MX2010011412A - Vacuna. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición inmunogénica, la cual comprende un antígeno de Streptococcus pneumoniae y una composición de adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceit n agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de agente emulsionante, por dosis humana.

Description

VACUNA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a composiciones de vacuna e inmunogénicas mejoradas, y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a formulaciones de vacuna o inmunogénicas, las cuales comprenden un adyuvante en emulsión de aceite en ag ua, y a su uso en medicina, en particular a su uso para aumentar las respuestas inmunitarias a diferentes antígenos, incluyendo a los antígenos de S. Pneumoniae, y a métodos de preparación , en donde la emulsión de aceite en agua comprende un tocol , un aceite metabolizable, y un agente emulsionante.

ANTECEDENTES TÉCN ICOS Siempre se necesitan nuevas composiciones o vacunas con una inmunogenicidad mejorada. Como u na estrategia, se han utilizado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria prod ucida para cualquier antígeno : dado, y/o para red ucir la reactogenicidad/toxicidad en el huéspe'd .

Las emulsiones de aceite en agua por sí mismas son bien conocidas en la materia , y se ha sugerido que son útiles como composiciones adyuvantes (Patente Europea Número EP 399843; Publicación I nternacional N úmero WO 95/1 7210) .

La Publicación I nternacional Número WO95/1 721 0 da a conocer emulsiones de aceite en agua, las cuales comprenden del 2 al 1 0 por ciento de escualeno, del 2 al 1 0 por ciento de alfa-tocoferol, y del 0.3 al 3 por ciento de Tween 80, y su uso solas o en combinación con QS21 y/o 3D-MPL.

La Publicación Internacional Número W099/12565 da a conocer composiciones en emulsión de aceite en agua que comprenden un aceite metabolizable, una saponina, y un esterol. La emulsiones de aceite en agua comprenden además 3D-MPL.

La Publicación Internacional Número W099/11241 da a conocer emulsiones de aceite en agua, las cuales comprenden un aceite metabolizable y una saponina, en donde el aceite y la saponina están presentes en una proporción de entre 1:1 y 200:1.

Existe todavía una necesidad de composiciones de vacuna e inmunogénicas mejoradas que proporcionen una respuesta inmunitaria adecuada y que sean menos reactogénicas en el huésped.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto que se pueden utilizar composiciones de vacuna o inmunogénicas que comprenden cantidades más bajas de cada componente de la emulsión de aceite en agua, mientras que todavía se mantiene una respuesta inmunitaria comparable contra un antígeno o composición antigénica dentro de esta composición. Esto tiene la ventaja de mantener el nivel de inmunogenicidad contra un antígeno mientras que se reduce la reactogenicidad dentro del huésped receptor.

De conformidad con lo anterior, en el primer aspecto de la presente invención se proporciona una composición inmunogénica, la cual comprende un antígeno de Streptococcus pneumoniae, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de vacuna, la cual comprende un antígeno de Streptococcus pneumoniae, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante,' por dosis humana.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una composición de vacuna o inmunogénica, la cual comprende un antígeno de Streptococcus pneumoniae, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante, en la elaboración de una composición inmunogénica para el tratamiento, el alivio, o la prevención de una infección o enfermedad neumocócica.

En un aspecto adicional, se proporciona un método o uso como se define anteriormente en la presente, para la protección contra una infección o enfermedad causada por un patógeno, el cual es una variante del patógeno a partir del cual se deriva el antígeno de la com posición inm unogénica . E n otra modalidad , se proporciona u n método o uso com o se define anteriormente en la presente, pa ra la protección contra infecciones o enferm edades causadas por un patógeno, el cual com prende un antígeno q ue u na variante del antígeno de la com posición in munogén ica .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Estudio clínico: titulaciones medias geométricas (GMTs) para el anticuerpo anti-hemaglutinina (HA) en diferentes puntos del tiempo (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) .

Figura 2: Estudio clínico: índice de seroprotección (SPR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (H l) con un intervalo de confianza del 95 por ciento en el día 0 y en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) .

Figura 3: Estudio clínico: índice de seroconversión (SCR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) con u n intervalo de confianza del 95 por ciento en el d ía 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad).

Figura 4: Estudio clínico: factor de seroconversión (SCF) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (H l) con un intervalo de confianza del 95 por ciento en el d ía 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) .

Figuras 5A-5C : Estudio en ratones: Prueba de inhibición de hemaglutinina (G MT +/- IC95) en ratones BALB/c primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas (intervalo de dosis AS03). Figu ra 5A: Titulaciones de Anti-A/Nueva Caledonia/20/99 H l ; Figura 5B : Titu laciones de Anti-A/Panam á/2007/99 H l . Fig u ra 5C : Titu laciones de Anti-B / S h andong / 7/97 H l .

Figura 6: Estudio en ratones: Prueba de inhibición de hemaglutinina (G T +/- IC95) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas (intervalo de dosis AS03).

Figura 7: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (célu las-T C D4+) en células monon ucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de ratones C57BI/6 primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas (intervalo de dosis AS03).

Figura 8: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (células-T CD4+) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de ratones C57BI/6 primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas e inmunizados con una dosis baja de antígeno (0.5 microgramos) y adyuvante con el intervalo de dosis AS03.

Figuras 9A-9F: Estudio en ratones: Titulaciones ELISA de Ig en suero específica de H5N 1 (A y B), y' respuestas isotípicas de lgG 1 anti-H5N 1 (C y D) e lgG2b (E y F) en el día 14 después de la inmunización (GMT +/- IC95) para dos dosis de antígeno diferentes: 1 .5 microgramos (A, C y E) o 0.38 microgramos (B , D y F) Figuras 10A-1 0B: Estudio en ratones: Prueba de inhibición de hemaglutinación (GMT +/- IC95) en el día 21 después de la inmunización (G MT +/- IC95) para dos dosis de antígeno diferentes: 1 .5 microg ramos (A) o 0.38 microgramos (B).

Figuras 11A-11 B: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (células-T CD4 + ) en ratones C57BI/6 puros inmunizados con diferentes dosis de la vacuna H5N1 (1.5 ó 0.38 microgramos) y adyuvante con el intervalo de dosis de AS03: (A) 1.5 microgramos de HA Ag (antígeno) o (B) 0.38 microgramos de HA Ag (antígeno).

Figura 12: Estudio en cerdos. Prueba de inhibición de hemaglutinina (GMT +/- IC95) en cerdos primeramente inoculados con cepas homólogas (intervalo de dosis AS03).

Figuras 13A-13C: Estudio en ratones. Respuesta inmunitaria I humoral medida mediante ELISA en ratones C57bl inmunizados con 3 microgramos de cada uno de dPly, PhtD, y Proteína D en adyuvante AS03 que contiene 250, 125 ó 62.5 microgramos de SB62.

Figuras 14A-14C: Estudio en ratones. Respuesta inmunitaria humoral medida mediante ELISA en ratones C57bl inmunizados con 6, 3 ó 1.5 microgramos de dPly, PhtD, y Proteína D en adyuvante AS03 que contiene 250, 125 ó 62.5 microgramos de SB62.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores pretenden que los términos "comprendiendo", "comprenden" y "comprende" en la presente, sean opcionalmente sustituibles con los términos "consistiendo en", "consisten en" y "consiste en", respectivamente, en cada caso.

Las modalidades de la presente en relación con "composiciones de vacuna" de la invención, también son aplicables a las modalidades en relación con "composiciones inmunogénicas" de la invención, y viceversa.

En una modalidad de la invención, se proporciona una composición de vacuna o inmunogénica que comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante! por dosis humana.

En una modalidad adicional de, la invención, se proporciona una composición de vacuna o inmunogénica que comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable (tal como escualeno), de 0.5 a 11 miligramos de tocol (tal como alfa-tocoferol y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante (tal como mono-oleato de sorbitán de polioxietileno), por dosis humana.

Componente de emulsión de aceite en agua La composición adyuvante de la invención comprende un adyuvante en emulsión de aceite en agua, de preferencia esta emulsión comprende un aceite metabolizable en una cantidad de 0.5 a 10 miligramos, un tocol en una cantidad de 0.5 a 11 miligramos, y un agente emulsionante en una cantidad de 0.4 a 4 miligramos, y que tiene gotas de aceite, de las cuales cuando menos el 70 por ciento por intensidad tienen diámetros de menos de 1 miera.

Con el objeto de que cualquier composición de aceite en agua sea adecuada para su administración a seres humanos, la fase de aceite del sistema en emulsión tiene que comprender un aceite metabolizable. El significado del término "aceite metabolizable" es bien conocido en la materia. Metabolizable se puede definir como 'ser capaz de transformarse mediante el metabolismo' (Dorland's lllustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25a Edición (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite de animal, o aceite sintético, el cual no sea tóxico para el receptor, y el cual sea capaz de transformarse mediante el metabolismo. Las nueces, semillas, y granos son las fuentes comunes de los aceites vegetales. Los aceites sintéticos también son parte de esta invención, y pueden incluir los aceites comercialmente disponibles, tales como NEOBEE® y otros. Un aceite metabolizable particularmente adecuado es el escualeno. El escualeno (2,6,10,15, 19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa-hexaeno) es un aceite insaturado, el cual se encuentra en grandes cantidades en el aceite de hígado de tiburón, y en cantidades más bajas en el aceite de oliva, en el aceite de germen de trigo, en el aceite de arroz integral, y en la levadura, y es un aceite particularmente preferido para utilizarse en esta invención. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho de que es un intermediario en la biosíntesis del colesterol (Merck Index, 10a Edición, Anotación Número 8619).

De una manera adecuada, él aceite metabolizable está presente en la composición adyuvante en una cantidad de 0.5 a 10 miligramos, de preferencia de 1 a 10, 'de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, ó de 5 a 6 miligramos (por ejemplo, de 2 a 3, de 5 a 6, o de 9 a 10 miligramos), específicamente 5.35 miligramos o 2.14 miligramos. En una modalidad adicional de la invención, el aceite metabolizable está presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad de 0.5 a 10 miligramos, de preferencia de 1 a 10, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, o de 5 a 6 miligramos (por ejemplo, de 2 a 3, de 5 a 6, o de 9 a 10 miligramos), específicamente 5.35 miligramos o 2.14 miligramos.

La cantidad de aceite metabolizable en la composición de vacuna o inmunogénica se puede expresar como un porcentaje de la composición total. De una manera adecuada, el aceite metabolizable está presente en la composición de vacuna en una cantidad del 0.5 por ciento al 2 por ciento, de preferencia del 0.25 al 2, o del 0.25 al 1.75, o del 0.5 al 1.65, o del 0.6 al 1.5, o del 0.8 al 1.4, o del 1 al 1.25 por ciento (volumen/volumen) de aceite del volumen total de la composición.

En otra modalidad específica, el aceite metabolizable está presente en una cantidad final de aproximadamente el 1.25 por ciento del volumen total de la .composición de vacuna (o inmunogénica). En otra modalidad esp'écífica, el aceite metabolizable está presente en una cantidad 'final del 0.25 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición.

A manera de aclaración, las° concentraciones dadas en volumen/volumen se pueden convertir en concentración en peso/volumen mediante la aplicación del siguiente factor de conversión: una concentración de escualeno del 5 por ciento (volumen/volumen) es equivalente a una concentración de escualeno del 4.28 por ciento (peso/volumen).

La emulsión de aceite en agua comprende un tocol. Los tocóles son bien conocidos en la materia y se describen en la Patente Europea Número EP0382271. De una manera adecuada, el tocol es alfa-tocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa-tocoferol (también conocido como succinato de vitamina E). Este tocol está adecuadamente presente en la composición adyuvante en una cantidad de 0.5 a 11 miligramos, de preferencia de 1 a 11, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, de 5 a 6 (por ejemplo, de 10 a 11, de 5 a 6, de 2.5 a 3.5, o de 1 a 3 miligramos). En una modalidad específica, el tocol está presente en una cantidad de 5.94 miligramos o de 2.38 miligramos. En una modalidad adicional, este tocol está adecuadamente presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad de 0.5 a 11 miligramos, de preferencia de 1 a 11, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, de 5 a 6 (por ejemplo, de 10 a 11, de 5 a 6, de 2.5 a 3.5, o de 1 a 3 miligramos). En una modalidad específica, el tocol está presente en una cantidad de 5.94 miligramos o de 2.38 miligramos.

La cantidad de tocol se puede expresar como un porcentaje del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica. De una manera adecuada, el tocol está présente en la composición de vacuna en una cantidad del 0.25 por ciento al 2 por ciento (volumen/volumen) del volumen "total de la composición inmunogénica, de preferencia al 0.2¿-2 por ciento, comprende del 0.25 al 2, o del 0.25 al 1.75, o del 0.5, al 1.65, o del 0.6 al 1.5, o del 0.8 al 1.4, o del 1 al 1.25 por ciento (volumen/volumen) de tocol del volumen total.

De preferencia, el tocol está presente en una cantidad de entre el 0.2 por ciento y el 2 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición de vacuna (o inmunogénica), más preferiblemente en una cantidad del 1.25 por ciento (volumen/ volumen) en un volumen de dosis de 0.5 mililitros.

En una modalidad específica, el tocol está presente en una cantidad final de aproximadamente el 1.25 por ciento del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica. En otra modalidad específica, el tocol está présente en una cantidad final del 0.25 por ciento (volumen/volumen) del volumen total, o del 1.25 por ciento (volumen/volumen) en un volumen de dosis de 0.5 mililitros, o del 0.9 por ciento (volumen/volumen), en un volumen de dosis de 0.7 mililitros, o del 0.5 por ciento (volumen/volumen) en una dosis de 0.5 mililitros, o del 0.35 al 0.37 por ciento, de preferencia del 0.36 por ciento en una dosis de vacuna o inmunogénica de 0.7 mililitros.

A manera de aclaración, las concentraciones dadas en volumen/volumen se pueden convertir en concentración en peso/volumen mediante la aplicación del siguiente factor de conversión: una concentración de aífa-tocoferol del 5 por ciento (volumen/volumen) es equivalente a1 una concentración de alfa-tocoferol del 4.8 por ciento (peso/volumen).

La emulsión de aceite en agua comprende además un agente emulsionante. El agente emulsionante puede ser adecuadamente mono-oleato de sorbitán de polioxietileno. En una modalidad particular, el agente emulsionante se puede seleccionar a partir del grupo que comprende: Polisorbato® 80 ó Tween® 80.

Este agente emulsionante está adecuadamente presente en la composición adyuvante en una cantidad de 0.1 a 5, de 0.2 a 5, de 0.3 a 4, de 0.4 a 3, o de 2 a 3 miligramos (por ejemplo, de 0.4 a 1.2, de 2 a 3, o de 4 a 5 miligramos) de agente emulsionante. En una modalidad específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad de 0.97 miligramos o de 2.425 miligramos.

Además, este agente emulsionante está adecuadamente presente en la composición de vacuna o inmunogénica en una cantidad de 0.1 a 5, de 0.2 a 5, de 0.3 a 4, de 0.4 a 3, o de 2 a 3 miligramos (por ejemplo, de 0.4 a Í.2, de 2 a 3, o de 4 a 5 miligramos) de agente emulsionante. En una modalidad específica, el agente emulsionante está presente' en una cantidad de 0.97 miligramos o de 2.425 miligramos.

La cantidad de agente emulsionante se puede expresar como un porcentaje del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica. De una manera adecuada, el agente emulsionante está presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad del 0.125 al 0.8 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición, de preferencia en del 0.08 al 0.5, o del 0.1 al 0.7, o del 0.2 al 0.6, o del 0.25 al 0.55, o del 0.3 al 0.52, o del 0.4 al 0.5 por ciento (volumen/volumen) del volumen total. En una modalidad específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad del 1 por ciento, del 0.5 por ciento, o del 0.2 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica.

A manera de aclaración, las concentraciones dadas en volumen/volumen se pueden convertir en concentración en peso/volumen mediante la aplicación del siguiente factor de conversión: una concentración de polisorbato 80 del 1.8 por ciento (volumen/volumen) es equivalente a una concentración de polisorbato 80 del 1.91 por ciento (peso/volumen).

En una modalidad específica, un volumen de dosis de vacuna o inmunogénica de 0.5 mililitros contiene el 0.45 por ciento (volumen/volumen) de Tween 80, y un volumen de dosis de 0.7 mililitros contiene el 0.315 por ciento (volumen/volumen) de Tween 80. En otra modalidad específica, una dosis de 0.5 mililitros contiene el 0.18 por ciento (volumen/volumen) de agente emulsionante, y una dosis de composición de vacuna o inmunogénica de 0.7 mililitros contiene el 0.126 por ciento (volumen/volumen) de agente emulsionante.

El término "dosis humana" significa una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano. Én términos generales, ésta es de entre 0.25 y 1.5 mililitros. En una modalidad, una dosis humana es de 0.5 mililitros. En una modalidad adicional, una dosis humana es más alta que 0.5 mililitros, por ejemplo de 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 ó 1 mililitro. En una modalidad adicional, una dosis humana es de entre 1 mililitro y 1.5 mililitros. En otra modalidad, en particular cuando la composición inmunogénica es para la población pediátrica, una dosis humana puede ser menor de 0.5 mililitros, tal como de entre 0.25 y 0.5 mililitros. La invención se caracteriza porque cada uno o todos los componentes individuales del adyuvante dentro de la composición inmunogénica están en un nivel más bajo de lo que anteriormente se pensaba que era útil, y son típicamente como se menciona anteriormente. Las composiciones particularmente adecuadas comprenden los siguientes componentes adyuvantes en las siguientes cantidades están en un volumen final de dosis humana de 0.5 mililitros: Tabla 1 La invención proporciona además una composición adyuvante, la cual comprende los componentes individuales como se definen anteriormente en la presente, y en la cantidad definida en lo anterior, por ejemplo, pero no exclusivamente, como se ilustra en la Tabla 1. Típicamente esta composición adyuvante estará en un volumen adecuado de la dosis humana. Cuando el adyuvante está en una forma líquida para combinarse con una forma líquida de una composición antigénica, la composición adyuvante estará en un volumen adecuado de la dosis humana que es una fracción del volumen final pretendido de la dosis humana, tal como, por ejemplo aproximadamente la mitad del volumen final pretendido de la dosis humana, por ejemplo un volumen de 350 microlitros para una dosis humana pretendida de 0.7 mililitros, o un volumen de 250 microlitros para una dosis humana pretendida dé 0.5 mililitros. La composición adyuvante se diluye cuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis humana final de vacuna. El volumen final de esta dosis, desde lüego, variará dependiendo del volumen inicial de la composición adyuvante y del volumen de la composición de antígeno agregada a la composición adyuvante. En una modalidad alternativa, se utiliza un adyuvante liquido para reconstituir una composición de antígeno liofilizada. En esta modalidad, El volumen adecuado Jde la dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se agrega al frasco que contiene la composición dé antígeno liofilizada. La dosis h um ana final puede variar entre 0.5 y 1 .5 m ililitros.

