；氨基酸594-618)；CMP(matrilin-1)(登录号NP_002370[gi：4505111]；氨基酸463-496)；HSF1(登录号AAX42211[gi：61362386]；氨基酸165-191)；和Cubilin(Accession No.NP_001072[gi：4557503]；氨基酸104-138)。预期合适的三聚化结构域导致表达蛋白的相当一部分组装成三聚体。例如，含有三聚化结构域的重组PreF多肽至少50％组装成三聚体(例如通过AFF-MALS估计的)。一般来说，表达多肽的至少60％，更优选至少70％，最希望至少75％或以上以三聚体存在。

为了进一步增强稳定性，HRB内的中性残基(比如亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸)可以取代为极性残基(比如赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺)。例如，就RSV PreF抗原而言，位于PreF位点512(相对天然F0蛋白)的亮氨酸残基可以取代为赖氨酸(SEQ ID NO：10所示示范性PreF抗原多肽中的L482K)。这一取代提高了卷曲螺旋疏水残基的周期性。类似地，可以在位点105的氨基酸后面添加赖氨酸。本领域技术人员可以在hMPV和PIV-3 F蛋白中挑选相应的或者相当的残基。

此外，删除(对hMPV和PIV是一个，对RSV是一个或者两个)弗林酶切割基序可以进一步稳定融合前构象子。对于这种设计，融合肽不被从F2切割下来，防止了从融合前构象子的球状头部释放和对临近膜的可接触性。融合肽和膜界面之间的相互作用预计是融合前状态不稳定的主要问题。在融合过程中，融合肽和目标膜之间的相互作用导致融合肽从球状头部结构中暴露出来，提高了融合前状态的不稳定和向融合后构象子的折叠。这种构象改变使得膜融合过程得以实现。除去一个(或者对于RSV任选两个)弗林酶切割位点预计会阻碍融合肽N端部分接近膜，从而稳定融合前状态。对于RSVF蛋白的情况，两个弗林酶切割位点之间被称为pep27的序列也可以去除。因此，在本文公开的示范性实施方案中，去除弗林酶切割基序产生的PreF抗原含有完整的融合肽，该融合肽在加工和组装过程之中或者之后不被弗林酶切割。

任选地，还可以通过例如取代一或多个氨基酸来去除至少一个非弗林酶切割位点。例如，试验证据表明在容易被某些金属蛋白酶进行切割的条件下，RSV PreF抗原可以在氨基酸110-118附近被切割(例如，切割发生在PreF抗原的氨基酸112和113之间；在SEQ ID NO：2所示参照F蛋白多肽中位点142的亮氨酸和位点143的甘氨酸之间)。相应地，该区域内一或多个氨基酸的修饰会减少PreF抗原的切割。例如，位点112的亮氨酸可以取代为不同氨基酸，比如异亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸。替代地或者另外地，位点113的甘氨酸可以取代为丝氨酸或丙氨酸。在hMPV和PIV PreF抗原的产生过程中观察到非弗林蛋白酶切割的情况中可以进行类似的修饰。

任选地，PreF抗原可以包含一或多个改变糖基化模式或状态的修饰(例如通过提高或降低天然F蛋白多肽中存在的一或多个糖基化位点上被糖基化的分子比例)。例如，SEQ ID NO：2的天然RSV F蛋白多肽可以在氨基酸位点27、70和500(对应SEQ ID NO：10的示范性PreF抗原的位点27、70和470)被糖基化。一个实施方案中，位于氨基酸位点500的糖基化位点附近被引入修饰(指定为N470)。例如，可以通过用诸如谷氨酰胺(Q)的氨基酸取代(通过比对对应示范性PreF抗原的位点470的参照序列的)位点500的天冬酰胺将糖基化位点除去。在糖基化位点引入能够提高糖基化效率的修饰是有利的。合适修饰的例子包括在位点500-502的以下氨基酸序列：NGS、NKS、NGT、NKT。有趣的是，已发现导致该糖基化位点的糖基化增加的修饰也会导致PreF的产生极大地提高。因此在某些实施方案中，PreF抗原在对应参照PreF序列(SEQ ID NO：2)氨基酸500的位置(例如在SEQ ID NO：10所示范的PreF抗原的位点470)上带有修饰的糖基化位点。合适的修饰包括在对应参照F蛋白多肽序列中位点500-502的氨基酸序列NGS、NKS、NGT、NKT。类似地，hMPV和PIV PreF抗原中的糖基化位点可以被修饰，例如SEQ IDNO：6所示参照hMPV F蛋白多肽序列中位点57、172和/或353中的一或多个所对应的氨基酸；和/或例如SEQ ID NO：8所示参照PIV3 F蛋白多肽中位点238、359和/或446中的一或多个所对应的氨基酸可以被修饰。

本文公开的任何稳定修饰，例如优选在PreF抗原的C末端添加异源稳定结构域，比如卷曲螺旋(例如，异亮氨酸拉锁结构域)；残基的修饰，比如疏水HRB结构域中亮氨酸到赖氨酸的修饰；去除弗林酶切割基序；去除非弗林酶切割位点；和/或糖基化位点的修饰可以与一种或多种(或者以任何希望的组合的所有)其他稳定修饰组合使用。例如，在RSV PreF抗原中，可以单独使用异源卷曲螺旋(或其他异源稳定结构域)，或者与下述中的任一种组合使用：疏水区内的修饰、和/或去除pep27、和/或去除一个或两个弗林切割位点、和/或去除非弗林切割位点、和/或糖基化位点的修饰。某些特定实施方案中，RSV PreF抗原包含C-端卷曲螺旋(异亮氨酸拉锁)结构域、位于HRB疏水结构域的稳定取代和两个弗林酶切割位点的去除。这样的实施方案缺少pep27，包含未被弗林酶切割去除的完整融合肽。在一个特定实施方案中，PreF抗原还包含位于氨基酸位点500的修饰的糖基化位点。在hMPV和/或PIV PreF抗原中，可以单独使用异源卷曲螺旋(或其他异源稳定结构域)，或者与下述中的任一种组合使用：疏水区内的修饰、和/或去除弗林切割位点、和/或去除非弗林切割位点、和/或糖基化位点的修饰。在某些特定实施方案中，hMPV或PIV PreF抗原包含C-端卷曲螺旋(异亮氨酸拉锁)结构域、位于HRB疏水结构域的稳定取代和弗林酶切割位点的去除。这样的实施方案包含未被弗林酶切割除去的完整的融合肽。任选地，hMPV或PIV PreF抗原还包含修饰的糖基化位点。

天然F蛋白多肽可以选自需要PreF抗原的副粘病毒的任何F蛋白。例如，对于RSV，可以选择RSV A或RSV B株，或者它们的变体(如上文定义的)。在某些示范性实施方案中，F蛋白多肽是SEQ ID NO：2所代表的F蛋白。WO2008114149(为了提供FSV F和G蛋白序列的其他例子的目的，通过引用并入本文)中公开了来自不同RSV株的F蛋白多肽的许多其他例子。

对于hMPV，可以选择任何A或B(例如A1、A2、B1、B2)株或者它们的变体(如上文定义的)。在某些示范性实施方案中，hMPV F蛋白多肽是SEQID NO：6所代表的F蛋白。Boivin et al.Emerg.Infect.Dis.10：1154-1157(2004)(为了公开示范性hMPV F蛋白序列的目的，通过引用并入本文)中公开了来自不同hMPV株的F蛋白多肽的许多其他例子。参考GenBank数据库，可以容易地鉴定到示范性核酸序列。

对于PIV，可以挑选选自血清型1-4的任何病毒株或它们的变体(如上文定义的)。例如，在设计用于防止下呼吸道疾病的组合物中，PIV最常用的是PIV-3株。某些示范性实施方案中，PIV F蛋白多肽是SEQ ID NO：8所代表的F蛋白。Prinoski et al.Virus Research 22：55-69(1991)中提供了其他PIV(例如PIV-3)融合蛋白的序列，该文献为了公开示范性PIV F蛋白序列的目的通过引用并入本文。参考GenBank数据库，可以容易地鉴定到示范性核酸序列。

为了便于对本公开的理解，不论来自哪个病毒株，所有氨基酸残基位点都是相对(即氨基酸残基位点对应)一个示范性F蛋白的氨基酸位点给出的。任何其他副粘病毒的相当的氨基酸位点都可由本领域技术人员利用现有的公知比对算法(比如BLAST，使用例如缺省参数)通过将所选病毒F蛋白的氨基酸序列与示范性序列进行序列比对容易地确定。这些或者任何其他副粘病毒F蛋白的其他变体可以来自遗传漂变，或者可能利用定点或随机突变人工制备，或者通过两个或多个已有变体的重组制备。这些额外的变体就本文公开的PreF(和PreF-G)抗原来说，也是合适的。

挑选F蛋白的F2和F1结构域时，本领域技术人员会认识到不必须包括完整的F2和/或F1结构域。一般来说，当选择F2结构域的亚序列(或片段)时，考虑构象是重要的。因此，F2结构域一般含有F2结构域中能够促进多肽组装和稳定性的一部分。如PCT/CA2008/002277中公开的，在某些涉及RSV F蛋白的实施方案中，F2结构域包含氨基酸26-105。在某些涉及hMPV F蛋白的示范性实施方案中，F2结构域包含氨基酸19-98。在某些涉及PIV F蛋白的示范性实施方案中，F2结构域包含氨基酸19-105。但是，长度(通过添加或缺失一或多个氨基酸)略有改变的变体也可能。

通常，选出F1结构域的至少一个亚序列(或片段)来进行设计，以维持包含了该F蛋白的免疫优势表位的稳定构象。在涉及RSV F蛋白的示范性实施方案中，F1结构域多肽包含RSV F蛋白多肽的至少大约氨基酸262-436。本文提供的一个非限制性实例中，F1结构域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137-516。本领域技术人员会认识到，实施者可以决定使用其他更短的亚序列。在涉及hMPV F蛋白的示范性实施方案中，F1结构域包含氨基酸103-480(例如103-481)，在涉及PIV F蛋白的示范性实施方案中，F1结构域包含氨基酸110-481(例如110-484)。

