CZ302062B6

CZ302062B6 - Derivát acyldipeptidu, zpusob jeho prípravy, meziprodukty pro jeho prípravu a farmaceutický prostredek, který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ302062B6
Application number: CZ20004893A
Authority: CZ
Inventors: Bauer@Jacques; Richard Martin@Olivier
Original assignee: Om Pharma
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2010-09-22
Also published as: AR029877A1; EE200000791A; JP2002519338A; AU4284899A; US7157092B1; CA2337807A1; PL195764B1; HUP0102475A2; CN1306504A; SK18872000A3; DE69935330D1; RU2223262C2; CZ20004893A3; EP1091928A1; JP4699609B2; CA2337807C; KR20010083078A; CN1168702C; PL345040A1; EP1091928B1

Abstract

Derivát N-acyldipeptidu obecného vzorce I, kde znamená R.sub.1 .n.a R.sub.2 .n.C.sub.2-24.n.acyl poprípade substituovaný jednou nebo nekolika substituenty ze souboru OH, alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio a C.sub.2-24.n.alkylthio vždy s 1 až 24 C-atomy, m 1 až 4, n 0, p 3 nebo 4 a q 1, X a Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu, pricemž znamená alespon jeden substituent X a Y fosfonoskupinu, a jeho adicní soli s minerálními nebo s organickými zásadami, zpusob jeho prípravy, meziprodukty pro tuto prípravu a imunologický farmaceutický prostredek, který ho obsahuje.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká oboru chemie, zvláště oblasti lékařské chemie. Je zaměřen na N~acyldípeptidový derivát odvozený od hydroxyIováných aminokyselin, jejichž volné funkční aminoskupiny se acyl ují mastnými kyselinami. Vynálezem jsou tedy deriváty N-acyldipeptidu odvozené od io hydroxylováných aminokyselin, jejichž volné funkční aminoskupiny jsou acylovány mastnými kyselinami. Charakteristickou vlastností takových sloučenin jsou biologické aktivity, zvláště imunomodulace větší než sloučenin známých ze stavu techniky.

i? Dosavadní stav techniky

Vynález se zaměřuje na pseudopeptidy označované jako analogy lipidů A'. Lipidy A' jsou glykolipidové molekulární entity, které tvoří lipidové zakončení liposacharidu (LPS), přičemž je LPS zakotven v buněčné membráně gram negativní bakterie. Těmto entitám se přičítá výrazná imunostimulační aktivita LPS (Rietschel a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1996, 216, str. 39, Zaehringer a kol. Adv.Carbohydr. Chem. Biochem. 1994, 50, str. 211).

Lipidy A' a jejich analogy mají zajímavá biologická působení jako imunomodulační a protírá kov i nová činidla (Shiba and Kotani, Daiichi Seiyaku Co., patentový spis číslo JP 61 227-586

A. Hasegawa a kol. Toho Pharmaceutical Industries, evropský patentový spis EP 224 260. Kodema a kol. Suntory Ltd., evropský patentový spis EP 688 289), obecně jsou však charakterizovány vysokou endotoxicitou.

Derivát lipidu A jménem OM—174 (de-O-acylovaný E.coli lipid A) má zvláštní význam pro .>() svoji velmi nízkou toxicitu a výrazné působení jako imunomodulační a protírakovinová činidlo a jako adjuvant (Davies, Bauer, Hirt, Schulthess, Laboratories OM S. A., světový patentový spis WO 95 14026). Komplexní struktura lipidů A ajejich toxicita stimulovala výzkum syntetických analogů, jako například hybridu O-acylovaných O-gly kosy lo váných aminokyselin (Achiva a kol., Chem. Pharm. Bull. 1994, 42, str. 2526, 1997, 45, str. 312, 1997, 45, str. 1089).

N-acylované pseudopeptidy podle vynálezu vytvářejí novou třídu syntetických analogů lipidu A zbavených jejich toxicity a majících výrazné imunomodulační vlastnosti.

Oxid dusíku NO a reaktivní oxygeny, jako je superoxidový anion, mají významnou úlohu pří regulaci imunního systému. Tyto aktivity jsou široce popsány (Bogdan C., Natural Immunol., 2001, 2, str. 970 až 916 a citovaná literatura).

Oxid dusíku NO má různé modulační působení na zánětlivou a imunní odezvu.

V živočišné tkáni se NO generuje NO-syntázami (NOS), které oxidují L-arginin na L-citrulin. Některé formy NOS jsou známy včetně indukovatelného NOS (iNOS nebo NOS II) obsaženého v makrofágách, monocytech a jiných typech buněk podílejících se na zánětlivých procesech. Induktorem NOS je LPS.

Interakce lípopolysacharidů (LPS) s TLR4 receptorovými spouštědly je kaskádou jevů vedoucích k aktivaci NFkB faktoru, který je zodpovědný za transkripci INOS enzymu. Oxid dusíku NO, produkovaný imunologicky nebo chemicky stimulovanými makrofágy, představuje antimikrobiální aktivitu připisovanou vytváření peroxynitritu (ONOO).

-1 CZ 302062 B6

Kromě této úlohy je oxid dusíku NO mocným regulátorem imunní odezvy. Zvláště se charakterizuje jako inhibitor exprese genů zahrnutých v buněčné proliferaci a zvláště buněk T subtypu Thl. Zdá se také, že inhibuje sekreci cytokinu svými T lymphocyty při zánětech.

Obecně tyto problémy popsal Coleman J. W.(lntemational Immunopharmacology, 2001, 2, str. 1397 až 1406). Jako další příslušná literatura se uvádějí zvláště: Wink (Curr. Top. Cell. Regul. 1995, 34, str. 159 až 187), Taylor-Robinson (Eur. J. Immunol., 1994, 24, str. 980 až 984), Bauer H. (Immunology 1997, 90, str. 205 až 211) Fehsel K (J. Ommunol. 1995, 155, str. 2858 až 2865).

io

Zvláště pro svojí schopnost stimulace oxidu dusíku NO je nutno považovat sloučeniny podle vynálezu jako činidla schopná modulovat imunní odezvu organismu a jsou proto užitečné jako farmaceutická činidla,

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je derivát N-acyldipeptidu obecného vzorce l

X-O-ťCHa >_m-CH-CCH2>n-C0NH-CCHa)p-LH-CCH₂ X,-U~Y Cl).

MHRi NHR₂ kde znamená

Ri a R₃ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxy25 lovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acylthioskupinu a alkylthioskupinu vždy s 1 až 24 atomy uhlíku, m 1 až 4, n 0, p 3 nebo 4, h

X a Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu, přičemž znamená alespoň jeden substituent X a Y fosfonoskupinu, a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

Pokud X a/nebo Y znamenají kyselou skupinu v neutrální formě, jde o formu volné fosforečné kyseliny. Je-li kyselá skupina ve formě s nábojem, jde o sůl fosforečné kyseliny, jmenovitě vytvářené adicí organické nebo anorganické zásady, s výhodou terapeuticky přijatelné. Pokud zásady nejsou vhodné pro terapeutickému použití, jsou použitelné například pro snadnou identi45 fikaci, pro čištění a pro separaci.

Zásady vytvářející soli určené k terapeutickému použití zahrnují hlavně zásady alkalických kovů, jako jsou například hydroxid sodný, draselný, nebo lithný, soli amoniové, zásady kovů alkalických zemin, jako hydroxid vápenatý, hořečnatý a strontnatý, hydroxid železnatý, organické zásady jako jsou zásady odvozené od primárních, sekundárních a terciárních aminů, jako jsou methylamin, diethylamin, monoethanolamin, diethanolamin, benzylamin, N-methylbenzylamin,

- 2 CZ 302062 B6 veratrylamin, trimethoxybenzylaniin, zásadité aminokyseliny, jako je lysin aomithin nebo aminocukry.

Příklady zásad nevhodných k terapeutickým účelům jsou brucin, strychnin, agmatin, homarin, glukosamin, N-methyl glukosamin nebo N-methylmorfolin. Jak shora uvedeno, jsou soli od nich odvozené vhodné například k separačním a identifikačním účelům.

Jestliže znamená m 1 a n 0, je příslušná molekula odvozena od šeřinu. Jestliže znamená m 2 a n 0, je molekula přicházející v úvahu odvozena od homoserinu. Jestliže znamená m 3 a n 0, jde io o petahomoserinové sloučeniny. Jestliže znamená m 4 a n 0, jde o hexahonoserinovou sloučeninu.

Jestliže znamená p 3 a q 1, může jít o citrullinovou, omithínovou nebo argininovou sloučeninu.

Jestliže znamená p 4 a* q 1, jde o homoargininovou nebo lysinovou sloučeninu.

Z derivátů N-acyldipeptidu označovaných zde také jako pseudodipeptidy mají zvláštní význam následující sloučeniny:

1-dihydrogenfbsfát nebo 10-dihydrogenfosfát 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(320 hydroxy-tetradekanoy lamino)—4-oxo-5-azadekan—1,10—diotu a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami,

1.10- bis(dihydrogenfosfát) 3-(3~dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxy-tetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekan-l,l0-diolu a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami,

1.10- bis( dihydrogenfosfát) 3-{3-hydroxytetradekanoylamino)-9-(3-dodekanoyIoxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekan-l,10-dÍolu a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami,

I-dihydrogenfosfát 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxy-tetradekanoylamino)~4—oxo—5-azadekan-l ,10—diolu a jeho adiční solí s minerálními nebo s organickými zásadami,

1 -dihydrogenfosfát 3-{3-hydroxytetradekanoy Iamino)-9-(3-dodekanoy loxytetradekanoy Iaminoy^-oxo-S-azadekan-UKL-diolu a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami,

10-dihydrogenfosfát 3-(3-hydroxytetradekanoylamino)-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoyl40 amino)-4-oxo-5-azadekan-l,10-diolu a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

Symboly R₍ a R₂ znamenají stejné nebo různé zbytky nasycených nebo nenasycených acylových derivátů s rozvětveným nebo s přímým řetězcem, které mohou obsahovat jeden nebo několik substituentů volených ze souboru zahrnujícího skupinu alkylovou, aminoskupinu, acylaminoskupinu, hydroxylovou skupinou, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, acylthioskupinu a alkylthioskupinu.

Příklady takových zbytků acylovaných, substituovaných derivátů jsou skupina ricinoleylová,

12-hydroxystearoyIová, 2-hydroxy-3-methylbutanoylová, 3-hydroxy-2-aminopentanoyIová, palmitoylová, elaidylová, eleostearoylová, arachydoylová, arachidonylová, gadoleylová, behenylová, erucylová, 8-methyldekanoylová, 9-methyldekanoylová, dokosohexanoylová nebo eikosapentanoylová. Významné acylové skupiny jsou odvozeny od 3-hydroxymyristové kyseliny a od 3-lauroyloxymyristové kyseliny.

-3 CZ 302062 B6

Sloučeniny obecného vzorce I a zejména monofosfóryIovane a bisfosforylované sloučeniny označované OM-294-MP, (MP) a OM-294—DP (DP), mají zajímavé farmako logické vlastnosti, hlavně se zřetelem na ímunomodulaci. Obzvláště přicházejí v úvahu pro léčení chorob souvisejících s nedostatky imunitního obranného systému nebo s nadměrnou expresí imunitních odezev závislých na použitých dávkách. Mohou se používat také při léčení rakoviny a jako adjuvanty nebo látky podporující odezvy při formulaci vakcín.

Vynálezem jsou tedy pseudopeptidy odvozené od hydroxylovaných aminokyselin, jejichž volné funkční aminoskupiny jsou acyIovány mastnými kyselinami. Charakteristickou vlastností takových sloučenin jsou biologické aktivity, zvláště imunomodulace větší než sloučenin známých ze stavu techniky.

Podstatou vynálezu je také způsob přípravy N-acyldipeptidového derivátu obecného vzorce I X-O-CCřte >_m-CH-<CH₂ >n-C0NH-CCHa >_P-CH-CCH₂ <I>.

NHRi NHR₂ kde znamená

Ri a R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acylthioskupinu a alkylthioskupinu vždy s 1 až 24 atomy uhlíku, m I až 4, n 0, p 3 nebo 4,

Μ I»

X a Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu, přičemž znamená alespoň jeden substituent X a Y fosfonoskupinu, a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami, při kterém se funkční aminoskupiny v nekoncové poloze (q+1) a v koncové poloze omega diaminokyseliny obecného vzorce H₂N-(CH₂)_p-CHNH₂(CH₂)_qlCOOH chrání blokovacími skupinami, které snadno podléhají acidolýze a hydrogenolýze, karboxylové funkční skupina vždy ve volné formě se nechává reagovat s redukčním činidlem k získání odpovídajícího alkoholu, funkční aminoskupina v nekoncové poloze (q+1) se uvolňuje a pak se acyluje aktivním derivátem karboxylové kyseliny obecného vzorce R₂OH, kde R₂ má shora uvedený význam, koncová funkční aminoskupina v poloze omega se následně uvolňuje hydrogenolýzou za získání aminoalkoholu obecného vzorce 11

H2N-CCH2 >p-CH-(CHp Χ,ΟΗ Cil),

I nhr₂

-4CZ 302062 B6 kde znamená R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů shora uvedených, p znamená 3 nebo 4 a q 1, aminoalkohol se kondenzuje v přítomnosti peptídového kondenzačního činidla v inertním rozpouštědle s derivátem omegahydroxyaminokyseliny obecného vzorce 111

XO-CCHz >m-CHCCH2)nCOOH Clil).

I

NHRi kde znamená

Rj acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů shora uvedených, m 1 až 4, n 0,

X skupinu dialkyloxyfosfory lovou nebo diary loxy fosfory lovou vzorce <RO)2P o

za získání pseudopeptidu obecného vzorce IV <RO>₂PO-CCH₂>in~CH'CCH2 >n-C0NH-CCH₂ Žp-CH-<CH₂ <IV> , •k I I □ MHRi NHR2 kde Ri, R₂, n, m, p a q mají shora uvedený význam, a R znamená skupinu snadno odštěpitelnou hydrogenolýzou, volná alkoholová funkční skupina se popřípadě fosforyluje fosforylačním činidlem popřípadě v přítomnosti kopulačního činidla a podrobuje se katalytické hydrogenaci k uvolnění funkční alkoholové skupiny popřípadě obsažené v acy lové skupině R₂, stejně jako fosfátové funkční skupiny po sekundární hydrogenolýze k odstranění chránící skupiny z případné druhé fosfátové skupiny za získání sloučeniny obecného vzorce V <H0>2P0-CCHz >ru-CH-CCH₂ >n-C0NH-CCffe >p-CH-CCH2 >q-0Y CV>.

Ψ I I

O NHRi NHRz kde znamená Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu a R_h R₂, n, m, p a q mají shora uvedený význam, která se popřípadě převádí na své soli reakcí s anorganickou nebo s organickou zásadou.

Stereochemie chirálních center acylaminoskupin je dána konfigurací použitých aminokyselin, zatímco stereochemie acylaminoskupin závisí na konfiguraci použitých mastné kyseliny, použité jako výchozí látky. Vycházet je možno z diaminokyseliny s konfigurací L nebo D nebo s konfigurací racemické povahy. Vycházet je možno z hydroxylované aminokyseliny s konfigurací L, D nebo z racemické směsi. Všechny tyto stereo izomery nebo diastereomery vynález zahrnuje.

Způsob podle vynálezu je založen na následujících, běžně používaných operacích, které jsou objasněny na reakčních schématech 1, 2 a 3 (obr. 33, 34 a 35).

-5CZ 302062 B6

1. Blokovací funkční aminoskupiny v poloze omega řetězce omítinového derivátu se provádí N-benzyioxykarbony lovou substitucí po reakci kyselé funkční skupiny se solí mědi, v alkalickém prostředí, reakcí tohoto karboxylátu mědi s benzylchlorformiátem a uvolněním karboxylové funkční skupiny chelatací mědi v kyselém prostředí k získání N-benzyloxykarbonylem substituovaného derivátu způsobem popsaným v literatuře (Organic Preparations and Procedures International, 23, str. 191 až 194, 1992).

2. Blokování funkční aminoskupiny v poloze a karboxylového podílu omithinového derivátu se provádí terč .-butoxy karbony lovou substitucí za použití alkylpyrokarbonátu jako terč-butylpyrokarbonát v alkalickém prostředí. Terc.-butylpyrokarbonát, reaguje se sousední funkční aminoskupinou za vzniku omega-benzyloxykarbonylaminokarbonylového derivátu a a-tercbenzyloxykarbonylaminokarboxylového derivátu.

3. Převedení karboxylové funkční skupiny na primární alkoholovou funkční skupinu se provádí způsobem popsaným v literatuře (Tetrahedron Letters 32, str. 923 až 926, 1991); toto převedení je založeno na reakci karboxylového derivátu s alkylchlorformátem, jako je isobutylchlorformát, za vzniku směsného anhydridu, který se redukuje borhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy, čímž se získá odpovídající hydroxylovaný derivát mající primární alkoholovou funkční skupinu.

4. Odstranění terc-butoxykarbonyl o vé skupiny v poloze a se provádí pomocí trifluoroctové kyseliny, která současně umožní vytvoření funkční aminoskupiny, jak odpovídá použití trifluoracetátu.

5. Acy láce takto uvolněné funkční aminoskupiny se provádí z výchozí soli trifluoroctové kyseliny pomocí směsného anhydridu připraveného z kyseliny R₂OH a alkylchlorformátu.

6. Uvolnění koncové funkční aminoskupiny se provádí hydrogenolýzou v přítomnosti katalyzátoru na bázi vzácných kovů, jako je platina, palladium na uhlí nebo na iridiovém nosiči.

7. Peptidová kopulace nebo vazba mezi aminosloučenínou obecného vzorce II a fosfory 1derivátem obecného vzorce III' se provádí v přítomnosti kopulačního Činidla, jako je 1-isobutyloxy-2-isobutyloxykarbonyl-l,2-dihydrochinolin, v inertním rozpouštědle, jako je rozpouštědlo obsahující halogen, nebo v přítomnosti karbodiimidu. Získá se tak sloučenina podobná dipeptidu obecného vzorce IV', jejíž hydroxylová funkční skupina případně vzniklá acylovou skupinou R²je blokována.

8. Hydroxylová funkční skupina acy lově skupiny R₂ se uvolňuje hydrogenolýzou v přítomnosti vzácného kovu, jako je palladium na vhodném nosiči například na uhlí.

9. Fosforová skupina se uvolňuje katalytickou hydrogenací v přítomnosti oxidu vzácného kovu, jako je oxid platiny.

10. Fosfory láce derivátu obecného vzorce IV' podobného dipeptidu, se provádí dvoustupňovým způsobem (Helv. Chim. Acta 70, str. 175, 1987). V prvním stupni se nechá sloučenina obecného vzorce IV' reagovat s dialkyl-N,N-dialkylfosforoamiditem nebo s diaryl-N,N-dialkylfosforoamiditem v přítomnosti kopulačního činidla, jako je [1 H]-tetrazol, v polárním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran; takto vytvořený fosfit se oxiduje na fosfát aromatickou peroxy karboxy lovou kyselinou, jako je například kyselina peroxyftalová, m-chlorperbenzoová nebo nitroperoxybenzoová. Fosforová skupina Y (obecný vzorec V) se uvolňuje katalytickou hydrogenací v přítomnosti vzácného kovu, jako je palladium na uhlí.

11. Fosfory láce homoserinového derivátu se provádí difenylfosforylhalogenidem v přítomnosti pyridinu a Ν,Ν-dialkylaminopyridinu (Helv. Chim. Acta 58, str. 518, 1975) po zablokování

-6CZ 302062 B6 funkční aminoskupiny terc.-butoxykarbonylovou skupinou za použití terč-b uty Ipyrokarbonátu v alkalickém prostředí a blokováním karboxylové funkční skupiny po vytvoření cesiové soli a benzylaci benzy lhalogenidem v dimethylformamidu nebo di methy lacetam idu.

12. Acylace atomu dusíku homoserinového derivátu se provádí tak, že se odstraní chránící skupina z funkční aminoskupiny trifluoroctovou kyselinou za získání trifluoroctové soli aminu a reakcí se směsným anhydridem, který se získá reakcí karboxylové kyseliny R_tOH a alky Ich lorformátu v přítomnosti reaktivního aminu například N-methyl morfo linu.

Vynález se dále týká meziproduktů shora uvedených obecného vzorce II a obecného vzorce III buď ve formě čistého enanciomeru nebo směsi stereoizomerú.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících jako účinnou látku nejméně jednu sloučeninu obecného vzorce I v neutrální nebo nabité formě, spolu s přísadou netoxického farmaceuticky přijatelného inertního excipientů nebo nosiče. Zvláště se vynález týká farmaceutických prostředků obsahujících jako účinnou látku alespoň jednu sůl sloučeniny obecného vzorce I, spolu s organickou nebo minerální zásadou, určených k terapeutickému účelu.

Vynález se týká také farmaceutických prostředků obsahujících sloučeninu obecného vzorce I ve formě čistého enantiomerů nebo ve formě směsi stereoizomerú, v kombinaci nebo v příměsi farmaceutického excipientů nebo nosiče.

Jako farmaceutické prostředky přicházejí v úvahu prostředky vhodné pro mukozní, transkutánní, topické, parenterální, digestivní nebo inhalační podání, jako jsou povlečené nebo nepovlečené tablety, kapsle, injekční roztoky nebo suspenze, spreje, gely, náplasti nebo roztoky k rychlé absorpci.

