PL195764B1

PL195764B1 - Pseudodipeptydy N-acylowe, sposoby wytwarzania pseudodipeptydów N-acylowych i kompozycje farmaceutyczne

Info

Publication number: PL195764B1
Application number: PL99345040A
Authority: PL
Inventors: Jacques Bauer; Olivier Richard Martin
Original assignee: Om Pharma
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2007-10-31
Also published as: HUP0102475A2; HUP0102475A3; EP1091928A1; CA2337807C; CN1306504A; US20060148678A1; AU4284899A; EE04489B1; DK1091928T3; RU2223262C2; EP1091928B1; ES2284275T3; TWI255808B; CZ20004893A3; AR029877A1; BR9911329A; KR20010083078A; PL345040A1; DE69935330D1; US7157092B1

Abstract

1. Pseudodipeptydy N-acylowe o wzorze ogólnym I: w którym kazdy R 1 i R 2 oznacza grupe acylowa pochodzaca od kwasu karboksylowego zawierajacego od 2 do 24 atomów wegla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgalezionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo wiecej niz jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmujacej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupe aminowa, grupe acyloaminowa, grupe acylotio i grupe (C 1-C 24)alkilotio, m, p i q oznaczaja liczby calkowite od 1 do 10, n oznacza liczbe calkowita od 0 do 10, kazdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupe kwasowa wybrana z grupy obejmujacej: - karboksy[(C 1-C 5)alkil], - CH-[(CH 2) mCOOH][(CH 2) nCOOH], gdzie m = 0 do 5, a n = 0 do 5, - fosfono[(C 1-C 5)alkil], - dihydroksyfosforyloksy[(C 1-C 5)alkil], - dimetoksyfosforyl, - grupe fosfonowa, - hydroksysulfonyl, - hydroksysulfonylo[(C 1-C 5)alkil], - hydroksysulfonyloksy[(C 1-C 5)alkil] w postaci obojetnej albo naladowanej, z tym ograniczeniem, ze co najmniej jeden z podstawników X i Y ma okreslona jak wyzej grupe kwasowa w postaci obojet- nej albo naladowanej, a A i B oznaczaja niezaleznie od siebie atom tlenu, atom siarki albo grupe iminowa -NH-. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pseudodipeptydy N-acylowe, sposoby wytwarzania pseudodipeptydów N-acylowych i kompozycje farmaceutyczne zawierające pseudodipeptydy N-acylowe.

Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny chemii, a zwłaszcza dziedziny chemii medycznej, dokładniej pseudodipeptydów pochodzących od hydroksyaminokwasów, w których wolne aminowe grupy funkcyjne są zamidowane przez kwasy tłuszczowe.

Przedmiotem wynalazku są pseudodipeptydy N-acylowe o wzorze ogólnym I:

X-A-(CH₂)mCH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH₂)_q-B-Y (I)

I I

NHRi NHR₂ w którym każdy R1 iR2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)-alkilotio, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę kwasową wybraną z grupy obejmującej:

- karboksy[(C1-C5)alkil],

- CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH], gdziem=0do5,an=0do5,

- fosfono[(C1-C5)alkil],

- dihydroksyfosforyloksy[(C1-C5)alkil],

- dimetoksyfosforyl,

- grupę fosfonową,

- hydroksysulfonyl,

- hydroksysulfonylo[(C1-C5)alkil],

- hydroksysulfonyloksy[(C1-C5)alkil] w postaci obojętnej albo naładowanej, z tym ograniczeniem, że co najmniej jeden z podstawników X i Y ma określoną jak wyżej grupę kwasową w postaci obojętnej albo naładowanej, a

A i B oznaczają niezależnie od siebie atom tlenu, atom siarki albo grupę iminową -NH-.

Korzystnie X i/lub Y oznaczają grupę kwasową przeprowadzoną w postać soli przy użyciu zasady nieorganicznej albo organicznej, zwłaszcza do zastosowania terapeutycznego.

Korzystnie związki zawierają elementy o konfiguracji R albo S, albo elementy racemiczne.

Korzystnie przedmiotem wynalazku są związki o wzorze ogólnym I':

X-O-(CH₂)mCH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH₂)_q-O-Y (1' )

I I

NHRi NHR₂ w którym każdy R1 iR2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)alkilotio, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, a każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę fosfonową.

Korzystnie związkiem jest 1- i/lub 10-diwodorofosforan 3-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną.

PL 195 764 B1

Korzystnie związkiem jest 1,10-bis(diwodorofosforan) 3-(3-dodekanoiloksy-tetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną.

Korzystnie związkiem jest 1,10-bis(diwodorofosforan) 3-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-9-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną.

Korzystnie związkiem jest mono-1-diwodorofosforan 3-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną.

Korzystnie związkiem jest mono-1-diwodorofosforan 3-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-9-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania pseudodipeptydów określonych powyżej o wzorze ogólnym I:

X-A-(CH₂)_mCH-(CH2)n-CO-NH-(CH₂)p-CH-(CH2)q-B-Y (I)

I I

NHR! NHR₂ w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)-alkilotio, w którym co najmniej jeden z podstawników R1 albo R2 oznacza grupę acyloksyacylową, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę kwasową wybraną z grupy obejmującej:

- karboksy[(C1-C5)alkil],

- CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH], gdziem=0do5,an=0do5,

- fosfono[(C1-C5)alkil],

- dihydroksyfosforyloksy[(C1-C5)alkil],

- dimetoksyfosforyl,

- hydroksysulfonyl,

- hydroksysulfonylo[(C1-C5)alkil],

- hydroksysulfonyloksy[(C1-C5)alkil],

- grupę fosfonową, w postaci obojętnej albo naładowanej, z tym ograniczeniem, że co najmniej jeden z podstawników X i Y oznacza określoną powyżej grupę kwasową w postaci obojętnej albo naładowanej, a

A i B mają powyżej podane znaczenia, polegający na tym, że blokuje się aminowe grupy funkcyjne w położeniu (q+1) i w położeniu ω diaminokwasu o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH za pomocą reagenta blokującego ulegającego odpowiednio acydolizie i wodorolizie, poddaje się wolną pozostałą karboksylową grupę funkcyjną działaniu środka redukującego z wytworzeniem odpowiedniego alkoholu, uwalnia się aminową grupę funkcyjną w położeniu (q+1), którą następnie acyluje się za pomocą pochodnej funkcyjnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 ma powyżej podane znaczenie, a następnie uwalnia się końcową aminową grupę funkcyjną drogą wodorolizy z otrzymaniem aminoalkoholu o wzorze ogólnym II:

H₂N-(CH₂)_p-CH-(CH₂)_q-OH (II) I nhr₂

PL 195 764 B1 w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo kilkoma podstawnikami określonymi jak wyżej, a p i q oznaczają liczbę całkowitą od 1 do 10, następnie diaminoalkohol kondensuje się w obecności peptydowego środka kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku z pochodną ω-hydroksy-, -amino- albo -tioaminokwasu o wzorze ogólnym III:

XA-(CH₂)m-CH-(CH2)n-COOH (111)

I

NHR, w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionegoalbopodstawionegojednym albokilkomapodstawnikami,jakokreślonowyżej, moznaczaliczbęcałkowitąod1do10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, Aoznaczaatomtlenu,atomsiarkialbogrupęiminowąNH,a

X oznacza rodnik kwasowy o powyżej podanym znaczeniu, obecny ewentualnie w postaci zestryfikowanej, z utworzeniem pseudodipeptydu o wzorze ogólnym IV:

XA(CH₂)_m-CH-(CH2)n-CONH-(CH₂)p-CH-(CH₂)_q-OH (IV)

I I

NHRi NHR₂ w którym R1,R2, m, n, p i q mają powyżej podane znaczenia, którego alkoholową grupę funkcyjną, jeżeli jest to pożądane, można podstawiać, alkilować albo acylować za pomocą środka podstawiającego,alkilującegoalboacylującegoi,jeżeli jest to konieczne, w obecności środka sprzęgającego poddawać uwodornianiu katalitycznemu albo innemu sposobowi usuwania grupy zabezpieczającej, otrzymując związek o wzorze ogólnym I:

X-A-(CH₂)_m-CH-(CH₂)n-CONH-(CH₂)p-CH-(CH₂)q-B-Y (I)

I I

NH NH

I I

Ri R₂ wktórymA,B,X,Y,R1,R2,n,m,piqmająpowyżejpodane znaczenia.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania fosfopseudodipetydów określonych powyżej, o wzorze ogólnym I':

X-O-(CH₂)_mCH-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)p-CH-(CH₂)_q-O-Y (i')

I I

NHRi NHR₂ w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)alkilotio, m,piqoznaczająliczbycałkowiteod1do10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdyX i Y oznacza atom wodoru albo grupę fosfonową w postaci obojętnej albo naładowanej,

PL 195 764 B1 polegający na tym, że blokuje się aminowe grupy funkcyjne w położeniu (q+1) i w położeniu ω diaminokwasu o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH za pomocą reagentów blokujących ulegających odpowiednio acydolizie i wodorolizie, poddaje wolną pozostałą karboksylową grupę funkcyjną działaniu środka redukującego z wytworzeniem odpowiedniego alkoholu, uwalnia się aminową grupę funkcyjną w położeniu (q+1), którą acyluje się za pomocą pochodnej funkcyjnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 ma powyżej podane znaczenie, a następnie uwalnia się końcową aminową grupę funkcyjną drogą wodorolizy z otrzymaniem aminoalkoholu o wzorze ogólnym II:

H₂N-(CH₂)_p-CH-(CH₂)_q-OH (11)

I nhr₂ w którym R₂ oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo kilkoma podstawnikami o powyżej podanym znaczeniu, a p i q oznaczają liczbę całkowitą od 1do 10, następnie aminoalkohol kondensuje się w obecności peptydowego środka kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku z pochodną ω-hydroksy-, -amino- albo -tioaminokwasu o wzorze ogólnym III':

ZCHCHzJrn-CH-iCH^n-COOH (III')

I

NHR, w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionegoalbopodstawionegojednymalbokilkomapodstawnikami, moznaczaliczbęcałkowitąod1do10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, aXoznaczarodnikdialkoksy-albodiaryloksyfosforylowyowzorze (RO)₂P

I o

otrzymując pseudodipeptyd o wzorze ogólnym IV':

(RO^PO-iCH^m-CH-iCH^n-CONH-iCHzJp-CH-iCHz^-OH (IV')

I I I

O NHRi NHR₂ wktórymR1,R2,m,n,piqmająpowyżejpodaneznaczenia, a R oznacza rodnik ulegający wodorolizie, którego alkoholową grupę funkcyjną, jeżeli jest to pożądane, można fosforylować za pomocą środka fosforylującego w obecności, jeżeli jest to konieczne, środka sprzęgającego i poddawać uwodornianiu katalitycznemu w dwóch etapach tak aby zablokować alkoholową grupę funkcyjną ewentualnie istniejącą na grupie acylowej R2 i fosforanową grupę funkcyjną, i ewentualnie istniejącą drugą fosforanową grupę funkcyjną, które można następnie odblokować drogą wodorolizy, otrzymując pochodną o wzorze ogólnym V:

(HO)₂P-O-(CH₂)_m-CH-(CH₂)_n-CONH-(CH₂)p-CH-(CH₂)q-O-Y (V) i I I

O NH NH

Ri R₂ w którym Y oznacza atom wodoru albo grupę fosfonową.

PL 195 764 B1

Korzystnie w powyższych sposobach prowadzi się etap dodatkowy przeprowadzania w sól przy użyciu zasady nieorganicznej albo organicznej.

Korzystniej etap przeprowadzania w sól prowadzi się przy użyciu terapeutycznie dopuszczalnej zasady nieorganicznej albo organicznej.

Korzystnie w powyższych sposobach jako kwas karboksylowy R1OH stosuje się kwas 3-dodekanoiloksytridekano-karboksylowy.

Korzystnie w powyższych sposobach jako kwas karboksylowy R2OH stosuje się kwas 3-hydroksytridekanokarboksylowy.

Przedmiotem wynalazku są ponadto kompozycje farmaceutyczne, charakteryzujące się tym, że jako składnik czynny zawierają co najmniej jeden związek określony powyżej o wzorze ogólnym I:

X-A-(CH2)_mCH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH₂)_q-B-Y (I)

NHRi

NHR₂ w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)-alkilotio, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę kwasową wybraną z grupy obejmującej:

- karboksy[(C1-C5)alkil],

- CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH], gdziem=0 do5,an=0 do5,

- fosfono[(C1-C5)alkil],

- dihydroksyfosforyloksy[(C1-C5)alkil],

- dimetoksyfosforyl,

- dihydroksyfosforyl,

- hydroksysulfonyl,

- hydroksysulfonylo[(C1-C5)alkil],

- hydroksysulfonyloksy[(C1-C5)alkil], w postaci obojętnej albo naładowanej, z tym ograniczeniem, że co najmniej jeden z podstawników X i Y ma określoną jak wyżej grupę kwasową w postaci obojętnej albo naładowanej, a

A i B oznaczają niezależnie od siebie atom tlenu, atom siarki albo grupę iminową -NH-, przy czym jeden z atomów wodoru pseudodipeptydu może być zastąpiony grupą Z, która oznacza peptyd Pb CS His6-242-310, IFA/Pb CS 242-310-His6, albuminę jaja lub tuberkulinę, w połączeniu albo w mieszaninie z obojętną, nietoksyczną, farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką lub nośnikiem.

Korzystnie związek o wzorze I stanowi jeden z tych związków, w których X i/lub Y oznacza rodnik fosfonowy, a A i B oznaczają atom tlenu.

Korzystniej składnik czynny ma postać soli z terapeutycznie dopuszczalną zasadą nieorganiczną albo organiczną.

Korzystnie składnik czynny ma postać enancjomerycznie czystą albo postać mieszaniny steroizomerów.

W pseudodipeptydach N-acylowych według wynalazku co najmniej jedna grupa hydroksylowa może być zacylowana ugrupowaniem kwasowym, w postaci obojętnej albo naładowanej, przy czym pseudodipeptydy N-acylowe według wynalazku mogą odpowiadać ogólnemu wzorowi I:

X-A-(CH2)_mCH-(CH₂)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH₂)q-B-Y (I)

NHRi

NHR₂

PL 195 764 B1 w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio, grupę C1-C24-alkilotio, m,pi q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, wskaźnik n oznacza liczbę całkowitą od 0 do10, każdy X i Y oznacza wodór albo grupę kwasową w postaci obojętnej albo naładowanej, z tym ograniczeniem, że co najmniej jeden z podstawników X i Y oznacza grupę kwasową w postaci obojętnej albo naładowanej, każde A i B oznacza niezależnie od siebie atom tlenu, siarki albo grupę iminową -NH-.

Grupy kwasowe Xi Y wybiera się korzystnie spośród ugrupowań:

- karboksy[(C1-C5)alkil],

- CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH], gdzie m = 0 do 5, a n = 0 do 5,

- fosfono[(C1-C5)alkil],

- dimetoksyfosforyl,

- grupę fosfonową,

- hydroksysulfonyl,

- hydroksysulfonyloksy[(C1-C5)alkil].

Gdy podstawniki X i/lub Y oznaczają grupę kwasową w postaci obojętnej, to chodzi o wolną postać karboksylową, sulfonową albo fosforową. Gdy chodzi o grupę kwasową w postaci naładowanej, to chodzi o solotwórczą postać karboksylową, sulfonową albo fosforową, zwłaszcza przez dodanie zasady nieorganicznej albo organicznej, dogodnie dopuszczalnej do zastosowania terapeutycznego. Gdy zasady nie są dopuszczalne do zastosowania terapeutycznego, to mogą służyć jako środek do identyfikacji, oczyszczania albo rozdzielania.

To samo rozumowanie stosuje się do przypadku gdy X i/lub Y oznaczają grupę karboksyloalkilową albo alkilenobiskarboksylową, hydroksysulfonylową, hydroksysulfonyloalkilową, hydroksysulfonyloksyalkilową, fosfonoalkilową, fosforyloksyalkilową.

Terapeutycznie dopuszczalne zasady obejmują zwłaszcza zasady alkaliczne, takie jak wodorotlenek sodowy, potasowy, litowy, sole amonowe, zasady na bazie metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek wapnia albo strontu, sole magnezowe, sole żelazowców i podobne, zasady organiczne, takie jak zasady pochodzące od amin pierwszorzędowych, drugorzędowych albo trzeciorzędowych, takich jak metyloamina, dietyloamina, monoetanoloamina, dietanoloamina, benzyloamina, N-metylobenzyloamina, weratryloamina (ang. veratrylamine), trimetoksybenzyloamina, aminokwasy zasadowe, takie jak lizyna albo ornityna, albo aminocukry.

Do zasad nieużytecznych terapeutycznie należy na przykład brucyna, strychnina, agmatyna, homaryna (ang. homarine), glukozamina, N-metyloglukozamina albo N-metylomorfolina. Jak wskazano wyżej, pochodzące od nich sole będą służyć jako środki do rozdzielania albo identyfikacji.

Gdy m jest równe 1, a n jest równe 0, to cząsteczka pochodzi od seryny. Gdy m jest równe 2, a n jest równe 0, to cząsteczka pochodzi od homoseryny. Gdy m jest równe 3, a n jest równe 0, to chodzi o pochodną pentahomoseryny. Gdy m jest równe 4, a n jest równe 0, to chodzi o pochodną heksahomoseryny.

Gdy p jest równe 3, a q jest równe 1, to może chodzić o pochodną cytruliny albo ornityny albo argininy. Gdy p jest równe 4, a q jest równe 1, to może chodzić o pochodną homoargininy albo lizyny.

Spośród pseudodipeptydów według wynalazku jako związki szczególnie korzystne uważa się związki o wzorze ogólnym I':

X-O-(CH₂)_mCH-(CH2)n-CO-NH-(CH₂)p-CH-(CH₂)q-O-Y (i')

I I

NHR! NHR₂ w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym

PL 195 764 B1 z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)alkilotio, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę fosfonową, a zwłaszcza:

- 1 i/lub 10-diwodorofosforan 3-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-aza-dekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną,

- 1,10-bis(diwodorofosforan) 3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną,

- 1,10-bis(diwodorofosforan) 3-(hydroksytetradekanoiloamino)-9-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną,

- 1-diwodorofosforan 3-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną,

- 1-diwodorofosforan 3-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-9-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną,

- 10-diwodorofosforan 3-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-9-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganiczną albo organiczną.

Określenie R1 i R2 obejmuje pochodne acylowe z łańcuchem o zmiennej długości, identyczne albo różne, rozgałęzione albo prostołańcuchowe, nasycone albo nienasycone, które mogą zawierać jeden albo więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej alkil, grupę aminową, grupę acyloaminową, hydroksyl, alkoksyl, acyloksyl, grupę acylo-tio i grupę alkilotio.

Przykładami takich podstawionych pochodnych acylowych jest rodnik rycynoleilowy, 12-hydroksystearoilowy, 2-hydroksy-3-metylomasłowy, 3-hydroksy-2-aminopentanoilowy, palmitoilowy, elaidylowy, eleostearoilowy, arachidoilowy, arachidonylowy, gadoleilowy, behenylowy, erucylowy, 8-metylodekanoilowy, 9-metylodekanoilowy, dokozaheksaenoilowy albo eikozapentaenoilowy.

Szczególnie zalecanym ugrupowaniem acylowym jest kwas 3-hydroksymirystynowy i kwas 3-lauryloksymirystynowy.

Związki o wzorze ogólnym I, a zwłaszcza związki mono- i bisfosforylowane oznaczone odpowiednio nazwą kodową jako OM-294-MP (MP) i OM-294-DP (DP) odznaczają się interesującymi właściwościami farmakologicznymi, a zwłaszcza immunomodulującymi. Szczególne istotne są one w leczeniu chorób związanych z niewystarczającą odpowiedzią immunologiczną albo z nadmierną odpowiedzią immunologiczną, w zależności od stosowanych dawek. Znajdują one także zastosowanie w leczeniu nowotworu oraz jako adiuwant albo środek wzmagający przy komponowaniu szczepionek.

Inne zastosowania związków według wynalazku mogą obejmować zastosowanie jako wektory cząsteczek interesujących terapeutycznie ze względu na ich właściwości tworzenia niekowalencyjnych kompleksów o naturze hydrofilowej i hydrofobowej. Ich amfifilowy charakter sprzyja tworzeniu się i transportowi cząsteczek interesujących terapeutycznie w kierunku receptorów błonowych, jak również w kierunku błon komórkowych i cytoplazmy. Mogą być one podawane, samodzielnie albo w połączeniu z cząsteczką interesującą terapeutycznie, drogą doustną, pozajelitową, doodbytniczą, miejscowo, podskórnie albo podśluzówkowo. Można je stosować samodzielnie albo w połączeniu z cząsteczką interesującą terapeutycznie drogą inkubacji ex vivoz komórkami krwi w celu otrzymania komórek immunokompetenych przed wstrzyknięciem ich ponownie in vivo drogą pozajelitową.

Cząsteczki MP i DP wykazują podobne właściwości jako adiuwanty dla układu immunologicznego, gdy są stosowane na przykład przy szczepieniu, w połączeniu z odpowiednimi antygenami, przeciw chorobom pochodzenia wirusowego, pasożytniczego, bakteryjnego albo grzybowego. W przeciwieństwie do tego związki według wynalazku wykazują właściwości całkowicie różne pod względem swojej zdolności do indukowania wytwarzania cytokin albo dojrzewania immunokompetentnych komórek macierzystych pochodzących z narządów hematopoetycznych albo limfoidowych.

Związek MP sprzyja dojrzewaniu i różnicowaniu monocytów w funkcjonalne komórki dendrytyczne, w obecności albo przy braku odpowiedniego antygenu, i przyczynia się w ten sposób do wzmocnienia odporności humoralnej i komórkowej. Związek DP ma ze swojej strony właściwości przeciwnowotworowe.

PL 195 764 B1

Związki według wynalazku są szczególnie interesujące ze względu na ich słabą toksyczność.

Stosuje się je w leczeniu ludzi i zwierząt w dawkach w zakresie od 0,025 mg do 100 mg na dawkę jednostkową i od 0,05 do 200 mg dziennie.