E l método para prod ucir las em ulsiones de aceite en agua es bien conocido po r la persona experta en este cam po. Com ú nmente , el método com prende mezclar la fase de aceite que contiene tocol con u n tensoactivo , tal como una solución de PBS/TWE E N 80M R, seguido por homogeneización utilizando un homogeneizador, y i estaría claro para un experto en la materia que u n método que comprenda pasar la mezcla dos veces a través de una aguja de jeringa , sería adecuado para homogeneizar pequeños volúmenes de líquido. Ig ualmente, el proceso de emulsión en un microfluidizador (máquina Microfluidics M 1 1 0S, un máximo de 50 pasadas, durante un período de 2 minutos a una entrada ! de presión máxima de 6 bar (presión de salida de aproximadamente 850 bar)) podría ser adaptado por el experto en la técnica para producir volúmenes menores o mayores de emulsión. La adaptación se podría lograr mediante experimentación de rutina, la cual comprende la medición de la emulsión resultante hasta que sé obtiene una preparación con gotas de aceite del diámetro requerido.

En una emulsión de aceite en ag ua, el aceite y el emulsionante deben estar en un veh ículo acuoso. Él veh ículo acuoso puede ser, por ejemplo , suero regulado con fosfato.

De preferencia , los sistemas en emulsión de aceite en agua de la presente invención tienen un tamaño pequeño de la gota de aceite en el rango de sub-micras. De una manera adecuada, los tamaños de las gotas estarán en el intervalo 1 20 a 750 nanómetros, más preferiblemente serán tamaños de 120 a 600 nanómetros de diámetro. Más preferiblemente, la emulsión de aceite en agua contiene gotas de aceite, de las cuales cuando menos el 70 por ciento por intensidad son menores de 500 nanómetros de diámetro, más preferiblemente cuando menos el 80 por ciento por intensidad son menores de 300 nanómetros de diámetro, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento por intensidad están en el intervalo de 120 a 200 nanómetros de diámetro.; El tamaño de la gota de aceite, es decir, el diámetro, de acuerdo con la presente invención, se da por intensidad. Existen varias maneras de determinar el diámetro del tamaño de la gota de aceite por intensidad. La intensidad se mide mediante el uso de un instrumento dimensionador, de una- manera adecuada mediante dispersión de luz dinámica, tal como el Malvern Zetasizer 4000 o de preferencia el Malvern Zetasizer 3000HS. Se da un procedimiento detallado en el Ejemplo II.2. Una primera posibilidad es determinar el diámetro promedio z (ZAD) mediante dispersión de luz dinámica (PCS - espectroscopia de correlación de fotones); este método adicionalmente da el índice de polidispersidad (PDI), y tanto el ZAD como el PDI se calculan con el algoritmo de acumulantes. Estos valores no requieren del conocimiento del índice de refracción de partículas. Un segundo medio es calcular el diámetro de la gota de aceite mediante la determinación de la distribución total de tamaños de partículas mediante otro algoritmo, ya sea el Contin, o NNLS, o el "Malvern" automático (el algoritmo por omisión proporcionado por el instru me nto dimensionador). La mayor parte del tiem po , debido a que se desconoce el índice de refracción de las partículas de u na com posición compleja , solam ente se toma en consideración la d istribución de intensidad , y si es necesario, la media de intensidad q ue se orig ina a partir de esta d istribución .

Inm unoestim ulantes Opcionales En una modalidad adicional de la invención , se proporciona una composición de vacuna o inmunogénica que comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante , la cual comprende una emulsión de aceite en agua y opcionalmente uno o más inmunoestimulantes adicionales, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 1 1 miligramos de tocol , y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante .

En una modalidad , la composición adyuvante comprende una emulsión de aceite y agua como se describe en la presente. En una modalidad adicional, la composición adyuvante puede comprender además uno o más adyuvantes o inmu noestimulantes adicionales. En una modalidad adicional, la composición adyuvante opcionalmente comprende uno o más adyuvantes o inmunoestimulantes adicionales diferentes de QS21 y/o MPL.

El adyuvante adicional opcional se selecciona a partir del grupo de: una saponina , lípido A o un derivado del mismo, un oligonucleótido inmunoestimulante, un fosfato de alquil-glucosaminida , una sal de metal, un agonista de los receptores tipo- Toll, o combinaciones de los mismos. Se prefiere que el adyuvante sea un agonista de los receptores tipo-Toll, en particular un agonista de un receptor tipo-Toll 2, 3, 4, 7, 8 ó 9, o una saponina. Además se prefiere que el sistema adyuvante comprenda dos o más adyuvantes a partir de la lista anterior. Las combinaciones de preferencia contienen un adyuvante de saponina (en particular QS21) y/o un agonista del receptor tipo-Toll 4, tal cómo 3D-MPL o un agonista del receptor tipo-Toll 9, tal como un CpG que contenga un oligonucleótido inmunoestimulante. Otras combinaciones preferidas comprenden una saponina (en particular QS21), y un agonista del receptor tipo-Toll 4, tal como una saponina (en particular QS21), y un ligando del receptor tipo-Toll 4, tal como 3D-MPL o un fosfato de alquil-glucosaminida.

En una modalidad, el adyuvante adicional es un ligando del receptor tipo-Toll (TLR) 4, de preferencia un agonista, tal como un derivado de lípido A, en particular monofosforilo-lípido A, o más particularmente, monofosforilo-lípido A 3-desacilado (3 D - MPL).

El 3D-MPL está disponible bajo la marca comercial registrada MPL® por GlaxoSmithKline Biologicals North America y promueve primordialmente las respuestas de células-T CD4+ con un fenotipo de IFN-g (Th1). Se puede producir de acuerdo con los métodos que se dan a conocer en la Patente Británica Número 2 220 211 A. Químicamente, es una mezcla de monbfosforilo-lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. De preferencia, en las composiciones de la presente invención, se utiliza un 3D-MPL de partículas pequeñas. El 3D-MPL de partículas pequeñas tiene un tamaño de partículas tal que se pueda filtrar para esterilizarse a través de un filtro de 0.22 mieras. Estas preparaciones se describen en la Solicitud Internacional de Patente Número WO 94/21292. Los derivados sintéticos de lípido A son conocidos, y se piensa que son agonistas de TLR 4, incluyendo, pero no limitándose a: O 174 (di-fosfato ácido de 2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetra-decanoil-amino]-4-o-fosfono^-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-a-D-glucopiranosilo), (Publicación Internacional Número WO 95/ 14026), OM 294 DP (3S, 9R)-3--[(R)-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxHtetradecanoil-amino]-decano-1 , 10-diol, 1 ,10-bis-(di-fosfato ácido) (Publicaciones Internacionales Números W099 /64301 y WO 00/0462), OM 197 MP-Ac DP 10-(6-amirio-hexanoato) de (3S-, 9R) -3- [(R)-dodecanoiloxi-tetradecanoil-aminb]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-decano-1 ,10-diol, 1 -di-fosfato ácido (Publicación Internacional Número WO 01/46127).

Otros ligandos de TLR4 que se pueden utilizar son fosfatos de alquil-glucosaminida (AGPs), tales como aquéllos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO9850399 o en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6303347 (también se dan a conocer procesos para la preparación de AGPs), o sales farmacéuticamente aceptables de AGPs, como se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6764840. Algunos AGPs son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Se piensa que ambos son útiles como adyuvantes.

Otros ligandos de TLR-4 adecuados, capaces de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-4 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5) son, por ejemplo, lipopolisacárido a partir de bacterias gram-negativas y sus derivados, o fragmentos de los mismos, en particular un derivado no tóxico de LPS (tal como 3D-MPL). Otros agonistas de TLR adecuados son: proteína de choque por calor (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ó 90; Proteína A de tensoactivo, oligosacáridos de hialuronano, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinógeno y &-defensina-2, dipéptido de muramilo (MDP) o p oteína F del virus sincicial respiratorio. En una modalidad, el agonista de TLR es HSP 60, 70 ó 90.

Los receptores tipo-Toll (TLRs) son receptores transmembrana tipo I, conservados en la evolución entre los insectos y los seres humanos. Hasta ahora se han establecido diez TLRs (TLRs 1-10) (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). Los miembros de la familia de TLR tienen dominios extracelulares e intracelulares similares; se ha demostrado que sus dominios extracelulares tienen secuencias de repetición ricas en leucina, y sus dominios intracelulares son similares a la región intracelular del receptor de interleucina-1 (IL-1R). Las células de TLR se expresan diferencialmente entre las células' inmunes y otras células (incluyendo las células epiteliales vasculares, adipocitos, miocitos cardíacos, y células epiteliales intestinales). El dominio intracelular de los TLRs pueden interactuar con la proteina adaptadora Myd88, la cual también posee el dominio IL-1R en su región citoplásmica, conduciendo a la activación de las citoquinas por NF-KB; esta senda de Myd88 es una manera en la cual se efectúa la liberación de citoquina mediante la activación del TLR. La principal expresión de los TLRs está en los tipos de células, tales como las células presentadoras de antígeno (por ejemplo, las células dendríticas, los macrófagos, etc.).

La activación de las células dendríticas mediante la estimulación a través de los TLRs conduce a la maduración de las células dendríticas, y a la producción de las citoquinas inflamatorias, tales como IL-12. La investigación llevada a cabo hasta ahora has encontrado que los TLRs reconocen diferentes tipos de agonistas, aunque algunos agonistas son comunes a varios TLRs. Los agonistas de TLR se derivan predominantemente 'a partir de bacterias o virus, e incluyen moléculas tales como flagelina o el lipopolisacárido (LPS) bacteriano.

"Agonista de TLR" significa el componente que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de una senda de señalización de TLR, ya sea como un ligando directo o bien indirectamente a través de la generación de ligandos endógenos o exógenos (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5).

En otra modalidad, otros agonistas naturales o sintéticos de las moléculas de TLR se utilizan como inmunoestimulantes adicionales opcionales. Éstos podrían incluir, pero no se limitan a, agonistas para TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9.

En una modalidad de la presente invención, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-1 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-1 se selecciona a partir de: Lipopéptidos (LPs) tri-acilados; modulina soluble en fenol; lipopéptido de Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3-bis-(palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, lipopéptido de triclorhidr to (Pam3Cys), el cual imita el término amino acetilado de una lipoproteína bacteriana, y lipopéptido de OspA a partir de Borrelia burgdorfei.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-2 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-2 es uno o más de una lipoproteína, a peptidoglicano, un lipopéptido bacteriano a partir de M tuberculosis, B burgdorferi. T pallidum; peptidoglicanos a partir de las especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manurónicos, porinas de Neisseria, fimbrias bacterianas, factores de virulencia de Yersina, viriones de CMV, hemaglutinina de sarampión, y zimosano a partir de levadura. ' En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-3 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-3 es ARN de doble cadena (dsARN), o ácido poli-inosínico/poli-citidílico (Poli-IC), un patrón de ácido nucleico molecular asociado con la infección viral.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-5 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-5 es la flagelina bacteriana.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-6 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-6 es lipoproteína micobacteriana, lipopéptido di-acilado, y modulina soluble en fenol. Otros agonistas de TLR6 se describen en la Publicación Internacional Número WO2003043572.

En una modalidad alternativa, áe utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-7 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-7 es un ARN de una sola cadena (ssARN), loxoribina, un análogo de guánosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquirtolina, o un derivado de los mismos. En una modalidad, el agonista de TLR es imiquimod. Otros agonistas de TLR7 se describen en la Publicación Internacional Número WO02085905.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-8 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-8 es un ARN de una sola cadena (ssARN), una molécula de imidazoquinolina con actividad anti-viral, por ejemplo resiquimod (R848); el resiquimod también es capaz de ser reconocido por TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que se pueden utilizar incluyen aquéllos descritos en la Publicación Internacional Número WO2004071459. 1 También se pueden utilizar inmunoestimulantes de oligonucleótidos o cualquier otro agonista del receptor tipo-Toll (TLR) 9. Los oligonucleótidos preferidos para utilizarse en los adyuvantes o vacunas o composiciones inmunogénicas de la presente invención son los oligonucleótidos que contienen CpG, que contienen de preferencia dos o más motivos de dinucleótido CpG separados por cuando menos tres, más preferiblemente por cuando menos seis o más nucleótidos. Un motivo CpG es un nucleótido de Citosina seguido por un nucleótido de Guanina. Los oligonucleótidos CpG de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad preferida, el internucieótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente un enlace de fosforotioato, aunque los enlaces de fosfodiéster y otros enlaces internucleotidos están dentro del alcance de la invención. También se incluyen dentro del alcance de la invención los oligonucleótidos con enlaces internucleotidos mixtos. Los métodos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en las Patentes Números US5,666,153, US5,278,302 y WO95/26204.

Los ejemplos de los oligonucleótidos preferidos tienen las siguientes secuencias. Las secuencias de preferencia contienen enlaces internucleotidos modificados por fosforotioato.

OLIGO 1 (SEQ ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO:3): ACÓ GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG ; OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) ' OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCÓ ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Los oligonucleótidos de CpG alternativos pueden comprender las secuencias preferidas anteriores, en las que haya supresiones o adiciones sin consecuencias. Los oligonucleótidos de CpG utilizados en la presente invención se pueden sintetizar mediante cualquier método conocido en la materia (por ejemplo, véase la Patente Europea Número EP 468520). De una manera conveniente, estos oligonucleótidos se pueden sintetizar utilizando un sintetizador automatizado.

De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la composición adyuvante comprende además un inmunoestimulante adicional, el cual se selecciona a partir del grupo que consiste en: un agonista de TLR-1, un agonista de TLR-2 , un agonista de TLR-3, un agonista de TLR-4, un agonista de TLR-5, un agonista de TLR-6, un agonista de TLR-7, un agonista de TLR-8, un agonista de TLR-9, o una combinación de los mismos.

Otros inmunoestimulantes preferidos para utilizarse en la presente invención son Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada a partir del árbol sudamericano Quilaja Saponaria Molina, y fue primeramente descrita por tener una actividad adyuvante por Dalsgaard' y colaboradores, en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für d ie gesamte Virusforschung, Volumen 44, Springer Verlag, Berlín, páginas 243-254). Se han aislado fragmentos purificados de Quíl A mediante HPLC, los cuales retienen su actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (Patente Europea Número EP 0 362 278), por ejemplo QS7 y QS21 (también conocidos como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina natural derivada a partir de la corteza del Quillaja saponaria Molina, que induce las células-T citotóxicas CD8+ (CTLs), las células Th1, y una respuesta de anticuerpo lgG2a predominante, y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.

Se han descrito formulaciones particulares de QS21 que se prefieren particularmente; estas formulaciones comprenden además un esterol (Publicación Internacional Número W096/33739). Cuando se incluyen escualeno y una saponina (opcionalmente QS21), es benéfico incluir también un esterol (opcionalmente colesterol) a la formulación, debido a que éste permite tener una reducción en el nivel total de aceite en la emulsión. Esto conduce a un costo reducido de elaboración, mejora de la comodidad global de la vacunación, y también mejoras cualitativas y cuantitativas de las respuestas inmunitarias resultantes, tales como una mejor producción de IFN-?. De conformidad con lo anterior, el sistema adyuvante de la presente invención' típicamente comprende una proporción de aceite metabolizable : saponina (peso/peso) en el intervalo de 200:1 a 300:1; también la" presente invención se puede utilizar en una forma "baja en aceite", cuyo intervalo opcional es de 1:1 a 200:1, opcionalmente de 20:1 a 100:1, o sustancialmente de 48:1; esta vacuna retiene las propiedades adyuvantes benéficas de todos los componentes, con un pe'rfil de reactogenicidad muy reducido. De conformidad con lo nterior, algunas modalidades tienen una proporción de escualeno : QS21 (peso/peso) en el intervalo de 1:1 a 250:1 ó de 20:1 a 200:1 ó de 20:1 a 100:1, o sustancialmente de 48:1. Opcionalmente, también se incluye un esterol (por ejem plo , colesterol) , presente en u na proporción de sapon ina : esterol com o se describe en la presente .

Antígenos y composición de antíqeno Las formulaciones de vacuna o inmunogénicas contienen un antígeno de Streptococcus pneumo iae capaz de provocar una respuesta inmu nitaria contra un patógeno de seres humanos o de animales. Cuando el antígeno neumocócico es una proteína , la proteína opcionalmente se conjuga , por ejemplo, con un sacárido. Opcionalmente, la proteína no se conjuga o está presente en la composición inmunogénica como una proteína libre. U na proteína no conjugada no se enlaza covalentemente a un sacárido como una proteína portadora .

