JP2022523157A - キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質、免疫原性組成物、ならびに使用方法 - Google Patents

キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質、免疫原性組成物、ならびに使用方法 Download PDF

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エル． ムーア，マーティン
トッド，シーン
シー． ストバート，クリストファー
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エモリー ユニバーシティー
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Abstract

本開示は、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードするキメラ型呼吸器合胞体ウイルス、ならびにワクチンにおけるキメラ型ウイルスまたはキメラ型ウイルス中の成分の使用に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質のためにＲＳＶのＦタンパク質を代用するＲＳＶ骨格を含む弱毒化生ワクチンに関する。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１９年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／８０４，００５号による利益を主張し、当該仮出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）は呼吸器のウイルス病原体であり、無症候性感染から重症の気管支炎に及ぶ様々な病気を引き起こす。ｈＭＰＶは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含むニューモウイルス亜科のマイナス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ｈＭＰＶは季節性であり、おおよそインフルエンザと同様の季節性分布に従う。５歳までにほぼ全ての小児がｈＭＰＶに曝露され、再感染が一般的に生じる。ほとんどの場合、感染症状は軽度であるが、年少、免疫不全性、または高齢の患者では、喘息などの二次的状態と合併した場合、感染の結果、入院の可能性あるいは死亡の可能性すらある。現在、ｈＭＰＶに対処するための承認されたワクチンまたは抗ウイルス薬はない。したがって、ｈＭＰＶ感染を予防および治療するための方法を同定する必要がある。
ワクチンは、生ウイルス株の死滅化（不活化）バージョンの場合もあれば弱体化（弱毒化）バージョンの場合もある。Ｚｈａｎｇ他は、ウイルスｍＲＮＡキャップメチルトランスフェラーゼを阻害することにより、ヒトメタニューモウイルス弱毒化生ワクチン候補を報告している。Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０１４，８８（１９）：１１４１１－２９。Ｏｌｍｅｄｉｌｌａｓ他は、キメラ型ニューモウイルス亜科融合タンパク質を、交差中和抗体応答を誘導するための免疫原として報告している。ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１７，ｅ２０１７０８０７８。
Ｌｉａｎｇ他は、パラインフルエンザウイルスベクターによって発現するＲＳＶ融合タンパク質を報告している。Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１６，９０（２１）：１００２２－１００３８．Ｓｔｏｂａｒｔ他は、コットンラットにおいて免疫原性の操作された熱安定性を有する生ＲＳＶワクチンを報告している。Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１３９１６（２０１６）。また、ＷＯ２０１７／０７５１２５およびＷＯ２０１４／１５２５３４も参照のこと。
本明細書に引用された参考文献は、先行技術を認めるものではない。
本開示は、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶウイルスにおいて、ワクチン生成のために、ＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメインおよび／または細胞質側末端のｈＭＰＶ Ｆタンパク質への付加が首尾よく使用され得るという発見に関する。理論に拘束されることは望まないが、ＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端は、ウイルスの集合を促進し、ウイルス産生を増加させると考えられている。したがって、本開示は、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードするキメラ型呼吸器合胞体ウイルス、ならびにワクチンにおけるキメラ型ウイルスまたはキメラ型ウイルス中の成分の使用に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質のためにＲＳＶのＦタンパク質を代用するＲＳＶ骨格を含む弱毒化生ワクチンに関する。
ある特定の態様において、本開示は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端を含む、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質に関する。ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質はＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメインも含み、このとき、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、Ｎ→Ｃ末端方向で、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメイン、ＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメイン、およびＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を有する生キメラ型ウイルスを含む免疫原性組成物に関する。ある特定の実施形態において、生キメラ型ウイルスは、配列番号１またはそのバリアント（例えば、配列番号１に対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するそのバリアント）をコードする核酸を含む。ある特定の実施形態において、配列番号１をコードする核酸は、配列番号２またはそのバリアント（例えば、配列番号２に対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するそのバリアント）を含む。ある特定の実施形態において、生キメラ型ウイルスは、呼吸器合胞体ウイルスのＳＨタンパク質をコードする遺伝子を含まない。
ある特定の実施形態において、本開示は、配列番号１またはそのバリアント、または５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を有するバリアントを有するキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質を含む融合タンパク質およびキメラ型粒子を企図している。ある特定の実施形態において、バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態において、キメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質は、配列番号６のＮ末端ｈＭＰＶ配列、
ＭＳＷＫＶＶＸ１ＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＸ２ＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＸ３ＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＸ４Ｘ５ＲＦＶＬＧＡＩＡＸ６ＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＸ７ＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＸ８ＡＩＫＸ９ＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＸ１０ＦＶＳＫＮＬＴＸ１１ＡＩＮＫＮＫＣＤＩＸ１２ＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＸ１３ＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＸ１４ＫＡＡＰＳＣＳＸ１５ＫＸ１６ＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＸ１７ＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＸ１８ＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＸ１９ＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＸ２０ＳＦＤＰＸ２１Ｘ２２ＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＸ２３ＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＸ２４ＳＡＥＫＧＮＴ
を有し（配列中、Ｘ１はＩもしくはＶであり、Ｘ２はＡもしくはＴであり、Ｘ３はＥもしくはＤであり、Ｘ４はＲもしくはＱであり、Ｘ５はＲもしくはＳであり、Ｘ６はＬもしくはＦであり、Ｘ７はＶもしくはＩであり、Ｘ８はＴもしくはＮであり、Ｘ９はＮもしくはＧであり、Ｘ１０はＥもしくはＤであり、Ｘ１１はＲもしくはＳであり、Ｘ１２はＡもしくはＤであり、Ｘ１３はＶもしくはＹであり、Ｘ１４はＶもしくはＩであり、Ｘ１５はＫもしくはＥであり、Ｘ１６はＫもしくはＲであり、Ｘ１７はＱもしくはＫであり、Ｘ１８はＫもしくはＲであり、Ｘ１９はＮもしくはＳであり、Ｘ２０はＳもしくはＮであり、Ｘ２１はＶもしくはＩであり、Ｘ２２はＫもしくはＲであり、Ｘ２３はＮもしくはＳであり、および／またはＸ２４はＳもしくはＮである）、例えば、Ｆ［ヒトメタニューモウイルス］ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：
ＡＥＫ２６８９５．１（配列番号２０）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＥＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＫＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＩＦＩＩＩＫＫＴＫＫＱＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ；
ＡＥＫ２６８８６．１（配列番号２１）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＰＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＴＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ；
ＡＥＫ２６９０６．１（配列番号２２）、
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＱＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＧＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＲＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＮＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＶＡＶＬＧＬＴＭＩＳＶＳＩＩＩＩＩＫＫＴＫＫＰＫＧＡＰＰＥＬＮＧＶＴＮＧＧＦＩＰＨＳ；
ＡＣＪ５３６１２．１．（配列番号２３）、
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＤＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＲＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＬＴＭＩＳＶＳＩＩＩＩＩＫＫＴＲＫＰＴＧＡＰＰＥＬＮＧＶＴＮＧＧＦＩＰＨＳ；
ＡＣＪ５３５６５．１（配列番号２４）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＥＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＩＦＩＩＩＫＫＴＫＫＱＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ；
ＡＨＶ７９８５８．１（配列番号２５）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＶＬＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ；
ＢＢＢ３５０８８．１（配列番号２６）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＮＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＩＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ；
ＡＨＶ７９４７３．１（配列番号２７）、
ＭＳＷＫＶＶＶＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ；
ＡＡＳ２２１２５．１（配列番号２８）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＲＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ；
ＡＵＦ７２４４５．１（配列番号２９）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＦＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＩＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ；
ＡＣＪ５３５７５．１（配列番号３０）、
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＲＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＳＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＩＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ
で示されるものである。
ある特定の実施形態において、Ｘ１～Ｘ２４はそれぞれ、個別的かつ独立的に、任意のアミノ酸またはその中で同定されたアミノ酸の保存的置換である。
ある特定の実施形態において、キメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質は、配列番号７のＣ末端ＲＳＶ配列、
Ｘ２ＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＸ１ＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＸ３ＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ
を有し（配列中、Ｘ１はＳまたはＬであり、Ｘ２はＩまたはＶであり、Ｘ３はＶまたはＩである）、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＵＣ６８１４９．１、ＡＨＷ８１４３０．１、ＡＩＺ９５８９３．１、ＡＨＷ８１４４０．１、およびＡＪＺ７００６７．１を有する呼吸器合胞体ウイルスＡ型で示されるものである。ある特定の実施形態において、Ｘ１～Ｘ３はそれぞれ、個別的かつ独立的に、任意のアミノ酸またはその中で同定されたアミノ酸の保存的置換である。
ある特定の実施形態において、本開示は、配列番号１または５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを有するキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸またはベクターを企図している。ある特定の実施形態において、核酸は配列番号２またはそのバリアントを含む。ある特定の実施形態において、バリアントは、同義コドンを含むか、またはコドン脱最適化されているものである。
ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、ＲＳＶ ＮＳ１およびＮＳ２、またはキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子を有し、これらのタンパク質は任意選択で、野生型Ａ２ウイルスと比較して、Ｖｅｒｏ細胞におけるタンパク質の発現率が半分よりも低減するようにコドンが脱最適化されている。
ある特定の実施形態において、ＮＳ１の発現率は、野生型系統Ａ２ウイルスと比較して、Ｖｅｒｏ細胞において三分の一（１／３）、四分の一（１／４）、五分の一（１／５）、または十分の一（１／１０）よりも低減する。
ある特定の実施形態において、ＮＳ２の発現率は、野生型系統Ａ２ウイルスと比較して、Ｖｅｒｏ細胞において三分の一（１／３）、四分の一（１／４）、五分の一（１／５）、または十分の一（１／１０）よりも低減する。