Stereochemię centrów chiralnych grup acyloaminowych określa się za pomocą konfiguracji aminokwasów wyjściowych, podczas gdy stereochemia grup acyloaminowych zależy od konfiguracji wyjściowych kwasów tłuszczowych. Można wyjść z diaminokwasu o konfiguracji L albo D, albo racematu. Można wyjść także z hydroksylowanego aminokwasu o konfiguracji L, D, albo racematu. Wszystkie te stereoizomery albo diastereoizomery są objęte wynalazkiem.

Sposób według wynalazku można określić za pomocą następujących zalecanych rozwiązań przedstawionych na schematach syntezy 1,2i 3 (Fig. 33, 34 i 35):

1. Blokowanie aminowej grupy funkcyjnej w położeniu ω na łańcuchu pochodnej ornityny prowadzi się drogą N-benzyloksykarbonylowania po początkowej reakcji kwasowej grupy funkcyjnej z solą miedzi w środowisku alkalicznym, reakcji tego karboksylanu miedzi z chloromrówczanem benzylui uwolnienia karboksylowej grupy funkcyjnej drogą chelatowania miedzi w środowisku kwaśnym w celu otrzymania pochodnej N-benzyloksykarbonylowej sposobem opisanym w „Organic Preparations and Procedures International 23 (1992) 191-194”.

2. Blokowanie aminowej grupy funkcyjnej w położeniu α względem grupy karboksylowej pochodnej ornityny prowadzi się drogą tert-butyloksykarbonylowania za pomocą pirowęglanu alkilowego, takiego jak pirowęglan tert- butylu, w środowisku zasadowym. Pirowęglan tert-butylu reaguje z bliższą aminową grupą funkcyjną dając pochodną ω-benzyloksykarbonyloamino-a-tert-butyloksykarbonyloaminokarboksylową.

3. Przekształcenie karboksylowej grupy funkcyjnej w pierwszorzędową alkoholową grupę funkcyjną prowadzi się sposobem opisanym w Tetrahedron Letters 32 (1991) 923-926, polegającym na tym, że pochodną karboksylową poddaje się reakcji z chloromrówczanem alkilu, takim jak chloromrówczan izobutylu, z utworzeniem mieszanego bezwodnika, który redukuje się za pomocą borowodorkumetalualkalicznegoalbometaluziemalkalicznych,wceludojściadoodpowiedniejpochodnej hydroksylowej, która ma pierwszorzędową alkoholową grupę funkcyjną.

4. Usunięcie grupy tert-butyloksykarbonylowej w położeniu α prowadzi się przez działanie kwasu trifluoro-octowego, które prowadzi jednocześnie do utworzenia się trifluorooctanu aminowej grupy funkcyjnej.

5. Acylowanietakuwolnionej aminowej grupyfunkcyjnej prowadzi się wychodząc z soli trifluorooctowej za pomocą mieszanego bezwodnika otrzymanego z kwasu R2OH i chloromrówczanu alkilowego.

6. Uwolnienie końcowej aminowej grupy funkcyjnej prowadzi się drogą hydrogenolizy w obecności katalizatora na bazie metalu szlachetnego, takiego jak platyna, pallad na węglu albo iryd.

7. Sprzęganie peptydowe pomiędzy związkiem aminowym o wzorze II i pochodną fosforylowaną o wzorze III' prowadzi się w obecności środka sprzęgającego, takiego jak 1-izobutyloksy-2-izobutyloksykarbonylo-1,2-diwodoro-chinolina w rozpuszczalniku obojętnym, takim jak rozpuszczalnik zawierający fluorowce, albo stosując karbodiimid. W ten sposób otrzymuje się pseudodipeptyd o wzorze ogólnym (IV') którego hydroksylowa grupa funkcyjna zawarta ewentualnie w grupie acylowej R2 jest zablokowana.

8. Uwolnienie hydroksylowej grupy funkcyjnej grupy acylowej R2 prowadzi się drogą wodorolizy w obecności metalu szlachetnego, takiego jak pallad, osadzonego na nośniku, takim jak węgiel.

9. Uwolnienie grupy fosforowej prowadzi się drogą uwodorniania katalitycznego w obecności tlenkumetaluszlachetnego,takiegojaktlenekplatyny.

10. Fosforylowanie pochodnej pseudodipeptydowej IV' prowadzi się w dwóch etapach (Helv. Chim. Acta 70 (1987) 175). W pierwszym etapie związek IV' poddaje się działaniu N,N-dialkilofosforamidytudialkilualbodiaryluwobecnościśrodkasprzęgającego,takiegojak[1H]-tetrazol,wrozpuszczalnikupolarnym,takimjaktetrahydrofuran.Takutworzonyfosforynpoddajesięnakoniecutlenianiu do fosforanu za pomocą aromatycznego kwasu nadtlenokarboksylowego, takiego jak na przykład kwas nadtlenoftalowy, kwas m-chloronadbenzoesowy albo kwas nitronadbenzoesowy. Uwolnienie grupy fosforowej Y (wzór V) prowadzi się drogą uwodorniania katalitycznego w obecności metalu szlachetnego, takiego jak pallad na węglu.

11. Fosforylowaniepochodnejhomoserynyprowadzisięzapomocąhalogenkudifenylofosforylu w obecności pirydyny i N,N-dialkiloaminopirydyny (Helv. Chim. Acta 58 (1975), 518) po zablokowaniu aminowej grupy funkcyjnej drogą tert-butoksykarbonylowania za pomocą pirowęglanu tert-butylu

PL 195 764 B1 w środowisku zasadowym i zablokowaniu karboksylowej grupy funkcyjnej po utworzeniu soli cezu, ibenzylowaniuzapomocąhalogenkubenzyluwdimetyloformamidziealbodimetyloacetamidzie.

12. Acylowanie atomu azotu pochodnej homoseryny prowadzi się po usunięciu grupy zabezpieczającej aminowej grupy funkcyjnej za pomocą kwasu trifluorooctowego z uzyskaniem soli trifluorooctowej aminy,i reakcji z mieszanym bezwodnikiem otrzymanym wwynikureakcji pomiędzy kwasem karboksylowym R1OHi chloromrówczanem alkilu w obecności reaktywnej aminy, takiej jak N-metylomorfolina.

W sposobach według wynalazku powstają ponadto produkty pośrednie o wzorze ogólnym II i o wzorze ogólnym IIIi III' w postaci enancjomerycznie czystej albo w postaci mieszaniny stereoizomerów.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać jako składnik czynny co najmniej jeden związek o wzorze ogólnym I, w postaci obojętnej albo naładowanej, w połączeniu albo w mieszaninie obojętną, nietoksyczną farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką lub nośnikiem.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać jako składnik czynny co najmniej jedną sól związku o wzorze ogólnym I z farmaceutycznie dopuszczalną zasadą nieorganiczną alboorganiczną.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać związek o wzorze ogólnym I w postaci enancjomerycznie czystej albo w postaci mieszaniny stereoizomerów, w połączeniu albo w mieszaninie z farmaceutyczną zaróbką lub nośnikiem.

Spośród branych pod uwagę postaci farmaceutycznych można zacytować te, które nadają się do podawania drogą jelitową, pozajelitową, drogą inhalacji, miejscowo, przezskórnie albo na śluzówkę, takie jak na przykład tabletki powlekane, tabletki niepowlekane, kapsułki, roztwory i zawiesiny do iniekcji, aerozole, żele, plastry albo roztwory szybko przenikające.

Związki według wynalazku można dogodnie podawać drogą iniekcji w postaci roztworów albo zawiesin wodnych, ewentualnie zobojętnionych aminą albo hydroksyloaminą.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając go i są przedstawione na schematach syntezy 1do 6 (Fig. 33 do 38).

Przykład I

Kwas4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloksy-tetradekanoiloamino]propanokarboksylowy

1. Nα-Tert-butyloksykarbonylo-DL-homoseryna g (16,76 mmola) homoseryny rozpuszczono w 20 ml wody i dodano ten roztwór do 16,73 ml 1M NaOH i 3,006 g węglanu cezu (9,23 mmola). Po 5 minutach mieszania roztwór ochłodzono na łaźni wodno-lodowej. Następnie dodawano 60 ml dioksanu i pirowęglanu tert-butylu. Mieszaninę reakcyjną utrzymuje się mieszając na łaźni wodno-lodowej w ciągu 1 godziny, a następnie w ciągu 5 godzin w temperaturze otoczenia. Następnie usuwano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, a suchą pozostałość wykorzystano bezpośrednio w następnym etapie.

2. Nα-Tert-butyloksykarbonylo-DL-homoserynian benzylu

Do pozostałości z etapu 1dodano 20 ml dimetyloformamidu i odparowano do sucha, a następnie dodano do środowiska reakcyjnego 60 ml dimetyloformamidu i 4,5 ml bromku benzylu (20,13 mmola), przy czym tworzył się bezbarwny osad. Mieszaninę utrzymywano mieszając przez 16 godzin, a następnie odpędzano rozpuszczalnik pod próżnią. Pozostałość ekstrahowano 2 razy po 20 ml octanu etylu. Fazę organiczną przemyto odpowiednio wodą (20 ml),a następnie roztworem soli (20 ml),po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Roztwór odparowano, a pozostałość wykorzystywano jako taką w następnym etapie.

3. Nα-Tert-butyloksykarbonylo-O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoserynian benzylu

Pozostałość z poprzedniego etapu wysuszono pod wysoko zmniejszonym ciśnieniem, a następnie rozpuszczono w chlorku metylenu (60 ml). Następnie do roztworu dodano 4,11 g 4-dimetyloaminopirydyny (33,56 mmola) w roztworze, mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 minut, po czym dodano 12 ml pirydyny i 6,95 ml chlorofosforanu difenylu (33,56 ml). Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 18 godzin, a następnie przemyto go 1N kwasem chlorowodorowym (5 x 20 ml), wodą (30 ml) i roztworem soli (30 ml). Fazęorganiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym, a rozpuszczalnik odpędzono pod próżnią. Pozostałość oczyszczano drogą chromatografii „Flash” (heksan/octan etylu, 4:1). Frakcję główną zatężono, a pozostałość przekrystalizowano. W ten sposób otrzymano 7,49 g produktu fosforylowanego (wydajność 82,4%, temperatura topnienia 63,5-64,0°C).

4.O-(Difenyloksyfosforylo)-DL-homoserynianbenzylu

Produkt fosforylowany z poprzedniego etapu (7,88 g, 15,4 mmola) rozpuszczono w 15 ml kwasu trifluorooctowego i roztwór utrzymywano mieszając w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny.

PL 195 764 B1

Następnie odpędzono rozpuszczalnik pod próżnią, a suchą pozostałość oczyszczono drogą chromatografii równowagowej (MeOH/CH2Cl2, 10:1). Frakcję główną zatężono, a pozostałość przekrystalizowano w temperaturze pokojowej. W ten sposób otrzymano 7,17 g produktu fosforylowanego (wydajność 88,9%) i wykorzystywano go bez dalszego oczyszczania w następnym etapie.

5. 2-[(R)-3-Dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(difenyloksyfosforyloksy)propanokarboksylan benzylu

4,284 g (10,07 mmola) kwasu (R)-3-dodekanoiloksytridekanokarboksylowego otrzymanego sposobem opisanym w Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205-2214, rozpuszczono w 30 ml tetrahydrofuranu i roztwór ochłodzono do temperatury -15°C na łaźni lodowo-solnej. Następnie dodawano 1,108 ml (10,07 mmola) N-metylomorfoliny i 1,31 ml (10,07 mmola) chloromrówczanu izobutylu. Mieszanie kontynuowano przez 30 minut, po czym dodano do mieszaniny reakcyjnej 5,724 g (10,07 mmola) O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoserynianu benzylu w mieszaninie 30 ml tetrahydrofuranu i 5 ml trietyloaminy. Po mieszaniu przez noc w temperaturze otoczenia odpędzono rozpuszczalnik pod próżnią i dodano do pozostałości 20 ml wody. Na koniec mieszaninę ekstrahowano za pomocą octanu etylu (2 x 30 ml). Fazy organiczne połączono, przemyto kolejno wodą (20 ml) i roztworem soli (20 ml) i wysuszono nad siarczanem magnezowym. Następnie odparowano rozpuszczalnik, a pozostałość oczyszczono drogą chromatografii „Flash” (heksan/octan etylu, 2:1, Rf=0,29). Wydajność 7,455 g albo 87,1%, temperatura topnienia 31,0-32,1°C.

¹H-NMR (CDCl3, 250 MHz), δ w ppm: 7,4-7,1 (m, 15H), 6,90 (2d, 1H, ³J=7,6Hz, NH), 5,3-5,1 (m, 3H), 4,7 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4-2,1 (m, 4H), 1,4-1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H).

¹³C-NMR (CDCl3, 63 MHz), δ w ppm: 173,01, 171,08, 169,66, 150,18 (d, ²JP,C=7,1Hz), 135,01, 129,60, 128,33, 128,14, 127,96, 125,21, 119,80 (d, ³JP,C=5,0Hz), 70,69, 67,05, 65,19 (d, ²JP,C=5,6Hz), 49,13, 40,97, 40,77 (2 diast.), 34,20, 33,98, 33,82, 31,70, 29,42, 29,34, 29,14, 28,94, 25,01, 24,77, 22,47, 13,91.

6. Kwas 4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloamino]propanokarboksylowy

Przygotowano roztwór estru otrzymanego w etapie 5 (2,33 g, 2,6 mmola) w 300 ml metanolu o czystości HPLC w kolbie trójszyjnej i dodano do niego 10% pallad na węglu. Zawartość kolby przepłukano pod próżnią w celu odpędzenia powietrza, a następnie wprowadzano wodór pod ciśnieniem atmosferycznym. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia w ciągu jednej godziny, a następnie usunięto szybko katalizator drogą filtracji na membranie, a przesącz zatężano do uzyskania bezbarwnego syropu. Syrop był jednorodny, co potwierdzono drogą chromatografii cienkowarstwowej i NMR, i został wykorzystany bezpośrednio bez dodatkowego oczyszczania w etapie sprzęgania; Rf 0,75 (dichlorometan/metanol/trietyloamina, 10:1:0,5).

¹H-NMR (CDCl3, 250 MHz) δ w ppm: 7,4-7,1 (m, 10H), 6,85 (d, 1H, NH), 5,15 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4-2,15 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4-1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H).

¹³C-NMR (CDCl3, 63 MHz) δ w ppm: 173,35, 173,30 (2 diast.), 172,75, 170,37, 150,0 (d, ²JP,C=7,5Hz), 129,55, 125,28, 119,71 (d, ³JP,C=4,4Hz), 70,78, 65,65 (d, ²JP,C=5,9Hz), 49,00, 40,77, 40,63 (2 diast.), 34,13, 33,86, 33,76, 31,59, 29,31, 29,25, 29,03, 28,82, 24,88, 24,68, 22,36, 13,76.

Kwas 4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]propanokarboksylowy można otrzymać według tej samej kolejności reakcji zastępując w etapie 5 przykładu I kwas (R)-3-dodekanoiloksytridekanokarboksylowy kwasem (R)-3-benzyloksytridekanokarboksylowym.

P r zyk ł a d II (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentanol-1

1. Sól miedziowa D-ornityny

Do roztworu D-ornityny (5,25 g, 30 mmoli) w 30 ml 1M wodorotlenku sodowego dodano 50 ml roztworu pentahydratu siarczanu miedzi (3,814 g, 15,3 mmola) w wodzie i kontynuowano mieszanie w ciągu 2 godzin. Następnie odparowano do sucha rozpuszczalnik i dodano 60 ml metanolu z utworzeniem stałej substancji o barwie purpurowej, którą oddzielano i przemywano odpowiednio dioksanem i metanolem.

2. (2R)-2-Amino-5-(benzyloksykarbonyloamino)butanokarboksylan miedzi

Purpurową substancję stałą rozpuszczono w 40 ml 1M sody i 70 ml dioksanu, po czym roztwór ochłodzono na łaźni lodowo-wodnej i dodano do niego 5,14 ml (36 mmoli) chloromrówczanu benzylu. Mieszanie na łaźni lodowo-wodnej kontynuowano w ciągu 3 godzin, a następnie w temperaturze pokojowej w ciągu 15 godzin. Purpurowy osad oddzielono, a następnie przemyto odpowiednio 95% etanolem (40 ml), wodą (50 ml) i etanolem (60 ml). Osad wysuszono w piecyku (T < 45°C, pod zmniejszonym ciśnieniem); wydajność po dwóch etapach 8,27 g, 93% w stosunku do wartości przewidywanej.

PL 195 764 B1

3. Kwas (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-(tert-butyloksykarbonyloamino)butanokarboksylowy

Sól miedziową otrzymaną w etapie 2 rozpuszczono w 2M kwasie chlorowodorowym (400 ml) i do roztworu dodano EDTA (8,15 g, 27,8 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2,5 godziny, a następnie zobojętniano do pH 7 dodając 5M sodę (około 160 ml), przy czym tworzył się bezbarwny osad. Mieszaninę mieszano przez 2,5 godziny na łaźni lodowo-wodnej, osad odfiltrowano, przemyto zimną wodą aż do uzyskania bezbarwnego odcieku, a następnie suszono w piecyku w temperaturze poniżej 60°C. Tę substancję stałą rozpuszczono w 156 ml 1M NaOH i ochłodzono roztwór na łaźni lodowo-wodnej. Do tego roztworu dodano 7,7 g (35,2 mmola) pirowęglanu tert-butylu w dioksanie (160 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 45 minut, a następnie przez 16 godzin w temperaturze otoczenia. Rozpuszczalnik organiczny odparowano i dodano do pozostałości 70 ml octanu etylu. Na koniec zakwaszano fazę wodną dodając 2N kwas chlorowodorowy aż do pH ~3. Warstwę wodną ekstrahowano jeszcze jeden raz za pomocą 100 ml octanu etylu. Fazy organiczne połączono i przemyto wodą (30 ml) i roztworem soli (30 ml). Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią otrzymując po oczyszczaniu drogą chromatografii „Flash” bezbarwny olej (wydajność: 8,42 g po dwóch etapach, 76,7% wartości przewidywanej) (Rf 0,19, dichlorometan/MeOH, 20:1).

4. (2R)-5-(Benzyloksykarbonyloamino)-2-(tert-butyloksykarbonyloamino)pentanol-1

Do zimnego roztworu (-15°C) pochodnej kwasu diamino-butanokarboksylowego otrzymanego w etapie 3 (5,45 g, 14,8 mmola) w 60 ml THF dodano 1,654 ml (14,8 mmola) N-metylomorfoliny i 9,6 ml (14,8 mmola) chloromróczanu izobutylu (IBCF). Roztwór mieszano w temperaturze -15°C w ciągu 1 minuty, a następnie dodano do niego roztwór borowodorku sodowego (5,104 g, 44,6 mmola) w 10 ml wody. Mieszanie w temperaturze -15°C utrzymywano jeszcze w ciągu 10 minut, a następnie dodano 400 ml wody w celu zatrzymania reakcji. Roztwór ekstrahowano octanem etylu (2 x 100 ml), a fazy organiczne połączono i przemyto za pomocą 50 ml wody i 60 ml roztworu soli, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Następnie odpędzono rozpuszczalnik, a pozostałość przekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan (4,94 g, wydajność 94,9%, temperatura topnienia 47,5-48°C).

5. Odblokowanie pochodnej 2,5-diaminopentanolu-1

6,32g (18 mmola) (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-(tert-butyloksykarbonyloamino)pentanolu-1 otrzymanego w etapie 4 rozpuszczono w 25 ml kwasu trifluorooctowego, a następnie mieszano w ciągu 2,5 godziny w temperaturze otoczenia. Następnie odparowano rozpuszczalnik, a pozostałość oczyszczono drogą chromatografii „Flash” (MeOH/CH2Cl2, 10:1). W ten sposób otrzymano bezbarwną szklistą masę, która topiła się w temperaturze otoczenia. Wydajność wynosiła 5,45 g soli trifluorooctowej (wydajność 82,7%). Chlorowodorek topił się w temperaturze 133,0-134,3°C (rekrystalizacja z metanolu).

6. (2R)-5-(Benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentanol-1

Do ochłodzonego do temperatury -15°C 5,27 g (15,8 mmola) kwasu (R)-3-benzyloksytridekanokarboksylowego (Bull. Chem. Soc. Jpn, 60 (1987), 2197-2204) w 30 ml tetrahydrofuranu dodano 1,89 ml (15,8 mmola) N-metylomorfoliny i 2,21 ml IBCF (15,8 mmola). Mieszaninę reakcyjną utrzymywano mieszając w temperaturze -15°C w ciągu 30 minut, a następnie dodawano do niej 5,25 g soli trifluorooctowej z poprzedniego przykładu (14,4 mmola) w 30 ml tetrahydrofuranu i 1,44 ml trietyloaminy w roztworze. Mieszanie kontynuowano w temperaturze otoczenia w ciągu 16 godzin, a następnie dodano 30 ml wody i 60 ml octanu etylu. Fazę organiczną oddzielono, a fazę wodną ekstrahowano jeszcze jeden raz octanem etylu (60 ml). Fazy organiczne połączono, przemyto wodą (30 ml) i roztworem soli (30 ml), a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość przekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan (5,824 g, wydajność 71,2%);

temperatura topnienia 117,5°-118°C, Rf 0,32, octan etylu/eter naftowy, 3:1.

¹H-NMR (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 7,4-7,2 (m, 10H), 6,5 (d, 1H, NH), 5,1 (s, 2H), 4,9 (m, 1H, NH), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,8 (m, 2H),3,5 (m, 2H),3,1 (m, 2H),2,4 (m, 2H),1,6-1,4 (m, 6H), 1,4-1,2 (m,18H), 0,9 (t, 3H).

¹³C-NMR (CDCl3, 63 MHz), δ w ppm: 172,24, 156,49, 138,06, 136,53, 128,46, 128,04, 127,87, 76,76, 71,39, 66,60, 65,44, 51,54, 41,43, 40,65, 33,76, 31,87, 29,61, 29,30, 28,01, 26,47, 25,05, 22,65, 14,09.

7. (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentanol-1

W kolbie trójszyjnej dodano 150 mg 20% palladu na węglu do roztworu (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentanolu-1 (3,0 g, 5,27 mmola) i 6 ml trietyloaminy w 300 ml etanolu o czystości HPLC. Powietrze usunięto pod próżnią, a następnie wprowadzono do kolby wodór. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia w ciągu 2 godzin, a następnie oddzielono katalizator przez filtrację na membranie i zatężono przesącz otrzymując

PL 195 764 B1 bezbarwną substancję stałą jednorodną pod względem NMR, wykorzystywaną jako taką w następnym etapie bez dalszego oczyszczania; Rf 0,2, dichlorometan/metanol/trietylo-amina, 5:1:0,5, temperatura topnienia 47-48°C.