En una modalidad de la invención , la composición inmunogénica de la invención comprende una proteína neumocócica que es opcionalmente un miembro de las proteínas de la familia triad de poli-histidina (Pht) , fragmentos o proteínas de fusión , o equivalentes inmunológicamente fu ncionales de las mismas. Las proteínas PhtA, PhtB, PhtD o PhtE pueden tener u na secuencia de aminoácidos que comparta el 80 porf ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, ó el 1 00 por ciento de identidad con una secuencia dada a conocer en las Publicaciones Internacionales Números WO 00/37105 ó WO 00/39299 (por ejemplo, con la secuencia de aminoácidos 1 -838 ó 21 -838 de la SEQ I D NO : 4 de la Publicación I nternacional Número WO 00/371 05 para PhtD) . Por ejemplo, las proteínas de fusión se componen de la longitud completa o de fragmentos de 2, 3 ó 4 de PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Los ejemplos de las proteínas de fusión son PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E. PhtD/A. PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B y PhtE/D, en donde las proteínas se enlazan con el primero mencionado en el término N (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO01/98334).

Cuando se utilizan fragmentos de las proteínas Pht (por separado o como parte de una proteína de fusión), cada fragmento opcionalmente contiene uno o más motivos triad de histidina y/o regiones de bobina enrollada de estos polipéptidos. Un motivo triad de histidina es la porción del polipéptido que tiene la secuencia HxxHxH, en donde H es histidina y x es un aminoácido diferente de histidina. Una región de bobina enrollada es una región predicha mediante el algoritmo "Caceites", Lupus, A y colaboradores (1991) Science 252; 1162-1164. En una modalidad, el o cada fragmento incluye uno o más motivos triad de histidina, así como cuando menos una región de bobina enrollada. En una modalidad, el o cada fragmento contiene exactamente o cuando menos 2, 3, 4 ó 5 motivos triad de histidina (opcionalmente, con la secuencia de Pht nativa entre los 2 o más triads, o la secuencia intra-triad que es más del 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 por ciento idéntica a una secuencia de Pht intra-triad neumocócica nativa - por ejemplo, la secuencia intra-triad mostrada en la SEQ ID NO: 4 de la Publicación Internacional Número WO 00/37105 para PhtD). En una modalidad, el o cada fragmento contiene exactamente o cuando menos 2, 3 ó 4 regiones de bobina enrollada. En una modalidad, una proteína Pht dada a conocer en la presente incluye la proteína de longitud completa con la secuencia de señal unida, la proteína de longitud completa madura con el péptido de señal (por ejemplo 20 aminoácidos en el término N) removido, variantes que se presenten naturalmente de la proteína Pht, y fragmentos inmunogénicos de la proteína Pht (por ejemplo, los fragmentos como se describen anteriormente, o polipéptidos, los cuales comprenden cuando menos 15 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de una secuencia de aminoácidos de las Publicaciones Internacionales Números WO00/37105 ó WO00/39299, en donde este polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmunitaria especifica para dicha secuencia de aminoácidos de las Publicaciones Internacionales Números WO00/37105 ó WO00/39299).

En particular, el término "PhtD", como se utiliza en la presente, incluye la proteína de longitud completa con la secuencia de señal unida, la proteína de longitud completa madura con el péptido de señal (por ejemplo 20 aminoácidos en el término N) removido, las variantes que se presentan naturalmente de PhtD, y los fragmentos inmunogénicos de PhtD (por ejemplo, los fragmentos como se describen anteriormente, o polipéptidos, los cuales comprenden cuando menos 15 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de una secuencia de aminoácidos de PhtD de las Publicaciones Internacionales Números WO00/37105 ó WO00/39299, en donde este polipéptido es capaz de provocar" una respuesta inmunitaria específica para dicha secuencia de aminoácidos de PhtD de las Publicaciones Internacionales Números WOOO/37105 ó WOOO/39299 (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 de la Publicación Internacional Número WO 00/37105 para PhtD).

En una modalidad, la composición inmunogénica de la invención comprende cuando menos 11 proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en la familia triad de poli-histidina (PhtX), la familia de proteína de enlace de colina (CbpX), truncados de CbpX, la familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (o fusiones), neumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 y Sp133. En una modalidad adicional, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en la familia triad de poli-histidina (PhtX), la familia de proteína de enlace de colina (CbpX), truncados de CbpX, la familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (o fusiones), neumolisina (Ply), PspA; PsaA, y Sp128. En una modalidad adicional, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en la familia triad de poli-histidina (PhtX), la familia de proteína de enlace de colina (CbpX), truncados de CbpX; la familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (o fusiones), neumolisina (Ply), y Sp128. ' La familia Pht (triad de poli-histidina) comprende las proteínas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. La familia se caracteriza por una secuencia de lipidación, dos dominios separados por una región rica en prolina , y varios triads de histidina , posiblemente invol ucrados en el enlace de metal o de n ucleósido o en la actividad enzim ática , (de 3 a 5) regiones de bobina en rollada , u n térm ino N conservado, y u n térm ino C heterogéneo . Está presente en todas las cepas de neumococos probadas . También se han encontrado proteínas hom ologas en otros estreptococos y en Neisseria. En una modalidad de la invención , la proteína Pht de la invención es PhtD. Se entiende , sin embargo, que los términos Pht A, B , D, y E se refieren a las proteínas que tienen las secuencias que se dan a conocer en las citas más adelante, así como las variantes que se presentan natu ralmente (y hechas por el hombre) que tengan una homolog ía de secuencia que sea cuando menos el 90 por ciento idéntica a las proteínas referenciadas. Opcionalmente es cuando menos el 95 por ciento idéntica, o cuando menos el 97 por ciento idéntica .

Con respecto a las proteínas PhtX, PhtA se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/1 8930, y también es referida como Sp36. Como se observa anteriormente, es una proteína a partir de la familia triad de poli-histidina, y tiene el motivo de señal tipo I I de LXXC . PhtD se da a conocer en la Publicación I nternacional Número WO 00/371 05, y también es referida como Sp036D. Como se observa anteriormente, también es una proteína a partir de la familia triad de poli-histidina, y tiene el motivo de señal tipo I I de LXXC. PhtB se da a conocer en la Publicación I nternacional N úmero WO 00/371 05, y también es referida como Sp036B . Otro miembro de la familia PhtB es el Polipéptido Degradante-C3, como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/17370. Esta proteína también es a partir de la familia triad de poli-histidina, y tiene el motivo de señal tipo II de LXXC. Por ejemplo, un equivalente inmunológicamente funcional es la proteína Sp42 que se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/18930. Un truncado de PhtB (de aproximadamente 79 kD) se da a conocer en la Publicación Internacional Número W099/15675 que también se considera como un miembro de la familia PhtX. PhtE se da a conocer en la Publicación Internacional Número WOOO/30299 y es referida como BVH-3. Cuando cualquier proteína Pht es referida en la presente, esto significa que se pueden utilizar fragmentos inmunogénicos o fusiones de los mismos de la proteína Pht. Por ejemplo, una referencia a PhtX incluye los fragmentos inmunogénicos o fusiones de los mismos a partir de cualquier proteína Pht. Una referencia a Ph'tD o PhtB también es una referencia a las fusiones de PhtDE o PhtBE como se encuentran, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO0198334.

La neumolisina es una toxina multifuncional con actividades distintas de activación citolítica (hémolítica) y del complemento (Rubins y colaboradores, Am . Respi. 'Cit Care Med, 153: 1339-1346 (1996)). La toxina no es secretada por los neumococos, sino que se libera después de la lisis de los neumococos bajo la influencia de la autolisina. Sus efectos incluyen, por ejemplo, la estimulación de la producción de citoquinas inflamatorias por parte de los monocitos humanos, la inhibición del movimiento1 de los cilios sobre el epitelio respiratorio humano, y la disminución de la actividad bactericida y migración de neutrófilos. El efecto más obvio de la neumolisina es la lisis de los glóbulos rojos sanguíneos, que involucra el enlace con colesterol. Debido a que es una toxina, necesita destoxificarse (es decir, no debe ser tóxica para un ser humano cuando se proporcione en una dosificación adecuada para la protección) antes de poderse administrar in vivo. La expresión y clonación de la neumolisina de tipo silvestre o nativa se conocen en la materia. Véase, por ejemplo, Walker y colaboradores (Infect Immun, 55: 1184-1189 (1987)), Mitchell y colaboradores (Biochim Biophys Acta, 1007: 67-72 (1989), y Mitchell y colaboradores (NAR, 18: 4010 (1990)). La destoxificación de ply se puede conducir por medios químicos, por ejemplo, se puede someter a un tratamiento con: formalina o glutaraldehído, o con una combinación de ambos (Publicación Internacional Número WO 04081515, Publicación Internacional del TCP Número PCT7 EP2005/010258). Estos métodos son bien conocidos en la materia para diversas toxinas. De una manera alternativa, ply se puede destoxificar genéticamente. Por consiguiente, la invención abarca derivados de proteínas neumocócicas, las cuales pueden ser, por ejemplo, proteínas mutadas. El término "mutada" se utiliza en la presente para significar una molécula que ha sufrido supresión, adición, o sustitución de uno o más aminoácidos empleando las técnicas bien conocidas para la mutagénesis dirigida al sitio, o cualquier otro método convencional. Por ejemplo, como se describe anteriormente, una proteína ply muíante ply se puede alterar de tal manera que sea biológicamente inactiva, mientras que todavía i mantenga sus epítopos inmunogénicos, véanse, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO90/06951, Berry y colaboradores (Infect Immun, 67: 981-985 (1999)), y la Publicación Internacional Número WO99/03884.

Como se utiliza en la presente, sé entiende que el término "Ply" se refiere a una neumolisina mutada o destoxificada adecuada para uso médico (es decir, no tóxica).

Con respecto a la familia de proteína de enlace de colina (CbpX), los miembros de esa familia originalmente se identificaron como proteínas neumocócicas que se podían purificar mediante cromatografía por afinidad de colina. Todas las proteínas de enlace de colina se enlazan de una manera nd covalente a las fracciones de fosforil-colina del ácido teicoico de la pared celular y del ácido lipoteicoico asociado con membrana. Estructuralmente, tienen varias regiones en común sobre toda la familia, aunque puede variar la naturaleza exacta de las proteínas (secuencia de aminoácidos, longitud, etc.). En general, las pró'teínas de enlace de colina comprenden una región N-terminal (N), regiones de repetición conservadas (R1 y/o R2), una región rica en prolina (P), y una región de enlace de colina conservada (C), hecha de múltiples repeticiones, que comprende aproximadamente la mitad de la proteína. Como se utiliza en esta solicitud, el término "familia de proteína de enlace de colína (CbpX)" se selecciona a partir del grupo que consiste en las proteínas de enlace de colina como sé identifican en la Publicación Internacional Número W097/41151 , PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, y CbpG. CbpA se da a conocer en la Publicación Internacional Número W097/41151. CbpD y CbpG se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO00/29434. PspC se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO97/09994. PbcA se da a conocer en la Publicación Internacional Número W098/21337. SpsA es una proteína de enlace de colina que se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/39450. Opcionalmente, las proteínas de enlace de colina se seleccionan a partir del grupo que consiste en CbpA, PbcA, SpsA y PspC.

Una modalidad de la invención comprende truncados de CbpX, en donde "CbpX" se define anteriormente, y "truncados" se refiere a las proteínas CbpX que carecen del 50 por ciento o más de la región de enlace de colina (C). Opcionalmente, estas proteínas carecen de toda la región de enlace de colina. Opcionalmente, los truncados de proteína carecen de: (i) la región de enlace de colina, y (ii) una porción de la mitad N-terminal de la próteína también, y no obstante, retienen cuando menos una región de repetición (R1 o R2). Opcionalmente, el truncado tiene 2 regiones de repetición (R1 y R2). Los ejemplos de estas modalidades son NR1xR2 y R1xR2, como se ilustran en las Publicaciones Internacionales Números W099/51266 o W099/51188; sin embargo, también se contemplan otras proteínas de enlace de colina que carezcan de una región de enlace de colina similar dentro del alcance de esta invención.

La familia LytX es de proteínas asociadas con membrana, asociadas con la tisis celular. El dominio N-terminal comprende los dominios de enlace de colina; sin embargo la familia LytX no tiene todas las características que se encuentran en la familia CbpA mencionada anteriormente y, por consiguiente, para la presente invención, la familia LytX se considera distinta de la familia CbpX. En contraste con la familia CbpX, el dominio C-terminal contiene el dominio catalítico de la familia de :la proteína LytX. La familia comprende LytA, B y C. Con respecto ja la familia LytX, LytA se da a conocer en Ronda y colaboradores, Eur J Biochem, 164: 621-624 (1987). LytB se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/18930, y también es referida > como Sp46. LytC también es aquélla se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/18930, y también es referida como Sp91. Una modalidad de la invención comprende LytC. r Otra modalidad comprende truncados de LytX, en donde "LytX" se define anteriormente, y "truncados" se refiere a las proteínas LytX que carecen del 50 por ciento o más de la región de enlace de colina. Opcionalmente, estas proteínas carecen de toda la región de enlace de colina. Todavía otra modalidad de esta invención comprende proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (o fusiones). Opcionalmente, éstas comprenden NR1xR2 (o R1xR2) de CbpX y la porción C-terminal (Cterm, es decir, que carece de los dominios de enlace de colina) de LytX (por ejemplo, LytCCterm o Sp91Cterm). Opcionalmente, CbpX se selecciona a partir del grupo que consiste en CbpA, PbcA, SpsA y PspC.

Opcionalmente, es CbpA. Opcionalmente, LytX es LytC (también I referida como Sp91). Otra modalidad de la presente invención es un truncado de PspA o PsaA que carece del dominio de enlace de i colina (C), y se expresa como una proteína de fusión con LytX. Opcionalmente, LytX es LytC.

Con respecto a PsaA y PspA, ambas son conocidas en este campo. Por ejemplo, PsaA y las variantes de supresión transmembrana de la misma, han sido descritas por Berry y Patón, Infecí Immun, Diciembre de 1996; 64(12): 5255-62. PspA y las variantes de supresión transmembrana de la misma se han dado a conocer, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 5804193, y en las Publicaciones Internacionales Números WO 92/14483 y WO 99/53940.

Sp128 y Sp130 se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO00/76540. Sp125 es un ejemplo de una proteína superficial neumocócica con, el motivo anclado a la pared celular de LPXTG (en donde X es 'cualquier aminoácido). Se ha encontrado que cualquier proteína dentro de esta clase de proteína superficial neumocócica con este motivo es útil dentro del contexto de esta invención y, por consiguiente, se considera como una proteína adicional de la invención. La üSp125 misma se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/18930, y también es conocida como ZmpB - una metaloproteinasa de zinc. Sp101 se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/06734 (en donde tiene la referencia # y85993). Se caracteriza por una secuencia de señal tipo I. Sp133 se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/06734 (en donde tiene la referencia # y85992). También se caracteriza por una secuencia de señal tipo I.

Las proteínas de la invención también pueden ser combinadas benéficamente. Combinada significa que la composición inmunogénica comprende todas las proteínas que se encuentran dentro de las siguientes combinaciones, ya sea como proteínas portadoras o bien como proteínas libres, o como una mezcla de las dos. Por ejemplo, en una combinación de dos proteínas, como se estipula posteriormente en la presente, ambas proteínas se pueden utilizar como proteínas portadoras, o ambas proteínas pueden estar presentes como proteínas libres, o atabas pueden estar presentes como proteína portadora y como proteína libre, o una puede estar presente como una proteína portadora y una proteína libre, mientras que la otra está presente sólo como una proteína portadora o sólo como una proteína libre, o una puede estar presente como una proteína portadora y la otra como una proteína libre. Cuando se da una combinación de tres proteínas, existen posibilidades similares. Las combinaciones incluyen, pero no se limitan a, proteínas quiméricas o de fusión PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1 xR2-Sp91 Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD +Í?PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, proteínas quiméricas o de fusión PhtA + NR1xR2- Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NRÍxR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, I R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Opcionalmente, NR1xR2 (o R1xR2) es a partir de CbpA o PspC. Opcionalmente, es a partir de CbpA. Otras combinaciones incluyen combinaciones de 3 proteínas, tales como PhtD + NR1xR2 + Ply, y PhtA + NR1xR2 + PhtD. En una modalidad, la composición de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como proteínas portadoras. En una modalidad adicional, la composición de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como proteínas libres.

Una respuesta inmunitaria efectiva contra PhtD o la proteína de fusión de la misma, se mide ,por ejemplo, mediante un ensayo de protección, tal como se describe en el Ejemplo 15. Una respuesta inmunitaria efectiva proporciona cuando menos el 40 por ciento, el 50 por ciento, el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, o el 90 por ciento de sobrevivencia 7 días después del estímulo con una cepa heteróloga. Dado que la cepa de estímulo es heteróloga, la protección proporcionada se debe a la respuesta inmunitaria contra PhtD o la proteína de fusión de la misma.

De una manera alternativa, una respuesta inmunitaria efectiva contra PhtD se mide mediante un ELISA, como se describe en el Ejemplo 14. Una respuesta inmunitaria efectiva da una respuesta de IgG anti-PhtD de cuando menos 250, 300, 350, 400, 500, 550 ó 600 microgramos/mililitro de GMC.

En una modalidad, la composición inmunogénica de la invención comprende neumolisina.

En una modalidad, la composición inmunogénica de la invención comprende una proteína neumocócica que se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6699703, por ejemplo, la proteína neumocócica que tiene la secuencia, o que es codificada por la secuencia de las SEQ ID NOs: 1 a 5326 de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6699703.

En una modalidad de la invención, la composición inmunogénica comprende una proteína neumocócica que no es aquélla que se da a conocer en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP2007/060743.