ある特定の実施形態において、ＳＨタンパク質をコードする遺伝子は、切断されたタンパク質が発現するまたはタンパク質が発現しないように、欠失または改変される。ある特定の実施形態において、Ｍ２－２をコードする遺伝子は、切断されたタンパク質が発現するまたはタンパク質が発現しないように、欠失または改変される。ある特定の実施形態において、Ｇタンパク質をコードする遺伝子は、切断されたタンパク質が発現するまたはタンパク質が発現しないように、欠失または改変される。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示されるキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶを含むワクチンおよび免疫原性組成物に関する。ある特定の実施形態において、組成物はさらに、アジュバントおよび／または他の医薬的に許容される担体を含む。ある特定の実施形態において、アジュバントは、アルミニウムゲル、アルミニウム塩、またはモノホスホリルリピドＡである。
ある特定の実施形態において、アジュバントは水中油型エマルジョンである。ある特定の実施形態において、水中油型エマルジョンはさらに、α－トコフェロール、スクアレン、および／または界面活性剤を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、対象を呼吸器合胞体ウイルスに対しワクチン接種または免疫化するための方法であって、本明細書で開示されるキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶまたはそれを含む免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、有効量は、対象内で防御免疫応答を産生する。
ある特定の実施形態において、対象は、妊娠中の女性であるか、２、３、または４歳未満の小児である。ある特定の実施形態において、対象の免疫系は低下しているか、６０または６５歳を超えているか、または化学療法薬もしくは免疫抑制薬を定期的に投与されている。
ある特定の実施形態において、本開示は、配列番号１またはそのバリアントを有するキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含むベクターに関する。ある特定の実施形態において、ベクターは、プラスミドまたはバクテリア人工染色体から選択される。
ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、ヒト対象に感染性のものおよびヒト対象に対し感染性でないものを含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される配列番号１またはそのバリアントを有するキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質を含む粒子、ＲＳＶ－ｈＭＰＶ粒子、またはウイルス様粒子に関する。ある特定の実施形態において、粒子は、感染性の弱毒化生キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを含む。ある特定の実施形態において、粒子は、不活性化ＲＳＶ－ｈＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを、例えば、核酸なしで、または１つ、２つ、３つもしくはそれより多くのもしくはいずれのＲＳＶもしくはｈＭＰＶタンパク質も発現可能でない核酸と共に含む。ある特定の実施形態において、粒子は、熱またはホルムアルデヒドなどの方法を用いて死滅される。ある特定の実施形態において、粒子は、ウイルス構造タンパク質、ならびに本明細書で開示される配列番号１またはそのバリアントを有するキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質の発現によって再構成される。
図１は、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）弱毒化生ワクチン候補ＤＨ１（ＯＥ１－ｈＭＰＶ－Ｆ）、ＤＨ２（ＯＥ１－ｈＭＰＶ－Ｆ（ＲＳＶ ＴＭ＋ＣＴ）、ＤＨ３（ＯＥ４－ｈＭＰＶ－Ｆ）、ＤＨ４（ＯＥ４－ｈＭＰＶ－Ｆ（ＲＳＶ ＴＭ＋ＣＴ）のゲノム概略図を示している。ＤＨコンストラクトを生成するため、ｈＭＰＶ ＴＮ／９４－４９Ｆ遺伝子（全長）またはｈＭＰＶ ＴＮ／９４－４９Ｆ遺伝子（ＲＳＶ Ｆ膜貫通および細胞質側末端を含む）をＲＳＶ Ａ２株骨格に挿入した。Ａ２骨格へのさらなる修飾には、ＮＳ１およびＮＳ２遺伝子のコドン脱最適化ならびに小疎水性（ＳＨ）遺伝子の欠失が含まれた。 図２は、Ｖｅｒｏ細胞におけるｈＭＰＶ Ｆタンパク質発現を示している。ブロットは、野生型ｈＭＰＶ（１）、模擬（２）、ＲＳＶ株ＯＥ１（３）、およびｈＭＰＶワクチン候補ＤＨ２（４）のＦタンパク質発現を示している。細胞をＭＯＩ ０．５で感染させ、感染後４８時間で収集した。同量のタンパク質をブロットした。 図３は、Ｖｅｒｏ細胞におけるｈＭＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖曲線を示している。Ｖｅｒｏ細胞を用いて増殖動態分析を行った。細胞を、各時点について２連でＭＯＩ ０．１で感染させた。蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）アッセイにより、試料をＶｅｒｏ細胞上で滴定した。 図４Ａは、ＤＨ２およびＯＥ１についての初代正常気管支上皮（ＮｈＢＥ）細胞におけるｈＭＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖曲線を示している。ＮｈＢＥ細胞に対し増殖動態分析を行った。細胞を、各時点について２連でＭＯＩ ０．１で感染させた。蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）アッセイにより、試料をＶｅｒｏ細胞上で滴定した。 図４Ｂは、ＤＨ２、ＯＥ１、およびＡ２についての初代正常気管支上皮（ＮｈＢＥ）細胞におけるｈＭＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖曲線を示している。 図４Ｃは、ＤＨ２、ＯＥ１、およびＡ２－Ｌ１９Ｆについての初代正常気管支上皮（ＮｈＢＥ）細胞におけるｈＭＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖曲線を示している。 図５は、ヒトメタニューモウイルスＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＫ２６８９５．１（ＴＮ／９４－４９Ｆ；配列番号５）で提供されるｈＭＰＶ－Ｆタンパク質と、本明細書で開示されるキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質（配列番号１）との配列比較を示しており、同一性は４９８／５３９（９２％）となっている。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｖｅｒ ｔｗｅｎｔｙ ｙｅａｒｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，６，１３８（２００９）。 同上。 図６Ａは、コンセンサス配列配列番号６における最初の１８０アミノ酸と、様々なｈＭＰＶ株由来のＦタンパク質（配列番号２０～３０）とのアラインメントを示している。 同上。 図６Ｂは、コンセンサス配列配列番号６におけるアミノ酸１８１～３６０と、様々なｈＭＰＶ株由来のＦタンパク質（配列番号２０～３０）とのアラインメントを示している。 同上。 図６Ｃは、コンセンサス配列配列番号６におけるアミノ酸３６１～４８９と、様々なｈＭＰＶ株由来のＦタンパク質（配列番号２０～３０）とのアラインメントを示している。 同上。
本開示についてより詳細に説明する前に、本開示が、記載される特定の実施形態に限定されず、当然ながらそれ自体が変動し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、このような用語が限定的であるようには意図されていないことも理解されたい。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の実施または試験を行う際には、本明細書に記載の方法および物質に類似したまたは同等の、任意の方法および物質を使用することもできるが、ここでは好ましい方法および物質について説明する。
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、個別の刊行物または特許が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用され、刊行物が引用される方法および／または物質を開示および説明するために、参照により本明細書に援用される。任意の刊行物の引用は、出願日以前の開示に対するものであり、本開示が、事前の開示によってこのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、示される公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、実際の公開日は独立に確認する必要があり得る。
本開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書で説明および例示がなされている個々の実施形態は別々の要素および特徴を有し、これらは、本開示の範囲および趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から分離することもそれらと組み合わせることも容易にできる。任意の示された方法は、示された事象の順に実行することも、他の任意の論理的に可能な順に実行することもできる。
本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内の免疫学、医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学、生理学などの技術を用いる。このような技術は、文献で十分に説明されている。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「当該（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。本明細書およびその後の特許請求の範囲では、複数の用語について言及されるが、これらの用語は、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有するように定義される。
様々な実施形態を説明する前に、以下の定義を示す。別段の指示がない限り、これらの定義が使用されるべきである。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介し結合したアミノ酸を含む化合物を指し、これらは互換的に使用される。
「部分」という用語は、（「所与のタンパク質の一部」のように）タンパク質に関して使用される場合、そのタンパク質のフラグメントを指す。フラグメントのサイズは、４アミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス１アミノ酸まで及び得る。
「キメラ型呼吸器合胞体ウイルス」または「キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ」という用語は、ゲノムまたはアンチゲノムが宿主細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）内で複製するのを可能にするのに十分なＲＳＶ遺伝子を含む核酸を指し、核酸の配列は、ｈＭＰＶ遺伝子配列またはフラグメントを含む少なくとも１つの核酸セグメントを含むように改変される。キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、コドンが天然に存在するコドンとは異なるように改変されたＲＳＶまたはｈＭＰＶ遺伝子を含むが、天然に発現するものと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生する。異なる株のＲＳＶ－ｈＭＰＶは、異なるヌクレオチド配列を有し、類似の機能を有する異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する。したがって、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、ＲＳＶまたはｈＭＰＶ遺伝子を含み、ある株由来の１つ以上の遺伝子が代替株または第２の株の遺伝子から置き換えられて、ＲＳＶまたはｈＭＰＶゲノム全体の核酸配列が自然界に見出されるＲＳＶまたはｈＭＰＶと同一にならないようにする。ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、タンパク質発現を切り捨てるように翻訳開始コドンの後に核酸が欠失する株を含む。このとき、ゲノムについてのこのような切断パターンが、天然に存在するウイルスには見出されないことを前提とする。ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、感染性でありヒト対象内で複製し得るものを含む。
「キメラ」または「キメラ型」という用語は、ポリペプチドに関して使用される場合、自然環境では共に存在しない異なる供給源から得られ、共にクローニングされ、翻訳後に単一のポリペプチド配列として作用する、２つ以上のコード配列の発現産物を指す。コード配列は、同じ生物種または異なる生物種から得られたものを含む。本開示は、キメラ型ＲＳＶ／ｈＭＰＶ融合（Ｆ）タンパク質に関する。天然に存在するＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、ビリオン膜を標的細胞膜に融合させる主要な表面糖タンパク質である。融合タンパク質は、準安定性の融合前立体構造で存在し、これが続いて主要なリフォールディングを経て、ビリオンおよび標的細胞膜に近似し融合を可能にする、安定した融合後形態となる。
「相同体」または「相同」という用語は、ポリペプチドに関して使用される場合、２つのポリペプチド間の高度な配列同一性、または３次元構造間の高度な類似性、または活性部位と作用機序との間の高度な類似性を指す。好ましい実施形態において、相同体は、参照配列に対し６０％超の配列同一性、より好ましくは７５％超の配列同一性、さらにより好ましくは９０％超の配列同一性を有する。
ポリペプチドへの適用において、「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、例えば、「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ（Ｈｅｉｎ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１７９－１９０）といったプログラムによって最適にアラインメントされた場合に、デフォルトギャップ重みを用いて、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、少なくとも９９．５％の同一性、少なくとも９９．９％の同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
「バリアント」および「変異体」という用語は、ポリペプチドに関して使用される場合、１つ以上のアミノ酸が別の（通常は、関連する）ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を指す。バリアントは「保存的」変化を有してもよく、このとき、置換されたアミノ酸は類似の構造的または化学的特性を有する。保存的アミノ酸置換の１つのタイプは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。より稀には、バリアントが「非保存的」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置き換え）を有する場合がある。同様の軽微なバリエーションには、アミノ酸の欠失もしくは挿入（言い換えれば、付加）、またはその両方も含まれ得る。どのアミノ酸残基がどれだけ、生物学的活性を失うことなしに置換、挿入、または欠失され得るかを決定する際の指針は、当技術分野で周知されているコンピュータープログラム、例えば、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを用いて見出すことができる。バリアントは、機能アッセイで試験することができる。好ましいバリアントは、１０％未満、好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満の変化（置換、欠失などのいずれか）を有する。
「遺伝子」という用語は、ＲＮＡまたはポリペプチドもしくはその前駆体（例えば、プロインスリン）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列を指す。機能的ポリペプチドは、ポリペプチドの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、全長コード配列またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。「部分」という用語は、遺伝子に関して使用される場合、そのタンパク質のフラグメントを指す。フラグメントのサイズは、数ヌクレオチドから全遺伝子配列マイナス１ヌクレオチドまで及び得る。したがって、「遺伝子の少なくとも一部を含むヌクレオチド」は、遺伝子のフラグメントを含む場合も遺伝子全体を含む場合もある。
「遺伝子」という用語は、構造遺伝子のコード領域も包含し、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、５’および３’末端両方のコード領域に隣接し、いずれの末端上で約１ｋｂの距離にある配列を含む。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは核または一次転写物から除去または「スプライシング」されるため、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中に存在しない。ｍＲＮＡは翻訳中に機能して、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を指定する。
イントロンを含むことに加えて、遺伝子のゲノム形態は、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列も含み得る。このような配列は、「フランキング」配列または領域と称される（このようなフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列に対し５’または３’側に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御またはそれに影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写の終結、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