Především se sloučeniny podle vynálezu, popřípadě neutralizované aminem nebo hydroxyalkylaminem, podávají injektováním vodných roztoků nebo suspenzí.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se používají jako nosiče molekul terapeutického významu pro svou schopnost vytvářet nekovalentní asociační komplexy hydrofilní nebo hydrofobní povahy. Jejich charakter umožňuje vytváření a transport molekul terapeutického významu na membránové receptory jakož také na buněčné stěny a cytoplasmus. Mohou se používat samotné nebo spolu s molekulami terapeutického významu pro podání cestou orální, parenterální, rektální, topickou, transkutánní nebo mukosální. Mohou se používat samotné nebo spolu s molekulami terapeutického významu pro dočasnou ex-vivo inkubaci s krevními buňkami pro konkurenční imunitu takových buněk před reinjekcí buněk in-vivo parenterální cestou.

Molekuly MP a DP mají podobné vlastnosti při použití jako adjuvantu imunního systému, například při vakcinaci ve spojení se vhodnými antigeny, proti virovým, parasitickým, mikrobiálním nebo houbovým nemocem. Naproti tomu mají však sloučeniny podle vynálezu zásadně odlišné vlastnosti se zřetelem na schopnost navozovat produkci cytokinů nebo zrání imunitě konkurujících kmenů buněk pocházejících z hematopoeitických a lymfoidních orgánů.

Sloučenina MP usnadňuje zrání a diferenciaci monocytů na funkční dendritické buňky v přítomnosti nebo v nepřítomnosti vhodného antigenu a tak přispívá k silné humorální a celulámí imunitě. Sloučeniny DP působí jako protinádorová činidla.

Sloučeniny podle vynálezu jsou významné zvláště pro svoji nízkou toxicitu. Používají se v terapii lidí a zvířat jako jednotkové dávky l až 100 mg účinné látky a v denních dávkách 1 až 300 mg účinné látky.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Vynález objasňují také schémata 1 až 6 a obr. 33 až 38.

CZ 302062 Β6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Indukování proliferace buněk kmene kostní dřeně

Na ose x je koncentrace v μΜ, na ose y je OD v AU při 490 nm-AU 490 nm platí pro LPSE coli -Δ- platí pro OM-294-DP

-A- platí pro OM-294-MP

- · - · platí pro slepou zkoušku

Obr. 2 Indukce produkce NO v myších makrofágových buňkách Na ose x je koncentrace v μΜ, na ose y je nitrit (μΜ) platí pro LPSE coli -Δ- platí pro OM-294-DP

-A- platí pro OM-294-MP

Obr. 3 Indukce konjugátu dextran-FITC. Na ose x jsou stimuly media, LPS, OM—294—MP, OM-294-DP

Na ose y je absorpce konjugátu dextran-FITC (%)

Obr. 4 Absence konjugátu Dextran-FITC: Na dávce závislý efekt při nízkých koncentracích. Na dávce závislá odezva vůči LPS & OM-294-MP na absorpci dextranu.

Na ose x je koncentrace v μΜ, na ose y je inhibice v %.

—n— platí pro LPS ··- platí pro OM-294-MP

Obr. 5 Účinek závislý na dávce vyjádřený absorpcí konjugátu dextran-FITC při vysokých koncentracích.

Procento inhibice absorpce konjugátu FITC-dextran Na ose x je pg/ml, na ose y je % inhibice.

-□- platí pro LPS platí pro OM-294-MP

Obr. 6 Exprese CD40 společně stimulujícího povrchového markéru

Na ose x jsou stimuly media, LPS, OM-294—MP, OM-294—DP na ose y je střední fluorescence (%).

* p<0,0005 § P<0,001

Obr. 7 Exprese CD86 společně stimulujícího povrchového markéru

Na ose x jsou stimuly media, LPS, OM-294—MP, OM—294—DP na ose y je střední fluorescence (%).

* p<0,0005 § p<0,05

Obr. 8 Exprese CD83 společně stimulujícího povrchového markéru

Na ose x jsou stimuly media, LPS, OM-294—MP, OM-294-DP na ose y je střední fluorescence (%).

* p<0,0005 § p<0,01

Obr. 9 Exprese CD80 společně stimulujícího povrchového markéru

-8CZ 302062 B6 * p<0,0005 § P<0,5

Obr. 10 Účinek produktů OM-294-MP a OM-294-DP na produkci α-TNF predendritickými buňkami ve stupni DC-6. Na ose xje čas v hodinách, na ose y je α-TNF (pg/ml)

-0— platí pro prostředí

-Δ- platí pro LPS platí pro OM-294-DP

-+- platí pro OM-294-MP

Obr. 11

Účinek produktů OM-294—MP a OM—294—DP na produkci IL—12 p70 predendritickými buňkami ve stupni DC-6. (IFN=gamaIFN).

IL—12 p70 v supematantech dendritických buněk (DC-6)

Na ose xje doba inkubace v hodinách, na ose y je IL-12p70 (pg/ml).

-o-	platí pro prostředí
-·-	platí pro LPS
	platí pro LPS+IFN
-x-	platí pro OM-294—MP
	platí pro OM-294-MP + IFN

Obr. 12 Účinek produktů OM-294-MP na produkci lL-12p70 monocyty (IFN=gamaIFN). IL—12 p70 v supematantech monocytů

Na ose xje doba inkubace v hodinách, na ose y je IL-12p7O (pg/ml).

-o- platí pro prostředí

-·- platí pro LPS

-□- platí pro LPS+IFN

-x- platí pro OM-294—MP . .a. . platí pro OM-294—MP + IFN

Obr. 13 ELIS A 2 po prvním imunizaěním ošetření.

Zkouška na protilátky specificky zaměřené na PbCS His₆-242-3I0, 3 týdny po první injekci (ELISA ě. 2).

Na ose xje ředění séra, na ose y absorbance při 405 nm.

-A- platí pro PbCS 242-310,6 His —Δ— platí IFA/Pb CS 242-310,6 His

-- platí pro OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His

-0- platí pro OM-294-DP/Pb CS 242-310,6 His

-x- platí pro OM-294-MP platí pro OM-294-DP

Obr. 14 ELISA 3 po druhém imunizaěním ošetření.

Zkouška na protilátky specificky zaměřené na PbCS His₆-242-310, 4 týdny po druhé injekci (ELISA ě. 3).

Na ose xje ředění séra, na ose y absorbance při 405 nm.

-A- platí pro PbCS 242-310,6 His

-Δ- platí IFA/Pb CS 242-310,6 His

-4- platí pro OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His

-0- platí pro OM-294-DP/Pb CS 242-310,6 His

-x- platí pro OM-294-MP

..+.. platí pro OM-294-DP

Obr. 15 ELISA 4 po třetím imunizaěním ošetření.

Zkouška na protilátky specificky zaměřené na PbCS His₆-242-310, 2 týdny po třetí injekci (ELISA ě, 4).

Na ose x je ředění séra, na ose y absorbance pri 405 nm.

-9CZ 302062 B6

Na ose x je ředění séra, na ose y absorbance při 405 nm. -A- platí pro Pb CS 242-310,6 His -Δ- platí IFA/Pb CS 242-310,6 His 4- platí pro OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His

0- platí pro OM-294-DP/Pb CS 242-310,6 H is x- platí pro OM-294-MP .+.. platí pro OM-294-DP

Obr. 16 Protilátkový titr před a po jednom, dvou a třech imunizačních ošetřeních. Změna titru ío protilátek specificky zaměřených na PbCS HÍs₆242-310, po 1., 2. a 3. injekci.

Na ose x je ELISA č., na ose y je reciproká hodnota proti látkového titru.

Na ose x je ředění séra, na ose y absorbance při 405 nm.

-A-	platí pro Pb CS 242-310,6 His
-Δ-	platí IFA/PbCS 242-310,6 His
	platí pro OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His
-Φ-	platí pro OM-294-DP/Pb CS 242-310,6 His
-x-	platí pro OM-294-MP
	platí pro OM-294-DP

Obr. 17 ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty tříslových mízních uzlin stimulovaných PbCS 245-252 jeden týden po druhém imunizačním ošetření.

ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty tříslových mízních uzlin jeden týden po druhém imunizačním ošetření.

Na ose x jsou stimulátory na ose y je počet specifických lymfocytů na milion buněk 2? (prázdný obdélník -adjuvant samotný, plný obdélník - adjuvant + antigen)

Obr. 18 ELISPOT gamalFN produkující lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS 245-252 jeden týden po druhém imunizačním ošetření.

ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty sleziny jeden týden po druhé imunizaci 3o Na ose x jsou stimulovány na ose y je počet specifických lymfocytů na milion buněk (prázdný obdélník -adjuvant samotný, plný obdélník -adjuvant + antigen)

Obr. 19 ELISPOTgamalFN produkující lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS 245 až 252 jeden týden po druhém imunizačním ošetření.

ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty tříslových mízních uzlin jeden týden po třetí imunizaci

Na ose x jsou stimulátory na ose y je počet specifických lymfocytů na milion buněk (prázdný obdélník -adjuvant samotný, plný obdélník -adjuvant + antigen)

Obr. 20 ELISPOTgamalFN produkující lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS 245-252 tři týdny po třetím imunizaci.

ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty sleziny jeden týden po třetí imunizaci Na ose x jsou stimulátory na ose y je počet specifických lymfocytů na milion buněk (prázdný obdélník -adjuvant samotný, plný obdélník - adjuvant + antigen)

Obr. 21 Elektroforetogram samotného OM-294-DP, samotného antigenu PbCS His₆-242-310 samotného a komplexu PbCSHis₆-242-310-, OM-294-DP.

Na ose x je čas (min), na ose y je abs. [AU]

Obr. 22 Specifické protilátky IgGl zaměřené na HINI

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník —IgG 1 14 dní, plný obdélník - IgGl 28 dní, **p<se zřetelem na B)

Obr. 23 Specifické protilátky IgG2 zaměřené na Η IN 1

- 10CZ 302062 B6

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgG2 14 dní, plný obdélník - IgG2 28 dní, ** p<se zřetelem na B)

Obr. 24 Specifické protilátky IgM zaměřené na Η IN 1

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgM 14 dní, plný obdélník - IgM dní, * <0,05 ** p<se zřetelem na B) io Obr. 25 Specifické protilátky IgGl zaměřené na ovalbumin

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgGl 14 dní, plný obdélník - IgGl 28 dní, ** p<se zřetelem na B)

Obr. 26 Specifické protilátky IgG2 zaměřené na ovalbumin

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgG2 14 dní, plný obdélník - IgG2 28 dní, * <0,05 ** p<se zřetelem na B)

Obr. 27 Specifické protilátky IgM zaměřené na ovalbumin

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgM 14 dní, plný obdélník - IgM 28 dní

Obr. 28 Specifické protilátky IgGl zaměřené na TT 25 Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgGl 14 dní, plný obdélník - IgGl 28 dní, ** p<se zřetelem na B)

Obr. 29 Specifické protilátky IgG2a zaměřené na TT 30 Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgG2 14 dní, plný obdélník - IgGl 28 dní, ** p<se zřetelem na B)

Obr, 30(a) Nárůst imunitní odezvy anti-gp63 vlivem adjuvantu OM-294-MP: porovnání s BCG. 35 Na ose x je gp63 pg/ml, na ose y je absorbance ³H-TdR (cpmxl0~³)gp63 pg/ml —o— platí pro bez adjuvantu

-·- platí pro OM-294-MP

-- platí pro BCG

Obr. 30(b) Gama IFN a IL-4 bez adjuvantu, s adjuvantem OM-294-MP a porovnání s BCG.

Na ose x je gp63 pg/ml, na ose y jsou cytokiny pg/ml

Obr. 31 (a) Odezva in vitro lymfocytů mízních uzlin odvozená od myší předběžně imunizovaných in vivo antigenem LmCPb:

Vliv adjuvantu OM-294-MP.

Na ose x je Lm CPb (pg/ml), na ose y je pohlcení ³H-TdR (cpmxlO^-3)

-- platí neimunizované

-o- platí pro bez adjuvantu

-·- platí pro OM-294-MP

Obr. 3 l(b) Gama IFN a IL—4, neimunizováno, bez adjuvantu, s adjuvantem OM-294—MP Na ose x je Lm CPb pg/ml, na ose y jsou cytokiny pg/ml

Obr. 32(a) Nárůst imunitní odezvy anti-LmCPb vlivem adjuvantu OM-294-MP: porovnání s BCG.

- ii CZ 302062 B6

Na ose x je LmCPb gg/ml, na ose y je absorbance ³H~TdR (cpmxlO ³)

-o- platí pro bez adjuvantu

-·- platí pro OM-294-MP platí pro BCG

Obr. 32(b) Gama 1FN a 1L-4, bez adjuvantu, s adjuvantem OM-294—MP a porovnání s BCG. Na ose x je LmCPb gg/ml, na ose y jsou cytokiny pg/ml

Obr. 33 Schéma syntézy 1

Obr. 34 Schéma syntézy 2

Obr. 35 Schéma syntézy 3

Obr. 36 Schéma syntézy 4

Obr. 37 Schéma syntézy 5

Obr. 38 Schéma syntézy 6

Obr. 39 Spektrum 1. D i fosfory I ováná sloučenina. Spektra ES-MS (kladný druh) Zařízení: Micromass Quatro 11 (Z-sprej)

Obr. 40 Spektrum 2. Monofosforylovaná sloučenina. Spektra ES-MS (kladný druh) 25 Zařízení: Micromass Quatro 11 (Z-sprej)

Obr. 41 Spektrum 3. Difosforylovaná sloučenina. Spektra ES-MS (fragmentace kladného druhu)

Zařízení: Hewlett-Packard MSD

Obr. 42 Spektrum 4. Monofosforylovaná sloučenina. Spektrum 'H-NMR. Rozpouštědlo: CDCI3 + 0,1% triethano lamin Zařízení: Varian Unity INOVA 500 MHz

Obr. 43 Spektrum 5. Monofosforylovaná sloučenina. Spektrum ¹ H-NMR. Rozpouštědlo: (objemově 3:1) CDCI3 + CD3OD Zařízení: Varian Unity INOVA 500 MHz

Obr. 44 Spektrum 6. Monofosforylovaná sloučenina. Spektrum ‘‘C-NMR. Rozpouštědlo:

CDCI 3

Zařízení: Bruker DPX 250 MHz

Obr. 45 Spektrum 7. Difosforylovaná sloučenina. Spektrum ¹³C-NMR. Rozpouštědlo: CDCI3 Zařízení: Bruker DPX 250 MHz

Obr. 46 Spektrum 8. Monofosforylovaná sloučenina. Spektrum ^3IP-NMR. Rozpouštědlo: CDCI3

Zařízení: Bruker DPX 250 MHz

Obr. 47 Spektrum 9. Difosforylovaná sloučenina. Spektrum ³¹P-NMR. Rozpouštědlo: CDCI3 Zařízení: Bruker DPX 250 MHz

V příkladech se používají následující zkratky: 55 IBCF isobutylchlorformát

- 12CZ 302062 B6

IDQ l-isobutyloxy-2-isobuty loxy karbony 1-1,2-dihydrochinolin

LPS liposacharid

TBAP tetrabutylamoniumfosfát

TEoA triethanolamin

Příklady provedeni vynálezu to Příklad 1

4-<Difeny lo xyfosfory loxy >-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoy lam i no] butanová kyselina

1. N α-T erc-buty loxykarbony 1-D L-homoserin

Rozpustí se 2 g homoserinu (16,78 mmol) ve 20 ml vody a do roztoku se přidá 16,78 ml ÍM roztoku hydroxidu sodného a 3,006 g uhličitanu česného (9,23 mmol). Míchá se po dob upěti minut a roztok se ochladí na lázni ledu a vody. Přidá se 60 ml dioxanu a terc-butylpyrokarbonátu. Reakční směs se udržuje za míchání na lázni ledové vody po dobu jedné hodiny a pak na teplotě místnosti po dobu pěti hodin. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Suchý zbytek se použije přímo v následujícím stupni.

2. Na-Terc.-butyloxykarbonylbenzyl-DL-homoserinát

Do zbytku ze stupně 1 se přidá 20 ml dimethylformamidu a rozpouštědlo se odpaří k suchu a do reakční směsí se přidá 60 ml dimethylformamidu a 4,5 ml benzylbromidu (20,13 mmol). Vznikne bílá sraženina. Směs se míchá 16 hodin. Rozpouštědlo se odežene ve vakuu. Zbytek se zkoncentruje nebo extrahuje se dvakrát 20 ml ethylacetátu. Organická vrstva se promyje postupně vodou (20 ml) a solankou (20 ml) a vysuší se bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se použije v následujícím stupni.

3. Benzy Ι-Να-terc -butyl oxykarbonyl-O-(di feny loxy fosfory l)-DL-homoserinát

Zbytek z předchozího stupně se vysuší ve vysokém vakuu a rozpustí se v methylenchloridu (60 ml). Do roztoku se přidá 4,11 g 4—dimethylaminopyrídinu (33,56 mmol) a reakční směs se míchá 10 minut, načež se přidá 12 ml pyridinu a 6,95 ml chlorfosfátu (33,56 mmol). Roztok se míchá pri teplotě místnosti 18 hodin, promyje se IN kyselinou chlorovodíkovou (5x20 ml), vodou (30 ml) a solankou (30 ml). Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odežene ve vakuu. Zbytek se čistí bleskovou chromatografíí (hexan/ethyl40 acetát = 4:1). Hlavní frakce se zkoncentruje k vy krystalování zbytku. Získá se 7,49 g fosforylovaného produktu (82,4% výtěžek). Teplota tání 63,5 až 64,0 °C.

4. Benzyl-0-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinát

Fosforylovaný produkt z předchozího stupně (7,88 g, 15,4 mmol) se rozpustí v 15 ml trifluoroctové kyseliny a roztok se udržuje za míchání 2,5 hodiny na teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odežene ve vakuu a zbytek se vyčistí bleskovou chromatografíí (methanol/dichlormethan = 10:1). Hlavní frakce se zkoncentruje a zbytek se nechá vykrystalovat pri teplotě místnosti. Získá se 7,17 g fosforylovaného produktu (výtěžek 88,9%). Produktu se použije v následujícím stupni bez dalšího zpracování.

5. Benzyl 2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-{difenyloxyfosforyloxy)butanoát

4,284 g (10,07 mmol) (R)-dodekanoyloxytetradekanové kyseliny připravené způsobem podle

Bull. Chem. Soc. Jpn. 60, str. 2205 až 2214 (1987) se rozpustí ve 30 ml tetrahydrofuranu a roztok

- 13CZ 302062 B6 se ochladí na teplotu -15 °C v ledové solankové lázni. Přidá se 1,108 ml (10,07 mmol) N-methylmorfolinu a 1,31 ml (10,07 mmol) isobutylchlorformátu. Vmíchání se pokračuje 30 minut. Do reakční směsi se přidá 5,724 g (10,07 mmol) benzyl-0-(difenyloxyfosforyl)-DLhomoserinátu ve směsi 30 ml tetrahydrofuranu a 5 ml triethylaminu. Míchání se přes noc při teplotě místnosti, rozpouštědlo se odžene ve vakuu a do zbytku se přidá 20 ml vody. Směs se extrahuje ethylacetátem (2x30 ml). Organické vrstvy se spojí, promyjí se postupně vodou (20 ml), solankou (20 ml) a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se čistí bleskovou chromatografií (hexan-ethylacetát 2:1, R_f = 0,29). Získá se 7,455 g produktu, (87,1 % výtěžek). Teplota tání 31,0 až 32,1 °C.

'H-NMR (CDCU, 250MHz), δ ppm: 7,4 - 7,1 (m, I5H), 6,90 (2d, IH, ³J=7,6 Hz, NH),

5.3- 5,1 (m, 3H), 4,7 (m, IH), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4-2,1 (m, 4H), 1,6 (m, 4H),

1.4- 1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H). ^|3C-NMR (CDCb, 63 MHz), δ ppm: 173,01, 171,08, 169,66, 150,18, (d, V₍,_C = 7J Hz), 135,01, 129,60, 128,33, 128,14, 127,96, 125,21, 119,80 (d, ³Jp,c = 5,0 Hz), 70,69, 67,05, 65,19 (d, ²J_P,_C = 5,6 Hz), 49,13, 40,97, 40,77 (2 diast.), 34,20,

33,98, 33,82, 31,70, 29,42,29,34,29,14, 28,94, 25,01, 24,47, 13,91.

6. 4-(Difenyloxyfosforyloxy)~2~[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]butanová kyselina

Připraví se roztok benzylesteru získaného ve stupni 5 (2,23 g, 2,6 mmol) ve 300 ml methanolu čistoty HPLC ve tříhrdlé baňky a přidá se 10 g 10% palladia na uhlí. Vzduch se z baňky odsaje ve vakuu a baňka se naplní vodíkem za tlaku okolí. Reakční směs se míchá jednu hodinu při teplotě místnosti, katalyzátor se rychle odfiltruje na membráně a filtrát se zkoncentruje, čímž se získá bezbarvá kapalina. Tento produkt je homogenní podle chromatografie v tenké vrstvě a NMR a použije se bez dalšího čištění v kopu lačním stupni. RF=0,75 (dichlormethan/methanol/triethylamin 10:1:0,5). *RMN (CDCb) 250 MHz), δ ppm: 7,4-7,1 (m, 10H), 6,85 (2d, IH, NH), 5,15 (m, IH), 4,6 (m, 1H),4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4 - 2,15 (m, 4H), l,6(m,4H), 1,4-1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H). ⁿC-NMR (CDCb, 63 MHz), δ ppm: 173,35, 171,30 (2 diast.), 172,75, 170,37, 150,0 (d, ²JPiC = 7,5 Hz), 129,55, 125,28, 119,71 (d, ³JP,c = 4,4 Hz), 70,78, 65,65, (d, ²J_PC = 5,9 Hz), 49,00, 40,77, 40,63 (2 diast.), 34,13, 33,86, 33,76, 31,59, 29,31, 29,25, 29,03,

28,82,24,88, 24,68, 22,36, 13,76.