La presente invención proporciona además una vacuna que contiene las composiciones inmunog'énicas de la invención, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la composición inmunogénica de la invención comprende una proteína neumocócica seleccionada a partir del grupo que consiste en PhtA.'PhtD, PhtB, PhtE, LytB, LytC, LytA, Sp125, SP101, Sp128, Sp130, Sp133, o las proteínas que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6699703, incluyendo las I proteínas de S. pneumoniae representadas o codificadas por las SÉQ ID NOs: 5225, 5200, 3166, 4360, 5137, 4263, 3166, 5226, 3716, 4360, 5243, 3964, 5179, 3850, 4263, 5137, 5226, 5325, 3850, 5179 :ó 5325 de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 'Número US6699703, o los equivalentes inmunológicamente funcionales de las mismas. Los equivalentes inmunológicamente funcionales incluyen las secuencias que comparten cuando menos el 80, 90, 95, 98 ó 99 por ciento de identidad con la secuencia mencionada. Los equivalentes inmunológicamente funcionales también incluyen fragmentos que tienen cuando menos 6, 10, 20, 30, 40 ó 50 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia mencionada. Los equivalentes inmunológicamente funcionales son capaces de provocar una respuesta inmunitaria que reconoce al antígeno nativo.

I Vac —u ~n ~a—ci—ón™- I t Las preparaciones de vacuna que contienen las composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden utilizar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a la infección, mediante la administración de esta vacuna por medio de la vía sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección por medio de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, o subcutánea; o por medio de administración mucosal a los tractos oral/alimentario, respiratorio, o genitourinario. Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una sola dosis, los componentes de la misma también se1 pueden co-administrar juntos al mismo tiempo o en diferentes tiempos (por ejemplo, los conjugados de sacáridos neumocócicos se podrían administrar por separado, al mismo tiempo, ó 1 a' 2 semanas después de la administración de cualquier componente de proteína bacteriana de la vacuna, para una coordinación óptima'de las respuestas inmunitarias unas con respecto a otras). En adición, las vacunas de la invención se pueden administrar intramuscularmente para la primera inoculación, e intranasalmente para las dosis de refuerzo.

El contenido de antigenos de proteína en la vacuna típicamente estará en el intervalo de 1 a 100 microgramos, de preferencia de 5 a 50 microgramos, más típicamente en el intervalo de 5 a 25 microgramos. En seguida de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.

La preparación de vacuna se déscribe en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Editores Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, Nueva York). La encapsulación dentro de liposomas es descrita por Fullerton, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,235,877.

Las vacunas de la presente invención se pueden almacenar en solución o liofilizadas. De preferencia, la solución se liofiliza en la presencia de un azúcar, tal como sacarosa o lactosa. Todavía es además preferible que se liofilicen y sé reconstituyan de una manera extemporánea antes de usarse. 1 En un aspecto de la invención, se proporciona un kit de vacuna, el cual comprende un frasco "que contiene una composición inmunogénica de la invención, opteionalmente en una forma liofilizada, y que comprende adernáU un frasco que contiene un adyuvante, como se describe en la presente. Se prevé que en este aspecto de la invención, el adyuvante 'se utilizará para reconstituir la composición inmunogénica liofilizada. ; Aunque las vacunas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía, la administración de las vacunas i descritas en la piel (ID) forma una modalidad de la presente invención. La piel humana comprende una cutícula "córnea" externa, denominada como el estrato córneo;, el cual se sobrepone a la epidermis. Debajo de esta epidermis está una capa denominada como la dermis, la cual a su vez se sobrepone al tejido subcutáneo. Los investigadores han demostrado que la inyección de una vacuna en la piel, y en particular en la dermis, estimula una respuesta inmunitaria, la cual también se puede asociar con un número de i ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas en la presente forma una característica preferida de la presente invención.

La técnica convencional de la inyección intradérmica, el procedimiento de "Mantoux", comprende los pasos de limpiar la piel, y entonces estirar con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre angosto (calibre 26-31) hacia arriba, se inserta la aguja en un ángulo de entre 10° y 15°. Una vez^que se inserta el bisel de la aguja, se baja el barril de la aguja)' y se avanza adicionalmente mientras se aplica una ligera presión para elevarla debajo de la piel. Entonces se inyecta el líquido muy lentamente, formando de esta manera una burbuja o protuberancia sobre la superficie de la piel, seguido por un retiro lento de la aguja.

Más recientemente, se han descrito dispositivos que se diseñan específicamente para administrar agentes líquidos dentro o a través de la piel, por ejemplo, los dispositivos descritos en la Publicación Internacional Número WO 99/34850 y en la Patente Europea Número EP 1092444, también los dispositivos de inyección de chorro descritos, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 01/13977; en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, y en las Publicaciones Internacionales Números WO 97/37705 y WO 97/13537. Los métodos alternativos de administración intradérmica de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringas y agujas convencionales, o dispositivos diseñados para el suministro balístico de vacunas sólidas (Publicación '' Internacional Número WO 99/27961), o parches transdérmicos '(Publicaciones Internacionales Números WO 97/48440 y WO 98/28037); o se aplican a la superficie de la piel (suministro transdérmico b transcutáneo, Publicaciones Internacionales Números WO 98/20734'y WO 98/28037).

Cuando las vacunas de la presente invención son para administrarse a la piel, o más específicamente en la dermis, la vacuna está en un volumen bajo de líquido, en particular un volumen de entre aproximadamente 0.05 mililitros, y 0.2 mililitros.

El contenido de antígenos en las vacunas para la piel o intradérmicas de la presente invención puede ser similar a la dosis convencional, como se encuentra en las vacunas intramusculares (véase lo anterior). Sin embargo, és una característica de las vacunas para la piel o intradérmicas que las formulaciones pueden ser de "dosis baja". De conformidad con lo anterior, los antígenos de proteína en las vacunas de "dosis, baja" de preferencia están presentes en tan poco como de 0.1 a 10 microgramos, de preferencia de 0.1 a 5 microgramos por dosis; y los antígenos de sacárido (de preferencia conjugados) pueden estar presentes en el intervalo de 0.01 a 1 microgramo, y de preferencia de entre 0.01 y 0.5 microgramos de sacárido por dosis.

Como se utiliza en la presente, el término "suministro intradérmico" significa el suministro de la vacuna a la región de la dermis en la piel. Sin embargo, la vacuna no necesariamente se i localizará exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa en la piel localizada entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 2.0 milímetros desde la superficie de la piel humana, pero hay cierta cantidad de variación entre los individuos y en las diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar llegar a la dermis si se va 1.5 milímetros más adelante de la superficie de la piel. La dermis se localiza entre el estrato córneo y la epidermis en la superficie y en la capa subcutánea más adelante. Dependiendo del modo de suministro, la vacuna por último se puede localizar exclusivamente o primordialmente dentro de la dermis, ó' finalmente se puede distribuir dentro de la epidermis y la dermis.

La cantidad de cada antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induzca una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en los vacunados típicos. Esta cantidad variará dependiendo de cuál ¡nmunógeno específico se emplee, y de cómo se presente.

En una modalidad adicional, se proporciona un método para el tratamiento de un individuo susceptible a, o que sufra de, una enfermedad, mediante la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente.

También se proporciona un método para evitar que un individuo contraiga una enfermedad seleccionada a partir del grupo que comprende enfermedades infecciosas bacterianas y virales, enfermedades parasitarias, en particular enfermedad patogénica intracelular, enfermedades proliferatiyas, tales como cánceres de próstata, de mama, colo-rectal, de pulmón, pancreático, renal, de ovarios, o melanoma; trastornos crónicos que no sean cáncer, alergia; el cual comprende la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente a este individuo.

En una modalidad adicional, sé proporciona una composición de vacuna para utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una condición o enfermedad, en donde la composición de vacuna comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, la cual comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

En una modalidad adicional, se proporciona el uso de una composición de vacuna en la elaboración de un medicamento para I utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una condición o enfermedad, en donde la composición de vacuna comprende un antígeno o composición de antígeno, iy una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, la cual comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite ¡ metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.1 a !4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

La invención se describirá adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes: El Ejemplo I describe métodos de lectura inmunológicos empleados en estudios en ratones', hurones, cerdos, y seres humanos.

El Ejemplo II describe la preparación de las formulaciones en emulsión de aceite en agua y adyuvante utilizadas en los estudios ejemplificados. i i El Ejemplo III muestra un estudio clínico en una población de adultos de 18 a 59 años de edad, corí'una vacuna que contiene una preparación disociada de antígeno de influenza y diferentes dosis de adyuvante AS03. G El Ejemplo IV muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones BALB/c primeramente inoculados.

El Ejemplo V muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de I ¦! I I influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales J comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados.

El Ejemplo VI muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03 y una dosis baja de antígeno) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados.

El Ejemplo VII muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de H5N1 disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03 y antígeno) en ratones C57BI/6 puros. ' El Ejemplo VIII muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de influenza con adyuvante y sin adyuvante en cerdos Large White (Grandes Blancos) primeramente inoculados.

Ejemplo I - Métodos de lectura inmunológicos 1.1. Métodos con ratones 1.1.1. Prueba de inhibición de hemaglutinación Principio de la prueba (procedimiento clásico).

Las titulaciones de anticuerpo anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de influenza (de temporada), utilizando la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl). El principio de la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) se basa en la capacidad de los anticuerpos anti-influenza específicos para inhibir la hemaglutinación de los glóbulos rojos sanguíneos (RBC) mediante la hemaglutinina del virus de influenza (HA). Los sueros inactivados por calor se tratan con Caolín y glóbulos rojos sanguíneos (RBC) para remover los inhibidores no específicos. Después del tratamiento previo, se incuban diluciones dobles de los sueros con 4 unidades de hemaglutinina de cada cepa de influenza. Entonces se agregan los glóbulos rojos sanguíneos, y se califica la inhibición de la aglutinación. Las titulaciones se expresan como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibe completamente la hemaglutinación. Debido a que la primera dilución de suero es de i 1:20, un nivel indetectable se califica como una titulación igual a 10. Adaptación para H5N1 (descripción específica de inhibición de hemaglutinación (Hl) utilizando eritrocitos de caballo): Debido a que se documentó 'cjue el ensayo clásico de la inhibición de hemaglutinación (Hl) para determinar los anticuerpos anti-hemaglutinina (HA) no funciona bien para la cepa H5N1, se empleó el protocolo adaptado utilizando glóbulos rojos sanguíneos (RBC) de caballo.

Los eritrocitos de caballo se utilizan para las cepas pandémicas de H5N1. Suspensión de'glóbulos rojos sanguíneos de caballo al 0.5 por ciento (concentración final) en regulador de fosfato que contiene BSA al 0.5 por cientd (albúmina de suero bovino, concentración final). Esta suspensión se prepara cada día mediante lavado de los glóbulos rojos sanguíneos con el mismo regulador de fosfato y un paso de centrifugación subsiguiente (10 minutos, 2,000 revoluciones por minuto). Este paso de lavado se tiene que repetir una vez. Después de la adición de los glóbulos rojos sanguíneos de caballo a la mezcla de reacción de suero y suspensión de virus; las placas se tienen que incubar a temperatura ambiente (RT, 20°C +/-2°C) durante dos horas, debido a la baja velocidad de sedimentación de los glóbulos rojos sanguíneos de caballo.

Análisis estadístico El análisis estadístico se llevó a cabo sobre las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) después de la vacunación utilizando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de variación se puede describir brevemente como sigue: · Transformación de datos Log.

Prueba de Shapiro-Wilk sobre cada población (grupo) con el objeto de verificar la normalidad de a distribución de los grupos.

Prueba de Cochran con el objeto de verificar la homogeneicidad de variación entre las diferentes poblaciones (grupos). ' • Análisis de variación sobre los datos seleccionados.

Prueba para la interacción de ANOVA de dos vías.

Prueba de Tukey-HSD para comparaciones múltiples 1.1.2. Teñido de citoquina intracelular Esta técnica permite hacer una cuantificación de los linfocitos- T específicos del antígeno con base en la producción de citoquina: las células-T efectoras y/o las céfülas-T efectoras-de memoria producen IFN-?, y/o las células-T de memoria central producen IL-2. las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se cosechan en el día 7 después de la inmunización.

Las células linfoides se vuelven a estim ula r in vitro en la presencia del inhibidor de secreción (Brefeldine) .

Estas células se procesan entonces mediante el procedimiento inmunofluorescente convencional utilizando anticuerpos fluorescentes (CD4, CD8 , IFN-?, e IL-2) . Los resultados se expresan como una frecuencia de células positivas para citoquina dentro de las células-T CD4/CD8. El teñido intracelular de citoquinas de las células-T se llevó a cabo sobre las células monon ucleares de sangre periférica (PBMC) 7 días después de la segunda inmunización. La sangre se recolectó de los ratones, y se reservó en el medio RPMI heparinizado + Add . Para la sangre, se pusieron en capas suspensiones de PBL diluidos en RPMI + Add sobre un gradiente de Lympholyte-Mammal de acuerdo con el protocolo recomendado (centrifugar durante 20 minutos a 2, 500 revoluciones por minuto y a temperatura ambiente) . Las células mononucleares en la interfase se removieron , se lavaron 2 veces en RPM I + Add , y las suspensiones de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se ajusta ron a 2 x 1 06 células/mililitro en RPM I con ' suero fetal de becerro al 5 por ciento .

La estimulación con el antígeno in vitro de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se llevó a cabo en una concentración final de 1 x 1 07 células/mililitro (tubo FACS) con Fl Integ ral (1 microg ramo de HA/cepá), y entonces se incubaron durante 2 horas a 37°C con la adic¡óri rde anti-C D28 y anti-C D49d (1 microg ramo/mililitro para ambos) .

En seguida del paso de re-estimulación del antígeno, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se incuban durante la noche a 37°C en la presencia de Brefeldina (1 microgramo/mililitro) a 37°C, para inhibir la secreción de citoquina. El teñido de IFN-? / IL-2 / CD4 / CD8 se llevó a cabo como sigue: Las suspensiones de células se lavaron, se volvieron a suspender en 50 microlitros de suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de i becerro al 1 por ciento (FCS) conteniendo reactivo de bloqueo Fe al 2 por ciento (1/50; 2.4G2). Después de 10 minutos de incubación a 4°C, se agregaron 50 microlitros de una mezcla de anti-CD4-PE (2/50), y anti-CD8 perCp (3/50), y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Después de un lavado en suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de becerro al 1 por ciento (FCS), las células se permeabilizaron volviendo a suspender en 200 microlitros de Cytofix-Cytoperm (Kit BD), y se incubaron durante 20 minutos a 4°C. Las células luego se lavaron con Perm Wash (Kit BD), y se volvieron a suspender con 50 microlitros de una mezcla de APC anti-IFN-? (1/50) + FITC anti-IL-2 (1/50) diluida en Perm Wash. Después de una incubación mínima de 2 horas y máxima durante la noche a 4°C, las células se lavaron con Perm Wash y se volvieron a suspender en suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de becerro al 1 por ciento (FCS) + paraformaldehído al 1 por ciento. El análisis de la muestra se llevó a cabo mediante FACS. Las células vivas se pasaron por compuerta (FSC/SSC), y se llevó a cabo la adquisición en aproximadamente 20,000 eventos (linfocitos) ó 35,000 eventos sobre las células-T CD4 + . Los porcentajes de IFN-Y+ o IL2+ se calcularon sobre las poblaciones pasadas por compuerta CD4+ y CD8 + . 1.1.3. ELISA Anti-H5N 1.

La cuantificación de las titulaciones de anticuerpos de Ig, IgG 1 e lgG2b anti-H5N1 se llevó a cabo mediante un ELISA utilizando H5N1 disociado como recubrimiento, Las soluciones de virus y anticuerpos se utilizaron a 100 microlitros por pozo. El virus H5N1 disociado se diluyó en una concentración final de 1 microgramo/ mililitro en suero regulado con fosfato (PBS), y se adsorbió durante la noche a 4°C en los pozos de las placas de microtitulación de 96 pozos (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454). Las placas entonces se incubaron durante 1 hora a 37°C cori 200 microlitros por pozo de suero regulado con fosfato (PBS), que contiene albúmina de suero bovino al 1 por ciento y Tween 20 al 0.1 por ciento (regulador de saturación). Se agregaron doce diluciones dobles de los sueros en regulador de saturación a las placas recubiertas con H5N1, y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37°C. Las placas se lavaron cuatro veces con suero regulado con fosfato (PBS), Tween 20 al 0.1 por ciento. Se agregó la Ig anti-ratón conjugada-biotinilada (Prozan-E0413) diluida a 1/500, o la IgG 1 a'nti-ratón conjugada-biotinilada (Imtech 1070-08), o una lgG2b anti-ratón biotinilada (Imtech 1090-08) diluida a 1/4,000 en suero regulado con fosfato (PBS), albúmina de suero bovino al 1 por ciento, y Tween 20 al 0.1 por ciento, a cada pozo, y se incubó durante 1hora 30 minutos a 37°C; después de un paso de lavado, las placas se incubaron durante 30 minutos con un conjugado de Estreptavidina-Biotina-Peroxidasa (Prozan P0397) diluido a 1/10,000 en suero regulado con fosfato (PBS), albúmina de suero bovino al 1 por ciento, y Tween 20.

Para la revelación colorimétrica, las placas se incubaron durante 20 minutos a 22°C con una solución de o-fenil-diamina al 0.04 por ciento (Sigma P4664) H202 al 0.03 por ciento en regulador de citrato 0.1 M, pH de 4.2. La reacción se detuvo con H2S04 2N, y las microplacas se leyeron a 490-630 nanómetros.

I.2. Métodos en Hurones 1.2.1. Prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) Procedimiento de prueba.

Las titulaciones de anticuerpo anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de influenza se determinaron utilizando la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl). El principio de la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) se basa en la capacidad de los anticuerpos anti-influenza específicos para inhibir la hemaglutinación de glóbulos rojos sanguíneos de" pollo (RBC) mediante la hemaglutinina del virus de influenza (HA). Primero se trataron los sueros con una solución de neuraminidasa al 25 por ciento (RDE), y se inactivaron por calor para remover los inhibidores no específicos. Después del tratamiento previo, se incubaron diluciones dobles de los sueros con 4 unidades de hemaglutinina de cada cepa de influenza. Entonces se agregaron los glóbulos rojos sanguíneos de pollo, y se calificó la inhibición de aglutinación. Las titulaciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió completamente la hemaglutinación. Debido a que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se calificó como una titulación igual a 5.