「異種性遺伝子」という用語は、その自然環境にない（すなわち、ヒトの手によって改変された）因子をコードする遺伝子を指す。例えば、異種性遺伝子は、ある種由来の遺伝子が別の種に導入されたものを含む。また、異種性遺伝子は、何らかの方法で改変された（例えば、変異した、複数のコピーで付加された、非ネイティブのプロモーターまたはエンハンサー配列に結合した、など）生物にとってネイティブな遺伝子も含む。異種性遺伝子は、異種性遺伝子配列が、典型的には、調節エレメント（例えば、異種遺伝子がコードするタンパク質の遺伝子、または染色体内の遺伝子配列と天然に会合して見出されないプロモーター）を含むヌクレオチド配列と連結している点で、または自然界には見出されない染色体の部分（例えば、通常は発現しない座位で発現する遺伝子）と会合している点で、内在性遺伝子とは区別される。
「ポリヌクレオチド」という用語は、２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは３個超、通常は１０個超からなる分子を指す。正確なサイズは多くの因子に依存し、ひいてはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。ポリヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはこれらの組合せを含む任意の方式で生成され得る。「オリゴヌクレオチド」という用語は、概して、短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指すが、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用される場合もある。
「核酸」という用語は、ヌクレオチドのポリマー、または上記のようなポリヌクレオチドを指す。この用語は、単一の分子または分子の集合を示すために使用される。核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができ、以下に説明されるように、コーディング領域および様々な制御エレメントの領域を含むことができる。
「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」または「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」または指定されたポリペプチドを「コードする核酸配列」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、言い換えれば、遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡのいずれかの形態で存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。転写の適切な開始および／または一次ＲＮＡ転写物の正しいプロセシングを可能にするために必要な場合、エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、ポリアデニル化シグナルなどの好適な制御エレメントを遺伝子のコード領域のごく近傍に配置することができる。代替的に、本開示の発現ベクターで利用されるコード領域は、内在性エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内在性および外在性両方の制御エレメントの組合せを含んでもよい。
「組換え型」という用語は、核酸分子について言及する場合、分子生物学的技術によって連結した核酸のセグメントから構成される核酸分子を指す。「組換え型」という用語は、タンパク質またはポリペプチドについて言及する場合、組換え核酸分子を用いて発現するタンパク質分子を指す。
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関係づけられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」については「Ｔ－Ｃ－Ａ」に対し相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、この場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する。あるいは、核酸間で「完全な」または「全体的な」相補性があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を及ぼす。これは、増幅反応において、そして核酸間の結合に依存する検出方法においては、特に重要である。
「相同性」という用語は、核酸に関して使用される場合、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があり得る。「配列同一性」とは、２つ以上の核酸またはタンパク質間の関連性の尺度を指し、総比較長に対するパーセンテージとして示される。同一性の計算は、それぞれのより大きな配列中で同一でありかつ同じ相対的位置にあるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を考慮に入れる。同一性の計算は、「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）および「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などのコンピュータープログラム内に含まれるアルゴリズムによって行うことができる。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する（またはそれと競合する）配列であり、「実質的に相同」という機能的用語を用いて言及される。標的配列に対し完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて、低ストリンジェンシーの条件下で試験され得る。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下で標的に対し完全に相同である配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）を競合し阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が、非特異的結合が許容されるようなものであるということではない。低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いへの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合の不在は、部分的な程度の相補性（例えば、約３０％未満の同一性）さえも欠如した第２の標的の使用によって試験することができ、非特異的結合の不在下では、プローブは第２の非相補的標的とハイブリダイズしない。
以下の用語：「参照配列」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的同一性」は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために使用される。「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、例えば、配列表に示される全長ｃＤＮＡ配列の一セグメントとして、より大きな配列のサブセットである場合もあれば、完全な遺伝子配列を含む場合もある。概して、参照配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドであり、頻繁には長さが少なくとも２５ヌクレオチドであり、多くの場合は長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の部分）を含むことができ、（２）さらに、２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含むことができるため、２つの（またはそれより多くの）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたり比較して配列が類似する局所領域を同定および比較することにより、実施される。本明細書で使用する場合、「比較ウィンドウ」とは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド位置の概念的セグメントであって、ポリヌクレオチド配列が、少なくとも２０の連続するヌクレオチドの参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、２つの配列を最適にアラインメントするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、セグメントを指す。比較ウィンドウをアラインメントするための最適な配列アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所ホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））により、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））により、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．）８５：２４４４（１９８８））により、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査により行うことができ、様々な方法によって生成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり最も高いパーセンテージのホモロジーをもたらすもの）が選択される。「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較ウィンドウにわたり同一である（すなわち、ヌクレオチドに基づいて）ことを意味する。
ある特定の実施形態において、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両方の配列内で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が生じる位置の数を定量して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けることによって計算され、その結果、配列同一性のパーセンテージが得られる。
ある特定の実施形態において、配列「同一性」とは、アラインメントの２つの配列間の配列アラインメントで正確に一致するアミノ酸の数（パーセンテージとして表される）を指し、これは、同一の位置の数を最も短い配列の大きい方で割ったもの、またはオーバーハングを除いた同等の位置の数（内部ギャップは同等の位置としてカウントされる）を用いて計算される。例えば、ポリペプチドＧＧＧＧＧＧおよびＧＧＧＧＴは、５中４または８０％の配列同一性を有する。例えば、ポリペプチドＧＧＧＰＰＰおよびＧＧＧＡＰＰＰは、７中６または８５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態において、本明細書で表現される任意の配列同一性の記載は、配列類似性で代用され得る。「類似性」パーセントは、アラインメントの２つの配列間の類似性を定量化するために使用される。この方法は、ある特定のアミノ酸が一致を有するのに同一でなくてもよいことを除いて、同一性を決定することと同一である。アミノ酸は、以下のアミノ酸基：芳香族－Ｆ Ｙ Ｗ；疎水性－Ａ Ｖ Ｉ Ｌ；正荷電：Ｒ Ｋ Ｈ；負荷電－Ｄ Ｅ；極性－Ｓ Ｔ Ｎ Ｑに従って、類似した特性を有する群の中にある場合、一致として分類される。
本明細書で使用する場合、「実質的同一性」という用語は、少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較ウィンドウ、高頻度には少なくとも２５～５０ヌクレオチドのウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０～９５％の配列同一性、より通常的には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列の特徴を示し、このとき、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を、比較ウィンドウにわたって合計で参照配列の２０％以下の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と比較することにより、計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであってもよく、例えば、本開示で特許請求される組成物の全長配列の一セグメントとしてのサブセットであってもよい。
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的に相同」という用語は、上記のように低～高ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖とハイブリダイズし得る任意のプローブを指す。
一本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的に相同」という用語は、上記のように低～高ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズし得る（すなわち、一本鎖核酸配列の補体である）任意のプローブを指す。
「作用可能な組合せで」、「作用可能な順序で」、および「作用可能に結合した」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示可能な核酸分子が産生されるような方式での核酸配列の結合を指す。この用語は、機能的タンパク質が産生されるような方式でのアミノ酸配列の結合も指す。
「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現のいくつかの態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えば、プロモーターは、作用可能に結合したコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。
真核生物の転写調節シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７，１９８７）。プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫、哺乳類、および植物細胞内の遺伝子を含めた様々な真核生物源から単離されている。プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントもウイルスから単離されており、これらは原核生物に見出される。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的タンパク質を発現させるために使用される細胞タイプに依存する。いくつかの真核生物プロモーターおよびエンハンサーの宿主範囲は広いが、他のものは限定された細胞タイプのサブセットで機能的である（総説としては、Ｖｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７，１９８６；およびＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８７（前掲）を参照）。
「プロモーターエレメント」、「プロモーター」、または「プロモーター配列」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子の発現を活性化するスイッチとして機能するＤＮＡ配列を指す。遺伝子は、活性化された場合、転写される、または転写に関与しているとされる。転写は、遺伝子からのｍＲＮＡ合成に関与する。そのため、プロモーターは転写調節エレメントとして働き、また、遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始部位も提供する。
プロモーターは、組織特異的な場合も細胞特異的な場合もある。「組織特異的」という用語は、プロモーターに適用される場合、異なるタイプの組織（例えば、葉）における同じ目的ヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しない場合に、目的ヌクレオチド配列の選択的発現を特定のタイプの組織（例えば、種子）に指示可能なプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例えば、レポーター遺伝子をプロモーター配列に作用可能に結合してレポーターコンストラクトを生成し、レポーターコンストラクトが得られたトランスジェニック生物の各組織に組み込まれるようにレポーターコンストラクトを生物のゲノムに導入し、トランスジェニック生物の異なる組織でのレポーター遺伝子の発現を検出すること（例えば、レポーター遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、タンパク質、またはタンパク質活性を検出すること）によって評価することができる。１つ以上の組織で、他の組織でのレポーター遺伝子の発現レベルよりも高いレベルのレポーター遺伝子の発現が検出されることは、そのプロモーターが、より高いレベルの発現が検出される組織に特異的であることを示す。「細胞タイプ特異的」という用語は、プロモーターに適用される場合、同じ組織内の異なるタイプの細胞における同じ目的ヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しない場合に、目的ヌクレオチド配列の選択的発現を特定のタイプの細胞に指示可能なプロモーターを指す。「細胞タイプ特異的」という用語は、プロモーターに適用される場合、単一の組織内の領域で目的ヌクレオチド配列の選択的発現を促進することができるプロモーターも意味する。プロモーターの細胞タイプ特異性は、当技術分野で周知されている方法（例えば、免疫組織化学染色）を用いて評価することができる。簡潔に述べると、組織切片をパラフィン中に包埋し、パラフィン切片を、発現がプロモーターによって制御される目的ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物に特異的な一次抗体と反応させる。一次抗体に特異的な標識された（例えば、ペルオキシダーゼ結合）二次抗体を、切片化された組織に結合させ、特異的結合を（例えば、アビジン／ビオチンを用いて）顕微鏡によって検出する。