¹H-NMR (CDCl3, 250 MHz), δ w ppm: 7,4-7,2 (m, 5H), 6,75 (d, 1H, NH), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,9 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 2,3-2,6 (m, 7H), 1,7-1,2 (m, 24H), 0,9 (t, 3H).

¹³C-NMR (CDCl3, 63 MHz), δ w ppm: 171,86, 138,13, 128,37, 127,87, 127,75, 76,8!, 71,50, 64,57, 51,38, 41,51, 41,17, 33,89, 31,82, 29,26, 28,57, 28,03, 25,07, 22,60, 14,04.

(2R)-5-Amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentanol-1 można otrzymać drogą tej samej kolejności reakcji zastępując w etapie 6 w przykładzie II kwas (R)-3-benzyloksytridekanokarboksylowy kwasem (R)-3-dodekanoiloksytridekanokarboksylowym.

P r zyk ł a d III

1-Wodorofosforan 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekanodiolu-1,10

1. Sprzęganie peptydowe

W roztworze kwasu (2RS)-4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-propanokarboksylowego (1,0 mmol), otrzymanego w przykładzie I, rozpuszczonego w 20 ml chlorku metylenu, dyspergowano 363,6 mg (1,2 mmola) IIDQ (1-izobutyloksy-2-izobutyloksykarbonylo-1,2-diwodorochinolina). Po 15 minutach mieszania dodano 1,0 mmol (2R)-5-amino-2-[(R)-benzyloksytetradekanoiloamino]pentanolu-1 otrzymanego w przykładzie II w 10 ml chlorku metylenu i utrzymywano mieszaninę reakcyjną z mieszaniem w ciągu 4 godzin. Roztwór zatężono, a pozostałość oczyszczono drogą chromatografii „Flash” (CH2Cl2/aceton, 5:2, Rf 0,23). Rozpuszczalnik odpędzono otrzymując w ten sposób bezbarwny syrop (0,620 g, wydajność 52,7%) pseudodipeptydu fosforylowanego; Rf 0,49, dichlorometan/metanol/trietyloamina, 10:1:0,5.

¹H-NMR (CDCl3, 250 MHz), δ w ppm: 7,40-7,15 (m, 15H), 7,00 (m, 1H), 6,90 i 6,80 (2d, 2 diast., 1H), 6,65 (d, 1H) (3 x NH), 5,15 (m, 1H), 4,50 (m, 3H), 4,30 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 2,41-2,14 (m, 8H), 1,6-1,4 (m, 8H), 1,4-1,1 (m, 54H), 0,9 (t, 9H, 3CH3).

¹³C-NMR (CDCl3, 63 MHz), δ w ppm: 173,11, 171,68, 170,52 (2 diast.), 169,94 (2 diast.), 150,0 (d, ²JP,C=7,2Hz), 138,20 (2 diast.), 129,58, 127,99, 127,49, 127,26, 125,24, 119,73 (t, ³JP,C=5,0Hz), 76,48, 71,12, 70,71, 65,36 (szeroki), 64,22, 50,96, 49,71 (szeroki), 41,46, 41,05, 39,07, 34,13, 34,00, 32,70, 31,61, 29,34, 29,06, 28,87, 27,98, 25,25, 24,92, 24,72, 22,38, 13,80.

2. 1-(Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekanol-10

Roztwór otrzymanego wyżej pseudodipeptydu fosforylowanego (488 mg, 0,42 mmola) i kwasu octowego (1,9 ml) w 65 ml etanolu o czystości HPLC umieszczono w kolbie trójszyjnej i dodano do niego 200 mg 10% palladu na węglu. Powietrze usunięto pod próżnią, a następnie do kolby wprowadzono wodór. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia w ciągu 2 godzin, po czym oddzielono katalizator przez filtrację na membranie i odpędzono rozpuszczalnik pod próżnią otrzymując z wydajnością 92% surowy produkt. Próbkę produktu oczyszczono drogą chromatografii „Flash” (CH2Cl2/aceton, 5:4, Rf 0,24). W ten sposób otrzymano stałą substancję szklistą; Rf 0,68, chlorek metylenu/metanol, 5:2.

¹³C-NMR (CDCl3, 63 MHz), δ w ppm (kilka podwójnych sygnałów na skutek obecności diastereoizomerów): 173,60, 173,15, 170,67, 170,60, 170,27, 170,07, 150,24 (d), 129,92, 125,66, 120,05 i 119,90 (2d), 71,11, 71,05, 68,83, 66,21 (szeroki), 64,71, 51,38, 50,32, 50,12, 43,25, 43,12, 41,66, 41,57, 39,30, 37,26, 34,45, 32,84, 31,86, 29,62, 29,50, 29,29, 29,13, 28,08, 25,57, 25,19, 24,97, 22,62, 14,03.

3. 1-Diwodorofosforan 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradeka-noiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoilo-amino]dekanodiolu-1,10

W kolbie trójszyjnej uaktywniano wstępnie w ciągu 10 minut za pomocą wodoru tlenek platyny (137 mg) w absolutnym etanolu (5 ml). Następnie dodano roztwór 1-(difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekanolu-10 (411 mg, 0,38 mmola) w absolutnym etanolu (20 ml). Powietrze odpędzano pod wysoką próżnią, a następnie napełniano kolbę wodorem. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia w ciągu 2 do 3 godzin, katalizator oddzielono przez filtrację na membranie, a rozpuszczalnik odpędzono pod próżnią. Ostatecznie otrzymano nieoczyszczony produkt w postaci bezbarwnej substancji stałej (wydajność brutto 98%); Rf 0,50, chloroform/metanol/woda, 6:4:0,6.

PL 195 764 B1

1-Diwodorofosforan 3-[(R)-3-Hydroksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]dekanodiolu-1,10możnaotrzymaćwychodzączkwasu4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]propanokarboksylowegowtejsamejkolejności reakcji (Schemat3)(Fig.35).

Alternatywnie 1-diwodorofosforan 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekanodiolu-1,10 otrzymuje się wychodząc z kwasu asparaginowego z tą samą kolejnością następujących reakcji (schematy syntezy 1, 5i 6, Fig. 33, 37 i 36): zabezpieczenie wolnej grupy funkcyjnej OH (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentanolu-1 przez ugrupowanie benzyloksy-metylowe, uwolnienie 5-aminowej grupy funkcyjnej tego związku drogą wodorolizy, sprzęganie peptydowe tej aminy z monoestrową pochodną kwasu D-albo L-asparaginowego zawierającego na swojej aminowej grupie funkcyjnej albo grupę zabezpieczającą albo grupę (R)-3-dodekanoiloksy-tetradekanoilową, uwolnienie i redukcja końcowej karboksylowej grupy funkcyjnej za pośrednictwem mieszanego bezwodnika, usunięcie grupy zabezpieczającej, jeżeli jest to konieczne, z aminowej grupy funkcyjnej pochodzącej od kwasuasparaginowego, a następnie N-acylowanie za pomocą pochodnejkwasu(R)-3-dodekanoiloksytridekanokarboksylowego, fosforylowanie hydroksylowej grupy funkcyjnej w położeniu C-1, a na koniec odblokowanie fosforanowych grup funkcyjnych i grup hydroksylowych drogą wodorolizy.

Przykład IV

Otrzymywanie 1,10-bis(diwodorofosforanu) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekanodiolu-1,10

1-(Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]dekanol-10 (985 mg, 0,84 mmola) traktowano N,N-dietylofosforamidytemdibenzylu(0,58ml, czystość 85%) w obecności [1H]-tetrazolu (182 mg) w tetrahydrofuranie (35 ml) w ciągu 30 minut w temperaturze otoczenia. Pośredni fosforyn utleniano przez dodanie roztworu kwasu m-chloronadbenzoesowego (535 mg) w 25 ml chlorku metylenu w temperaturze od 0° do -20°C. Po 20 minutach dodano roztwór Na2S2O3 (20 ml) w celurozłożenia nadmiaru środka utleniającego, a następnie rozcieńczano eterem fazę organiczną. Fazę organicznąoddzielano, przemywano kolejno wodnym roztworem Na2S2O3 (5 x20 ml), roztworem NaHCO3 (2 x 20 ml),a następnie wodnym kwasem chlorowodorowym (20 ml),suszono nad MgSO4 izatężano. Nieoczyszczony produkt oczyszczano drogą chromatografii „Flash” na żelu krzemionkowym (CH2Cl2/aceton, 10:3), W ten sposób otrzymaną zabezpieczoną pochodną difosforylowaną (900 mg, wydajność 75%, Rf 0,64, dichlorometan/aceton, 5:2) poddano uwodornianiu katalitycznemu w metanolu o czystości HPLC (100 ml) w obecności 10% palladu na węglu (300 mg) pod ciśnieniem atmosferycznym przez 4 godziny w temperaturze otoczenia. Katalizator usuwano przez filtrację na membranie, a przesącz zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując nieoczyszczony 10-(dihydroksyfosforyloksy)-1-(difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan (Rf 0,6, chloroform/metanol/woda, 6:4:0,6) z wydajnością 89%. Ten produkt poddano następnie uwodornianiu katalitycznemu na tlenku platyny (380 mg) w etanoluoczystościHPLC(130mg) przez 24 godzinyw temperaturze otoczenia pod ciśnieniem atmosferycznym. Następnie katalizator usuwanoprzezfiltracjęnamembranie, a przesącz zatężano otrzymując wolny bis-diwodorofosforan (Rf0,20, chloroform/MeOH/woda, 6:4:0,6).

1,10-bis(Diwodorofosforan) 3-[(R)-3-hydroksytetra-dekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetra-dodekanoiloamino]dekanodiolu-1,10 można otrzymać wychodząc z kwasu 4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)benzyloksy-tetradekanoiloamino]propanokarboksylowego i (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentanolu-1z tą samą kolejnością reakcji (Schemat 3, Fig. 35).

Alternatywnie 1,10-bis(diwodorofosforan) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekanodiol-1,10 można otrzymać wychodząc z kwasu asparaginowego z ciągiem następujących reakcji (Schematy syntezy 1, 4 i 6): uwalnianie 5-aminowej grupy funkcyjnej (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentanolu-1 drogą wodorolizy, sprzęganie peptydowe tej aminy z monoestrową pochodną kwasu D- albo L-asparaginowego zawierającego w swojej aminowej grupie funkcyjnej albo grupę zabezpieczającą albo grupę (R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilową, uwalnianie i redukcjakońcowej karboksylowej grupy funkcyjnej za pośrednictwem mieszanego bezwodnika, usuwanie grupy zabezpieczającej, jeżeli jest to konieczne, z aminowej grupy funkcyjnej pochodzącej od kwasu asparaginowego, a następnie N-acylowanie za pomocą pochodnej kwasu (R)-3-dodekanoiloksytridekanokarboksylowego, fosforylowanie

PL 195 764 B1 hydroksylowych grup funkcyjnych w położeniu C-1 i C-10, i końcowe odblokowanie fosforanowych grup funkcyjnych i hydroksylu drogą wodorolizy.

Przykład V - Oczyszczanie i analiza związków według wynalazku

1. Oczyszczanie związków monofosforylowanych i difosforylowanych

Produkty syntezy związków mono- i difosforylowanych rozpuszczano w mieszaninie woda/izopropanol (1:1 objętościowo) z 0,1% trietyloaminy uzyskując pH od 8do 9. Następnie dodano taką ilość 2M wodorowęglanu amonowego, która była konieczna do uzyskania stężenia 25 mM.

Oczyszczanie prowadzono drogą preparatywnej chromatografii HPLC z odwróconą fazą w następujących warunkach:

Kolumna: Bondapack C18 PrepPak, 40 x 200 mm, 15-20 μm, 300 A, Waters,

Fazaruchoma: A: izopropanol/woda (1 :1 , objętościowo),

50mMwodorowęglanamonowy,

B: izopropanol/woda (2:8, objętościowo),

50mMwodorowęglanamonowy,

Przepustowość: 40ml/min

Elucja: adsorpcja izokratyczna na kolumnie: 40% B (60% A), 10minut, gradient A:B: 40 do 80% B w ciągu 10 minut, elucja izokratyczna 80% B, 30 minut,

Przemywanie: 100%B,10minut

Wykrywanie: UV,210nm

W takich warunkach wymywania czas retencji związku monofosforylowanego wynosił od 18do25 minut. W przypadku zaobserwowania obecności produktów monofosforylowanych (niecałkowite usunięcie grup zabezpieczających w czasie końcowego odfenylowania), trzeba było przeprowadzić dokładniejsze oczyszczanie.Takie oczyszczanie dodatkowe prowadzono w następujących warunkach:

Kolumna: Kromasil C18, 21 x 250 mm, 5 μm, 100 A, Macherey-Nagel

Fazaruchoma: A: izopropanol/woda (1:1, objętościowo),

50mMwodorowęglanamonowy,

B: izopropanol/woda (2:8, objętościowo),

50mMwodorowęglanamonowy,

Przepustowość: 40ml/min

Elucja: adsorpcja izokratyczna na kolumnie: 40% B (60% A), 10 minut, elucjaizokratyczna:

związek monofosforylowany: 80% B, 30 minut związek difosforylowany: 74% B, 30 minut

Przemywanie: 100%B,10minut,

Wykrywanie: UV,210i254nm

Frakcje zawierające związki monofosforylowane albo difosforylowane w postaci soli amonowych zbierano i zatężano drogą adsorpcji na fazie C18 Bondapack, 15-20 μm, 300 A, Waters. Sól sodową związków monofosforylowanych i difosforylowanych otrzymywano drogą przemywania za pomocą roztworu NaCl o stężeniu 10 g/lw wodzie/izopropanolu (9:1, objętościowo). Po usunięciu nadmiaru NaCl przez przepuszczenie 5 objętości mieszaniny woda/izopropanol (9:1, objętościowo) na kolumnie związek poddano wymywaniu za pomocą czystego izopropanolu. Ten rozpuszczalnik odparowano następnie do sucha na wyparce obrotowej. Końcowe rozpuszczanie prowadzono w wymaganej objętości wody (dodano0,1%trietanoloaminywprzypadkuzwiązkumonofosforylowanego) w celu uzyskania stężenia docelowego 2 mg/ml. Filtrację sterylizującą prowadzono następnie na filtrze 0,2 μm, Express Membrane, Millipore (jeżeli objętość była mniejsza niż 50 ml: system Steriflip, a jeżeli objętość była większa niż 50 ml: system Steritop). W przypadku związku monofosforylowanego sonifikację roztworu (3 razy w ciągu 10 sekund) w temperaturze otoczenia prowadzonoprzed filtracją sterylizującą.

2. Monitorowanie i wydajność oczyszczania

Po każdym etapie frakcje analizowano drogą chromatografii analitycznej HPLC w fazie odwróconej zgodnie z następującymi warunkami:

Kolumna: Supelcosil C18, 3 μm, 4,6 x 150 mm, 100 A, Supelco

Faza ruchoma: A: woda/acetonitryl (1 :1 , objętościowo),

5mMTBAP

B: woda/izopropanol (1:9, objętościowo),

5mMTBAP

PL 195 764 B1

TBAP: fosforan tetrabutyloamoniowy

Przepustowość: 1 ml/min

Elucja: gradient A:B (75:25 do 0:100) w ciągu 37,5 minut

Wykrywanie: UV, 210i 254 nm.

W tych warunkach chromatograficznych czasy retencji obserwowane w przypadku związków mono- i difosforylowanych wynosiły odpowiednio 25,5 ± 0,5 i 20,8 ± 0,5 minut. Uzyskane wydajności oczyszczania zmieniały się od 57 do 94% w przypadku związku monofosforylowanego i od 71 do 92% w przypadku związku difosforylowanego. Otrzymano odpowiednio 311 mg i 189 mg związków monoi difosforylowanych.

3. Oznaczanie i analiza czystości produktów końcowych

Oznaczanie i kontrolę czystości otrzymanych produktów prowadzono drogą chromatografii HPLC/UV w opisanych wyżej warunkach chromatograficznych. Zgodnie z tymi analizami uzyskane czystości w przypadku różnych partii wytworzonych związków mono- i difosforylowanych zmieniały się od 99 do 100%. Aby wykazać obecność nieczynnych zanieczyszczeń w UV przeprowadzono analizy LC/ES-MS (jonizacja typu elektrorozpylania w trybie dodatnim). W przypadku tych ostatnich fosforan tetrabutyloamoniowy (5 mM) zastąpiono octanem amonowym (25 mM) w celu spełnienia warunków jonizacji na powierzchni rozdziału przy elektro-rozpylaniu.

Zastosowano alternatywne sposoby oznaczania roztworów końcowych. Można na przykład zacytować analizę ilościową fosforanów całkowitych (przystosowaną od Ames, B.N., Methods in Enzymology VII (1966), 115-117), aminokwasów (przystosowaną od Hughes et al., J. Chromatogr. 389 (1987), 327-33) i łańcuchów acylowych (przystosowaną od Miller, L.T., Hewlett-Packard Application Note (1984), 228-237).

4. Analizy spektroskopowe

4.1 Spektrometria masowa

Widma ES-MS (tryb dodatni i ujemny) związków mono- i difosforylowanych zmierzono na trzech typach spektrometrów masowych (Finnigan LCQ, pułapka jonowa, Micromass Quatro II, kwadrupol potrójny, Hewlett-Packard MSD, kwadrupol pojedyńczy). Przeprowadzono również analizy uzupełniające typu MS/MS. Widma potwierdzające identyczność i czystość produktów są załączone w załączniku.

Widma ES-MS (tryb dodatni)

Związek difosforylowany:

(Micromass Quattro II: widmo 1; HP-MSD: widmo 3) (Fig. 39i 41)

Przy niskiej energii obserwowano większościowy jon pseudocząsteczkowy o m/z 1014,6 [M+H]⁺. Widoczne były również addukty sodowe o m/z 1036,6 [M+Na]⁺, 1058,6 [M+H+2Na]⁺ i 1080,5 [M+2H+3Na]⁺.

Zgodnie z wybranym stopniem fragmentacji obserwowano dwa fragmenty o m/z 916,5 [M-98+H]⁺, i 818,6 [M-98+H]⁺ potwierdzające obecność dwóch grup fosforylowych w cząsteczce. Jak pokazuje widmo 3 (Fig. 41), względna intensywność zaobserwowanych jonów zmienia się znacznie w zależności od przyłożonej energii.

Związek monofosforylowany:

(Micromass Quattro II: widmo 2) (Fig. 40)

Trochę inny schemat jonizacji otrzymano w przypadku związku monofosforylowanego na skutek obecności w analizowanych roztworach trietanoloaminy (TeoA). Obserwowano większościowy jon pseudocząsteczkowy o m/z 934,4 [M+H]⁺, jak również addukty sodowe [M+Na]⁺ i potasowe [M+K]⁺o m/z odpowiednio 956,3 i 972,3. Widoczna była również druga grupa adduktów o m/z 1083,4 [M+TeoA+H]⁺, m/z 1105,3 [M+TeoA+Na]⁺ i m/z 1121,3 [M+TeoA+K]⁺. Obecność grupy fosforylowanej w cząsteczce potwierdzano fragmentem om/z [M-98+H]⁺ obserwowanym przy wysokiej energii.

Widma ES-MS (tryb ujemny)

Jony obserwowane w widmach ES-MS związków mono- i difosforylowanych w trybie ujemnym były całkowicie zgodne z wynikami uzyskanymi w trybie dodatnim.

Przeprowadzono również analizy jonizacyjne FAB (tryb dodatni). Przy niskiej rozdzielczości związki mono- i difosforylowane stanowią addukty sodowe o m/z odpowiednio 956,5 i 1036,5.

Przy wysokiej rozdzielczości (matryca na bazie alkoholu 3-nitrobenzylowego) obserwowano pik o m/z 956,667 dla monofosforanu, co odpowiada przewidywanemu wzorowi cząsteczkowemu C49H96O11N3PNa (masa obliczona 956,668 amu).

W przypadku fosforanu zmierzono pik o m/z 1036,635, co odpowiada przewidywanemu wzorowi cząsteczkowemu C49H97O14N3P2Na (masa obliczona: 1036,634 amu).

PL 195 764 B1

Wszystkie analizy MS świadczą o wysokiej czystości otrzymanych produktów.

4.2 Magnetyczny rezonans jądrowy

Widma ¹H-NMR i ¹³C-NMR związków mono- i difosforylowanych zmierzono na aparatach typu Bruker DPX odpowiednio przy 250,13 i 62,89 MHz, i typu Varian Unity Inova 500 odpowiednio przy 499,87 i 125,7 MHz. Widma ³¹P-NMR rejestrowano przy 121,6 MHz (Bruker DPX). Widma potwierdzające identyczność i czystość produktów przedstawiono w załączniku.

Widma ¹H-NMR (widma 4 i 5, Fig. 42 i 43)

- Związek monofosforylowany: na widmie zarejestrowanym w CDCl3 + 0,1% trietanoloaminy (TeoA, widmo 4) obserwowano sygnały odpowiadające trzem protonom przy atomach azotu N(5), N(2a) i N(2b) pomiędzy 7 i 9,5 ppm (patrz powiększone okienko spektralne). Sygnały przypisane H-N(2a) i H-N(2b) pojawiały się w postaci dwóch dubletów, które świadczą o obecności mieszaniny stereoizomerów. Obserwowano również przewagę jednego z diastereoizomerów (skutek różnych etapów oczyszczania).

- Związek difosforylowany: na widmie zarejestrowanym w CDCl3-CD3OD (3:1, objętościowo, widmo 5) sygnały odpowiadające H-N(5), H-N(2a) i H-N(2b) nie były już widoczne na skutek wymiany w obecności CD3OD. Informacje dodatkowe dotyczące przypisania różnych sygnałów uzyskano drogą doświadczeń z korelacjami homo- i heterojądrowymi (¹H-¹H-NMR: COSY, ¹H-¹³C-NMR: HSQC i HMBC).

Widma ¹³C-NMR (widma 6 i 7, Fig. 44 i 45)

Rejestracja widm ¹³C-NMR jest szczególnie trudna w skutek słabej rozpuszczalności związków mono- i difosforylowanych.

Widma ³¹P-NMR (widma 8 i 9, Fig. 46 i 47)

W przypadku dwóch związków mono- i difosforylowanych obserwowano pik pojedyńczy.