当选择F2和F1结构域(或者如下文讨论的，对某些PreF-G抗原的G蛋白成分而言)的亚序列时，除了构象学方面的考虑，最好在包含其他免疫原性表位的基础上对序列(例如变体、亚序列等)进行选择。例如，利用锚定基序或其他方法，比如本领域已知的神经网络或多项式函数判定来鉴定其他T细胞表位，参见例如RANKPEP(mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html提供)；ProPredI(imtech.res.in/raghava/propredI/index.html提供)；Bimas(www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html提供)；和SYFPEITH(syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm提供)。例如，利用算法确定肽的“结合阈值”，挑选那些分数使它们在一定亲和力有较高MHC或抗体结合概率的肽。算法基于特定位点上特定氨基酸对MHC结合的影响、特定位点上特定氨基酸对抗体结合的影响，或者含有基序的肽中特定取代对结合的影响。就免疫原性肽来说，“保守残基”是肽中特定位点上比随机分布所预期的出现频率明显高的残基。锚定残基是提供与MHC分子的接触点的保守残基。通过这种预测方法鉴定到的T细胞表位可以通过测量它们与特异MHC蛋白的结合以及当呈递给MHC蛋白时刺激T细胞的能力来确认。

PreF抗原(包括以下讨论的PreF-G抗原)包含与表达系统对应的信号肽是有利的，例如，包含哺乳动物或病毒信号肽，比如RSV F0天然信号序列(例如SEQ ID NO：2的氨基酸1-25或者SEQ ID NO：10的氨基酸1-25)，或者hMPV或PIV天然信号序列(例如SEQ ID NOs：6或8的氨基酸1-18)。一般来说，选择的信号肽与选中用于重组表达的细胞相容。例如，信号肽，比如杆状病毒信号肽，或蜂素信号肽可以用于在昆虫细胞内进行表达。合适的植物信号肽是本领域已知的，如果优选植物表达系统。许多示范性信号肽是本领域已知的(参见例如Zhang & Henzel，Protein Sci.，13：2819-2824(2004)，该文献描述了多种人信号肽)，在例如SPdb信号肽数据库中有列表，该数据库包括古细菌、原核生物和真核生物的信号序列(http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/)。任选地，以上抗原可以包含其他序列或标签，比如协助纯化的His标签。

任选地，PreF抗原可以包含其他免疫原性成分。某些特别有利的实施方案中，PreF抗原包含副粘病毒G蛋白抗原成分。示范性的含有PreF和来自RSV的G成分的嵌合蛋白在PCT/CA2008/002277中有详细描述，为了其中对示范性嵌合PreF-G蛋白的详细描述，将该文献通过引用并入本文。可以给任何副粘病毒，包括特别是hMPV和PIV(例如PIV-3)设计和生产相当的PreF-G蛋白。

例如，对于挑选对应天然存在病毒株的序列，一或多个结构域可以在序列上对应RSV A或B株，比如常见的命名为A2或Long的实验室分离物，或者任何其他天然存在株或分离物(如以上提到的WO2008114149中公开的)。类似地，可以挑选对应其他天然存在副粘病毒(包括例如hMPV和PIV)的序列(如以上提到的Boivin et al.Emerg.Infect.Dis.10：1154-1157(2004)和Prinoski et al.Virus Research 22：55-69(1991)中分别公开的)。SEQ ID NOs：10、12和14提供了示范性PreF蛋白多肽(分别对应RSV、hMPV和PIV-3)。

除了这些天然发生的和分离的变体，PreF(包括PreF-G)抗原中还可以采用与上述序列有相似度的基因工程变体。本领域技术人员理解，PreF抗原多肽(和如下文描述的多核苷酸序列)之间的相似度，与对多肽一样(和一般来说的核苷酸序列)，可以表达为序列间的相似度，另外也可称为序列同一性。序列同一性常常以百分比同一性(或相似度)来衡量，百分比越高，两个序列的一级结构越相似。一般，两个氨基酸(或多核苷酸)序列的一级结构越相似，由折叠和组装产生的更高结构越相似。PreF多肽(和多核苷酸)序列的变体通常含有一个或少数几个氨基酸缺失、添加或取代，但它们仍有高百分比的相同氨基酸(以及一般来说多核苷酸)。更重要的是，变体保持了本文公开的参照序列的结构上的因此也就是构象上的特性。因此相对SEQ ID NOs：10、12和14中的一个示范性PreF序列，含有1、2、3、4、5或高达10个氨基酸添加、缺失和/或取代的PreF蛋白多肽也是本文公开的PreF蛋白多肽的实施方案。例如，合适的实施方案包括含有氨基酸取代的RSV、hMPV和/或PIV-3 PreF蛋白(例如SEQ ID NOs：10、12和/或14所示的)，所述取代修饰了糖基化位点(如上文讨论)。类似地，合适的实施方案包含相对SEQ IDNOs：10、12和/或14，改变了内部肽酶切割位点(如上文讨论)的氨基酸取代。在某些实施方案中，PreF多肽相对SEQ ID NOs：10、12和14，包含这两种修饰。

确定序列同一性的方法是本领域公知的，可以应用于PreF抗原多肽以及编码它们的核酸(例如如下文描述的方法)。各种程序和序列比对算法在Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Higgins and Sharp，Gene 73：237，1988；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151，1989；Corpet et al.，核酸Research 16：10881，1988和Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988中有描述。Altschul et al.，Nature Genet.6：119，1994提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403，1990)可以从多个来源得到，包括National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，可以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。NCBI网站提供了如何使用该程序确定序列同一性的描述。

某些情况中，相对它所来源的天然存在的病毒株的氨基酸序列，PreF抗原含有一或多个氨基酸修饰(例如除了以上提到的稳定修饰)。这种差别可以是一或多个氨基酸的添加、缺失或取代。变体的差别通常不超过氨基酸残基的大约1％或2％或3％或4％或5％或6％或10％或15％或20％。例如，与SEQ ID NO：10的示范性PreF抗原多肽序列相比，或者与基于hMPV和/或PIV序列的PreF抗原类似物(比如示范性序列SEQ ID NOs：12和14)相比，变体PreF抗原(包括PreF-G)多肽序列可以包含1个或2个，或最多5个，或最多大约10个，或最多大约15个，或最多大约50个，或最多大约100个氨基酸的差异。因此，就F或G蛋白或者PreF抗原(包括PreF-G抗原)而言的变体一般与参照序列，或者本文公开的任何示范性PreF抗原具有至少80％、或85％，更常见的至少大约90％或以上，比如94％或95％或96％或97％，或者甚至98％或99％序列同一性。包含在本公开中作为特点之一的其他变体是PreF抗原(包括PreF-G抗原)，所述PreF抗原包含选自WO2008114149(RSV)、Boivin et al.Emerg.Infect.Dis.10：1154-1157(2004)(hMPV)和Prinoski et al.Virus Research 22：55-69(1991)(PIV)中公开的天然存在变体的全部或部分核苷酸或氨基酸序列。例如，在某些实施方案中，RSVPreF多肽与SEQ ID NO：10有至少89％序列同一性；hMPV PreF多肽与SEQ ID NO：12有至少94％序列同一性；PIV PreF多肽与SEQ ID NO：14有至少95％序列同一性。其他变体可以来自遗传漂变，或者可能利用定点或随机突变人工制备，或者通过两个或多个已有变体的重组制备。这些额外的变体就本文公开的PreF(和PreF-G)抗原来说，也是合适的。例如，修饰可以是不会改变得到的PreF抗原的构象或免疫原性表位的一或多个氨基酸(比如2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸，最多大约10个氨基酸或者更多)的取代。

替代地或者另外地，修饰可以包括一或多个氨基酸的缺失和/或一或多个氨基酸的添加。的确，如果需要的话，一或多个多肽结构域可以是合成多肽，所述合成多肽不对应任何单一病毒株，而是包括来自多个病毒株的成分亚序列，或者甚至来自通过比对多个副粘病毒株的多肽推测的共有序列。在某些实施方案中，一或多个多肽结构域通过添加构成标签的氨基酸序列被修饰，所述标签能够协助后续的加工或纯化。所述标签可以是抗原或表位标签、酶标签或多聚组氨酸标签。标签一般位于蛋白的一端或者另一端，比如抗原或融合蛋白的C末端或N末端。

编码PREF抗原的核酸

本公开的另一个方面涉及编码以上描述的PreF抗原的重组核酸。更明确地说，所述核酸编码包含F蛋白多肽抗原的多肽，其中所述F蛋白多肽抗原包含副粘病毒F蛋白多肽的F2结构域和F1结构域，核酸所编码的多肽包含选自以下的至少一个修饰：(i)添加包含异源三聚化结构域的氨基酸序列；(ii)缺失至少一个弗林酶切割位点；(iii)缺失至少一个非弗林酶切割位点；和(iv)在F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加至少一个亲水氨基酸。任选地，这种多核苷酸编码糖基化位点带有修饰的PreF抗原。此外，对于RSV PreF抗原，修饰还可以包括缺失pep27结构域中的一或多个氨基酸。这类多肽的性质和结构细节已在上文详细公开。本领域技术人员根据本文的教导，可以容易地确定编码所述多肽中任一个和所有多肽的核苷酸序列，包括序列表中提供的示范性序列和其他方式包括在本公开的序列(例如通过引用并入的)。

在某些实施方案中，重组核酸经过密码子优化以便在选中的原核或真核宿主细胞内表达。PCT/CA2008/002277中提供了编码PreF抗原的密码子优化核酸的细节，所述核酸经密码子优化用于在哺乳动物(例如CHO)细胞中表达，所述文献通过引用并入本文。为了协助其复制和表达，可以将核酸并入载体，比如原核或真核表达载体。包含重组副粘病毒PreF抗原编码核酸的宿主细胞也是本公开的特点。适合的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，比如大肠杆菌；和大量的真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母)细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞(比如CHO、VERO和HEK293细胞)。

为了协助其复制和表达，可以将核酸并入载体，比如原核或真核表达载体。虽然本文公开的核酸可以包含到各种载体(包括例如，细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；由质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体；病毒DNA，比如痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、假狂犬病病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和许多其他病毒)中的任一种中，载体常常是适合产生多肽表达产物的表达载体。在表达载体中，编码PreF抗原的核酸通常被安排在引导mRNA合成的合适的转录调控序列(启动子和任选地一或多个增强子)的附近和同一方向。即，目标多核苷酸序列可操纵地连接着合适的转录调控序列。这类启动子的例子包括：CMV的立即早期启动子、LTR或SV40启动子、杆状病毒的多角体蛋白(polyhedron)启动子、lac或trp启动子、噬菌体T7和λP_L启动子，以及其他已知能够调控基因在原核或真核细胞或者它们的病毒中的表达的启动子。表达载体一般还含有用于起始翻译的核糖体结合位点或转录终止子。载体任选包含合适的序列以便扩增表达。此外，表达载体任选包含一或多个可选择的标记物基因从而给选择转化宿主细胞提供表现型特征，比如对于真核细胞培养物，二氢叶酸还原酶或新霉素抗性；或者在大肠杆菌中比如卡那霉素、四环素或氨苄青霉素抗性。