4-(Difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)“3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]butanová kyselina se může připravit podle stejného reakčního schéma náhradou v 5. stupni příkladu 1 (R)-3-dodeka35 noyloxytetradekanové kyseliny kyselinou (R)-3-benzyloxytetradekanovou.

Příklad 2 (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l~ol

1. Sůl D-omithinu s mědí

Do roztoku D-omithinu (5,25 g, 30 mmol) ve 30 ml ÍM roztoku hydroxidu sodného, se přidá 45 50 ml roztoku pentahydrátu síranu měďnatého (3,814 g, 15,3 mmol) ve vodě. Vmíchání se pokračuje dvě hodiny. Reakční směs se odpaří k suchu. Přidá se 60 ml methanolu, čímž vznikne rudě zbarvená pevná látka, která se oddělí a promyje se postupně dioxanem a methanolem.

2. (2R)-5-Amino-5-benzyloxykarbonylamino)pentanoát mědi

Rudě zbarvená pevná látka se rozpustí ve 40 ml 1M sodného louhu a 70 ml dioxanu, roztok se ochladí na ledové lázni a přidá se 5,14 ml (36 mmol) benzylchlorformátu. V míchání se pokračuje tri hodiny na ledové lázni a pak 15 hodin pri teplotě místnosti. Rudě zbarvená sraženina se shromáždí a promyje se 95% ethanolem (40 ml), vodou (50 ml) a ethanolem (60 ml). Sraženina

- 14CZ 302062 B6 se vysuší v pícce (T do 45 °C, ve vakuu). Dvoustupňovým procesem se získá 8,27 g produktu (93% výtěžek).

3. (2R}_5-(Benzyloxykarbonylamino)-2-(terc-butyloxykarbonylamino)pentanová kyselina

Sůl mědi, získaná ve stupni 2, se rozpustí ve 2M chlorovodíkové kyselině (400 ml) a přidá se ethylendiamintetraoctová kyseliny (8,15 g, 27,8 mmol). Směs se míchá 2,5 hodiny a neutralizuje se přidáním sodného louhu (přibližně 160 ml) do hodnoty pH 7. Vytvoří se bílá sraženina. Směs se míchá 2,5 hodiny na ledové lázni. Sraženina se odfiltruje, promývá se studenou vodou až do získání bezbarvého odtoku, vysuší se v pícce při teplotě 60 °C. Pevná látka se rozpustí ve 156 ml IM roztoku hydroxidu sodného a roztok se ochladí na ledové lázni. Do roztoku se přidá 7,7 g (35,2 mmol) terc.-butylpyrokarbonátu v dioxanu (160 ml). Směs se míchá 45 minut při teplotě 0 °C a 16 hodin při teplotě místnosti. Organické rozpouštědlo se odpaří a do zbytku se přidá 70 ml ethylacetátu. Vodná vrstva se okyselí 2N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH přibližně 3. Vodná vrstva se opět extrahuje 100 ml ethylacetátu. Organické vrstvy se spojí a promyjí se vodou (30 ml) a solankou (30 ml). Rozpouštědlo se odežene ve vakuu a vzniklý bezbarvý olej se čistí bleskovou chromatografií (získá se 8,42 g produktu ve dvou stupních (76,7% výtěžek). Rf = 0,19, dichlorethan-methanol 20:1).

4. (2R)-5-(BenzyIoxykarbonylamino)-2-(terc-butyloxykarbonylamino)pentan-l-ol

Do studeného roztoku (-15 °C) derivátu diaminopentanové kyseliny získané ve stupni 3 (5,45 g, 14,8 mmol) v 60 ml tetrahydrofuranu se přidá 1,654 mi (14,8 mmol) N-methylmorfolinu a 9,6 ml (14,8 mmol) isobutylchlorformátu (IBCF). Roztok se míchá při teplotě -15 °C 1 minutu a přidá se borhydrid sodný (5,104 g, 44,6 mmol) v 10 ml vody. V míchání se pokračuje po dobu dalších 10 minut, načež se přidá 400 ml vody k ukončení reakce. Roztok se extrahuje ethylacetátem (100 ml 2x). Organické vrstvy se spojí, promyjí se postupně vodou (50 ml), solankou (60 ml) a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odstraní a zbytek se překrystaluje ze směsi ethylacetátu. Získá se 4,95 g produktu (94,9% výtěžek) o teplotě tání 47,5 až 48 °C.

5. Odstranění chránící skupiny z derivátu 2,5-diaminopentan-l-oIu

Rozpustí se 6,32 g (18 mmol) (2R)-5-(benzyloxykarbonyIamino)-2-(terc-butyloxykarbonylamino)pentan-l-olu, získaného ve stupni 4, v 25 ml trifluoroctové kyseliny a směs se míchá 2,5 hodiny při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se čistí bleskovou chromatografií (methanol/dichlormethan 10:1). Získá se bezbarvý sklovitý produkt tající při teplotě místnosti. Získá se 5,45 g produktu v podobě soli trifluoroctové kyseliny (výtěžek 82,7%). Hydroch loridová sloučenina má teplotu tání 133,0 až 134,3 °C (překrystalizace z methanolu).

6. (2R)-5-(Benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyJoxytetradekanoylamino]pentan-l-ol

Do roztoku předem vychlazeného na teplotu -15 °C 5,27 g (15,8 mmol) (R)-3-benzyloxytetradekanové kyseliny (Bull. Chem. Soc. Jpn., str. 2197 až 2204, 1987) ve 30 ml tetrahydrofuranu se přidá 1,89 ml (15,8 mmol) N-methylmorfolinu a 2,21 ml IBCF (15,8 mmol). Reakční směs se udržuje za míchání 30 minut na teplotě -15 °C. Do roztoku se přidá 5,25 g soli trifluoroctové kyseliny podle odstavce 5 (14,4mmol) ve 30 ml tetrahydrofuranu a 1,44 ml triethylaminu. V míchání se pokračuje při teplotě místnosti 16 hodin, načež se přidá 30 ml vody a 60 ml ethyl· acetátu. Organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se znovu extrahuje ethylacetátem (60 ml). Organické vrstvy se spojí, promyjí se postupně vodou (30 ml), solankou (30 ml) a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se překrystaluje ze směsi acetát/hexan. Získá se 5,842 g produktu (výtěžek 71,2%). Teplota tání = 117,5 až 118 °C. Rf = 0,32, ethylacetát-petrolether3:l. 'H-NMR (CDC1₃, 250 MHz) δ ppm: 7,4 - 7,2 (m, 10H), 6,5 (2d, IH, N//)> 5,1 (s, 2H), 4,9 (m, IH, ΝΉ), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,8 (m,2H), 3,5 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 1,6-1,4 (m, 6H), 1,4- 1,2

- 15 CZ 302062 B6 (m, I8H), 0,9 (t, 3H). ^I3C-NMR (CDCb, 63 MHz), δ ppm: 172,24, 156,49, 138,06, 136,53, 128,46, 128,04, 127,87, 76,76, 71,39, 66,60, 65,44, 51,54, 41,43, 40,65, 33,76, 31,87, 29,61, 29,30, 28,01,26,47, 25,05, 22,65, 14,09.

7. (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylammo]pentan-l-ol

Do tříhrdlé baňky se vnese 150 mg 20% palladia na uhlí do roztoku (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylaminojpentan-l-olu (3,0 g, 5,27 mmol) a 6 ml triethylaminu ve 300 ml ethanolu čistoty HPLC. Vzduch se z baňky vypudí pri jejím plnění io vodíkem. Reakční směs se míchá dvě hodiny při teplotě místnosti, katalyzátor se odfiltruje přes membránu a filtrát se zkoncentruje, čímž se získá homogenní bílá pevná hmota podle chromatografíe TLC a použije se v následujícím stupni bez dalšího čištění. Rf - 0,2, dichlormethanmethanol/triethylamin 5:10:5, teplota tání 47 až 48 °C.

'H-NMR (CDCb, 250 MHz), δ ppm: 7,4 - 7,2 (m, 5H), 6,75 (d, 1 Η, N/Y), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,9 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 2,3-2,6 (m, 7H), 1,7-1,2 (m, 24H), 0,9 (t, 3H). ¹³C-NMR (CDCb, 63 MHz), δ ppm: 171,86, 138,13, 128,37, 127,87, 127,75, 76,81, 71,50, 64,57, 51,38, 41,51, 41,17, 33,89, 31,82, 29,26, 28,57, 28,03, 25,07, 22,60, 14,04.

(2R)-5-Amino-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]pentan-l-ol lze získat stejným postupem nahrazením (R)-3-benzy loxytetradekanové kyseliny ve stupni 6 příkladu 2 (R)-3-dodekanoyloxytetradekanovou kyselinou.

Příklad 3

3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekan-l, 10-diol-l -dihydrogenfosfát jo 1. Peptidová kopulace

V roztoku (2 RS)-4-(d i feny loxy fosfory loxy )-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoy lamino] butanové kyseliny (1,0 mmol), získané podle příkladu 1, rozpuštěné ve 20 ml methylenchloridu, se suspenduje 363,6 mg (1,2 mmol) l-isobutyloxy-2-Ísobutyloxy-karbonyl-l,2-dihydrochinolinu (IDQ). Míchá se po dobu 15 minut, přidá se 1,0 mmol (2R)-5-amino-2-[(R)-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-olu podle příkladu 2, rozpuštěného v 10 ml methylenchloridu a reakční směs se míchá čtyři hodiny.

Roztok se zkoncentruje a zbytek se čistí bleskovou chromatografií (dichlormethan/aceton =5:2, 40 Rf0,23). Rozpouštědlo se odstraní, čímž se získá 0,620 g bezbarvé husté kapaliny (výtěžek

52,7%), kterou je fosforylovaná sloučenina podobná dipeptidu. Rf=0,49 díchlormethan/methanol/triethy lamin 10:1:0,5.

'H-NMR (CDCb, 250 MHz), δ ppm: 7,40 - 7,15 (m, 15), 7,00 (m, IH), 6,90 a 6,80 (2d, 2 diast IH), 6,65 (d, IH) (3 x NH), 5,15 (m, IH), 4,50 (m, 3H), 4,30 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,4í (m,2H), 3,15 (m, 2H), 2,41-2,14 (m, 8H), 1,6-1,4 (m, 8H), 1,4 - 1,1 (m, 54H), 0,9 (t, 9H 3CH₃). ¹³C-NMR (CDCb, 63 MHz), δ ppm: 173,11, 171,68, 170,52, (2 diast.), 169,94 (2 diast) 150,0 (d, Jpc = 7,2 Hz), 138,0 (2 diast.), 129,58, 127,99, 127,49, 127,26, 125,24, 119,7(t, Jpc = 5,0 Hz), 76,48, 71,12, 70,71, 65,86 (broad spin), 64,22, 50,96, 49,71 (broad spin), 41,46 41,05, 39,07, 34,13, 34,00, 32,70, 31,61, 29,34, 29,06, 28,87, 27,98, 25,25, 24,92, 24,72, 22,38 13,80.

2. l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]^4-oxo~5-aza9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekan-10-ol

- 16CZ 302062 B6

Roztok fosforylované sloučeniny podobné dipeptidu (488 mg, 0,42 mmol) shora získané a kyseliny octové (1,9 ml) v 65 ml ethanolu Čistoty HPLC se zavede do tříhrdlé kulaté baňky a přidá se 200 mg 10% palladia na uhlí. Vzduch se vytěsní ve vakuu a baňka se naplní vodíkem. Reakční směs se míchá dvě hodiny při teplotě místnosti, načež se katalyzátor odfiltruje membrá5 novou filtrací a rozpouštědlo se odežene ve vakuu, čímž se získá surový produkt (92% výtěžek). Vzorek produktu se čistí bleskovou chromatografií (dichlormethan/aceton 5:4, Rf - 0,24). Získá se sklovitá pevná látka. Rf - 0,68, 5:2 methylenchlorid/methanol. (^,3C-NMR (CDCb, 63 MHz) δ v ppm (objeví se několik signálů ve tvaru dubletu v důsledku přítomnosti diastereomerů):

io 173,60, 173,15, 170,67, 170,60, 170,27, 170,07, 150,24(d), 129,92, 125,66, 120,05, 119,90 (2d), 71,11, 71,05, 68,83; 66,21 (broad spin), 64,71, 51,38; 50,32, 50,12, 43,25, 43,12, 41,66, 41,57, 39,30, 37,26, 34,45, 32,84, 31,86, 29,62, 29,5, 29,29, 29,13, 28,08, 25,57, 25,19, 24,97, 22,62, 14,03.

is 3. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino-4-oxo-5-aza]-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoy laminojdekan-1,10-diol-1 -dihydrogenfosfát

V tříhrdlé kulaté baňce se předběžně 10 minut aktivuje oxid platiny (137 mg) vodíkem v absolutním ethanolu (5 ml). Přidá se roztok )-{difeny loxyfosfory loxy )-3-[(R)-3-dodekanoyl20 oxytetradekanoy lamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)_3-hydroxytetradekanoy laminojdekan-10—olu (411 mg, 0,38 mmol) v absolutním ethanolu (20 ml). Vzduch se vytěsní ve vysokém vakuu a baňka se naplní vodíkem. Reakční směs se míchá dvě až tři hodiny při teplotě místnosti, katalyzátor se odfiltruje membránovou filtrací a rozpouštědlo se odežene ve vakuu, čímž se získá surový produkt v podobě bílé pevné látky (98% výtěžek). R_f=0,50, chloroform/methanol/voda

6:4:0,6.

3-[( R)-3_Hydroxytetradekanoy lam i no-4-oxo-5_aza]-9-[(R)-3~dodekanoy loxytetradekanoy 1 amino]dekan-l, 10—diol 1-dihydrogenfosfát je možno získat stejným postupem (schéma 3, obr. 35) použitím 4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]butanové kyseliny a (2R)-5-amino-2-[(R)_3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]pentan-l-olu.

Nebo se 3-[(R)-3-dodekanoy loxy tetrade kanoyl am i no-4-oxo-5-aza]-9-[( R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekan-l,10-diol-I-dihydrogenfosfát získá z asparagové kyseliny následujícím způsobem (reakční schéma l, 5 a 6, obr. 33, 37 a 38): chráněním volné funkční hydroxylové skupiny (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamÍno]pentan-lolu benzyloxymethylovou skupinou, uvolněním funkční 5-aminoskupíny této sloučeniny hydrogenolýzou, uskutečněním peptidové vazby tohoto aminu s monoesterifikováným derivátem Dnebo L-asparagové kyseliny uchováním jeho funkční aminoskupiny bud’ chránící skupinou nebo skupinou (R)-3-dodekanoy loxy tet řade kanoyl o vou, uvolněním a redukcí koncové karboxylové funkční skupiny směsným anhydridem, popřípadě odstraněním chránící skupiny z funkční aminoskupiny odvozené od asparagové kyseliny, N-acylací derivátem (R)-3-dodekanoyloxytetradekanové kyseliny, fosforylací funkční hydroxyskupiny na C| a nakonec odblokováním fosfátové a hydroxylové funkční skupiny hydrogenolýzou.

Příklad 4

Příprava3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekan-l, 10—d iol—1,10-bis-(dÍhydrogen fosfátu) l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]~4-oxy-5-aza-9[(R)-3-benzyIoxytetradekanoylamino]-dekan-10-ol (985 mg, 0,84 mmol) se nechá reagovat 30 minut s dibenzyl-N,N -diethylfosforamiditem (0,58 ml, 85% čistoty) v přítomnosti [IH]— tetrazolu (182 mg) v tetrahydrofuranu (35 ml) pri teplotě místnosti. Fosfitový meziprodukt se oxiduje přísadou roztoku m-chlorperoxybenzoové kyseliny (535 mg) ve 25 ml methylenchloridu

- 17CZ 302062 B6 při teplotě 0 až -20 °C. Po 20 minutách se přidá roztok thiosíranu sodného (20 ml) k neutralizaci veškerého přebytečného oxidantu, načež se organická vrstva zředí etherem. Organická vrstva se oddělí, promyje se postupně vodným roztokem thiosíranu sodného (5x20 ml), roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2x20 ml), vodnou kyselinou chlorovodíkovou (20 ml), vysuší se síranem hořečnatým a zkoncentruje se. Surový produkt se čistí bleskovou chromatografií na silikagelu (dichlormethan/aceton = 10:3). Takto získaný chráněný difosforylovaný derivát (900 mg, 75% výtěžek) (Rf 0,64, 5:2 dichlormethan/aceton) se katalyticky hydrogenuje po dobu čtyř hodin v methanolu čistoty HPLC (1000 ml) v přítomnosti 10% palladia na uhlí (300 mg) za tlaku a teplotě okolí. Katalyzátor se odfiltruje membránovou filtrací a filtrát se zakončentruje za snížeio ného tlaku, čímž se získá surový 10-(d i hydroxy fosfory loxy)-] -(d i feny loxy fosfory loxy )-3-[(R)3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamíno]dekan (Rf = 0,63, chloroform/methanol/voda 6:4:0,6) s 89% výtěžkem. Tento produkt se podrobí katalytické hydrogenací na oxidu platiny (380 mg) v ethanolu čistoty HPLC (130 ml) 24 hodin při teplotě a tlaku místnosti. Katalyzátor se odfiltruje membránovou filtrací a filtrát se zkoncen15 truje, čímž se získá volná bisdihydrogenfosfátová sloučenina (Rf=0,20, chloroform/methanol/voda, 6:4:0,6).

3-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino3-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]dekan-l,10-diol-l,10-bis(dihydrogenfosfát) je možno získat tím, že se vychází ze

2o 4-(difeny loxyfosfory loxy )-2-[(R}-3-dodekanoyloxytetradekanolylamÍno]pentan-l-olu stejným postupem (schéma 3, obr. 35).

Nebo lze získat 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4~oxo-5-aza-9-[(R)-3hydroxytetradekanoylamino]dekan-l,10-diol-l,10-bis(dihydrogenfosfát) z asparagové kyseliny následujícím způsobem (reakční schéma 1, 4 a 6): uvolněním funkční 5-aminoskupiny (2R)-5-(benzy loxykarbony lamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l—olu hydrogenolýzou, převedením peptidové vazby tohoto aminu monoesterifikovaným derivátem D- nebo L-asparagové kyseliny, majícím na funkční aminoskupině buď chránící skupinu nebo (R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylovou skupinu, uvolněním a redukováním koncové karboxy30 lové funkční skupiny pomocí směsného anhydridu, případně odstraněním chránící skupiny z funkční aminosokupiny odvozené od asparagové kyseliny, pak N-acylací derivátem (R)-3-dodekanoyloxytetradekanové kyseliny, fosforylací hydroxylové funkční skupiny v C| a Cjo a nakonec odblokováním fosfátových a hydroxy lových funkčních skupin hydrogenolýzou.

Příklad 5

Čištění a analýza sloučenin podle vynálezu

1. Čištění monofosforylovaných a difosforylovaných sloučenin

Monofosforylované a d i fosfory lované syntetické produkty se rozpustí ve směsi vody a isopropanolu (objemově 1:1) s 0,1 % triethylaminu k nastavení hodnoty pH na 8 až 9. Postupně se přidá potřebné množství 2M hydrogenuhličitanu amonného k dosažení koncentrace 25 mM.

Čištění se provede preparativní reverzní fázovou chromatografií HPLC za následujících podmínek:

Sloupec: Bondapack Cl 8 Prep Pak. 40x200 mm, 15-20 pm, 30 nm Waters

Mobilní fáze:

A: isopropanol/voda (objemově l: 1), 50 mM hydrogenuhličitanu amonného

B: isopropanol/voda (objemově 2:8), 50 mM hydrogenuhličitanu amonného

- 18CZ 302062 B6

Průtočná rychlost: 40 ml/min

Eluce: isokratická adsorpce na sloupci: 40 % B (60 % A), 10 minut

Gradient A:B: 40 - 80 % B během 10 minut

Isokratická eluce: 80 % B, 30 minut

Promývání: 100 % B, 10 minut

Detekce: UV, 210 nm (vlnová délka)

Za uvedených elučních podmínek je retenční doba monofosforylované sloučeniny 25 až 30 minut, zatímco difosforylované sloučeniny 18 až 25 minut. Zjistí-li se přítomnost monofenylových produktů (neúplné zbavení chránící skupiny při defenylaci), je nutný jemnější stupeň čištění. Toto další čištění probíhá za následujících podmínek:

Sloupec: Kromasil Cl8,21x250 mm, 5 pm, 10 nm, Macherey-Nagel

Mobilní fáze:

A: isopropanol/voda (objemově 1:1), 50 mM hydrogenuhličitanu amonného

B: isopropanol/voda (objemově 2:8), 50 mM hydrogenuhličitanu amonného

Průtočná rychlost: 10 ml/min

Eluce: isokratická adsorpce na sloupci: 40 % B (60 % A), 10 minut

Isokratická eluce: monofosforylovaná sloučenina: 80 % B, 30 minut, difosforylovaná sloučenina: 74 % B, 30 minut

Promývání: 100 % B, 10 minut

Detekce: UV, 210 a 254 nm (vlnová délka)

Frakce obsahující monofosforylované a difosforylované sloučeniny ve formě amoniových solí se shromáždí a zkoncentrují se adsorpcí C 18 fází Bondapack, 15-20 pm, 30 nm, Waters. Sodná sůl monofosforylovaných a d i fosfory lovaných sloučenin se získá promytím roztokem 10 g/1 chloridu sodného ve směsi voda/isopropanol (objemově 9:1). Po odstranění přebytku chloridu sodného protečením 5 objemů směsi voda/isopropanol (objemově 9:1), se sloučenina eluuje čistým isopropanolem. Toto rozpouštědlo se odpaří k suchu na rotační odparce. Konečná rozpuštění se provede požadovaným množstvím vody (v případě monofosforylované sloučeniny s přísadou 0,1 triethanolaminu) k získání cílové koncentrace 2 mg/ml. Provede se sterilní filtrace filtrem 0,2 pm Express Membráně, Millipore (je-li objem menší než 50 ml, doporučuje se systém Sterifiip, je-li objem větší než 50 ml, doporučuje se systém Steritop).