プロモーターは、構成的な場合も調節可能な場合もある。「構成的」という用語は、プロモーターについて言及する場合、プロモーターが、刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光など）の不在下で、作用可能に結合した核酸配列の転写を指示可能であることを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞および任意の組織での導入遺伝子の発現を指示可能である。
これに対し、「調節可能」または「誘導可能」プロモーターは、刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光など）の存在下で、作用可能に結合した核酸配列の転写レベルを指示可能なプロモーターであり、この転写レベルは、刺激の不在下での作用可能に結合した核酸配列の転写レベルとは異なる。
エンハンサーおよび／またはプロモーターは、「内在性」の場合も「外在性」の場合も「異種性」の場合もある。「内在性」エンハンサーまたはプロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子と天然に結合しているものである。「外在性」または「異種性」のエンハンサーまたはプロモーターは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によって遺伝子に並列して配置され、その結果遺伝子の転写が結合したエンハンサーまたはプロモーターによって指示されるエンハンサーまたはプロモーターである。例えば、第１の遺伝子と作用可能な組合せの内在性プロモーターを単離し、除去し、第２の遺伝子と作用可能な組合せで配置して、それを第２の遺伝子と作用可能な組合せで「異種性プロモーター」にすることができる。様々なこのような組合せが企図されている（例えば、第１および第２の遺伝子は、同じ種に由来する場合も異なる種に由来する場合もある）。
真核細胞で組換え型ＤＮＡ配列を効率的に発現させるには、典型的には、得られた転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは概してポリアデニル化シグナルの下流にあり、数百ヌクレオチドの長さである。本明細書で使用する場合、「ポリ（Ａ）部位」または「ポリ（Ａ）配列」という用語は、新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を示す。ポリ（Ａ）テールが欠如した転写物は不安定であり、急速に分解されるため、組換え型転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターで利用されるポリ（Ａ）シグナルは、「異種性」の場合も「内在性」の場合もある。内在性ポリ（Ａ）シグナルは、ゲノム内の所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見出される。異種性ポリ（Ａ）シグナルは、ある遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’側に配置されたものである。一般的に使用される異種性ポリ（Ａ）シグナルは、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルである。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限フラグメントに含まれ、終結およびポリアデニル化の両方を指示する。
「ベクター」という用語は、１つの細胞から別の細胞へＤＮＡセグメントを移行させる核酸分子を指す。「ビヒクル」という用語は、「ベクター」と互換的に使用されることがある。
「発現ベクター」または「発現カセット」という用語は、特定の宿主生物で作用可能に結合したコード配列を発現させるのに使用される所望のコード配列および適切な核酸配列を含む組換え型核酸を指す。原核生物での発現のために使用される核酸配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター（任意）、およびリボソーム結合部位を、しばしば他の配列と共に含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
「宿主細胞」という用語は、異種性遺伝子を複製および／または転写および／または翻訳することが可能な任意の細胞を指す。したがって、「宿主細胞」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれにあるかにかかわらず、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞）を指す。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物に存在し得る。
「選択マーカー」は、人工的選択または同定に適した形質を付与するポリペプチドをコードする組換え型ベクターに導入された核酸であり（下記の「レポーター遺伝子」も参照）、例えば、ベータ－ラクタマーゼは抗生物質抵抗性を付与し、これにより、ベータ－ラクタマーゼを発現する生物が増殖培地中で抗生物質の存在下で生存することが可能になる。もう一つの例はチミジンキナーゼであり、これは宿主をガンシクロビル選択に対し感受性にする。これは、予想される色の有無に基づいて所望の細胞と所望でない細胞とを区別することを可能にする、スクリーニング可能なマーカーであり得る。例えば、ｌａｃ－ｚ遺伝子は、Ｘ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトシド）の存在下で青色を呈するベータ－ガラクトシダーゼ酵素を産生する。組換え型挿入によってｌａｃ－ｚ遺伝子が不活性化された場合、得られるコロニーは無色になる。１つ以上の選択マーカーが存在してもよく、例えば、発現生物がその増殖に必要な特定の化合物（栄養要求性）を合成できないことを補完する酵素や、ある化合物を増殖に対し毒性のある別の化合物に変換できる酵素が存在してもよい。ＵＲＡ３は、オロチジン－５’リン酸デカルボキシラーゼであり、ウラシルの生合成に必要であり、ウラシルに対し栄養要求性のｕｒａ３変異体を補完することができる。また、ＵＲＡ３は、５－フルオロオロチン酸を毒性化合物５－フルオロウラシルに変換する。さらなる企図されている選択マーカーとしては、抗細菌抵抗性を付与するまたは蛍光タンパク質を発現する任意の遺伝子が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、以下の遺伝子が挙げられる：ａｍｐｒ、ｃａｍｒ、ｔｅｔｒ、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒ、ｎｅｏｒ、ｈｙｇｒ、ａｂｘｒ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ型遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ｐ－グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）、ｅｇｆｐ、ｙｆｐ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ｌａｃＺａ、ｌａｃＺＡＭ１５、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）、細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）、ビアラホス抵抗性遺伝子（ｂａｒ）、ホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、アラビトールデヒドロゲナーゼ（ａｔｌＤ）、ＵＤＰ－グルコース：ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼＩ（ｇａｌＴ）、アントラニル酸シンターゼのフィードバック不感受性αサブユニット（ＯＡＳＡ１Ｄ）、２－デオキシグルコース（２－ＤＯＧＲ）、ベンジルアデニン－Ｎ－３－グルクロニド、Ｅ．ｃｏｌｉトレオニンデアミナーゼ、グルタミン酸１－セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ（ＧＳＡ－ＡＴ）、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、塩耐性遺伝子（ｒｓｔＢ）、フェレドキシン様タンパク質（ｐｆｌｐ）、トレハロース－６－Ｐシンターゼ遺伝子（ＡｔＴＰＳ１）、リジンラセマーゼ（ｌｙｒ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、トリプトファンシンターゼベータ１（ＡｔＴＳＢ１）、デハロゲナーゼ（ｄｈｌＡ）、マンノース－６－リン酸レダクターゼ遺伝子（Ｍ６ＰＲ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、およびＤ－セリンアンモニアリアーゼ（ｄｓｄＡ）。
「標識」とは、別の分子（例えば、抗体またはタンパク質）と直接的または間接的に結合体化して、その分子の検出を容易にする検出可能な化合物または組成物を指す。標識の具体的かつ非限定的な例としては、蛍光タグ、酵素結合、および放射性同位体が挙げられる。１つの例において、「標識受容体」は、受容体における異種性ポリペプチドの組込みを指す。標識には、ポリペプチドへの放射性標識アミノ酸の組込みまたはビオチニル部分の共有結合が含まれ、これは、マーク付きのアビジン（例えば、光学的または比色的方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で知られており、使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：放射性同位体または放射性ヌクレオチド（例えば、３５Ｓもしくは１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、またはガドリニウムキレートなどの磁性剤。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって結合する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される配列またはそのバリアントもしくは融合物を含む組換え型ポリペプチドであって、アミノ酸配列のアミノ末端または炭素末端が、任意選択で、異種性アミノ酸配列、標識、またはレポーター分子に結合している、組換え型ポリペプチドに関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示されるポリペプチドまたはその融合タンパク質をコードする核酸を含む組換え型ベクターに関する。
ある特定の実施形態において、組換え型ベクターは、任意選択で、哺乳類、ヒト、昆虫、ウイルス、細菌、細菌プラスミド、酵母関連の複製起点または遺伝子（例えば、遺伝子もしくはレトロウイルス遺伝子もしくはレンチウイルスのＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳヌクレオチドセグメント、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｖｐｘから選択される遺伝子、またはｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖから選択される構造遺伝子）を含む。
ある特定の実施形態において、組換え型ベクターは任意選択で、遺伝子ベクターエレメント（核酸）、例えば、選択マーカー領域、ｌａｃオペロン、ＣＭＶプロモーター、ハイブリッドニワトリＢ－アクチン／ＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧ）プロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列、ｃｉｓ作用性ウッドチャック調節後エレメント（ｐｏｓｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）、スキャフォールド結合領域（ＳＡＲ）、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ＦＬＡＧタグコード領域、ｃ－ｍｙｃタグコード領域、金属アフィニティータグコード領域、ストレプトアビジン結合ペプチドタグコード領域、ポリＨｉｓタグコード領域、ＨＡタグコード領域、ＭＢＰタグコード領域、ＧＳＴタグコード領域、ポリアデニル化コード領域、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０複製起点、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点、ｆ１起点、ｐＢＲ３２２起点、またはｐＵＣ起点、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位、ｌｏｘＰ部位、Ｃｒｅレコンビナーゼコード領域、あるいは複数クローニング部位、例えば、５０もしくは６０ヌクレオチド未満の連続セグメント内に５、６、もしくは７もしくはそれ以上の制限部位を有する部位、または２０もしくは３０ヌクレオチド未満の連続セグメントで３もしくは４もしくはそれ以上の制限部位を有する部位を含む。
「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイされ得るタンパク質をコードする遺伝子を指す。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、修飾されたｋａｔｕｓｈｋａ、ｍｋａｔｅ、およびｍｋａｔｅ２（例えば、Ｍｅｒｚｌｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，４，５５５－５５７およびＳｈｃｈｅｒｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００８，４１８，５６７－５７４を参照）、ルシフェラーゼ（例えば、ｄｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５（１９８７）、ならびに米国特許第６，０７４，８５９号；第５，９７６，７９６号；第５，６７４，７１３号；および第５，６１８，６８２号（これらの全ては、参照により本明細書に援用される）を参照）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４３２８４；複数のＧＦＰバリアントが、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼが挙げられる。
「野生型」という用語は、遺伝子について言及する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子の特徴を有する遺伝子を指す。「野生型」という用語は、遺伝子産物について言及する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。「天然に存在する」という用語は、対象物に適用して本明細書で使用する場合、対象物が自然界に見出され得るという事実を指す。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が、生物（ウイルスを含む）内に存在し、自然界で供給源から単離することができ、かつ実験室内でヒトによって意図的に改変されていない場合、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。野生型遺伝子は、集団内で最も高頻度に観察されるものであり、したがって、遺伝子の「正常」または「野生型」形態と任意に命名される。これに対し、「修飾された」または「変異体」という用語は、遺伝子または遺伝子産物について言及する場合、それぞれ、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列の修飾および／または機能的特性の修飾（すなわち、特徴の改変）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する変異体が単離され得ることに留意されたい。このような変異体は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに改変された特徴を有するという事実によって同定される。
「アンチセンス」または「アンチゲノム」という用語は、そのヌクレオチド残基の配列がセンス鎖内のヌクレオチド残基の配列に対し逆の５’→３’方向であるヌクレオチド配列を指す。ＤＮＡ二重鎖の「センス鎖」とは、天然状態の細胞によって「センスｍＲＮＡ」に転写されるＤＮＡ二重鎖内の鎖を指す。したがって、「アンチセンス」配列は、ＤＮＡ二重鎖内の非コード鎖と同じ配列を有する配列である。
「単離された」という用語は、生物学的物質（例えば、ウイルス、核酸、またはタンパク質）であって、天然に存在する環境で通常それに付随するまたはそれと相互作用する成分を実質的に含まない生物学的物質を指す。単離された物質は、任意選択で、その天然環境で当該物質と共に見出されない物質、例えば、細胞を含む。例えば、当該物質がその天然環境（例えば、細胞）にある場合、当該物質は、その環境中に見出される物質にとってネイティブではない細胞内の位置（例えば、ゲノムまたは遺伝子エレメント）に配置される。例えば、天然に存在する核酸（例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサーなど）が、天然に手段しない手段により、その核酸にとってネイティブではないゲノムの座位（例えば、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター、またはアンプリコン）に導入される場合、その核酸は単離状態となる。このような核酸は、「異種性」核酸とも称される。例えば、単離されたウイルスは、野生型ウイルスのネイティブな環境（例えば、感染した個体の上咽頭）以外の環境（例えば、細胞培養系、または細胞培養から精製された環境）に存在する。