表达载体还可以包含其他表达元件来提高例如翻译效率。这些信号包括例如ATG起始密码子和相邻的序列。某些情况中，例如将翻译起始密码子和相关序列元件与目的多核苷酸序列(例如天然起始密码子)同时插入合适的表达载体中。这种情况中，不需要额外的翻译调控信号。但对于只插入了多肽编码序列或它的一部分的情况，要给编码PreF抗原的核酸的翻译提供外源的翻译调控信号，包括ATG起始密码子。起始密码子的放置处于正确的阅读框中以确保目的多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以来自各种来源，可以是天然的也可以是合成的。如果需要，可以通过包含适合所用细胞系统的增强子来进一步提高表达效率(Scharf et al.Results ProblCell Differ 20：125-62(1994)；Bitter et al.Methods in Enzymol 153：516-544(1987))。

某些情况中，编码PreF抗原的核酸(比如载体)包含一或多个其他序列元件，所述选中的序列元件用于提高和/或优化PreF编码核酸在导入宿主细胞时的表达。例如，在某些实施方案中，编码PreF抗原的核酸包含内含子序列，比如人疱疹病毒5内含子序列。内含子已被反复证实当它被恰当地置于重组构建体时，能够增强同源和异源核酸的表达。另一类表达增强序列包括超基因元件，比如核基质附着区(Matrix Attachment Region，或MAR)或类似的超基因元件，例如STAR元件(例如，比如Otte et al.，Biotechnol.Prog.23：801-807，2007中公开的那些STAR元件)。不受任何理论约束，MARs被认为能够介导靶DNA序列锚定到核基质上，产生从异染色质核心延伸出来的染色质环结构域。虽然MARs不含有任何明显的共有序列或可识别的序列，它们最一致的特点似乎是整体的高A/T含量，C碱基在一条链上占优势。这些区域形成弯二级结构，所述弯二级结构易于发生链分离，可能含有作为链分离成核点的核心解旋元件(CUE)。已发现与MAR序列关联的几个简单富含AT的序列基元：例如A-box、T-box、DNA解旋基序、SATB1结合位点(H-box，A/T/C25)和对于脊椎动物或果蝇的共有拓扑异构酶II位点。示范性MAR序列在已公开的美国专利申请20070178469和国际专利申请WO02/074969(文献通过引用并入本文)中有描述。可用于增强PreF抗原编码核酸的表达的其他MAR序列包括Girod et al.，Nature Methods，4：747-753，2007中描述的鸡溶菌酶MAR、MARp1-42、MARp1-6、MARp1-68和MARpx-29(分别在GenBank登录号EA423306、DI107030、DI106196、DI107561和DI106512中公开)。技术人员能够理解，可以通过选择产生中等增强水平的MAR，比如报导过的MAR 1-9来进一步调控表达。如果需要，可以例如利用诸如MAR-Finder(在futuresoft.org/MarFinder网站提供)、SMARTest(genomatix.de网站提供)或SMARScan I(Levitsky et al.，Bioinformatics 15：582-592，1999)的软件通过检索序列数据库鉴定替代的MAR序列来提高PreF抗原的表达。在某些实施方案中，MAR与PreF抗原编码序列在相同核酸(例如载体)上被导入(例如转染)宿主细胞。在替代的实施方案中，MAR被放在另外的核酸(例如反式)上导入，其任选与PreF抗原编码多核苷酸序列共整合。

足够指导本领域普通技术人员生成重组PreF抗原核酸的示范性程序可以在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3d ed.，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，1992(和2003年的补充)；以及Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology：ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，4th ed.，Wiley & Sons，1999中找到。

SEQ ID NOs：9和PCT/CA2008/002277中代表了编码PreF抗原多肽的示范性核酸。包含糖基化位点修饰的变体，例如在对应SEQ ID NO：2中位点500的氨基酸带有修饰的变体，可以通过改变(例如突变)(与例如SEQ IDNO：1的多核苷酸序列相比的)位点1408-1414附近的核苷酸来产生。编码(例如糖基化效率提高的)糖基化变体的合适核苷酸序列包括：aacgggt、aacaagt、aacggga和aacaaga。替代的序列，比如消除糖基化位点的cagcagt，也是可能的。通过将选自任何已知或随后发现的副粘病毒的类似F和G蛋白多肽序列进行组装可以产生其他变体，例如象WO2008114149中公开的，或者Boivin et al.Emerg.Infect.Dis.10：1154-1157(2004)(hMPV)和Prinoski et al.Virus Research 22：55-69(1991)(PIV)中描述的编码变体的。SEQ ID NOs：11和13分别提供了编码hMPV和PIV PreF蛋白的示范性多核苷酸序列。本领域技术人员可以制备与示范性变体有序列同一性的其他序列变体。一般来说，核酸变体编码的多肽的氨基酸残基差别不超过1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％。这就是说，所编码的多肽与SEQ ID NOs：9、11和13中的一个有至少80％、或85％，或更常见的有至少大约90％或以上，比如95％或者甚至98％或99％的序列同一性。本领域技术人员立即可以明白，编码PreF多肽的多核苷酸序列本身由于遗传密码的冗余性可能序列同一性小一些。某些情况中，相对它所来源的天然存在病毒株的氨基酸序列，PreF抗原含有一或多个氨基酸修饰(例如除了以上提到的稳定修饰)。这种不同可以分别是一或多个核苷酸或氨基酸的添加、缺失或取代。变体的差别通常不超过大约1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％的核苷酸残基。例如，与SEQ ID NO：9的示范性PreF抗原核酸相比，或者与SEQ ID NOs：11和13的示范性hMPV或PIV PreF序列的类似核酸相比，变体PreF抗原(包括PreF-G)核酸可以包含1、或2、或最多5个、或最多大约10个、或最多大约15个、或最多大约50个、或最多大约100个核苷酸的差别。因此，就RSV F或G蛋白或PreF抗原(包括PreF-G抗原)核酸而言的变体通常与SEQID NO：9、11或13所展示的PreF蛋白多肽有至少80％、或85％，更常见的是有至少大约90％或以上，比如95％或者甚至98％或99％的序列同一性。其他变体可以来自遗传漂变，或者可能利用定点或随机突变人工制备，或者通过两个或多个已有变体的重组制备。这些额外的变体就本文公开的PreF(和PreF-G)抗原来说，也是合适的。

除了先前描述的变体核酸，与SEQ ID NOs：9、11或13所代表的示范性核酸中的一或多个(和/或与SEQ ID NOs：1、3和5)杂交的核酸也可以作为编码PreF抗原的核酸使用。本领域技术人员理解，除了以上讨论的％序列同一性衡量标准，两个核酸之间序列相似性的另一个指标是相互杂交的能力。两个核酸的序列越相似，它们杂交的条件越严紧。杂交条件的严紧程度是序列依赖性的，在不同环境参数下不同。因此，造成特定严紧程度的杂交条件根据所选杂交方法和杂交核酸序列的组成及长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na⁺和/或Mg⁺⁺浓度)决定了杂交的严紧度，尽管清洗时间也会对严紧度有影响。一般选择的严紧条件比特定序列在限定离子强度和pH下的热变性温度低大约5℃-20℃。其中T_m是靶序列有50％与完全匹配的探针发生杂交时的温度(在限定离子强度和pH)。核酸杂交的条件以及严紧度计算方法可以在例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Tijssen，Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I：Theory andNucleic Acid Preparation，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Elsevier Science Ltd.，NY，NY，1993.以及Ausubel et al.ShortProtocols in Molecular Biology，4^th ed.，John Wiley & Sons，Inc.，1999中找到。

为了本公开的目的，“严紧条件”涵盖这样的条件，在所述条件下只有当杂交分子与靶序列之间的错配低于25％，杂交才会发生。“严紧条件”可以分成更具体的严紧水平以便更确切的定义。因此，用于本文“温和严紧”条件是在该条件下有25％以上序列错配的分子不发生杂交的条件；“中等严紧”条件是在该条件下有15％以上错配的分子不发生杂交的条件，“高度严紧”条件是在该条件下有10％以上错配的序列不发生杂交的条件。“超严紧”条件是在该条件下有6％以上错配的序列不发生杂交的条件。相反，在“低严紧”条件下杂交的核酸包括那些序列同一性低得多的核酸，或者只在核酸的较短亚序列有序列同一性的核酸。因此，应当明白本公开涵盖的各种核酸变体能够与SEQ ID NOs：1、3和5中的至少一个在至少编码F蛋白的F2结构域和F1结构域的部分上杂交。例如，这些核酸可以与SEQ ID NOs：9、11和/或13中的至少一个几乎全长杂交。

某些例子中，核酸经由适合在原核细胞(例如大肠杆菌细胞)中导入和表达的载体导入细胞。例如，包含编码PreF抗原的多核苷酸序列的核酸可以导入各种商品载体或专用载体，比如pET系列的表达载体(例如pET9b和pET2d)。IPTG可以诱导编码序列的表达，得到高水平的蛋白表达。编码PreF抗原的多核苷酸序列在噬菌体T7启动子的引导下被转录。替代的载体，比如包含热诱导型λpL启动子的pURV22也是合适的。

表达载体被导入(例如通过电穿孔)合适的细菌宿主。有许多合适的大肠杆菌株，可以由本领域技术人员选择(例如，Rosetta和BL21(DE3)株已被证明适用于含有PreF抗原编码多核苷酸序列的重组载体的表达)。

更典型地，编码PreF抗原的多核苷酸被引入适合在真核(例如昆虫或哺乳动物细胞)中导入和表达的表达载体。为了利于在选中的载体/宿主细胞中进行表达，这些核酸经过密码子优化。在一个示范性实施方案中，编码PreF抗原的多核苷酸序列被引入载体，比如Lonza Biologicals公司开发的pEE14载体。多肽在组成型启动子，比如立即早期CMV(巨细胞病毒)启动子的引导下表达。挑选表达所述多肽的稳定转染细胞是根据转染细胞在没有谷氨酰胺来源的情况下生长的能力进行的。被成功引入pEE14的细胞能够在没有外源谷氨酰胺的情况下生长，因为pEE14载体表达GS(谷氨酰胺合成酶)酶。选中的细胞可以经克隆扩增并对其表达所需PreF多肽进行研究。