Análisis estadístico.

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo sobre las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) (Día 41, antes del estímulo) utilizando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de variación se puede describir brevemente como sigue: Transformación de datos Log.

Prueba de Shapiro-Wilk sobre cada población (grupo) con el objeto de verificar la normalidad de la distribución de los grupos.

Prueba de Cochran con el objeto de verificar la homogeneicidad de variación entre las diferentes poblaciones (grupos).

Prueba para la interacción del ANOVA de una vía.

Prueba de Tuckey-HSD para comparaciones múltiples. 1.2.2. Monitoreo de la temperatura corporal Las temperaturas individuales ' se monitorearon durante el período de estímulo con los transmisores y mediante el registro de telemetría. Todos los implantes se verificaron y se restauraron, y DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, Holanda) llevó a cabo una nueva calibración antes de colocarse en la cavidad intraperitoneal. Todos los animales se alojaron individualmente en jaulas individuales durante estas mediciones.

Las temperaturas se registraron cada 15 minutos, 4 días antes del estímulo hasta 7 días después del estímulo. 1.2.3. Lavados nasales Los lavados nasales se llevaron a cabo mediante la administración de 5 mililitros de suero regulado con fosfato (PBS), en ambas fosas nasales de los animales despiertos. El inoculo se recolectó en una caja de Petri, y se colocó en recipientes de muestras sobre hielo seco.

Titulación viral en los lavados nasales Todas las muestras nasales se filtraron primero para esterilizarse a través de filtros Spin X (Costar) para remover cualquier contaminación bacteriana. Se transfirieron 50 microlitros de diluciones diez veces en serie de los lavados nasales a las placas de microtitulación que contenían 50 microlitros del medio (10 pozos/ dilución). Entonces se agregaron a cada pozo 100 microlitros de células MDCK (2.4 x 105 células/mililitro), y se incubaron a 35°C durante 5 a 7días. ' Después de 5 a 7 días de incubación, el medio de cultivo se removió suavemente, y se agregaron 100 microlitros de un medio que contenía 1/20 WST-1, y se incubaron durante otras 18 horas.

La intensidad del tinte de formazán amarillo producida después de la reducción de WST-1 mediante las células viables, es proporcional al número de células viables presentes en el pozo al final del ensayo de titulación viral , y se cuantificó mediante la med ición de la absorbencia de cada pozo a la longitud de onda i i apropiada (450 nanómetros). El corte se define como la OD promed io de las células de control no infectadas - 0.3 O D (0.3 OD corresponde a +/- 3 Desviación Estándar de la OD de las células de control no infectadas) . U na calificación positiva se define cuando la OD es < el corte , y en contraste , u na calificación negativa se define cuando la O D es > el corte . Las titu laciones de envoltu ra viral fueron determ i nadas por "Reed y Muench" , y se expresaron com o Log TC I D50/m ililitro .

I.3. Métodos en Cerdos 1.3.1 . Prueba de inhibición de hemaglutinación (H l) Procedimiento de prueba.

Las titulaciones de anticuerpo a nti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de influenza se determinaron utilizando la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) . El principio de la prueba de inhibición de hemaglutinación (H l) sé basa en la capacidad de los anticuerpos anti-influenza específicos para inhibir la hemaglutinación de glóbulos rojos sanguíneos d¿: pollo (RBC) mediante la hemaglutinina del virus de influenza (HA). Primero se trataron los sueros con una solución de neuraminidasa al 25 por ciento (RDE), y se inactivaron por calor para remover los inhibidores no específicos . Después del tratamiento previo, se incubaron diluciones dobles de los sueros con 4 unidades de hemaglutinina de cada cepa de influenza. Entonces se agregaron los glóbulos rojos sangu íneos de pollo, y se calificó la inhibición de aglutinación . Las titulaciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió completamente la hemaglutinación. Debido a que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se calificó como una titulación igual a 5.

Análisis estadístico.

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo sobre las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) (Día 41, antes del estímulo) utilizando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de variación se puede describir brevemente como sigue: · Transformación de datos Log.

Prueba de Shapiro-Wilk sobre cada población (grupo) con el objeto de verificar la normalidad de la distribución de los grupos.

Prueba de Cochran con el objeto de verificar la homogeneicidad de variación entre las diferentes poblaciones (grupos).

Prueba para la interacción del ANOVA de una vía.

Prueba de Tuckey-HSD para comparaciones múltiples. I.4. Ensayos para evaluar la respuesta inmunitaria en los seres humanos 1.4.1. Ensayo de inhibición de hemaglutinación La respuesta inmunitaria se determinó mediante la medición de los anticuerpos de Hl, empleando el método descrito por el WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, EUA (1991) (Organización Mundial de la Salud, Centro de Colaboración para Influenza, Centros para el Control de Enfermedades, Atlanta, EUA (1991)).

Se condujeron mediciones de las titulaciones de anticuerpos sobre las muestras de suero descongeladas-congeladas, con un micrométodo estandarizado y comprensivamente validado, utilizando 4 unidades de inhibición de hemaglutinación (4 HIU) de los antígenos apropiados, y una suspensión de eritrocitos de ave de corral al 0.5 por ciento. Los inhibidores del suero no específicos se removieron mediante tratamiento por calor y mediante la enzima destructora de los receptores.

Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar los niveles de anticuerpo de Hl. Empezando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de dilución (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1:20,480.

El punto final de la titulación se tomó como el paso de dilución más alta que mostró una inhibición completa (100 por ciento) de la hemaglutinación. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado.

I.4.2. Ensayo de Inhibición de Neuraminidasa El ensayo se llevó a cabo en placas de microtitulación recubiertas con fetuina. Se preparó una serie de dilución doble del anti-suero, y se mezcló con una cantidad estandarizada de virus de influenza A H3N2, H1N1 o de influenza B. La prueba se basó en la actividad biológica de la neuraminidasa que libera enzimáticamente el ácido neuramínico a partir de la fetuina. Después de la disociación el ácido neuramínico terminal, se desenmascaró la ß-D-galactosa-N- acetil-galactosam in a . Se agregó a los pozos la aglutin ina de caca huate marcada con peroxidasa de rad ícula roja (H RP) a partir de Arachis hipogaea, la cual se enlaza específicamente a las estructu ras de galactosa . La cantidad de aglutinina enlazada se puede detectar y cuantificar en u na reacción del sustrato con tetra-metil-bencidina (TM B). La dilución de anticuerpo más alta que todavía in hibe la actividad de neuraminidasa viral por cuando menos el 50 por ciento se indicó como la titulación de N I . 1.4.3. Ensayo de Anticuerpo Neutralizante Se cond ujeron mediciones de los anticuerpos neutralizantes sobre las muestras de suero descongeladas-congeladas. La neutralización del virus mediante los anticuerpos contenidos en el suero se determinó en un ensayo de microneutralización . Los sueros se utilizaron sin mayor tratamiento en el ensayo.

Cada suero se probó por triplicado. Se mezcló una cantidad estandarizada del virus con diluciones^en serie de suero, y se incubó para permitir el enlace de los anticuerpos al virus. Entonces se agregó una suspensión celular que contenía una cantidad definida de células M DCK a la mezcla de virus y ánti-suero, y se incubó a 33°C. Después del período de incubación , s!é visualizó la réplica del virus mediante la hemaglutinación de glóbulos rojos sangu íneos de pollo. Se calculó la titulación de neutralización del 50 por ciento de un suero mediante el método de Reed y uench. 1.4.4. La I nmunidad Mediada por Células se evaluó mediante Citometría de Flujo de Cito uina (C FCV Las células-T CD4 y CD8 específicas del antígeno de sangre periférica se pueden volver a estimular in vitro para producir IL-2, CD40L, TNF-alfa, e IFN, si se incuban con su antígeno correspondiente.

En consecuencia, las células-T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar mediante citometría de flujo en seguida del marcado con inmunofluorescencia convencional del fenotipo celular, así como mediante la producción de citoquinas intracelulares. En el presente estudio, el antígeno de vacuna de influenza, así como los péptidos derivados a partir de la proteína de influenza específica, se utilizaron como el antígeno para volver a estimular las células-T específicas de influenza. Los resultados se expresaron como una frecuencia de células-T CD4 o CD8 positivas para las citoquinas dentro de la sub-población de células-T CD4 o CD8.

I.4.5. Métodos Estadísticos 1.4.5.1. Puntos finales primarios Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales inducidos durante un período de seguimiento de 7 días (escdecir, día de la vacunación y los 6 días siguientes) después de la vacunación y globalmente.

Porcentaje, intensidad y r lación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no solicitados durante un período de seguimiento de 21 días (es decir, día de la vacunación y los 20 días siguientes) después de la vacunación y globalmente.

Presentación de eventos adversos g raves du rante todo el í estudio . 1.4.5.2. Puntos finales secundarios Para la respuesta inm unitaria humoral: Variables observadas: En los días 0 y 21 : inhibición de hemaglutinación en suero (H l) , y titulaciones de anticuerpos de NI , probadas por separado contra cada una de las tres cepas del virus de influenza representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H 1 N 1 , anti-H3N2 y anti-B) .

En los días 0 y 21 : titulaciones de anticuerpo neutralizante, probadas por separado!; contra cada una de las tres í cepas del virus de influenza representadas en la vacuna .

Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95 por ciento): Titulaciones medias geométricas (G MTs) de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (H l) en suero con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) antes y después de la vacunación . j índices de seroconversión* con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) en el día 21,.

Factores de conversión** con intervalos de confianza del 95 por ciento (C l 95%) en el día 21 . índices de seroprotección*.** con intervalos de confianza del 95 por ciento (C l 95%) en el d ía 21.

¡ • Titulaciones medias geométricas (G Ts) de anticuerpos de inhibición de neuraminidasa (NI)' en suero (con intervalos de confianza del 95 por ciento) en todos los puntos del tiempo. * índice de seroconversión definido como el porcentaje de vacunados que tienen un aumento de cuando menos 4 veces en las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero en el día 21 comparándose con el día 0, para cada cepa de vacuna.

** Factor de conversión definido como las veces de aumento en titulaciones medias geométricas (GMTs) de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero en el día 21 comparándose con el día 0, para cada cepa de vacuna. *** índice de protección definido como el porcentaje de vacunados con una titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero = 40 después de la vacunación (para cada cepa de vacuna), que usualmente se acepta como indicador de la protección.

Se debe entender que para algunos de los estudios clínicos, la reactogenicidad/seguridad pueden ser'puntos finales secundarios, y la inmunogenicidad puede ser el punto final primario.

Para la respuesta inmunitaria mediada por células (C I) Variable observada En los días 0 y 21: frecuencia de células CD4/CD8 positivas para citoquina por 106 en diferentes pruebas. Cada prueba cuantifica la respuesta de las células-T CD4/CD8 a: Antígeno de influenza peptídico (gf) (se necesita dar/explicar la naturaleza precisa y el origen de estos antígenos).

Antígeno de influenza disociado (sf).

Antígeno de influenza integral (wf).

Variables derivadas: * Células que producen cuando menos dos citoquinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa).

Células que producen cuando menos CD40L y otra citoquina (IL-2, TNFa, IFNy).

• Células que producen cuando menos IL-2 y otra citoquina (CD40L, TNFa, IFNy).

• Células que producen cuando menos IFNy y otra citoquina (IL-2, TNFa, CD40L).

Células que producen cuando menos TNFa y otra citoquina (IL-2, CD40L, IFNy). 1.3.5.3. Análisis de inmunogenicidad El análisis de inmunogenicidad se basó en la cohorte vacunada total. Para cada grupo de tratamiento, se calcularon los siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95 por ciento): Titulaciones medias geométricas (GMTs) de inhibición de hemaglutinación (Hl) y titulaciones de anticuerpos de inhibición de neuraminidasa (NI) en los días 0 y 21 Titulaciones medias geométricas (GMTs) de titulaciones de anticuerpo neutralizante en los días 0 y 21.

Factores de conversión en el día 21. · índices de seroconversión (SC) en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados que tienen cuando menos un aumento de 4 veces en las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero en el día 21 comparándose con el día 0. · índices de protección en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados con una titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero = 1:40.

Se resumió la frecuencia de linfocitos-T CD4/CD8 que se secretan en respuesta (estadística descriptiva) para cada grupo de vacunación en cada punto del tiempo (Día 0, Día 21), y para cada antígeno (Influenza peptídica (pf), influenza disociada (sf), e influenza integral (wf)).

Estadística descriptiva en1 la diferencia individual entre las respuestas al punto del tiempo (Después-Antes) para cada grupo de vacunación y cada antígeno (pf, sf, y wf) en cada una de 5 pruebas diferentes.

Se utilizó una prueba no paramétrica (prueba de Kruskall- Wallis) para comparar las diferencias de localización entre los 3 grupos, y se calculó el valor-p estadístico para cada antígeno en cada una de 5 pruebas diferentes. Todas las pruebas de significado fueron de dos colas. Los valores-p menores o iguales a 0.05 se consideraron como estadísticamente significativos.

Ejemplo II - Preparación de las formulaciones en emulsión de aceite en agua y adyuvante A menos que se informe de otra manera, la emulsión de aceite en agua utilizada en los siguientes ejemplos está compuesta de una i fase orgánica hecha de 2 aceites (alfa-tocoferol y escualeno), y una fase acuosa de suero regulado con fosfato (PBS), que contiene Tween 80 como el agente emulsionante. A menos que se informe de otra manera, las formulaciones adyuvantes de la emulsión de aceite en agua utilizadas en los siguientes ejemplos se hicieron comprendiendo el siguiente componente de la emulsión de aceite en agua (se dan las concentraciones finales): 2.5 por ciento de escualeno (volumen/volumen), 2.5 por ciento de alfa-tocoferol (volumen/volumen), 0.9 por ciento de mono-oleato de sorbitán de polioxietileno (volumen/volumen) (Tween 80), véase la Publicación Internacional Número WO 95/17210:' Esta emulsión, denominada como AS03 en los siguientes ejemplos, se preparó como sigue, como un concentrado dos veces. 11.1. Preparación de emulsión SB62 Este método se utilizó en los estudios reportados en las secciones de ejemplos clínicos y pre-clínicos. La preparación de la emulsión SB62 se hace mediante 'la mezcla, bajo una fuerte agitación, de una fase de aceite compuesta de componentes hidrofóbicos (DL-a-tocoferol y escualeno), y una fase acuosa que contiene los componentes solubles en agua (el detergente aniónico Tween 80 y suero regulado con fosfato (PBS) mod (modificado), pH de 6.8). Con agitación, la fase de aceite (volumen total de 1/10) se transfiere a la fase acuosa (volumen total de 9/10), y la mezcla se agita durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla resultante entonces se somete a fuerzas cortantes, de impacto y cavitación en la cámara de interacción de un microfluidizador (15,000 PSI (1,050 kg/cm2) - 8 ciclos, ó 3 ciclos en el adyuvante utilizado en el estudio clínico reportado en el Ejemplo III), para producir gotas en sub-micras (distribución de entre 100 y 200 nanómetros). El pH resultante es de entre 6.8 ± 0.1. La emulsión SB62 se esteriliza entonces mediante filtración a través de una membrana de 0.22 mieras y la emulsión estéril en volumen se almacena refrigerada en recipientes Cupac de 2°C a 8°C. Se inunda con gas inerte estéril (nitrógeno o argón) en el volumen muerto del recipiente con El volumen final de la emulsión SB62 durante cuando menos 15 segundos. J La composición final de la emulsión SB62 es como sigue : Tween 80: 1.8 por ciento (volumen/volumen) 19.4 miligramos/ mililitro; Escualeno: 5 por ciento (volumen/volumen) 42.8 miligramos/ mililitro; a-tocoferol: 5 por ciento (volumen/volumen) 47.5 miligramos/ mililitro; PBS-mod: NaCI 121 mM, KCI 2.38 mM, Na2HP04 7.14 mM,-KH2P041.3 mM; pH de 6.8 ± 0.1. ?;? Ejemplo III - Estudio clínico en una población de adultos de 18 a 59 años de edad con una vacuna que contiene una preparación disociada de antígeno de influenza y diferentes dosis de adyuvante AS03 (Flu-LD-004) III.1. Introducción Se condujo un estudio ciego indi idual controlado, de selección aleatoria, en fase II en una población de adultos de 18 a 59 años de edad en el año 2006, con el objeto de evaluar la inmunogenicidad, la seguridad, y la reactogenicidad de la vacuna candidata de dosis baja de GlaxoSmithKIine Biologicals (es decir, que contiene 5 microgramos de HA por cepa) con dos dosis de adyuvante AS03.

La respuesta inmunitaria humoral (es decir, anti-hemaglutinina) se midió 21 días después de la administración intramuscular de una dosis de una vacuna con adyuvante AS03. Se utilizó FluarixMR como referencia. j III.2. Diseño del estudio Tres grupos de sujetos en paralelo recibieron la siguiente vacuna intramuscularmente: un grupo de 100 sujetos recibieron una inyección de la vacuna de virus de influencia disociada de dosis baja que contenía 5 microgramos de HA con adyuvante ASÓ3 (FluLD1/1); un grupo de 100 sujetos recibieron una inyección de la vacuna de virus de influencia disociada de dosis baja que contenía 5 microgramos de HA con adyuvante de media dosis de AS03 (AD03 ½) (FluLDI/2); un grupo de 100 sujetos recibieron una dosis de FluarixMR (Fluarix).

Programa: una inyección intramuscular de la vacuna de influenza en el día 0, citas en el sitio del estudio en el día 0 y en el día 21 con una recolección de muestras de sangre (determinación del anticuerpo inhibidor de hemaglütinación (Hl)), y un contacto telefónico adicional en el día 30 (conclusión del estudio). i i La vacuna de influenza disociada trivalente estándar -FluarixMR utilizada en este estudio, es una vacuna comercial del año 2006 desarrollada y elaborada por GlaxoSmithKIine Biologicals.

