CN113631187A - 嵌合RSV和hMPV F蛋白、免疫原性组合物和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及编码嵌合RSV和hMPV F蛋白的嵌合呼吸道合胞病毒以及该嵌合病毒或其中的组分在疫苗中的用途。在某些实施例中，本公开涉及用嵌合RSV和hMPV F蛋白替代RSV的F蛋白的包含RSV主链的减毒活疫苗。

Description

嵌合RSV和hMPV F蛋白、免疫原性组合物和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年2月11日提交的美国临时申请第62/804,005号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

人类偏肺病毒(hMPV)是一种呼吸道病毒病原体，其引起一系列范围从无症状感染到严重细支气管炎的疾病。hMPV是包括呼吸道合胞病毒(RSV)在内的肺泡病毒科(Pneumoviridae)的负链单链RNA病毒。hMPV是季节性的，大致遵循与流感类似的季节性分布。到5岁时，几乎所有儿童都将暴露于hMPV，并且通常发生再感染。尽管在大多数情况下，感染症状是轻微的，但在年轻的、免疫受损的或年老的患者中，如果感染与继发病症诸如哮喘混合，则感染可能导致住院治疗或甚至死亡。目前还没有批准的疫苗或抗病毒剂来解决hMPV。因此，需要鉴定用于预防和治疗hMPV感染的方法。

疫苗可以是活病毒株的杀死(灭活)或弱化(减毒)形式。Zhang等人报道了通过抑制病毒mRNA帽甲基转移酶的人偏肺病毒减毒活疫苗候选物。《病毒学杂志(J Virol)》，2014，88(19)：11411-29。Olmedillas等人报道了作为免疫原诱导交叉中和抗体应答的嵌合肺泡病毒科融合蛋白。《EMBO分子医学(EMBO Mol Med.)》2017，e201708078。

Liang等人报道了由副流感病毒载体表达的RSV融合蛋白。《病毒学杂志》2016，90(21)：10022-10038。Stobart等人报道了具有工程热稳定性的活RSV疫苗，其在棉鼠中是免疫原性的。《自然通信(Nature Communications)》，7，文章编号：13916(2016)。也参见WO2017/075125和WO 2014/152534。

本文引用的参考文献不是对现有技术的认可。

发明内容

本公开涉及以下发现：向hMPV F蛋白添加RSV F蛋白的跨膜结构域和/或胞质尾可以成功地用于嵌合RSV-hMPV病毒中以产生疫苗。不希望受理论的束缚，据信RSV F蛋白的胞质尾促进病毒组装，导致病毒产生增加。因此，本公开涉及编码嵌合RSV和hMPV F蛋白的嵌合呼吸道合胞病毒，以及所述嵌合病毒或其中的组分在疫苗中的用途。在某些实施例中，本公开涉及用嵌合RSV和hMPV F蛋白替代RSV的F蛋白的包含RSV主链的减毒活疫苗。

在某些方面，本公开涉及包含hMPV F蛋白胞外域和RSV F蛋白胞质尾的嵌合RSV和hMPV F蛋白。在某些实施例中，嵌合RSV和hMPV F蛋白还包括RSV F蛋白跨膜结构域，其中嵌合RSV和hMPV F蛋白在N至C末端方向包含hMPV F蛋白胞外域、RSV F蛋白跨膜结构域和RSVF蛋白胞质尾。

在某些实施例中，本公开涉及包含活嵌合病毒的免疫原性组合物，所述活嵌合病毒具有编码嵌合RSV和hMPV F蛋白的核酸。在某些实施例中，活嵌合病毒包含编码SEQ IDNO：1或其变体的核酸，例如，其与SEQ ID NO：1具有至少约85％序列同一性的变体。在某些实施例中，编码SEQ ID NO：1的核酸包含SEQ ID NO：2或其变体，例如，其与SEQ ID NO：2具有至少约85％序列同一性的变体。在某些实施例中，活嵌合病毒不含编码呼吸道合胞病毒SH蛋白的基因。

在某些实施例中，本公开涵盖融合蛋白和嵌合颗粒，其包含具有SEQ ID NO：1或其变体或具有大于50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性的变体的嵌合hMPV和RSV F蛋白。在某些实施例中，变体包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多个氨基酸取代或保守氨基酸取代。

在某些实施例中，嵌合hMPV和RSV F蛋白具有SEQ ID NO：6的N末端hMPV序列，

其中X¹是I或V，X²是A或T，X³是E或D，X⁴是R或Q，X⁵是R或S，X⁶是L或F，X⁷是V或I，X⁸是T或N，X⁹是N或G，X¹⁰是E或D，X¹¹是R或S，X¹²是A或D，X¹³是V或Y，X¹⁴是V或I，X¹⁵是K或E，X¹⁶是K或R，X¹⁷是Q或K，X¹⁸是K或R，X¹⁹是N或S，X²⁰是S或N，X²¹是V或I，X²²是K或R，X²³是N或S，并且/或者X²⁴是S或N，诸如在F[人类偏肺病毒]

登录号中提供的那些：

在某些实施例中，X¹至X²⁴各自单独且独立地是任何氨基酸或其中鉴定的那些的保守取代。

在某些实施例中，嵌合hMPV和RSV F蛋白具有SEQ ID NO：7的C末端RSV序列，

X²MITTIIIVIIVILLX¹LIAVGLLLYCKARSTPX³TLSKDQLSGINNIAFSN，

其中X¹是S或L，X²是I或V，X³是V或I，诸如在具有

登录号AUC68149.1、AHW81430.1、AIZ95893.1、AHW81440.1和AJZ70067.1的A型呼吸道合胞病毒中提供的那些。在某些实施例中，X¹至X³各自单独且独立地是任何氨基酸或其中鉴定的那些的保守取代。

在某些实施例中，本公开涵盖编码具有SEQ ID NO：1或其具有大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的变体的嵌合hMPV和RSV F蛋白的核酸或载体。在某些实施例中，核酸包含SEQ ID NO：2或其变体。在某些实施例中，变体是含有同义密码子或密码子去优化的那些。

在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV具有编码RSV NS1和NS2或嵌合hMPV和RSV F蛋白的基因，它们任选地被密码子去优化，使得与野生型A2病毒相比，该蛋白在Vero细胞中的表达率减少超过一半。

在某些实施例中，与野生型A2病毒株相比，NS1在Vero细胞中的表达率减少超过三分之一(1/3)、四分之一(1/4)、五分之一(1/5)或十分之一(1/10)。

在某些实施例中，与野生型A2病毒株相比，NS2在Vero细胞中的表达率减少超过三分之一(1/3)、四分之一(1/4)、五分之一(1/5)或十分之一(1/10)。

在某些实施例中，使编码SH蛋白的基因缺失或改变，使得表达截短的蛋白或不表达蛋白。在某些实施例中，使编码M2-2的基因缺失或改变，使得表达截短的蛋白或不表达蛋白。在某些实施例中，使编码G蛋白的基因缺失或改变，使得表达截短的蛋白或不表达蛋白。

在某些实施例中，本公开涉及包含本文公开的嵌合RSV-hMPV的疫苗和免疫原性组合物。在某些实施例中，组合物进一步包含佐剂和/或其他药学上可接受的载体。在某些实施例中，佐剂是铝凝胶、铝盐或单磷酰脂质A。

在某些实施例中，佐剂是水包油乳液。在某些实施例中，水包油乳液进一步包含α-生育酚、角鲨烯和/或表面活性剂。

在某些实施例中，本公开涉及给受试者接种针对呼吸道合胞病毒的疫苗或使受试者针对呼吸道合胞病毒免疫的方法，该方法包含向受试者施用有效量的本文公开的嵌合RSV-hMPV或包含其的免疫原性组合物。在某些实施例中，有效量在受试者中产生保护性免疫反应。

在某些实施例中，受试者是怀孕的母亲、低于2、3或4岁的儿童。在某些实施例中，受试者具有降低的免疫系统、超过60或65岁或定期施用化学疗法或免疫抑制药物。

在某些实施例中，本公开涉及包含编码具有SEQ ID NO：1或其变体的嵌合hMPV和RSV F蛋白的核酸的载体。在某些实施例中，载体选自质粒或细菌人工染色体。

在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV包括对人类受试者具有传染性的那些和对人类受试者不具有传染性的那些。

在某些实施例中，本公开涉及包含如本文公开的具有SEQ ID NO：1或其变体的嵌合hMPV和RSV F蛋白的颗粒、RSV-hMPV颗粒或病毒样颗粒。在某些实施例中，颗粒包含活的和传染性的减毒嵌合RSV-hMPV基因组或反基因组。在某些实施例中，颗粒包含和灭活的RSV-hMPV基因组或反基因组，例如，不含核酸或具有不能表达RSV或hMPV蛋白中的一种、两种、三种或更多种或任一种的核酸。在某些实施例中，使用诸如加热或甲醛的方法杀死颗粒。在某些实施例中，通过表达病毒结构蛋白和本文公开的具有SEQ ID NO：1或其变体的嵌合hMPV和RSV F蛋白来重构颗粒。