另一个例子中，利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)，将编码PreF抗原的多核苷酸序列导入昆虫细胞。能够感染昆虫细胞的重组杆状病毒可以利用商品载体、试剂盒和/或系统来制备，比如来自BD BioScience的BDBaculoGold系统。简单来说，编码抗原的多核苷酸序列被插入到pAcSG2转移载体中。然后，宿主细胞SF9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))用pAcSG2嵌合质粒和BD BaculoGold共转染，其中所述BD BaculoGold含有杆状病毒-苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus，(AcNPV))的线性基因组DNA。转染后，pACSG2质粒和杆状病毒基因组之间发生同源重组因而产生重组病毒。在一个例子中，PreF抗原在多角体蛋白启动子(pH)的调控下表达。类似的转移载体可以利用其他启动子，比如Basic(Ba)和p10启动子来产生。类似地，可以采用替代的昆虫细胞，比如与Sf9密切相关的SF21和来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的High Five细胞系。

转染和诱导表达(根据所选的启动子和/或增强子或其他调控元件)后，表达的多肽被回收(例如纯化或富集)并复性折叠成有抗原活性的融合前构象。

生产RSV抗原性多肽的方法

本文公开的PreF抗原(包括PreF-G抗原，和适用的情况中的G抗原)利用重组蛋白表达和纯化的成熟操作过程来产生。足够指导本领域技术人员的程序可在以下参考文献中找到：Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，200；和Ausubel et al.Short Protocols in Molecular Biology，4^th ed.，JohnWiley & Sons，Inc.，999。其他具体细节在下文提供。

将编码PreF抗原(如上文所述)的重组核酸通过各种公知程序导入宿主细胞，所述程序根据选定的载体和宿主细胞，包括比如电穿孔、脂质体介导的转染(例如利用商品脂质体转染剂，比如LIPOFECTAMINE^TM2000或TRANSFECTIN^TM)、磷酸钙沉淀、感染、转染等。

因此，包含重组PreF抗原编码核酸的宿主细胞也是本公开的一个特征。适合的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，比如大肠杆菌；和无数真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母，比如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母)细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(比如CHO和HEK293细胞)。重组PreF抗原核酸例如经由载体(比如表达载体)被导入(例如转导、转化或转染)宿主细胞。正如上文描述过的，载体最一般是质粒，但这类载体也可以是例如，病毒颗粒、噬菌体等。合适的表达宿主的例子包括：细菌细胞，比如大肠杆菌、链霉菌和伤寒沙门氏菌；真菌细胞，比如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和粗糙脉孢菌；昆虫细胞，比如果蝇和草地贪夜蛾；哺乳动物细胞，比如3T3、COS、CHO、BHK、HEK 293或Bowes黑素瘤；植物细胞，包括藻细胞等。

宿主细胞可以培养在常规营养培养基中，所述培养基根据启动子的激活、挑选转化子或扩增插入的多核苷酸序列等需要进行了改进。诸如温度、pH等的培养条件一般就是以前给选中用于表达的宿主细胞使用的条件，对本领域技术人员是显而易见的，可参见本文引用的参考文献，包括例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，thirdedition，Wiley-Liss，New York和该书引用的参考文献。发明所述核酸对应的表达产物还可以在非动物细胞中产生，比如植物、酵母、真菌、细菌等。除了Sambrook、Berger和Ausubel，关于细胞培养的详细描述可以在Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg and Phillips(eds)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ  Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag (BerlinHeidelberg New York)和Atlas and Parks(eds)The Handbook of  Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL中找到。

在细菌系统中，根据表达产物的预期用途，有大量表达载体可供选择。例如，当需要大量多肽或其片段用于产生抗体时，优选采用引导高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。这类载体包括，但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，比如BLUESCRIPT(Stratagene)，该载体中目的编码序列(例如本发明以上描述的多核苷酸)可以连接到载体中序列的读框内，所述序列编码氨基端启动翻译的甲硫氨酸和随后的7个β-半乳糖苷酶残基，从而它们产生有催化活性的β-半乳糖苷酶融合蛋白；pIN载体(Van Heeke & Schuster(1989)J Biol Chem 264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison WI)，该载体中氨基端甲硫氨酸连接到组氨酸标签读框内；等等。

类似地，在酵母(比如酿酒酵母)中，含有组成型或诱导型启动子(比如α因子、乙醇氧化酶和PGH)的许多载体可以用于所选表达产物的生产。综述参见Berger，Ausubel，and，例如Grant et al.(1987；Methods in Enzymology153：516-544)。在哺乳动物宿主细胞中，许多表达系统，包括基于质粒和病毒的系统可供使用。

任选是根据宿主细胞对插入序列的表达的调控能力或者宿主细胞以预期方式加工表达蛋白的能力来进行挑选的。所述蛋白修饰包括，但不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧化、磷酸化、脂化和酰基化)。任选在宿主细胞中进行翻译后加工，例如(由弗林蛋白酶)将蛋白的前体形式切割为成熟形式。不同的宿主细胞，比如3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等有特定的细胞机器和特征性机制进行这类翻译后活动，可供选择以确保导入的外来蛋白的正确修饰和加工。

为了长期高产量地生产本文公开的重组PreF抗原，一般使用稳定表达系统。例如，cell lines which稳定表达PreF抗原多肽的细胞系利用表达载体导入宿主细胞，所述表达载体含有病毒复制原点或内源表达元件以及选择性标记基因。导入载体后，细胞在营养培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基中。选择性标记的目的是赋予抗性以便进行挑选，它的存在保证那些能够成功表达导入序列的细胞的生长和回收。例如，稳定转化细胞的抗性组或菌落可以利用适合该细胞类型的组织培养技术进行增殖。转化有PreF抗原编码核酸的宿主细胞任选培养在适合编码蛋白的表达和从培养物中回收的条件下。

在转导合适的宿主细胞系并且宿主细胞生长至合适的细胞密度后，通过适当的手段(例如温度变化或化学诱导)对所选的启动子进行诱导，细胞继续培养一段时间。任选地，培养基包含能够减少蛋白酶对表达蛋白的降解的成分和/或添加物。例如，用于培养产生PreF抗原的细胞的培养基可以包含蛋白酶抑制剂，比如螯合剂或小分子抑制剂(例如AZ11557272、AS111793等)，以便减少或消除细胞内或胞外(例如基质)不希望的蛋白酶切割。任选地，细胞培养在无血清(和/或无动物产物)培养基中。细胞可以根据目的以方便的规模生长，例如在摇瓶或生物反应器中。

然后从培养基中回收分泌的多肽产物。替代地，可以通过离心收集细胞，经物理或化学手段破碎，并保留得到的粗提取物进一步纯化。蛋白表达所采用的真核或微生物细胞可以通过任何方便的方法破碎，包括反复冻融、超声波、机械破碎或利用细胞裂解剂或本领域技术人员已知的其他方法。

表达的PreF抗原可以通过本领域已知的许多方法之一从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离心、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析(例如利用本文提到的任何一种标签系统)、羟磷灰石层析和凝集素层析。如果需要可以使用蛋白重折叠步骤来完成成熟蛋白的构型。最后，在纯化终末步骤中可以采用高效液相层析(HPLC)。除了以上提到的参考文献，许多纯化方法是本领域熟知的，包括例如下述文献中列举的：Sandana(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；和Bollag et al.(1996)Protein Methods，2 ^nd  Edition Wiley-Liss，NY；Walker(1996)The Protein Protocols  Handbook Humana Press，NJ，Harris and Angal(1990)Protein Purification  Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，U.K.；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice 3 ^rd  Edition Springer Verlag，NY；Janson and Ryden(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution  Methods and Applications，Second Edition Wiley-VCH，NY；以及Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ.。

在一个示范性实施方案中，按照以下纯化方案从细胞中回收PreF蛋白。编码PreF多肽的重组核酸被导入宿主CHO细胞后，包含被导入多核苷酸序列的瞬时转染宿主细胞或经过扩增的稳定细胞群生长在培养基中，生长条件适合细胞生长到对所需目的来说可以接受的规模(例如象Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，third edition，Wiley-Liss，New York和其中引用的参考文献中描述的)。一般来说，细胞于37℃生长在摇瓶或生物反应器中的无血清培养基中，以2-3天的间隔传代。由在这些条件下扩增的细胞建立起来的新培养物通常在生物反应器的无血清培养基中于27℃温育5-7天，pO2维持在20％，从而产生PreF抗原。

为了回收重组PreF抗原，将细胞培养物离心，细胞培养物上清液保存在零下70℃以备后用。培养物上清液融化后，上清液用MilliQ水稀释2x，并用HCl调节到pH 6.0。将稀释后的上清液以75cm/h上样到3L CM CeramicHyperD FF树脂中，所述树脂装在BPG 140/500柱子中并用20mM磷酸盐(pH6.0)平衡。上样后，平衡缓冲液流过柱子以便回到UV基线。用5个柱体积(CV)的25mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗后，用含有0.1M NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)进行洗脱。

CM Hyper D洗脱流份用20mM磷酸盐(pH 7.0)3.3x稀释，在270ml羟磷灰石II型柱子(装在XK 50中)上进行处理，用20mM PO₄(Na)缓冲液(pH7.0)以50mL/min平衡。柱子用平衡缓冲液(～3CV)洗后，用含有0.5M NaCl的20mM PO4(Na)(pH 7.0)进行洗脱。

HA洗脱流份以15mL/min(与树脂有10分钟接触时间)上样到150mLCapto Adhere柱子(装在XK 26中)上进行处理，以20mM磷酸盐(pH 7.0)平衡。用5CV含有0.1M精氨酸缓冲液的10mM磷酸盐(pH 7.0)清洗后，用含有0.6M精氨酸的10mM磷酸盐(pH 7.0)进行洗脱。

然后将Capto Adhere洗脱流份浓缩大约10x以便在制备性大小排阻层析(SEC)柱上处理。浓缩用50kD Pellicon聚醚砜膜进行。在SEC柱子上处理之前，材料经PLANOVA 20N 100cm²滤器过滤，作为病毒清除步骤。该纳米过滤步骤可以安排在Pellicon膜浓缩之前或者之后进行。

然后用500mL Superdex S200柱子进行制备SEC，10mM磷酸盐(Na/K₂)、160mM NaCl(pH 6.5)缓冲液(对应最终缓冲液)作为流动相。将等同5％SEC柱体积的浓缩PreF以～2.6mL/min上样到树脂中。通常收集10mL流份。如果需要，汇集在一起的流份通过银染和抗HCP(宿主细胞蛋白)Western印迹在SDS胶上分析以便优化产量同时减少HCP水平。