P r zyk ł a d- V Badania farmakologiczne związków według wynalazku

1. Oznaczanie endotoksyczności za pomocą testu chromogennego w Limulus

Endotoksyczność oznaczano za pomocą chromogennego testu z produktami lizy Limulus Amoebocyte (chromogenny LAL z Charles River Endosafe, partia # EK4121E, Charleston, USA). Test ten jest oparty na aktywacji przez lipopolisacharydy (LPS), albo produkty o porównywalnej strukturze, kaskady enzymatycznej obecnej w LAL. O tej aktywacji enzymatycznej świadczy cięcie przez proteazę chromogenu związanego z peptydem, na końcu łańcucha kaskady enzymatycznej według następującej reakcji:

LPS albo PRODUKT aktywacja proteazy LAL i hydroliza peptydu/chromogenu

Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-p-nitroanilina ---->

(bezbarwny)

-----> Ac-Ile-Glu-Ala-Arg + p-nitroanilina (barwny, 405 nm)

Reakcję enzymatyczną prowadzono w temperaturze 37°C, a tworzenie się chromogenu w czasie mierzono przy 405 nm. W etapie końcowym tej metody kinetycznej rejestruje się czas potrzebny dla uzyskania 0,2 jednostki OD i obliczano aktywność endotoksyczną względem wzorca LPS (krzywa wzorcowa).

Wyniki wyrażano w EU (jednostka endotoksynowa) względem standardowego preparatu lipopolisacharydu z E. coli. W przypadku tej serii testów 1 EU odpowiada 0,08 mg równoważnika LPS.

Wyniki wskazują na stosunkowo dużą zmienność, chociaż jest to normalne w przypadku tego rodzaju prób ilościowych, które wskazują przede wszystkim na rząd wielkości. Test LAL wykorzystuje się przede wszystkim do wykazania braku pirogenów (górna granica stężenia endotoksyny) w preparatach farmaceutycznych. Oznaczanie ilościowe zawartości pirogenów powinno być bezwarunkowo porównywane wtej samej indywidualnej serii standardowych doświadczeń.

PL 195 764 B1

Wyniki

Wyniki (średnia ± odchylenie standardowe) uzyskane dla produktów według wynalazku przedstawionowtabeli(a):

Tabela (a)

Aktywacja produktów lizy z Limulus amebocyte (LAL)

Produkty	Aktywność LAL w EU/mg	Aktywność LAL w równoważnikach LPS ng równ. LPS/mg
OM-294-DP	56 ± 43	6,2
OM-294-MP	13 ± 2	1,4
LPS z E. coli (odnośnik)	7,7 ± 1,6 x 10⁶	0,85 x 10⁶

Związki według wynalazku były w teście LAL 10⁶ mniej aktywne niż LPS. OM-294-DP i OM-294-MP są zatem produktami szczególnie interesującymi ze względu na swoją słabą toksyczność, związaną z ich zdolnością do indukowania immunomodulującej aktywności biologicznej (in vivoi in vitro).

2. Oznaczanie rozrostu komórek macierzystych szpiku kostnego myszy w odpowiedzi na stymulacjęLPS albo związkami według wynalazku

Protokół

Dwie myszy płci męskiej C57/BL6 w wieku 6 tygodni uśmiercono drogą inhalacji CO2, a następnie skręcenia szyi. Myszy wymyto w alkoholu i ściągnięto całkowicie skórę z tylnych członków. Kości stawów biodrowych, ud i piszczeli usunięto na poziomie stawów. Mięso usunięto w większości za pomocą skalpela. Kości oczyszczono, a końce kości pocięto za pomocą nożyc. Szpik ekstrahowano ze światła kości przez 3-krotne wstrzyknięcie 1ml pożywki Eagle modyfikowanej przez Dulbecco (pożywka DH) przez końce, które zostały odcięte nożycami. Komórki zawieszono w pożywce DH i wirowano przez 5 minut z prędkością 300x g. Supernatant odrzucono, a komórki macierzyste zawieszono w pożywce DH uzupełnionej 20% płodową surowicą cielęcą (FCS). Stężenie komórek nastawiono na 500000 komórekna ml.

Produkty rozpuszczone w pożywce DH uzupełnionej FCS, aminokwasami i antybiotykami rozcieńczano seryjnie, bezpośrednio w mikropłytce z 96 wgłębieniami, przy czym prowadzono 9 rozcieńczeń ze współczynnikiem rozcieńczania 3,16. Produkty badano w seriach po sześć, a każda płytka zawierała kontrolę negatywną złożoną z samej pożywki. Objętość końcowa w każdym wgłębieniu wynosiła 100 μ|. Mikropłytki poddano inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w atmosferze 8% CO2 w inkubatorze nasyconym wilgocią w celu buforowania pożywki. Po 1 godzinie do produktów dodano 100 μΙ zawiesiny komórek i kontynuowano inkubację przez 7 dni.

Rozrost oznaczano drogą pomiaru ut|eniania substratu chromogennego (XTT) w mitochondriachżywychkomórek.

Po 7 dniach mikropłytki poddano wirowaniu przez 5 minut z prędkością 400 x g, pobierano i usuwano 100 μΙ supernatantu. Do każdej płytki dodawano 50 μΙ roztworu zawierającego 1 mg/ml XTT, 3-[1-feny|oamino-karbony|o)-3,4-tetrazo|ium]-bis[(4-metoksy-6-nitro)-benzenosu|fonianu sodowego, i 0,008 mg/ml PMS (metylosiarczan N-metylodibenzopirazyny) w pożywce RPMI. Po 8 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C w atmosferze 8% CO₂ w inkubatorze nasyconym wilgocią mikropłytki poddano odczytowi w spektrofotometrze przy długości fali 490 nm względem odnośnika 690 nm.

Wyniki przedstawiająjako wartości średnie (± odchylenie standardowe) w postaci krzywej dawka/odpowiedź. Wartości kontroli negatywnej złożonej z pożywki DH (średnia ± odchylenie standardowe wszystkich danych doświadczalnych) są również przedstawione w postaci graficznej.

W tym doświadczeniu związki według wynalazku indukowały znaczący rozrost macierzystych komórek szpiku kostnego myszy. Był on prawie tak samo znaczny jak rozrost indukowany przez LPS E. coli, lecz stężenie minimalne konieczne do indukowania znacznej reakcji było wyższe. Produkt monofosforylowany indukował słabszą odpowiedź niż odpowiedź indukowana przez produkt difosforylowany. Na fig. 1 przedstawiono reprezentatywne doświadczenie pochodzące ze zbioru 3 niezależnych doświadczeń uzyskanych w partii różnych preparatów komórkowych.

PL 195 764 B1

3. Oznaczanie wytwarzania tlenku azotu w klarownych cieczach makrofagów

Protokół

Dwie myszy C57/BL6 płci męskiej w wieku 6 tygodni uśmiercono drogą inhalacji CO2, a następne zwichnięcia szyi. Myszy myto w alkoholu i całkowicie ściągano skórę z tylnych członków. Kości biodrowe, udowe i piszczelowe usuwano na poziomie stawów. Mięso usuwano głównie za pomocą skalpela. Kości oczyszczano i odcinano ich końce za pomocą nożyc. Szpik ekstrahowano przez wstrzyknięcie 3 razy po 1ml pożywki Eagle zmodyfikowanej przez Dulbecco (pożywka DH) do światła kości. Komórki zawieszano w pożywce DH i poddano wirowaniu przez 5 minut z prędkością 300 x g. Supernatant odrzucano, a komórki zawieszano do stężenia 40000 komórek na ml w pożywce DH uzupełnionej 20% surowicy końskiej (HS) i 30% supernatantu z hodowli L929. L929 są linią fibroblastówmysz, przy czym supernatant znadhodowli tych komórek jest bogaty w czynnik wzrostu dla makrofagów (M-CSF). Zawiesinę komórek rozdzielano po 12 ml do płytek Petriego, które poddano inkubacji przez 8dni w temperaturze 37°C w atmosferze 8% CO2 w inkubatorze nasyconym wilgocią. Po 8 dniach komórki macierzyste zróżnicowały się w dojrzałe makrofagi. Makrofagi zdrapano drogą inkubacji przez 45 minut w temperaturze 4°C w zimnym PBS. Po wirowaniu i usunięciu komórki zawieszano w pożywce DH uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą (FCS), glutaminą, asparaginą, argininą, kwasemfoliowym,merkaptoetanolemi antybiotykami (penicylina i streptomycyna). Komórki macierzyste zbierano i nastawiano stężenie komórek na 700000 komórek na ml.

Produkty rozpuszczone w pożywce DH uzupełnionej FCS, aminokwasami i antybiotykami rozcieńczano seryjnie bezpośrednio w mikropłytce z 96 wgłębieniami. Prowadzono 9 do 10 rozcieńczeń w zależności od produktów, ze współczynnikiem rozcieńczenia 3,16. Produkty badano w trzech powtórzeniach, a każda mikropłytka zawierała kontrolę negatywną złożoną z samej pożywki. Objętość końcowa w każdym wgłębieniu wynosiła 100 pi. Mikropłytki poddano inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w atmosferze 8% CO2 w inkubatorze nasyconym wilgocią w celu buforowania pożywki. Po 1 godzinie do produktów dodano 100 μl zawiesiny komórek i kontynuowano inkubację przez 22 godziny.

Po 22 godzinach makrofagi poddano wirowaniu przez 5minut z prędkością 400 x g i pobierano100 μl supernatantu, i przenoszono do mikropłytki. Do każdego wgłębienia dodano 100 μl odczynnika Griessa 5 mg/ml sulfanilamidu +0,5 mg/ml chlorowodorku N-(1-naftyloetylenodiaminy) w 2% wodnym kwasie fosforowym. Mikropłytki poddano odczytowi w spektrofotometrze przy długości fali 562 nm względem odnośnika o długości 690 nm. Stężenie azotynu jest proporcjonalne do stężenia tlenku azotu. Stężenie azotynu oznaczano względem krzywej standardowej, liniowej w zakresie od 1 do 25 μΜ azotynu.

Wyniki przedstawiono po odjęciu kontroli negatywnej jako średnią ± odchylenie standardowe w postaci krzywej dawka/odpowiedź.

W tym doświadczeniu związki według wynalazku indukowały wytwarzanie tlenku azotu przez makrofagi gryzoni w sposób zgodny z krzywą dawka-odpowiedź. Produkt difosforylowany indukował rozrost większy niż rozrost indukowany przez LPS z E. coli, lecz minimalne stężenie konieczne do indukowania znaczącej odpowiedzi było wyższe. Produkt monofosforylowany indukował słabszą odpowiedź niż odpowiedź indukowana przez produkt difosforylowany i LPS z E. coli. Na fig. 2 przedstawiono reprezentatywne doświadczenie pochodzące z zespołu 3 niezależnych doświadczeń uzyskanych z różnych preparatów komórkowych.

4. Oznaczanie zdolności związków według wynalazku do aktywowania wytwarzania α-TNF przez ludzkie makrofagi pęcherzykowe

Protokół

Otrzymywanie makrofagów pęcherzykowych: Ludzkie makrofagi pęcherzykowe otrzymano drogą przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) płuc pacjentów cierpiących na raka płuc. BAL prowadzono bezpośrednio po zabiegu chirurgicznym na tkance płucnej pochodzącej ze zdrowych części płata płucnego. Przemywanie prowadzono za pomocą 0,9% NaCl strzykawką o pojemności 50ml. Otrzymane komórki składały się w ponad 85% z makrofagów, a inne komórki stanowiły głównie limfocyty. Po wirowaniu komórki zawieszano w pożywce RPMI, a czerwone ciałka krwi usuwano drogą wirowania na Ficoll Pack (Research Grade). Makrofagi przemywano 3 razy HBSS i posiewano w mikropłytkach z 24 wgłębieniami, w ilości 1ml na wgłębienie zawierające ogółem 1000000 komórek. Po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C makrofagi przylegały, a wgłębienia przemywano 3 razy po 1 ml HBSS w celu usunięcia komórek nieprzylegających. Po przemywaniach do każdego wgłębienia zawierającego makrofagi dodano 1ml RPMI.

PL 195 764 B1

Inkubacja z produktami i oznaczanie α-TNF: makrofagi pęcherzykowe poddano inkubacji w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO₂, ze stężeniami 0,1 μg/ml, 1 μg/ml i 10 μg/ml następujących produktów:

-kontrolanegatywna:RPMI

-kontrolapozytywna:LPSz E. coli (serotyp O5:B5, Difco, Detroit, USA)

- związek monofosforylowany według wynalazku (OM-294-MP)

- związek difosforylowany według wynalazku (OM-294-DP)

Supernatanty znad hodowli zbierano po 24 godzinach i analizowano pod kątem zawartości w nich α-TNF (zestaw Kit BioSource Cytoscreen, Camarillo, CA, USA) z granicą wykrywalności 1 pg/ml.

Wyniki

Pochodne monofosforylowane i difosforylowane według wynalazku indukowały umiarkowane wytwarzanie α-TNF począwszy od stężenia 10 μg/ml. Pochodna monofosforylowana według wynalazku indukowały wytwarzanie α-TNF w większym stopniu niż wytwarzanie indukowane przez pochodną difosforylowaną. Kontrola pozytywna LPS indukowała przy 3 badanych stężeniach zwiększone wytwarzanie α-TNF. Wyniki przedstawiono w tabeli (a).

Tabela (a)

Indukcja przez OM-294-MP i OM-294-DP wytwarzania α-TNF przez ludzkie makrofagi pęcherzykowe

			α-TNF [pg/ml]
		średnia + odchylenie standardowe z 3
			niezależnych doświadczeń
Produkt	0 pg/ml	0,1 pg/ml	1 pg/ml	10 pg/ml
Kontroia negatywna: RPMI Kontrola pozytywna: LPS z E. coli	195±70		7667±1115	9858±2148	10390±3415
OM-294-MP-1			246±38	353±75	1049±295
OM-294-MP-2			205±62	291±70	1124±406
OM-294-DO-1			156±66	117±85	329±141
OM-294-DP-2			171±79	88±61

5. Oznaczanie zdolności związków według wynalazku do hamowania wytwarzania α-TNF wludzkichmakrofagach pęcherzykowych, indukowanego przez liposacharyd z E. coli (LPS)

Protokół

Otrzymywanie makrofagów pęcherzykowych: Ludzkie makrofagi pęcherzykowe otrzymano drogą przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) płuc pacjenta cierpiącego na raka płuc. BAL prowadzono bezpośrednio po zabiegu chirurgicznym na tkance płucnej pochodzącej ze zdrowych części płata płucnego. Przemywanie prowadzono za pomocą 0,9% NaCl strzykawką o pojemności 50 ml. Otrzymane komórki składały się w ponad 85% z makrofagów, a inne komórki stanowiły głównie limfocyty. Po odwirowaniu komórki zawieszano w pożywce RPMO, a czerwone ciałka krwi usuwano drogą odwirowania na Ficoll Pack (Research Grade). Makrofagi przemywano 3 razy HBSS i posiewano do mikropłytek zawierających 24 wgłębienia w ilości 1 ml na wgłębienie zawierające ogółem 1000000 komórek. Po jednej godzinie inkubacji w temperaturze 37°C makrofagi przylegały i wgłębienia przemywano 3 razy po 1ml HBSS w celu usunięcia komórek nieprzylegających. Po przemyciu do każdego wgłębienia zawierającego makrofagi dodawano 1 ml RPMI. Inkubacja z produktami i oznaczanie α-TNF: makrofagi pęcherzykowe poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 z LPS z E. coli (serotyp O5: B5, Difco, Detroit, USA) przy stężeniu 1 μg/ml, do których dodano jednocześnie następujące produkty o stężeniu 10 μg/ml:

-kontrolanegatywna:RPMI

- związek monofosforylowany według wynalazku (OM-294-MP)

- związek difosforylowany według wynalazku (OM-294-DP)

Po 24 godzinach zbierano supernatanty znad hodowli i analizowano pod kątem zawartości α-TNF (zestaw Kit BioSource Cytoscreen, Camarillo, Ca, USA) z granicą wykrywalności 1pg/ml.

PL 195 764 B1

Wyniki

Pochodna difosforylowana hamowała w sposób znaczący indukowane normalnie przez LPS wytwarzanie α-TNF. Pochodna monofosforylowana hamowała częściowo wytwarzanie α-TNF indukowane przezLPS. Wyniki przedstawiono wtabeli (a).

T ab el a (a)

Hamowanie przez OM-294-MP i OM-294-DP indukowanego przez LPS wytwarzania α-TNF w ludzkich makrofagach pęcherzykowych

Produkt	α-TNF [pg/ml]	% hamowania
RPMI (kontrola negatywna)	73	—
Tylko LPS z E. coli (1 pg/ml) (kontrola pozytywna)	8170	0
OM-294-MP-1 (10 pg/ml) + LPS z E. coli (1 pg/ml)	4577	44
OM-294-MP-2 (10 pg/ml) + LPS z E. coli (1 pg/ml)	4789	41
OM-294-DP-1 (10 pg/ml) + LPS z E. coli (1 pg/ml)	1267	84
OM-294-DP-2 (10 pg/ml) + LPS z E. coli (1 pg/ml)	1280	84

6.WpływproduktówOM-294-MPi OM-294-DP na dojrzewanie ludzkich komórek dendrytycznych

Oceniono zdolność produktów OM-294-MP i OM-294-DP do indukowania dojrzewania komórek predendrytycznych w komórki dendrytyczne, przy czym mierzono następujące parametry: wprowadzaniedekstranuFITCi ekspresja cząsteczek powierzchniowych CD40, CD80, CD83 i CD86.

Protokół

Komórki: jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowano z kożuszków leukocytarnych sześciu dawców krwi. Dawcy przed oddaniem krwi nie byli poddawani żadnemu leczeniu.

Przygotowanie komórek: monocyty oczyszczone drogą selekcji przez przyleganie zawieszano w pożywce RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA), zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej, GM-CSF (10 ng/ml; IM-HGM1, Immungenex Corp., Los Angeles, CA, USA) i IL-4 (10 ng/ml; Nr 204-IL, R&D System, Minneapolis, MN, USA) w ilości 1 x 10⁶ komórek/ml i posiewano na płytki Petriego o średnicy 10 cm (P10, Falcon, Becton Dickinson, Plymouth, UK, 10 x 10⁶ komórek na płytkę P10) przez 6 dni (z wymianą pożywki po 3 dniach). Te komórki są nazywane komórkami predendrytowymi (DC-6). Dojrzewanie komórek predendrytycznych do komórek densdrytycznych prowadzono drogą inkubacji z OM-294-MP, OM-294-DP albo LPS w ciągu 3 dodatkowych dni przy stężeniach podanych niżej pod częścią Produkty. W 9 dniu (DC-9) komórki zbierano do analizy różnych parametrów wskazujących na dojrzałość komórek dendrytycznych, przy czym oceniano cząsteczki powierzchniowe CD40, CD80, CD83, CD86, jak również zdolność do inkorporacji dekstranu-FITC. Wszystkie te parametry analizowano za pomocą aparatury FACS EPICS-XL-MCL (Coulter Immunology, Hialeah, Finlandia) (Lanzavecchia et al., J. Exp. Med. 179 (1994) 1109; Lanzavecchia et al., J. Exp. Med. 182 (1995) 389).

Ocena wyników: ekspresję cząsteczek powierzchniowych podano w % średniej fluorescencji komórek stymulowanych LPS (kontrola pozytywna): inkorporację dekstranu obliczano w stosunku do inkorporacji komórek utrzymywanych w pożywce i podaje w %. W analizie statystycznej za pomocą testu t Studenta porównano wartości otrzymane w różnych testach z wartościami otrzymanymi dla kontroli pozytywnej. Wartości p < 0,05 uważano za wartości znaczące.

Produkty: przygotowano roztwory macierzyste OM-294-DP i OM-294-MP o stężeniu 1 mg/ml w 0,9% wodnym roztworze NaCl, z dodatkiem 0,1% trietyloaminy w przypadku OM-294-MP. Roztwory poddawano inkubacji w temperaturze 37°C przez 20 minut, mieszano energicznie w ciągu 3 minut, a następnie rozcieńczano do stężenia 100 μο/ml w pożywce hodowlanej RPMI 1640 i wykorzystywano albo w stężeniu 10 μο/ml (Fig. 3, 6, 7, 8) albo w stężeniach w granicach od 0,02 do 25 μg/ml (Fig. 4, 5).

Produkt wzorcowy: liposacharyd z E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, USA), roztwór podstawowy 5 mg/ml w PBS. Roztwór pośredni przygotowuje się przy stężeniu 100 μg/ml w pożywce hodowlanym RPMI 1640. Badane stężenia wynoszą albo 10 μg/ml (Fig. 3, 6, 7, 8) albo mają wartości od 0,02 do 10 pg/ml (Fig. 4, 5).

PL 195 764 B1

Wyniki

Niedojrzałe komórki dendrytyczne (DC-6) pochodzące ze zróżnicowania monocytów, poprzez połączone działanie GM-CSF i IL-4, były zdolne do inkorporacji dekstranu-FITC. W czasie procesu dojrzewania komórki traciły tę zdolność. Analizy prowadzono w etapie różnicowania DC-9.

Wyniki podano w % zaobserwowanej inkorporacji dekstranu-FITC w komórkach niestymulowanych (pożywka, Fig. 3). Komórki potraktowane LPS albo OM-294-MP zachowały odpowiednio tylko 10% i 19% fagocytozy, natomiast komórki stymulowane OM-294-DP zachowały całą swoją zdolność do inkorporacji dekstranu (97 i 99%). Krzywa dawka/odpowiedź wskazuje, że OM-294-MP ma wyjątkową zdolność do indukowania różnicowania komórek DC-6 do komórek DC-9 przy stężeniach wynoszących od 0,02 do ponad 25 μg/ml (patrz Fig. 4 - niskie stężenia i Fig. 5 - wysokie stężenia).

Innym kryterium dojrzewania DC jest ekspresja współstymulujących cząsteczek powierzchniowych. Badano ekspresję CD40, CD80, CD83, CD 86, a wyniki przedstawiono w % średniej fluorescencji w stosunku do ekspresji tych markerów indukowanej przez LPS.

OM-294-MO zwiększał ekspresję wszystkich analizowanych cząsteczek powierzchniowych: CD40 (39%), CD80 (62%), CD83 (60%), CD86 (77%) (patrz Fig. 6, 7, 8, 9).