Při zpracovávání monofosforylované sloučeniny je výhodné prozvučet roztok (3x10 sekund) při teplotě místnosti před sterilní filtrací.

2. Sledování a výtěžek čištění

Po ukončení každého stupně se frakce analyzují reverzní fázovou chromatografií HPLC za těchto podmínek:

- 19 CZ 302062 B6

Sloupec: Supelcosil Cl8, 3 pm, 4,6x150 mm, 10 nm, Supelco

Mobilní fáze:

A: voda/acetonitril (objemově 1:1), 5 mM TBAP B: voda/isopropanol (objemově 1:9), 5 mM TBAP io TBAP: tetrabutylamoniumfosfát Průtočná rychlost: 1 ml/min

Eluce: gradient A:B (75:25 -0:100) během 37,5 minuty

Detekce: UV, 210a 254 nm (vlnová délka).

Při takto provedené chromatografii jsou pozorované retenční doby monofosforylováných sloučenin 25,5 ± 0,5 minut a d i fosfory lo váných sloučenin je 20,8 ± 0,5 minut. V7těžek čištění monofosforylovaných sloučenin je 57 až 94% a d i fosfory lovaných sloučenin 71 až 92%. Získá se 311 mg monofosforylovaných sloučenin a 189 mg difosforylovaných sloučenin.

3. Zkouška a analýza stupně čistoty konečného produktu

Kvantitativní zkoušky a analýzy stupně čistoty produktů se provádějí pomocí HPLC/UV za shora popsaných provozních podmínek chromatografie. Podle těchto zkoušek jsou stupně čistoty získané u jednotlivých monofosforylovaných a difosforylovaných zkušebních vzorků 99 až 100%. K odhalení přítomnosti neaktivních nečistot v UV oblasti se provádějí analýzy LC/ESMS (pozitivní způsob elektrosprejové ionizace). K tomu se nahradí (5mM) tetrabutylamonium30 fosfátu (25 mM) acetátu amonného k vyhovění požadavkům ionizace na elektrosprejovém rozhraní.

Ke zkoušení konečných produktů se používá alternativních způsobů. Například kvantitativní analýzy celkových fosfátů (podle Ames Β. N., Methods in Enzymology VII, str. 115 až 117,

1966), aminokyselin (podle Hughes a kol. J. Chromatography 389, str. 327 až 333, 1987) a acylových řetězců (podle Miller L. T., Hewlett Packard Application Notě str. 228 až 237, 1984).

4. Spektrální analýza

4o 4.1 Hmotová spektrometrie

Vynesou se spektra ES-MS (negativní a pozitivní druhy) monofosforylovaných a difosforylovaných sloučenin za použití tří typů hmotových spektrometrů (Finnigan LCW, ion trap, Micromass Quattro II, tripletový stav quadrupol, Hewlett Packard MSD, singlet quadrupol). Jako doplněk se provádějí také analýzy MS/MS. Spektra dokládající identitu a čistotu uvedených produktů jsou v dodatku.

ES-MS spektra (pozitivní druh)

Difosforylovaná sloučenina:

(Micromass Quattro II: spektrum 1, HP-MSD: Spektrum 3) (obr. 39 & 41).

V oblasti nízkých energií lze pozorovat hlavní pseudomolekulámí ionty při poměru m/z 1014,6 [M+H]⁺. Sodné příměsi pri poměru m/z 1036,6 [M+Naf, 1058,6 [M+H+2Na]⁺ a pri 1080,5 [M+2H+3Na]⁺jsou také viditelné.

-20CZ 302062 B6

V závislosti na stupni fragmentace lze pozorovat dva 916,5 [M-98+H]⁺ a 818,6 [M-98-H]⁺fragmenty m/z, což dokládá přítomnost dvou fosforylových skupin na molekule. Jak je vyznačeno spektrem 3 (obr.41), kolísá relativní intenzita pozorovaných iontů v závislosti na použité úrovni energie.

Monofosforylovaná sloučenina:

(Micromass Quattro II: spektrum 2) (obr. 40)

Poněkud odlišný ionizační diagram se získá pro monofosfoiylovanou sloučeninu v důsledku přítomnosti triethanolaminu (TEoA) v analyzovaném roztoku. Hlavní pseudomolekutámí iont lze pozorovat při poměru m/z 934,4 [M+H]⁺, stejně jako adukty sodné 956,3 [M+H]⁺ a draselné [M+K]⁺ pri poměru m/z 1083,4 [M+TEA+H]⁺ a při poměru m/z 1105,3 [M+TeOH+Na]⁺ a při poměru m/z 1121,3 [M+TeOH+K]\ Přítomnost fosforylové skupiny uvnitř molekuly je patrná z fragmentu zjištěném při vysoké úrovni energie odpovídající poměru m/z 836,4 [M-98+H]⁺. Spektra ES-MS (negativní druh)

Iontové druhy pozorované v negativním druhu spekter ES-MS monofosfory lovaných sloučenin a difosforylovaných sloučenin dosti souhlasí s výsledky získanými v pozitivní formě.

Provádějí se také FAB ionizační analýzy (pozitivní forma). Pri nízké rozlišovací úrovni vykazují monofosforylované sloučeniny sodné adukty při poměru 956,5 [M+Na]⁺ a difosforylované sloučeniny pri poměru m/z 1036,5 [M+Na]⁺.

Při vysoké rozlišovací úrovni (3-nitrobenzyl alkoholová matrice) je pozorovaný vrchol pri poměru m/z 956,667 pro monofosfátovou sloučeninu odpovídající očekávanému molekulovému vzorci C^HegO) )N₃PNa (předpověděná hmotnost: 956,668 amu).

Pro di fosfory lovanou sloučeninu je zaznamenán vrchol při poměru m/z 1036,635, což odpovídá molekulovému vzorci C₄9H₉7Oi₄N₃P2Na (vypočtená hmotnost: 1036,634 amu).

Ze všech provedených analýz MS vyplývá vysoký stupeň čistoty získaných produktů.

4.2 nukleární magnetická resonance

Spektra *H-NMR a ^l3C-NMR monofosfory lovaných a difosfory lovaných sloučenin se zjišťují přístrojem DPX Brucker, pracujícím při frekvencích 250,13 a 62,89 MHz a systémem Varian Unity lnová pracujícím při frekvencích 500 až 499,87 a 125,7 MHz. Spektra ^3,P-RMN se zaznamenávají při 121,6 MHz (DPX Brucker). Spektra, dokládající identitu a čistotu těchto produktů jsou uvedena v dodatku.

Spektra ¹ H-NMR (spektra4 & 5) (obr. 42 & 43)

Monofosforylovaná sloučenina: Na spektrech zaznamenaných v CDC1₃ + OJ % triethanolaminu (TEoA) (spektrum A) jsou patrny signály odpovídající třem protonům pocházejícím od atomů dusíku N(5), N(2a) a N(2b) mezi 7 až 9,5 ppm (zvětšený pohled spektrálního okna). Signály připisované H-N(2a) H-N(2b) jsou patrny ve formě dvou dubletu, které dokládají přítomnost směsi stereoizomerů. Ukazuje se, že jeden diastereoizomer převládá (jako důsledek různých stupňů vyčištění).

Difosforylovaná sloučenina: Na spektrech zaznamenaných v CDC1₃-CD₃OD (objemově 3:1) (spektrum 5) nejsou již signály odpovídající H-N(5), H-N(2a a H-N(2b) patrné v důsledku výměny druhů v přítomnosti CD₃OD.

-21 CZ 302062 Β6

Dodatečné informace, týkající se významu různých signálů, se získají pokusy homonukleámí a heteronukleámí korelace ('H^H-NMR: COSY, ’H-ⁿC-NMR:HSQC & HMBC).

Spektra ^ISC-NMR (spektra 6 & 7) (obr. 44 & 45)

Zaznamenávání spekter ^r'C-NMR je neobyčejně obtížné pro dosti nízkou rozpustnost monofosforylovaných adifosforylovaných sloučenin.

Spektra ³¹P-NMR (spektra 8 & 9) (obr. 46 & 47)

Pro monofosforylované a difosforylované sloučeniny je patrný jediný vrchol.@LH 4

Příklad 6

Farmakologické studie sloučenin podle vynálezu

1. Stanovení endotoxicity Limulovým chromogenickým testem

Endotoxicita se zjišťuje chromogenovým Limuls Amoeobocyte Lysáte testem (Chromogenic LAL of Charles River Endosafe, šarže # EK412 E, Charleston, USA). Tento test se zakládá na aktivaci lipopolysacharidem (LPS) nebo strukturálně analogickými produkty enzymatické kaskády obsažené v LAL. Tato enzymatická aktivace se projevuje rozštěpením chromogenu vázaného na peptid za působení proteázy v konečném stádiu této enzymatické kaskády podle následujícího reakčního schéma:

LPS nebo PRODUKT i

LAL aktivace proteázy a hydrolýza peptid/chromogenové molekuly

I

Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-p-nitroanilin —► Ac-Ue-Glu-Ala-Arg+ p-nitroanilin (bezbarvý) zbarvený (405 nm)

Enzymatická reakce se provádí při teplotě 37 °C a časové vytváření chromogenu se měří při 405 nm. V konečném stavu této zkoušky stanovící časový průběh se zaznamenává doba potřebná k dosažení OD 0,2 jednotek a endotoxícká aktivita se vypočítává na základě standardu LPS (standardní křivky).

Výsledky jsou vyjádřeny v EU (endotox i nových jednotkách) ve vztahu k standardizované přípravě liposacharidů E.coli. Pro tyto soubory zkoušek odpovídá 1 EU 0,08 mg ekvivalentu LPS.

Výsledky ukazují poměrně vysoký stupeň variability, ačkoli to je normální u kvantitativních zkoušek takového druhu, které poskytují v zásadě náznak magnitudy. Testování LAL se provádí hlavně k důkazu nepřítomnosti pyrogenů (horní meze koncentrace endotoxinů) ve farmaceutických prostředích. Závazné je porovnat kvantitativní zkoušku obsahu pyrogenů s danými dobře standardizovanými jednotlivými sériemi pokusů.

-22CZ 302062 B6

Výsledky

Výsledky (průměr ± směrodatná odchylka) získané u produktů podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce (A)

Tabulka (A)

Aktivace limulus amoebocyt lysátu (LAL)

produkt, γ	Akt i vace LAL v EU/ ng	aktivita LAL v ekvivalentech ng e<i.LPS/»g
0M-294-LP	56 + 48	6, 2
OH-294-ttP	13 + 2	1.4
E.coli EPS	7,7 ± 1,6x10*	0,85 x 10*
< referenční)

Sloučeniny podle vynálezu jsou 10⁶krát méně aktivní než LPS v testu LAL. OM-294-DP a OM-294-MP jsou proto zajímavými produkty vzhledem ke své nízké toxicitě, ve spojení se svou schopností zprostředkovávat biologické aktivity a působí jako imunomodulátory (jak in vivo, tak in vitro).

2. Stanovení proliferace kmene buněk myší kostní dřeně v odezvě na stimulaci LPS nebo sloučenin podle vynálezu Způsob

Vdechováním oxidu uhličitého se usmrtí dva myší šest neděl staří samci C57/BL6 a následuje krční dislokace. Myši se promyjí alkoholem a kůže zadních končetin se úplně odstraní. Přerušením kloubů se vyjmou pánevní, stehenní a holenní kosti. Skalpelem se odstraní maso. Kostí se očistí a konce kostí se ustřihnou nůžkami. Kostní dřeň se extrahuje z dříků kostí trojnásobným injektováním modifikovaného prostředí Dulbeco Eagle (DH-medium) z vnějších částí odstřižených nůžkami. Buňky se suspendují v DH mediu a odstřeďují se 5 minut při 300 x g. Supematant se vyhodí a kmenové buňky se suspendují v DM mediu doplněném 20 % zárodečného telecího séra (FCS). Koncentrace buněk se upraví na 500 000 buněk/ml.

Sériově se zředí produkty předem rozpuštěné v DH mediu doplněném FCS, aminokyselinami a antibiotiky a vnesou se přímo do 96důlkových mikrotitrových destiček. Za použití součinitele 3,16 se připraví 9 zředění. Produkty se testují v sériích po šesti a každá mikrotitrová destička zahrnuje negativní kontrolu obsahující plné médium. Konečný objem v každém důlku je 100 μί. Mikrotitrové destičky se inkubují jednu hodinu v inkubátoru při teplotě 37 °C v prostředí s 8 % oxidu uhličitého při 100% relativní vlhkosti kpufrování media. Po jedné hodině se do produktu přidá 100 μΐ buněčné suspenze a v inkubaci se pokračuje sedm dní.

Proliferace se zjišťuje měřením oxidace chromogenového substrátu (XTT) v mitochondrii živých buněk.

-23CZ 302062 B6

Po sedmi dnech se mikrotitrové destičky odstředí 5 minut při 400 x g a 100 μΐ supematantní kapaliny se odsaje a vyhodí. Do každého důlku se přidá 50 μΐ 1 mg/ml XTT 3-[1-fenylaminokarbonyl)-3,4-tetrazoliumbis[(4-methoxy-6-nitro)benzensulfonátu] sodného a 0,008 mg/ml PMS (N-methyldibenzopyrazin, methyl sul fátu) v mediu RPMI. Po osmihodinové inkubaci v inkubátoru pri teplotě 37 °C v prostředí s 8 % oxidu uhličitého při 100% relativní vlhkosti se mikrotitrové destičky odečtou spektrofotometrem pri 480 nm oproti standardu 690 nm.

Výsledky se vyjádří jako průměrné hodnoty (± směrodatná odchylka vynesením dávky oproti křivce odezvy. Graficky se znázorní také hodnoty negativní kontroly složené z DH media (průio měr ± směrodatná odchylka všech experimentálních dat).

V tomto pokusu vyvolávají sloučeniny podle vynálezu významnou proliferaci kmenových buněk myší kostní dřeně. Míra takové odezvy je téměř stejná s mírou vyvolanou E.coli LPS, avšak minimální koncentrace potřebná k vyvolání významné odezvy je vyšší. Monofosfotylovaný produkt vyvolává mírnější odezvu než d i fosfory I ováný produkt. Obr. 1 znázorňuje reprezentativní pokus odvozený ze souboru tří nezávislých studií provedených na odlišných buněčných přípravcích.

3. Stanovení produkce oxidu dusíku v supematantních kapalinách makrofágových kultur.

Způsob

Vdechováním oxidu uhličitého se usmrtí dva myší šest neděl staří samci C57/BL6 a následuje krční dislokace. Myši se promyjí alkoholem a kůže zadních končetin se úplně odstraní. Přeruše25 ním kloubů se vyjmou pánevní, stehenní a holenní kosti. Skalpelem se odstraní maso. Kosti se očistí a konce kostí se ustřihnou nůžkami. Kostní dřeň se extrahuje z dříků kostí trojnásobným injektováním t ml modifikovaného media Dulbeco Eagle (DH-medium) do dříku kostí. Buňky se resuspendují v DH mediu a odstřeďují se 5 minut pri 300 x g. Supematant se vyhodí a kmenové buňky se resuspendují v DH mediu doplněném 20% koňského séra (HS) a 30%

L929 supematantu kultury pri hustotě 40 000 buněk/ml. L929 je fíbroblastová myší buněčná linie, jejíž supematantová kapalina je bohatá na makrofág (M-CSF) růstového faktoru. Buněčná suspenze se rozdělí na podíly po 12 ml v Petři miskách, které se inkubují osm dní v inkubátoru při teplotě 37 °C v prostředí s 8 % oxidu uhličitého při 100% relativní vlhkosti. Po osmi dnech se kmenové buňky rozdělí na dospělé makrofágové buňky. Makrofágové buňky se seškrabou po inkubaci 45 minut pri teplotě 4 °C do studeného pufru PBS. Po odstředění a odstranění supernatantu se buňky resuspendují v DH mediu doplněném 5% zárodečného telecího séra (FCS), glutaminem, asparaginem, argininem, kyselinou folovou, merkaptoethanolem a antibiotiky (penicillinem a streptomycinem). Kmenové buňky se shromáždí a jejich hustota se upraví na 700 000 buněk/ml.

Produkty, rozpuštěné napřed v DH mediu doplněném FCS, aminokyselinami a antibiotiky, se sériově naředí přímo v 96důlkových mikrotitračních destičkách. Za použití součinitele zředění 3,16 se připraví 9 až 10 zředění v závislosti na produktech. Produkty se testují třikrát a každá mikrotitrační destička obsahuje negativní kontrolu obsahující plné medium. Konečný objem v každém důlku je 100 μΐ. Mikrotitrační destičky se inkubují 1 hodinu v inkubátoru při teplotě 37 °C v prostředí s 8 % oxidu uhličitého pri 100% relativní vlhkosti k pufřování media. Po jedné hodině se do produktu přidá 100 μΐ buněčné suspenze a inkubace se prodlouží na 22 hodin.

Po 22 hodinách se mikrotitrové destičky odstředí 5 minut při 400 x g a odsaje se 100 μΙ super50 natantové kapaliny a převede se do mikrotitrové destičky. Do každého důlku se přidá 100 μΙ Griessova činidla [5 mg/ml sulfanilamidu + 0,5 mg/ml N-(l-naftylethylendiamin)hydrochloroidu ve 2,5% vodné fosforečné kyselině], Mikrotitrové destičky se odečtou spektrofotometrem při vlnové délce 562 nm oproti referenční vlnové délce 690 nm. Koncentrace nitrilu

-24CZ 302062 B6 je úměrná obsahu oxidu dusíku. Obsah nitritu se stanoví pomocí standardní křivky, která vyjadřuje lineární závislost v rozsahu 1 až 25 μΜ.

Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka po odečtení hodnoty negativní kontroly a vynesou se jako křivka závislosti dávky na odezvě.

Při tomto pokusu vyvolávají sloučeniny podle vynálezu produkci oxidu dusíku myšími makrofágovými buňkami způsobem konsistentním s křivkou závislosti dávky na odezvě. Difosforylovaný produkt vyvolává proliferaci ve značně větší míře než E.coli LPS, avšak koncentrace potřebná k vyvolání významné odezvy je vyšší. Monofosforylovaný produkt vyvolává mírnější odezvu ve srovnání s odezvou vyvolávanou difosforylovaným produktem a E coli LPS. Na obr. 2 je znázorněn reprezentativní pokus odvozený ze 3 nezávislých měření na různých buněčných přípravcích.

4. Stanovení schopnosti sloučenin podle vynálezu vyvolat produkci α-TNF lidskými alveolovými makrofágovými buňkami

Způsob

Příprava alveolových makrofágových buněk: Lidské alveolové makrofágové buňky se získají bronchoalveolovým proplachem (BAL) plic pacientů trpících rakovinou plic. BAL se provádí bezprostředně po chirurgickém zákroku plicní tkáně včetně zdravé části plicního laloku. Proplachuje se 0,8% roztokem chloridu sodného pomocí 50 ml injekční stříkačky. Získané buňky tvoří z 85% makrofágové buňky a většinou ostatních buněk jsou lymfocyty. Po odstředění se buňky suspendují v mediu RPMI a červené krvinky se odstraní odstředěním na zařízení Ficoll Pack (pro výzkum). Makrofágové buňky se promyjí třikrát HBSS a naočkují se do 24důlkových mikrotitrových destiček v množství 1 ml na důlek obsahující celkem 1 000 000 buněk. Po jednohodinové inkubaci při teplotě 37 °C výsledné makrofágové buňky ulpějí a důlky se promyjí třikrát 1 ml HBSS k odstranění neulpělých buněk. Po promývací operaci se do každého důlku, obsahujícího makrofágové buňky, přidá 1 ml RPMI.

Inkubace produkty a zkouška α-TNF: Alveolové makrofágové buňky se inkubují při teplotě 37 °C v prostředí obsahujícím 5 % oxidu uhličitého v přítomnosti 0,1 pg/ml, 1 pg/ml a 10 pg/ml následujících produktů:

negativní kontroly RPMI,

- pozitivní kontroly: E.coli LPS (serotyp 05:B5, Difco, Detroit, USA),

- monofosforylované sloučeniny podle vynálezu (OM-294—MP),

- difosforylované sloučeniny podle vynálezu (OM-294—DP).

Kultivační supematanty se získají po 24 hodinách a analyzují se na obsah α-TNF (BioSource Cytoscreen Kit, Camarillo, CA, USA) s citlivostí 1 pg/ml.

Výsledky

Monofosforylované a difosfotylované deriváty podle vynálezu vyvolávají mírnou produkci aTNF v koncentracích tak malých, jako je 10 pg/ml. Monofosforylované deriváty podle vynálezu vyvolávají produkci α-TNF v větší míře než difosforylované. Positivní kontrola LPS vyvolává ve všech třech testovaných koncentracích vysokou produkci α-TNF. Výsledky jsou v tabulce (a).