附图说明

图1说明了人类偏肺病毒(hMPV)活减毒疫苗候选物DH1(OE1-hMPV-F)、DH2(OE1-hMPV-F(RSV TM+CT))、DH3(OE4-hMPV-F)、DH4(OE4-hMPV-F(RSV TM+CT))的示意性基因组。为了产生DH构建体，将含有RSV F跨膜和胞质尾的hMPV TN/94-49 F基因(全长)或hMPV TN/94-49 F基因插入RSV A2毒株主链中。对A2主链的进一步修饰包括使NS1和NS2基因去优化的密码子，和小的疏水(SH)基因的缺失。

图2显示了hMPV F蛋白在Vero细胞中的表达。印迹显示野生型hMPV(1)、模拟物(2)、RSV毒株OE1(3)和hMPV疫苗候选物DH2(4)的F蛋白表达。以MOI 0.5感染细胞，并在感染后48小时收获。印迹等量的蛋白。

图3显示了hMPV在Vero细胞中的体外生长曲线。使用Vero细胞进行生长动力学。以MOI 0.1感染细胞，每个时间点一式两份。通过荧光灶单位(FFU)测定在Vero细胞上滴定样品。

图4A显示了hMPV在原代正常支气管上皮(NhBE)细胞中DH2和OE1的体外生长曲线。在NhBE细胞上进行生长动力学。以MOI 0.1感染细胞，每个时间点一式两份。通过荧光灶单位(FFU)测定在Vero细胞上滴定样品。

图4B显示了hMPV在原代正常支气管上皮(NhBE)细胞中DH2、OE1和A2的体外生长曲线。

图4C显示了hMPV在原代正常支气管上皮(NhBE)细胞中DH2、OE1和A2-L19F的体外生长曲线。

图5显示了人类偏肺病毒GenBank登记号AEK26895.1(TN/94-49F；SEQ ID NO：5)中提供的hMPV-F蛋白与本文公开的嵌合RSV-hMPV F蛋白(SEQ ID NO：1)的序列比较，具有498/539同一性(92％)。Yang等人，二十多年来人类偏肺病毒融合蛋白的遗传多样性和进化，《病毒学杂志》，6，138(2009)。

图6A提供了共有序列SEQ ID NO：6中的前180个氨基酸与来自hMPV的各种毒株(SEQ ID NO：20-30)的F蛋白的比对。

图6B提供了共有序列SEQ ID NO：6中的氨基酸181-360与来自hMPV的各种毒株(SEQ ID NO：20-30)的F蛋白的比对。

图6C提供了共有序列SEQ ID NO：6中的氨基酸361-489与来自hMPV的各种毒株(SEQ ID NO：20-30)的F蛋白的比对。

具体实施方式

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施例，并且因此当然可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅为了描述特定实施例，并不意图进行限制，因为本公开的范围将仅受限于所附权利要求。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中所引用的所有出版物和专利通过引用并入在本文中，犹如每个个体出版物或专利都具体地且单独地被指示为通过引用并入且通过引用并入在本文中以结合所引用出版物所陈述的内容来公开和描述方法和/或材料。任何出版物的引用均是其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开无权凭借在先公开内容而早于该出版物。此外，提供的发布日期可能与可能需要独立确认的实际发布日期不同。

如本领域的技术人员在阅读本公开之后将清楚，本文中所描述且所示出的各个实施例中的每一者具有分立部件和特征，这些分立部件和特征可以很容易与其它数个实施例中的任一者的特征分离或结合，而不脱离本公开的范围或精神。任何记载的方法可以按照所记载事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

除非另有说明，否则本公开的实施例将采用本领域技术范围内的免疫学、医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学、生理学等技术。此类技术在文献中有充分的解释。

须注意，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个指代物，除非上下文另有明确指示。在本说明书和随后的权利要求中，除非明显相反的意图，否则将参考将被定义为具有以下含义的多个术语。

在描述各种实施例之前，除非另有说明，否则应提供并应使用以下定义。

术语“蛋白”和“多肽”是指包含通过肽键连接并且可互换使用的氨基酸的化合物。

术语“部分”在用于指蛋白时(如在“给定蛋白的一部分”中)是指该蛋白的片段。片段的大小范围可以从四个氨基酸残基到整个氨基酸序列减去一个氨基酸。

术语“嵌合呼吸道合胞病毒”或“嵌合RSV-hMPV”是指含有足够RSV基因以允许基因组或反基因组在宿主细胞(例如Vero细胞)中复制的核酸，并且序列核酸被改变以包括至少一个含有hMPV基因序列或片段的核酸区段。嵌合RSV-hMPV包括其中密码子被改变为不同于天然存在的密码子的RSV或hMPV基因，即使该基因产生具有与天然表达的那些氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。不同的RSV-hMPV毒株将具有不同的核苷酸序列，并表达具有相似功能的不同氨基酸序列的蛋白。因此，嵌合RSV-hMPV包括RSV或hMPV基因，其中来自一个毒株的一个或多个基因被替代或第二毒株中的基因替换，使得整个RSV或hMPV基因组的核酸序列与自然界中发现的RSV或hMPV不同。在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV包括使核酸在用于开始翻译的密码子之后缺失以截断蛋白表达的那些毒株，条件是在天然存在的病毒中未发现基因组的此类截断模式。在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV包括具有传染性并且可以在人类受试者中复制的那些。

术语“嵌合体”或“嵌合的”当用于指多肽时是指从不同来源获得的两个或更多个编码序列的表达产物，它们在自然环境中不一起存在，已被克隆在一起，并且在翻译后充当单一的多肽序列。编码序列包括从相同或不同物种的生物体物种获得的那些序列。本公开涉及嵌合RSV/hMPV融合(F)蛋白。天然存在的RSV和hMPV F蛋白是导致病毒体膜与靶细胞膜融合的主要表面糖蛋白。融合蛋白以亚稳定的融合前构象存在，随后经历主要重折叠成稳定的融合后形式，接近病毒体和靶细胞膜并使得能够融合。

术语“同源物”或“同源的”当用于指代多肽时是指两个多肽之间的高度序列同一性，或三维结构之间的高度相似性，或活性位点和作用机制之间的高度相似性。在一个优选的实施例中，同源物与参考序列具有大于60％的序列同一性，并且更优选大于75％的序列同一性，并且仍更优选大于90％的序列同一性。

当应用于多肽时，术语“基本相同”意指两个肽序列在最佳比对时，诸如通过程序“GAP”(Genetics Computer Group，威斯康星州麦迪逊)、“ALIGN”(DNAStar，威斯康星州麦迪逊)、Jotun Hein(Hein(2001)《太平洋生物计算研讨会(Proc.PacificSymp.Biocomput.)》179-190)，使用默认间隙权重进行最佳比对，享有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，例如至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性、至少99.5％的同一性、至少99.9％的同一性。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守氨基酸取代。

术语“变体”和“突变体”当用于指代多肽时是指与另一个通常相关的多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性。一种类型的保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。更罕见的是，变体可能具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似的微小变化还可包括氨基酸缺失或插入(换句话说就是添加)，或两者。使用本领域公知的计算机程序如DNAStar软件可以找到确定哪些和多少氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不破坏生物活性的指导。可以在功能测定中测试变体。优选的变体具有小于10％，并且优选小于5％，并且仍更优选小于2％的变化(无论是取代还是缺失等)。

术语“基因”是指包含产生RNA或多肽或其前体(例如胰岛素原)所必需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。功能性多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要该多肽的所需活性或功能特性(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)得以保留。术语“部分”当用于指代基因时是指该基因的片段。片段的大小范围可以从几个核苷酸到整个基因序列减去一个核苷酸。因此，“包含基因的至少一部分的核苷酸”可包含基因的片段或整个基因。

术语“基因”还涵盖结构基因的编码区，并包括位置在5′端和3′端都与编码区相邻的序列，在任一端的距离约为1kb，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5′并且存在于mRNA上的序列称为5′非翻译序列。位于编码区3′或下游并且存在于mRNA上的序列称为3′非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式二者。基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(mRNA)的基因区段；内含子可能含有调节元件，诸如增强子。从核或初级转录本中移除或“剪接出”内含子；因此，信使RNA(mRNA)转录本中不存在内含子。mRNA在翻译过程中发挥作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。

除了含有内含子之外，基因的基因组形式还可以包括位于存在于RNA转录本上的序列的5′端和3′端二者的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录本上的非翻译序列的5′或3′)。5′侧翼区可含有调节序列，诸如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3′侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。

术语“异源基因”是指编码不在其自然环境中(即，已被人为改变)的因子的基因。例如，异源基因包括来自一个物种的被引入另一物种的基因。异源基因还包括已以某种方式改变(例如，突变、以多拷贝添加、连接至非天然启动子或增强子序列等)的原产于生物体的基因。异源基因与内源基因的区别在于异源基因序列通常与包含调节元件的核苷酸序列相连，诸如未发现与由异源基因编码的蛋白的基因或染色体中的基因序列天然相关的启动子，或与自然界中未发现的染色体部分相关的启动子(例如，在基因不正常表达的基因座中表达的基因)。

术语“多核苷酸”是指由两个或更多个、优选多于三个并且通常多于十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。确切的大小将取决于许多因素，所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。多核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。术语“寡核苷酸”通常指短长度的单链多核苷酸链，尽管它也可以与术语“多核苷酸”互换使用。