OM-294-DP wykazywał wpływ na ekspresję badanych markerów podobny do wpływu pożywki hodowlanej. Ten wpływ nie przekraczał 20% wpływu LPS.

7. Wpływ produktów OM-294-MP i OM-294-DP na wytwarzanie α-TNF i IL-12p70 przez monocyty i komórki predendrytyczne w etapie DC-6

Komórki DC-6 (5 x 10⁵/500 μΐ pożywka) stymulowano w ciągu 4, 6 i 24 godzin albo LPS (10 pg/ml) albo OM-294-MP (10 pg/ml) lub OM-294-DP (10 pg/ml).

Protokół

Warunki doświadczalne in vitro: Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowano z kożuszków leukocytarnych sześciu dawców krwi (przed oddaniem krwi dawcy nie podlegali żadnemu leczeniu). Monocyty izolowano na gradiencie Ficoll, a następnie oczyszczano drogą selekcji przez przyleganie. Następnie zbierano monocyty przylegające luźno i zachowano część komórek jako monocyty. Oczyszczone monocyty zawieszano w pożywce RPMI-1640, zawierającej 10% FCS, w ilości 1x 10⁶komórek/ml i posiewano na płytki Petriego o średnicy 10 cm (P10-Falcon, Becton Dickinson, Plymouth, UK) w ilości 10 x 10⁶ komórek/płytka P-10. Komórki poddawano hodowli w ciągu 6 dni w pełnej pożywce RPMI1640 zawierającej GM-CSF (10 ng/ml) i IL-4 (10 ng/ml). Po 6 dniu komórki zbierano, przemywano 3 razy HBSS, rozdzielano do płytki z 24 wgłębieniami w ilości 5 x 10⁵ komórek na wgłębienie w 500 pl pełnej pożywki RPMIi stymulowano LPS (10 pg/ml), OM-294-MP (10 pg/ml) albo OM-294-DP (10 pg/ml). α-TNF oraz IL-12p70 oznaczano za pomocą ELISA w supernatantach znad hodowli, które odzyskiwano po 4, 6 i 24 godzinach.

Produkty: produkty PM-294-MP i OM-294-DP (roztwór podstawowy o stężeniu 1mg/ml w sterylnej wodzie) poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut i mieszano energicznie w ciągu 3 minut, a następnie rozcieńczano do 100 pg/ml i wykorzystywano w stężeniu końcowym 10 pg/ml w pożywce hodowlanej RPMI1640.

Produkt wzorcowy: liposacharyd z E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, USA), roztwór podstawowy 5 mg/ml w PBS, roztwór pośredni w pożywce hodowlanej: 100 pg/ml, stosowany w stężeniu końcowym 10 pg/ml.

Oznaczanie α-TNF i IL-12p70: zestaw Kit α-TNF Biosource KHC3012, partia PP003-J061703 (BiosourceInternational, Camarillo,CA,USA). Protokół ELISA według instrukcji zestawu producenta. IL-12p70 oznaczano w supernatantach znad hodowli za pomocą ELISA stosując zestaw dla ludzkiej IL-12 (nr D1200, partia 990 6232, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Wyniki α-TNF

OM-294-MP stymulował wytwarzanie α-TNF przez komórki DC-6 w sposób podobny do wytwarzania LPS zarówno z punktu widzenia kinetyki wytwarzania, jak i stężenia α-TNF (Fig. 10). Maksimum α-TNF znajdowało się w przypadku obu produktów pomiędzy 6 a 24 godziną.

OM-294-DP stymulował tylko marginalnie wytwarzanie α-TNF przez komórki DC-6.

IL-12p70

IL-12 była indukowana na ogół w obecności γ-IFN (LPS + γ-IFN, OM-294-MP + γ-IFN) w monocytach (Fig. 12) i komórkach DC-6 (Fig. 11).Cytokina pojawiała się raczej w DC niż w monocytach.

PL 195 764 B1

Ocena właściwości wspomagających OM-294-DP i OM-294-MP wmodeluimmunizacjimyszy z syntetycznym peptydem (Pb CS His6-242-310) C-terminalnego obszaru proteiny powierzchniowej circumsporozoite z Plasmodium berghei

Protokół

Antygen: peptyd Pb CS (HHHHHHGGMN NKNNNNDDSY IPSAEKILEF VKQIRDSITE EWSQCNVTCG SGIRVRKRKG SNKKAEDLTL EDIDTEI), nazywany dalej His6-242-310, odpowiadający sekwencji aminokwasów 242 do 310 białka cirkumsporozoitu (ang. circumsporozoite) z Plasmodium berghei, szczep ANKA, zawierający 6 reszt histydyny, 2 glicyny i jedną metioninę, dodane do N-terminalnej części, otrzymywano według metody Merrifielda i Althertona (Atherton et al., Bioorg. Chem.8 (1979) 350-351). Polipetydotrzymanonażywicynabazie alkoholup-alkoksybenzylowego (żywicaWang)o stopniu podstawienia 0,4 mmol/g. Stosowano 10-krotnynadmiarmolowy pochodnychF-mocaminokwasówwczasemsprzęgania30minut. Peptyd oczyszczano drogą chromatografii z wykluczeniem wielkości (Sephadex g25, Pharmacia, S), a następnie chromatografii z odwróconą fazą (W-Porex 5 C-4, 250 x 10 mm, Phenomenex,Torrance,CA,USA)zgradientemwciągu40minut wychodzączmieszaniny10do50%acetonitryluw0,1% objętościowo kwasie trifluorooctowym/wodzie, z przepustowością 3 ml/min. Skład aminokwasowy oczyszczonego peptydu oznaczano według Knechta i Changa(Anal.Chem.58(1966) 2373-2379), a masę cząsteczkową potwierdzano drogą spektrometrii masowej na aparaturze Voyager-DE (Perseptive Biosystem, Framingham, MA, USA). Roztwór wyjściowy antygenu otrzymywano o stężeniu 0,4 mg/ml w 0,9% wodnym roztworze NaClipH8,0.

Adiuwanty: roztwory wyjściowe OM-294-DP i OM-294-MP otrzymano o stężeniu1mg/ml w0,9% wodnym roztworze NaCl, z dodatkiem 0,1% trietyloaminy w przypadku OM-294-MP. Kontrolę pozytywną stanowił niekompletny adiuwant Freunda (IFA z Difco, Detroit, MI, USA), a kontrolę negatywną stanowił 0,9% roztwór NaCl.

Mieszaninaantygen-adiuwant:jednąobjętośćantygenuzmieszano z jedną objętością adiuwanta w ciągu 3 minut za pomocą urządzenia Vortex.

Immunizacja: myszy płci męskiej BALB/c w wieku 6 tygodni (6 mysz na grupę) poddawano trzykrotnej immunizacji za pomocą podskórnego wstrzyknięcia w podstawę ogona 0,1 ml następujących mieszanin:

Grupa	Adiuwant 0,05 mg/wstrzyknięcie	Antygen 0,02 mg/wstrzyknięcie	Liczba myszy
1	...	PB CD Hise-242-310	6
2	IFA	PB CD Hise-242-310	6
3	OM-294-MP	PB CD Hise-242-310	6
4	OM-294-DP	PB CD Hise-242-310	6
5	OM-294-MP	---	6
6	OM-294-DP	---	6

Schemat immunizacji i pobieranie próbek:

Tygodnie	0	3	4	7	9
Immunizacje	T	T		T
Reakcja specyficznych przeciwciał	T	T		T	T
Reakcja CTL			T		T

Pobieraniekrwiiorganówlimfoidowych:

Otrzymywaniesurowicy:pobieraniepróbekkrwiodbywało się w odstępach czasowych 0, 3, 7 i 9 tygodni. Krew pozostawiano na 60 minut w temperaturze 37°C, a następnie umieszczano na noc wtemperaturze4°C.Nakoniecsurowicęzamrażanowtemperaturze-80°Cażdoczasuoznaczania przeciwciał.

PL 195 764 B1

Pobieranie pachwinowych węzłów chłonnych i śledziony: niektóre zwierzęta z każdej grupy uśmiercano po 4 albo odpowiednio 9 tygodniach. Pachwinowe węzły chłonne i śledzionę pobierano chirurgicznie.

Oznaczanie miana przeciwciała anty-Pb CS His6-242-310: Oznaczanie miana przeciwciała skierowanego specyficznie przeciw antygenowi Pb CS His6-242-310 przeprowadzano za pomocą ELISA. Wiązanie antygenu prowadzono na mikropłytce z 96 wgłębieniami (Maxisorp F 96, Nunc, DK) drogą inkubacji przez noc w wilgotnej komorze, w temperaturze 4°C, przy czym każde wgłębienie było wypełnione 0,1 ml PBS (roztwór soli buforowany fosforanem) zawierającym 0,001 mg/ml antygenu Pb CS His6-242-310. Nasycanie mikropłytki prowadzono za pomocą PBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA, Fluka, CH).Płytki przemywano PBS zawierającego 0,05% Tween 20 (Sigma, Saint-Louis, MO, USA). Surowice pobrane po 0, 3, 7 i 9 tygodniach rozcieńczano seryjnie za pomocą buforu rozcieńczającego (PBS zawierający 2,5% odtłuszczonego mleka w proszku i 0,05 Tween 20), a następnie przenoszono do mikropłytki i pozostawiano na 1godzinę w temperaturze otoczenia (TA). Następnie płytki przemywano PBS, dodawano do nich roztwór rozcieńczający zawierający poliklonalne przeciwciałoprzeciwko immunoglobulinie myszy, sprzężone z fosfatazą alkaliczną (Sigma, SaintLouis, MO, USA), i poddano inkubacji przez 1godzinę w temperaturze otoczenia. Płytki przemywano PBS, a specyficzne przeciwciała wykazywano drogą reakcji kolorymetrycznej z substratem fosfatazy alkalicznej, fosforanem p-nitrofenylu (Sigma, Saint-Louis, MO, USA). Absorbancję przy długości fali405 nm mierzono za pomocą czytnika mikropłytek (czytnik Dynatech 25000 ELISA, Ashford, Middlesex, UK), przy czym każdą surowicę oznaczano w dwóch powtórzeniach. Przedstawione wyniki są średnią wartości uzyskanych dla myszy każdej grupy. Miano przeciwciała oznaczano względem ostatniego rozcieńczenia indukującego znaczącą odpowiedź pozytywną, to jest o wartości gęstości optycznej większej niż wartość poziomu szumów tła z odchyleniami standardowymi ±3 SD.

Testy ELISPOT:

Przeciwciała ukierunkowane specyficznie przeciwko anty-Y-interferonowi myszy (O1E703B2) utrwalano drogą inkubacji, przez noc w temperaturze 4°C w wilgotnej komorze, roztworu przeciwciała o stężeniu 50 μg/ml w mikropłytce ELISPOT, której denko wgłębień jest pokryte nitrocelulozą (Millipore, Molsheim, F). Etap nasycania prowadzono przez dodanie DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą (FCS, Fakola, CH) w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C. Komórki otrzymane z narządów limfoidowych (pachwinowe węzły chłonne i śledziona) hodowano w mikropłytkach zawierających 200000 komórek na wgłębienie, a następnie współhodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 37°C z 100000 komórek P815 pobudzonych albo niepobudzonych za pomocą krótkiego peptydu Pb CS 245-252. Po inkubacji komórki usuwano i po etapie przemywania dodawano w ciągu 2 godzin drugi kompleks biotyna-przeciwciało anty-Y-IFN myszy (ANI, 2 μg/ml w PBS z 1% BSA). Następnie dodawano streptawidynę sprzężoną z fosfatazą alkaliczną (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFN) i poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, następnie prowadzono 3 przemywania PBS zawierającym 0,05% Tween 20, a następnie 3 przemywania PBS. Obecność kompleksów immunologicznych anty-Y-IFN wykazywano przez dodanie substratu BCIP/NBT (Sigma, St-Louis, MO, USA). Reakcję zatrzymano przez przemywanie bieżącą wodą. Plamki pozytywne dla anty-Y-IFN zliczano następnie pod mikroskopem dwukularowym. Plamki specyficzne odpowiadają różnicy pomiędzy liczbą plamek zliczonych w obecności komórek wzbudzonych za pomocą peptydu i liczbą plamek zliczonych przy braku peptydu. Przedstawione wyniki są średnią z wartości otrzymanych dla myszy w każdej grupie. Wyraża się je liczbą plamek na milion hodowanych komórek.

Wyniki

Reakcja przeciwciała: Specyficzne wytwarzanie przeciwciał anty-Pb CS His6-242-310, oznaczone za pomocą ELISA, przedstawiono graficznie dla myszy poddanych jednej, dwóm i trzem immunizacjom. Kontrola przeprowadzona po jednym wstrzyknięciu jednego antygenu dawała bardzo niskie miano przeciwciała. Miano przeciwciała uzyskane po jednym wstrzyknięciu antygenu zmieszanego z OM-294-MP albo odpowiednio OM-294-DP jest już praktycznie tak samo wysokie, jakz dodatkiem niekompletnego adiuwanta Freunda (IFA) zmieszanego z tym samym antygenem (Fig. 13). Po dwóch wstrzyknięciach adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP były zdolne do wywoływania reakcji serologicznej odpowiednio wyższej albo równej reakcji IFA (Fig. 14). Po trzech wstrzyknięciach adiuwanty OM-294-MP iOM-294-DPsązdolnedowywoływaniareakcjiserologicznejwiększejniżreakcjaIFA(Fig.15).

Figura13-ELISAprzeprowadzona3tygodniepopierwszejimmunizacji.

Figura14-ELISAprzeprowadzona4tygodniepodrugiejimmunizacji.

PL 195 764 B1

Figura 15 - ELISA przeprowadzona 2 tygodnie po trzeciej immunizacji.

Figura 16- Miano przeciwciała przed jedną, dwiema i trzema immunizacjami.

Miana przeciwciała zwierząt każdej grupy przed immunizacją i po jednej, dwóch i trzech immunizacjach przedstawiono jako średnią (Fig. 16).

Reakcja CTL: rozpoznanie T-komórkowego epitopu Pb CS 245-252 obecnego w peptydzie Pb CS His6-242-310, który służył do immunizacji, wykazywano wyraźnie za pomocą testu ELISPOT. Reakcję limfocytów T pochodzących od zwierząt poddanych immunizacji (pachwinowe węzły chłonne i śledziona, pobrane w tydzień po drugim wstrzyknięciu i odpowiednio dwa tygodnie po trzecim wstrzyknięciu) wykazuje się drogą zwiększenia liczby plamek pozytywnych dla interferonu γ (γ-IFN). Na Fig. 17, 18, 19, 20 przedstawiono wyniki będącymi średnimi wartości uzyskanych dla każdego rozcieńczenia i dla myszy każdej grupy. Wyrażono je liczbą plamek na milion komórek w hodowli.

Dwa adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP zwiększały bardzo znacząco odpowiedź CTL limfocytów pochodzących ze śledziony i pachwinowych węzłów chłonnych, przy czym reakcje śledziony były większe niż reakcje pachwinowych węzłów chłonnych. Adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP indukowały aktywność CTL wyraźnie wyższą niż aktywność IFA.

8. Wykazanie niekowalencyjnej asocjacji OM-294-antygen drogą elektroforezy kapilarnej

Elektroforezękapilarnąwykorzystano w tym przykładzie do wykazania tworzenia niekowalencyjnychkompleksówpomiędzy OM-294-DPapeptydemPbCSHis6-242-310wczasietworzenia preparatu szczepionkowego.

Protokół

Metodaanalizy:

Bufor na bazie 20 mM boranu sodowego (dekahydrat tetraboranu disodowego, Merck nr 6306), pH nastawione na 7,4 za pomocą 1N NaOH (Fluka nr 72072), kapilara strefowa (nie szczepiona), długość 30 cm, średnica 50 μm, wykrywanie przy długości fali 200 nm za pomocą aparatury Beckmann PACE MDQ (Beckman, Brea, CA, USA).

Warunki rozdzielania

Czas [min]	Proces	Ciśnienie	Rozpuszczalnik
0,00	Przemywanie kapilarne	20,0 psi	H2O
3,00	Przemywanie kapilarne	20,0 psi	1N NaOH
6,00	Wstrzykiwanie próbki	0,5 psi	Bufor boranowy
6,08	Rozdzielanie	30,0 KV	Bufor boranowy

Antygeny:peptydsyntetycznyPbCSHis6-242-310ostężeniu1 mg/ml w wodzie

Adiuwant:OM-294-DPostężeniu1mg/mlwH2O

Mieszanina antygen-adiuwant: 250 μg/ml

Wyniki

Kompleksy antygen-adiuwant powstające przy tworzeniu kompozycji preparatu szczepionkowego wykazywano na elektroforegramie przez znikanie piku adiuwanta i przesunięcie piku antygenu do nowego piku specyficznego dla kompleksu (Fig. 21).

9. Leczenie raka otrzewnej indukowanego przez wstrzykiwanie komórek pochodzących z syngenicznej linii nowotworowej PROb u szczura BDIX

Celem tego doświadczenia jest wykazanie przeciwnowotworowego wpływu OM-294-DP podanegowpostaci serii dożylnych wstrzyknięć szczurom, które miały makroskopowe nowotwory o wielkościkilkumm.

Protokół

Zwierzęta: szczep szczurów BDIX wyhodowanych wsobnie został ustalony w roku 1937 przez H. Druckreya. Para szczurów pochodzących z instytutu Max Pianek Institut z Friburga stała się zaczątkiem kolonii utrzymywanej od roku 1971 w hodowli zwierząt laboratoryjnych przez system pojedyńczej linii. Zgodnie z tym systemem wybiera się pojedyńczą parę brat-siostra w celu otrzymania potomków następnej generacji. Szczury wykorzystywane do tej pracy pochodzą z Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire d'Iffa-Credo (Arbresle, Francja), któremu laboratorium powierzyło hodowlę szczepu. Wykorzystywane szczury były płci męskiej w wieku 3 miesięcy ±1tydzień.

PL 195 764 B1

Indukcja nowotworów drogą wstrzyknięcia komórek PROb:

Pochodzenie komórek PROb: szczep fragmentu raka okrężnicy zaindukowanegouwsobnego szczura BDIX za pomocą 1,2-dimetylohydrazyny pochodziła z linii komórkowej DHD/K12. Ta linia przywierających komórek została podzielona na dwie sublinie w zależności od wrażliwości komórek na trypsynę, a komórki, które odrywają się trudno, zostały oznaczone jako DHD/K12-TR. Komórki DHD/K12-TR wstrzyknięte syngenicznym szczurom BDIX indukują postępujące nowotwory. Tę linię klonowano, przy czym do tej pracy wykorzystano tylko klon DHD/K12-TRb oznaczony ostatecznie jako PROb.

Warunkihodowli:przywierającekomórkiPRObhodowanow zamkniętych butelkach hodowlanych (Falcon, Becton Dickinson, New-Jersey, USA) w temperaturze 37°C w pełnej pożywce złożonej z pożywki F10 Hama (Bio-Whittaker, Walkersville, USA), doktóregododano10%płodowąsurowicę cielęcą (FCS, Anval,Betton,Francja).Tępożywkęhodowlanąwymienianoco trzy dni. Po osiągnięciu konfluencjikomórkiodrywanood podłoża za pomocą 2 ml roztworu EDTA/trypsyna przez 3 do 5 minut, po 3 zraszaniach po 2 mltego samego roztworu w ciągu 2 do 3 minut.Komórki zawieszano w pełnej pożywce, przy czym FCS blokowało działanie trypsyny. Brak zanieczyszczenia komórek przezmikoplazmyi bakteriesprawdzanoregularnie drogąbarwieniaDNAza pomocąfluorochromu Hoechst33258 (AldrichChemie,Steinheim,RFN).

Indukcja raka otrzewnej: komórki PROb odrywano od podłoża wsposób przedstawiony w ustępie „warunki hodowli”i zliczanow roztworze błękitu trypanowego, barwnika, który umożliwia ocenę żywotności komórek. Komórki zawieszano w pożywce F10Hama. Nowotwory otrzewnej indukowano przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 10⁶ żywych komórek PROb syngenicznemu szczurowi BDIX, znieczulonemu eterem.Wstrzyknięcie komórek nowotworowych przeprowadzono w dniu 10. W tych warunkach u wszystkich szczurów rozwijał się nowotwór otrzewnej wraz z wytwarzaniem krwistej puchlinybrzusznejiginęłyonepomiędzy6i12tygodniempowstrzyknięciukomórek.

Leczenie nowotworu otrzewnej: leczenie rozpoczęto 13 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, gdy zrakowacenia były utworzone z guzków o średnicy kilku milimetrów. Leczenie obejmowało 10 wstrzyknięć dootrzewnowych OM-294-DP w dawce 1 mg/kg o stężeniu 0,8 mg/ml, rozpuszczonegow0,9%NaCl.Wstrzyknięciawykonywano3razynatydzień(poniedziałek,środaipiątek)wżyłę penisa.Grupękontrolnątraktowanosamymnośnikiem0,9%NaCl.

Ocena skuteczności leczenia: przy D42, 6 tygodni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, szczuryuśmiercanoipoddanosekcji,azrakowaceniaocenianowbadaniachnaślepo.Niebyłmożliwy pomiar objętości zrakowacenia, lecz przeciwnie możliwe było zaklasyfikowanie zrakowaceń do różnych klas. Określa się pięć klas w zależności od liczby i średnicy guzków:

Klasa0:brakwidocznychguzków

Klasa1:łatwomożnapoliczyćguzkiośrednicyod0,1do0,2cm

Klasa2:liczneguzkiośrednicyod0,1do0,5cm,którychniemożnajużpoliczyć

Klasa3:jamaotrzewnejulegainwazjiguzków,zktórychniektóreosiągnęły1cmśrednicy

Klasa 4: jama jest całkowicie zajęta przez masy nowotworowe o średnicy kilku cm

Ocena objętości puchlin brzusznych i masy zwierząt: objętość puchliny brzusznej mierzono przez dwukrotne ważenie szczurów. Grupa szczurów kontrolnych, których nie poddawano żadnemu leczeniu, lecz tylko wstrzyknięciom 0,9% NaCl, umożliwiała ocenę normalnego rozwoju zrakowaceń oraz ocenę skuteczności leczenia.

Określanie skuteczności leczenia: czas trwania życia szczurów z leczonych grup porównuje się z czasem trwania życia grupy kontrolnej.Objętość zrakowaceń i puchlin brzusznych szczurów z leczonych grup porównuje się z objętością u szczurów z grupy kontrolnej.