-25CZ 302062 B6

Tabulka (a) Vyvolávání produkce α-TNF sloučeninami OM-294—MP a OM-294-DP v lidských alveolových makrofágových buňkách a-TNF [pg/ml] průměr ± směrodatná, odchylka 2© 3 nezávislých pokusů

Produkt	O pg/ml	O,1 pg/ml	1 pg/ml	10 pg/ml
negativní kontrola	RPMI 195+70
positivní kontrola:E.colí LPS	7667±115	9858+2148	10390+341«
0M-294-WP-Í		246+38	353±75	1049±295
0M-294-MP-2		205+62	291+70	1124±406
OM-294-DP-t		156+66	117±85	329±14t
0M-294-DP-2		17+79	S8±61

5. Stanovení kapacity sloučenin podle vynálezu k inhibici produkce α-TNF v lidských alveolových makrofágových buňkách, v odezvě na E.coli Lipopolysacharidu (LPS)

Způsob

Příprava alveolových makrofágových buněk: Lidské alveolové makrofágové buňky se získají io bronchoalveolovým proplachem (BAL) plic pacientů trpících rakovinou plic. BAL se provádí bezprostředně po chirurgickém zákroku plicní tkáně včetně zdravé Částí plicního laloku.

Proptachuje se 0,8% roztokem chloridu sodného pomocí 50 ml injekční stříkačky. Získané buňky tvoří z 85% makrofágové buňky a většinou ostatních buněk jsou lymfocyty. Po odstředění se buňky suspendují v mediu RPMI a červené krvinky se odstraní odstředěním na zařízení Ficoll

Pack (pro výzkum). Makrofágové buňky se promyjí třikrát HBSS a naočkují se do 24důlkových mikrotitrových destiček v množství 1 ml na důlek obsahující celkem 1 000 000 buněk. Inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, výsledné makrofágové buňky ulpějí a důlky se promyjí třikrát 1 ml HBSS k odstranění neulpělých buněk. Po promývací operaci se do každého důlku, obsahujícího makrofágové buňky, přidá 1 ml RPMI.

Inkubace s produkty a zkouška α-TNF: Alveolové makrofágové buňky se inkubují pri teplotě 37 °C v prostředí obsahujícím 5 % oxidu uhličitého v přítomnosti E.coli LPS (O5:B5 serotyp Difco, Detroit, Sp. st. a,), při 1 mg/ml, do kterého se současně přidají následující produkty o koncentraci 10gg/mI:

- negativní kontrola: RPMI, monofosforylovaná sloučenina podle vynálezu (OM-294-MP),

- difosforylovaná sloučenina podle vynálezu (OM-294-DP).

-26CZ 302062 B6

Výsledky

Difosforylovaný derivát podle vynálezu inhibuje produkci α-TNF normálně vyvolávanou LPS. Monofosforylovaný derivát částečně inhibuje produkci α-TNF vyvolávanou LPS. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce (a).

io

Tabulka (a)

Inhibice produkce α-TNF vyvolané LPS sloučeninami OM-294-MP a OM-294-DP v lidských alveolových makrofágových buňkách

Produkt	<x-TRF [pg/ml]	% inhibice
RPMI (negativní kontrola)	73	-
E.coli LPS (lOug/nl) C posi t i vn í kontro1a)	8470	0
Oři - 294- MP- 1 ( 1 Opg/ η 1) E.coli LPS (lpg/rnl)	4577	44
0M-294-MF-2 (lOMg/»i> E.coli LPS <1Mg/ml)	4789	41
OM-294-DP-1 <lOjug/el> E.coli LPS <lpg/ftl)	1267	84
0M-294-DP-2 (lOpg/ml) E.coli LPS <1pg/ml)	1280	84

6. Účinek produktů OM-294—MP a OM-294-DP na dendritické zrání molekul

Vyhodnocuje se schopnost produktů OM-294-MP a OM-294-DP vyvolávat zrání predendritických buněk na dendritické buňky. Měří se následující parametry: Začleňování konjugátu

FITC-Dextranu a exprese povrchových markérů CD40, CD80, CD83, CD86.

Způsob

Buňky: Izolují se mononukleované buňky periferální krve z povlaku bílých krvinek šesti zdra25 vých dárců krve. Dárci neprodělávají žádné ošetření před odběrem krve.

-27CZ 302062 B6

Příprava buněk:

Monocyty vyčištěné ulpívací selekcí se resuspendují v mediu RPMl-1640 (Sigma-Aldrich: St.Louis, MO, Sp. st. a.) obsahujícím 10% zárodečného telecího séra, GM-CSF (10 ng/ml,

IM-HGMÍ, Immungenex Corp., Los Angeles, CA, Sp. st. a..) a IL-4 (10 ng/ml, č. 204 IL, R&D System, Minneapolis, MN, Sp. st. a.) při hustotě 1x10⁶ buněk/ml a rozdělí se do Petriho misek o průměru 10 cm (P10, Falcon, Becton, Dickinson, Plymouth, UK) (10x10⁶ buněk na misku P10) a kultivují se 6 dní (s výměnou čerstvého media po třech dnech). Tyto buňky se označují jako predend rit ické buňky (DC-ó). Zrání predendritických buněk na dendritické se dosahuje inkubací io buněk OM-294—MP a OM-294-DP a LPS po tři další dny při koncentracích nastavených pod Product sečti on. Devátého dne (DC-9) se buňky shromáždí a analyzují se za použití různých indikátorů zralosti dendritických buněk: posuzují se povrchové markéry CD40, CD80, CD83, CD86 i z hlediska jejich schopnosti odstraňovat konjugát FITC-Dextran. Všechny tyto parametry se analyzují za použití přístroje EPICS-XL-MCL model FACS (Counter Immunology, Hialeah,

Finsko) (Lanzavecchia a kol., J. Exp. Med. 179, str. 1109, (1994), Lanzavecchia a kol., J. Exp. Med. 182, str. 389 (1995).

Analýza dat:

Exprese povrchových markérů se vyjadřuje procentem střední fluorescence buněk stimulovaných LPS (pozitivní kontrola). Odstranění konjugátu FITC—Dextran se vypočítá s ohledem na rychlost odstranění buněk udržovaných v zásaditém prostředí a vyjadřuje se v procentech. Statistická analýza Studentovým t-testem zahrnuje porovnání dat získaných z různých testů s daty pozitivní kontroly. Míra významnosti dat je stanovena při p <0,05.

Produkty:

Zásobní roztoky OM-294—MP a OM-294-DP se připraví v koncentraci 1 mg/ml v 0,9% vodném roztoku chloridu sodného, v případě OM-294-MP s přísadou 0,1 % triethylaminu. Roztoky se inkubují 20 minut pri teplotě 37 °C za intenzivního míchání po dobu tri minut, zředí se na 100 pg/ml v kultivačním mediu RPMI-1640 a používají se buď v koncentraci 10 mg/ml (obr, 3, 6, 7, 8) nebo v koncentracích od 0,02 do 25 pg/ml (obr. 4, 5).

Referenční produkt:

Lipopolysacharid E.coli (LPS, D1FCO, Detroit, MI, Sp. st. a.) jako zásobní roztok 5 mg/ml v PBS. Připraví se jako meziprodukt roztok 100gg/ml v kultivačním mediu RPMI 1640. Koncentrace k testování jsou buď 10 pg/ml (obr. 3, 6, 7, 8) nebo v koncentracích 0,02 až 10 pg/ml (obr. 4, 5).

Výsledky

Nedozrálé dendritické buňky (DC-6) pocházející z diferenciace monocytů, spojovacím působením GM-CSF a IL—4, jsou schopny začleňovat konjugát FIFC-Dextran. Během zrání buňky ztrácejí schopnost začleňovat konjugát FIFC-Dextran. Analýzy se provádějí po dosažení diferenciačního stavu DC 9.

Výsledky se vyjadřují v procentech začlenění konjugátu FITC-Dextron pozorovaného v nastimulovaných buňkách (základní medium) (obr. 3). Buňky zpracované LPS nebo OM294-MP si so uchovají pouze 10 % nebo OM-294-MP pouze 19% své fagocytové kapacity, zatímco buňky stimulované OM-294-DP si uchovají plně svou schopnost začleňovat konjugát FITC-Dextran (98 až 99 %). Křivka závislosti odezvy na dávce naznačuje, že OM-294—MP má vynikající kapacitu k vyvolávání diferenciace buněk DC-6 do DC-9 pri koncentracích od 0,02 pg/ml do

-28CZ 302062 Bó pg/ml (obr. 4), přičemž byly testovány nízké koncentrace a obr. 5 pro testování vyšší koncentrace.

Jiným kritériem k posouzení zralosti DC je exprese spolu stimulujících povrchových markérů. Testuje se exprese CD40, CD80, CD83 a CD86. Výsledky jsou vyjádřeny v procentech průměrné fluorescence založené na expresi těchto markérů vyvolané LPS.

OM-294-MP zvyšuje expresi všech testovaných povrchových markérů: CD40(39%), CD80(62%), CD83(60%), CD86(77%) (obr. 6, 7, 8, 9).

OM-294-DP vykonává podobný účinek jako základní kultivační medium na expresi zkoumaných markérů. Tento efekt nepřesahuje 20 % účinku LPS.

7. Účinek produktů OM-294-MP a OM-294—DP na produkci α-TNF a lL-12p70 monocytů a predendritických buněk při stavu DC-6

Buňky DC-6 (5χ10⁵/500 μ1 media) se stimulují během 4 hodin, 6 hodina 24 hodin bud’ LPS (10 pg/ml) nebo OM-294-MP (10 pg/ml) a nebo OM-294-DP (10 pg/ml).

Způsob

Podmínky experimentů Ín vivo: Získají se mononukleové buňky periferní krve z povlaku bílých krvinek šesti zdravých dárců krve (před odběrem krve dárci neprodělali žádné léčení). Monocyty se izolují na gradientu Ficoll, načež se čistí ulpívací selekcí. Volně ulpělé buňky se shromáždí a jedna frakce buněk se uloží jako monocyty. Vyčištěné monocyty se resuspendují do media DPMI-1640 obsahujícího 10 % FCS v míře lxl O⁶ buněk/ml a rozdělí se do Petři misek o průměru 10 cm (P10, Falcon, Becton, Dickinson, Plymouth, UK) měrou 10x10⁶ buněk na misku P10. Buňky se kultivují šest dní v plném mediu RPMI 1640 obsahujícím GM-CSF (10 ng/ml) a IL-4 (10 ng/ml). Šestého dne se buňky shromáždí, promyjí se HBSS a naočkují se do 24důlkové destičky v hustotě 5x10⁵ buněk/důlek v 500 pl plného media RPMI a stimulují se LPS (10 pg/ml), OM-294—MP (10 pg/ml) nebo OM-294-DP (10 pg/ml). Postupem ELISA se zkoumají jak α-TNF tak IL-12p70 v supematantech kultuiy, jež se zpětně získají po 4, 6 a 24 hodinách.

Produkty:

Produkty OM-294-MP a OM-294-DP (1 mg/ml zásobního roztoku ve sterilní vodě) se inkubují 20 minut při teplotě 37 °C a míchají se intenzivně 3 minuty, načež se zředí na 100 mg/ml a použijí se v konečné koncentraci 10 pg/ml v kultivačním mediu RPMI 1640.

Referenční produkt:

Lipopolysacharidy E.coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, Sp. st. a.), zásobní roztok 5 mg/ml v PBS, jako meziprodukt roztok 100 pg/ml v kultivačním mediu: 100 pg/ml, použitý v konečné koncentraci 10 pg/ml.

Test α-TNF a IL-12p70:

Podle dodavatelovy instrukční příručky se soupravou α-TNF KHC3012 kit společnosti Biosource, batch # PP003-J061703 (Biosource International, Camarillo, CA, Sp. st. a.) ELISA se provede zkouška IL12p70 v kultivačních supematantech způsobem ELISA za pomoci lidské OL-12 kit (č. Dl200, dávka 990 6232, R&D System, Minneapolis, MN, Sp. st. a.).

-29CZ 302062 B6

Výsledky α-TNF

OM-294-MP stimuluje produkci α-THF buňkami DC-6 podobným způsobem jako LPS, jak z hlediska časového průběhu produkce tak z hlediska koncentrace α-TNF (obr. 10). U obou produktů je vrchol α-TNF mezi 6 až 24 hodinami. OM-294—DP má pouze malý stimulační účinek na produkci α-TNF buňkami DC-6.

io IL- 12p70

Obecně platí, že IL—12 se vyvolá v přítomnosti gamalFN (LPS + gama IFN, OM-294-MP + gama IFN) v monocytech (obr. 12) a v buňkách DC—6 (obr. 11). Nástup produkce cytokinů je dřívější v DC než v monocytech.

8. Vyhodnocení vlastností adjuvantů OM-294-MP a OM-294—DP v myším imunizačním modelu se syntetickým peptidem (Pb CS His₆-242-310) C-terminálové oblasti cirkumsporozoitového povrchového proteinu Plasmodium berghei.

Způsob Antigen:

Peptid Pb CS (HHHHHHGGMN NKNNNNDDSY IPSAEKILEFVKQIRDS1TEEWSQCNV25 TCG SGIRVRKRKRG NKKAEDLTL EDIDTEI dále nazývaný Dis₆-242-310 odpovídající sekvenci aminokyselin 242-310 cirkům sporozoitového kmene ANKA povrchového proteinu Plasmodia berghei plus N-terminálový úsek 6-histidinu, 2-cy klinu a jednoho methioninového zbytku se získá způsobem, který popsali Merrifield a Athenon (Athenon a kol., Bioorg. Chem. 8, str. 350 až 351, 1979). Polypeptid se připraví na p-alkoxybenzy lal koho lové pryskyřici (Wangova pryskyřice) mající stupeň substituce 0,4 mmol/g. Při době kopulace 30 minut se použije 10-násobného molámího přebytku derivátů F-moc aminokyselin. Peptid se čistí chromatografií vylučující velikost (Sephadex G25, Pharmacia, Sweden), pak reverzní fázovou chromatografií (W-Porex 5 C-4,250x10 mm, Phenomenex, Torrance, CA, Sp. st, a.) za použití 40-min gradientu směsi objemově 10 až 50% acetonitri 1/0,1 % trifluoroctové kyseliny při průtočné rychlosti

3 ml/min.

Složení aminokyselin peptidu se určí způsobem Knecht a Chang (Annal. Chem. 58, str. 2373 až 2379, 1986) a molekulová hmotnost se určí hmotovou spektrometrií za použití přístroje model Voyager DE (Perspective Biosystem, Framingham, MA, Sp. st. a.). Zásobní roztok antigenu se připraví o koncentraci 0,4 mg/ml v systému 0,9 % chloridu sodného/voda při hodnotě pH 8,0. Adjuvanty:

Zásobní roztoky OM-294-DP a OM-294-MP se připraví o koncentraci 1 mg/ml v 0,9% vodném roztoku chloridu sodného se začleněním 0,1 % triethylaminu pro OM-294-MP. Pozitivní kontrolou je neúplný Freundův adjuvant (1FA od Difco, Detroit, MI, Sp. st. a.), negativní kontrolou je 0,9% roztok chloridu sodného.

Směs antigen-adjuvant:

Jeden objem antigenu a jeden objem adjuvantu se tři minuty vířivě míchá.

-30CZ 302062 B6

Imunizační režimy:

týdnů staré myší samice BALB/c (6 myší ve skupině) se imunizují třikrát, subkutánním injektováním do konce ocasu 0,1 ml následujících směsí:

Skupina.	Adjuvant 0,05 mg/infekce	Ant igen	Počet myší
O, 02	mg/injekce
1		PbCS	Hise-242-310	6
2	IFA	PbCS	HíS6’242-3Í0	6
3	0M-294-MP	PbCS	Hise-242-310	6
4	Ort-294-DP	PbCS	Híse-242-310	6
5	0M-294-MF		-	6
6	Ort-294-DP		-	6

Imunizační a odběrová tabulka

Týdny	O	3	4	7	9
Imunizace	t	t		Ť
Specifická odezva na protilátky Odezva CTL	Ť	t	t	t	Ť t

Odběr vzorku lymfoidního orgánu a krve:

ío Odběr séra:

Odběr krve se koná v týdnech 0, 3, 7 a 9. Krev se nechá ustát Šest minut při teplotě 37 °C a pak se nechá stát pres noc při teplotě 4 °C. Sérum se zmrazí na teplotu -80 °C až do zkoušky protilátky.

Získání tříselných lymfatických uzlin a sleziny:

Část z každé skupiny zvířat se po 4 nebo 9 týdnech usmrtí a chirurgicky se odejmou lymfatické uzliny z třísel a slezina.

Stanovení proti látkového titru anti-PbCSHis₆242-3 1 0

Zkouška protilátek, specificky zaměřená na antigen PbCSHis„242-310, se provádí způsobem ELISA. Vazba antigenu se provádí v mikrotitračních 96důlkových destičkách (Maxisorp F96, Nunc, DK) inkubací přes noc ve vlhké komoře při teplotě 4°C v každém důlku obsahujícím

0,1 ml PBS (fosfátem pufrovaná solanka) obsahujícím 0,001 mg/ml antigenu PbCSHis₆242-310.

Blokování mikrotitrační destičky se provádí PBS obsahujícím 1 % albuminu hovězího séra (BSA, Fluka, Švýcarsko). Destičky se omyjí PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20 (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Vzorky séra, shromážděné v týdnu 0, 3, 7 a 9, se sériově zředí ředicím pufrem (PBS obsahující 2,5 % prášku sbíraného mléka a 0,05 % Tweenu 20) a přenesou se do mikrotitrační destičky a nechají se stát jednu hodinu při teplotě místnosti. Destičky se pak omyjí PBS a vnese se do nich zředěný roztok obsahující myší polyklonální aniimunoglobulin napojený na alkalickou fosfatázu (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.) a inkubují se jednu hodinu při teplotě místnosti. Destičky se omyjí PBS a specifické protilátky se vyvolají barevnou reakcí přidáním

-31 CZ 302062 B6 substrátu alkalické fosfatázy, p-nitrofenylfosfátu (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Absorbance při 405 nm se odečte čítačem mikrotitrační destičky (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), každý vzorek séra se měří dvakrát. Výsledky jsou průměrem měření se zřetelem na myši každé skupiny. Protilátkový titr je dán nej vyšším zředěním dávajícím významně pozitiv5 ní odezvu, tedy OD větší než je úroveň šumu ±3D.

Zkouška EL1SPOT

Protilátky, specificky zaměřené na myší gama-interferon (OIE703B2), jsou vázány inkubací přes io noc při teplotě 4 °C ve vlhké komoře, přidáním proti látkového roztoku při 50gg/ml v mikrotitrační destičce ELI SPOT, kde dno důlku je pokryto nitrocelulózou (Millipore, Molsheim,

Francie). Blokování se provede přidáním media DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, Sp. st. a.) obsahujícího 10 % zárodečného telecího séra (FCS, Fakola, Švýcarsko) a dvouhodinovým ustátím při teplotě 37 °C. Buňky, získané z lymfatických orgánů (z tříselných lymfatických uzlin a ze sleziny) se kultivuji v mikrotitračních destičkách při hustotě 200 000 buněk/důlek, se společně kultivují se 100 000 buněk P815 po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C popřípadě v soutěži s krátkým peptidem PbCS 245 až 252. Po inkubaci se buňky vyjmou a po promytí se přidá druhý myší anti-gamalFN protilátkový-biotinový komplex (ANI, 2 μ^πιΐ v PBS s 1 % BSA) a inkubuje se dvě hodiny. Přidá se streptavidin-alkalický fosfatázový konjugát (Boehringer, Mannheim, zo Mannheim, Německo) a inkubuje se jednu hodinu při teplotě 37 °C, provede se trojí promytí PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20, následované trojím promytím PBS. Přítomnost anti-gama IFN imunitních komplexů se demonstruje přidáním substrátu BCIP/NBT (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Tato reakce se ukončí promytím vodou z vodovodu. Místa, která jsou pozitivní na gama IFN, se pod stereomikroskopem odečtou. Specifický počet skvrn je rozdílem mezi skvrnami odečtenými v přítomnosti buněk soutěžících s peptidem a skvrnami odečtenými v nepřítomnosti peptidu. Výsledky jsou střední hodnoty měření, zaznamenané pro myši každé skupiny. Jsou vyjádřeny jako počet skvm na milion kultivovaných krevních buněk.

Výsledky

Protilátková odezva:

Produkce protilátek, specificky zaměřených na PbCSHis₆-242-310, zjištěná způsobem ELISA, je graficky znázorněna pro myši, kterým byly podány jedna, dvě a tři imunizační dávky. Kontrola zahrnuje jedinou dávku samotného antigenu a výsledky velmi slabého protilátkového titru. Protilátkový titr s jednou samotnou dávkou antigenu ve směsi sOM-294-MP nebo případně OM294-DP je téměř tak vysoký jako odezva pozorovaná při neúplném Freundově Adjuvantu (IFA) ve směsi s týmž antigenem (obr. 13). Po dvou dávkách OM-294-MP a OM-294-DP jsou adjuvanty schopny vyvolat serologickou odezvu, která je případně větší než odezva IFA (obr. 14). Po třech dávkách jsou schopny adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP vyvolat serologickou odezvu, která je vyšší než odezva IFA (obr. 15),

Obr. 13 ELISA 3 týdny po první imunizační dávce,

Obr. 14 ELISA 4 týdny po druhé imunizační dávce,

Obr. 15 ELISA 2 týdny po třetí imunizační dávce.