在0.22μm Millex滤器(替代地可以使用Sterivex滤器)上过滤后获得纯化的批次。如果需要，纯化的PreF抗原制品在使用前可以保存在-70℃。

替代地，PreF蛋白可以包含多聚组氨酸(例如6组氨酸)标签，所述标签可以用于协助纯化。对于这种带组氨酸标签的PreF多肽，可以采用以下纯化方案。在用固定化金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化之前，细胞培养物上清液在缓冲液A(20mm Bicine，pH8.5)中稀释两倍，pH调节至8.5。得到的溶液上样到已用缓冲液A平衡好的柱体积23ml的Q sepharose FF柱子(GEHealthcare)上。PreF蛋白与某些宿主细胞杂质一起被捕获到柱子上。可能对IMAC纯化步骤造成干扰的培养基成分没有滞留，而是消除到穿流液中。蛋白通过200mM、400mM、600mM、800mM和1M NaCl逐步洗脱被分开和洗脱。目的PreF蛋白在200mM NaCl的第一个步骤中洗脱。任选地，利用SDS PAGE和Western印迹(用抗His标签的抗体检测带标签的PreF蛋白)可以监测蛋白回收情况。在继续进行纯化前可以将流份汇集。

(汇集的)含PreF蛋白的洗脱流份在缓冲液B(20mM Bicine、500mMNaCl、pH8.3)中稀释3倍，pH被调节到8.3。得到的溶液上样到加载氯化镍(GE Healthcare)的例如柱体积5ml的已用缓冲液B平衡好的IMACsepharose FF树脂上。PreF结合到树脂上，大部分宿主细胞杂质被洗脱到穿流液中。柱子用20mM咪唑清洗以便除去弱结合的杂质。PreF蛋白经250mM咪唑一步洗脱。可以进行用考马斯亮蓝染色的SDS PAGE和抗His标签Western印迹来鉴定阳性流份。

由IMAC得到的集合然后可以利用Centricon浓缩装置(Millipore)浓缩到至少150μg/ml的浓度，蛋白在补充有500mM L-精氨酸的PBS缓冲液中透析。得到的蛋白用RCDC蛋白检测法(BioRad)定量，并保存在-70或-80℃待用。

免疫原性组合物和方法

本文公开的PreF抗原可用于配制免疫原性组合物，特别是那些包含来自至少两种不同副粘病毒的抗原的组合的免疫原性组合物，其中所述副粘病毒是导致婴儿中呼吸道疾病，包括严重下呼吸道疾病的重要原因。通常，这类免疫原性组合物包含至少两种副粘病毒和药物可接受载体或赋形剂。例如，在某些实施方案中，免疫原性组合物包含hMPV抗原和PIV抗原，比如PIV-3抗原或PIV-1抗原。在其他实施方案中，免疫原性组合物包含RSV抗原和hMPV抗原或者PIV抗原(例如PIV-3抗原或PIV-1抗原)。在其他实施方案中，免疫原性组合物包含三种抗原。例如，在某些实施方案中，免疫原性组合物包含hMPV抗原、PIV抗原和RSV抗原(例如，hMPV抗原、PIV-3抗原和RSV抗原)。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含hMPV抗原和两种不同PIV抗原(比如PIV-3抗原和PIV-1抗原)。这些组合物任选还包含RSV抗原。优选如本文公开的，抗原是副粘病毒PreF抗原。

在某些实施方案中，免疫原性组合物是减少或防止hMPV、PIV(例如PIV-3)和RSV中至少两种引起的感染的疫苗。某些实施方案中，免疫原性组合物是减少或防止感染hMPV、PIV(例如PIV-3)和RSV中至少两种后的病理学反应的疫苗。任选地，含有选自不同副粘病毒(例如选自hMPV、PIV和RSV)的至少两种PreF抗原的免疫原性组合物与不同病原病毒的至少一种其他抗原一起成剂。例如，病原生物体可以是副粘病毒的另一个株(例如第一个PIV株是PIV-3的情况，另一个是PIV-1)，或者可以是副粘病毒之外的呼吸道病毒病原体，比如流感病毒。在其他实施方案中，选择其他抗原来协助给药或者减少保护受试对象抵抗多种传染性生物体所需的接种次数。例如，抗原可以来源于流感病毒、乙肝病毒、白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎病毒、链球菌或肺炎球菌等中的一种或多种。

在某些实施方案中，通常即PreF抗原不包含G蛋白成分的实施方案中，可以用一或多种分离的重组和/或纯化副粘病毒G蛋白配制免疫原性组合物。现有技术已描述过许多合适的G蛋白，包括全长重组G蛋白，和由G蛋白的一部分(比如氨基酸128-229或130-230)和融合伙伴(比如硫氧还蛋白)或者信号和/或前导序列(协助表达和/或纯化)组成的嵌合蛋白。与PreF抗原混合使用的示范性RSV G蛋白可以在PCT/CA2008/002277、WO2008114149、美国专利5,149,650、美国专利6,113,911、美国已公开申请20080300382和美国专利7,368,537中找到，这些文献均通过引用并入本文。

药物可接受载体和赋形剂是公知的，可以由本领域技术人员选择。例如，载体或赋形剂可以有利地包含缓冲液。任选地，载体或赋形剂还含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的成分。助溶/稳定剂的例子包括去污剂，例如月桂肌氨酸和/或Tween。替代的助溶/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成多元醇(比如蔗糖、海藻糖等)。大量药物可接受载体和/或药物可接受赋形剂是本领域已知的，在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，by E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，5th Edition(975)中有描述。

相应地，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体来制备适合通过所选给药途径递送给受试对象的制剂。

合适的赋形剂包括，但不限于：甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污的甜菜碱磺酸、盐酸胍、脲、氧化三甲胺、KCl、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和其他二价阳离子相关盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇和β-巯基乙醇。其他赋形剂可以是去污剂(包括：Tween80、Tween20、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基葡萄糖苷、月桂酰麦芽糖苷、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-0、Zwittergent 3-2、Zwittergent3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲胺)。

任选地，免疫原性组合物还包含佐剂。就适合给予受试对象以便引发抗RSV的保护性免疫反应的免疫原性组合物而言，挑选佐剂以引发Th1型免疫反应。

通常挑选佐剂以便增强被给予组合物的受试对象或受试对象群体中的Th1型免疫反应。例如，当免疫原性组合物是要给予对RSV感染易感(或风险增加)的特定年龄组受试对象时，要挑选在受试对象或受试对象群体中安全并有效的佐剂。因此，当配制含有RSV PreF抗原的免疫原性组合物用于老年受试对象(比如年龄超过65的受试对象)给药时，挑选在老年受试对象中安全有效的佐剂。类似地，当含有PreF抗原的免疫原性组合物是要给予新生儿或婴儿受试对象(比如出生到两岁的受试对象)时，挑选在新生儿和婴儿中安全有效的佐剂。

此外，一般挑选经免疫原性组合物给药途径给予时能够增强Th1免疫反应的佐剂。例如，当配制用于经鼻给药的含有PreF抗原的免疫原性组合物时，蛋白酶体和protollin是合适的Th1偏向型佐剂。相反，当免疫原性组合物配制用于肌内给药时，适合挑选包含3D-MPL、角鲨烯(例如QS21)、脂质体、和/或油和水乳剂中的一种或多种的佐剂。

适合与PreF抗原组合使用的一种佐剂是无毒的细菌脂多糖衍生物。合适的脂质A无毒衍生物的例子是单磷酰脂质A或更具体地说是3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以MPL的名字销售，在文件中称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进有IFN-γ(Th1)表现型的CD4+T细胞反应。3D-MPL可以根据GB2220211A中公开的方法生产。从化学上来说，它是带有3、4、5或6个酰基化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL的颗粒大小使它能够经0.22μm滤器过滤除菌。WO94/21292中描述了这种制剂。

脂多糖，比如3D-MPL，每个人类剂量的免疫原性组合物中可以使用1-50μg。这种3D-MPL可以按大约25μg的水平使用，例如20-30μg之间，合适的是21-29μg之间或22-28μg之间或23-27μg之间或24-26μg之间，或者25μg。另一个实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含大约10μg水平的3D-MPL，例如5-15μg之间，合适的是6-14μg之间，例如7-13μg之间或8-12μg之间或9-11μg之间，或者10μg。再一个实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含大约5μg水平的3D-MPL，例如1-9μg之间，或2-8μg之间，或者合适的是3-7μg之间或4和μg之间，或者5μg。

在其他实施方案中，脂多糖可以是如美国专利6,005,099和欧洲专利0729 473 B1中描述的(1-6)葡萄糖胺二糖。本领域技术人员根据这些文献中的教导，很容易制备出各种脂多糖，比如3D-MPL。这些文献均通过引用并入本文。除了以上提到的免疫刺激剂(与LPS或MPL或3D-MPL结构相似的)，是以上MPL结构一部分的酰基化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其他实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中的某些被描述为TLR-4激动剂，包括但不限于：OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰氧四环-癸酰氨]-4-o-磷酸基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰氨]-α-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯/盐)，(WO 95/14026)；OM 294 DP(3S，9R)-3--[(R)-十二酰氧十四酰氨]-4-氧-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰氨]癸烷-1，10-二醇1，10-双(二氢磷酸酯)(WO 99/64301和WO 00/0462)；和OM 197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二酰氧十四酰氨]-4-氧-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸盐10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)。

其他可以使用的TLR4配体是烷基葡萄糖胺磷酸酯(AGPs)，比如WO98/50399或美国专利6,303,347(还公开了AGPs的制备过程)中公开的那些，合适的是RC527或RC529或者美国专利6,764,840中公开的AGPs的药物可接受盐。某些AGPs是TLR4激动剂，某些是TLR4拮抗剂。两种都被认为可以作为佐剂使用。

其他能够经由TLR-4引起信号传导反应(Sabroe et al，JI 2003 p1630-5)的合适的TLR-4配体是例如，来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物或者它们的片段，特别是LPS的无毒衍生物(比如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是：热震惊蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白A、透明质酸寡糖、硫酸肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防御素-2以及胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP 60、70或90。其他合适的TLR-4配体在WO 2003/011223和WO 2003/099195中有描述，比如WO2003/011223的4-5页或者WO2003/099195的3-4页公开的化合物I、化合物II和化合物III，特别是WO2003/011223中公开为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764的那些化合物。例如一个合适的TLR-4配体是ER804057。

其他TLR激动剂也可以作为佐剂使用。术语“TLR激动剂”是指这样的试剂，所述试剂能够直接作为配体或者通过产生内源或外源配体间接引起经由TLR信号传导途径的信号传导反应。这些天然或合成TLR激动剂可以作为替代的或额外的佐剂使用。Kaisho & Akira，Biochimica et Biophysica Acta1589：1-13，2002中提供了TLRs作为佐剂受体的简短综述。这些潜在的佐剂包括，但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。相应地，在一个实施方案中，佐剂和免疫原性组合物还包含选自TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂或它们的组合的佐剂。