Analiza statystyczna: Istotność statystyczną efektuimmunoterapiiokreślanotestemKruskalaWallisaklasyfikowaniazrakowaceń,testemdrogąanalizywariancyjnej w przypadku objętości puchliny brzusznej i testem „log rank” w przypadku stopnia przeżycia.

Wyniki

Zrakowacenia: OM-294-DP wykazywał w tym modelu znaczną aktywność przeciwnowotworową. Ta aktywność była wykazywana zwłaszcza na podstawie liczby zwierząt bez nowotworów (klasa 0), natomiast różnica w porównaniu z kontrolą NaCl była znaczna w przypadku objętości nowotworów (p< 0,05). Znaczny był także wpływ leczenia za pomocą OM-294-DP na objętość puchliny brzusznej (p < 0,05).

PL 195 764 B1

T ab el a (a)

Klasazrakowaceńi objętośćpuchlinybrzusznej

Leczenie	Liczba szczurów, które majązrakowacenia klasy:	Wpływ produktu (*)	Objętość puchliny brzusznej ml/szczur	Wpływ produktu (**)
	0	1	2	3	4		granice	średnia±δ
NaCl⁽¹⁾	1	0	1	0	7	—	0-84	38 ± 29	---
OM-294-DP⁽²⁾	4	1	2	1	2	p < 0,05	0-73	8 ± 23	p < 0,05

(*): test Kruskalla-Wallisa;

(**): analiza wariancyjna ⁽¹⁾ : 8 z 10 szczurów zginęło z powodu nowotworu przed uśmierceniem, 1 do J34 miały guzki i żółtaczkę, lecz nie można było określić klasy (kanibalizm), 1 do J37 (klasa 4), 2 do J38 (klasa 4), 1 do J39 (klasa 4), 2 do J40 (klasa 4) i 1 do J41 (klasa 4). U szczura klasy 0 stwierdzono podczas sekcji nowotwór pod skórą i jest prawdopodobne, że nie powiodło się wstrzyknięcie komórek nowotworowych.

⁽²⁾ : szczur byłmartwyw 14d, w czasiepierwszego wstrzyknięcia leczenia, i niemiałzrakowaceń. Jeden z uśmierconych szczurów klasy 0miał nowotwór podskórny (nie powiodło sięwstrzyknięcie komórek nowotworowych).

Stopień przeżycia:

Zwierzęta uśmiercano w dniu 42. Stopień przeżycia oznaczony w 42 dniu po wstrzyknięciu komórek nowotworowych - 90% zwierząt leczonych za pomocą OM-294-DP przeżyło, natomiast w grupie nie leczonej tylko 20% zwierząt pozostało jeszcze przy życiu. OM-294-DP przedłużał znacznie czas życia szczurów (p < 0,001).

Masa:

OM-294-DP nie wywierał znaczącego wpływu na zmianę masy w porównaniu ze zwierzętami, które otrzymywały tylko NaCl, jak pokazują to wartości przedstawione w Tabeli (b).

T ab el a (b)

Zmianamasy szczurów (średnie± odchylenie standardowe)

Dzień	NaCl	OM-294 DP
0	314 ± 19	277 ± 19
13	337 ± 18	310 ± 21
20	342 ± 20	304 ± 23
29	361 ± 23	317 ± 24
41	314 ± 38	327 ± 26

10. Ocena właściwości adiuwanta OM-294-DP w modelu immunizacji myszy drogą podawania donosowego podjednostki B ureazy z Helicobacter pylori

Wykazano, że myszy można zabezpieczyć przed infekcją przez Helicobacter pylori uodporniając je drogą podawania doustnego albo donosowego podjednostki B ureazy z Helicobacter pylori (UreB) w obecności adiuwanta na bazie toksyny cholery (CT) (Corthesy-Teulaz I. et al., Gastroenterology 109 (1995) 115, Michetti P. et al., Gastroenterology 116 (1999) 804, Saldinger P.F. et al., Gastroenterology 115 (1998) 891). Ta odpowiedź humoralna anty-UreB zmierzona w surowicy poddanych immunizacji myszy była głównie typu IgG1 (reakcja Th2). Wpływ adiuwanta OM-294-DP oceniano u myszy BALB/c (n = 6) poddanych cztery razy immunizacji w tygodniowych przedziałach czasowych drogą donosowego podawania podjednostki B ureazy z rekombinacyjnej Helicobacter pylori (UreB) w obecności adiuwanta OM-294-DP. Myszy kontrolne BALB/c poddawano immunizacji tylko za pomocą adiuwanta OM-294-DP. Dwa tygodnie po ostatniej immunizacji pobierano krew od każdej myszy i oznaczano za pomocą ELISA immunoglobuliny anty-UreB w osoczu (IgG całkowite, IgG1 i IgG2).

Protokół

Zwierzęta: Myszy BALB/c/Ola/HsD (Harland, Horst, Holandia): 24 myszy.

Antygen: HpUreB 1-569, wyrażony jako białko rekombinacyjne w E. coli (szczep M15, Qiagen, Hilden, D) według opisanego poprzednio protokołu (Michetti et al., Gastroenterology 107 (1994)1002).

PL 195 764 B1

Adiuwant: OM-294-DP (roztwór podstawowy o stężeniu 2,2 mg/ml).

Protokółimmunizacji:

Utworzonoczterygrupypo6myszy:

Grupa A: 6 myszy BALB/c poddawano cztery razy immunizacji drogą podawania donosowego tylko 25 μg OM-294-DP (25 μl na dawkę) jeden raz tygodniowo w ciągu 4 kolejnych tygodni,

Grupa B: 6 myszy BALB/c poddawano immunizacji drogą donosowego podawania 50 μg UreB 1-569 + 25 μg OM-294-DP (25 μl na dawkę) jeden raz tygodniowo w ciągu kolejnych 4 tygodni.

Dwa tygodnie po ostatniej immunizacji droga podawania donosowego od każdej myszy z grupy AiBpobierano przez ogon krew.

OznaczanieIgGwsurowicy:

Bufor osłaniający (pH 9,6): na jeden litr Na2CO3 (15 mM, 1,59 g), NaHCO3 (34,8mM, 2,93 g), Thimerosal (0,01%); Bufor PBS-Tween pH 7,4: na jeden litr NaCl (137 mM, 8,0 g), KH2PO4(1,5 mM,0,2 g), Na2HPO4 (8,0 mM, 1,15 g), KCl (2,7 mM, 0,2 g), Tween 20 (0,1%, 1 ml); bufor cytrynian/fosforan, pH5,0: na jeden litr kwas cytrynowy (44,4mM, 9,32 g), Na2HPO4(103 mM, 14,6 g); roztwór substratu 10x (O-fenylodiamina = OPD): OPD (10 mg/ml w buforze cytrynianowym); roztwór azydku sodowego: 1%; roztwór zatrzymujący: 0,01 azydku sodowego w 0,1M buforze cytrynian/fosforan, pH 5,0.

Metoda: Roztwór antygenu (UreB 1-569 z dnia 26.05.1999, roztwór podstawowy o stężeniu 0,5 mg/ml) przygotowano o stężeniu 5 μg/ml w buforze osłaniającym o pH 9,6 (na 50 ml buforu 500 μl roztworu UreB). Odpipetowano 100 μl na wgłębienie w trzech płytkach z 96 wgłębieniami z okrągłymi denkami (0,5 μg Ureb na wgłębienie). Płytki pozostawiono do inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37°C, usuwano z płytek supernatant i nasycano wgłębienia dodając 100 μl 0,1% roztworu PBS-Tween + 5% mleka w proszku na wgłębienie. Inkubację płytek prowadzono w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie usuwano roztwór nasycający, przemywano wgłębienia 3 razy 100 μl PBS-Tween i usuwano supernatant. Następnie przygotowano każdą badaną surowicę myszy w rozcieńczeniu 1:200 w 0,1% buforze PBS-Tween (5 μl surowicy w 1 ml buforu PBS-Tween). Surowice (100 μθ rozdzielano w dwóch powtórzeniach w 3 płytkach (1 płytka do wykrywania całkowitych IgG, 1 płytka do wykrywania IgG1i 1płytka do wykrywania IgG2). Całość poddawano inkubacji przez noc w temperaturze 4°C, a następnie przemywano wgłębienia 3 razy 100 μl PBS-Tween. Następnie przygotowano roztwory przeciwciała względem całkowitych anty-lgG, sprzężonego z biotyną, o rozcieńczeniu 1:500 (Amersham, Cat#RPN 1177), przeciwciała względem anty-lgG1 (Amersham Cat#RPN 1180) i przeciwciała anty-IgG2a (Pharmingen Cat#02012D) w buforze PBS-Tween. 100 μl roztworu przeciwciała względem całkowitych IgG dodawano do płytki nr 1, 100 μl roztworu przeciwciała przeciwko IgG1 - do płytki nr 2 i 100 μl roztworu przeciwciała przeciwko IgG2a - do płytki nr 3 i poddano płytki inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Wgłębienia płytek przemywano 3 razy PBS-Tween. Następnie przygotowano streptawidyna-HRP (Dako, Cat#p0397) o rozcieńczeniu 1:1000 w buforze PBS-Tween i dodano 100 μl na wgłębienie, po czym poddano płytki inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Wgłębienia przemywano 3 razy 100 μl buforu PBS-Tween. Następnie przygotowano roztwór substratu rozcieńczając w stosunku 1:10 roztwór OPD (10x) w 0,1M buforze cytrynian/fosforan i do rozcieńczonego roztworu OPD dodawano H₂O₂ w ilości 1 μl na ml. Do każdego wgłębienia płytek dodawano 50 μl roztworu substratu. Po odczekaniu 10-20 minut do pojawienia się zabarwienia zatrzymywano reakcję dodając 50 μl buforu zatrzymującego. Absorbancję odczytywano przy długości fali 492 nm (z odczytem standardu przy 620 nm) wykorzystując kontrolę negatywną jako zero.

Analiza statystyczna. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SD(n= 6). Wartości p obliczanoza pomocątestu t Studenta. Wartości p < 0,05 uważano jako wartości znaczące.

Wyniki

U myszy poddanych immunizacji drogą donosowego podawania UreB 1-569 + OM-294-DP rozwijała się odporność humoralna względem anty-UreB: obecność we krwi przeciwciała IgG1 względem anty-UreB 1-569.

Obecność przeciwciał specyficznych względem UreB z Hp w surowicy myszy mierzono za pomocą ELISA. UreB (0,5 μg/wgłębienie) umieszczono w płytkach z 96 wgłębieniami o okrągłym denku w buforze węglanowym o pH 9,6. Przeciwciała specyficzne wykrywano za pomocą całkowitych przeciwciał anty-IgG, przeciwciał IgG1 i IgG2a królika. Wyniki są podane w postaci gęstości optycznej (OD) zmierzonej przy długości fali 492 nm. Wartości OD 3 razy większe niż wartości zmierzone w surowicy myszy nie stykających się dotychczas z odpowiednim bodźcem uważano za pozytywne. W surowicy myszy poddanych immunizacji za pomocą tylko OM-294-DP nie wykrywano żadnego przeciwciała względem anty-UreB. U myszy poddanych immunizacji UreB + OM-294-DP rozwijały się

PL 195 764 B1 również przeciwciała całkowite IgG względem anty-Ureb (OD = 0,274 ±0,130, p < 0,05) i IgG1względem anty-Ureb (OD = 0,212 ±0,128, p < 0,05), lecz nie rozwijały się przeciwciała IgG2a względem anty-UreB (DO = 0,008 ±0,005, nie znaczące).

U myszy BALB/c poddanych immunizacji drogą donosowego podawania podjednostki B ureazy z Helicobacter pylori (UreB) + OM-294-DP rozwijała się humoralna odpowiedź anty-UreB, przeważnie typu IgG1. OM-294-DP może zatem działać jakoadiuwantprzypodawaniudrogądonosowąiwspomagaćrozwijaniesięodpowiedzihumoralnejtypuTh2.

11. OM-294-MP i OM-294-DP połączone z antygenem H1N1: oznaczanie specyficznych przeciwciałwytworzonych u myszy po 1 albo 2 podawaniach podskórnych

Protokół

Celem tych badań było wykazanie wpływu adiuwanta OM-294-MP i OM-294-DP w przypadku antygenugrypowegoH1N1 (hemaglutyninaA/Beijing262/95,SolvayDuphar,Weesp,NL).Wtymcelu60 myszy BALB/c (płci żeńskiej, w wieku 8 tygodni na początku leczenia) podzielono na 6 następujących grup:

Grupy	Antygen, stężenie końcowe: 2,5 pg na zwierzę/wstrzyknięcie	Adiuwanty, stężenie końcowe: 50 pg na zwierzę/wstrzyknięcie	NaCl (0,9%)	Wstrzykiwana objętość
A: NaCl	-	-	150 pl	150 pl
B: H1N1	H1N1 (100 pl)	-	50 pl	150 pl
C: H1N1 + OM-294-MP	H1N1 (100 pl)	OM-294-MP (50 pl)	-	150 pl
D: PH1N1 + OM-294-MP	H1N1 (100 pl)	OM-294-DP (50 pl)	-	150 pl
E: OM-294-MP	-	OM-294-MP (50 pl)	100 pl	150 pl
F: OM-294-DP	-	OM-294-DP (50 pl)	100 pl	150 pl

Antygen: przygotowano roztwór wyjściowy H1N1 o stężeniu 25 pg/ml w 0,9% NaCl.

Adiuwanty: przygotowano roztwory wyjściowe OM-294-DP i OM-294-MP o stężeniu 1 mg/ml w wodzie do iniekcji, z dodatkiem 0,1% trietanoloaminy w przypadku OM-294-MP. Kontrolę negatywną stanowił roztwór 0,9% NaCl bez antygenu.

Mieszanina antygen-adiuwant: przed poddaniem wirowaniu w ciągu 3 minut adiuwanty umieszczano na 20 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodawano antygen i NaCl (0,9%), jak pokazano wyżej w tabeli, i na krótko przed umieszczeniem w mieszalniku obrotowym na 15 minut w temperaturze otoczenia poddawano mieszaninę antygen/adiuwant worteksowaniu, a następnie całość poddawano worteksowaniu przez 3 minuty.

Immunizacje: wstrzyknięcia miały miejsce w 0i 14 dniu. Mieszaniny przedstawione w powyższej tabeli podano podskórnie (75 plna jeden bok, ogółem 150 pl na zwierzę). Pobieranie krwi miało miejsce w dniu 14 i 28 (nakłucie orbitalne).

Oznaczanie immunoglobulin anty-H1N1: następujące immunoglobuliny surowicy specyficzne dla H1N1 oznaczano podwójnie za pomocą ELISY: IgG1, IgG2a i IgM. Mówiąc pokrótce, mikropłytki z wgłębieniami (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) poddawano inkubacji (pokrywanie przez noc) w temperaturze 4°C z 100 pl H1N1 (0,5 pg) w buforze węglanowym (pH 9,6). Po przemyciu za pomocą 0,5% Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) surowice rozcieńczano 50-, 200-i 800-krotnie (roztwór rozcieńczający: roztwór soli buforowany fosforanem (PBS) + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA, Sigma, St. Louis, Mo,USA) + 0,02% Tween-20). Do wgłębień płytek dodawano 100 pl każdej z rozcieńczonych surowic. Taka inkubacja trwała 15 minutw temperaturze 37°C.

Po drugim przemywaniu IgG1, IgG2a i IgM specyficzne dla H1N1 poddawano inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C z 100 pl przeciwciał (antymysie przeciwciało szczura) anty-IgG1, sprzężonych z peroksydazą (Serotec, Oxford, UK), IgG2a sprzężonych z peroksydazą (Pharmingen, San Diego, CA USA) i IgM sprzężonych z biotyną (Pharmingen, San Diego, CA, USA), uprzednio rozcieńczonych buforem PBS/BSA/Tween (rozcieńczenia odpowiednio 250-, 1000-i 500-krotne). W przypadku IgM, po dodatkowym przemywaniu, konieczna była trzecia inkubacja (30 minut w temperaturze 37°C) z 1/100 roztworem streptawidyny sprzężonej z peroksydazą (Dako, Glostrup, DK).

PL 195 764 B1

Po przemyciu dodawano 100 μl roztworu 1,2-fenylenodiaminy (OPD, Merck, Darmstad, RFN) w celu wykryciaperoksydazy sprzężonej z wtórnymi przeciwciałami anty-IgG1 i anty-IgG2a (natomiast w przypadku IgM stosowanym odczynnikiem jest 3',3',5',5'-tetrametylobenzydyna (TMB, Sigma, St. Louis, Mo, USA). Po inkubacji w ciągu 20 minut w temperaturze otoczenia reakcję przerywano przez dodanie 100 μl 2N H₂SO₄. Absorbancje mierzono przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika płytek Bio Rad 3550.

Wyniki

Wyniki każdego pomiaru przy długości fali 490 nm wyrażano w jednostkach umownych (UA) naml. Jest to możliwe drogą porównania każdej próbki z wzorcem przygotowanym z różnymi rozcieńczeniami zbioru próbek w 28 dniu, pochodzących z grupy B (zwierzęta poddane wstrzyknięciu tylko H1N1). Z definicji zbiór próbek, rozcieńczony 50 razy, ma stężenie 1000 UA/ml. Poszczególne wyniki korygowano na koniec zgodnie z odpowiednim współczynnikiem rozcieńczenia (50-, 200- albo 800-krotnie). Podano tu tylko średnią dla każdej grupy i odchylenie standardowe (SD).

Tabela (a)

Immunoglobuliny specyficzne względem H1N1 podklasy Ig1 (jednostki umowne/ml + SD, **p < 0,01 (testy Anova + Dunnetta (dwustronne))

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	3 ± 5	0 ± 0
B: H1N1	11161±5755	53950 ± 23403
C: H1N1 + OM-294-MP	34411** ± 13719	228467** ± 109123
D: H1N1 + OM-294-DP	30101** ± 19061	382325** ± 201314
E: OM-294-MP	69 ± 34	59 ± 31
F: OM-294-DP	59 ± 21	38 ± 25

Tabela (b)

Immunoglobuliny specyficzne przeciwko H1N1 podklasy Ig2a (jednostki umowne/ml + SD, **p < 0,01 (test Anova + Dunnetta (dwustronne))

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	0 ± 0	0 ± 0
B: H1N1	26883 ± 20779	50352 ± 30846
C: H1N1 + OM-294-MP	179344** ± 139781	1622722** ± 986195
D: H1N1 + OM-294-DP	103630** ± 96257	681441 ±1072710
E: OM-294-MP	1619± 743	1767± 1034
F: OM-294-DP	452 ± 584	782 ± 857

Tabela (c)

Immunoglobuliny specyficzne przeciwko H1N1 podklasy IgM (jednostki umowne/ml + SD, **p < 0,05 (test Anova + Dunnetta (dwustronny))

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	22102± 5862	21531 ± 3693
B: H1N1	37787±1501	57306 ± 26886
C: H1N1 + OM-294-MP	67936** ± 21334	95108± 38669
D: H1N1 + OM-294-DP	598100*±18324	92920 ± 26971
E: OM-294-MP	19065± 34	18018± 4016
F: OM-294-DP	20756± 7160	20944 ± 9065

PL 195 764 B1

Te wyniki wskazują, że adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP były aktywne w badanym modelu, ponieważ zwiększały znacznie u myszy po jednym albo dwóch wstrzyknięciach (patrz Fig. 22,23,24) przeciwciała względem produktów anty-H1N1 , niezależnie od analizowanej podklasy immunoglobuliny (IgG1,IgG2aiIgM).

12.OM-294-MPiOM-294-DPpołączonezantygenemalbuminyjaja:oznaczaniespecyficznych przeciwciałwytwarzanych przez myszy po 1 albo 2 podawaniach podskórnych

Protokół

Celem tych badań było wykazanie wpływu adiuwanta OM-294-MP i OM-294-DP względem antygenu albuminy jaja (Fluka Chemie, Buchs, CH). W tym celu 50 myszyBALB/c (płci żeńskiej, w wieku 8 tygodni na początku leczenia) podzielono na 5 następujących grup:

Grupy	Antygen, stężenie końcowe: 50 pg na zwierzę/wstrzyknięcie	Adiuwanty, stężenie końcowe: 50 pg na zwierzę/wstrzyknięcie	NaCl	Wstrzykiwana objętość
A: NaCl	-	-	150 pl	150 pl
B: Ova	Ova (100 pl)	-	50 pl	150 pl
C: Ova + OM-294-MP	Ova (100 pl)	OM-294-MP (50 pl)	-	150 pl
D: Ova + OM-294-DP	Ova (100 pl)	OM-294-DP (50 pl)	-	150 pl
E: OM-294-MP	-	OM-294-MP (50 pl)	100 pl	150 pl

Antygen:roztwórwyjściowyalbuminyjajaprzygotowanoo stężeniu0,5mg/mlw0,9%NaCl.

Adiuwanty: roztwory wyjściowe OM-294-DP i OM-294-MP przygotowano o stężeniu 1 mg/ml w wodzie do iniekcji, z dodatkiem 0,1% trietanoloaminy w przypadku OM-294-MP. Kontrolę negatywną stanowił0,9% roztwór NaCl bez antygenu.

Mieszanina antygen-adiuwant: przed poddaniem wirowaniu w ciągu 3 minut adiuwanty umieszczano na 20 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodawano antygen i NaCl (0,9%), jak przedstawiono wyżej w tabeli, i przed umieszczeniemna 15 minut w mieszalniku obrotowym w temperaturze otoczenia mieszaninę antygen/adiuwant poddawano krótko worteksowaniu, po czym całość poddawano worteksowaniu przez 3 minuty.

Immunizacje: wstrzyknięcia miały miejsce w dniu 0i 14. Mieszaniny przedstawione w poprzedniej tabeli podawano podskórnie (75 μl na jeden bok, ogółem 150 μl na zwierzę). Pobieranie krwi miało miejsce w dniu 14 i 28 (nakłucie orbitalne).