ウイルスまたは弱毒化ウイルスの「免疫学的有効量」は、個体（例えば、ヒト）が当該病原体に次に曝露されたときに自らの免疫応答を増強するのに十分な量である。誘導された免疫のレベルは、例えば、中和分泌および／または血清抗体の量を測定することにより、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合免疫吸着、またはマイクロ中和アッセイにより、モニタリングすることができる。
ウイルスに対する「防御免疫応答」とは、個体（例えば、ヒト）によって示される免疫応答であって、その個体が次に野生型ウイルスに曝露されおよび／または感染したときに、重篤な下気道疾患（例えば、肺炎および／または細気管支炎）に対し防御的である免疫応答を指す。
キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ
天然に存在するＲＳＶ粒子は、典型的には、マトリックスタンパク質および糖タンパク質を含むエンベロープによって囲まれたらせん状ヌクレオカプシド内にウイルスゲノムを含む。ヒト野生型ＲＳＶのゲノムは、タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２－１、Ｍ２－２、およびＬをコードし、Ｇ、Ｆ、およびＳＨは糖タンパク質である。ＲＳＶポリメラーゼ活性は、大タンパク質（Ｌ）およびリンタンパク質（Ｐ）からなる。ウイルスのＭ２－１タンパク質は転写中に使用され、おそらくは転写複合体の一成分である。ウイルスのＮタンパク質は複製中に新生ＲＮＡをカプシド形成するのに使用される。
ゲノムは宿主細胞の細胞質で転写および複製される。宿主細胞の転写の結果、典型的には、１０個のメチル化およびポリアデニル化されたｍＲＮＡが合成される。アンチゲノムは、複製中に生じたゲノムのプラスセンスＲＮＡ補体であり、これは次にゲノム合成の鋳型として作用する。ウイルス遺伝子には、保存的な遺伝子開始（ＧＳ）配列および遺伝子末端（ＧＥ）配列が隣接している。ゲノムの３’末端および５’末端には、リーダーおよびトレーラーヌクレオチドがある。野生型リーダー配列は、３’末端にプロモーターを含む。ウイルスポリメラーゼがＧＥシグナルに到達すると、ポリメラーゼはポリアデニル化してｍＲＮＡを放出し、次のＧＳシグナルでＲＮＡ合成を再開する。Ｌ－Ｐ複合体は、プロモーターの認識、ＲＮＡ合成、ｍＲＮＡの５’末端のキャッピングおよびメチル化、ならびに３’末端のポリアデニル化を担うと考えられている。ポリメラーゼは時として接合部で遺伝子から解離すると考えられている。ポリメラーゼはゲノムの３’末端で転写を開始するため、その結果発現の勾配が生じ、ゲノムの３’末端の遺伝子は５（末端の遺伝子よりも高頻度で転写される。
ゲノムを複製するために、ポリメラーゼはｃｉｓ作用性ＧＥおよびＧＳシグナルに応答せず、ゲノムのプラスセンスＲＮＡ補体、アンチゲノムを生成する。アンチゲノムの３’末端にトレーラーの補体が存在し、これはプロモーターを含む。ポリメラーゼは、このプロモーターを使用してゲノムセンスＲＮＡを生成する。裸のＲＮＡとして放出されるｍＲＮＡとは異なり、アンチゲノムおよびゲノムＲＮＡは、合成される際にウイルス核タンパク質（Ｎ）によりカプシド形成される。
ウイルスｍＲＮＡの翻訳後、全長（＋）アンチゲノムＲＮＡが、（－）ＲＮＡゲノムの複製のための鋳型として産生される。感染性組換え型ＲＳＶ（ｒＲＳＶ）粒子は、形質移入したプラスミドから回収することができる。ＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｌ、およびＭ２－１タンパク質の同時発現、ならびに全長アンチゲノムＲＮＡがあれば、ＲＳＶ複製に十分である。Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，１９９５，９２（２５）：１１５６３－１１５６７および米国特許第６，７９０，４４９号を参照。
ある特定の実施形態において、本開示は、キメラ型Ｆポリペプチドの特定の所望の配列およびそれをコードする組換え型核酸に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、これらのポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターおよび当該ベクターを含む細胞を企図している。ある特定の実施形態において、ベクターは、選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端を含む、キメラ型Ｆタンパク質に関する。キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質はＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメインも含むことができ、このとき、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、Ｎ→Ｃ末端方向で、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメイン、ＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメイン、およびＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端を含む。
ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの位置および構造は当技術分野で知られており（例えば、参照）、配列ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＥＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＲＲＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＫＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴ（配列番号８）、ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＤＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＲＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＳＡＥＫＧＮＴ（配列番号９）、またはこれらの部分（例えば、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、もしくは少なくとも約４００アミノ酸を含むこれらのフラグメント、またはこれらに対し少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の配列同一性を備える配列）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメインは、約１～１００アミノ酸、約１～９０アミノ酸、約１～８０アミノ酸、約１～７０アミノ酸、約１～６０アミノ酸、または約１～５０アミノ酸、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０アミノ酸によって切断される。
ＲＳＶ膜貫通ドメイン（ＴＭ）の位置および構造は、当技術分野で知られており（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＰＮＡＳ ８１：７６８３－７６８７の図３を参照）、配列ＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳＬＩＡＶＧＬＬＬ（配列番号１０）、ＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣ（配列番号１１）、ＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣ（配列番号１２）、もしくはＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬ（配列番号１３）、または上記のいずれかの部分（例えば、少なくとも約１５アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２１アミノ酸、少なくとも約２２アミノ酸、少なくとも約２３アミノ酸、少なくとも約２４アミノ酸、もしくは少なくとも約２５アミノ酸を含む上記のいずれかのフラグメント、または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の配列同一性を含む配列）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＲＳＶ ＴＭドメインは、約１～１５アミノ酸、約１～１０アミノ酸、約１～５アミノ酸、約１～３アミノ酸、約５～１５アミノ酸、または約５～１０アミノ酸によって、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０アミノ酸によって切断される。
ＲＳＶ細胞質側末端（ＣＴ）ドメインの位置および構造は、当技術分野で知られており（例えば、Ｂａｖｉｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７（１９）：１０７３０－１０７４１を参照）、配列ＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号１４）、ＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号１５）、ＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＫ（配列番号１６）、もしくはＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＫ（配列番号１７）、または上記のいずれかの部分（例えば、少なくとも約１５アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２１アミノ酸、少なくとも約２２アミノ酸、もしくは少なくとも約２３アミノ酸を含む上記のいずれかのフラグメント、または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の配列同一性を含む配列）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＲＳＶ ＣＴドメインは、約１～１５アミノ酸、約１～１０アミノ酸、約１～５アミノ酸、約１～３アミノ酸、約５～１５アミノ酸、または約５～１０アミノ酸によって、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０アミノ酸によって切断される。
ある特定の実施形態において、本開示は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のＮ末端部分およびＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分を含むキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質を提供する。ある特定の実施形態において、ｈＭＰＶ－ＲＳＶキメラ型Ｆタンパク質のＮ末端部分は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のＮ末端部分の約４００～約５４０アミノ酸、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のＮ末端部分の約４２５～約５２５アミノ酸、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のＮ末端部分の約４５０～約５００アミノ酸、またはｈＭＰＶ Ｆタンパク質のＮ末端部分の約４７０～約４９０アミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、ｈＭＰＶ－ＲＳＶキメラ型Ｆタンパク質のＣ末端部分は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約１０～約１００アミノ酸、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約２５～約７５アミノ酸、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約４０～約６０アミノ酸、またはＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約５０アミノ酸を含む。
キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質での使用に適したｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列としては、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１９３（３）：３８７－３９５に記載されているようなＴＮ／９４－４９（サブグループＡ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＫ２６８９５．１）株、ＴＮ／９６－１２（サブグループＡ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＫ２６８８６．１）株、ＴＮ／９８－２４２（サブグループＢ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＫ２６９０６．１）、およびＴＮ／８９－５１５（サブグループＢ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＪ５３６１２．１）のＦタンパク質が挙げられる。キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質での使用に適した他のｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列としては、ＡＣＪ５３５６５．１、ＡＨＶ７９８５８．１、ＢＢＢ３５０８８．１、ＡＨＶ７９４７３．１、ＡＡＳ２２１２５．１、ＡＵＦ７２４４５．１、およびＡＣＪ５３５７５．１が挙げられる。キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質での使用に適したＲＳＶ Ｆタンパク質配列としては、Ｈｏｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９，５１２－５２２（２０１５）；Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９０，２４５－２５３（２０１５）；およびＨｏｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４３４，１２９－１３６（２０１２）に記載されているような株Ａ２－系統１９ＦおよびＡ２－系統１９Ｆ（Ｉ５５７Ｖ）由来のＦタンパク質、ならびにＲｏｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９２（６）：ｅ０１５６８－１７（２０１８）に記載されているようなＢｕｅｎｏｓ Ａｉｒｅｓ（サブグループＢ）Ｆタンパク質のコンセンサス配列が挙げられる。キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質での使用に適した他のＲＳＶ Ｆタンパク質配列としては、ＡＵＣ６８１４９．１、ＡＨＷ８１４３０．１、ＡＩＺ９５８９３．１、ＡＨＷ８１４４０．１、およびＡＪＺ７００６７．１が挙げられる。
ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質で使用されるｈＭＰＶおよびＲＳＶ配列の部分は、野生型タンパク質の対応する部分に対し約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約９９％以上の配列同一性を含む。
ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号１、または配列番号１に対し約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上の配列同一性を含むタンパク質を含む。
ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、トリプシン非依存的切断部位を導入するためにＲＱＳＲ（配列番号１８）～ＲＲＲＲ（配列番号１９）の変異を含む。この変異は、ウイルスのトリプシン非依存的増殖を促進する。この変異を導入するための方法は、当技術分野で知られている。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８５（１）を参照。
ＲＳＶを保存するための一般的なベクターとしては、プラスミドおよびバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）が挙げられる。典型的には、バクテリア人工染色体は、Ｆ因子のｏｒｉＳ、ｒｅｐＥ、ｐａｒＡ、およびｐａｒＢ遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を、選択マーカー（例えば、抗生物質に対し抵抗性をもたらす遺伝子）と作用可能な組合せで含む。核酸配列は、任意選択で変異したウイルスのゲノムまたはアンチゲノム配列、例えば、任意選択で変異したＲＳＶ株とすることができる。
Ｅ．ｃｏｌｉでのＲＳＶの培養は、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）を利用することによって遂行することができる。ＲＳＶを保存および遺伝子操作するためのＢＡＣベクターは、Ｓｔｏｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１６，１４４２：１４１－５３および米国特許出願公開第２０１２／０２６４２１７号で報告されている。開示されたＢＡＣは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）株１９系統のアンチゲノム配列であるＦ遺伝子を除いて、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）株Ａ２の完全なアンチゲノム配列を含む。