术语“核酸”是指核苷酸的聚合物或如上所述的多核苷酸。该术语用于指定单个分子或分子集合。核酸可以是单链或双链的，并且可以包括编码区和如下所述的各种控制元件的区域。

术语“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”或“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”或“编码特定多肽的核酸序列”是指包含基因编码区的核酸序列或换句话说就是编码基因产物的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸、多核苷酸或核酸可以是单链的(即有义链)或双链的。合适的控制元件诸如增强子/启动子、剪接点、多聚腺苷酸化信号等，如果允许正确启动转录和/或正确加工初级RNA转录本需要，可以紧邻基因的编码区放置。可替代地，本公开的表达载体中使用的编码区可含有内源增强子/启动子、剪接点、间插序列、多聚腺苷酸化信号等或内源和外源控制元件的组合。

术语“重组”当指代核酸分子时是指由借助于分子生物学技术连接在一起的核酸区段组成的核酸分子。术语“重组”当指代蛋白或多肽时是指使用重组核酸分子表达的蛋白分子。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，对于序列“A-G-T”，其与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中尤其重要。

术语“同源性”当与核酸相关使用时是指互补性的程度。可能存在部分同源性或完全同源性(即同一性)。“序列同一性”是指两个或更多个核酸或蛋白之间相关性的量度，并以相对于总比较长度的百分比给出。同一性计算考虑了相同和在它们各自的较大序列中处于相同的相对位置的那些核苷酸或氨基酸残基。同一性的计算可以通过计算机程序诸如“GAP”(Genetics Computer Group，威斯康星州麦迪逊)和“ALIGN”(DNAStar，威斯康星州麦迪逊)内含有的算法来执行。部分互补序列是至少部分抑制(或竞争)完全互补序列与靶核酸杂交的序列，使用功能术语“基本同源”指代。可以在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、溶液杂交等)检查完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序列或探针将在低严格性条件下竞争并抑制完全同源的序列与靶标结合(即杂交)。这并不是说低严格性条件使得允许非特异性结合；低严格性条件要求两个序列彼此结合是特定的(即选择性的)相互作用。可以通过使用甚至缺乏部分互补性程度(例如，小于约30％的同一性)的第二靶标来测试非特异性结合的不存在；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不会与第二非互补靶标杂交。

以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸之间的序列关系：“参考序列”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本相同”。“参考序列”是用作序列比较基础的规定序列；参考序列可以是更大序列的子集，例如作为序列表中给出的全长cDNA序列的区段，或者可以包含完整的基因序列。通常，参考序列长度为至少20个核苷酸，经常长度为至少25个核苷酸，并且通常长度为至少50个核苷酸。由于两个多核苷酸可各自(1)包含两个多核苷酸之间相似的序列(即完整多核苷酸序列的一部分)，并且(2)可进一步包含两个多核苷酸之间不同的序列，因此通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较。如本文所用，“比较窗口”是指至少20个邻近核苷酸位置的概念区段，其中多核苷酸序列可以与至少20个邻近核苷酸的参考序列相比，并且其中比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比，可以包含20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以实现两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2：482(1981))，Needleman和Wunsch的同源性比对算法(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48：443(1970))，Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Pearson和Lipman，《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》(US)85：2444(1988))，这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，威斯康星州麦迪逊)，或者检验进行，并且选择由各种方法生成的最佳比对(即，在比较窗口内产生最高同源性百分比)。术语“序列同一性”是指在比较窗口内两个多核苷酸序列是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。

在某些实施例中，术语“序列同一性百分比”通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列，确定相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)出现在两个序列中的位置数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。

在某些实施例中，序列“同一性”是指在比对的两个序列之间的序列比对中完全匹配的氨基酸的数量(以百分比表示)，使用相同位置的数量除以最短序列或不包括突出的等效位置数量中的较大者来计算，其中内部间隙被视为等效位置。例如，多肽GGGGGG和GGGGT具有4/5或80％的序列同一性。例如，多肽GGGPPP和GGGAPPP具有6/7或85％的序列同一性。在某些实施例中，本文表达的序列同一性的任何叙述可以被序列相似性替代。“相似性”百分比用于量化比对的两个序列之间的相似性。该方法与确定同一性相同，除了某些氨基酸不必相同即可匹配之外。如果氨基酸根据以下氨基酸组属于具有相似性质的组，则它们被归类为匹配：芳香族-F Y W；疏水-A V I L；带正电：R K H；带负电-D E；极性-S T N Q。

本文所用的术语“基本相同”表示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包括在至少20个核苷酸位置的比较窗口内，通常在至少25-50个核苷酸的窗口内，与参考序列相比，具有至少85％序列同一性，优选至少90％至95％序列同一性，更通常地，至少99％的序列同一性的序列，其中序列同一性百分比是通过将参考序列与多核苷酸序列进行比较来计算的，所述多核苷酸序列可以包括在比较窗口内总共20％或更少的参考序列的缺失或添加。参考序列可以是更大序列的子集，例如作为本公开中要求保护的组合物的全长序列的区段。

术语“基本同源”当用于指代双链核酸序列诸如cDNA或基因组克隆时是指可以在如上所述的低至高严格性条件下与双链核酸序列的一条或两条链杂交的任何探针。

术语“基本同源”当用于指代单链核酸序列时是指可以在如上所述的低至高严格性条件下与单链核酸序列杂交(即，它是单链核酸序列的补充)的任何探针。

术语“在可操作的组合中”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指以使得产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白分子的合成的核酸分子的方式连接核酸序列。该术语还指以产生功能性蛋白的方式连接氨基酸序列。

术语“调节元件”是指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件。例如，启动子是促进可操作连接的编码区转录起始的调节元件。其他调节元件是剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止信号等。

真核生物中的转录控制信号包含“启动子”元件和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，其与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(Maniatis等人，《科学(Science)》236：1237，1987)。启动子元件和增强子元件已从多种真核来源中分离出来，该多种真核来源包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞中的基因。启动子元件和增强子元件也已从病毒中分离出来并存在于原核生物中。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而另一些则在有限的细胞类型子集中起作用(综述参见Voss等人，《生物化学科学趋势(TrendsBiochem.Sci.)》，11：287，1986；和Maniatis等人，同上1987)。

如本文所用，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指DNA序列，即充当开关、激活基因表达的DNA序列。如果基因被激活，则认为其被转录或参与转录。转录涉及从基因合成mRNA。因此，启动子充当转录调节元件，并且还提供用于启动基因转录为mRNA的位点。

启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。术语“组织特异性”用于启动子时是指能够指导目标核苷酸序列选择性表达到特定类型的组织(例如种子)的启动子，而相同目标核苷酸序列在不同类型组织(例如，叶子)中相对不表达。启动子的组织特异性可以通过例如以下来评价：将报告基因可操作地连接到启动子序列以产生报告构建体、将报告构建体引入生物体的基因组中使得报告构建体整合到所得转基因生物体的每个组织中，并检测报告基因在转基因生物体的不同组织中的表达(例如，检测mRNA、蛋白或由报告基因编码的蛋白的活性)。相对于报告基因在其他组织中的表达水平，在一种或多种组织中检测到更高水平的报告基因表达表明启动子对检测到更高水平表达的组织具有特异性。术语“细胞类型特异性”应用于启动子时是指能够指导目标核苷酸序列在特定类型的细胞中选择性表达的启动子，而相同目标核苷酸序列在相同组织内的不同细胞类型中相对不表达。术语“细胞类型特异性”当应用于启动子时还意指能够促进目标核苷酸序列在单个组织内的区域中选择性表达的启动子。启动子的细胞类型特异性可以使用本领域公知的方法评估，例如免疫组织化学染色。简言之，将组织切片包埋在石蜡中，并使石蜡切片与一抗反应，该一抗对目标核苷酸序列编码的多肽产物具有特异性，其表达受启动子控制。允许对一抗具有特异性的标记的(例如，过氧化物酶缀合的)二抗与切片组织结合，并通过显微镜检测特异性结合(例如，与抗生物素蛋白/生物素)。

启动子可以是组成型的或可调节的。术语“组成型”当指代启动子时意指启动子能够在没有刺激(例如热休克、化学物质、光等)的情况下指导可操作连接的核酸序列的转录。通常，组成型启动子能够指导转基因在基本上任何细胞和任何组织中的表达。

相比之下，“可调节的”或“可诱导的”启动子是能够在存在刺激(例如热休克、化学物质、光等)的情况下指导可操作连接的核酸序列的转录水平的启动子，其与在没有刺激的情况下可操作连接的核酸序列的转录水平不同。

增强子和/或启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源的”增强子或启动子是与基因组中的给定基因天然连接的增强子或启动子。“外源的”或“异源的”增强子或启动子是借助于遗传操作(即分子生物学技术)毗邻基因放置的增强子或启动子，使得由连接的增强子或启动子指导基因的转录。例如，与第一基因可操作组合的内源启动子可以被分离、去除，并与第二基因可操作组合放置，从而使其成为与第二基因可操作组合的“异源启动子”。考虑了多种此类组合(例如，第一基因和第二基因可以来自相同物种，或来自不同物种)。