Oznaczanie immunoglobulin anty-albuminy jaja: za pomocą ELISA oznaczano w dwóch powtórzeniach następujące immunoglobuliny surowicy specyficzne przeciwko albuminie jaja: IgG1, IgG2a i IgM. Mówiąc pokrótce, mikropłytki z wgłębieniami (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) poddawano inkubacji (coating overnight) w temperaturze 4°C z 100 μl albuminy jaja (0,5 μg) w buforze wodorowęglanowym (pH 9,6). Po przemyciu za pomocą 0,5% Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) surowice rozcieńczano 50-, 200-i 800-krotnie (roztwór rozcieńczający: roztwór soli buforowany fosforanem (PBS)+ 1% albuminy surowicy krwi bydlęcej (BSA, Sigma, St. Louis,MO, USA) + 0,02% Tween-20). Do wgłębień płytek dodawano 100 μl każdej rozcieńczonej surowicy. Ta inkubacja trwała 45 minut w temperaturze 37°C. Po drugim przemywaniu IgG1, IgG2a i IgM specyficzne dla albuminy jaja poddawano inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C ze 100 μl przeciwciał (antymysie przeciwciało szczura) anty-lgG1, sprzężonych z peroksydazą (Serotec, Oxford, UK), IgG2a sprzężone z peroksydazą (Pharmingen, San Diego, CA, USA) i IgM sprzężone z biotyną (Pharmingen, San Diego, Ca, USA), uprzednio rozcieńczonych w buforze PBS/BSA/Tween (odpowiednio rozcieńczenia 250-, 1000- i 500-krotne). W przypadku IgMpo dodatkowym przemyciu konieczna była trzecia inkubacja (30 minut w temperaturze37°C) z roztworem streptawidyny sprzężonej z peroksydazą (Dako, Glostrup, DK). Po przemyciu dodawano100 μl roztworu 1,2-fenylenodiaminy (OPD, Merck, Darmstad, RFN) w celu wykrycia peroksydazy sprzężonej z wtórnymi przeciwciałami anty-IgG1 i anty-IgG2a (natomiast w przypadku IgM stosowanym odczynnikiem była t 3',3',5',5'-tetrametylobenzydyna (TMB, Sigma, St. Louis, Mo, USA). Po inkubacji w ciągu 20 minut w temperaturze otoczenia (40 minut w przypadku TMB) reakcję przerywano przez dodanie 100 μl 2N H₂SO₄. Absorbancje mierzono przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika płytek Bio Rad 3550.

PL 195 764 B1

Wyniki

Wyniki każdego pomiaru przy długości fali 490 nm wyrażano w jednostkach umownych (UA) na ml. Było to możliwe przez porównanie każdej próbki z wzorcem przygotowanym z rozcieńczeń zbioru próbek pochodzących z grupy B w dniu 28 (zwierzęta poddane wstrzyknięciu samej albuminy jaja). Zdefinicjizbiórpróbekrozcieńczony50razymastężenie1000UA/ml.Poszczególnewynikikorygowano na konieczgodniezodpowiednimwspółczynnikiemrozcieńczenia(50,200albo800razy). Podanotu tylko średnią z każdej grupy oraz odchylenie standardowe (SD).

Tabela (a)

Immunoglobuliny specyficzne przeciwko albuminie jaja podklasy IgG1 (jednostki umowne/ml + SD, **p < 0,01 (testy Anova + Dunnetta (dwustronnie))

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	6 ±6	16 ± 12
B: Ova	728 ±589	47743 ± 46294
C: Ova + OM-294-MP	4361*± 2513	284121** ± 164822
D: Ova + OM-294-DP	3240** ± 1794	277025** ± 173737
E: OM-294-MP	19 ± 8	40 ± 69

Tabela (b)

Immunoglobuliny specyficzne przeciwko albuminie jaja podklasy IgG2a (jednostki umowne/ml + SD, **p < 0,01 (test Anova + Dunnetta (dwustronnie))

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	2996 + 898	5414±1554
B: Ova	5201 ± 1880	73162±107954
C: Ova + OM-294-MP	9524 ± 6809	625663*± 681232
D: Ova + OM-294-DP	18108*± 14958	601434 ±624166
E: OM-294-MP	11253± 12169	4192± 2104

Tabela (c)

Immunoglobuliny specyficzne przeciwko albuminie jaja podklasy IgM (jednostki umowne/ml + SD)

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	14009± 6158	12288± 7136
B: Ova	19423±13778	47998 ± 34035
C: Ova + OM-294-MP	21652± 9524	38240 ± 8822
D: Ova + OM-294-DP	25762± 10975	74399± 119781
E: OM-294-MP	19742± 5667	9827 ± 2021

Te wyniki wskazują, że adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP były aktywne w badanym modelu, ponieważ zwiększały znacznie (w przypadku podklas IgG1i IgG2a) po jednym albo 2 wstrzyknięciach (patrz Fig. 25, 26, 27) przeciwciała specyficzne przeciwko albuminie jaja, wytwarzane przez myszy.

13. OM-294-MP i OM-294-DP w połączeniu z antygenem TT (Tetanus toxoid):oznaczaniespecyficznychprzeciwciał wytworzonych u myszy po 1 albo 2 podawaniach podskórnych

PL 195 764 B1

Protokół

Celem tych badań było wykazanie wpływu adiuwanta OM-294-MP i OM-294-DP w przypadku antygenu TT (Massachusetts Biologic Laboratories, MA, USA). W tym celu 40 myszy BALB/c (płci żeńskiej, w wieku 8 tygodni na początku leczenia) podzielonona4następującegrupy:

Grupy	Antygen, stężenie końcowe: 20 pg na zwierzę/wstrzyknięcie	Adiuwanty, stężenie końcowe: 50 pg na zwierzę/wstrzyknięcie	NaCl (0,9%)	Wstrzykiwana objętość
A: NaCl	-	-	150 pl	150 pl
B: TT	TT (100 pl)	-	50 pl	150 pl
C: TT + OM-294-MP	TT (100 pl)	OM-294-MP (50 pl)	-	150 pl
D: TT + OM-294-DP	TT (100 pl)	OM-294-DP (50 pl)	-	150 pl

Antygen: przygotowano roztwór wyjściowy TT o stężeniu 0,2 mg/ml w 0,9% NaCl.

Adiuwanty: przygotowano roztwory wyjściowe OM-294-DP i OM-294-MP o stężeniu 1 mg/ml wwodziedoiniekcji,zdodatkiem 0,1%trietanoloaminywprzypadkuOM-294-MP.Kontrolę negatywną stanowiłroztwór0,9%NaClbezantygenu.

Mieszaninaantygen-adiuwant: przed poddaniem wirowaniuw ciągu 3 minut adiuwanty umieszczano na 20 minut w temperaturze 37°C, a następnie dodawano antygen i NaCl, jak przedstawiono wyżej w tabeli, i przed umieszczeniem w mieszarce obrotowej na 15 minut w temperaturze otoczenia mieszaninę antygen-adiuwant poddawano krótko worteksowaniu, po czym całość poddawano worteksowaniu przez 3 minuty.

Immunizacje: wstrzyknięcia przeprowadzano w dniu 0 i 14. Mieszaniny przedstawione uprzednio w tabeli podawano podskórnie (75 μl na jeden bok, ogółem 150 μl na zwierzę). Pobieranie krwi odbywało się w dniu 14 i 28 (nakłucie orbitalne).

Oznaczanieimminoglobulin anty-TT: następujące immunoglobuliny surowicy specyficzne przeciwko TT oznaczano w dwóch powtórzeniach za pomocą ELISA: IgG1, IgG2ai IgM. Mikrołytki z wgłębieniami (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) poddawano inkubacji (pokrywanie przez noc) w temperaturze 4°C ze 10° μl TT (0,5 pg) w buforze wodorowęglanowym (pH 9,6). Po przemyciu 0,5% Tween (Merck, Hohenbrunn, RFN) surowice rozcieńczano 50-, 200- i 800-krotnie (roztwór rozcieńczający: roztwór soli buforowany fosforanem (PBS) + 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA, Sigma, St. Louis, MO, USA) + 0,02% Tween-20)). Do wgłębień dodawano 100 μl każdej z rozcieńczonych surowic. Ta inkubacja trwał 45 minut w temperaturze 37°C.

PodrugimprzemyciuIgG1,IgG2aiIgMspecyficzneprzeciwkoTTpoddawanoinkubacjiprzez30 minut w temperaturze 37°C ze 100 μl przeciwciał (antymysie przeciwciało szczura) anty-IgG1 sprzężonych z peroksydazą (Serotec, Oxford, UK), IgG2a sprzężonych z peroksydazą (Pharmingen, San Diego,Ca,USA)i IgMsprzężonychzbiotyną(Pharmingen,SanDiego,Ca,USA),uprzedniorozcieńczonych buforem PBS/-BSA/Tween (rozcieńczenia odpowiednio 250-, 1000- i 500-krotne). W przypadkuIgMpoprzemyciudodatkowymkoniecznabyła3-ciainkubacja(30minutwtemperaturze37°C) z roztworem 1/100 streptavidyny sprzężonej z peroksydazą (Dako, Glostrup, DK).

Po przemyciu dodawano 100 μl roztworu 1,2-fenylenodiaminy (OPD, Merck, Darmstad, RFN) w celu wykrycia peroksydazy sprzężonej z wtórnymi przeciwciałami anty-IgG2a (natomiast w przypadku IgM stosowanym odczynnikiem był 3',3',5',5'-tetrametylobenzydyna (TMB,Sigma, St. Louis, MO)). Poinkubacjiwciągu20minutwtemperaturzeotoczenia(40minutwprzypadkuTMB)reakcjęprzerywano przez dodanie 100 μl 2N H₂SO₃. Absorbancje mierzono przy długości fali 490 mn za pomocą czytnikapłytekBioRad3550.

Wyniki

Wyniki każdego pomiaru dla immunoglobulin IgG1 i IgG2a przy długości fali 490 nm podano w jednostkach umownych (UA) na ml. Jest to możliwe drogą porównywania każdej próbki z wzorcem przygotowanym z rozcieńczeń zbioru próbek w 28 dniu, pochodzącym z grupy B (zwierzęta poddane wstrzyknięciu tylko TT). Z definicji zespół próbek rozcieńczony 50 razy ma stężenie 1000 UA/ml. Poszczególne wyniki korygowano zgodnie z odpowiednim współczynnikiem rozcieńczania (50, 200 albo 800 razy). Podano tu tylko średnią dla każdej grupy oraz odchylenie standardowe (SD). Co się tyczy oznaczania IgM specyficznych dla TT, to ponieważ „szum tła” pomiaru był zbyt wysoki, nie można było

PL 195 764 B1 ustalić żadnej wyraźnej różnicy pomiędzy grupą B (tylko TT) i grupami C i D (TT z adiuwantami) mierząc specyficzne IgMw taki sam sposób jak IgG1i IgG2a. Przeciwnie, miano specyficznych IgMmożna było zmierzyć stosując raczej kolejne rozcieńczenia każdej próbki niż opisane uprzednio UA, i biorąc pod uwagę w przypadku każdej próbki maksymalne rozcieńczenie, które dawało absorbancję większą niż średnia + 3 SD absorbancji grupy A(NaCl).Tak uzyskane miano wskazywało liczbę razy, do jakich można rozcieńczyć próbkę surowicy, zanim absorbancja uzyskana przy długości fali 490 nm nie pokryje się z szumami tła. To końcowe rozcieńczenie podano dalej w Tabeli (c) dla IgM.

Tabela (a)

Immunoglobuliny specyficzne przeciwko TT podklasy IgG1 (jednostki umowne/ml + SD, **p < 0,01 (testy Anova + Dunnetta (dwustronny))

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	1 ± 2	0 ± 1
B: TT	2871±1633	34367±15018
C: TT + OM-294-MP	8502** ± 2020	78506** ±21660
D: TT + OM-294-DP	11620** ± 2348	136463** ±41025

Tabela (b)

Immunoglobuliny specyficzne przeciwko TT podklasy IgG2a (jednostki umowne/ml + SD, **p < 0,01 (test Anova + Dunnetta (dwustronny))

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	351 + 506	539 ±1046
B: TT	2547 ± 2539	61387± 82269
C: TT + OM-294-MP	8869 ± 6979	65881 ± 46635
D: TT + OM-294-DP	21969** ± 25067	148365±134196

Tabela (c)

Miano immunoglobulin specyficznych przeciwko TT podklasy IgM (rozcieńczenia dla każdej próbki dające sygnał przy 490 nm większy niż sygnał średniej + 3 SD sygnału grupy A)

Grupy	Dzień 14	Dzień 28
A: NaCl	Wzorzec	Wzorzec
B: TT	9 zwierząt < 25 1 zwierzę < 50	10 zwierząt < 25
C: TT + OM-294-MP	9 zwierząt < 25	7 zwierząt < 25 1 zwierzę < 100 2 zwierzęta > 1600
D: TT + OM-294-DP	7 zwierząt < 25 1 zwierzę < 200 2 zwierzęta > 1600	10 zwierząt < 25

Te wyniki wskazują, że adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP były aktywne w badanym modelu, ponieważ zwiększały często znacznie po 1 albo 2 wstrzyknięciach (patrz Fig. 28, 29) specyficzne przeciwciała IgG1i IgG2a anty-TT, wytworzone przez myszy. Przeciwnie, tylko niektóre ze zwierząt wytwarzały IgMspecyficzne przeciwko TT.

14. Ocena właściwości adiuwanta OM-294-MP w modelu immunizacji myszy CBA drogą podawaniapodskórnegoantygenuz Leishmaniagp63

Protokół

Myszy CBA otrzymały do ogona w 8-dniowych odstępach czasu dwa wstrzyknięcia podskórne 2 μg gp63. Adiuwant OM-294-MP mieszano z dwiema dawkami antygenu, natomiast BCG mieszano tylko

PL 195 764 B1 z jedną dawką. Każda mysz otrzymała 2 x 50pg OM-294-MP albo 200 pg BCG. Grupę kontrolną poddawano wstrzyknięciu tylko antygenu (bez adiuwanta). Dziesięć dni po drugim wstrzyknięciu komórki pachwinowych węzłów chłonnych i okołotętniczych (grupy po 3 myszy) poddawano hodowli i oceniano reakcję rozrostową na oczyszczony antygen gp63 drogą pomiaru inkorporacji tymidyny (³H-TdR).Wytwarzanie cytokin γ-IFN i IL-4 in vitro przez limfocyty węzłów stymulowane ponownie in vitro przez antygen gp63 (zestawy γ-IFN MIF00 i IL-4 M4000, R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK) oznaczono również, przed dodaniem ³H-TdR, za pomocą ELISA na każdej próbce supernatantów znad hodowli limfocytów z węzłów chłonnych. Wartości podane w tabelach oznaczają w przypadku inkorporacji ³H-TdR średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (potrójnie), wyrażoną w cpm, a w przypadku cytokin w supernatantach -średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (z trzech powtórzeń) wyrażoną w pg na ml.

Antygen: przygotowano roztwór wyjściowy gp63 o stężeniu 40 pg/ml w 0,9% NaCl.

Adiuwanty: przygotowano roztwór wyjściowy OM-294-MP o stężeniu 1mg/ml w wodzie do iniekcji, z dodatkiem 0,1% trietanoloaminy. Kontrolę negatywną stanowił roztwór PBS bez antygenu.

Mieszanina antygen-adiuwant: przed poddaniem wirowaniu w ciągu 3 minut adiuwanty umieszczano na 10 minut w temperaturze 37°C. Następnie, przed poddaniem inkubacji w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C, antygen (1objętość) i adiuwant (1 objętość) mieszano i poddawano krótkiemu worteksowaniu, po czym worteksowano całość przez 3 minuty.

Wyniki

Umyszypoddanychimmunizacjiantygenemgp63adiuwant OM-294-MP indukował lepszą reakcję rozrostu limfocytów (Tabela (a) i Fig. 30 (a)) niż BCG. Faktycznie w stosunku do hodowli pochodzących od zwierząt poddanych immunizacji bez adiuwanta zwiększenie rozrostu wynosiło od 3,1 do 6 w przypadku produktu OM-294-MP, natomiast nie przekraczało ono 3,5 w przypadku BCG (2,6 do3,5). W tych samych kulturach limfocytowych wytwarzanie cytokin mierzono w supernatancie(Tabela (b) i Fig. 30 (b)). Obserwowano, że antygen gp63 indukował wydzielanie γ-IFN w ilościach równoważnych, gdy myszy traktowano adiuwantem OM-294-MP albo BCG. Przeciwnie, adiuwant OM-294-MP wydawał się preferować limfocyty odporne (anty-gp63) na wydzielanie większych ilości IL-4, natomiast limfocyty myszy potraktowanych za pomocą BCG wydzielały ilości niewielkie, a nawet niewykrywalne, tej cytokiny.

Tabela (a)

Wpływ adiuwanta OM-294-MP na reakcję immunologiczną względem antygenu gp63, zmierzoną drogą rozrostu limfocytów T mysz w reakcji na antygengp63 in vitro

gp63 in vitro	Bez adiuwanta (cpm x 10^-3/ml)	OM-294-MP (cpm x 10^-3/ml)	BCG (cpm x 10^-3/ml)
0	1,4 ±0,4	2,8 ± 0,7	5,3 ± 1,1
0,16	18 ± 5	65 ± 11	47 ± 9
0,31	17 ± 5	92 ± 11	57 ± 17
0,62	16 ± 4	93 ± 13	54 ± 13
1,25	13 ± 2	39 ± 7	44 ± 9

Wartości przedstawione w Tabeli (a) są średnią arytmetyczną ±odchylenie standardowe inkorporacji (z trzech powtórzeń hodowli).

PL 195 764 B1

Tabela (b)

Wpływ adiuwanta OM-294-MP podawanego in vivow połączeniu z antygenem gp63 na wytwarzanie in vitro cytokin przez limfocyty węzłów chłonnych

Stężenie γ-IFN (pg/ml)
gp63 pg/ml	Bez adiuwanta	294-MP	BCG
0	< 9	< 9	27
0,3	78	135	200
0,6	38	120	105
Stężenie IL-4 (pg/ml)
gp63 pg/ml	Bez adiuwanta	294-MP	BCG
0	< 8	< 8	< 8
0,3	< 15	125	15
0,6	< 8	83	< 8

Adiuwant OM-294-MP wzmagał u myszy CBA poddanych immunizacjigp63(antygenamfifilowy pasożyta Leishmania) specyficznąreakcjękomórekTocenianąinvitrodrogą pomiaru rozrostu limfocytów i indukowanego przez antygen wytwarzania γ-IFN i IL-4.

16. Skuteczność adiuwanta OM-294-MP w czasie pierwotnej reakcjikomórekTanty-LmCPbq modeluimmunizacyjnymmyszy CBA podskórnie antygenem LmCPb z Leishmania mexicana

Protokół

Myszy CBA otrzymały w ogon wstrzyknięcie 2 pg LmCPb z albo bez 50 pg adiuwanta OM-294-MP. Grupa kontrolna (nie poddana immunizacji) otrzymała wstrzyknięcie buforu fizjologicznego. Jedenaście dni później komórki pachwinowych węzłów chłonnych i okołotętniczych (grupy po 3 myszy) poddawano hodowli i oceniano reakcję rozrostową na oczyszczony antygen LmCPb, na pełny preparat amastygot z Leishmania mexicana i na konkanawalinę A (Con A) drogą pomiaru inkorporacji trytowanej tymidyny (³H-TdR). Za pomocą ELISA oznaczano również wytwarzanie cytokin γ-IFN i IL-4 przez limfocyty węzłów chłonnych stymulowane ponowniein vitroprzez antygen LmCPb z Leishmania mexicana albo przez amastygoty (zestawy γ-IFN MIF00 i IL M4000, R&D Systems Europe Ltd, Abington, ₃

UK) na każdej próbce supernatantów znadhodowli limfocytów węzłów przed dodaniem ³H-TdR.

Wartości podane w tabelachstanowią w przypadku inkorporacji ³H-TdR wartość średnią ±odchylenie standardowe (z trzech powtórzeń), wyrażoną w cpm, a w przypadku cytokin w supernatantach -średnią arytmetyczną ±odchylenie standardowe (z trzech powtórzeń) wyrażoną w pg na ml.

Antygen: przygotowano roztwór wyjściowy LmCPb o stężeniu 40 pg/ml w dwukrotnie zatężonym PBS.

Adiuwanty: przygotowano roztwór wyjściowy OM-294-MP ostężeniu 1mg/ml w wodzie do iniekcji z dodatkiem 0,1% trietanoloaminy. Kontrolę negatywną stanowił roztwór PBS bez antygenu.

Mieszanina antygen-adiuwant: przed poddaniem wirowaniu w ciągu 3 minut adiuwanty umieszczano na 10 minut w temperaturze 37°C. Następnie antygen (1 objętość) i adiuwant (1 objętość) mieszano i poddano krótko worteksowaniu przed poddaniem inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37°C, po czym całość poddawano worteksowaniu przez 3 minuty.

Wyniki

Przy braku jakiegokolwiek środka stymulującego dodanego do pożywki hodowlanej adiuwant OM-294-MP sprzyjał rozwijaniu się limfocytów, które podlegają samorzutnemu rozrostowi (Tabela (a) i Fig. 32 (a)) i wydzielają ślady γ-IFN (Tabela (b) i Fig. 31 (b)). Ta reakcja wzmagała się silnie, gdy do hodowli dodawano oczyszczony antygen LmCPb albo pełny wyciąg z pasożytów. Wtym doświadczeniu stwierdzono, że istnieje wyraźny wpływ adiuwanta na indukcję uczulonych limfocytów (anty-LmCPb)zdolnychdowydzielaniadużychilościIL-4(Tabela(b)iFig.31(b)).