在本发明的一个实施方案中，使用了能够经由TLR-1引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-1引起信号传导反应的合适的TLR激动剂选自：三酰基化脂肽(LPs)；酚溶性modulin；结核分枝杆菌LP；模拟细菌脂蛋白乙酰化氨基端的S-(2，3-双(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸(Pam3Cys)LP；和来自伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的OspA LP。

在替代的实施方案中，使用了能够经由TLR-2引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-2引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是来自结核分枝杆菌、伯氏疏螺旋体或苍白螺旋体的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌的种的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、细菌纤毛、耶尔森氏菌毒力因子、CMV毒粒、麻疹病毒血凝素以及来自酵母的酵母聚糖中的一种或多种。

在替代的实施方案中，使用了能够经由TLR-3引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-3引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)或聚肌胞苷酸(Poly IC)，后者是与病毒感染关联的分子核酸形式。

在替代的实施方案中，使用了能够经由TLR-5引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-5引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。

在替代的实施方案中，使用了能够经由TLR-6引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-6引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白、二酰基化LP和酚溶性modulin。其他TLR6激动剂在WO2003/043572中有描述。

在替代的实施方案中，使用了能够经由TLR-7引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-7引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(loxoribine，位点N7和C8的鸟嘌呤核苷类似物)或咪唑喹啉化合物或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。其他TLR7激动剂在WO 2002/085905中有描述。

在替代的实施方案中，使用了能够经由TLR-8引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-8引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如雷西莫特(resiquimod，R848)。雷西莫特也能被TLR-7识别。其他可以使用的TLR-8激动剂包括WO 2004/071459中描述的那些。

在替代的实施方案中，使用了能够经由TLR-9引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-9引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是HSP90。替代地，能够经由TLR-9引起信号传导反应的TLR激动剂是细菌或病毒DNA，含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，在特定序列语境中被称为CpG基序。含有CpG的寡核苷酸诱发占优势的Th1反应。这些寡核苷酸是公知的，在例如WO 96/02555、WO 99/33488以及美国专利6,008,200和5,856,462中有描述。合适的CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。用于本发明的免疫原性组合物中的合适寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任选含有被至少3个，合适的是至少6个或更多个核苷酸隔开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和后面的鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键合是二硫代磷酸酯，或者合适的是硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其他核苷酸间键也在发明的范围内。还包含在本发明范围内的是带有混合的核苷酸间键合的寡核苷酸。生产硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美国专利5,666,153、5,278,302和WO 95/26204中有描述。

可以与PreF抗原一起用于免疫原性组合物的其他佐剂，例如单独或者与3D-MPL或本文描述的另一种佐剂组合使用的佐剂是皂苷，比如QS21。

Lacaille-Dubois，M and Wagner H.(1996.A review of the biological andpharmacological activities of saponins.Phytomedicine vol 2pp 363-386)提供了关于皂苷的教导。皂苷是广泛分布在植物和海洋动物界的类固醇或三萜甙。皂苷的特点是在水中形成摇动时发泡的胶态溶液和沉淀胆固醇。当皂苷靠近细胞膜时，它们能够在膜上产生孔样结构导致膜破裂。红细胞的溶血即是该现象的一个例子，这是某些但并非全部皂苷的属性。

皂苷已知可以作为用于系统给药的疫苗中的佐剂。各种皂苷的佐剂和溶血活性已有广泛研究(Lacaille-Dubois and Wagner，同前)。例如，Quil A(来源于的树皮南美树种莫利那肥皂草皂树(Quillaja Saponaria Molina))及其组分在US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev TherDrug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；以及EP 0 362 279B1中有描述。包含QuilA部分的颗粒结构，被称为免疫刺激复合物(Immune StimulatingComplexes，ISCOMS)是溶血性的，已被用于疫苗制备(Morein，B.，EP 0 109942 B1；WO 96/11711；WO 96/33739)。溶血皂苷QS21和QS17(HPLC纯化的Quil A组分)被描述为强力的系统佐剂，它们的生产方法在美国专利.5,057,540和EP 0 362 279 B1中公开，所述专利通过引用并入本文。被用于系统疫苗接种研究的其他皂苷包括来源于其他植物物种，比如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的皂苷(Bomford et al.，Vaccine，10(9)：572-577，1992)。

QS21是来源于莫利那肥皂草皂树皮的HPLC纯化的无毒组分。美国专利5,057,540中公开了生产QS21A的方法。含有QS21的非反应性佐剂配方在WO 96/33739中有描述。以上提到的文献通过引用并入本文。所述免疫活性皂苷，比如QS21，每个免疫原性组合物人类剂量中可以按照1到50μg之间的量使用。有益的是QS21以大约25μg的水平使用，例如20-30μg之间，合适的是21-29μg之间或22-28μg之间或23-27μg之间或24-26μg之间，或者是25μg。另一个实施方案中，免疫原性组合物的人类剂量中包含大约10μg水平的QS21，例如5和15μg之间，合适的是6-14μg之间，例如7-13μg之间或8-12μg之间或9-11μg之间，或者是10μg。再一个实施方案中，免疫原性组合物的人类剂量中包含大约5μg水平的QS21，例如1-9μg之间或2-8μg之间，或者合适的是3-7μg或4-6μg之间，或者是5μg。这种包含QS21和胆固醇的制剂已被证实当与抗原一起成剂时是成功的Th1刺激佐剂。因此，例如，PreF多肽适合与包含QS21和胆固醇组合的佐剂一起用于免疫原性组合物中。

任选地，佐剂还可以包含矿物盐，比如铝或钙盐，特别是氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。例如，含有3D-MPL和铝盐(例如氢氧化铝或“明矾”)联用的佐剂适合用于配制给予人受试对象的含有PreF抗原的免疫原性组合物。

另一类适合用于含PreF抗原的制剂的Th1型佐剂包括基于OMP的免疫刺激组合物。基于OMP的免疫刺激组合物尤其适合作为粘膜佐剂，例如用于鼻内给药。基于OMP的免疫刺激组合物是一类来自革兰氏阴性细菌(包括，但不限于奈瑟氏菌)的外膜蛋白(OMPs，包括某些孔蛋白)制品(参见例如Lowell et al.，J.Exp.Med.167：658，1988；Lowell et al.，Science 240：800，1988；Lynch et al.，Biophys.J.45：104，1984；Lowell，in″New Generation Vaccines″2nd ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，Basil，Hong Kong，page 193，1997；美国专利5,726,292；美国专利4,707,543)，可以作为载体来用或用在免疫原(比如细菌或病毒抗原)组合物中。某些基于OMP的免疫刺激组合物可以称为“蛋白体(Proteosomes)”，它们是疏水的并且人使用是安全的。所述蛋白体有能力自动组装成大约20nm到大约800nm的囊泡或囊泡样OMP簇，并与蛋白抗原(Ags)，特别是含有疏水部分的抗原非共价地合并、协作、关联(例如静电地或者疏水地)，或以其他方式合作。任何产生处于囊泡或囊泡样形式中的外膜蛋白成分的制备方法，包括多分子膜结构或者一或多个OMPs构成的熔融球状OM组合物，都包含在蛋白体的定义中。蛋白体可以按照现有技术的描述制备，例如(参见例如美国专利5,726,292或美国专利5,985,284)。蛋白体还可以含有来自制备OMP孔蛋白的细菌(例如奈瑟氏菌)的脂多糖或脂肪寡糖(分别是LPS或LOS)，其中脂多糖或脂肪寡糖只占整个OMP制品的2％以下。

蛋白体主要由化学提取的脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白(OMPs)(主要是孔蛋白A和B以及4型OMP)组成，利用去污剂保持在溶液中(Lowell GH.Proteosomes for Improved Nasal，Oral，or Injectable Vaccines.In：Levine MM，Woodrow GC，Kaper JB，Cobon GS，eds，New Generation Vaccines.New York：Marcel Dekker，Inc.1997；193-206)。蛋白体可以与多种抗原通过例如渗滤或常规透析过程成剂，所述抗原是例如来自病毒来源的纯化或重组蛋白，包括本文公开的PreF多肽。逐步去除去污剂使得形成直径大约100-200nm的颗粒状疏水复合物(Lowell GH.Proteosomes for Improved Nasal，Oral，orInjectable Vaccines.In：Levine MM，Woodrow GC，Kaper JB，Cobon GS，eds，New Generation Vaccines.New York：Marcel Dekker，Inc.1997；193-206)。

″蛋白体：LPS或Protollin″用于本文是指混合蛋白体的制备，例如通过外源添加至少一种脂多糖来提供OMP-LPS组合物(可以作为免疫刺激组合物)。因此OMP-LPS组合物可以由Protollin的两种基本成分组成，所述组合物包含(1)由革兰氏阴性菌，比如脑膜炎奈瑟氏菌制备的蛋白体的外膜蛋白制品(例如Projuvant)，和(2)一或多种脂多糖的制品。脂肪寡糖可以是内源的(例如OMP蛋白体制品天然含有的)，可以与来自外源制备的脂肪寡糖(例如由与OMP制品来源不同的培养物或微生物制备的)的OMP制品混合或组合，或者可以是它们的组合。这些外源加入的LPS可以与OMP制品来自相同的革兰氏阴性细菌，或者来自不同的革兰氏阴性细菌。Protollin也应被理解为任选包含脂质、糖脂、糖蛋白、小分子等，以及它们的组合。Protollin可以按照例如美国专利申请公开2003/0044425中描述的进行制备。

不同佐剂，比如以上提到的佐剂的组合，也可以用于含有PreF抗原的组合物。例如，正如已经提到的，QS21可以与3D-MPL一起成剂。QS21∶3D-MPL的比率一般在1∶10到10∶1的水平；比如1∶5到5∶1，常常基本是1∶1。通常，比率在2.5∶1到1∶1 3D-MPL∶QS21的范围内。另一个组合佐剂制品包含3D-MPL和铝盐，比如氢氧化铝。当组合配制时，这种组合可以增强抗原特异性Th1免疫反应。

某些情况中，佐剂制品包含水包油乳剂，或者比如钙或铝盐(例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝)的矿物质盐。

某些实施方案中，佐剂包含油和水乳剂，例如水包油乳剂。水包油乳剂的一个例子是在水性载体中包含可代谢油，比如角鲨烯；母育酚(tocol)，比如生育酚，例如α-生育酚；和表面活性剂，比如山梨醇三油酸酯(Span 85^TM)或聚环氧乙烷山梨醇单油酸酯(Tween 80^TM)。在某些实施方案中，水包油乳剂不含有任何其他免疫刺激剂(特别是不含有无毒脂质A衍生物，比如3D-MPL；或皂苷，比如QS21)。水性载体可以是例如磷酸盐缓冲液。此外，水包油乳剂可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。