在真核细胞中重组DNA序列的有效表达通常需要表达指导所得转录物有效终止和多聚腺苷酸化的信号。转录终止信号通常存在于多聚腺苷酸化信号的下游，并且长度为几百个核苷酸。如本文所用，术语“poly(A)位点”或“poly(A)序列”表示指导新生RNA转录物的终止和多聚腺苷酸化二者的DNA序列。重组转录物的高效多聚腺苷酸化是令人满意的，因为缺少poly(A)尾的转录物不稳定并且降解迅速。表达载体中使用的poly(A)信号可以是“异源的”或“内源的”。内源poly(A)信号天然存在于基因组中给定基因编码区的3′端。异源poly(A)信号是从一个基因中分离出来并位于另一个基因3′的信号。常用的异源poly(A)信号是SV40 poly(A)信号。SV40 poly(A)信号含在237bp BamHI/Bcll限制性片段上，并指导终止和多聚腺苷酸化二者。

术语“载体”是指将DNA区段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。术语“媒介物”有时与“载体”互换使用。

术语“表达载体”或“表达盒”是指含有所需编码序列和用于在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列的合适核酸序列的重组核酸。用于在原核生物中表达的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选)和核糖体结合位点，通常还有其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多聚腺苷酸化信号。

术语“宿主细胞”是指能够复制和/或转录和/或翻译异源基因的任何细胞。因此，“宿主细胞”是指任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞，诸如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，无论位于体外还是体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。

“选择标记”是引入重组载体的核酸，其编码赋予适合人工选择或鉴定的性状的多肽(也参见下文“报告基因”)，例如，β-内酰胺酶赋予抗生素抗性，其允许表达β-内酰胺酶的生物体在生长培养基中在存在抗生素的情况下存活。另一实例是胸苷激酶，其使宿主对更昔洛韦选择敏感。它可能是可筛选的标记物，允许基于存在或不存在预期的颜色来区分想要的和不需要的细胞。例如，lac-z-基因产生β-半乳糖苷酶，它在存在X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的情况下赋予蓝色。如果重组插入使lac-z-基因失活，则产生的种群是无色的。可存在一种或多种选择标记，例如，可以补充表达生物体无法合成其生长所需的特定化合物(营养缺陷型)的酶，以及能够将化合物转化为对生长有毒的另一种化合物的酶。乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶URA3是尿嘧啶生物合成所必需的，并且可以补充对尿嘧啶而言是营养缺陷型的ura3突变体。URA3还将5-氟乳清酸转化为有毒化合物5-氟尿嘧啶。其他考虑的选择标记包括赋予抗菌抗性或表达荧光蛋白的任何基因。实例包括但不限于以下基因：ampr、camr、tetr、杀稻瘟菌素(blasticidinr)、neor、hygr、abxr、新霉素磷酸转移酶II型基因(nptll)、p-葡萄糖醛酸酶(gus)、绿色荧光蛋白(gfP)、egfp、yfp、mCherry、p-半乳糖苷酶(lacZ)、lacZa、lacZAM15、氯霉素乙酰转移酶(cat)、碱性磷酸酶(phoA)、细菌荧光素酶(luxAB)、双丙氨磷抗性基因(bar)、磷酸甘露糖异构酶(pmi)、木糖异构酶(xylA)、阿拉伯糖醇脱氢酶(atlD)、UDP-葡萄糖：半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶I(galT)、邻氨基苯甲酸合酶的反馈不敏感α亚基(OASA1D)、2-脱氧葡萄糖(2-DOGR)、苄基腺嘌呤-N-3-葡萄糖苷酸、大肠杆菌苏氨酸脱氨酶、谷氨酸1-半醛氨基转移酶(GSA-AT)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、耐盐基因(rstB)、铁氧还蛋白样蛋白(pflp)、海藻糖-6-P合酶基因(AtTPS1)、赖氨酸消旋酶(lyr)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、色氨酸合酶β1(AtTSB1)、脱卤素酶(dhlA)、甘露糖-6-磷酸还原酶基因(M6PR)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)和D-丝氨酸解氨酶(dsdA)。

“标签”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接与另一分子诸如抗体或蛋白缀合以促进该分子的检测。标签的具体、非限制性实例包括荧光标签、酶促连接和放射性同位素。在一个实例中，“标签受体”是指在受体中并入异源多肽。标签包括放射性标记的氨基酸的并入或生物素基部分与多肽的共价连接，这可以通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可以通过光或比色法检测的荧光标记物或酶促活性的链霉亲和素)来检测。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。多肽标签的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核苷酸(诸如³⁵S或¹³¹I)、荧光标签(诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系元素磷)、酶标签(诸如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基团、二级报告基因识别的预定多肽表位(诸如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁性剂诸如钆螯合物。在一些实施例中，标签通过各种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。

在某些实施例中，本公开涉及包含本文公开的序列或其变体或融合体的重组多肽，其中氨基酸序列的氨基末端或碳末端任选地附接至异源氨基酸序列、标签或报告分子。

在某些实施例中，本公开涉及包含编码本文公开的多肽或其融合蛋白的核酸的重组载体。

在某些实施例中，重组载体任选地包含哺乳动物、人、昆虫、病毒、细菌、细菌质粒、酵母相关复制起点或基因，诸如基因或逆转录病毒基因或慢病毒LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS和INS核苷酸区段或选自tat、rev、nef、vif、vpr、vpu和vpx的基因或选自gag、pol和env的结构基因。

在某些实施例中，重组载体任选地包含基因载体元件(核酸)诸如选择标记区、lac操纵子、CMV启动子、杂交鸡B-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、tac启动子、T7 RNA聚合酶启动子、SP6 RNA聚合酶启动子、SV40启动子、内部核糖体进入位点(IRES)序列、顺式作用土拨鼠后调节元件(WPRE)、支架附着区(SAR)、反向末端重复序列(ITR)、FLAG标签编码区、c-myc标签编码区、金属亲和标签编码区、链霉亲和素结合肽标签编码区、polyHis标签编码区、HA标签编码区、MBP标签编码区、GST标签编码区、多聚腺苷酸化编码区、SV40多聚腺苷酸化信号、SV40复制起点、Col E1复制起点、f1起点、pBR322起点或pUC起点、TEV蛋白酶识别位点、IoxP位点、Cre重组酶编码区或多克隆位点，诸如在少于50或60个核苷酸的连续区段内具有5、6或7个或更多个限制性位点，或在少于20或30个核苷酸的连续区段内具有3或4个或更多个限制性位点。

术语“报告基因”是指编码可被测定的蛋白的基因。报告基因的实例包括但不限于修饰的katushka、mkate和mkate2(参见例如，Merzlyak等人，《自然方法(Nat.Methods)》，2007，4，555-557和Shcherbo等人，《生物化学杂志(Biochem.J.)》，2008，418，567-574)、萤光素酶(参见例如，deWet等人，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》7：725(1987)和美国专利第6,074,859号、第5,976,796号、第5,674,713号以及第5,618,682号；其所有通过引用并入本文)、绿色荧光蛋白(例如，GenBank登录号U43284；许多GFP变体可从ClonTechLaboratories，加利福尼亚州帕洛阿尔托商购)、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。

术语“野生型”当指代基因时是指具有从天然存在来源分离的基因特征的基因。术语“野生型”当指代基因产物时是指具有从天然存在来源分离的基因产物特征的基因产物。如本文所用，术语“天然存在的”应用于物体时是指物体可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从自然界的来源中分离并且尚未在实验室中被人类有意地修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，并且因此被任意指定为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”或“突变的”当指代基因或基因产物时分别是指与野生型基因或基因产物相比时显示出序列和/或功能特性的修饰(即改变的特征)的基因或基因产物。需要注意的是，可以分离天然存在的突变体；这些通过与野生型基因或基因产物相比时它们具有改变的特征的事实来识别。

术语“反义”或“反基因组”是指其核苷酸残基序列相对于有义链中的核苷酸残基序列呈反向5′至3′方向的核苷酸序列。DNA双链体的“有义链”是指在其自然状态下被细胞转录成“有义mRNA”的DNA双链体中的链。因此，“反义”序列是与DNA双链体中的非编码链具有相同序列的序列。

术语“分离的”是指生物材料，诸如病毒、核酸或蛋白，其基本上不含在其天然存在的环境中通常伴随其或与其相互作用的组分。分离的材料任选地包含在其自然环境如细胞中未与该材料一起发现的材料。例如，如果材料处于其自然环境诸如细胞中，则该材料已被放置在细胞中的不是在该环境中发现的材料所固有的位置(例如，基因组或遗传元件)。例如，如果通过非天然存在的方式将天然存在的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)引入不是该核酸固有的基因组的基因座(例如，载体诸如质粒或病毒载体，或扩增子)，则该天然存在的核酸变为分离的。此类核酸也称为“异源”核酸。例如，分离的病毒处于与野生型病毒的天然环境(例如，受感染个体的鼻咽)不同的环境(例如，细胞培养系统，或从细胞培养物纯化)中。

病毒或减毒病毒的“免疫学有效量”是足以增强个体(例如，人)自身针对随后暴露于介质的免疫反应的量。可以例如通过测量中和分泌和/或血清抗体的量来监测诱导免疫的水平，例如通过噬斑中和、补体固定、酶联免疫吸附剂或微量中和测定进行所述测量。