III.3. Objetivos del estudio III.3.1. Objetivo primario Evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por las vacunas del estudio en términos de titulaciones de anticuerpos anti-hemaglutinina: Variables observadas en los días 0 y 21: titulaciones de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación en suero.

Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95 por ciento): Titulaciones medias geométricas (G Ts) de anticuerpos en suero en los días 0 y 21. índices de seroconversión*'en el día 21 Factores de conversión** en el día 21 índices de protección*** en los días 0 y 21 * El índice de seroconve sión para la respuesta de anticuerpos de hemaglutinina se define como el porcentaje de vacunados que tienen ya sea una titulación antes de la vacunación < 1:10 y una titulación después de la vacunación > 1:40, o bien una titulación antes de la vacunación > 1:10 y cuando menos un aumento del cuádruple en la titulación después de la vacunación.

** Factor de conversión definido como las veces de aumento en las titulaciones medias geométricas (GMTs) de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero después de la vacunación comparándose con el día 0; *** índice de protección definido como el porcentaje de vacunados con una titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero > 40 después de la vacunación que usualmente se acepta que indica protección.

III.3.2. Objetivo secundario Evaluar la seguridad y reactogenicidad de las vacunas del estudio en términos de eventos adversos locales y generales inducidos, eventos adversos no inducidos, y eventos adversos graves: Presentación, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales inducidos durante un período de seguimiento de 7 días (es decir, el día de la vacunación y los 6 días siguientes) después de cada vacunación en cada grupo.

Presentación, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no inducidos durante un período de seguimiento de 30 días (es decir, el día de la vacunación y los 29 días siguientes) después de la vacunación en cada grupo.

Presentación y relación de eventos adversos graves durante todo el período del estudio en cada grupo.

III.4. Composición de vacuna y administración III.4.1. Preparación de la vacuna La vacuna de influenza sin adyuvante es una vacuna de influenza inactivada de virión disociado trivalente que consiste en tres volúmenes de antígeno viral monovalente (preparados a partir de, respectivamente, las cepas de influenza A/H1N1, A/H3N2 y B). Los antígenos presentes en esta vacuna son los mismos que aquéllos de la vacuna con licencia FluarixMR, la cual está disponible en el mercado como FluarixMR (a-Rix®) desde el año 1992, y contiene 15 microgramos de HA/cepa por dosis. Las cepas de influenza incluidas en los lotes clínicos FluLD son las cepas que se seleccionaron para el Hemisferio Norte en 2006/2007: Cepa tipo A / Nueva Caledonia / 20/99 (H1N1): A / Nueva Caledonia / 20/99 (H1N1) IVR-116.

Cepa tipo A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2): A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) NYMCX-161.

B / Malasia / 2506/2004.

Los antígenos se derivan a partir de virus cultivados en huevo. La disociación se lleva a cabo con desoxicolato de sodio antes del paso de inactivación, el cual se lleva a cabo a través de la siguiente acción del desoxicolato de sodio y el formaldehído.

La vacuna de influenza de dosis baja (FluLD) con adyuvante AS03 (lotes clínicos) se basa en la vacuna FluarixMR comercialmente disponible (preparada a partir de, respectivamente, las cepas de influenza A/H1N1, A/H3N2 y B), pero con un contenido de antígeno más bajo, y con adyuvante del sistema adyuvante de GSK, AS03. El AS03 consiste en una emulsión de aceite en agua (SB62) que contiene dos aceites biodegradables, escualeno y a-tocoferol (Vitamina E), y un tensoactivo, polisorbato 80 (Tween 80). Los antígenos de influenza se incorporan en la fase acuosa del sistema adyuvante mediante una mezcla simple con la emulsión. Se han probado dos formulaciones, que difieren por la cantidad de adyuvante introducido con los antígenos Flu en el lote de la vacuna. Las vacunas con adyuvante contienen 5 microgramos de hemaglutinina (HA) de cada cepa de virus de influenza por dosis, combinados con una dosis completa (AS03) o media dosis (AS03 ½) del sistema adyuvante AS03. Los excipientes son los siguientes: polisorbato 80 (Tween 80), octoxinol 10 (Tritón X-100), succinato ácido de alfa-tocoferilo, cloruro de sodio, di-fosfato ácido de sodio, di-fosfato ácido de potasio, cloruro de potasio, agua para inyecciones.

Las vacunas de influenza de dosis baja con adyuvante AS03 (FluLD, dosis completa o media dosis de AS03) son vacunas sin conservadores. Sin embargo, contienen cantidades traza de tiomersal (< 1.25 microgramos de Hg por dosis) desde las primeras etapas del proceso de elaboración. Ambas se presentan como vacunas de una sola dosis en jeringaste vidrio (Tipo I) previamente llenadas con un volumen de 0.5 mililitros/dosis.

III.4.1.1. Composición de vacuna de influenza con adyuvante AS03 Una dosis de FluLD (dosis completa o media dosis de AS03) corresponde a 0.5 mililitros. La composición se proporciona en la Tabla 3. El contenido de HA por dosis es de 5 microgramos para ambas formulaciones, siendo la única diferencia la cantidad de AS03 presente en los recipientes finales.

Tabla 3 Composición de vacuna de influenza de dosis baja con adyuvante AS03 (dosis completa y media dosis de AS03) Cantidad por dosis Componente (0.5 m l_) Viriones disociados inactivados - A/Nueva Caledonia/20/99 (H 1 N 1 ) IVR-1 16 5 pg HA - A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) NYMCX-1 61 5 pg HA - B/Malasia/2506/2004 5 ig HA Adyuvante (Dosis completa / Media dosis) - emulsión SB62 (Volumen total) 0.250 ml_ • escualeno 10.70 mg / 5.35 mg • DL-a-tocoferol 1 1 .88 mg / 5.94 mg • Polisorbato 80 (Tween 80) 4.85 mg / 2.425 mg Polisorbato 80 (Tween 80) 0.122 mg Octoxinol 1 0 (Tritón X-1 00) 0.0283 mg Succinato ácido de a-tocoferilo 0.01665 mg Cloruro de sodio 4 mg Di-fosfato de sodio 0.575 mg Di-fosfato ácido de potasio 0.1 00 mg Cantidad por dosis Componente (0.5 ml_) Cloruro de potasio 0.1 01 mg i Agua para inyecciones hasta 0.50 mL Abreviaturas: HA = Hemaglutinina.

El contenido total en Polisorbato 80 corresponde a 4.972 miligramos por dosis cuando se utiliza la dosis completa de AS03, y a 2.547 miligramos por dosis cuando se utiliza media dosis de AS03.

III.4. 1.2. Producción de preparación de antlgeno de influenza inactivado disociado ',·.

Los antígenos de influenza son ¡ idénticos a aquéllos incluidos en el FluarixMR (Vacuna de Virus de I nfluenza) . Los volúmenes monovalentes consisten en virus disociados inactivados purificados que se preparan a partir de las semillas de procesamiento de las tres cepas de virus de influenza, tipo A (H 1 N 1 y H3N2) , y tipo B , las cuales se cultivan individualmente en huevos de gallina embrionados. Estas semillas de procesamiento se derivan a partir de cepas que se reciben a partir de un centro colaborador de la Organización M undial de la Salud , siguiendo las recomendaciones anuales de la Organización Mundial de la Salud . Para el proceso para la preparación de los antígenos, se da una referencia, a manera de ilustración, en la Publicación Internacional Número WO 02/097072. Los volúmenes de los tres lotes monovalentes se basan en el contenido de hemaglutinina (HA) medido en cada volumen monovalente antes de la formulación, y sobre El volumen de elaboración objetivo.

Un suero regulado con fosfato concentrado 10 veces (pH de 7.4 cuando se concentra 1 vez), y una pre-mezcla de Tween 80 y succinato ácido de a-tocoferilo, se diluyen en agua para inyecciones, seguido por agitación durante 5 a 30 minutos a temperatura ambiente.

Los tres volúmenes monovalentes concentrados se diluyen entonces sucesivamente en la solución resultante de suero regulado con fosfato / Tween 80 - succinato ácido de a-tocoferilo, hasta una concentración de: 20 microgramos de HA de cada volumen monovalente de A (H1N1, H3N2) 23.32 microgramos de HA del volumen monovalente de B por mililitro del volumen trivalente intermedio (5 microgramos de HA de cada volumen monovalente de A y 5.83 microgramos de HA de B / 500 microlitros de volumen final trivalente).

Entre las adiciones de cada volumen monovalente, la mezcla se agita durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente, y durante 15 a 30 minutos después de la adición del último volumen monovalente. Este volumen trivalente intermedio, también referido como "pre-reserva", se puede mantener a +2°C - +8°C, o se puede procesar adicionalmente hasta el paso de formulación final en el mismo día. El volumen final de la pre-reserva es de 250 microlitros por dosis.

II I.4.1.3. Preparación de composiciones de vacuna con adyuvante AS03 Vacuna con adyuvante: LD AS031/1 (Tabla 4) Se agrega PBS modificado concentrado 10 veces (pH de 7.4 cuando se concentra una vez; NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, Na2HP04 8.1 mM, KH2P04 1.47 mM, pH de 7.4), así como una mezcla que contiene Tween 80, Tritón X-100 y VES (las cantidades son tomando en cuenta el detergente presente en las cepas), a agua para inyecciones. Después de 5 a 30 minutos de agitación, se agregan 20 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de cada cepa H1N1 y H3N2, y 23.32 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de la cepa B con 10 a 30 minutos de agitación entre cada adición. Después de 15 a 30 minutos de agitación, se desecha un pequeño volumen del denominado como "volumen intermedio" para el análisis, y se almacena entre +2°C y +8°C. El volumen intermedio está en suero regulado con fosfato (PBS) moderado concentrado 1 vez. La concentración de los detergentes objetivo es de 488 microgramos de Tween 80 por mililitro, de 73.6 microgramos de Tritón X-100 por mililitro, y de 66.6 microgramos de VES por mililitro.

Entonces se prepara la formulación final: Se agrega un volumen igual de SB62 (véase la preparación en el Ejemplo II) a cada 250 microlitros del volumen intermedio de pre-reserva, y se mezcla durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. Se verifica í el pH para quedar en el intervalo de entre 6.8 y 7.5. La formulación se inunda con nitrógeno, y entonces se almacena entre +2°C y 8°C antes de llenarse.

Tabla 4 Vacuna de dosis baja con adyuvante AS03 Componente Concentración Volumen (mL) Paso 1: Pre-reserva A/Nueva Caledonia, volumen 104 Mg/ml 302.88 monovalente A/ Wisconsin, volumen 85 Mg/ml 370.59 monovalente B/ Malasia, volumen 110 pg/ml 333.90 monovalente Véase la PBS mod(1) 56.76 leyenda Tween 80 48,000 Mg/ml 5.24 Residuo de la Tritón X-100 cepa H3N2 Componente Concentración Volumen (ml_) Succinato ácido de a- 26,480 pg/ml 1.2 tocoferilo Agua filtrada 504.43 Volumen total = 1 ,575 (mi) Se recuperan 75 mililitros de muestras de la pre-reserva para probarse Volumen de pre-reserva restante = 1.500 (mi) Paso 2: Añadido a la pre- reserva Emulsión SB62 1,500 Volumen final total = 3,000 (mi) (1): La composición del volumen final de regulador es: NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, Na2HP048.1 mM, KH2P04 1.47 mM, pH de 7.4 Vacuna con adyuvante: LD AS031/2 (Tabla 5) Se agrega PBS modificado concentrado 10 veces (pH de 7.4 cuando se concentra una vez - véase la composición anterior), así como una mezcla que contiene Tween 80, Tritón X-100 y VES (las cantidades son tomando en cuenta el detergente presente en las cepas) a agua para inyecciones. Después de 5 a 30 minutos de agitación, se agregan 20 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de cada cepa de H1N1 y H3N2, y 23.32 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de la cepa B, con 10 a 30 minutos de agitación entre cada adición. Después de 15 a 30 minutos de agitación, se desecha un pequeño volumen del denominado como "volumen intermedio" para el análisis, y se almacena entre +2°C y + 8°C. El suero regulado con fosfato (PBS) modificado se concentra una vez en el volumen intermedio. La concentración de los detergentes objetivo es de 488 microgramos de Tween 80 por mililitro, de 73.6 microgramos de Tritón X-100 por mililitro, y de 66.6 microgramos VES por mililitro.

Entonces se prepara la formulación final: Primero se diluye el SB62 con el regulador de suero regulado con fosfato (PBS) modificado, y se agita durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se agrega un volumen igual de este SB62 diluido a cada 250 microlitros de pre-reserva del volumen intermedio. Después de 30 a 60 minutos de agitación a temperatura ambiente, se verifica el pH para quedar en el intervalo de entre 6.8 y 7.5. La formulación se inunda con nitrógeno, y entonces se almacena entre + 2°C y 8°C antes de llenarse.

El volumen final de ambas formulaciones es de 500 microlitros por dosis, y la concentración final de hemaglutinina (HA) es de 10 microgramos de cada volumen monovalente de A, y de 11.66 microgramos del volumen monovalente de B por mililitro del volumen final trivalente. Las concentraciones objetivo finales de Tween 80, Tritón X-100 (residuo de la elaboración del volumen monovalente de H3N2) y succinato ácido de a-tocoferilo (el succinato ácido de a-tocoferilo es una forma de éster del RRR (isómero D)-a-tocoferol) son de 244 microgramos/mililitro, 58.6 microgramos/mililitro, y 33.3 microgramos/ mililitro, respectivamente.

Tabla 5 Vacuna de dosis baja con adyuvante AS03 (media dosis de adyuvante) Componente Concentración Volumen (mi) Paso 1: Pre-reserva Paso 1: Pre-reserva A/Nueva Caledonia, volumen 104 Mg/ml 300.96 monovalente Al Wisconsin, volumen 85 pg/ml 368.24 monovalente B/ Malasia, volumen 110 pg/ml 331.78 monovalente Véase la PBS mod(1) 56.4 leyenda Tween 80 48,000 Mg/ml 5.2 Componente Concentración Volumen (mi) Residuo de la Tritón X-100 cepa H3N2 Succinato ácido de a- 26,480 pg/ml 1.2 tocoferilo Agua filtrada 501.22 Volumen total = 1,565 (mi) Se recuperan 75 mililitros de muestras de la pre-reserva para probarse Volumen de ore-reserva restante = 1.500 (mi) Paso 2: Añadido a la pre- reserva Emulsión SB62 750 Véase la PBS mod(1) 75 leyenda Agua filtrada 675 Volumen final total = 3,000 (mi) (1): La composición del volumen final de regulador es: NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, Na2HP048.1 mM, KH2P04 1.47 mM, pH de 7.4.

III.4.2 Administración de vacuna La vacuna se rellena en jeringas de vidrio estériles de 1.25 mililitros Tipo I (Farmacopea Europea). Cada jeringa se rellena hasta un objetivo de 0.57 mililitros (intervalo: de 0.54 a 0.60 mililitros). Las vacunas se administraron intramuscularmente en la región deltoide del brazo no dominante. Todas las vacunas se presentaron como jeringas previamente llenadas (0.5 mililitros). Con el objeto de asegurar una inyección intramuscular apropiada de la vacuna, se utilizó una aguja de cuando menos 25G y de cuando menos 2.5 centímetros de longitud. 111.5 Resultados de la población del estudio En este estudio se inscribió un total de 300 sujetos: 100 sujetos en cada uno de los 3 grupos. La edad promedio de la cohorte vacunada total en el momento de la vacunación fue de 36.7 años con una desviación estándar de 13.67 años. La edad promedio y la distribución de géneros de los sujetos a través de los 3 grupos de vacuna fueron similares. 111.6 Resultados de inmunogenicidad El análisis de inmunogenicidad se llevó a cabo sobre la cohorte de ATP para la inmunogenicidad (297 sujetos).

Respuesta inmunitaria humoral Con el objeto de evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por la vacuna candidata dé influenza de dosis baja con adyuvante AS03, se calcularon los siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95 por ciento) para cada grupo de tratamiento: Titulaciones medias geométricas (GMTs) de titulaciones de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (Hl) en los días 0 y 21; · índices de seroconversión (SC) en el día 21; • Factores de conversión en el día 21; Indices de protección en el día 0 y 21.

III.6.1 Titulaciones medias geométricas (GMT) de inhibición de hemaglutinación (Hl) Las titulaciones medias geométricas (GMT) para los anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (Hl) con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) se muestran en la Tabla 10 y en la Figura 1. Las proporciones de las titulaciones medias geométricas (GMT) ajustadas entre los grupos se muestran en la Tabla 11.

Antes de la vacunación las titulaciones medias geométricas (GMT) de los anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (Hl) para las 3 cepas de vacuna estuvieron dentro del mismo intervalo en los 3 grupos de tratamiento. Las titulaciones medias geométricas (GMT) observadas en el día 21 para los grupos con adyuvante tienden a ser más altas que para el grupo de Fluarix para las 3 cepas con una diferencia estadística (no hubo traslape de los intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%), y la proporción de la titulación media geométrica (GMT) ajustada no contuvo el valor de 1) entre FluLD1/1 y Fluarix para la cepa de vacuna A/Wisconsin. También se observó una diferencia estadística (la proporción de la titulación media geométrica (GMT) ajustada no contuvo el valor de 1) entre FluLD1/2 y Fluarix para la cepa de vacuna B/Malasia.