Obr. 16 Protilátkový titr naměřený před a po první, po druhé a po třetí imunizační dávce.

Protilátkové titry zvířat v každé skupině před imunizační dávkou a po jedné, dvou a třech imunizačních dávkách jsou uvedeny jako průměrné hodnoty (obr. 16).

Odezva CTL:

Zjištění epitopu T-buněk PbCS 245-252 obsaženého v PbCSHis₆-242-310 shora použitého pro imunizaci je dobře předvedeno testem ELISPOT. Odezva T-lymfocytů zaznamenaná u imunizovaných zvířat (tříselné lymfatické uzliny a slezina, získané jeden týden po druhé dávce a popřípa55 dě dva týdny po třetí dávce) je doložena nárůstem pozitivního počtu dávek pro gama interferon

-32CZ 302062 B6 (gama IFN), Výsledky uvedené na obr. 17, 18, 19 a 20 jsou vypočteny jako průměrná hodnota měření, dosažená každým zředěním a pro myši každé skupiny. Jsou vyjádřeny počtem dávek na milion buněk v kultuře.

Výsledky obou adjuvantů OM-294-MP a OM-294-DP znamenají velmi významný nárůst odezvy CTL lymfocytů odvozených ze sleziny a tříselných lymfatických uzlin.Odezvy sleziny jsou vyšší než odezvy tříselných lymfatických uzlin. Aktivita CTL, vyvolaná adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP je zřetelně nadřazena aktivitě vyvolané IFA.

io 9. Důkaz nekovalentních komplexů antigenů OM-294 kapilární elektroforézou

K prokázání nekovalentního vytváření komplexu OM-294-DP a peptidu PbCSHis₆-242-310 během přípravy vakcíny se použije kapilární elektroforézy.

Způsob

Analýza: Pufr 20 mM borátu sodného (disodiumtetraborátdekahydrát, Merck, č. 6306) se nastaví na hodnotu pH 7,4 IN roztokem hydroxidu sodného (Fluka č. 72072).

Kapilární (neroubovaná) trubice, rozdělená po zónách, délka 30 cm, průměr 50 pm. Detekce se provádí při 200 nm ze použití přístroje Beckman PÁCE MDQ (Beckman, Brea, CA, Sp. st. a.).

Podmínky separace:

Čas Cain.1	Proces	Tlak	Rozpouštědlo
O. OO	kapiiÁrní proplach	138 kPa	voda
3, OO	kap i 1ární prop1ach	138 kPa	IR NaOH
6,00	injektáz vzorku	3,45 kPa	borátový pufr
6. OS	separace	30,0 KV	borátový pufr

Antigeny: PbCSHis₆-242-310 syntetický peptid pří 1 mg/ml H₂O Adjuvant: OM-294-DP pri 1 mg/ml v H₂O

Směs antigenů a adjuvantu: 250 pg/ml + 250 pg/ml

Výsledky

Vytváření komplexu antigen-adjuvant je patrno při přípravě tohoto vakcínového prostředku na diagramu elektroforézy vymizením adjuvantového vrcholu a posunem antigenového vrcholu za vzniku nového vrcholu, který je specifický pro nově vytvořený komplex (obr. 21).

10. Ošetřování peritoneální rakoviny vyvolané injekcí buněk odvozených ze syngenické nádorové linie PROb krys BDIX

Tento experiment má dokázat protinádorové působení OM-294—DP, podávaného v sériích, například injektováním krysám majícím makroskopické nádory o velikosti několik milimetrů.

-33 CZ 302062 B6

Způsob

Zvířata:

Kmen ín-bred krys BDIX ustavil H. Druckrey v roce 1937. Párek krys z Max Planckova Institutu ve Fribourgu (FRA) byl počátečním zdrojem této kolonie, která byla udržována od roku 1971 systémem jediné linie v domově laboratorních zvířat. Podle tohoto systému se vyčlení jediný pár sestra-bratr k získání potomstva následující generace. Krysy použité při této práci jsou z ústavu Experimental Animal Breeding Center v lffa-Credo (Arbresle, Francie), který pokračoval io v chovu za pomoci přihlašovatelovy laboratoře. Použitými krysami jsou samci staří 3 měsíce ± 1 týden.

Vyvolání nádoru injektováním PROb:

Původ buněk PROb:

Napřed se odvodila buněčná linie DHD/K12z roubu karcinomového fragmentu tlustého střeva v kryse in-bread BDIX ošetřením 1,2-dimethylhydrazinem. Tato linie ulpělých buněk se rozdělila do dvou podskupin podle jejich citlivosti na ošetření trypsinem a buňky, které nebylo možno snadno oddělit, se nazvaly DHD/KI2-TR. Když byly buňky DHD/K12-TR injektovány do syngenických DB1X krys, vyvolaly trvale se vyvíjející nádory. Tato linie byla klonována a v tomto výzkumu bylo použito pouze klonu DHD/K-12-TRb, nazvaného PROb.

Kultivační podmínky: Llpělé buňky PROb se pěstovaly v uzavřených lahvích (Falcon, Becton,

Dickinson, New Jersey, Sp. st. a.) pri teplotě 37 °C v plném mediu pocházejícím z Hamova media F10 (Βίο-Whittaker, Walkersville, Sp. st. a.), do kterého bylo přidáno 10 % zárodečného telecího séra (FCS, Anval. Betton, Francie). Kultivační medium se vyměňovalo každé tri dny. Po slinutí, se buňky uvolnily nebo seškrabaly během tří až pěti minut z podložky 2 ml roztokem EDTA/trypsin, následovaly tri oplachy 2 ml téhož roztoku během dvou až tří minut, buňky se resuspendovaly do plného media s přísadou FCS k ukončení trypsinové reakce. Nepřítomnost znečištění v buňkách mykoplasmového a bakteriálního původu se kontrolovala v pravidelných intervalech vybarvením DNA Hoechstovým fluorochromem 33258 (Aldrich Chímie, Steiheim, Německo).

Zavedení peritoneálního karcinomu:

Buňky PROb se uvolní ze svého podkladu způsobem popsaným ve stati „kultivační podmínky“ a buňky se odečtou v roztoku trypanové modře jakožto barvicího činidla jako prostředku k posouzení životaschopnosti buněk. Buňky se suspendují v Hamově mediu F10. Pod etherovou anestesí se vyvolají pobrišnicové karcinomy intraperitoneální injekcí 10⁶ buněk PROb u syngenických krys BDIX. Injekce nádorových buněk se provede desátého dne. Za těchto podmínek se u všech krys vyvine peritoneální karcinom s produkcí krvavých shluků v útrobách a krysy hynou mezi 6. až 12. dnem po injektování buněk.

Léčení peritoneálního karcinomu:

S léčením se započne 13. dne po injektování nádorových buněk, když se vytvoří karcinomová hmota v uzlinách o průměru několika milimetrů. Léčení spočívá v injektování 10 i.v. injekcí OM-294-DP v množství 1 mg/kg tělesné hmotnosti a v dávkách 0,6 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného. Injekce se podávají třikrát za týden (v pondělí, ve středu a v patek) do pěni lové žíly. Kontrolní skupina je ošetřována samotným 0,9% roztokem chloridu sodného.

-34CZ 302062 B6

Posouzení účinnosti léčby:

Dne D42, 6 týdnů po injektování nádorových buněk, se krysy usmrtí, rozpářou a rozvoj karcinomu se posuzuje slepou studií. Měření objemu karcinomu není proveditelné, místo toho je možno karcinomy klasifikovat do 4 různých typů.

Podle počtu a průměru karcinomových uzlin se definuje 5 tříd:

třída 0: uzliny jsou viditelné třída 1: uzliny o průměru 0,1 až 0,2 cm lze snadno spočítat třída 2: jsou patrny nesčetné uzliny o průměru 0,1 až 0,5 cm třída 3: břišní dutina je zamořena uzlinami, z nichž některé mají průměr 1 cm.

třída 4: dutina je úplně zamořena nádory o velikosti několika centimetrů.

Objem shluků a změna hmotnosti zvířat:

Objem shluků se měří dvojnásobným vážením zvířat. Skupina kontrolních neléčených krys, kterým byl injektován pouze 0,9% roztok chloridu sodného, umožňuje posuzovat normální vývoj karcinomů a sledovat léčbu.

Posuzování účinnosti léčby:

Míra přežití krys v léčené skupině se porovnává s mírou přežití kontrolních skupin. Objemy karcinomů a shluků léčených krys se porovnávají s měřeními krys v kontrolní skupině.

Statistická analýza:

Statistická významnost účinků imunoterapie se stanoví pomocí Kruskall-Wallisova testu ke klasifikování karcinomů. Podobně se provádí variační analyzový test pro data objemu shluků a dlouhodobý test se provádí u přeživších krys.

Výsledky

Karcinomy: V tomto modelu prokázal OM-294-DP pozoruhodnou protinádorovou aktivitu. Tato aktivita je podrobněji vyjádřena počtem zvířat bez nádoru (třída 0) a dále je rozdíl oproti kontrole s chloridem sodným významný (p<0,05) pro objem nádoru. Dopad léčení OM-294-DP na objem shluků je také významný (p<0,05).

Léčba Počat krys s rakovinou Účinek pro* Objel shluků Účinek patřících do třídy středku (ri v il/krysu produktu (*ri

12 3 4 rozsah průiér io

RaCV¹* 10 10 7

0-84 38129

0Η'294-Ν*^2ϊ 4 12 12 p<0,05 0-73 8123 p<0,05 (*): Kruskall-Wallísův test, (**) Variační analýza ('): 8 až 10 krys uhynulo na rakovinu před zabitím, 1 krysa při D34 vykázala uzliny a žloutenku, nebylo však možná přesné stanovení tříd (kanibalismus), 1 krysa při D37 patřila do třídy 4, 2 kiysy při D38 patřily do třídy 4, jedna při D39 patřila do třídy 4, dvě při D40 patřily do

-35 CZ 302062 B6 třídy 4 a 1 při D41 patřila do třídy 4. Jedna krysa třídy 0 vykázala po rozpárání podkožní nádor, je pravděpodobné, že selhala injekce nádorových buněk.

(²) Jedna krysa při D14 pošla v době první léčebné injekce, další rakovinou netrpěla. Jedna z krys usmrcených v třídě 0 vykázala podkožní nádor (selhala injekce nádorových buněk).

Přežití:

Zvířata byla usmrcena v den D42. Přežití bylo zjištěno v den D42 po injekci nádorových buněk, 90 % zvířat ošetřených OM-294-DP přežilo, zatímco u neošetřené skupiny zůstalo naživu pouze io 20 % zvířat. Míra přežití krys je významně působením OM-284—DP rozšířena (p<0,001).

Hmotnost:

OM-294-DP nemá významný vliv na změny hmotnosti v porovnání se zvířaty ošetřenými pouze i? samotným roztokem chloridu sodného podle dat uvedených v tabulce (b).

Dny NaCl GM-294-DP

O	314*19	277±19
13	33711S	310±2t
20	342120	304123
29	361123	317124
41	314138	327126

11. Vyhodnocení vlastností adjuvantu OM-294-DP podle úmrtnosti myšího imunizačního modelu nosním podáním podjednotky ureázy B Heliobacter pylori

Ukázalo se, že myši mohou být ochráněny před infekcí Heliobacter pylori, jsou-li imunizovány podjednotkou ureázy B Heliobacter pylori ústním nebo nosním podáním v přítomnosti adjuvantu na bázi cholera toxinu (CT) (Corthésy-Teulaz I. a kol., Gastroenterology 109, str. 115, 1995); Michetti P a kol. Gastroenterology 116, str. 804, 1999); Saldinger P. F. a kol. Gastroenterology 115, str. 891, 1998). Tato humorální odezva na anti-Ure B, měřená v séru imunizovaných myší, je hlavně typu IgGl (odezva Th2). Hodnocení adjuvantu OM-294-DP se provádí u myší BALB/c (n=6) imunizovaných Čtyřikrát v týdenních intervalech nosním podáním ureázy B podjednotky (UreB) rekombinantního Heliobacter pylori v přítomnosti OM-294-DP. BALB/c kontrolní myši byly imunizovány samotným adjuvantem OM-294-DP. Dva týdny po poslední dávce se od každé myši odebere krev ke stanovení anti-UreB imunoglobulinů způsobem ELISA (totální IgG, IgGl a IgG2a),

Způsob

Zvířata:

Myši BALB/cOla/HsD (Harland, Horst, Nizozemsko) 24 myší.

Antigen:

HpUreB 1-569, expresováný jako rekombinantní protein E. coli (kmen Ml5, Qiagen, Hilden, Německo) shora popsaným způsobem (Michetti P a kol. Gastroenterology 107, str. 1002, 1994). Adjuvant:

OM-294-DP (zásobní roztok 2,2 mg/ml).

-36CZ 302062 B6

Imunizační režimy:

Čtyři skupiny po 6 myších:

Skupina A: 6 myší BALB/c se imunizuje čtyřikrát nosním podáním 25 gg samotného OM-294—DP (25 μΐ na dávku) jednou týdně po 4 po sobě následující týdny.

Skupina B: 6 myší BALB/c se imunizuje čtyřikrát nosním podáním 50 gg UreB 1-569 + 25 gg OM-294-DP (25 gl na dávku) jednou týdně po 4 po sobě následující týdny.

Dva týdny po poslední imunizaci nosem se odebere krev z ocasu každé myši skupiny A a B. Zkouška na IgG v séru:

Povlékací pufr (pH9,6): na 1 litr uhličitanu sodného (15 mM, 1,59 g), hydrogenuhličitan sodný (34,8 mM, 2,93 g), Thimerosal (0,01 %), pufr PBS-Tween, hodnota pH 7,4: na 1 litr, chlorid sodný (137 mM, 8,0 g), dihydrogenfosforečnan draselný (1,5 mM, 0,2 g), hydrogennatriumfosforečnan (8,0 mM, 1,15 g), chlorid draselný (2,7 mM, 0,2 g), Tween 20 (0,1% 1 ml), citrát/fosfátový pufr, hodnota pH 5,0: na 1 litr kyseliny citrónové (44,4 mM, 9,32 g), hydrogendinatriumfosforečnan (103 mM, 14,6 g), roztok substrátu lOx (O-feny Idi amin = OPD) 10-násobná koncentrace): (10 mg/ml v citrátovém pufru): roztok azidu sodného: 1%, ukončovací roztok: 0,01 % azidu sodného v citrát/fosfátovém pufru 0,1 M, pH 5,0.

Způsob:

Připraví se roztok antigenu (zásobní roztok UreB 1-569 připravený 26. května 1999, 0,5 mg/ml zásobního roztoku) v koncentraci 5 gg/ml v povlékacím pufru pH 9,6 (500 gl roztoku UreB na 50 ml pufru). Do každého důlku ve třech 96důlkových destičkách s kulatým dnem se pipetou nakape 100 gl (0,5 gg UreB na důlek). Destičky se inkubují dvě hodiny při teplotě 37 °C. Supernatant se z destiček odstraní. Důlky se blokují přísadou 100 gl systému PBS/0,1 % roztoku Tween + 5 % práškového mléka na důlek. Destičky se inkubují 300 minut při teplotě 37 °C. Blokovací roztok se vyhodí a důlky se promyjí třikrát 100 gl roztoku PBS/Tween. Supematanty se vyhodí. Připraví se roztok 1:200 každého testovaného myšího séra v systému PBS/0,1 % Tween pufru (5 gl séra v 1 ml PBS/Tween). Séra (100 gl) se rozdělí po dvou do třech destiček (I destička k detekci celého IgG, 1 destička k detekci IgGl, 1 destička k detekci IgG2a). Inkubace proběhne přes noc pri teplotě 4 °C. Destičky se promyjí třikrát lOOgl pufru PBS-Tween. Jednotlivě se připraví roztoky 1:500 na biotin vázané protilátky celkového anti-IgG (Amersham, CattfRPN 1177), protilátky anti-IgG 1 (Amersham, Cat#RPN 1180) a protilátky anti-ígG2a (Pharmingen Cat# přibližně 02012D) v pufru PBS/Tween. lOOgl roztoku protilátky celkového anti-IgG 1 se přidá do destičky č. 1, 100 gl roztoku protilátky anti-IgG 1 se přidá do destičky č. 2 a lOOgl roztoku protilátky anti-IgG2a se přidá do destičky č. 3. Provede se jednohodinová inkubace při teplotě 37 °C. V pufru PBS-Tween se připraví roztok 1:1000 streptavidinu-HRP (Dako, Cat#p0397) a lOOgl roztoku se přidá do každého důlku. Provede se jednohodinová inkubace pri teplotě 37 °C. Důlky se promyjí třikrát pufrem PBS/Tween. Roztok substrátu se připraví 10-násobným zředěním roztoku OPD (lOx) v 0,1 M citrát/fosfátovém pufru.Do zředěného roztoku OPD se přidá 1 gl peroxidu vodíku. Do každého důlku se přidá 50 gl roztoku substrátu. Po dobu 10 až 20 minut se nechá vyvinout zbarvení. Reakce se ukončí přidáním 50 gl ukončovacího pufru. Pomocí negativní kontroly jako slepé zkoušky se odečte absorbance při 492 nm (přičemž standardní odečtení je při 620 nm).

-37CZ 302062 B6

Statistická analýza:

Data pro střed ± směrodatná odchylka (n=6) se odvodí ze Studentova t-testu. Úroveň významnosti je při p<0,05.

Výsledky

U předem imunizovaných myší UreB-1-569 + OM-294-DP podaném nosem se vyvinula antí-UreB humorální imunita :anti-UreB-1-569 IgGI je obsažen v krvi, io

Přítomnost protilátek specificky zaměřených proti UreB Hp v myším séru se měří způsobem ELISA. UreB (0,5 μΙ/důlek) se rozdělí do 96důlkových destiček s kulatým dnem spolu s uhličitanovým pufrem s hodnotou pH 9,6. Specifické protilátky se zjistí pomocí králičích protilátek antiIgG jako celku, anti-IgGl a anti-IgG2a. Výsledky se udávají jako odečtení optické hustoty (OD) při 492 nm. Hodnoty OD 3x větší než naměřené hodnoty v séru naivních myší se považují za pozitivní. Žádné protilátky anti-UreB se nenacházejí v séru myší imunizovaných samotným OM-294-DP. U myší, které byly imunizovány Ure+OM-294-DP se také vyvinuly protilátky celkového UreB IgG (OD = 0,274 ± 0,130, p<0,05) a anti-UreB IgGI (OD= 0,121 ±0,128, p<0,05) nevyvinuly se však protilátky anti-UreB IgG2a (OD = 0,008 + 0,005, nevýznamné).

U myší BALB/c imunizovaných podjednotkou ureázy B Heliobacter pylori nosním podáním (UreB)+OM-294-DP se vyvinula humorální odezva anti-UreB hlavně typu IgGI. OM-294-DP může proto působit jako adjuvant pri podávání nosní cestou a podporovat vývoj humorální imunity typu Th2.

12. OM-294—M a OM-294—DP v kombinaci s antigenem H1NI: Určení specifických protilátek vypěstovaných v myších po jednom nebo po dvou sub kután nich podání

Způsob

Účelem této studie je demonstrovat adjuvantní účinek OM-294-M a OM-294-DP na chřipkový antigen H1N1 (262195 A/B Beijing haemaglutinin, Solva Duphar, Weesp, Nizozemsko). Skupina 60 myší BALB/c(samice staré 8 týdnů na začátku ošetřování) se rozdělí do 6 skupin takto:

Skupina	1 .Antigen konečná koncentrace 2,5 ug na myš/injekci	Adjuvanly konečná koncentrace 50 pg na myš/injekci	NaCl (0.9%)	Injekto - */aný objem
A: NaCl	-		150 μΙ	150 μΙ
Β : H1N1	H1N1 (100 pl)		50 μΙ	150 μΐ
C: H1N1+ OM-294-MP	H1N1 (100 μί)	OM-294-MP (50 ul)	-	150 μΙ
D : H1N1 + OM-294-DP	H1N1 (100 μ!)	OM-294-MP (50 μΙ)	100 μΙ	150 μΙ
E : OM-294-MP	-	OM-284-MP (50JJl)	100 μΙ	150 μΐ
F: OM-294-DP	-	OM-284-DP (50 μΙ)	100 μΙ	150 μΙ

-38CZ 302062 B6

Antigen:

Zásobní roztok HINI se připraví v koncentraci 25 pg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného Adjuvanty:

Zásobní roztoky OM-294-DP a OM-294-MP se připraví v koncentraci l mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1 % triethanolaminu do OM-294-MP. Negativní kontrolou je 0,9% roztok chloridu sodného bez antigenu.

Směs antigen-adjuvant:

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20 minut při teplotě 37 °C. Přidá se antigen a roztok chloridu sodného (0,9%) jak uvedeno v tabulce a směs antigenu a adjuvantu se krátce vířivě míchá, načež se vnese do rotačního mísiče na 15 minut při teplotě místnosti, a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři minuty.