针对病毒的“保护性免疫反应”是指当个体随后暴露于和/或感染有野生型病毒时，个体(例如人)表现出的预防严重的下呼吸道疾病(例如肺炎和/或细支气管炎)的免疫反应。

嵌合RSV-hMPV

天然存在的RSV颗粒通常含有在螺旋状核壳体内的病毒基因组，该病毒基因组被基质蛋白和含有糖蛋白的包膜包围。人类野生型RSV的基因组编码蛋白NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L。G、F和SH是糖蛋白。RSV聚合酶活性由大蛋白(L)和磷蛋白(P)组成。病毒M2-1蛋白在转录过程中使用，并且可能是转录酶复合物的组分。病毒N蛋白用于在复制过程中壳体化新生RNA。

基因组在宿主细胞的细胞质中转录和复制。宿主细胞转录通常导致合成十种甲基化和多聚腺苷酸化mRNA。反基因组是复制期间产生的基因组的正义RNA补充，其又充当基因组合成的模板。病毒基因的两侧是保守的基因起始(GS)和基因结束(GE)序列。基因组的3′端和5′端是前导核苷酸和尾随核苷酸。野生型前导序列含有在3′端的启动子。当病毒聚合酶到达GE信号时，聚合酶多聚腺苷酸化并释放mRNA，并在下一个GS信号时重新启动RNA合成。L-P复合物被认为负责识别启动子、RNA合成、加帽和mRNA 5′末端的甲基化以及它们3′端的多聚腺苷酸化。据信聚合酶有时会在连接处与基因解离。因为聚合酶在基因组的3′端启动转录，这导致产生表达梯度，其中基因组3′端的基因比5′端的基因转录更频繁。

为了复制基因组，聚合酶不响应顺式作用的GE和GS信号，并产生基因组的正义RNA补充，即反基因组。反基因组的3′端是尾随的补充，其含有启动子。聚合酶使用该启动子产生基因组有义RNA。与以裸RNA形式释放的mRNA不同，反基因组和基因组RNA在合成时被病毒核蛋白(N)壳体化。

病毒mRNA翻译后，产生全长(+)反基因组RNA作为(-)RNA基因组复制的模板。可从转染的质粒中回收感染性重组RSV(rRSV)颗粒。RSV N、P、L和M2-1蛋白以及全长反基因组RNA的共表达足以进行RSV复制。参见Collins等人，《美国科学院院报(Proc Natl Acad SciU S A.)》，1995，92(25)：11563-11567和美国专利第6,790,449号。

在某些实施例中，本公开涉及嵌合F多肽和编码其的重组核酸的某些所需序列。在某些实施例中，本公开考虑包含编码这些多肽的核酸的重组载体和包含所述载体的细胞。在某些实施例中，载体包含选择标记或报告基因。

在某些实施例中，本公开涉及包含hMPV F蛋白胞外域和RSV F蛋白胞质尾的嵌合F蛋白。嵌合RSV和hMPV F蛋白还可包括RSV F蛋白跨膜结构域，其中嵌合RSV和hMPV F蛋白在N至C末端方向上包含hMPV F蛋白胞外域、RSV F蛋白跨膜结构域和RSV F蛋白胞质尾。

hMPV F蛋白胞外域的位置和结构是本领域已知的(参见例如)并且可以包括序列

VSSSFDPIRFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNKILNSAEKGNT(SEQ ID NO：9)，或其部分(例如，其包含至少约200个氨基酸、至少约300个氨基酸或至少约400个氨基酸的片段，或包含与其具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％的序列同一性的序列)。在某些实施例中，hMPV F蛋白胞外域被截短约1-100个氨基酸、约1-90个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-70个氨基酸、约1-60个氨基酸或约1-50个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸。

RSV跨膜结构域(TM)的位置和结构是本领域已知的(参见例如，Collins等人(1984)《美国科学院院报(PNAS)》81：7683-7687，图3)，并且可以包括序列IMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLL(SEQ ID NO：10)、IMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYC(SEQ ID NO：11)、IMITAIIIVIIWLLSLIAIGLLLYC(SEQ ID NO：12)或IMITAIIIVIIWLLSLIAIGLLL(SEQ IDNO：13)或任何前述的部分(例如，任何前述的包含至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约21个氨基酸、至少约22个氨基酸、至少约23个氨基酸、至少约24个氨基酸或至少约25个氨基酸的片段，或包含与其具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％至少约99％的序列同一性的序列)。在某些实施例中，RSV TM结构域被截短约1-15个氨基酸、约1-10个氨基酸、约1-5个氨基酸、约1-3个氨基酸、约5-15个氨基酸、或约5-10个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸。

RSV胞质尾(CT)结构域的位置和结构是本领域已知的(参见例如，Baviskar等人(2013)《病毒学杂志》87(19)：10730-10741)并且可以包括序列YCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：14)、KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：15)、YCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK(SEQ ID NO：16)、KAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK(SEQ IDNO：17)，或任何前述的部分(例如，任何前述的包含至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约21个氨基酸、至少约22个氨基酸或至少约23个氨基酸的片段，或包含与其具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性的序列)。在某些实施例中，RSV CT结构域被截短约1-15个氨基酸、约1-10个氨基酸、约1-5个氨基酸、约1-3个氨基酸、约5-15个氨基酸或约5-10个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸。

在某些实施例中，本公开提供嵌合RSV-hMPV F蛋白，其包含hMPV F蛋白的N末端部分和RSV F蛋白的C末端部分。在某些实施例中，hMPV-RSV嵌合F蛋白的N末端部分包含hMPVF蛋白N末端部分的约400至约540个氨基酸，hMPV F蛋白N-末端部分的约425至约525个氨基酸，hMPV F蛋白N末端部分的约450至约500个氨基酸，或hMPV F蛋白N末端部分的约470至约490个氨基酸。在某些实施例中，hMPV-RSV嵌合F蛋白的C末端部分包含RSV F蛋白C末端部分的约10至约100个氨基酸，RSV F蛋白C-末端部分的约25至约75个氨基酸，C末端部分的约40至约60个氨基酸，或RSV F蛋白的C末端部分的约50个氨基酸。

适用于嵌合RSV-hMPV F蛋白的hMPV F蛋白序列包括TN/94-49(亚组A2；GenBank登录号AEK26895.1)毒株的F蛋白、TN/96-12(亚组A1 GenBank登录号AEK26886.1)毒株，TN/98-242(亚组B1，GenBank登录号AEK26906.1)和TN/89-515(亚组B2，GenBank登录号ACJ53612.1)，如Williams等人(2006)《传染病杂志(J Infect Dis.)》193(3)：387-395所述。适用于嵌合RSV-hMPV F蛋白的其他hMPV F蛋白序列包括ACJ53565.1、AHV79858.1、BBB35088.1、AHV79473.1、AAS22125.1、AUF72445.1和ACJ53575.1。适用于嵌合RSV-hMPV F蛋白的RSV F蛋白序列包括来自毒株A2-系19F和A2-系19F(I557V)的F蛋白，如Hotard等人《病毒学杂志》89，512-522(2015)；Meng等人《病毒学杂志》90，245-253(2015)；和Hotard等人《病毒学(Virology)》，434，129-136(2012)所述，和Buenos Aires(亚组B)F蛋白的共有序列，如Rostad等人《病毒学杂志》92(6)：e01568-17(2018)所述。适用于嵌合RSV-hMPV F蛋白的其他RSV F蛋白序列包括AUC68149.1、AHW81430.1、AIZ95893.1、AHW81440.1和AJZ70067.1。

在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV F蛋白中使用的hMPV和RSV序列的部分包含与野生型蛋白的相应部分具有约70％或更多、约75％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多或约99％或更多的序列同一性。

在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV F蛋白包含SEQ ID NO：1，或包含与SEQ ID NO：1具有约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多或约99％或更多的序列同一性的蛋白。

在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV F蛋白包含RQSR(SEQ ID NO：18)至RRRR(SEQ IDNO：19)突变以引入不依赖胰蛋白酶的切割位点。这种突变促进了病毒中不依赖胰蛋白酶的生长。引入该突变的方法是本领域已知的。参见Zhang等人(2012)《病毒学方法杂志(JVirol Methods)》185(1)。

用于储存RSV的常见载体包括质粒和细菌人工染色体(BAC)。通常，细菌人工染色体包含一种或多种选自由与选择标记例如提供抗生素抗性的基因可操作组合的F因子的oriS、repE、parA和parB基因组成的群组的基因。核酸序列可以是任选突变的病毒的基因组或反基因组序列，例如任选突变的RSV毒株。

在大肠杆菌细菌中培养RSV可以通过利用细菌人工染色体(BAC)来完成。Stobart等人，《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》，2016，1442：141-53和美国专利申请公开第2012/0264217号中报道了用于储存和基因工程RSV的BAC载体。所公开的BAC含有除F基因外的呼吸道合胞病毒(RSV)毒株A2的完整反基因组序列，其是RSV株系19的反基因组序列。

与辅助质粒一起，它可用于反向遗传学系统以恢复感染性病毒。质粒上的反基因组序列可以在病毒恢复之前突变，以产生具有所需突变的病毒。

在某些实施例中，本公开涉及产生RSV-hMPV颗粒的方法，包含：将具有BAC基因和RSV-hMPV反基因组的载体插入分离的真核细胞中，并在形成RSV病毒体的条件下将一种或多种选自由编码RSV的N蛋白的载体、编码RSV的P蛋白的载体、编码RSV的L蛋白的载体和编码RSV的M2-1蛋白的载体组成的群组的载体插入细胞。可通过在使得载体进入细胞的条件下物理注射、电穿孔或混合细胞和载体来将载体插入细胞中。