Tabla 10 índices de seropositividad y titulaciones medias geométricas (GMTs) para el anticuerpo anti-hemaglutinina (HA) en los días 0 y 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) Anticuerpo Grupo Tiempo N =1C 1/DIL GMT Min Max n % Clí 5% 1/DL Clí 5% LL UL LL UL FluLDI/1 PRE 99 80 80.8 71.7 88.0 31.9 23.5 43.4 <10.0 2560.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 475.4 352.2 641.6 20.0 7240.0 ANueva FluLDI/2 PRE 99 80 80.8 71.7 88.0 36.1 26.9 48.5 <10.0 3620.0 Celedonia PI(D21) 99 98 99.0 94.5 100 399.0 294.7 540.2 <10.0 7240.0 Fluarix PRE 98 85 86.7 78.4 92.7 26.1 20.5 33.2 <10.0 1280.0 PI(D21) 98 98 100 96.3 100 380.6 274.2 528.4 10.0 7240.0 FluLDI/1 PRE 99 61 61.6 51.'3 71.2 16.8 13.1 21.5 <10.0 453.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 276.2 223.5 341.3 28.0 5120.0 A/Wisconsin FluLD1/2 PRE 99 66 66.7 56:5 75.8 19.9 15.2 25.9 <10.0 640.0 PI(D21) 99 99 100 96:3 100 241.9 192.9 303.4 20.0 5120.0 Fluarix PRE 98 58 59.2 48:8 69.0 14.7 11.6 18.6 <10.0 320.0 PI(D21) 98 97 99.0 94:4 100 172.3 136.4 217.6 <10.0 5120.0 Anticuerpo Grupo Tiempo N = 101/DIL GMT Min Max CI95% 1/DL Cl 95% LL UL UL FluLDI/1 PRE 99 72 72.7 62.9 81.2 20.4 15.9 26.1 <10.0 453.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 268.6 221.3 326.0 28.0 2560.0 B/Malasia FluLDI/2 PRE 99 76 76.8 67.2 84.7 22.2 17.6 27.9 <10.0 320.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 301.5 246.1 369.4 28.0 3620.0 Fluarix PRE 98 76 77.6 68.0 85.4 26.5 20.9 33.6 <10.0 320.0 PI(D21) 98 97 99.0 94.4 100 219.2 171.4 280.2 <10.0 5120.0 FIULD1/1 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

FluLDI/2 Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con media dosis de adyuvante AS03.

Fluarix Vacuna Fluarix.

GMT Titulación media geométrica de anticuerpos.

N Número de sujetos con resultados disponibles. n% Número/porcentaje de sujetos seropositivos (titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) >= 1:10).

Cl 95% = Intervalo de confianza del 95 por ciento, LL = Límite inferior, UL = Límite superior.

MIN/MAX = Mínimo/Máximo.

PRE = Antes de la vacunación en el día 0.

Pl (D21) = Después de la vacunación en el día 21.

Tabla 11 Proporciones de las titulaciones medias geométricas (GMT) ajustadas entre grupos para cada cepa de vacuna en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) GMT GMT Descr. Descr.

Anticuerpo N ajusN ajusProporción deGM IT ajustada Grupo Grupo tada tada Orden de Valor Cl í Í5% Proporción LL UL FluLD1/1 A/Nueva FluLD1/1 99 472.4 FluLD1/2 99 385.0 1.23 0.80 1.88 /FluLD1/2 FluLD1/1 Caledonia FluLDI/1 99 472.3 Fluarix 98 396.9 1.19 0.78 1.82 /Fluarix FluLDI/2 (1/DIL) FluLD1/2 99 385.0 Fluarix 98 397.0 0.97 0.63 1.49 Fluarix FluLD1/1 A/Wisconsin FluLD1/1 99 277.3 FluLD1/2 99 230.0 1.21 0.90 1.62 FluLD1/2 GMT GMT Descr. Descr.

Anticuerpo N ajusN ajusProporción deGM T ajustada Grupo Grupo tada tada Orden de Valor Cl < Í5% Proporción LL UL FluLDI/ (1/DIL) FluLDI/1 99 277.5 Fluarix 98 180.8 1.54 1.14 2.06 /Fluarix FluLDI/2 FluLD /2 99 230.0 Fluarix 98 180.6 1.27 0.95 1.71 /Fluarix FluLDI/1 B/Malasia FluLD1/1 99 275.1 FluLD1/2 99 303.4 0.91 0.68 1.22 /FluLDI/2 FluLD1/1 (1/DIL) FluLD1/1 99 275.2 Fluarix 98 212.7 1.29 0.96 1.74 /Fluarix FluLDI/2 FluLD1/2 99 303.4 Fluarix 98 212.6 1.43 1.06 1.92 /Fluarix Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con media dosis de adyuvante AS03.

Fluarix = Vacuna Fluarix.

GMT ajustada = titulación media geométrica de anticuerpos ajustada para la titulación de la línea base. N = Número de sujetos con resultados disponibles tanto antes como después de la vacunación.

Cl 95% = Intervalo de confianza del 95 por ciento para la proporción de la titulación media geométrica (GMT) ajustada (modelo Ancova: ajuste para la titulación de la línea base - variación reservada con más de 2 grupos); LL = límite inferior, UL = límite superior.

II 1.6.2 Factores de conversión de titulaciones de anticuerpos anti-inhibición de hemaglutinación (Hl), índices de seroprotección e índices de seroconversión (se correlaciona para la protección como se establece para la vacuna de influenza en los seres humanos) Los resultados se presentan en ía Tabla 6 - Figura 2 para los índices de seroprotección, Tabla 7 - Figura 3 para los índices de seroconversión, y Tabla 8 - Figura 4 para los factores de conversión.

En todos los grupos se alcanzó el umbral requerido por las Autoridades Europeas para los índices de seroprotección (70 por ciento) (cuando menos el 94.9 por' ciento). Para cada cepa de vacuna, los índices de seroprotección en el día 21 para los 3 grupos estuvieron dentro del mismo intervalo.

En todos los grupos se alcanzó el umbral requerido por las Autoridades Europeas para los índices de seroconversión (40 por ciento) (cuando menos el 65 por ciento).

Para la cepa de vacuna A/Nueva Caledonia, el índice de seroconversión (SCR) en el día 21 para los 3 grupos estuvo dentro del mismo intervalo.

Para la cepa de vacuna A/Wisconsin, el índice de seroconversión (SCR) en el día 21 para el grupo de FluLD1/1 tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix. El índice de seroconversión (SCR) en el día 21 para el grupo de FluLD1/2 estuvo dentro del mismo intervalo comparándose con el grupo de Fluarix.

Para la cepa de vacuna B/Malasia, el índice de seroconversión (SCR) en el día 21 para el grupo de FluLD1/2 tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix. El índice de seroconversión (SCR) en el día 21 para el grupo dé FluLD1/1 estuvo dentro del mismo intervalo comparándose con el grupo de Fluarix.

En todos los grupos se alcanzó el umbral requerido por las Autoridades Europeas para los factores de seroconversión (2.5) (cuando menos 6.2).

Para la cepa de vacuna A/Nueva Caledonia, el factor de seroconversión (SCF) en el día 21 para los 3 grupos pareció estar dentro del mismo intervalo. El valor observado para el grupo de FluLD1/2 fue más bajo que el valor observado para el grupo de Fluarix pero se pudo explicar by el índice de seroprotección antes de la vacunación más alto en el grupo de FluLD1/2.

Para la cepa de vacuna A/Wisconsin, el factor de seroconversión (SCF) en el día 21 para el grupo de FluLD1/1 tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix. El factor de seroconversion (SCF) en el día 21 para el grupo de FluLD1/2 estuvo dentro del mismo intervalo comparándose con el grupo de Fluarix.

Para la cepa de vacuna B/ alas¡a, el factor de seroconversion (SCF) en el día 21 para los dos grupos con adyuvante tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix.

Tabla 6 índices de seroprotección (SPR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) en el día 0 y en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) Cepa de Vacuna Grupo Tiempo N SPR Cl 95% n % LL UL A/Nueva FluLD1/1 PRE 99 41 41.4 31.6 51.8 Caledonia PI(D21) 99 95 96.0 90.0 98.9 FluLDI/2 PRE 99 55 55.6 45.2 65.5 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 Fluarix PRE 98 35 35.7 26.3 46.0 PI(D21) 98 93 94.9 88.5 98.3 Cepa de Vacuna Grupo Tiempo N SPR Cl 95% n % LL UL A/Wisconsin FluLDI/1 PRE 99 32 32.3 23.3 42.5 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 FluLDI/2 PRE 99 37 37.4 27.9 47.7 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 Fluarix PRE 98 25 25.5 17.2 35.3 PI(D21) 98 93 94.9 88.5 98.3 B/Malasia FluLDI/1 PRE 99 31 31.3 22.4 41.4 • PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 FluLD1/2 PRE 99 39 39.4 29.7 49.7 PI(D21) 99 98 99.0 94.5 100 Fluarix PRE 98 44 44.9 34.8 55.3 PI(D21) 98 94 95.9 89.9 98.9 FluLD1/1 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

FluLD1/2 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con media dosis de adyuvante AS03.

Fluarix = Vacuna Fluarix.

N = Número de sujetos con resultados disponibles. n/% = Número/porcentaje de sujetos seroprotegidos (titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) > = 40 1/DIL).

Cl 95% = Intervalo de confianza del 95 por ciento, LL = Límite inferior, UL = Límite superior.

PRE = Antes de la vacunación en el día 0.

Pl (D1) = Después de la vacunación en el día 21.

Fuente de datos = Apéndice, Tabla MIA.

Tabla 7 índice de seroconversión (SCR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemagl utinación (Hl) en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) FluLD 1 /1 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

FluLD1/2 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con media dosis de adyuvante AS03.

Fluarix = Vacuna Fluarix.

La seroconversión se define como: Para los sujetos inicialmente seronegativos, titulación de anticuerpos >= 40 1/DIL después de la vacunación Para los sujetos inicialmente seropositivos, titulación de anticuerpos después de la vacunación >= 4 veces la titulación de anticuerpos antes de la vacunación.

N = Número de sujetos con resultados antes y después de la vacunación disponibles. n/% = Número/porcentaje de sujetos seroconvertidos.

Cl 95% = Intervalo de confianza del 95 por ciento, LL = Límite inferior, UL = Límite superior.

Tabla 8 Factor de seroconversión (SCF) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) FluLD1/1 = Vacuna de influenza de dosis baja microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con media dosis de adyuvante AS03.

Fluarix = Vacuna Fluarix.

N = Número de sujetos con resultados antes y después de la vacunación disponibles.

SCF = Factor de seroconversión o proporción media geométrica (media[log10(PI(D21 )/PRE)]).

Cl 95% = Intervalo de confianza del 95 por ciento, LL = Límite inferior, ÚL = Límite superior.

III.7 Conclusiones de seguridad Una reactogenicidad más alta en términos de síntomas (locales/generales) inducidos, y síntomas no inducidos en los grupos de vacuna con adyuvante comparándose con el grupo de Fluarix fue la tendencia global observada en este estudio.

Una reducción del contenido 'de AS03 en la vacuna con adyuvante tiene un impacto significativo sobre todos los síntomas generales y locales de grado 3.

La presentación de síntomas no inducidos tendió a ser más alta en los grupos de vacuna con adyuvante (el 55 por ciento y el 47 por ciento de los sujetos), comparándose con el grupo de Fluarix (35 por ciento).

A partir de estos resultados, se puede concluir que el perfil de reactogenicidad y segu ridad de las vacunas cand idatas , es satisfactorio y cl ínicamente aceptable .

III.8. Conclusiones globales I I I .8.1 . Resultados de inmunogenicidad El objetivo primario de este estudio fue evaluar la respuesta inmunitaria humoral (titulaciones de anticuerpos anti-inhibición de hemaglutinación (H l)) provocada por la vacuna de influenza de dosis baja con dos diferentes concentraciones del adyuvante AS03, y con Fluarix.

En el d ía 21 , las tres vacunas excedieron los requerimientos de las Autoridades Europeas para el registro anual de las vacunas de influenza de virión disociado ("Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for I nfluenza Vaccines" para la evaluación inmunológica de los cambios anuales de la cepa CPM P/BWP/214/96) . Las titulaciones medias geométricas (G MT) tendieron a ser más altas en los grupos con adyuvante comparándose con el grupo de Fluarix, con una diferencia estad ísticamente significativa observada para las cepas de vacuna A/Wisconsin (FluLD 1 /1 contra Fluarix) , y B/Malasia (FluLD 1 /2 contra Fluarix) . Se observaron índices de seroprotección similares en los tres grupos de vacunas, en el intervalo desde el 94.9 por ciento hasta el 99 por ciento. Se observó que los índices de seroconversión y los factores de seroconversión fueron más altos en los grupos con adyuvante que en el grupo de Fluarix. Los datos a partir de este estudio también revelaron que la inmunogenicidad inducida por la vacuna con la mitad de la dosificación de adyuvante AS03 fue comparable con aquélla inducida con la dosis completa de adyuvante.

Hl.8.2. Resultados de reactogenicidad v seguridad La administración de la vacuna de influenza de dosis baja candidata con adyuvante AS03 fue segura y clínicamente bien tolerada en la población del estudio, es decir, en las personas adultas de entre 18 y 59 años de edad. La vacuna de media dosis con adyuvante mostró una disminución notoria en la incidencia de los síntomas locales y generales inducidos, comparándose con la vacuna de dosis completa con adyuvante.

Ejemplo IV Evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones BALB/c primeramente inoculados IV.1. Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones primeramente inoculados con influenza con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas humorales mediante AS03 inducidas por las vacunas de influenza formuladas con este adyuvante de aceite en agua. Para simular la situación en seres humanos, se condujo un experimento utilizando ratones primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas.

IV.1.1. Grupo de Tratamiento (Tabía 9) Los grupos de 27 ratones adultos hembras BALB/c se inocularon primeramente intranasalmente (volumen de 20 microlitros) en el día 0 con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (5 microgramos de hemaglutinina (HA) para cada cepa). Las cepas de primera inoculación consistieron en variantes desfasadas más tempranas (5 microgramos de H1N1 inactivado integral de hemaglutinina (HA) A/Johannesburg/82/96, H3N2 A/Sidney/5/97, B/Harbin/7/94) que aquéllas incluidas en la vacuna. Veintiocho días más tarde, los ratones se vacunaron con una sola dosis de la vacuna candidata intramuscularmente en un volumen total de 50 microlitros. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de dos dosis de AS03 (completas o medias). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron los antígenos virales de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shangdong/7/97 (1.5 microgramos/cepa, 1/10a parte de la dosis humana).

Tabla 9 Gr Antígeno / Formulación Otro Tratamiento Disociado trivalente / Llano (sin Primera inoculación 1 adyuvante) heteróloga DO 2 Disociado trivalente / AS03 Primera inoculación Gr Antígeno / Formulación Otro Tratamiento heteróloga DO Primera inoculación 3 Disociado trivalente / AS03 1/5 heteróloga DO IV.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X100, y Succinato de vitamina E (VES), se prepara con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microgramos/mililitro de Tween 80, 110 microgramos/mililitro de Tritón X100, y 100 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla se calculan tomando en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.

Preparación de un litro de regulador de suero concentrado 10 veces (PBS, pH de 7.4): A 0.800 litros de agua para inyecciones, se les agregan 80 gramos de NaCI, 2 gramos de KCI, 11.44 gramos de Na2HP04, 2 gramos de KH2P04. Después de la solubilización, se ajusta hasta 1.0 litro con agua para inyecciones. El pH estará en 7.4 cuando se diluya 10 veces.

Disociado trivalente / llano La formulación de una dosis de 50 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

Disociado trivalente /AS03 Una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X100, y Succinato de vitamina E (VES), se prepara con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microgramos/mililitro de Tween 80, 110 microgramos/mililitro de Tritón X100, y 100 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla se calculan tomando en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.

La formulación de una dosis de 50 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura .ambiente, + 1.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 25 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de dosis completa, ó 5 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de media dosis, 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

IV.1.3. Lecturas (Tabla 10) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió antes de la inmunización (día 28), y 14 días después de la inmunización (27 ratones/grupo), las muestras de suero se probaron mediante la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl).

Tabla 10 IV.2. Resultados IV.2.1. Inmunidad humoral Los resultados se presentan en las Figuras 5A-5C. En este modelo de ratón de primera inoculación hetero-subtípica seguida por una sola vacunación, se mostró que el AS03 y las diluciones del mismo inducían titulaciones más altas de inhibición de hemaglutinación (Hl), comparándose con la vacuna llana. Para todas las cepas de influenza A, se observó un aumento estadísticamente significativo de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) (p < 0.05). Para la cepa H1N1, también se observó una diferencia significativa en las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) entre el AS03 y el AS03 1/5 (p < 0.05). Una dosis reducida de AS03 fracasó para aumentar las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) para las tres cepas comparándose con la vacuna llana. Se observaron respuestas muy bajas contra la cepa B (B/Shangdong); esto probablemente se debe al desfasamiento antigénico significativo entre las cepas B utilizadas para la primera inoculación y la vacuna. IV.3. Sumario de resultados y conclusiones En conclusión, se observó un aumento en las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) en los animales primeramente inoculados con las cepas hetero-subtípicas cuando se utilizaron las vacunas con adyuvante AS03 comparándose con la vacuna llana. Una dosis completa de AS03 fue óptima para obtener titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) robustas contra las tres vacunas de cepas de influenza.

Ejemplo V Evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados V.1 . Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones primeramente inocu lados con influenza con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas humorales y celulares mediante las vacunas de influenza inducidas por AS03 formuladas con este adyuvante de aceite en agua .

Para simular la situación humana, se condujo un experimento utilizando ratones primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas.