PL 195 764 B1

T ab el a (a)

Reakcja rozrostowa in vitrokomórek węzłów chłonnych poddanych immunizacji in vivo LmCPb: wpływ adiuwanta OM-294-MP

	Inkorporacja ³H-TdR (cpm x 10^-3/ml)
Antygen in vitro	Bez immunizacji	Bez adiuwanta	OM-294-MP
Brak środka stymulującego	0,9 ± 0,3	2,2 ± 0,7	11 ± 2
LmCOb 0,6 pg/ml	0,8 ± 0,4	1,7 ± 0,1	19 ± 4
LmCOb 1,7 pg/ml	0,9 ± 0,1	4,6 ± 1,6	40 ± 4
LmCOb 5 pg/ml	1,3± 0,8	7,2 ± 0,6	80 ± 5
LmCOb 15 pg/ml	2,6 ± 0,4	16,2 ± 2,1	140 ± 10
Amastygoty 1,9 x 10^-6/ml	0,8 ± 0,2	1,7 ± 0,1	44 ± 7
Amastygoty 6 x 10^-6/ml	1,5± 0,2	4,6 ± 0,6	79 ± 6
Amastygoty 17 x 10^-6/ml	2,9 ± 0,6	7,2 ± 0,6	119 ± 4
Con A 5 pg/ml	123 ± 33	193 ± 17	196 ± 10

T ab el a (b)

Wydzielanie in vitro cytokin przez limfocyty węzłów chłonnych poddanych immunizacji in vivo za pomocą LmCPb: wpływ adiuwanta OM-294-MP na reakcję pierwotną

Wytwarzanie γ-IFN (pg/ml)
Stymulant in vitro	Brak immunizacji	Bez adiuwanta	OM-294-MP
Brak środka stymulującego	< 9	< 9	25
LmCPb 15 pg/ml	< 9	46	480
Amastygoty 17 x 10^-6/ml	< 9	95	320
Con A 5 pg/ml	> 1800	> 1800	> 1800
Wytwarzanie IL-4 (pg/ml)
Stymulant in vitro	Brak immunizacji	Bez adiuwanta	OM-294-MP
Brak środka stymulującego	< 8	< 8	< 8
LmCPb 15 pg/ml	< 8	< 8	130
Amastygoty 17 x 10^-6/ml	< 8	< 8	65
Con A 5 pg/ml	92	190	360

Adiuwant OM-294-MP był także bardzo skuteczny w czasie pierwotnej reakcji T (w następstwie pojedynczego wstrzyknięcia szczepionki). Charakterystyki wpływu wspomagającego na tę reakcję (zwiększenie rozrostu limfocytów, indukcja cytokin) były podobne do charakterystyk obserwowanych wczasiereakcji na dwa wstrzyknięcia szczepionki.

16. Ocena właściwości adiuwantów OM-294-MP i OM-294-DP w modelu immunizacji myszy CBA, przez podskórne podanie antygenuLmCPbzLeishmaniamexicana: porównanie z BCG

Protokół

Myszy CBA (8 myszy w grupie) otrzymały w ogon w 8-dniowych przerwach dwa wstrzyknięcia podskórne od 3 do 5 μg oczyszczonego LmCPb. Adiuwanty OM-294-DP, OM-294-MP mieszano z dwiema dawkami antygenu, natomiast BCG został zmieszany tylko z pierwszym. Każda mysz otrzymała 2 x 50 μg adiuwanta OM albo 200 μg BCG. Osiem dni po drugim wstrzyknięciu pobierano węzły chłonne pachwinowe i okołotętnicze (3 myszy w grupie), a komórki hodowano w celu określenia reakcji rozrostowej na oczyszczony antygen LmCPb, albo odpowiednio reakcji rozrostowej na pełny preparat amastygot z Leishmania mexicana albo na konkanawalinę A (Con A). Reakcję rozrostową oceniano

PL 195 764 B1 ₃ drogą pomiaru inkorporacji trytowanej tymidyny ( H-TdR). Wytwarzanie cytokin γ-IFN i IL-4 przez limfocyty węzłów chłonnych stymulowanych ponownie in vitroantygenem LmCPb z Leishmania mexicana albo przez amastygoty albo przez Con A oznaczano przed dodaniem ³H-TdR za pomocą ELISA (zestawy γ-IFN MIF00 i IL-4 M4000, R&D Systems Europę Ltd, Abingdon, UK) na każdej próbce z supernatantów znad hodowli limfocytów węzłów chłonnych.

Wartości podane w tabelach są w przypadku miana przeciwciała średnią arytmetyczną ±odchylenie standardowe wyrażoną w % standardu w przypadku inkorporacji ³H-TdR, średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (z trzech powtórzeń) wyrażoną w cpm, a w przypadku cytokin w supernatantach - średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (z trzech powtórzeń) wyrażonąw pg na ml.

Antygen: przygotowano roztwór wyjściowy LmCPb o stężeniu zawartym pomiędzy 60 i 100 pg/ml w0,9%NaCl.

Adiuwanty: przygotowano wyjściowe roztwory OM-294-MP i OM-294-DP o stężeniu 1 mg/ml w wodzie do iniekcji z dodatkiem 0,1% trietanoloaminy w przypadku OM-294-MP. Kontrolę negatywną stanowił roztwór PBS bez antygenu.

Mieszanina antygen-adiuwant: przed poddaniem wirowaniu w ciągu 3 minut adiuwanty utrzymywano przez 10 minut w temperaturze 37°C. Następnieantygen (1 objętość) i 0,9% adiuwant (1 objętość) mieszano i przed poddaniem ich inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37°C poddano krótko worteksowaniu, a na koniec całość poddawano ponownie worteksowaniu przez 3 minuty.

Wyniki

U myszy poddanych immunizacji antygenem LmCPb (Tabela (a) i (b), Fig. 32 (a) i (b)), produkty OM-294-MP i OM-294-DP wywołały efekt podobny do efektu obserwowanego u myszy, u których rozwijała się reakcja immunologiczna względem gp63. Stąd w obecności LmCPb (15 pg/ml) stopień rozrostu kultur pochodzących od myszy, które poddano immunizacji antygenem plus adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP, był odpowiednio 23 i 28 razy większy niż dla hodowli pochodzących od myszy, którym podano sam antygen (bez adiuwanta). Wpływ BCG w tych warunkach był mniejszy, ponieważ zwiększenie rozrostu było tylko 11-krotne. Analogiczne efekty miały miejsce wtedy, gdy hodowle stymulowano za pomocą oczyszczonego antygenu albo za pomocą pełnego wyciągu z pasożyta Leishmania, orazwe wszystkich badanych stężeniach antygenu.

Wytwarzanie γ-IFN w reakcji na antygen LmCPb ma skłonność do nieznacznego wzrostu w przypadku produktu OM-294-DP w porównaniu z BCG (Tabela (b) i Fig. 32 (b)). Należy zauważyć, że w tym doświadczeniu limfocyty rozrastały się i wydzielały znaczne ilości γ-lFN nawet wtedy, gdy do pożywki hodowlanejnie dodawano antygenu. Wtym przypadku także adiuwant OM-294-DP miał skłonność do trochę większej skuteczności niż BCG. Wyraźna różnica pomiędzy adiuwantami OM-294-MP, odpowiednio OM-294-DP i BCG, wydajesię być, jak poprzednio, związana z rozwojem limfocytów zdolnych do wytwarzania IL-4. Ilość IL-4 wytworzona pod wpływem adiuwantów OM-294-MP i OM-294-DP była istotna, ponieważ była ona równoważna ilości wydzielonej przez limfocyty wystawione na działanie Con A, silny niespecyficzny środek stymuylujący dla limfocytów (patrz Tabela (a) i (b)).

Tabela (a): Reakcja rozrostowa in vitro komórek węzłów chłonnych, pochodzących od myszy poddanych immunizacji in vivo LmCPb: wpływ różnych adiuwantów

	Inkorporacja ³H-TdR (cpm x 10^-3/ml)
Stymulant in vitro	Bez adiuwanta	OM-294-DP	OM-294-MP	BCG
Brak środka stymulującego	1,7 ± 0,6	21,8± 2,2	17,1 ± 2,2	18,6 ± 4,8
LmCPb 0,6 pg/ml	0,8 ± 0,3	40,9 ± 12,7	22,9 ± 2,8	19,0 ± 7,4
LmCPb 1,7 pg/ml	2,4 ± 0,1	57,2 ± 10,9	34,1 ± 4,1	39,8 ± 5,7
LmCPb 5 pg/ml	2,8 ± 0,6	70,2 ± 9,2	70,3 ± 6,4	44,0 ± 10,4
LmCPb 15 pg/ml	4,3 ± 0,1	100,0 ± 6,5	124,2 ± 12,0	46,2 ± 0,3
Amastygoty 2 x 10^-6/ml	2,4 ± 0,6	61,0± 1,7	28,4 ± 8,3	24,4 ± 4,3
Amastygoty 6 x 10^-6/ml	2,3 ± 0,7	81,1 ± 5,5	66,1 ± 4,5	23,6 ± 2,5
Amastygoty 17 x 10^-6/ml	1,7 ± 0,4	78,2 ± 7,8	68,7 ± 2,3	23,4 ± 4,0
Con A 5 pg/ml	188,1 ± 21,0	135,9 ± 3,7	151,4 ± 3,7	119,7 ± 28,5

PL 195 764 B1

Wartości podane w tabeli stanowią wartość średnią ± odchylenie standardowe inkorporacji (trzy powtórzenia hodowli).

Tabela (b): Wytwarzanie cytokin in vitro przez limfocyty węzłówchłonnychmyszy poddanychimmunizacji in vivo antygenem LmCPb: wpływ różnych adiuwantów

Stężenie γ-IFN w pg/ml
Stymulant In vitro	Bez adiuwanta	OM-294-DP	OM-294-MP	BCG
Brak środka stymulującego	< 9	460	240	280
LmCPb 15 pg/ml	44	520	360	460
Amastygoty 17 x 10^-6/ml	14	> 600	> 600	480
Gon A 5 pg/ml	1200	1200	1900	> 3000
Stężenie IL-4 w pg/ml
Stymulant in vitro	Bez adiuwanta	OM-294-DP	OM-294-MP	BCG
Brak środka stymulującego	< 15	< 8	< 8	< 8
LmCPb 15 pg/ml	< 15	110	88	36
Amastygoty 17 x 10^-6/ml	< 8	130	110	29
Con A 5 pg/ml	40	230	85	105

Adiuwanty OM-294-MP i OM-294-DP zwiększały skutecznie reakcję odpornościową na rozpuszczalny antygen z Leishmania, proteazę LmCPb. Odzwierciedlało to in vitro zwiększenie reakcji rozrostowej po indukcji wytwarzania w znacznych ilościach γ-IFN i IL-4.

Przykład VI

Wodny roztwór do iniekcji

Związek z przykładu III 1 g

Polysorbate 80 0,2g

Chlorek sodowy 9g

Woda destylowana do iniekcji 1000ml

Wartość pH roztworu nastawiano na 7,4 za pomocą 0,1M HCl, a następnie sterylizowano przez filtrację na membranie 0,22 μm Steritop Express 1000 (membrana PES, 90 mm, SCGP T10 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Sterylny roztwór rozdzielano do sterylnych ampułek o pojemności 1ml.

Produkt liofilizacji

Związek z przykładu IV 2 g

Polysorbate 0,2g

Chloreksodowy 9g

Mannit 10g

Kwasaskorbinowy 0,1g

Wodadestylowanadoiniekcji 1000ml

Wartość pH roztworu nastawiano na 7,4 za pomocą 0,1M HCl, a następnie sterylizowano przez filtrację na membranie 0,22 μm Steritop Express 1000 (membrana PES, 90 mm, SCGP T10 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Sterylny roztwór rozdzielano do sterylnych wielodawkowych fiolekwilości1mlnafiolkę,anastępniepoddano liofilizacji.

Claims

1 . Pseudodipeptydy N-acylowe o wzorze ogólnym I:

X-A-(CH₂)_mCH-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)p-CH-(CH₂)_q-B-Y (I)

I I

NHRi NHR₂ w którym każdy R1i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)alkilotio, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę kwasową wybraną z grupy obejmującej:

- karboksy[(C1-C5)alkil],

- CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH], gdzie m = 0 do 5, a n = 0 do 5,

- fosfono[(C1-C5)alkil],

- dihydroksyfosforyloksy[(C1-C5)alkil],

- dimetoksyfosforyl,

-grupę fosfonową,

-hydroksysulfonyl,

- hydroksysulfonylo[(C1-C5)alkil],

2. Związekwedług zastrz. 1, znamienny tym, że X i/lub Y oznaczają grupę kwasową przeprowadzoną w postać soli przy użyciu zasady nieorganicznej albo organicznej, zwłaszcza do zastosowaniaterapeutycznego.

3. Związki według zastrz. 1 o wzorze ogólnym I, znamienne tym, że zawierają elementy o konfiguracjiRalboS,alboelementyracemiczne.

4. Związki według zastrz. 1 , o wzorze ogólnym I':

X-O-(CH₂)_rnCH-(CH₂)n-CO-NH-(CH₂)p-CH-(CH₂)q-O-Y (1' )

I I

NHRi NHR₂ w którym każdy R1i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)alkilotio, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, a każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę fosfonową.

5. Związek według zastrz. 1 albo 2, albo 4, którym jest 1- i/lub 10-diwodorofosforan 3-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego soleaddycyjnezzasadąnieorganicznąalboorganiczną.

6. Związek według zastrz. 1 albo 2, albo 4, którym jest 1 ,10-bis(diwodorofosforan) 3-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10ijego soleaddycyjnezzasadąnieorganicznąalboorganiczną.

PL 195 764 B1

7. Związek według zastrz. 1 albo 2, albo 4, którym jest 1 ,10-bis(diwodorofosforan) 3-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-9-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego soleaddycyjnezzasadąnieorganicznąalbo organiczną.

8. Związek według zastrz. 1 albo 2, albo 4, którym jest mono-1-diwodorofosforan 3-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-9-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10 i jego sole addycyjne z zasadą nieorganicznąalbo organiczną.

9. Związek według zastrz. 1 albo 2, albo 4, którym jest mono-1-diwodorofosforan 3-(3-hydroksytetradekanoiloamino)-9-(3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino)-4-okso-5-azadekanodiolu-1,10ijego soleaddycyjnezzasadą nieorganicznąalboorganiczną.

10.Sposóbwytwarzaniapseudodipeptydówokreślonychwzastrz.1owzorzeogólnymI:

X-A-(CH₂)_mCH-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_p-CH-(CH₂)q-B-Y (I)

I I

NHR! NHR₂ w którym każdy R1i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)alkilotio, w którym co najmniej jeden z podstawników R1albo R2 oznacza grupę acyloksyacylową, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę kwasową wybraną z grupy obejmującej:

- karboksy[(C1-C5)alkil],

- CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH], gdzie m = 0 do 5, a n = 0 do 5,

- fosfono[(C1-C5)alkil],

-dihydroksyfosforyloksy[(C1-C5)alkil],

-dimetoksyfosforyl,

- hydroksysulfonyl,

-hydroksysulfonylo[(C1-C5)alkil],

-hydroksysulfonyloksy[(C1-C5)alkil],

-grupę fosfonową, w postaci obojętnej albo naładowanej, z tym ograniczeniem, że co najmniej jeden z podstawników X i Y oznacza określoną powyżej grupę kwasową w postaci obojętnej albo naładowanej, a

A i B mają powyżej podane znaczenia, znamienny tym, że blokuje się aminowe grupy funkcyjne w położeniu (q+1) i w położeniu ω diaminokwasu o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH za pomocą reagenta blokującego ulegającego odpowiednio acydolizie i wodorolizie, poddaje się wolną pozostałą karboksylową grupę funkcyjną działaniu środka redukującego z wytworzeniem odpowiedniego alkoholu, uwalnia się aminową grupę funkcyjną w położeniu (q+1), którą następnie acyluje się za pomocą pochodnej funkcyjnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 ma powyżej podane znaczenie, a następnie uwalnia się końcową aminową grupę funkcyjną drogą wodorolizy z otrzymaniem aminoalkoholu o wzorze ogólnymII:

H₂N-(CH₂)p-CH-(CH₂)_q-OH (II)

I nhr₂ w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo kilkoma podstawnikami określonymi jak wyżej, a p i q oznaczają liczbę całkowitą od 1 do 10, następnie diaminoalkohol kondensuje się w obecności peptydowego

PL 195 764 B1 środka kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku z pochodną ω-hydroksy-, -amino- albo -tioaminokwasu o wzorze ogólnym III:

XA-(CH₂)m-CH-(CH2)n-COOH (111)

I

NHR!

w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo kilkoma podstawnikami, jak określono wyżej, m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10,

A oznacza atom tlenu, atom siarki albo grupę iminową NH, a

XA(CH₂)_m-CH-(CH₂)_n-CONH-(CH₂)_p-CH-(CH₂)_q-OH (IV)

I I

NHRi NHR₂ w którym R1,R2, m, n, p i q mają powyżej podane znaczenia, którego alkoholową grupę funkcyjną, jeżeli jest to pożądane, można podstawiać, alkilować albo acylować za pomocą środka podstawiającego, alkilującego albo acylującego i, jeżeli jest to konieczne, w obecności środka sprzęgającego poddawać uwodornianiu katalitycznemu albo innemu sposobowi usuwania grupy zabezpieczającej, otrzymując związek o wzorze ogólnym I:

X-A-(CH₂)_m-CH-(CH₂)n-CONH-(CH₂)p-CH-(CH₂)_q-B-Y (I)

I I

NH NH w którym A, B, X, Y, R1,R2, n, m, p i q mają powyżej podane znaczenia.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że prowadzi się etap dodatkowy przeprowadzaniawsólprzyużyciuzasadynieorganicznejalboorganicznej.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że etap przeprowadzania w sól prowadzi się przyużyciuterapeutyczniedopuszczalnejzasadynieorganicznejalboorganicznej.

13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako kwas karboksylowy R1OH stosuje się kwas3-dodekanoiloksytridekanokarboksylowy.

14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako kwas karboksylowy R2OH stosuje się kwas3-hydroksytridekanokarboksylowy.

15. Sposób wytwarzania fosfopseudodipetydow określonych w zastrz. 1 albo 2, o wzorze ogólnymI':

X-O-(CH₂)_mCH-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)p-CH-(CH₂)_q-O-Y (i')

I I

NHRi NHR₂ w którym każdy R1i R2oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę (C1-C24)alkilotio,

PL 195 764 B1 m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę fosfonową w postaci obojętnej albo naładowanej, znamienny tym, że blokuje się aminowe grupy funkcyjne w położeniu (q+1) i w położeniu ω diaminokwasu o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH za pomocą reagentów blokujących ulegających odpowiednio acydolizie i wodorolizie, poddaje wolną pozostałą karboksylową grupę funkcyjną działaniu środka redukującego z wytworzeniem odpowiedniego alkoholu, uwalnia się aminową grupę funkcyjną w położeniu (q+1), którą acyluje się za pomocą pochodnej funkcyjnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 ma powyżej podane znaczenie, a następnie uwalnia się końcową aminową grupę funkcyjną drogą wodorolizy z otrzymaniem aminoalkoholu o wzorze ogólnym II:

H₂N-(CH₂)_p-CH-(CH₂)_q-OH (11)

I nhr₂ w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo kilkoma podstawnikami o powyżej podanym znaczeniu, a p i q oznaczają liczbę całkowitą od 1 do 10, następnie aminoalkohol kondensuje się w obecności peptydowego środka kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku z pochodną ω-hydroksy-, -amino- albo -tioaminokwasu o wzorze ogólnym III':

XO-(CH₂)_rn-CH-(CH₂)_n-COOH (III')

I

NHR!

w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo kilkoma podstawnikami, m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, a X oznacza rodnik dialkoksy- albo diaryloksyfosforylowy o wzorze (RO)₂P

I o

otrzymując pseudodipeptyd o wzorze ogólnym IV':

(RO^PO-iCH^m-CH-iCH^n-CONH-iCHzJp-CH-iCHz^-OH (IV')

I I I

O NHRi NHR₂ w którym R1,R2, m, n, p i q mają powyżej podane znaczenia, a R oznacza rodnik ulegający wodorolizie, którego alkoholową grupę funkcyjną, jeżeli jest to pożądane, można fosforylować za pomocą środka fosforylującego w obecności, jeżeli jest to konieczne, środka sprzęgającego i poddawać uwodornianiu katalitycznemu w dwóch etapach tak aby zablokować alkoholową grupę funkcyjną ewentualnie istniejącą na grupie acylowej R2 i fosforanową grupę funkcyjną, i ewentualnie istniejącą drugą fosforanową grupę funkcyjną, które można następnie odblokować drogą wodorolizy, otrzymując pochodną o wzorze ogólnym V:

PL 195 764 B1 (HO)₂P-O-(CH₂)_m-CH-(CH₂)_n-CONH-(CH₂)_p-CH-(CH₂)q-O-Y (V)

NH

R₂ w którym Y oznacza atom wodoru albo grupę fosfonową.

16.Sposób według zastrz. 15, znamienny tym,żeprowadzi się etap dodatkowy przeprowadzaniawsólprzyużyciuzasadynieorganicznejalboorganicznej.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że etap przeprowadzania w sól prowadzi się przy użyciu terapeutycznie dopuszczalnej zasady nieorganicznej albo organicznej.

18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako kwas karboksylowy R1OH stosuje się kwas3-dodekanoiloksytridekano-karboksylowy.

19.Sposóbwedługzastrz.15, znamienny tym, że jako kwas karboksylowy R2OH stosuje się kwas 3-hydroksytridekanokarboksylowy.

20. Kompozycje farmaceutyczne, znamienne tym,żejakoskładnikczynnyzawierająconajmniejjedenzwiązekokreślonywzastrz.1owzorzeogólnymI:

X-A-(CH₂)_mCH-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)p-CH-(CH₂)q-B-Y (I)

NHRi

NHR₂ w którym każdy R1i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu karboksylowego zawierającego od 2 do 24 atomów węgla, nasyconego albo nienasyconego, liniowego albo rozgałęzionego, niepodstawionego albo podstawionego jednym albo więcej niż jednym podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksyl, acyloksyl, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę acylotio i grupę(C₁-C₂₄)'alkilotio, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, każdy X i Y oznacza atom wodoru albo grupę kwasową wybraną z grupy obejmującej:

-karboksy[(C1-C5)alkil],

-CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH], gdzie m = 0 do 5, a n = 0 do 5,

- fosfono[(C1-C5)alkil],

-dihydroksyfosforyloksy[(C1-C5)alkil],

- dimetoksyfosforyl,

- dihydroksyfosforyl,

-hydroksysulfonyl,

-hydroksysulfonylo[(C1-C5)alkil],

-hydroksysulfonyloksy[(C1-C5)alkil],

-grupę fosfonową, w postaci obojętnej albo naładowanej, z tym ograniczeniem, że co najmniej jeden z podstawników X i Y ma określoną jak wyżej grupę kwasową w postaci obojętnej albo naładowanej, a

21. Kompozycje według zastrz. 20, znamienne tym, że związek o wzorze I stanowi jeden z tych związków, w których X i ewentualnie Y oznacza rodnik fosfonowy, a A i B oznaczają atom tlenu.

22. Kompozycje według zastrz. 21, znamienne tym, że składnik czynny ma postać soli z terapeutyczniedopuszczalnązasadąmineralnąalboorganiczną.

23. Kompozycje według zastrz. 20 albo 21, albo 22, znamienne tym, że składnik czynny ma postać enancjomerycznie czystą albo postać mieszaniny steroizomerów.