これは、ヘルパープラスミドと共に、感染性ウイルスを回収するためのリバースジェネティクスシステムで使用することができる。プラスミド上のアンチゲノム配列をウイルス回収前に変異させて、所望の変異を有するウイルスを生成することができる。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＲＳＶ－ｈＭＰＶ粒子を生成する方法であって、ＢＡＣ遺伝子およびＲＳＶ－ｈＭＰＶアンチゲノムを有するベクターを単離された真核細胞に挿入することと、ＲＳＶのＮタンパク質をコードするベクター、ＲＳＶのＰタンパク質をコードするベクター、ＲＳＶのＬタンパク質をコードするベクター、ＲＳＶのＭ２－１をコードするベクターからなる群より選択される１つ以上のベクターを、ＲＳＶビリオンが形成される条件下で細胞に挿入することとを含む、方法に関する。ベクターの細胞への挿入は、ベクターが細胞に進入する条件下で、細胞およびベクターを物理的に注入、電気穿孔、または混合することによって行うことができる。
キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、ある特定の変異、欠失、またはバリアントの組合せ、例えば、ＲＳＶの低温継代された（ｃｐ）非温度感受性（ｔｓ）誘導体、ｃｐＲＳＶ、例えばｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨを含むことが企図されている。ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＳＨは、４つの独立した弱毒化遺伝子エレメント：ｃｐ（ｃｐＲＳＶの非ｔｓ弱毒化表現型を付与するＮおよびＬタンパク質のミスセンス変異に基づく）、ｔｓ２４８（Ｌタンパク質のミスセンス変異）、ｔｓ４０４（Ｍ２遺伝子の遺伝子開始転写シグナルにおけるヌクレオチド置換）、およびΔＳＨ（ＳＨ遺伝子の完全欠失）を含む。ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨは、独立した弱毒化遺伝子エレメント：ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＳＨに存在するもの、およびｔｓ１０３０（Ｌタンパク質におけるもう１つのミスセンス変異）を含む。Ｋａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．，２００５，１９１（７）：１０９３－１１０４（参照により本明細書に援用される）を参照。ある特定の実施形態において、ＲＳＶ－ｈＭＰＶアンチゲノムは、必須でない遺伝子（例えば、ＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、およびＭ２－２遺伝子）またはこれらの組合せにおいて欠失または変異を含み得ることが企図されている。
遺伝暗号の冗長性のため、個々のアミノ酸は、複数のコドン配列（同義コドンと称されることもある）によってコードされる。異なる種では、同義コドンは多少頻繁に使用され、コドンバイアスと称されることがある。過小表示された同義コドンの遺伝子のコード配列への遺伝子操作は、タンパク質のアミノ酸配列の変化なしにタンパク質の翻訳速度を低下させることが示されている。Ｍｕｅｌｌｅｒ他は、コドンバイアスの変化によるウイルスの弱毒化を報告している。Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２０：１７８４を参照。また、ＷＯ／２００８１２１９９２、ＷＯ／２００６０４２１５６、Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６，８０（７）：３２５９、およびＭｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６，８０（１９）：９６８７も参照。
ＲＳＶにおけるコドン脱最適化の使用は、Ｍｅｎｇ他、ＭＢｉｏ ５、ｅ０１７０４－０１７１４（２０１４）および米国特許出願公開第２０１６／００３０５４９号で報告されている。ある特定の実施形態において、本開示は、単離された核酸、コドン脱最適化を伴う組換え型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ、それから産生されるワクチン、およびそれに関するワクチン接種方法に関する。ある特定の実施形態において、コドンの脱最適化は、非構造遺伝子ＮＳ１およびＮＳ２、ならびに任意選択で遺伝子Ｌにおけるものである。さらなる実施形態において、遺伝子ＳＨは欠失している。ある特定の実施形態において、コドン脱最適化は、配列番号１またはそのバリアントによってコードされた配列を有するキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質におけるものである。
ある特定の実施形態において、本開示は、脱最適化された遺伝子ＮＳ１および／またはＮＳ２、任意選択で野生型ヒトＲＳＶの遺伝子Ｌまたはそのバリアントをコードする単離された核酸であって、ヌクレオチドが、Ｇｌｙを産生するコドンがＧＧＴであり、Ａｓｐを産生するコドンがＧＡＴであり、Ｇｌｕを産生するコドンがＧＡＡであり、Ｈｉｓを産生するコドンがＣＡＴであり、Ｉｌｅを産生するコドンがＡＴＡであり、Ｌｙｓを産生するコドンがＡＡＡであり、Ｌｅｕを産生するコドンがＣＴＡであり、Ａｓｎを産生するコドンがＡＡＴであり、Ｇｌｎを産生するコドンがＣＡＡであり、Ｖａｌを産生するコドンがＧＴＡであり、またはＴｙｒを産生するコドンがＴＡＴであり、またはこれらの組合せであるように置換される、単離された核酸に関する。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子はさらに、個々のコドンのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての組合せを含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子は、少なくとも２０、３０、４０、または５０、またはそれより多くのコドンを含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、脱最適化された遺伝子ＮＳ１および／またはＮＳ２、任意選択で野生型ヒトＲＳＶの遺伝子Ｌまたはそのバリアントをコードする単離された核酸であって、ヌクレオチドが、Ａｌａを産生するコドンがＧＣＧであり、Ｃｙｓを産生するコドンがＴＧＴであり、Ｐｈｅを産生するコドンがＴＴＴであり、Ｐｒｏを産生するコドンがＣＣＧであり、Ａｒｇを産生するコドンがＣＧＴであり、Ｓｅｒを産生するコドンがＴＣＧであり、またはＴｈｒを産生するコドンがＡＣＧであり、またはこれらの組合せであるように置換される、単離された核酸に関する。ある特定の実施形態において、核酸を含む遺伝子は、個々のコドンのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または全ての組合せを含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子はさらに、少なくとも２０、３０、４０、または５０、またはそれより多くのコドンを含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、キメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、配列番号１またはそのバリアントを含むキメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質）のための脱最適化された遺伝子をコードする単離された核酸であって、ヌクレオチドが、Ｇｌｙを産生するコドンがＧＧＴであり、Ａｓｐを産生するコドンがＧＡＴであり、Ｇｌｕを産生するコドンがＧＡＡであり、Ｈｉｓを産生するコドンがＣＡＴであり、Ｉｌｅを産生するコドンがＡＴＡであり、Ｌｙｓを産生するコドンがＡＡＡであり、Ｌｅｕを産生するコドンがＣＴＡであり、Ａｓｎを産生するコドンがＡＡＴであり、Ｇｌｎを産生するコドンがＣＡＡであり、Ｖａｌを産生するコドンがＧＴＡであり、またはＴｙｒを産生するコドンがＴＡＴであり、またはこれらの組合せであるように置換される、単離された核酸に関する。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子はさらに、個々のコドンのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての組合せを含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子は、少なくとも２０、３０、４０、または５０、またはそれより多くのコドンを含む。
Ｇｌｅｎｎ他は、妊娠可能年齢の健康な女性を対象とした呼吸器合胞体ウイルス組換え型融合（Ｆ）ナノ粒子ワクチンのランダム化盲検対照用量設定試験を報告している。Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１６，２１３（３）：４１１－２２。ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で報告されるＲＳＶコア構造タンパク質としての、キメラ型ｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、配列番号１またはそのバリアントを含むキメラｈＭＰＶおよびＲＳＶ Ｆタンパク質）を含むウイルス粒子およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。ウイルス粒子は一般的に、不活化ワクチン（または死菌ワクチン）として使用される。ＲＳＶは、培養下で増殖させ、次いで熱またはホルムアルデヒドなどの方法を用いて死滅させることができる。弱毒化生ワクチンは、典型的には、複製および／または感染の速度が遅くなるように弱体化させる。
ある特定の実施形態において、本開示は、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ粒子を全ウイルスワクチンとして、例えば、ＲＳＶ－ｈＭＰＶのゲノムが非複製性または非感染性であるように、熱、化学物質、または放射線に曝露された全ウイルス粒子として企図している。ある特定の実施形態において、本開示は、界面活性剤を使用してウイルスを破壊することにより、そして本明細書で開示されるキメラ型Ｆタンパク質を免疫系を刺激する抗原として精製してウイルスに対する応答を開始させることにより産生される、スプリットウイルスワクチン中のキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ粒子を企図している。
ＶＬＰは成熟ビリオンに酷似しているが、ウイルスゲノム物質（すなわち、ウイルスゲノムＲＮＡ）を含まない。したがって、ＶＬＰは本質的に複製的ではない。加えて、ＶＬＰは、ＶＬＰの表面にタンパク質を発現することができる。さらに、ＶＬＰはインタクトなビリオンに類似し、多価粒子構造であるため、ＶＬＰは、表面タンパク質に対する中和抗体を誘導するのに有効であり得る。ＶＬＰは反復して投与することができる。
ある特定の実施形態において、本開示は、表面上の本明細書で開示されるキメラ型Ｆタンパク質およびインフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ１）タンパク質コアを含むＶＬＰを企図している。Ｑｕａｎ他は、インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ１）タンパク質コアおよび表面上のＲＳＶ－Ｆから構成されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法を報告している。Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１１，２０４（７）：９８７－９９５。ＲＳＶ ＦおよびインフルエンザＭ１を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、これを昆虫細胞に形質移入して産生させることができる。
使用方法
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示されるキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ、ＲＳＶおよび／もしくはｈＭＰＶポリペプチド、ＲＳＶ－ｈＭＰＶ粒子、ＲＳＶ－ｈＭＰＶウイルス様粒子、ならびに／または核酸の免疫学的有効量を含む免疫原性組成物に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、個体の免疫系を刺激して、ｈＭＰＶおよび／またはＲＳＶに対する防御免疫応答を産生するための方法に関する。ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ、ポリペプチド、および／または核酸の免疫学的有効量は、生理学的に許容される担体中で個体に投与される。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される使用のための、本明細書で開示される核酸を含む医薬およびワクチン製品に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される使用のための医薬およびワクチン製品の製造のための、本明細書で開示される核酸またはベクターの使用に関する。
また、本開示は、他のタイプの弱毒化変異を分析し、これをワクチンまたは他の使用のためにキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶに組み込む能力も提供する。例えば、マウスの肺炎ウイルス（ＲＳＶのマウス対応物）の組織培養適合非病原性株は、Ｇタンパク質の細胞質側末端が欠如している（Ｒａｎｄｈａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０７：２４０－２４５（１９９５））。類推すれば、糖タンパク質ＨＮ、Ｇ、ＳＨの各々の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、欠失または修飾すれば弱毒化を達成する可能性がある。
本開示の感染性ＲＳＶ－ｈＭＰＶで使用するための他の変異には、ＲＳＶ－ｈＭＰＶミニゲノムの変異分析中に同定されたｃｉｓ作用性シグナルにおける変異が含まれる。例えば、リーダー配列、トレーラー配列、およびフランキング配列の挿入および欠失の分析によって、ウイルスプロモーターおよび転写シグナルが同定され、様々な程度のＲＮＡ複製または転写の低減に関連する一連の変異が示された。これらのｃｉｓ作用性シグナルの飽和変異誘発（各位置が順番に各ヌクレオチド代替物に改変される）によっても、ＲＮＡ複製または転写を低減する（またはある場合には増加させる）多くの変異が同定された。これらの変異のいずれも、本明細書で記載されるように、完全なアンチゲノムまたはゲノムに挿入することができる。他の変異は、ゲノムの３’末端のアンチゲノムの対応物による置換えを伴い、これはＲＮＡの複製および転写の変化に関連する。加えて、遺伝子間領域（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４５９４－４５９８（１９８６）（参照により本明細書に援用される））は、配列内容を短縮または延長または変化させることができ、天然に存在する遺伝子重複（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５１３４－５１３８（１９８７）（参照により本明細書に援用される））は、本明細書で記載される方法によって除去または異なる遺伝子間領域に変化させることができる。
ワクチン使用向けには、本開示に従って産生されたウイルスは、ワクチン製剤で直接使用してもよく、または所望により、当業者に周知されている凍結乾燥プロトコルを用いて凍結乾燥してもよい。凍結乾燥したウイルスは、典型的には、約４℃に維持される。使用の準備ができたら、凍結乾燥したウイルスを、安定化溶液（例えば、生理食塩水）中で、またはＳＰＧ、Ｍｇ、およびＨＥＰＥＳを含み、アジュバントを伴うまたは伴わない安定化溶液中で再構成する。
典型的には、本開示のＲＳＶ－ｈＭＰＶワクチンは、活性成分として、本明細書で記載されるように産生されるキメラ型ウイルスの免疫遺伝学的有効量を含む。修飾されたウイルスは、生理学的に許容される担体および／またはアジュバントと共に対象に導入され得る。有用な担体が当技術分野で周知されており、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが挙げられる。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージングする場合も、凍結乾燥する場合もあり、凍結乾燥製剤は、上述のように投与前に滅菌溶液と合わせる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調製および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含むことができる。許容されるアジュバントとしては、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンが挙げられ、これらは当技術分野で周知された物質である。
本明細書で記載されるようなキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ組成物を用いて、エアロゾル、液滴、経口、局所、または他の経路を介し免疫化すると、対象の免疫系は、ウイルスタンパク質、例えばＦ糖タンパク質に特異的な抗体を産生することにより、ワクチンに応答する。ワクチン接種の結果として、対象は、ｈＭＰＶおよび／もしくはＲＳＶ感染に対し少なくとも部分的もしくは完全に免疫を得るか、または中等症もしくは重症の（特に下気道の）ｈＭＰＶおよび／もしくはＲＳＶ感染に対し抵抗性を得る。
ワクチンが投与される対象は、ｈＭＰＶおよび／もしくはＲＳＶまたは密接に関連するウイルスによる感染に感受性であり、かつ対象がワクチン接種株の抗原に対し防御免疫応答を生成可能な任意の哺乳類とすることができる。したがって、好適な対象としては、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ（ｌａｇａｍｏｒｐｈ）、げっ歯類などが挙げられる。したがって、本開示は、様々なヒトおよび獣医学的使用のためのワクチンを作出するための方法を提供する。
本開示のＲＳＶ－ｈＭＰＶを含むワクチン組成物は、ｈＭＰＶおよび／もしくはＲＳＶ感染に感受性であるまたは別の形でそのリスクがある対象に投与されて、対象自身の免疫応答能力を増強する。このような量は、「免疫学的有効用量」として定義される。この使用においてもまた、的確な量は、対象の健康状態および体重、投与様式、製剤の性質に依存する。ワクチン製剤は、重篤なまたは生命を脅かす感染から対象患者を有効に保護するのに十分な量の本開示のキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶを提供すべきである。