预期嵌合RSV-hMPV包括某些突变、缺失或变体组合，诸如RSV的冷传代(cp)非温度敏感(ts)衍生物cpRSV，诸如rA2cp248/404/1030ΔSH。rA2cp248/404ΔSH含有4个独立的减毒遗传元件：cp，基于共同赋予cpRSV的非ts减毒表型的N和L蛋白中的错义突变；ts248，L蛋白中的错义突变；ts404，M2基因的基因起始转录信号中的核苷酸取代；和ΔSH，SH基因的完全缺失。rA2cp248/404/1030ΔSH含有独立的减毒遗传元件：存在于rA2cp248/404ΔSH和ts1030(L蛋白中的另一错义突变)中的那些。参见Karron等人，《传染病杂志》，2005，191(7)：1093-1104，特此通过引用并入。在某些实施例中，预期RSV-hMPV反基因组可含有在非必需基因(例如，SH、NS1、NS2和M2-2基因)或其组合中的缺失或突变。

由于遗传密码的冗余，单个氨基酸由多个密码子序列编码，有时称为同义密码子。在不同的物种中，同义密码子的使用频率或多或少，有时称为密码子偏倚。已显示将代表性不足的同义密码子遗传工程到基因的编码序列中会导致蛋白翻译率降低，而蛋白的氨基酸序列不变。Mueller等人报道了通过密码子偏倚变化的病毒减毒。参见《科学》，2008，320：1784。还参见WO/2008121992、WO/2006042156、Burns等人，《病毒学杂志》，2006，80(7)：3259和Mueller等人，《病毒学杂志》，2006，80(19)：9687。

Meng等人，《微生物学会(MBio)》，5 e01704-01714(2014)和美国专利申请公开第2016/0030549号中报道了RSV中密码子去优化的使用。在某些实施例中，本公开涉及分离的核酸、具有密码子去优化的重组RSV-hMPV、由其产生的疫苗以及与其相关的疫苗接种方法。在某些实施例中，密码子去优化在非结构基因NS1和NS2中并且任选地在基因L中。在进一步的实施例中，基因SH缺失。在某些实施例中，密码子去优化是在具有SEQ ID NO：1或其变体编码序列的嵌合hMPV和RSV F蛋白中。

在某些实施例中，本公开涉及编码去优化基因NS1和/或NS2、任选地野生型人RSV的基因L或其变体的分离的核酸，其中核苷酸被取代使得产生Gly的密码子是GGT，产生Asp的密码子是GAT，产生Glu的密码子是GAA，产生His的密码子是CAT，产生Ile的密码子是ATA，产生Lys的密码子是AAA，产生Leu的密码子是CTA，产生Asn的密码子是AAT，产生Gln的密码子是CAA，产生Val的密码子是GTA，或产生Tyr的密码子是TAT，或其组合。在某些实施例中，分离的核酸中的基因进一步包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有个体密码子的组合。在某些实施例中，分离的核酸中的基因包含至少20个、30个、40个或50个或更多个密码子。

在某些实施例中，本公开涉及编码去优化基因NS1和/或NS2、任选地野生型人RSV的基因L或其变体的分离的核酸，其中核苷酸被取代使得产生Ala的密码子是GCG，产生Cys的密码子是TGT，产生Phe的密码子是TTT，产生Pro的密码子是CCG，产生Arg的密码子是CGT，产生Ser的密码子是TCG，或产生Thr的密码子是ACG，或其组合。在某些实施例中，含有核酸的基因包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个或所有个体密码子的组合。在某些实施例中，分离的核酸中的基因进一步包含至少20个、30个、40个或50个或更多个密码子。

在某些实施例中，本公开涉及编码嵌合hMPV和RSV F蛋白例如包含SEQ ID NO：1或其变体的嵌合hMPV和RSV F蛋白的去优化基因的分离的核酸，其中核苷酸被取代使得产生Gly的密码子是GGT，产生Asp的密码子是GAT，产生Glu的密码子是GAA，产生His的密码子是CAT，产生Ile的密码子是ATA，产生Lys的密码子是AAA，产生Leu的密码子是CTA，产生Asn的密码子是AAT，产生Gln的密码子是CAA，产生Val的密码子是GTA，或产生Tyr的密码子是TAT，或其组合。在某些实施例中，分离的核酸中的基因进一步包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有个体密码子的组合。在某些实施例中，分离的核酸中的基因包含至少20个、30个、40个或50个或更多个密码子。

Glenn等人报道了一项健康育龄妇女中呼吸道合胞病毒重组融合(F)纳米颗粒疫苗的随机、盲法、对照、剂量范围研究。《传染病杂志》2016，213(3)：411-22。在某些实施例中，本公开涉及含有嵌合hMPV和RSV F蛋白，例如包含5EQ ID NO：1或其变体的嵌合hMPV和RSV F蛋白作为本文报道的RSV核心结构蛋白的病毒颗粒和病毒样颗粒(VLP)。病毒颗粒通常用作灭活疫苗(或死疫苗)。RSV可以在培养物中生长，然后使用诸如加热或甲醛的方法杀死。减毒活疫苗通常被削弱，使得复制和/或感染率较慢。

在某些实施例中，本公开考虑作为完整病毒疫苗的嵌合RSV-hMPV颗粒，例如暴露于热、化学制品或辐射的完整病毒颗粒，使得RSV-hMPV的基因组是非复制性或非传染性的。在某些实施例中，本公开考虑了裂解病毒疫苗中的嵌合RSV-hMPV颗粒，其通过使用去污剂破坏病毒并通过纯化出本文公开的嵌合F蛋白作为抗原来刺激免疫系统产生对病毒的反应来产生。

VLP与成熟的病毒体非常相似，但它们不含病毒基因组材料(即病毒基因组RNA)。因此，VLP本质上是非复制性的。此外，VLP可以在VLP表面表达蛋白。此外，由于VLP类似于完整的病毒体并且是多价颗粒结构，因此VLP可以有效诱导中和针对表面蛋白的抗体。VLP可以重复施用。

在某些实施例中，本公开涵盖在表面上包含本文公开的嵌合F蛋白和流感病毒基质(M1)蛋白核心的VLP。Quan等人报道了生产由流感病毒基质(M1)蛋白核心和表面上的RSV-F组成的病毒样颗粒(VLP)的方法。《传染病杂志》2011，204(7)：987-995。可以产生表达RSV F和流感M1的重组杆状病毒(rBV)，并将它们转染到昆虫细胞中进行生产。

使用方法

在某些实施例中，本公开涉及包含免疫学有效量的本文公开的嵌合RSV-hMPV、RSV和/或hMPV多肽、RSV-hMPV颗粒、RSV-hMPV病毒样颗粒和/或核酸的免疫原性组合物。在某些实施例中，本公开涉及用于刺激个体的免疫系统以产生针对hMPV和/或RSV的保护性免疫反应的方法。在某些实施例中，将在生理学可接受的载体中的免疫学有效量的本文公开的嵌合RSV-hMPV、多肽和/或核酸施用于个体。

在某些实施例中，本公开涉及用于本文公开的用途的包含本文公开的核酸的药物和疫苗产品。

在某些实施例中，本公开涉及本文公开的核酸或载体用于制造用于本文公开用途的药物和疫苗产品的用途。

本公开还提供了分析其他类型的减毒突变并将它们并入嵌合RSV-hMPV以用于疫苗或其他用途的能力。例如，小鼠肺炎病毒的组织培养物适应性非致病毒株(RSV的鼠对应物)缺乏G蛋白的胞质尾(Randhawa等人，《病毒学》207：240-245(1995))。以此类推，可以删除或修饰每种糖蛋白HN、G和SH的胞质和跨膜结构域以实现减毒。

用于本公开的传染性RSV-hMPV的其他突变包括在RSV-hMPV微型基因组的突变分析过程中鉴定的顺式作用信号中的突变。例如，前导序列和尾随序列以及侧翼序列的插入和缺失分析鉴定了病毒启动子和转录信号，并提供了一系列与不同程度的RNA复制或转录减少相关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(由此，每个位置依次被修饰为每个核苷酸替代物)还鉴定了许多减少(或在一种情况下增加)RNA复制或转录的突变。任何这些突变都可以插入到本文所述的完整反基因组或基因组中。其他突变涉及用其来自反基因组的对应物替换基因组的3′端，这与RNA复制和转录的变化有关。此外，基因间区域(Collins等人，《美国科学院院刊》83：4594-4598(1986)，通过引用并入本文)可以缩短或延长或改变序列内容，并且天然存在的基因重叠(Collins等人，《美国科学院院刊》84：5134-5138(1987)，通过引用并入本文)可以通过本文所述的方法去除或改变为不同的基因间区域。

对于疫苗用途，根据本公开产生的病毒可直接用于疫苗制剂中，或根据需要使用技术人员公知的冻干方案冻干。冻干病毒通常保持在约4摄氏度。当准备使用时，将冻干病毒在稳定溶液中重构，例如盐水或包含SPG、Mg和HEPES，有或没有佐剂。

通常，本公开的RSV-hMPV疫苗含有免疫遗传有效量的如本文所述产生的嵌合病毒作为活性成分。可以将修饰的病毒与生理学可接受的载体和/或佐剂一起引入受试者。有用的载体是本领域公知的，并且包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。得到的水溶液可以包装以按原样使用或冻干，如上所述，冻干制剂在施用前与无菌溶液合并。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。可接受的佐剂包括弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾，它们是本领域公知的材料。