本发明的另一个实施方案中，提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含抗原或抗原组合物和包含水包油乳剂的佐剂组合物以及任选的一或多种其他免疫刺激剂，其中所述水包油乳剂包含0.5-10mg可代谢油(合适的有角鲨烯)、0.5-11mg母育酚(合适的有生育酚，比如α-生育酚)和0.4-4mg乳化剂。

在一个特定实施方案中，佐剂制品包含制备成乳剂，比如水包油乳剂形式的3D-MPL。某些情况中，乳剂颗粒的直径大小低于0.2μm，如WO94/21292中公开的。例如，3D-MPL颗粒小到可以经0.22μm膜过滤除菌(如欧洲专利0 689 454中描述的)。替代地，3D-MPL可以制备成脂质体制剂。任选地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐剂还包含其他免疫刺激成分。

选择的佐剂在免疫原性组合物要给予的群体中是安全有效的。对于成年和老年群体，制剂含有的佐剂成分通常比婴儿制剂中的多。在使用水包油乳剂的特定制剂中，所述乳剂可以包含其他成分，例如比如胆固醇、角鲨烯、α-生育酚；和/或去污剂，比如Tween 80或Span85。在示范性制剂中，这些成分存在的量如下：大约1-50mg胆固醇、2-10％角鲨烯、2-10％α-生育酚和0.3-3％Tween 80。一般来说，角鲨烯∶α-生育酚的比率等于或小于1，这样能够提供更稳定的乳剂。某些情况中，制剂还可以含有稳定剂。

例如，当配制含有PreF多肽抗原的免疫原性组合物用于给予婴儿时，佐剂的剂量确定在婴儿受试对象中是有效并且相对没有反应性的。通常，婴儿制剂中的佐剂剂量比为成年人(例如65岁及以上的成年人)设计的制剂中使用的量少。通常，婴儿制剂中的佐剂剂量比为成年人(例如65岁及以上的成年人)设计的制剂中使用的量少(例如剂量可能是给予成年人的制剂中提供的剂量的一部分)。例如，3D-MPL的量通常在每剂1μg-200μg的范围，比如10-100μg或者10μg-50μg。婴儿剂量一般在该范围的较低一端，例如大约1μg-大约50μg，比如从大约2μg，或大约5μg，或大约10μg到大约25μg或大约50μg。通常，对于制剂中使用QS21的情况，范围是相当的(并且符合以上指出的比率)。对于油和水乳剂(例如水包油乳剂)的情况，提供给儿童或婴儿的佐剂剂量可以是给予成年人受试对象的剂量的一部分。存在明矾，例如与3D-MPL组合使用的情况中，用量通常在每剂大约100μg-1mg之间，比如大约100μg，或大约200μg到大约750μg，比如大约500μg。

免疫原性组合物一般含有免疫保护量(或其分剂量)的抗原，并且可以通过常规技术制备。免疫原性组合物，包括要给予人受试对象的那些，其制备概括描述于Pharmaceutical Biotechnology，Vol.61 Vaccine Design-the subunitand adjuvant approach，edited by Powell and Newman，Plenurn Press，1995和New Trends and Developments in Vaccines，edited by Voller et al.，UniversityPark Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。在脂质体内的包封由例如Fullerton(美国专利4,235,877)描述过。蛋白与大分子的偶联在Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757中有公开。

一般来说，每剂免疫原性组合物中的蛋白量选择能够在典型受试对象中诱发免疫保护反应，但没有明显有害副作用的量。这一语境下的免疫保护不一定意味着完全抗感染；它意味着抗某些症状或疾病，特别是抗与病毒关联的严重疾病的保护作用。根据所采用的具体免疫原，抗原的量可能不同。通常，每个人类剂量可以预期包含1-1000μg蛋白，比如大约1μg-大约100μg，例如，大约1μg-大约50μg，比如大约1μg、大约2μg、大约5μg、大约10μg、大约15μg、大约20μg、大约25μg、大约30μg、大约40μg或大约50μg。免疫原性组合物中使用的量根据受试对象群体(例如婴儿或老年人)来选择。通过标准研究，包括观察受试对象中的抗体效价和其他反应，可以给特定组合物确定最佳用量。在接受初始疫苗接种后，受试对象可以在大约4周后接受加强剂。

应当指出，无论选择何种佐剂，其在最终制剂中的浓度经计算对目标群体是安全有效的。例如，用于在人中引发抗副粘病毒(例如RSV、hMPV和PIV)的免疫反应的免疫原性组合物适合给予婴儿(例如从出生到1岁的婴儿，比如首次给药时年龄为0-6个月)。引发抗副粘病毒(例如RSV、hMPV和PIV)的免疫反应的免疫原性组合物也适合给予老年人(例如单独，或者与流感抗原和/或其他COPD相关病原体的抗原联合给药)。可以理解，这些不同应用中可以选择不同佐剂，每种情况的最佳佐剂和浓度可以由本领域技术人员根据经验决定。

相应地，PreF抗原或其编码核酸在制备药物中的用途也是本公开的特征之一，其中所述药物用于(之后治疗性地或者之前预防性地)治疗接触或感染了hMPV、PIV和RSV中的两种或多种。类似地，在受试对象中引发抗hMPV、PIV和/或RSV的免疫反应的方法也是本公开的特征之一。所述方法包括将免疫有效量的包含PreF抗原的组合物给予受试对象，比如人受试对象。组合物常常包含引发Th1型免疫反应的佐剂。组合物被配制用于引发对hMPV、PIV和/或RSV特异的免疫反应，而不会在接触这些病原体中任何一种后加重病毒疾病。这就是说，组合物被配制并且导致Th1型免疫反应，该免疫反应减少或预防hMPV、PIV和/或RSV的感染，和/或减少或预防感染这些副粘病毒后的病理反应。虽然组合物可以通过多种不同途径进行给药，最经常地，免疫原性组合物经由肌内或鼻内给药途径递送。

免疫原性组合物通常含有免疫保护量(或其分剂量)的抗原，可以通过常规技术制备。免疫原性组合物，包括要给予人受试对象的免疫原性组合物的制备在Pharmaceutical Biotechnology，Vol.61 Vaccine Design-the subunit andadjuvant approach，edited by Powell and Newman，Plenurn Press，1995和NewTrends and Developments in Vaccines，edited by Voller et al.，University ParkPress，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中有概括描述。在脂质体内的包封由例如Fullerton(美国专利4,235,877)描述过。蛋白与大分子的偶联在Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757中有公开。

一般来说，每剂免疫原性组合物中的蛋白量选择能够在典型受试对象中诱发免疫保护反应，但没有明显有害副作用的量。这一语境下的免疫保护不一定意味着完全抗感染；它意味着抗某些症状或疾病，特别是抗与病毒关联的严重疾病的保护作用。根据所采用的具体免疫原，抗原的量可能不同。通常，每个人类剂量可以预期包含1-1000μg蛋白，比如大约1μg-大约100μg，例如，大约1μg-大约50μg，比如大约1μg、大约2μg、大约5μg、大约10μg、大约15μg、大约20μg、大约25μg、大约30μg、大约40μg或大约50μg。免疫原性组合物中使用的量根据受试对象群体(例如婴儿或老年人)来选择。通过标准研究，包括观察受试对象中的抗体效价和其他反应，可以给特定组合物确定最佳用量。在接受初始疫苗接种后，受试对象可以在大约4-12周后接受加强剂。例如，在将含有PreF抗原的免疫原性组合物给予婴儿个体时，初始和后续的接种可以与同时期要给予的其他疫苗一起给予。

以下实施例仅供阐明某些特征和/或实施方案。这些实施例不应被理解为使发明限于所描述的特征或实施方案。

实施例

实施例1：示范性PreF抗原

呼吸道合胞病毒

在RSV F蛋白的基础上按照PCT/CA2008/002277中的公开制备了示范性副粘病毒PreF抗原，为了所有目的，将该专利申请并入本文。基于这样一个预测，即针对RSV F蛋白的融合前构象产生的免疫反应所优先包含的抗体能够防止参与膜融合的结合、构象转换和/或其他事件，从而提高了保护性反应的效力，因此为了将RSV F蛋白稳定在它的融合前构象，对蛋白进行了修饰。

图1A和B示意了RSV F0和示范性PreF重组抗原的特性。图1A代表了RSV F0蛋白。F0是由574个氨基酸组成的前蛋白。F0前蛋白在翻译后被蛋白水解加工和糖基化。信号肽(后来被信号肽酶去除)将F0前蛋白的翻译定靶到内质网(RE)上。RE中的新生肽然后在多个位点(以三角形代表)被N-糖基化。弗林蛋白酶对F0的切割产生F2和F1肽结构域，它们折叠并一起组装成F2-F1异质二聚体的三聚体(即，3份F2-F1)。在天然状态下，F蛋白通过其C端区域内的跨膜螺旋锚定在膜上。F0多肽的其他特性包括15个半胱氨酸、4个已被研究的中和表位、2个卷曲螺旋区和脂化基序。图1B显示了示范性PreF抗原的特性。为了构建PreF抗原，对F0多肽进行了修饰以便稳定F蛋白的融合前构象，从而保留F蛋白的优势免疫原表位，所述优势免疫原表位即是RSV病毒在与宿主细胞结合并融合前呈递的表位。相对F0多肽，向PreF抗原中引入了以下稳定突变。首先，在F0多肽胞外结构域的C末端放置一个稳定卷曲螺旋结构域来代替F0的膜锚定结构域。其次，去除pep27肽(在天然蛋白中位于F2和F1结构域之间)。第三，将两个弗林蛋白酶基序都除去。在替代的实施方案(命名为PreF_V1和PreF_V2)中，给C端结构域添加了RSV G蛋白的免疫活性部分(例如氨基酸149-229)。SEQID NO：10代表示范性RSV PreF抗原的序列。

正如PCT/CA2008/0022777中详细公开的，示范性PreF抗原被证实引发对RSV特异的强劲免疫反应。图6A和B展示了特征性IgG和中和抗体反应。图7展示了给予示范性PreF抗原所带来的抗RSV感染的保护作用。

人间质肺炎病毒(hMPV)和副流感病毒3(PIV-3)

制备了对应hMPV和PIV-3融合蛋白的其他PreF抗原。SEQ ID NOs：12和14分别代表这些PreF多肽的序列。正如RSV PreF抗原显示的，hMPV和PIV-3 PreF多肽在溶液中自组装成三聚体。