Imunizační režim:

Injekce se podají v den 0 a 14. Směsi uvedené v předchozí tabulce se podávají subkutánné (75 pl na místě a celkově 150 pl pro zvíře). Vzorky krve se odebírají 14. a 18. den (očnicové vpichy). Test imunoglobulinů anti-HINl:

Duplicitně se způsobem ELISA zkoušejí následující imunoglobuliny v séru, které jsou specificky zaměřeny na HlNLIgGl, IG2a a IgM. Mikrotitrační destičky (NUNC lmmunoplate, Roskilde, Dánsko) se inkubují (povlak přes noc) při teplotě 4 °C se 100 μί H1N1 (0,5 pg) v natři umhydrogenuhliČitanovém pufru o hodnotě pH 9,6. Po promytí 0,5% Tween-20 (Merck Hohenbrunn, Německo) se séra zředí 50x, 200x a 800x (ředicí roztok: fosfátem pufrovaná solanka (PBS) + 1 % albuminu hovězího séra (BSA Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.) + 0,02% Tween-20)). Do důlků se vnese 100 pl každého vzorku rozředěného séra. Inkubace při teplotě 37 °C trvá 45 minut.

Po druhém promytí se IgGl, IgG2a a IgM specificky zaměřené na HINI inkubují 30 minut při teplotě 37 °C spolu se 100 pl protilátek anti-IgGl (konjugát anti-myší krysí protilátka-peroxidáza) (Serotex, Oxford, UK), konjugát IgG2a-peroxydázy (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a.) a konjugát IgM-biotin (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a.), zředěný) předem pufrem PBS/BSA/Tween (250-, 1000-, 500-násobné zředění). Pro IgM je po mimořádném promytí potřebná třetí inkubace (30 min, při 37 °C) 1:100 zředěným roztokem konjugátu streptavidinperoxydáza (Dako, Glostrup, Dánsko).

Po promytí se přidá 100 pl roztoku feny len-1,2-d iam inu (OPD, Merck, Darmstadt, Německo) k detekci sekundárních speroxidázou kopulovaných protilátek anti-IgGl a anti-IgG2, zatímco pro IgM je použitým reakčním činidlem 3',3',5 ',5'-tetramethylbenzidin (TBM, Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Po 20 minutové inkubační prodlevě při teplotě místnosti se reakce ukončí přísadou 100 pl 2N kyseliny sírové. Hodnoty absorbance se odečtou při 490 nm destičkovým čtecím zařízením Bio-Rad 3550.

Výsledky

Výsledky každého odečtení při 490 nm jsou dány ve smluvních jednotkách (A.U.) na ml. Každý vzorek se porovnává se standardem připraveným z proměnných zředění lázně vzorku shromážděné ze skupiny B (zvířata injektovaná pouze H1N1) 28. dne. Lázní vzorkuje SOnásobný roztok o koncentraci 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky se pak korigují na odpovídající násobek zředění

-39CZ 302062 B6 (50 200 nebo 800x). Uvádějí se pouze střední hodnoty každé skupiny a směrodatná odchylka (SD).

Tabulka (a)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti H1N1 podtřídy IgGl (dohodnuté jednotky/ml± směrodatná odchylka, '* p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCl	3+5 ¹	0+0
B:H1N1	11161+5755	53950±23403
C : H1N1 + OM-294-MP	34411+13719-	228467**+109123
D : H1N1 + OM-294-DP	30101+19061	382325**+201314
Ε : OM-294-MP	69+34	59+31
F: OM-294-DP	59+21	38+25

Tabulka (b)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti H1N1 podtřídy IgG2a (dohodnuté jednotky/ml ± směrodatná odchylka, p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	₍Den 28
A: NaCl	0+0	0+0
B:H1N1 - I	26883+20779	50352+30846
C:H1N1 + OM-294-MF	179344**+139781	1622722**+986195
D : H1N1 + OM-294-DP	103630+96257	681441+1072710
Ε : OM-294-MP	1619+743	1767+1034
F ; OM-294-DP	452+584	782+857

Tabulka (c)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti H1N1 podtřídy IgM (dohodnuté jednotky/ml ± směrodatná odchylka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	i Den 14	Den 28
A: NaCl	22102+5862	21531+3693
Β:H1N1	37787+15001	57306+26886
C:H1N1 +OM-294-MP	67936**+21334	95108+38669
D : H1N1 +OM-294-DP	598100*+18324	92920+26971
Ε : OM-294-MP	19065+4069	18018+1016
F: OM-294-DP	20756+7160	20944+9065

-40CZ 302062 B6

Tyto výsledky ukazují, že adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP jsou aktivní ve zkoumaném modelu, jelikož významně zvyšují titr protilátek, specificky zvýšený oproti H1N2 u myší po jedné nebo dvou injekcích (obr. 22, 23, 24) nezávisle na uvažovaných podtřídách (IgGla, IgG2a a lhM).

13. OM-294-MP a OM-294-DP v kombinaci s ovalbuminovým antigenem: Určení specifických protilátek vzniklých v myších po jednom nebo po dvou subkutánních podáních Způsob

Tato studie má ukázat účinek adjuvantů OM-294-MP a OM-294-DP na ovalbuminový antigen (Fluka Chemie, Buchs, Švýcarsko). Rozdělí se 50 myší BALB/c (samice staré 8 týdnů na začátku ošetřování) do 5 následujících skupin:

Skupina	Ant igen konečná koncentrace 50 pg na myš/injekci	Adjuvanty konečná koncentrace 50 pg na myš/injekci	NaCÍ	Injekto- vaný objem
A: NaCI			150 μΙ	150 μΙ
B: Ova	Ova (100 pl)	-	50 μΙ	150 μΙ
C: Ova + OM-294-MP	Ova (100 μΙ)	OM-294-MP (50 μΙ)	-	150 μΐ
0 : Ova + OM-294-DP	Ova (100 pí)	OM-294-DP (50 μΙ)	-	150 μΐ
Ε: OM-294-MP	-	OM-294-MP (50 μΙ)	100 μΐ	150 μ)

Antigen:

Připraví se zásobní roztok ovalbuminu v koncentraci 0,5 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného.

Adjuvanty:

Zásobní roztoky OM-294-DP a OM-294-MP se připraví v koncentraci l mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1 % triethanolaminu do OM-294-MP. Negativní kontrolou je 0,9% roztok chloridu sodného bez antigenu,

Směs antigen-adjuvant:

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20 minut pri teplotě 37 °C. Přidá se antigen a roztok chloridu sodného (0,9%) jak uvedeno v tabulce a směs antigenu a adjuvantu se krátce vířivě míchá, načež se vnese do rotačního mísiče na 15 minut při teplotě místnosti, a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tri minuty.

Imunizační režim:

Injekce se podají v den 0 a 14. Směsi uvedené v předchozí tabulce se podávají subkutánně (75 μΐ na místě a celkově 150 μΐ pro zvíře). Vzorky krve se odebírají 14. a 18. den (očnicové vpichy). Test imunoglobulínů anti-ovalbuminu:

Duplicitně se způsobem ELISA zkoušejí následující imunoglobuliny v séru, které jsou specificky zaměřeny na ovalbumin: IgGl, IgG2a a IgM. Mikrotitrační destičky (NUNC Immunoplate,

-41 CZ 302062 B6

Koskilde, Dánsko) se inkubují (povlak přes noc) při teplotě 4 °C se 100 μΙ ovalbuminu (0,5 pg) v hydrogen uhličitanovém pufru o hodnotě pH 9,6. Po promytí 0,5% Tween-20 (Merck Hohenbrunn, Německo) se séra zředí 50x, 200x a 800x (ředicí roztok: fosfátem pufřovaná solanka (PBS) + 1 % albuminu hovězího sera (BSA Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.) + 0,02%

Tween-20)). Do důlků se vnese 100 pl každého vzorku rozředěného séra. Inkubace při teplotě °C trvá 45 minut.

Po druhém promytí se IgGl, IgG2a a IgM specificky zaměřené na albumin inkubují 30 minut při teplotě 37 °C spolu se 100 pl protilátek anti-IgGl (konjugát anti-myší krysí protilátka-peroxiio dáza) (Serotex, Oxford, UK), konjugát IgG2a-peroxídázy (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a.) a konjugát IgM-biotin (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a.), zředěný předem pufrem

PBS/BSA/Tween (250, 1000, 500násobné zředění). Pro IgM je po mimořádném promytí potřebná třetí inkubace (30 min. při 37 °C) 1:100 zředěným roztokem konjugátu streptavidinperoxydáza (Dako, Glostrup, Dánsko).

Po promytí se přidá 100 pl roztoku fenylen-l,2-diaminu (OPD, Merck, Darmstadt, Německo) k detekci sekundárních s peroxidázou kopulovaných protilátek anti-IgGl a anti-lgG2, zatímco pro IgM je použitým reakčním činidlem 3',3',5',5-tetramethylbenzidin (TBM, Sigma, St Louis, MO, Sp. st.a.). Po 20 minutové inkubační prodlevě při teplotě místnosti se reakce ukončí prísa20 dou 100 pl 2N kyseliny sírové.Hodnoty absorbance se odečtou při 490 nm destičkovým Čtecím zařízením Bio-Rad 3550.

Výsledky

Výsledky každého odečtení při 490 nm jsou udány ve smluvních jednotkách (A.U.) na ml. Každý vzorek se porovnává se standardem připraveným z proměnných zředění lázně vzorku shromážděné ze skupiny B (zvířata injektovaná pouze ovalbuminem) 28. dne. Lázní vzorkuje SOnásobný roztok o koncentraci 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky se pak korigují na odpovídající násobek zředění (50 200 nebo 800x). Uvádějí se pouze střední hodnoty každé skupiny a směrodatná odchylka (SD).

Tabulka (a)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti ovalbuminu podtřídy IgGl (dohodnuté jednotky/ml ± směrodatná odchylka, ’* p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A : NaCI	6+6	16+12
B: ova	728+589	47743+46294
C ; ova + OM-294-MP	4361 **+2513	284121 **+164822
D : ova + OM-294-DP	3240**+1794	277025**±173737
Ε : OM-294-MP	19+8	40+69

Tabulka (b)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti ovalbuminu podtřídy IgG2a (dohodnuté jednotky/ml ± směrodatná odchylka, * p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

-42CZ 302062 B6

Skupiny	Den 14	Den „38
A: NaCI	2996+898	5414+1554
8: ova	5201+1880	73162+107954
C : ova + OM-294-MP	9524+6809	625663*+681232
D : ova + OM-294-DP	18108**+14958	601434*+624166
E : OM-294-MP	11253+12169	4192+2104

Tabulka (c)

Imunogl obul iny specificky zvýšené oproti ovalbuminu podtřídy lgM (dohodnuté jednotky/ml 5 ± směrodatná odchylka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCI	14009+6158	12288+7136
B: ova	19423+13778	47998+34035
C : ova + OM-294-MP	21652+9524	38240+8822
D : ova + OM-294-DP	25762+10975	74399+119781
E : OM-294-MP	19742+5667	9827±2021

Tyto výsledky ukazují, že adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP jsou aktivní ve zkoumaném modelu, jelikož významně zvyšují titr protilátek, specificky zvýšený oproti ovalbuminu u myší po jedné nebo dvou injekcích (obr. 25, 26, 27) nezávisle na uvažovaných podtřídách (IgGla, to IgG2aaIgM).

14. OM-294—MP a OM-294-DP v kombinaci s antigenem TT (Tetanox toxoid): Určení specifických protilátek vzniklých v myších po jednom nebo dvou subkutánních podáních

Způsob

Tato studie má ukázat účinek adjuvantů OM-294-MP a OM-294-DP na TT antigen (Fluka Chemie, Buchs, Švýcarsko). Rozdělí se 50 myší BAKB/c (samice staré 8 týdnů na začátku ošetřování) do 5 následujících skupin:

Skupina	Ant igen konečná koncentrace 50 yg na myá/injekci	Adjuvanty konečná koncentrace 50 yg na myš/injekci	NaCI (0,9%)	Injekto* váný ob jeítt
A: NaCI	-		150 μΐ	150 μΙ
B:TT	TT(100 μΙ)	-	50 μΙ	150 μΐ
C : TT + OM-294-MP	TT(100 μ!)	OM-294-MP (50 μΙ)	-	150 μΙ
D : TT + OM-294-MP	TT(1OO μΙ)	OM-294-DP (50 μΙ)	-	150 μΙ

-43CZ 302062 B6

Antigen:

Připraví se zásobní roztok TT v koncentraci 0.2 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného. Adjuvanty:

Zásobní roztoky OM-294-DP a OM-294-MP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1 % triethanolaminu do OM-294-MP. Negativní kontrolou je 0,9% roztok chloridu sodného bez antigenu.

Směs antigen-adjuvant:

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20 minut pri teplotě 37 °C. Přidá se antigen a roztok chloridu sodného (0,9% jak uvedeno v tabulce a směs antigenu a adjuvantu se krátce vířivě míchá, načež se vnese do rotačního mísiče na 15 minut pri teplotě místnosti, a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři minuty.

Imunizační režim:

Injekce se podají v den 0 a 14. Směsi uvedené v předchozí tabulce se podávají subkutánně (75 μΐ na místě a celkově 150 μΐ pro zvíře). Vzorky krve se odebírají 14. a 18. den (očnicové vpichy). Test anti-TT imunoglobulinů:

Duplicitně se způsobem ELIS A zkoušejí následující imunoglobuliny v séru, které jsou specificky zaměřeny na TT: IgGl, lgG2a a lgM. Mikrotitrační destičky (NUNC Immunoplate, Roskílde, Dánsko) se inkubují (povlak přes noc) pri teplotě 4 °C se 100 μΐ TT (0,5 μg) v hydrogenuhličitanovém pufru o hodnotě pH 9,6. Po promytí 0,5% Tween-20 (Merck Hohenbrunn, Německo) se séra zředí 50x, 200x a 800x (ředicí roztok: fosfátem pufrovaná solanka (PBS) + 1 % albuminu hovězího sera (BSA Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.) + 0,02% Tween-20)). Do důlků se vnese 100 μΙ každého vzorku rozředěného séra. Inkubace pri teplotě 37 °C trvá 45 minut.

Po druhém promytí se IgGl, lgG2a a IgM, specificky zaměřené na TT, inkubují 30 minut při teplotě 37 °C spolu se 100 μΐ protilátek anti-IgGl (konjugát anti-myší krysí proti látka-peroxidáza) (Serotex, Oxford, UK), konjugát IgG2a-peroxydázy (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st, a.) a konjugát IgM-biotin (Pharmingen, San Diego, CA, Sp. st. a), zředěný předem pufrem PBS/BSA/Tween (250-, 1000-, 500-násobné zředění). Pro IgM je po mimořádném promytí potřebná třetí inkubace (30 min. při 37 °C) 1:100 zředěným roztokem konjugátu streptavidinperoxydáza (Dako, Glostrup, Dánsko).

Po promytí se přidá 100 μΙ roztoku feny len- 1,2-diaminu (OPD, Merck, Darmstadt, Německo) k detekci sekundárních speroxidázou kopulovaných protilátek anti-IgGl a anti-IgG2, zatímco pro IgM je použitým reakčním činidlem 3',3',5',5'-tetramethylbenzÍdin (TBM, Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Po 20 minutové inkubační prodlevě pří teplotě místnosti se reakce ukončí přísadou 100 μΙ 2N kyseliny sírové. Hodnoty absorbance se odečtou při 490 nm destičkovým čtecím zařízením Bio-Rad 3550.

Výsledky

Výsledky každého odečtení pri 490 nm jsou udány ve smluvních jednotkách (A.U.) na ml. Každý vzorek se porovnává se standardem připraveným z proměnných zředění lázně vzorku shromážděné ze skupiny B (zvířata injektovaná pouze TT) 28. dne. Lázní vzorku je 50násobný roztok o koncentraci 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky se pak korigují na odpovídající násobek zředění

-44CZ 302062 B6 (50 200 nebo 800x).Uvádějí se pouze střední hodnoty každé skupiny a směrodatná odchylka (SD).

Tabulka (a)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti TT podtřídy IgGl (dohodnuté jednotky/ml ± směrodatná odchylka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCI	1+2	0+1
B:TT	2871+1633	34367+15018
C : TT + OM-294-MP	8502**+2020	78506**+21660
D : TT + ΟΜ-294ΌΡ	11620*‘+2348	136463**+41025

io Tabulka (b)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti TT podtřídy IgG2a (dohodnuté jednotky/ml ± směrodatná odchylka, *’ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCI	351+506	536+1046
B : TT	2547+2539	61387+82269
C : TT + OM-294-MP	8869+6979	65881+46635
D : TT + OM-294-DP	21969**+25067	148365±134196

Tabulka (c)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti TT podtřídy IgM (dohodnuté jednotky/ml + směrodatná odchylka, “ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny Den 14 Den 28

A: HaCl i TT

Ci TT + OM-294-MP

D: TT + Ott-294-DF standard 9 zvířat <25 1 zvíře <50 9 zvířat <25 1 zvíře >1600 zvířat <25 zvíře <200 zvířata >1600 standard IO zvířat <25 zvířat <25 zvíře <100 zvířata >1600 10 zvířat <25

-45 CZ 302062 B6

Tyto výsledky ukazují, že adjuvanty OM-294-MP a OM-294—DP jsou aktivní ve zkoumaném modelu, jelikož významně zvyšují titr protilátek, specificky zvýšený oproti TT u myší po jedné nebo dvou injekcích (obr. 28, 29). Na rozdíl od toho pouze několik zvířat produkovalo IgM specifický pro TT.

15. Vyhodnocení adjuvantních vlastností OM-248-MP v imunizačním modelu myší CBA subkutánním podáváním antigenů Leishmania gp63

Myším CBA se podává gp63 dvěma subkutánními injekcemi do ocasu v dávce 2 pg v 8 denních io intervalech. Adjuvant OM-248-MP se smísí s oběma dávkami antigenů. BCG se smísí pouze s první dávkou. Každé myši se podá 2x 50 pg OM-248-MP nebo 200 pg BCG. Kontrolní skupina se injektuje antigenem samotným (bez adjuvantu). Deset dní po druhé injekci se buňky inguinálních a periaortických mízních uzlin (skupiny po 3 myších) kultivují a protiferační odezva na vyčištěný antigen gp63 se zkoumá měřením absorpce thymidinu (³H—TdR). In vitro produkce is cytokinu jako gama IFN a IL-4 sekretovaného lymfocyty lymfatické uzliny vyvolaná in vitro gp63 antigenem se také stanovuje způsobem ELISA (MIF 100 IFN a kity M4000 IL-4, R&D

Systems, Europe Ltd., Abingdon, UK) v každém vzorku supematantu lymfocytové kultury mízní uzliny před přidáním ³H-TdR.

Hodnoty uvedené v tabulkách pro absorpci ³H-TdR jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka (trojmo) vyjádřeným v cpm a hodnoty týkající se cytokinu v supernatantech odpovídají aritmetickému průměru ± směrodatná odchylka (trojmo) vyjádřenému v pg/ml.

Antigen:

Připraví se zásobní roztok gp63 v koncentraci 40 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného. Adjuvanty:

Zásobní roztok OM-294-MP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1 % triethanolaminu do OM-294-MP. Negativní kontrolou je PBS roztok bez antigenů.

Směs antigen-adjuvant:

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20 minut při teplotě 37 °C. Přidá se antigen (1 objem) a adjuvant (1 objem), vířivě se krátce míchá před inkubací 20 minut při teplotě 37 °C a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři minuty.

Výsledky

V myších imunizovaných antigenem gp63 vyvolává adjuvant OM-249-MP lepší odezvu lymfocytové proliferace (tabulka (a) a obr. 30 (a)). Skutečně vzhledem ke kulturám ze zvířat, která byla imunizována bez adjuvantu, je nárůst míry proliferace 3,1 až ónásobek pro produkt OM—249— MP, zatímco nepřesahuje 3,5-násobku pro BGG (2,6 až 3,5).

V takových lymfocytových kulturách se produkce cytokinu měří v supematantu (tabulka (b) a obr. 30(b)). Je patrno, že antigen gp63 vyvolává sekreci gama IFN v množstvích ekvivalentních u myší ošetřených OM-249-MP nebo BSG jako adjuvantem. Na rozdíl podstatných množství IL-4 imunitními lymfocyty (anti-gp63), zatímco lymfocyty myší ošetřených BCG vylučují menší nebo dokonce nezjistitelná množství uvedeného cytokinu.

-46CZ 302062 B6

Tabulka (a)

Účinek adjuvantu OM-249-MP na imunitní odezvu proti antigenu gp63, měřený proliferaci myšího lymfocytů T jako odezvy na antigen gp63 in vitro

gp63 in vitro (pg/ml) .	Bez ad juvantu (cpm x 10‘³/ml)	OM-294-MP (cpm x 10³/ml)	BCG (cpm x 10'³/ml)
0	1,4+0,4	2,8+0,7	5,3+1,1
0,16	18+5	65+11	47+9
0,31	17+5	92+11	57+17
0,62	16+4	93+13	54+13
1,25	13+2	39+7	44+9

Hodnoty uvedené v tabulce (a) jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka (trojité kultury).

io Tabulka (b)

Účinek adjuvantu OM-249-MP podávaného in vitro společně s antigenem gp63 na produkci in vitro cytokinů lymfocyty lymfatických uzlin

γ IFN koncentrace (pg/ml)
gp63 in vitro	bez adjuvantu	294-MP	BCG
0	<9	<9	27
0,3	78	135	200
oj	38	120	105
IL-4 koncentrace (pg/ml)
gp63 in vitro	Bez adjuvantu	294-MP	BCG
0	<8	<8	<8
0,3	< 15	125	15
OJ	<8	83	<8

Adjuvant OM-249-MP zvyšuje specifickou odezvu T in vitro v myších CBA, které byly imunizovány gp63 (amfofilním antigenem parazitu Leishnmania) jak zjištěno proliferaci lymfocytů a antigenem vyvolené produkce gama IFN a IL-4.