在用本文所述的嵌合RSV-hMPV组合物免疫后，经由气溶胶、液滴、口服、局部或其他途径，受试者的免疫系统通过产生对病毒蛋白如F糖蛋白具有特异性的抗体来应答疫苗。作为疫苗接种的结果，受试者变得对hMPV和/或RSV感染至少部分或完全免疫，或对发展中度或重度hMPV和/或RSV感染，特别是下呼吸道感染具有抗性。

施用疫苗的受试者可以是任何对hMPV和/或RSV或密切相关病毒感染敏感的哺乳动物，并且该受试者能够对接种毒株的抗原产生保护性免疫反应。因此，合适的受试者包括人类、非人类灵长类动物、牛科动物、马科动物、猪、绵羊、山羊、兔类动物(lagamorph)、啮齿动物等。因此，本公开提供了产生用于多种人类和兽医用途的疫苗的方法。

将含有本公开的RSV-hMPV的疫苗组合物施用于对hMPV和/或RSV感染敏感或以其他方式处于hMPV和/或RSV感染风险中的受试者以增强受试者自身的免疫反应能力。此类量被定义为“免疫原性有效剂量”。在这种用途中，精确的量再次取决于受试者的健康状况和重量、施用方式、制剂性质。疫苗制剂应提供足以有效保护受试者患者免受严重或危及生命的感染的本公开的嵌合RSV-hMPV的量。

根据本公开产生的嵌合RSV-hMPV可以与其他亚组或毒株的病毒组合以实现免受多个RSV-hMPV亚组或毒株的影响，或者可以将这些毒株的保护性表位工程化到如本文所述的一种病毒中。通常，不同的病毒将混合并同时施用，但也可以分开施用。例如，由于两个hMPV亚组的F糖蛋白在氨基酸序列上不同，因此这种相似性是交叉保护性免疫反应的基础，如在用嵌合RSV-hMPV或F抗原免疫并用异源毒株攻击的动物中观察到的。因此，用一种毒株进行免疫可以免受相同或不同亚组的不同毒株的影响。

在一些情况下，可能需要将本公开的嵌合RSV-hMPV疫苗与诱导对其他介质、特别是其他儿童病毒的保护性反应的疫苗组合。例如，本公开的嵌合RSV-hMPV疫苗可以与RSV疫苗同时施用。

可以进行本公开的疫苗组合物的单次或多次施用。在新生儿和婴儿中，可能需要多次连续施用以引发足够的免疫水平。施用可以开始于出生的第一个月内，或在大约两月龄之前，通常不迟于六月龄，并且必要时在整个童年时期每隔一段时间施用，诸如两个月、六个月、一年和两年，以维持足够的保护水平免受天然(野生型)感染的影响。类似地，对反复或严重RSV/hMPV感染特别敏感的成年人，诸如例如卫生保健工作者、日托工作者、幼儿的家庭成员、老年人(超过55、60或65岁)，或心肺功能受损的个体可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫反应。诱导免疫力的水平可以通过测量中和分泌和血清抗体的量来监测，并根据需要调整剂量或重复接种疫苗以维持所需的保护水平。此外，不同的疫苗病毒可能对不同的受体群体有利。例如，表达富含T细胞表位的额外蛋白的工程毒株可能特别有利于成人而不是婴儿。

通常通过气雾剂、喷雾器或其他局部应用施用于被治疗患者的呼吸道。重组嵌合RSV-hMPV以足以导致所需基因产物的治疗或预防水平的表达的量施用。在该方法中施用的代表性基因产物的实例包括编码例如特别适合瞬时表达的那些的基因产物，例如白介素-2、白介素-4、γ-干扰素、GM-CSF、G-CSF、促红细胞生成素，和其他细胞因子、葡萄糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA和疫苗抗原。

在某些实施例中，本公开涉及包含免疫学有效量的本公开的重组嵌合RSV-hMPV(例如，减毒活重组嵌合RSV-hMPV或灭活的、非复制性RSV-hMPV)的免疫原性组合物(例如，疫苗)、免疫学有效量的本文公开的多肽和/或免疫学有效量的本文公开的核酸。

在某些实施例中，本公开涉及刺激个体免疫系统以产生针对hMPV的保护性免疫反应的方法。在该方法中，将在生理学可接受的载体中的免疫学有效量的本文公开的重组嵌合RSV-hMPV、免疫学有效量的本文公开的多肽和/或免疫学有效量的本文公开的核酸施用于个体。

通常，载体或赋形剂是药学上可接受的载体或赋形剂，诸如无菌水、盐水溶液、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或其组合。根据本领域中建立的方案影响确保无菌、pH、等渗性和稳定性的此类溶液的制备。通常，选择载体或赋形剂以最小化过敏和其他不良作用，并适合特定的施用途径，例如皮下、肌内、鼻内、口服、局部等。所得水溶液可以例如包装以用于原样使用或冻干，冻干制剂在施用前与无菌溶液合并。

在某些实施例中，嵌合RSV-hMPV(或组分，例如RSV-hMPV F蛋白)以足以刺激对一种或多种hMPV毒株具有特异性的免疫反应的量施用(例如，施用免疫学有效量的嵌合RSV-hMPV或组分，例如RSV-hMPV F蛋白)。优选地，嵌合RSV-hMPV的施用引发保护性免疫反应。适用于产生针对hMPV和/或RSV的保护性免疫反应的用于引发保护性抗病毒免疫反应的剂量和方法是本领域技术人员已知的。参见例如美国专利第5,922,326号；Wright等人(1982)《感染性免疫学(Infect.Immun.)》37：397-400；Kim等人(1973)《儿科学(Pediatrics)》52：56-63；和Wright等人(1976)《儿科学杂志(J.Pediatr.)》88：931-936。例如，可以在每施用剂量约10³-10⁶pfu(噬斑形成单位)(例如，每施用剂量10⁴-10⁵pfu)的范围内提供病毒。通常，剂量将根据例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、施用方式和时间以及其他临床因素进行调整。疫苗制剂可以例如使用针头和注射器或无针注射装置通过皮下或肌内注射全身施用。优选地，疫苗制剂例如通过液滴、气溶胶(例如大颗粒气溶胶(大于约10微米))或喷入上呼吸道鼻内施用。虽然任一上述递送途径都会产生保护性的全身免疫反应，但鼻内施用赋予了在病毒进入部位引发粘膜免疫力的额外益处。对于鼻内施用，通常优选减毒活病毒疫苗，例如减毒、冷适应和/或温度敏感的重组病毒。作为减毒活病毒疫苗的替代或补充，例如可以使用死病毒疫苗、核酸疫苗和/或多肽亚单位疫苗，如Walsh等人(1987)《传染病杂志》155：1198-1204和Murphy等人(1990)《疫苗(Vaccine)》8：497-502所建议的。

在某些实施例中，减毒重组嵌合RSV-hMPV如在疫苗中所用，并且被充分减毒，使得感染症状，或至少是严重感染的症状，不会发生在用减毒病毒免疫(或以其他方式感染)的大多数个体中一一在其中病毒组分(例如，本文的核酸或多肽)用作疫苗或免疫原性组分的实施例中。然而，毒力通常被充分消除，使得轻度或重度下呼吸道感染通常不会发生在接种疫苗或附带受试者中。

虽然优选用单一剂量刺激保护性免疫反应，但可以通过相同或不同途径施用额外剂量以达到所需的预防效果。例如，在新生儿和婴儿中，可能需要多次施用以引发足够的免疫力水平。必要时可以在整个童年时期每隔一段时间继续施用，以保持足够保护水平免受野生型hMPV感染的影响。类似地，对反复或严重hMPV感染特别敏感的成年人，例如卫生保健工作者、日托工作者、幼儿的家庭成员、老年人和心肺功能受损的个体，可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫反应。例如，可以通过测量病毒中和分泌和血清抗体的量来监测诱导的免疫力水平，并根据需要调整剂量或重复接种疫苗以引发和维持所需的保护水平。

可替代地，可以通过用病毒离体或体内靶向树突状细胞来刺激免疫反应。例如，将增殖的树突状细胞暴露于足够量的病毒并持续足够的时间段以允许树突状细胞捕获hMPV抗原。然后通过标准的静脉移植方法将细胞转移到要接种的受试者中。

任选地，用于施用疫苗的制剂还含有一种或多种用于增强对hMPV抗原的免疫反应的佐剂。考虑的佐剂包括铝盐，诸如

和

考虑的佐剂包括水包油乳液，其中油充当水相中的溶质并形成分离的液滴，由乳化剂稳定。在某些实施例中，乳液含有角鲨烯或α-生育酚(维生素E)和另外的乳化剂诸如脱水山梨糖醇三油酸酯和聚山梨醇酯80(PS80)作为表面活性剂。在某些实施例中，乳液含有吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。GLA可以单独或在基于角鲨烯的水包油稳定乳液(SE)中与嵌合RSV-hMPV、颗粒或F蛋白一起配制。lyer等人报道了使用呼吸道合胞病毒融合蛋白(RSV-F)的不同粒径的水包油佐剂。《人类疫苗与免疫治疗学(Hum Vaccin Immunother)》，2015，11(7)：1853-1864。