本開示に従って産生したキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、他のサブグループもしくは株のウイルスと組み合わせて、複数のＲＳＶ－ｈＭＰＶサブグループもしくは株に対する保護を達成することができ、または本明細書で記載されるようにこれらの株の保護エピトープを１つのウイルスに操作することができる。典型的には、異なるウイルスは混合して同時に投与されるが、別々に投与することもできる。例えば、２つのｈＭＰＶサブグループのＦ糖タンパク質はアミノ酸配列が異なるため、この類似性は、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶまたはＦ抗原で免疫化し、異種性株に曝露した動物で観察されるような交差防御免疫応答の基礎である。したがって、ある株による免疫化によって、同じまたは異なるサブグループの異なる株から保護される可能性がある。
場合によっては、本開示のキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶワクチンを、他の薬剤、特に他の小児ウイルスに対する防御応答を誘導するワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。例えば、本開示のキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶワクチンは、ＲＳＶワクチンと同時に投与することができる。
本開示のワクチン組成物の単回または複数回投与を行うことができる。新生児および乳児では、十分なレベルの免疫を誘発するために、複数回の連続投与が必要となり得る。投与の開始は、ネイティブ（野生型）感染に対する十分なレベルの保護を維持するために必要に応じて、生後１ヵ月以内またはそれ以前、生後約２ヵ月以内、典型的には生後６ヵ月以内、および２ヵ月、６ヵ月、１年、および２年のように小児期を通じて間隔を置いて行うことができる。同様に、反復的または重篤なＲＳＶ／ｈＭＰＶ感染に対し特に感受性である成人、例えば、医療従事者、デイケアワーカー、幼児の家族、高齢者（５５歳、６０歳、または６５歳以上）、または心肺機能が損なわれた個体は、防御免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を必要とし得る。誘導された免疫のレベルは、中和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによってモニタリングすることができ、薬用量は、所望のレベルの保護を維持するために必要に応じて調整されるか、またはワクチン接種が繰り返される。さらに、異なるワクチンウイルスは、異なるレシピエント群に有利であり得る。例えば、Ｔ細胞エピトープに富んださらなるタンパク質を発現する操作株は、乳児よりもむしろ成人に特に有利であり得る。
投与は、典型的には、治療される患者の気道へのエアロゾル、ネブライザー、または他の局所適用によって行われる。組換え型キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、所望の遺伝子産物の治療的または予防的レベルの発現をもたらすのに十分な量で投与される。この方法で投与される代表的な遺伝子産物の例としては、例えば、一過性発現に特に適したものをコードする遺伝子産物、例えば、インターロイキン－２、インターロイキン－４、ガンマ－インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、エリスロポエチン、および他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、およびワクチン抗原をコードするものが挙げられる。
ある特定の実施形態において、本開示は、免疫学的有効量の本開示の組換え型キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ（例えば、弱毒化生組換え型キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶまたは不活化非複製ＲＳＶ－ｈＭＰＶ）、本明細書で開示されるポリペプチド、および／または免疫学的有効量の本明細書で開示される核酸の免疫学的有効量を含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、個体の免疫系を刺激して、ｈＭＰＶに対する防御免疫応答を産生するための方法に関する。当該方法では、本明細書で開示される組換え型キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶの免疫学的有効量、本明細書で開示されるポリペプチドの免疫学的有効量、および／または本明細書で開示される核酸の免疫学的有効量が、生理学的に許容される担体中で個体に投与される。
典型的には、担体または賦形剤は、医薬的に許容される担体または賦形剤、例えば、滅菌水、食塩水溶液、緩衝食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、またはこれらの組合せである。滅菌性、ｐＨ、等張性、および安定性を保証するこのような溶液の調製は、当技術分野で確立されたプロトコルに従って影響を受ける。概して、担体または賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない効果を最小限にし、かつ特定の投与経路（例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内、経口、局所など）に適合するように選択される。得られた水溶液は、例えば、そのままで使用するためにパッケージングする場合もあれば、凍結乾燥する場合もあり、凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌溶液と合わされる。
ある特定の実施形態において、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ（または成分、例えば、ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質）は、ｈＭＰＶの１つ以上の株に特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で投与される（例えば、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶまたは成分、例えば、ＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の免疫学的有効量が投与される）。好ましくは、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶの投与は、防御免疫応答を誘発する。ｈＭＰＶおよび／またはＲＳＶに対する防御免疫応答を産生するのに適した防御抗ウイルス免疫応答を誘発するための薬用量および方法は、当業者に知られている。例えば、米国特許第５，９２２，３２６号；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７－４００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ５２：５６－６３；およびＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．８８：９３１－９３６を参照。例えば、ウイルスは、投与される用量当たり約１０３～１０６ｐｆｕ（プラーク形成単位）の範囲（例えば、投与される用量当たり１０４～１０５ｐｆｕ）で提供され得る。典型的には、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与の様式および時間、ならびに他の臨床的因子に基づいて調整される。ワクチン製剤は、全身投与することができ、例えば、針およびシリンジまたはニードルレス注射デバイスを用いて皮下または筋肉内に注射することができる。好ましくは、ワクチン製剤は、鼻腔内に、例えば、液滴、エアロゾル（例えば、大粒子エアロゾル（約１０ミクロンより大きい））、またはスプレーによって上気道に投与される。上記の送達経路のいずれかが防御的全身免疫応答をもたらす一方で、鼻腔内投与は、ウイルスの進入部位で粘膜免疫を誘導するという付加的な利益を付与する。鼻腔内投与のためには、弱毒化生ウイルスワクチン、例えば弱毒化、低温馴化、および／または温度感受性組換えウイルスがしばしば好ましい。弱毒化生ウイルスワクチンの代替として、またはそれに加えて、例えば、死滅ウイルスワクチン、核酸ワクチン、および／またはポリペプチドサブユニットワクチンを使用することができ、このことはＷａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５：１１９８－１２０４およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８：４９７－５０２によって示唆されている。
ある特定の実施形態において、弱毒化組換え型キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶは、ワクチンで使用されるように十分に弱毒化されており、その結果、ウイルス成分（例えば、本明細書の核酸またはポリペプチド）がワクチンまたは免疫原性組成物として使用される実施形態においては、弱毒化ウイルスで免疫化した（または別の形で感染した）ほとんどの個体において、感染の症状、または少なくとも重篤な感染の症状が生じない。ただし、典型的には、ワクチン接種されたまたは偶発的な対象で軽症または重症の下気道感染症が典型的に生じないように、毒力は十分に抑止される。
単回用量による防御免疫応答の刺激が好ましいが、所望の予防効果を達成するために、同じ経路または異なる経路によって、さらなる用量を投与することができる。例えば、新生児および乳児では、十分なレベルの免疫を誘発するために、複数回の投与が必要となり得る。投与は、野生型ｈＭＰＶ感染に対する十分なレベルの保護を維持するために必要に応じて、小児期を通じて間隔を置いて継続することができる。同様に、反復的または重篤なｈＭＰＶ感染に対し特に感受性である成人、例えば、医療従事者、デイケアワーカー、幼児の家族、高齢者、および心肺機能が損なわれた個体は、防御免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を必要とし得る。誘導された免疫のレベルは、例えば、中粒子和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによってモニタリングすることができ、薬用量は、所望のレベルの保護を誘発および維持するために必要に応じて調整されるか、またはワクチン接種が繰り返される。
代替的に、免疫応答は、ウイルスによる樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ標的化によって刺激され得る。例えば、増殖している樹状細胞は、樹状細胞によるｈＭＰＶ抗原の捕捉を可能にするのに十分な量および時間でウイルスに曝露される。次いで、細胞を、標準的な静脈内移植法によってワクチン接種対象に移行させる。
任意選択で、ワクチンの投与のための製剤は、ｈＭＰＶ抗原に対する免疫応答を増強するための１つ以上のアジュバントも含む。企図されているアジュバントとしては、アルミニウム塩、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）およびＡｄｊｕｐｈｏｓ（登録商標）が挙げられる。企図されているアジュバントには、水中油型エマルジョンが含まれ、このとき、油は水相中の溶質として作用し、乳化剤によって安定化された単離された液滴を形成する。ある特定の実施形態において、エマルジョンは、スクアレンまたはα－トコフェロール（ビタミンＥ）を、界面活性剤としてのソルビタントリオレエートおよびポリソルベート－８０（ＰＳ８０）などの追加の乳化剤と共に含む。ある特定の実施形態において、エマルジョンは、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含む。ＧＬＡは、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶ、粒子、またはＦタンパク質と共に、単独でまたはスクアレンベースの水中油型安定性エマルジョン（ＳＥ）中で製剤化することができる。Ｉｙｅｒ他は、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（ＲＳＶ－Ｆ）を用いた異なる粒子サイズの水中油型アジュバントを報告している。Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１５，１１（７）：１８５３－１８６４。
好適なアジュバントとしては、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、および合成アジュバントＱＳ－２１が挙げられる。
所望の場合、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶの予防的ワクチン投与は、１つ以上の免疫刺激分子の投与と共に実施することができる。免疫刺激分子としては、免疫刺激活性、免疫強化活性、および炎症促進活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３）；成長因子（例えば、顆粒球－マクロファージ（ＧＭ）－コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；および他の免疫刺激分子（例えば、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２など）が挙げられる。免疫刺激分子は、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶと同じ処方で投与することができ、または別々に投与することもできる。タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果を産生することができる。
特定のサブグループの特定の株のキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶによる個体のワクチン接種は、異なる株および／またはサブグループのウイルスに対する交差防御を誘導することができるが、所望の場合、少なくとも２つの株（例えば、各々が異なるサブグループに相当する）由来の弱毒化ｈＭＰＶを個体にワクチン接種することにより、交差防御を増強することができる。同様に、キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶワクチンは、任意選択で、他の感染病原体に対する防御免疫応答を誘導するワクチンと組み合わせることができる。
実施例１：キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶウイルスの組立ておよびレスキュー
キメラ型ヒトＲＳＶ－ｈＭＰＶ Ｆタンパク質。
ＲＳＶワクチンの遺伝的背景内で呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）系統１９Ｆの尾部領域を含むｈＭＰＶのキメラ融合（Ｆ）タンパク質を発現する弱毒化生ワクチン候補を構築した。候補は、ＲＳＶ Ａ２リバースジェネティクスシステムを用いて組み立てたものであり、免疫調節性ＮＳ１およびＮＳ２遺伝子のコドン脱最適化と、小疎水性（ＳＨ）遺伝子の欠失と、ＯＥ１と名付けたコンストラクト遠赤外蛍光単量体Ｋａｔｕｓｈｋａ２（ｍＫａｔｅ２）タンパク質の発現とを含む。米国特許出願公開第２０１６００３０５４９号を参照。ＮＳ１およびＮＳ２遺伝子をコドン脱最適化した。これによってタンパク質の発現が減少するがなくなるわけではない。
制限部位Ｓａｌ ＩおよびＳａｃ ＩＩを用いてＲＳＶ系統１９Ｆ遺伝子を置き換えることにより、ＲＳＶ－ｈＭＰＶキメラ型Ｆ遺伝子をＢＡＣ ＯＥ１コンストラクトに挿入した。遺伝子開始および遺伝子停止はＲＳＶ特異的であった。加えて、ＲＱＳＲ（配列番号：１８）からＲＲＲＲ（配列番号：１９）までのトリプシン非依存的切断部位をＦタンパク質に導入した。これによってウイルスのトリプシン非依存的増殖が促進される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８５（１）を参照）。ＲＳＶ－ｈＭＰＶキメラ型Ｆタンパク質を配列番号１として下記に示す。これは、配列番号２として下記に示す遺伝子によってコードされる。
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＥＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＲＲＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＫＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号１）
ＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＡＡＣＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＡＴＣＡＴＧＴＡＧＣＡＣＴＡＴＡＡＣＴＧＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＴＡＣＣＡＡＣＧＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＡＧＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＡＧＡＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＣＴＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＧＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＣＴＡＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＴＴＧＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＣＴＣＧＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＴＴＡＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣＴＴＡＡＴＧＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＧＣＣＡＧＧＧＣＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＧＴＡＡＴＴＴＡＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴＧＧＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＡＣＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＴＴＡＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＡＴＧＧＴＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＧＴＴＧＣＴＴＧＣＴＡＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＧＴＡＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＣＴＣＣＴＡＴＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＡＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＡＴＣＡＧＣＴＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＡＴＣＡＴＧＡＴＡＡＣＴＡＣＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡＧＴＧＡＴＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＡＣＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＡＡＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＣＴＧＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＧＴＡＡＣＴＧＡ（配列番号２）
バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）コンストラクトの生成
ＯＥ１のためのバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）コンストラクトを使用して、本明細書で開示されるキメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶコンストラクトＤＨ２を生成した。ＯＥ１のためのバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）コンストラクトは、Ａ２－ｍＫａｔｅ２－系統１９Ｆ（Ｉ５５７Ｖ）を含むＢＡＣの修飾によって生成した。Ｈｏｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｍｅｎａｂｌｅ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３４，１２９－１３６（２０１２）を参照。遠赤蛍光レポーターである単量体Ｋａｔｕｓｈｋａ２（ｍＫａｔｅ２，Ｋ）の遺伝子は、ＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡの最初の遺伝子位置にある。この位置にｍＫａｔｅ２を含めたところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもマウスでもＲＳＶは減弱しなかった。ＳＨの欠失（ΔＳＨ）を、組換え媒介性変異誘発（組換え操作）によって実施した。オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、アンプリコン末端が標的部位に対し相同であるようにｇａｌＫカセットをＰＣＲ増幅して、ＳＨをｇａｌＫで置き換えた。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えの結果、遺伝子の開始点からＳＨ－Ｇ遺伝子間領域の末端まで、ＳＨがｇａｌＫカセットに置き換えられた。相補的なオリゴヌクレオチドをアニールし、これを使用して組換えの第２ステップでｇａｌＫカセットを除去した。ＳＨの的確な欠失をシークエンシングによって確認して、Ａ２－Ｋ－ΔＳＨ－系統１９Ｆ（Ｉ５５７Ｖ）ＢＡＣを得た。
ヒトコドン脱最適化ＮＳ１は、配列番号３であり、
ＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＴＧＴＴＡＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＣＴＡＡＣＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＴＡＣＧＡＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＧＴＣＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＡＡＡＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＡＣＴＡＧＡＴＧＡＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＧＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＧＧＡＴＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＧ ＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＡＡＡＴＣＣＧＴＡＡ
ＮＳ２は、配列番号４である。
ＡＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＴＡＡＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＡＧＡＡＡＣＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＴＣＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＧＡＴＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＴＡＣＧＴＡＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＴＴＣＧＡＣＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣＧＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＡＡＡＴＣＣＧＴＡＡ
ＤＨ２の配列
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ヒトメタニューモウイルスＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＫ２６８９５．１（ＴＮ／９４－４９Ｆ；配列番号５）
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＥＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＫＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＳＭＩＬＶＳＩＦＩＩＩＫＫＴＫＫＱＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＳ
Ｖｅｒｏ細胞および初代正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）におけるＤＨ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖
Ｖｅｒｏ細胞。６ウェルプレート中の７０％コンフルエントＶｅｒｏ細胞からの培地を吸引し、０．５ｍＬのウイルスを０．０１または０．５のＭＯＩで加えて、各ウイルス株について取得する各時点のウェルを複製した。プレートを室温で１時間揺すった。感染後、ウイルスを注意深く吸引し、単層を１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、２ｍＬの予め温めた完全なＥ－ＭＥＭ（Ｖｅｒｏ）を加えた。時間経過の間、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。感染後１、１２、２４時間、２、３、４、５、６、７、および８日目に時点を取得した。各時点で、単層を掻き取って上清中に入れ、短時間ボルテックスし、液体窒素中で瞬間凍結してから－８０℃で保存した。
Ｖｅｒｏ細胞におけるＭＯＩ ０．５での感染から４８時間後のｈＭＰＶ Ｆタンパク質発現を図２に示す（野生型ｈＭＰＶ（１）、模擬（２）、ＲＳＶ株ＯＥ１（３）、およびｈＭＰＶワクチン候補ＤＨ２（４））。同量のタンパク質をブロットした。
Ｖｅｒｏ細胞におけるｈＭＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖曲線を図３Ａに示す。上記のように、細胞を各時点について２連でＭＯＩ ０．１で感染させた。蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）アッセイにより、試料をＶｅｒｏ細胞上で滴定した。図３Ｂは、感染したＶｅｒｏ細胞の代表的な画像を示している。
ＮＨＢＥ細胞をＡＬＩで分化させ、単層をＰＢＳで洗浄してから、ＭＯＩ ０．１で１００μＬのウイルスで先端に感染させた。ウイルスを３７℃で２時間インキュベートしてから除去し、続いてＰＢＳで３回洗浄した。指定の時点で、１５０μＬの培地を先端面で３７℃で１０分間インキュベートし、これを収集しマイクロ遠心管に移した。このプロセスを繰り返して合計３００μＬのプールされた先端洗浄液を得、これを液体窒素中で凍結し、後の滴定のために－８０℃で保存した。Ｖｅｒｏ細胞の全ての分析についてＦＦＵ滴定を実施した。
ＮＨＢＥにおけるｈＭＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖曲線を図４に示す。上記のように、細胞を各時点について２連でＭＯＩ ０．１で感染させた。蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）アッセイにより、試料をＶｅｒｏ細胞上で滴定した。
ＢＳＲ／Ｔ７細胞におけるＤＨ２のレスキュー
４つのキメラ型ｈＭＰＶコンストラクトを生成し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定的に発現するＢＨＫ－２１ベースの細胞株クローンであるＢＳＲ／Ｔ７細胞でのレスキューを試みた。Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３（１）：２５１－２５９を参照。コンストラクトはＤＨ１～４と名付けた。ＤＨ１およびＤＨ２は、ＯＥ１（野生型Ｇ）の骨格を用いて構築した。ＤＨ１は全長ｈＭＰＶ Ｆ（配列番号５）を有し、ＤＨ２はＲＳＶ－ｈＭＰＶキメラ型Ｆ（配列番号２）を有する。ＤＨ３（全長ｈＭＰＶ Ｆ）およびＤＨ４（ＲＳＶ－ｈＭＰＶキメラ型Ｆ）は、ＯＥ４の骨格を用いて構築した。ＯＥ４は、ＯＥ１と同様、コドン脱最適化されたＮＳ１およびＮＳ２ならびにＳＨ遺伝子の欠失を含む。Ｓｔｏｂａｒｔ（２０１６）（前掲）を参照。加えて、このコンストラクトは、コドン脱最適化されたＧ遺伝子を含む。ｈＭＰＶ Ｆ遺伝子およびＲＳＶ－ｈＭＰＶキメラ型Ｆ遺伝子は、トリプシン非依存的切断部位を導入するためのＲＱＳＲ（配列番号１８）～ＲＲＲＲ（配列番号１９）の変異を含んでいた。この変異は、ウイルスのトリプシン非依存的増殖を促進する。
レスキューは、ＢＳＲ／Ｔ７細胞をＲＳＶヘルパープラスミド（ＲＳＶ Ｐ、Ｎ、Ｍ２－１、Ｌ）およびキメラ型ｈＭＰＶコンストラクトのアンチゲノムを含むＢＡＣプラスミドで同時形質移入することによって実施した。レスキューを数回試みたところ、ＤＨ２およびＤＨ４のみがレスキューできることが明らかになった。しかしながら、コドン脱最適化されたＧを発現するＤＨ４は、ＤＨ２よりも顕著に増殖が遅く、このことから、この候補がワクチン向けとしては過度に弱毒化されている可能性があることを示された。全長ｈＭＰＶ Ｆを含むコンストラクトは増殖しなかった。このことから、ＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端を含むＦタンパク質のキメラ型形態を使用するのがｈＭＰＶワクチン産生に有利であることが実証された。

Claims (16)

  1. ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端を含む、キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質。
  2. ＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含み、前記キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質が、Ｎ→Ｃ末端方向で、前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のエクトドメイン、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメイン、および前記ＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞質側末端を含む、請求項１に記載のキメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質。
  3. 前記キメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質が、配列番号１または配列番号１に対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１に記載のキメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む生キメラ型ウイルスを含む、免疫原性組成物。
  5. 前記核酸が、配列番号２または配列番号２に対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
  6. 前記生キメラ型ウイルスが、呼吸器合胞体ウイルスのＳＨタンパク質をコードする遺伝子を含まない、請求項４または５に記載の免疫原性組成物。
  7. アジュバントおよび／または他の医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  8. 前記アジュバントが、アルミニウムゲル、アルミニウム塩、またはモノホスホリルリピドＡである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
  9. 前記アジュバントが、任意選択でα－トコフェロール、スクアレン、および／または界面活性剤を含む水中油型エマルジョンである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
  10. 対象をパラインフルエンザウイルスに対し免疫化する方法であって、請求項３～９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  11. 請求項１または請求項２に記載のキメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする核酸。
  12. 配列番号２または配列番号２に対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１１に記載の核酸。
  13. 請求項１１または請求項１２に記載の核酸を含むベクター。
  14. プラスミドまたはバクテリア人工染色体から選択される、請求項１３に記載のベクター。
  15. ＲＳＶのＮＳ１およびＮＳ２タンパク質と、請求項１または請求項２に記載のキメラ型ＲＳＶおよびｈＭＰＶ Ｆタンパク質とを含む、単離された組換え粒子。
  16. 弱毒化生キメラ型ＲＳＶ－ｈＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを含む、請求項１５に記載の単離された組換え粒子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023288296A1 (en) * 2021-07-15 2023-01-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Prefusion-stabilized chimeric hmpv-rsv f proteins
WO2023154960A1 (en) * 2022-02-14 2023-08-17 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pan-pneumovirus vaccine compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007524372A (ja) * 2003-02-28 2007-08-30 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 組換えヒトメタニューモウイルスおよびその使用
EP2970981B1 (en) * 2013-03-14 2020-10-28 Emory University Recombinant rsv with silent mutations, vaccines, and methods related thereto
EP3344290A4 (en) * 2015-08-31 2019-02-27 Technovax, Inc. VACCINE BASED ON VIRUS-LIKE PARTICLES OF HUMAN RESPIRATORY SYNZYTIAL VIRUS (HRSV)

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