为了证实hMPV和PIV-3 PreF多肽的免疫原性以及它们适合作为抗原用于预防副粘病毒感染的组合疫苗，用包含单独一种，或者两种或三种组合的PreF多肽的免疫原性组合物免疫小鼠，如表1所示。

表1：免疫接种方案：RSV、hMPV、PIV-3组合组合物

通过ELISA确定各个血清样品的抗原特异性IgG抗体效价。简单来说，3套96孔板每个用来自RSV、hMPV或PIV(0.5μg)蛋白的一种preF包埋，于4℃温育过夜。血清样品在封闭缓冲液中从1∶200开始制备梯度稀释液，于室温温育2小时。结合的抗体用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Sigma，ON)检测。3，3A，5，5A-四甲基联苯胺(TMB，BD Opt EIATM，BDBiosciences，ON)用作HRP的底物。每孔中加入50μl 1M H₂SO₄以终止反应。用Molecular Devices微量培养板阅读仪(Molecular Devices，USA)检测450nm每孔的吸收值。结果表达为几何平均效价(GMT+/-95％CL)。说明性结果如图8A所示。

ELISA检测表明所有三种PreF抗原，单独或者两种和三种组合时均引发明显的IgG抗体效价。

高效价中和抗体的存在已被证实与抗副粘病毒感染的保护作用相关。为了展示PreF多肽能够引发保护性免疫反应，评估了来自三价、二价和单价-AS03免疫小鼠的血清抗病毒的中和潜力。检测中和抗体的分析法基于TCID₅₀方法。

在96孔板中，将来自各个免疫过的动物的血清在培养基(20μl/孔)中从1∶16的稀释度开始梯度稀释。对照孔只含有培养基或病毒特异抗体。病毒滴定在中和分析法之前进行。不同病毒之间的校准基于对Vero细胞的感染性。培养板中加入20ul/孔病毒储液(效价如下)。

RSV→2.67x10⁷TCID₅₀/ml

hMPV→2.81x10⁷TCID₅₀/ml

PIV-3→2.11x10⁹TCID₅₀/ml

培养板于33℃温育20分钟，将混合液转移到已接种1x10⁵细胞/mLVero细胞的96孔平底培养板中。33℃(5％CO₂)温育4天后，移去上清液；用PBS清洗培养板，附着的细胞用溶于PBS的1％低聚甲醛固定1小时。通过间接免疫荧光(RSV；hMPV)或细胞病变效应(PIV-3)监测感染。

利用Spearman-Karber(SK)方法计算50％组织培养感染量(TCID50)，NI百分比计算如下：

Neut效价(0ug/ml抑制剂)-Neut效价(25μg/ml抑制剂)X100

Neut效价(0μg/ml抑制剂)

如图8B所示，所有PreF抗原，无论单独还是组合使用均引发了能够抑制病毒复制的特异性中和抗体。

Claims (63)

1.免疫原性组合物，其包含至少两种选自人间质肺炎病毒(hMPV)、副流感病毒3(PIV-3)和呼吸道合胞病毒(RSV)的副粘病毒F蛋白抗原。

2.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述至少两种副粘病毒F蛋白抗原各包含含有副粘病毒F蛋白多肽的F₂结构域和F₁结构域的F蛋白多肽，其中所述F蛋白多肽缺少跨膜结构域并且包含异源三聚化结构域。

3.权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述至少两种副粘病毒F蛋白抗原是重组F蛋白多肽。

4.权利要求2或3所述的免疫原性组合物，其中所述异源三聚化结构域位于F₁结构域的C端。

5.权利要求1-4中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含F2结构域和F1结构域，而没有中间的弗林酶切割位点。

6.权利要求1-5中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含F2结构域和F1结构域之间的完整融合肽。

7.权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含至少一个选自下述的修饰：

(a)缺失至少一个酶切位点；

(b)在F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加至少一个亲水氨基酸；和

(c)氨基酸取代，其能改变糖基化。

8.权利要求1-7中任一项所述的免疫原性组合物，其中F蛋白多肽组装成三聚体。

9.权利要求1-8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述至少两种副粘病毒F蛋白抗原包含人呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白抗原，并包含人间质肺炎病毒(hMPV)F蛋白抗原和副流感病毒3(PIV-3)F蛋白抗原中的至少一种。

10.权利要求1-8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述至少两种副粘病毒F蛋白抗原包含人间质肺炎病毒(hMPV)F蛋白抗原和副流感病毒3(PIV-3)F蛋白抗原。

11.权利要求9中任一项所述的免疫原性组合物，还包含呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白抗原。

12.权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物，还包含流感病毒血凝素(HA)蛋白抗原。

13.权利要求1-12中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽还包含信号肽。

14.权利要求1-13中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含含有卷曲螺旋结构域的异源三聚化结构域。

15.权利要求14所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含含有异亮氨酸拉锁的三聚化结构域。

16.权利要求15所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：15的异亮氨酸拉锁结构域。

17.权利要求1-16中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽在F蛋白胞外结构域的疏水结构域中包含至少一个取代或添加的亲水氨基酸。

18.权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述疏水结构域是F蛋白胞外结构域的HRB卷曲螺旋结构域。

19.权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述疏水结构域是F蛋白胞外结构域的HRA结构域。

20.权利要求1-19中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含使天然F蛋白前体(F₀)中的弗林酶切割位点被消除的至少一个氨基酸添加、缺失或取代。

21.权利要求1-20中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽还包含能改变糖基化的至少一个修饰。

22.权利要求1-20中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述至少两种副粘病毒F蛋白抗原中的一或多种选自：

a)包含SEQ ID NO：10的或由其构成的RSV F蛋白多肽、包含SEQ IDNO：12或由其构成的hMPV F蛋白多肽，和包含SEQ ID NO：14或由其构成的PIV-3 F蛋白多肽；

b)SEQ ID NO：9所编码的RSV F蛋白多肽、SEQ ID NO：11所编码的hMPV F蛋白多肽、SEQ ID NO：13所编码的PIV-3 F蛋白多肽，和多核苷酸序列所编码的PreF蛋白多肽，所述多核苷酸序列与SEQ ID NOs：9、11和13中的至少一个在严紧条件下几乎全长杂交；以及

c)与SEQ ID NO：10有至少89％序列同一性的PreF多肽；与SEQ IDNO：12有至少94％序列同一性的PreF多肽；和与SEQ ID NO：14有至少95％序列同一性的PreF多肽。

23.权利要求1-21中任一项所述的免疫原性组合物，还包含至少一种副粘病毒G蛋白多肽或其片段。

24.权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述G蛋白多肽包含与SEQ ID NO：4所示的参照G蛋白序列中氨基酸位点149-229对应的氨基酸序列。

25.权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述G蛋白多肽相对天然G蛋白多肽包含至少一个氨基酸取代，该氨基酸取代与减少或防止疫苗增强型病毒疾病相关。

26.权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述G蛋白多肽包含全长G蛋白多肽或包含含有至少部分G蛋白多肽的融合蛋白。

27.权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述G蛋白多肽存在于含有所述F蛋白抗原的融合蛋白中。

28.权利要求1-25中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽还包含连接肽。

29.权利要求28所述的免疫原性组合物，其中所述连接肽包含氨基酸序列GG。

30.权利要求28所述的免疫原性组合物，其中所述连接肽包含氨基酸序列GGSGGSGGS。

31.权利要求1-30中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽还包含多聚组氨酸标签。

32.权利要求1-31中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含多肽多聚体。

33.权利要求1-32中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种F蛋白多肽包含多肽三聚体。

34.权利要求1-33中任一项所述的免疫原性组合物，还包含载体或赋形剂。

35.权利要求34所述的免疫原性组合物，其中所述载体或赋形剂包含缓冲液。

36.权利要求1-35中任一项所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。

37.权利要求36所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂引发Th1型免疫反应。

38.权利要求37所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含3D-MPL、QS21、水包油乳剂和明矾中的至少一个。

39.权利要求38所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳剂。

40.权利要求38或39所述的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂包含母育酚。

41.权利要求38-40中任一项所述的免疫原性组合物，还包含3D-MPL。

42.权利要求38所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含3D-MPL。

43.权利要求42所述的免疫原性组合物，还包含明矾。

44.权利要求42所述的免疫原性组合物，还包含QS21。

45.权利要求44所述的免疫原性组合物，其中所述3D-MPL和QS21在脂质体制剂中。

46.权利要求36-45中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂适合给予新生儿。

47.权利要求1-46中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物减少或防止hMPV、PIV-3和RSV中两者或更多者的感染。

48.权利要求1-47中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物减少或防止hMPV、PIV-3和/或RSV感染后的病理症状或疾病。

49.重组核酸，其包含编码权利要求1-33中任一项所述的重组副粘病毒F蛋白抗原的多核苷酸序列。

50.权利要求49所述的重组核酸，其中所述编码RSV抗原的多核苷酸序列经过密码子优化以便在选定的宿主细胞中表达。

51.权利要求49或50所述的重组核酸，其中所述核酸包含选自下述的多核苷酸序列：

a)包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的多核苷酸序列，或由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13构成的多核苷酸序列；

b)与a)的多核苷酸序列在严紧条件下几乎全长杂交的多核苷酸序列；和

c)与a)的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。

52.载体，其包含权利要求49-51中任一项所述的重组核酸。

53.权利要求52所述的载体，其中所述载体包含原核或真核表达载体。

54.宿主细胞，其包含权利要求49或50所述的核酸，或者权利要求52或53所述的载体。

55.权利要求54所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。

56.权利要求1-33中任一项所述的F蛋白抗原或者权利要求49或50所述的核酸在制备治疗RSV感染的药物中的用途。

57.权利要求56所述的F蛋白抗原或核酸的用途，其中所述药物为预防性治疗由hMPV、PIV-3和RSV中的一或多者造成的感染而给药。

58.引发抗hMPV、PIV-3和RSV中一或多者的免疫反应的方法，所述方法包括：

将权利要求1-48中任一项所述的免疫原性组合物给予受试对象。

59.权利要求58所述的方法，其中所述免疫反应包含Th1型免疫反应。

60.权利要求58-59所述的方法，其中所述免疫反应包含减少或防止hMPV、PIV-3和RSV中一或多者的感染的保护性免疫反应。

61.权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述受试对象是人受试对象。

62.权利要求1-33中任一项所述的免疫原性组合物，用于药品。

63.权利要求1-33中任一项所述的免疫原性组合物，用于预防或治疗RSV相关疾病。

Images