合适的佐剂包括例如：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)和合成佐剂QS-21。

如果需要，嵌合RSV-hMPV的预防性疫苗施用可以与一种或多种免疫刺激分子的施用结合进行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增强和促炎活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如，粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；和其他免疫刺激分子，诸如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1；B7.2等。免疫刺激分子可以在与嵌合RSV-hMPV相同的制剂中施用或可以分开施用。可以施用蛋白或编码该蛋白的表达载体以产生免疫刺激作用。

尽管给个体接种特定亚组的特定毒株的嵌合RSV-hMPV可以诱导针对不同毒株和/或亚组病毒的交叉保护，但如果需要，可以通过给个体接种来自至少两个毒株的减毒hMPV来增强交叉保护，例如，每个毒株代表不同的亚组。类似地，嵌合RSV-hMPV疫苗可以任选地与诱导针对其他致病因子的保护性免疫反应的疫苗组合。

实例

实例1-嵌合RSV-hMPV病毒的组装和拯救

嵌合人RSV-hMPV F蛋白

构建了表达hMPV嵌合融合(F)蛋白的在RSV疫苗遗传背景内含有呼吸道合胞病毒(RSV)系19F的尾部区域的减毒活疫苗候选物。该候选物使用RSV A2反向遗传学系统组装，并且含有免疫调节NS1和NS2基因的密码子去优化、小疏水(SH)基因的缺失以及远红荧光单体Katushka 2(mKate2)蛋白的表达，其是名为OE1的构建体。参见美国专利公开第20160030549号。将NS1和NS2基因密码子去优化，这减少但不消除蛋白的表达。

通过使用限制性位点Sal I和Sac II替换RSV系19F基因，将RSV-hMPV嵌合F基因插入到BAC OE1构建体中。基因起始和基因终止是RSV特异性的。此外，将RQSR(SEQ ID NO：18)至RRRR(SEQ ID NO：19)不依赖胰蛋白酶的切割位点引入F蛋白，其促进病毒中不依赖胰蛋白酶的生长(参见Zhang等人(2012)《病毒学方法杂志》185(1))。RSV-hMPV嵌合F蛋白在下面显示为SEQ ID NO：1，由下面显示为SEQ ID NO：2的基因编码。

细菌人工染色体(BAC)构建体的产生

OE1的细菌人工染色体(BAC)构建体用于产生本文公开的嵌合RSV-hMPV构建体DH2。OE1的细菌人工染色体(BAC)构建体通过修改含A2-mKate2-line19F(I557V)的BAC产生。参见Hotard等人，一种适用于重组介导的诱变的稳定呼吸道合胞病毒反向遗传学系统。《病毒学》434，129-136(2012)。为远红荧光报告基因的单体Katushka 2(mKate2，K)的基因位于RSV反基因组cDNA的第一基因位置。在这个位置包含mKate2不会在体外或小鼠中减弱RSV。SH的缺失(ΔSH)通过重组介导的诱变(重组工程)进行。寡核苷酸引物用于PCR扩增galK盒，使得扩增子末端与靶位点同源，以用galK替换SH。在大肠杆菌中重组导致从基因起始开始到SH-G基因间区域的末端用galK盒替换SH。在重组工程的第二步中，将互补寡核苷酸退火并用于去除galK盒。SH的精确缺失通过测序确认，从而产生A2-K-ΔSH-line19F(I557V)BAC。

人密码子去优化的NS1是SEQ ID NO：3

并且NS2是SEQ ID NO：4

DH2的序列

人类偏肺病毒GenBank登录号AEK26895.1(TN/94-49 F；SEQ ID NO：5)

DH2在Vero细胞和原代正常人支气管上皮细胞(NHBE)中的体外生长

Vero细胞。吸出6孔板中70％汇合的Vero细胞的培养基，并在每个病毒毒株获得的每个时间点以0.01或0.5的MOI添加0.5mL病毒以复制孔。将板在室温下摇动1小时。感染后，小心吸出病毒并用1mL PBS洗涤单层细胞两次，然后添加2mL预热的完全E-MEM(Vero)。在37℃和5％CO₂下孵育板，持续时间进程的持续时间。在感染后1、12、24小时、2、3、4、5、6、7和8天获得时间点。在每个时间点，将单层细胞刮入上清液中，短暂涡旋，并在液氮中快速冷冻，然后在-80℃下储存。

图2显示了在Vero细胞中以MOI 0.5感染后48小时的hMPV F蛋白表达(野生型hMPV(1)、模拟物(2)、RSV毒株OE1(3)和hMPV疫苗候选物DH2(4))。印迹等量的蛋白。

图3A显示了hMPV在Vero细胞中的体外生长曲线。如上所述，以MOI 0.1感染细胞，每个时间点一式两份。通过荧光灶单位(FFU)测定在Vero细胞上滴定样品。图3B显示了感染Vero细胞的代表性图像。

在ALI分化NHBE细胞，并且用PBS洗涤单层细胞，然后用100μL病毒以0.1的MOI进行顶端感染。使病毒在37℃下孵育2小时，然后取出，随后用PBS洗涤3次。在指定的时间点，将150μL培养基在37℃下在顶面孵育10分钟，然后收获并转移到微量离心管中。重复该过程以产生总共300μL合并的顶端洗液，将其在液氮中冷冻并储存在-80℃下以用于以后滴定。在Vero细胞中对所有分析进行FFU滴定。

hMPV在NHBE细胞中的体外生长曲线如图4所示。如上所述，以MOI 0.1感染细胞，每个时间点一式两份。通过荧光灶单位(FFU)测定在Vero细胞上滴定样品。

在BSR/T7细胞中拯救DH2

产生四种嵌合hMPV构建体，并试图在BSR/T7细胞中拯救，BSR/T7细胞是稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21基细胞系克隆。参见Buchholz等人(1999)《病毒学杂志》73(1)：251-259。构建体被命名为DH1-4。DH1和DH2使用OE1(野生型G)的主链构建，其中DH1具有全长hMPV F(SEQ ID NO：5)，并且DH2具有RSV-hMPV嵌合F(SEQ ID NO：2)。DH3(全长hMPV F)和DH4(RSV-hMPV嵌合F)是使用OE4的主链构建的，与OE1一样，其含有密码子去优化的NS1和NS2以及SH基因的缺失。参见Stobart(2016)，同上。此外，该构建体含有密码子去优化的G基因。hMPV F基因和RSV-hMPV嵌合F基因含有RQSR(SEQ ID NO：18)至RRRR(SEQ ID NO：19)突变以引入不依赖胰蛋白酶的切割位点。这种突变促进了病毒中不依赖胰蛋白酶的生长。

通过用RSV辅助质粒(RSV P、N、M2-1、L)和含有嵌合hMPV构建体的反基因组的BAC质粒同时转染BSR/T7细胞来进行拯救。几次拯救尝试表明，只有DH2和DH4能够被拯救。然而，表达密码子去优化的G的DH4的生长显著慢于DH2，这表明该候选物对于疫苗而言可能过于减毒。含有全长hMPV F的构建体不生长，表明使用包含RSV F蛋白胞质尾的F蛋白嵌合形式有利于生产hMPV疫苗。

Claims (16)

1.一种包含hMPV F蛋白胞外域和RSV F蛋白胞质尾的嵌合RSV和hMPV F蛋白。

2.根据权利要求1所述的嵌合RSV和hMPV F蛋白，其进一步包含RSV F蛋白跨膜结构域，其中所述嵌合RSV和hMPV F蛋白在N至C末端方向包含所述hMPV F蛋白胞外域、所述RSV F蛋白跨膜结构域和所述RSV F蛋白胞质尾。

3.根据权利要求1所述的嵌合RSV和hMPV F蛋白，其中所述嵌合RSV和hMPV F蛋白包含SEQ ID NO：1或其与SEQ ID NO：1具有至少约85％序列同一性的变体。

4.一种包含活嵌合病毒的免疫原性组合物，所述活嵌合病毒包含编码根据权利要求1至3中任一项所述的嵌合RSV和hMPV F蛋白的核酸。

5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述核酸包含SEQ ID NO：2或其与SEQID NO：2具有至少约85％序列同一性的变体。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述活嵌合病毒不含编码呼吸道合胞病毒SH蛋白的基因。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂和/或其他药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝凝胶、铝盐或单磷酰脂质A。

9.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是任选包含α-生育酚、角鲨烯和/或表面活性剂的水包油乳液。

10.一种使受试者针对副流感病毒免疫的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求3至9中任一项所述的免疫原性组合物。

11.一种编码根据权利要求1或权利要求2所述的嵌合RSV和hMPV F蛋白的核酸。

12.根据权利要求11所述的核酸，其包含SEQ ID NO：2或其与SEQ ID NO：2具有至少约85％序列同一性的变体。

13.一种包含权利要求11或权利要求12所述的核酸的载体。

14.根据权利要求13所述的载体，其选自质粒或细菌人工染色体。

15.一种分离的重组颗粒，其包含RSV的NS1和NS2蛋白以及根据权利要求1或权利要求2所述的嵌合RSV和hMPV F蛋白。

16.根据权利要求15的分离的重组颗粒，其包含活减毒嵌合RSV-hMPV基因组或反基因组。

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