16. Účinnost adjuvantu OM-249-MP během anti-LmCPb T-primámí odezvy v imunizačním modelu založeném na myších CBA při subkutánním podání antigenu Leishmania mexicana LmCPb.

Způsob

Myším CBA se podává jedinou injekcí do ocasu LmCVPb v dávce 2 pg buď v kombinaci s 50 pg adjuvantu OM-249-MP nebo bez ní. Kontrolní skupině se podá jedna injekce fyziologického solankového pufru (neimunízované subjekty). Po 11 dnech se inguinální a periaortické lymfatické uzliny (skupiny po třech myších) kultivují a vyhodnocuje se odezva vůči vyčištěnému antigenu LmCPb, vůči přípravě úplných amastigotů Leishmania mexicana a vůči concanvalinu A

-47 CZ 302062 B6 (Con A) měřením absorpce tritiovaného thymidinu (³H-TdR), Rovněž se způsobem ELISA stanoví produkce cytokinu gama IFN a IL—4 lymfocyty lymfatických uzlin vyvolaná in vitro antigenem LmCPb Leishmania mexicana nebo amastigoty (kity MIFPP gamalFN & M4000 OL—1, R&D Systems Europe Ltd. Abington, UK) za použití vzorku supematantu lymfocytů lymfatických uzlin každé kultury před přidáním ³H-TdR.

Hodnoty, uvedené v tabulkách pro absorpci H-TdR. jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka (trojmo) vyjádřeným v cpm a hodnoty týkající se cytokinů v supematantu odpovídají aritmetickému středu ± směrodatná odchylka (trojmo) vyjádřenému v pg/ml pro produkci cytoio kinu v supematantech.

Antigen:

Připraví se zásobní roztok LmCPb v koncentraci 40 mg/ml v PBS (2X)

Adjuvanty:

Zásobní roztok OM-294-MP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1 % triethanolaminu do OM-294-MP. Negativní kontrolou je PBS roztok bez antigenu.

Směs antigen—adjuvant:

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 10 minut pri teplotě 37 °C. Přidá se antigen (I objem) a adjuvant (1 objem), vířivě se krátce míchá před inkubací 20 minut při teplotě

37 °C a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři minuty.

Výsledky

V nepřítomnosti jakéhokoli stimulu v kultivačním mediu podporuje adjuvant OM-249-MP vývoj 30 lymfocytů, který podléhá spontánní proliferaci (tabulka (a) a obr. 30 (a)) a sekretuje stopová množství gama IFN (tabulka b), obr. 31(b)). Tato reakce se silně podpoří přidáním do kultur vyčištěného antigenu LmCPb nebo extrakt plného parazitu. V tomto pokusu je patrné, že adjuvant vykonává zřetelný vliv na indukci senzibilizovaných lymfocytů (anti-LmCPb) schopných sekrece podstatných množství IL—4 (Tabulka (b) a obr. 31 (b)).

Tabulka (a) Proliferativní odezva buněk lymfatických uzlin in vitro, imunizovaných in vivo působením LmVP: účinek adjuvantu OM-249-MP

	³H-TdR (cpm x 10‘³/ml)
Antigen in vitro	Me imun i - sovaný	Bez adjuvantu	OM-294-MP
stimuiantu	0,9+0,3	2,2+0,7	11+2
LmCPb 0,6 pg/ml	0,8+0,4	1,7+0/	19±4
LmCPb 1,7 pg/ml	0,9+0/	4,6+1,6	40+4
LmCPb 5 pg/ml	1,3±0,8	7,2+0,6	80+5
LmCPb 15 pg/ml	2,6+0,4	16,2+2,1	140+10
Amastigoty 1,9x10'® /ml	0,8+0,2	1,7+0,1 .	44+7
Amastigoty. 6x10*® /ml	1,5+0,2	4,6+0,6	79+6
Amastigoty 17 x 10“⁶ /ml	2,9+0,6	7,2+0-6	119+4
Con A 5 pg/ml	123+33	193+17	196+10

-48CZ 302062 B6

Tabulka (b)

Sekrece in vitro cytokinů lymfocyty lymfatických uzlin imunizovaných in vivo LmCP. Účinek adjuvantu OM-249-MP na primární odezvu

Produkce gama IFN C pg/ml)
Stimulant in vitro Neimunizovaný	Bez adjuvantu	0M-249-MP
žádný· stimulant <9	<9	25
LmCPb 15 jLtg/ml <9	46	480
amastigoty 17 x lO'^s/ttl <9	95	320
Con A 5 jug/ml >1300	>1800	>1800
Produkce IL-4 (pg/ml)
Stimulant in vitro Neimunizovaný	Bez adjuvantu	Oft-249-MP
žádná konkurence <8	<3	<3
LmCPb 15 Aig/ml <8	<3	130
amastigoty 17 x 10'^s/ml <3	<3	65
Con A 5 jug/ml 92	190	360

Adjuvant OM-249-MP je také velmi účinný během primární odezvy T (po jediné injekci vakcíny). Vlastnosti účinku adjuvantu na tuto odezvu (zvýšení proliferace lymfocytů, indukce produkce cytokinů) jsou podobné vlastnostem pozorovaným během odezvy na injekce vakcíny.

17. Vyhodnocení vlastností adjuvantů OM-249-MP a OM-249-DP v myším CBA imunizačním modelu subkutánním podáním antigenu LmCPb Leishmania mexicana: porovnání s BCG Způsob

Myším CBA (8 myší ve skupině) se podává 2 subkutánními injekcemi do ocasu 3 až 5 pg LmCVPb v 8denních intervalech. Adjuvanty OM-249-MP a OM-249-DP se smísí s oběma dávkami antigenu, zatímco BCG se smísí pouze s první dávkou. Každá myš dostane 2x50 μg BCG. 8 dní po poslední injekci se inguinální a periaortické lymfatické uzliny (skupiny po třech myších) odejmou a buňky se kultivují ke zkoumání proliferativní odezvy na vyčištění antigen LmCPb, nebo popřípadě na proliferativní odezvy vůči prostředku anastigotů Leishmania mexicana jako celku nebo Concanavalinu A (Con A). Proliferativní odezva se vyhodnocuje měřením absorpce tritio váného thymidinu (³H-TdR). Produkce cytokinů gama IFN a IL-4 lymfocyty lymfatických uzlin vyvolává in vitro antigenem LmCPb Leishmania mexicana nebo amastigoty se stanoví

-49CZ 302062 B6 způsobem ELISA (kity M1FPP gama IFN & M4000 OL-4, R&D Systems Europe Ltd. Abington, UK) za použití vzorku supematantu lymfocytů lymfatických uzlin každé kultury před přidáním ³H-TdR.

Hodnoty uvedené v tabulkách jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka vyjádřeným v procentech standardu vůči proti látkové mu titru, aritmetickým středem ± směrodatná odchylka (trojmo) vyjádřené v cpm pro absorpci ³H-TdR a aritmetickým středemisměrodatná odchylka (trojmo) vyjádřeným v pg/ml pro produkci cytokinu.

io Antigen:

Připraví se zásobní roztok LmCPb v koncentraci 60 až 100 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného.

Adjuvanty:

Zásobní roztoky OM-294-MP a OM-249-DP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k tnjektování s přísadou 0,1 % triethanolaminu do OM-249-MP. Negativní kontrolou je roztok PBS bez antigenu.

Směs antigen—adjuvant:

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 10 minut pri teplotě 37 °C. Přidá se antigen (1 objem) a adjuvant (1 objem), vířivě se krátce míchá před inkubací 20 minut při teplotě

37 °C a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tri minuty.

Výsledky

V myších imunizovaných antigenem LmCPb (tabulka (a) a (b), obr. 32 (a) a (b) vyvolávají produkty OM-249-MP a OM-249-DP podobný účinek jako pozorovaný u myší, které vyvíjejí imunitní odezvu vůči gp63. Proto v přítomnosti LmCPb (15 pg/ml) je míra proliferace kultur odvozených od myší, které byly imunizovány antigenem plus adjuvantem OM-249-MP 23x vyšší a antigenem plus adjuvantem OM-249-DP je 28x vyšší než kultury pocházející od myší, kterým byl podáván antigen samotný (bez adjuvantu). Dopad BCG v těchto podmínkách je menší, jelikož nárůst proliferace je pouze 11—násobný. Obdobné jevy jsou patrny u kultur nabuzených vyčištěným antigenem nebo úplným extraktem parazitu Leishmania a pro všechny testované koncentrace antigenu.

Produkce gamalFN jako odezva na antigen LmCPb má sklon být o málo vyšší s produktem

OM-249-DP než s BCG (tabulka (b) a obr. 32(b)). Je třeba připomenout, že v tomto pokusu lymfocyty proliferují a sekretují podstatná množství gama IFN i když antigen nemusel být přidán do kultivačního media. V tomto případě, se adjuvant OM-249-DP jeví jako poněkud účinnější než BCG. Zřetelný rozdíl mezi adjuvanty OM-249-MP, OM-249-DP a BCG je zřejmý, jak shora uvedeno, z hlediska vývoje lymfocytů schopných produkovat IL-4. Množství produkova45 ného IL-4 vlivem působení adjuvantů OM-249-MP a OM-249-DP je významné, jelikož souvisí s množstvím sekretovaným lymfocyty vystavenými účinku Con A, což je mocný, nespecifický stimulant lymfocytů (tabulka (a) a (b)).

-50CZ 302062 B6

Tabulka (a))

Proliterativní odezva in vitro buněk lymfatických uzlin odvozených z myší imunizovaných 5 in vivo působením LmVP: vliv různých adjuvantů

	’Η-TdR I	'cpm x 10'³/ml)
in vitro stimulant	Bez adjuvantu	OM-294-DP	OM-294-MP	BCG
b# stimulant u	1,7+0,6	21,8+2,2	17,1+2,5	18,6+4,8
LmCPb 0,6 pg/ml	0,8+03	40,9+12,7	22,9+2,8	19,0+7,4
LmCPb 1,7 pg/ml	2,4±0,1	57,2+10,9	34,1+4,1	39,8+5,7
LmCPb 5 pg/ml	2,8±0,6	70,2+9,2	70,3+6,4	44,0+10,4
LmCPb 15 pg/ml	4,3+0,1	100,0+6,5	124,2+13-0	46,2+03
Amastigot· 2x 10*/ml	2,4+0,6	61,0+1,7	28,4+8,3	24,4±4,3
Amastigot 6x10* /ml	2,3+0,7	81,5+5,5	66,1+4,5	23,6+2,5
Amastigot 17x10*/ml	1,7+0,4	78,2+73	68,7+23	23,4+4,0
Con A 5 pg/ml	188.1+21.0	135,9+3,7	151,4+3,7	119,7+28_?5

Hodnoty uvedené v tabulce jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka vyjádřeným absorpci indikátoru (trojité kultury)

-51 CZ 302062 B6

Tabulka (b)

Produkce in vitro cytokinů lymfocyty lymfatických uzlin imunizovaných in vivo LmCPb antige5 nem: vliv různých adjuvantů odezvu

Koncentrace gama IFN (pg/ml)

Stlmulant in vitro	Bez adjuvantu	0M-249-MP	OM-249-MP	BCG
žádný· stímulant	<9	460	240	230
LmCPb 15 pg/ml	44	520	360	460
aaast ígoty l?xlO‘^s,	/ml 14	>600	>600	430
Con A 5 pg/ml	1200	1200	1900	>3000
	Koncentrace lb	-4 <pg/ml)
Stioulant in vitro	Sez adjuvantu	OM-249-MP	OM-249-MP	BCG

žádný stimulant	<15	<8	<3	<3
LmCPb 15 pg/ml	<15	1 tc	83	26
aaast ígoty l?xlO’⁵/atl	<8	130	110	29
Con A 5 ng/ml	40	230	35	105

Adjuvanty OM—249-MP a OM-249-DP působí účinně na imunitní odezvu proti rozpustnému 10 antigenů peoteázy Leishmania mCPb. Projevuje se to in vitro nárůstem proliferativní odezvy následované indukcí produkce gama IFN a IL-4 ve významných množstvích.

Příklad 7

Vodný roztok k injektování

Sloučenina přikladu III Polysorbát 30 chlorid sodný destilovaná voda k injektování i . O g O, 2 g 9, O g 1000 »1

-52 CZ 302062 B6

Hodnota pH roztoku se nastaví na 7,5 O,1M kyselinou chlorovodíkovou a roztok se sterilizuje membránovou Filtrací na membráně 0,22 pm Steritop Express 1000 (membrána PES, 90 mM, SCGP T10 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, Sp. st. a.). Sterilním roztokem se plní ampuíe po 1 ml,

Lyofilizovaný produkt

sloučenina příkladu 4	2,0	g
PolysorbAt 30	0,2	a
chlorid sodný	9, O	9
marini tol	10,0	9
kyselína askorbová	O, 1	9
destilovaná voda k injektovAnf	1OOO ml

Hodnota pH roztoku se nastaví na 7,4 0,lM kyselinou chlorovodíkovou a roztok se sterilizuje membránovou filtrací na membráně 0,22 pm Steritop Express 1000 (membrána PES, 90 mm, SCGP T10 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, Sp. st. a.). Sterilním roztokem se plní vícedávkové lélpvly v množství 1 ml na lékovku a suší se vymrazováním.

Průmyslová využitelnost

Sloučenina podobná N-acyl-dipeptidu vhodná pro výrobu léčiv zejména proti nádorovým onemocněním.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Derivát N-acyldipeptidu obecného vzorce I

X-O-CCtfe )n-CONH-CCH2 >p-CH-CCH₂)_Q-O-Y CI),

I 1

NHRi NHR₂ kde znamená

R_t a R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acylthioskupinu a alkylthioskupinu vždy s l až 24 atomy uhlíku, m 1 až 4, n 0, p 3 nebo 4, q 1,

-53 CZ 302062 B6

X a Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu, přičemž znamená alespoň jeden substituent X a Y fosfonoskupinu,

2. Derivát N-acyld i peptidu obecného vzorce 1 podle nároku 1, jehož alespoň jedna fosfonoskupinaje převedena na svoji sůl minerální nebo organickou zásadou.

to

3* Derivát N-acyld i peptidu obecného vzorce i podle nároku 1 nebo 2, kterým je 1-dihydrogenfosfát nebo 10-dihydrogenfosfát 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoyIamino)-9-(3-hydroxy-tetradekanoylamino)—

4-oxo-5-azadekan-l,10-diolu ajeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

15 4. Derivát N—acyldipeptidu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kterým je 1,10—bis(dihydrogenfosfát) 3-(3-dodekanoyIoxytetradekanoylamino)-9-(3-hydtroxytetradekanoylamino)4—oxo-5-azadekan-l,10-diolu ajeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

5 a jeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami podle nároku 1 až 8, vyznačující se tím, že se aminoskupiny v nekoncové poloze (q+1) a v koncové poloze omega diaminokyseliny obecného vzorce io H₂N4CH₂)p-<HNH_r-(CH₂)_q__l-COOH blokují blokovacím činidlem, které snadno podléhá acidolýze a hydrogenolýze, uvolněná karboxy lová skupina se nechává reagovat s redukčním činidlem za získání odpovídajícího alkoholu, nekoncová aminoskupina v poloze (q+1) se uvolňuje, acyluje se funkčním derivátem karboxy15 lové kyseliny obecného vzorce R₂OH, kde R₂ má shora uvedený význam, načež se koncová aminoskupina v poloze omega uvolňuje hydrogenolýzou za získání aminoalkoholu obecného vzorce II

H2N-CCH2 >_p-CH-CCH2 >qOH CII>,

I

NHRa kde znamená

R₂ acy lovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů shora uvedených,

25 p znamená 3 nebo 4 a q h diaminoalkohol se kondenzuje v přítomnosti peptidového kondenzačního činidla v inertním roz30 pouštědle s funkčním derivátem omega-hydroxyaminokyseliny obecného vzorce III

X-O-CCH2 >ru-CH-CCH2 >nC0QH (III>,

I

NHRi kde znamená

Ri acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým 35 nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů shora uvedených v nároku 1, m 1 až 4,

40 n 0,

X dialkyloxyfosforylovou nebo d i ary loxy fosfory lovou obecného vzorce <R0>2PO

-55CZ 302062 B6 kde znamená R hydrogenolýzou od štěpíte lnou skupinu, za vytvoření pseudopeptidu obecného vzorce IV <RO>2PO-CCH2)m-CH-<CH2>n-CONH-<Cffe )_P-CH-CCH₂ >a”0H CIV), •l· I I □ NHRi NHR2 kde R|, R₂, n, m, p a q mají v nároku 1 uvedený význam a R znamená hydrogenolýzou odštěpitelnou alkylovou nebo arylovou skupinu, jehož další alkoholová skupina se popřípadě fosforyluje fosforylačním prostředkem popřípadě v přítomnosti kopulačního prostředku, na Čemž se jednak podrobuje katalytické hydrogenaci k deblokování alkoholové skupiny obsažené eventuálně na acylové skupině R₂, a jednak se uvolňuje fosfátová skupina a následně se hydrogenolýzou popřípadě obsažená fosfátová skupina deblokuje za získání sloučeniny obecného vzorce V <HCO₂P0-CCH₂ >m-CH-CCH₂ >n-C0NH-CCřfe >_P-CH-CCH₂ >c,-0Y

Ψ 1 I a NHRi HHR2 kde znamená Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu a R], R₂, m, n, p a q mají v nároku 1 uvedený význam, a produkt se popřípadě převádí na adiční sůl minerálními nebo organickými zásadami.

5. Derivát N-acyld i peptidu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kterým je 1,10-bis(di20 hydrogen fosfát) 3-(3-hydroxytetradekanoylamino)—9—(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)4—oxo-5-azadekan-l,10-diolu ajeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

5 ajeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

6. Derivát N—acyldipeptidu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kterým je 1-dihydrogenfosfát 3-{3-dodekanoyloxytetradekanovlamino)-9-(3-hydroxytetradekanoylamino)-4-oxo-525 azadekan-1,10—diolu ajeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

7. Derivát N-acyld i peptidu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kterým je l-dihydrogenfosfát 3 -{3-hydroxytetradekanoylamino)-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4-oxo-5azadekan-1,10—diolu ajeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

8. Derivát N-acyld ipeptidu obecného vzorce l podle nároku 1 nebo 2, kterým je 10—dihydrogenfosfát 3-(3-hydroxytetradekanoylamino)-

9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4oxo—5-azadekan— 1,10-diolu ajeho adiční soli s minerálními nebo s organickými zásadami.

35 9. Způsob přípravy derivátu N-acyld i peptidu obecného vzorce I podle nároku 1

X-O-CCHa >m-CH-CCHz )n-C0NH-CCH2 )p-CH-CCH₂ )<,-O-Y Cl).

MHRi NHR₂ kde znamená

Ri a R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s pří40 mým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupínu, acylaminoskupinu, acy lth ioskupinu a alkylthioskupinu vždy s 1 až 24 atomy uhlíku,

45 m 1 až 4, n 0, p 3 nebo 4, q b

- 54CZ 302062 B6

10. Meziprodukt pro přípravu derivátu N-acyldipeptidu obecného vzorce I podle nároku 1, kterým je derivát omegahydroxyaminokyseliny obecného vzorce III

X-O-CCHz)_m-CH-CCH₂JnCOOH Clil),

I

NHRi kde znamená

Ri acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahujejeden nebo několik substituentů uvedených v nároku 1, m celé číslo 1 až 4, n celé Číslo 0,

X dialkyloxyfosforylovou nebo d i ary loxy fosfory lovou obecného vzorce <R0)₂Po

-56CZ 302062 B6

11. Meziprodukt pro přípravu derivátu N-acyldipeptidu obecného vzorce I podle nároku 1, kterým je dipeptid obecného vzorce IV

CR0Ž2P0-CCH2 )m~CH-CCH₂ >_n-C0NH-<CřÍ2 )p-CH-CCHz Χ,-ΟΗ < IV) , l·

O NHRi NHR2 kde R], R₂, m,n,paq mají v nároku 1 uvedený význam, a R znamená hydrogenolýzou odštěpi5 telnou alkylovou nebo arylovou skupinu.

12. Meziprodukt pro přípravu derivátu N-acyldipeptidu obecného vzorce I podle nároku 1, kterým je aminoalkohol obecného vzorce II

HaN-CCHa >_P-CH-<CH₂ )_qOH Cil).

i

NHRa io kde znamená

R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů uvedených v nároku 1, p 3 nebo 4 a q 1.

20

13. Imunologický farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku alespoň jeden derivát N-acyldipeptidu obecného vzorce I

X-0-CCH2>m-CH-<CH₂)n-CONH-CCH2)_P-CH-CCH₂)q-0-Y Cl),

NHRi NHRz kde znamená

25 R| a R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acy loxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acylthioskupinu a alkylthioskupínu vždy s 1 až 24 atomy uhlíku, m 1 až 4, n 0,

35 p 3 nebo 4, q h

X a Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu v neutrální formě nebo ve formě soli, přičemž znamená

40 alespoň jeden substituent X a Y znamená fosfonoskupinu, spolu nebo ve směsi s netoxickým, farmaceuticky přijatelným inertním nosičem nebo excipientem.

-57CZ 302062 B6

14. Imunologický farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku derivát N-acyldipeptidu obecného vzorce 1, kde znamená X a/nebo Y fosfonoskupinu, a ostatní symboly mají v nároku 1 uvedený význam.

15. Imunologický farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou látku ve formě soli s minerální nebo s organickou zásadou přijatelnou pro terapeutické účely.

io

16. Imunologický farmaceutický prostředek podle nároků 13 a 15, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou látku ve formě čistého enantiomeru nebo ve formě směsi stereoizomerů.