V.1 .1 . Grupo de tratamiento (Tabla 1 1 ) Los g rupos de 25 ratones adultos hembras C57BI/6 se inocularon primeramente intranasalmente (volumen de 20 microlitros) en el d ía 0 con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (5 microgramos de hemaglutinina (HA) para cada cepa) . Las cepas de primera inoculación consistieron en variantes de desfasamiento más temprano (5 microgramos de H 1 N 1 inactivado integ ral de hemaglutinina (HA) A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panamá/2007/99, B/ Shangdong/7/97) que aq uéllas incluidas en la vacuna . Veintiocho días más tarde, los ratones se vacunaron con u na sola dosis de la vacuna candidata intramuscularmente en un volumen total de 1 00 microlitros. Los ratones se inmun izaron con formulaciones que conten ían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de tres dosis de AS03 (completa, 1 /2 ó 1 /5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos virales de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Nueva York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (1.5 microgramos/cepa, 1/10a parte de la dosis humana).

Tabla 11 V.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Disociado trivalente / Llano Las formulaciones para una dosis de 100 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (1.5 microgramos por cepa en la dosis final).

Disociado trivalente /AS03 Las formulaciones para una dosis de 100 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (1.5 microgramos por cepa en la dosis final) + 25 microlitros de emulsión SB62 para la dosis completa o 12.5 microlitros de emulsión SB 62 para la media dosis ó 5 microlitros de emulsión SB62 para la 1/5 de la dosis. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de la preparación.

V.1.3. Lecturas (Tabla 12) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió 21 días después de la inmunización (10 ratones/grupo), y las muestras de suero se probaron mediante la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl). La respuesta inmunitaria celular se probó 7 días después de la inmunización mediante teñido de citoquina intracelular (ICS).

Tabla 1 2 V.2. Resultados V.2.1 . Inmu nidad humoral (1 0 ratones/g rupo) .

Los resultados se presentan en la Figura 6. En este modelo de i ratón de primera inoculación hetero-subtípica seguida por una sola vacunación , se mostró que el AS03 y' las diluciones ( 1 /2 y 1 /5) del mismo inducían titulaciones más altas de inhibición de hemaglutinación (H l) comparándose con la vacuna llana . Para las tres cepas, no se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (H l) entre los ratones que recibieron la vacuna con adyuvante de una dosis completa AS03 o la dosis red ucida de AS03.

V.2.2. Inmu nidad celular (1 5 ratones/grupo) .

Los resultados se presentan en la Figura 7. Cualquiera que sea la dilución de AS03, se observaron respuestas de células-T CD4+ más altas en los ratones inmu nizados con la vacuna trivalente disociada con adyuvante AS03 com pará ndose con los ratones in m u nizados con llanos disociados trivalentes. Com pa rándose con la respuesta inducida en los ratones inm u nizados con disociado trivalente con adyuvante de una dosis com pleta de AS03, se observó una tendencia a tener respuestas celulares m ás bajas cuando los ratones se in m unizaron con disociado trivalente con adyuvante de dosis m ás bajas de AS03.

V.3. Sumario de resultados y conclusiones En conclusión , se observó un aumento en las respuestas humorales y celulares en los animales primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas cuando se utilizaron las vacunas con adyuvante AS03 comparándose con la vacuna llana. Se observó u na magnitud similar de la respuesta humoral entre los ratones inmunizados con la dosis completa o la dosis fraccionaria de adyuvante AS03. Sin embargo, una reducción en la dosis de adyuvante estuvo asociada con una tendencia a una magnitud reducida de la respuesta de células-T CD4+ .

Ejemplo VI - Evaluación pre-clínica de la respuesta inmunitaria celular i nducida por vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03 y una dosis baja de antígeno) en ratones C57BI/6 primeramente i noculados VI.1 . Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones primeramente inoculados con influenza con el objetó de evaluar el aumento en las respuestas inmunitarias celulares mediante AS03 inducido por vacunas de influenza que contenían una dosis baja de antígeno (0.5 microgramos/cepa, 1 /30a parte de la dosis humana), y formuladas con este adyuvante de aceite en agua.

Para simular la situación humana, se condujo un experimento utilizando ratones primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas.

VI .1.1. Grupo de tratamiento (Tabla 13) Los grupos de 15 ratones adultos hembras C57BI/6 se inocularon primeramente intranasalmente (volumen de 20 microlitros) en el día 0 con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (5 microgramos de hemaglütinina (HA) para cada cepa). Las cepas de primera inoculación consistieron en variantes de desfasamiento más temprano (5 microgramos de H1N1 inactivado integral de hemaglütinina (HA) A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panamá/2007/99, B/ Shangdong/7/97) que aquéllas incluidas en la vacuna. Veintiocho días más tarde, los ratones se vacunaron con una sola dosis de la vacuna candidata intramuscularmente en un volumen total de 50 microlitros. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de tres dosis de AS03 (completa, 1/2 ó 1/5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos virales de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Nueva York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (0.5 microgramos/cepa, 1/30a parte de la dosis h u ma na).

VI .1 .2. Preparación de las formulaciones de vacuna Disociado trivalente / llano Las formulaciones para una dosis de 50 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: ag ua para inyecciones + Reg ulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4, preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (0.5 m icrog ramos por cepa en la dosis final) .

Disociado trivalente /AS03 Las formulaciones para u na dosis de 50 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia : agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 1 0 veces, pH de 7.4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (0.5 microg ramos por cepa en la dosis final) + 25 microlitros de emulsión SB62 para la dosis completa, o 12.5 microlitros de emulsión SB 62 para la ½ dosis ó 5 microlitros de emulsión SB62 para la 1 /5 dosis. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seg uida del final de la preparación .

VI .1 .3. Lecturas (Tabla 14) La respuesta inmunitaria celular se probó 7 días después de la inmunización mediante teñido de citoquina intracelular.

Tabla 14 VI.2. Resultados Vl .2.1 . Inmunidad celular Los resultados se presentan en la Figura 8. Marginalmente se observaron respuestas de células-T C D4+ más altas en los ratones inm unizados con la vacuna disociada trivalente con adyuvante AS03 (completo o media dosis) , com parándose con los ratones inm un izados con llanos disociados trivalentes. Compará ndose con la respuesta ind ucida en los ratones in m u nizados con d isociado trivalente llano o con adyuvante de una dosis com pleta , o media dosis de AS03, se observa ron respuestas celulares m ás altas cuando los ratones se inm unizaron con disociado trivalente co n adyuvante de 1 /5 de la dosis de AS03.

VI.3. Sumario de resultados y conclusiones En conclusión , se observó un aumento mínimo en la respuesta de células-T CD4+s en los animales primeramente inoculados hetero-subtípicos cuando se utilizaron las vacunas con adyuvante AS03 comparándose con la vacuna llana. No se observó respuesta alguna a la dosis de adyuvante en este experimento, y en realidad , 1 /5 de la dosis de AS03 indujo frecuencias más alas de células-T CD4+ específicas del antígeno que lo que se vio con las dosis más altas de adyuvante . Sobre todo, estos datos no son consistentes con otros experimentos pre-clínicos, y pueden ser sugestivos de un problema técnico con este experimento en particular.

Ejem plo VII - Evaluación pre-clínica de vacunas de H5N 1 disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03 y antígeno) en ratones C57BI/6 puros VII .1 . Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones H5N1 puros con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas inmunitarias humorales y celulares mediante AS03 inducido por vacunas de H5N1 disociadas formuladas con este adyuvante de aceite en agua. En el caso de una pandemia, se espera que toda la población mundial sea inmunológicamente pura para la cepa de influenza pandémica de reciente circulación. Debido a este estado inmunitario puro, una vacuna para la pandemia probablemente requerirá de dos dosis de vacuna para proteger a los individuos de la infección y de la enfermedad grave causada por una nueva cepa de influenza. Para representar esta falta de exposición previa, se desarrolló un modelo de ratón puro para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna.

Vll.1.1. Grupo de tratamiento (Tabla 15) Los grupos de 15 ratones adultos hembras C57BI/6 puros se inmunizaron en los días 0 y 28 con la vacuna de H5N1 pandémica candidata intramuscularmente en un volumen total de 50 microlitros. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenían los antígenos de H5N1 disociados solos (H5N1 llano disociado), o con formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de diferentes dosis de AS03 (doble, completa, 1/2, ó 1/5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígeno viral H5N1 A / Vietnam / 1194/04 (1.5 ó 0.38 microgramos/cepa correspondientes a 1/10a parte de la dosis humana).

No se hizo formulación alguna con una dosis doble de AS03, sino más bien fue una inyección concomitante de 50 microlitros de H5N1 disociado/AS03 en dosis completa + una dosis de 50 microlitros de AS03.

Tabla 15 VI 1.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Preparación de un litro de regulador de volumen final (suero regulado con fosfato (PBS), pH de 7.2 + 0.2): A 0.800 litros de agua para inyecciones, se les agregan 7.699 gramos de NaCI, 0.200 gramos de KCI, 0.100 gramos de MgCI2 x 6H20, 2.600 gramos de Na2HP04 x 12 H20, 0.373 gramos de KH2P04. Después de la solubilización, se ajusta hasta 1.0 litro con agua para inyecciones H5N1 disociado / llano Preparación de una dosis de 50 microlitros: Se agregan Tiomersal (las cantidades son tomando en cuenta su concentración en la cepa), y Tritón X100 al regulador de volumen final. No se agrega Tween 80 a medida que se alcanza el contenido objetivo en la formulación mediante la concentración de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 368 microgramos/mililitro para el Tween 80, y de 35 microgramos/mililitro para el Tritón X100 en la dosis de formulación de 1.5 microgramos. Son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 93 microgramos/milil¡tro para el Tween 80, y de 8.9 microgramos/mililitro para el Tritón X100 in la dosis de formulación de 0.38 microgramos. Después de 5 a 30 minutos de agitación magnética, se agregan 1.5 ó 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA) (cepa H5N1). Las formulaciones se agitan durante 30 a 60 minutos. Se verifica el pH. Las inyecciones ocurren dentro de la hora en seguida del final de la formulación.

H5N1 disociado/ AS03 Preparación de una dosis de 50 microlitros: Se agregan Tiomersal (las cantidades son tomando en cuenta su concentración en la cepa) y Tritón X100 al regulador de volumen final. No se agrega Tween 80 a medida que se alcanza el contenido objetivo en la formulación mediante la concentración de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 368 microgramos/mililitro para el Tween 80, y de 35 microgramos/mililitro para el Tritón X100 en la dosis de formulación de 1.5 microgramos. Son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 93 microgramos/mililitro para el Tween 80, y de 8.9 microgramos/mililitro para el Tritón X100 en la dosis de formulación de 0.38 microgramos. Después de 5 a 30 minutos de agitación magnética, se agregan 1.5 ó 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA) (cepa H5N1). Después de 30 a 60 minutos de agitación magnética, se agregan 25 ó 12.5 ó 5 microlitros de emulsión SB62. Las formulaciones se agitan durante 30 a 60 minutos. Se verifica el pH. Las inyecciones ocurren dentro de la hora en seguida del final de la formulación VII.1.3. Lecturas (Tabla 16) La respuesta inmunitaria humoral se midió 14 días después de la inmunización (10 ratones/grupo) mediante las titulaciones de los anticuerpos anti-lg, IgG 1 e lgG2b (Figura 9, A-F). La respuesta inmunitaria humoral también se midió 21 días después de la inmunización (10 ratones/grupo) mediante el ensayo de inhibición de hemaglutinación anti-H5N1 (Figúralo, A-B).

La respuesta inmunitaria celular se probó 6 días después de la inmunización (5 reservas de 3 ratones por grupo) mediante teñido de citoquina intracelular (ICS) de células-T CD4+ específicas del antígeno numeradas mediante citometría de flujo (Figura 11, A-B).

Tabla 16 VII.2. Resultados VII.2.1. Respuesta inmunitaria humoral: ELISA e isotipos.

Los resultados se presentan en las Figuras 9A-9F.

En cada dosis de vacuna de H5N1 disociada, todos los grupos con adyuvante indujeron titulaciones de anticuerpos Ig, igG1 e lgG2b anti-H5N1 más altas, comparándose con la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante (Figuras 9 - A a F).

En cada dosis de vacuna de H5N1 disociada; la respuesta del anticuerpo de IgG 1 anti-H5N1 fue 4 a 5 veces más alta que la respuesta del anticuerpo de lgG2b anti-H5N1 (Figuras 9 - C a F). Con una dosis de 1.5 microgramos de hemaglutinina (HA) de la vacuna de H5N1 disociada, y combinada con cada dosis de adyuvante, no se observó diferencia alguna de las respuestas de los anticuerpos de Ig, IgG 1 e lgG2b anti-H5N1 (Figuras 9 - A, C y E).

Con una dosis de 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA) de la vacuna de H5N1 disociada, se obtuvo una tendencia a titulaciones de Ig anti-H5N1 más altas después de la inmunización con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante de 2 veces la dosis completa, comparándose con la respuesta inducida por la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03/2 (p = 0.7315), y AS03 1/5 (p = 0.9744) (Figura 9-B). También se observó esta tendencia para la respuesta del anticuerpo de IgG 1 anti-H5N1 (Figura 9-D). Sin embargo, la potencia no fue suficiente para observar una diferencia estadísticamente significativa (potencia del 25 por ciento para una diferencia de 1.7 veces, o del 47 por ciento para una diferencia de 2 veces).

VII.2.2. Respuesta inmunitaria humoral: Titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl).

Con una dosis de 1.5 microgramos de hemaglutinina (HA)/ ratones: En cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03 indujeron titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) más altas, comparándose con la respuesta obtenida en los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante (Figura 10-A). No se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) cuando la vacuna de H5N1 disociada tuvo el adyuvante con un intervalo de dosis de AS03 (Figura 10-A).

Con una dosis de 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA)/dosis En cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con la vacuna de H5N 1 disociada con adyuvante AS03 indujeron titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) más altas, comparándose con la respuesta obtenida en los ratones inmunizados con la vacuna de H5N 1 disociada sin adyuvante (Figura 1 0B) .

Se observaron titulaciones de inhibición de hemaglutinación (H l) significativamente más altas con la vacuna de H5N 1 disociada con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03, comparándose con la respuesta obtenida con la vacuna de H5N 1 disociada con adyuvante AS03/2 (p = 0.032 para una diferencia de 4 veces) (Figura 1 0B) .

No se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (H l) en los ratones inmunizados con vacuna de H5N 1 disociada con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03, o una dosis completa de AS03, o entre los ratones inmunizados con la vacuna de H5N 1 disociada con adyuvante AS03/2 o AS03/5 (Fig ura 1 0B) .

Comparación entre la dosis de antigeno (1.5 microgramos o 0.38 microgramos): No se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) entre los ratones inmunizados con cada dosis de hemaglutinina (HA) de la vacuna de H5N 1 disociada con adyuvante AS03, AS03/2 o AS03/5, excepto entre los ratones inmunizados con 1 .5 microgramos de H5N 1 disociada de hemaglutinina (HA) con adyuvante AS03/5, y los ratones inmunizados con 0.38 microgramos de H5N1 disociada de hemaglutinina (HA) con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03 (Figuras 10A-10B). Las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) fueron significativamente más altas en seguida de la inmunización con 0.38 microgramos de H5N1 disociada de hemaglutinina (HA) con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03, comparándose con la dosis de antígeno más alta combinado con la dosis de adyuvante más baja (1.5 microgramos de hemaglutinina (HA) con AS03/5, p = 0.0193 para el una diferencia de 4 veces) (Figuras 10A-10B).

VI 1.2.3. Respuesta inmunitaria celular Los resultados se presentan en las Figuras 11A-11B.

En cada dosis de vacuna de H5N1 disociada (1.5 ó 0.38 microgramos) se observaron respuestas de células-T CD4+ más altas en los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante de diferentes dosis de AS03, comparándose con los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante (Figuras 11A-11B).

En una dosis de 1.5 microgramos de vacuna de H5N1 disociada, una reducción de la dosis de AS03 correspondió a una disminución en las frecuencias de células-T CD4+ (Figura 11A). Sin embargo, en una dosis de 0.38 microgramos de vacuna de H5N1 disociada, no se observó diferencia alguna en la respuesta de células-T CD4 + s entre diferentes dosis de adyuvante en los ratones inmunizados con las vacunas de H5Ñ1 disociadas con adyuvante AS03 (Figura 11B)..

VII.3. Sumario de resultados y conclusiones Los estudios de inmunogenicidad en los ratones mostraron que la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante indujo respuestas humorales (ELISA de anti-H5N1 y titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl)) y celulares (CD4 + células-T) significativamente más altas que aquéllas inducidas por la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante.

No se observó ningún efecto de respuesta a la dosis de antígeno para la respuesta inmunitaria humoral entre los ratones inmunizados con 1.5 microgramos y 0.38 microgramos de vacuna de H5N1 disociada con adyuvante, sugiriendo que, en la presencia de adyuvante, se pueden requerir dosis todavía más bajas de hemaglutinina (HA) para observar un efecto de respuesta a la dosis en este modelo.

Se observó un fuerte incremento en la respuesta de células-T CD4+S en los ratones puros cuando se utilizaron las vacunas pandémicas de H5N1 con adyuvante' AS03, comparándose con la vacuna de H5N1 llana. No se observó impacto alguno de la dilución de AS03 cuando se utilizó una dosis de 0.38 microgramos de vacuna de H5N1 disociada como la vacuna candidata, mientras que se observó una disminución de las respuestas de células-T CD4 cuando se usaron 1.5 microgramos de la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03 en la dosis reducida.

Como se observó anteriormente, no se observó diferencia alguna en las respuestas inmunitarias humorales y celulares entre los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada (en cualquiera de las dosis de antígeno) con adyuvante de una dosis completa AS03 o con AS03/2. Se detectó alguna mejora en la respuesta inmunitaria cuando se utilizó 2 veces la dosis completa de AS03 en la formulación de vacuna y, de conformidad con lo anterior, se detectó una disminución en la respuesta inmunitaria cuando se utilizó AS03/5 en la formulación de vacuna.

Sobre todo, los datos reportados aquí apoyan la potencia de este novedoso sistema adyuvante en esta formulación de vacuna.

Ejemplo VIII - Evaluación pre-clínica de vacunas de influenza con adyuvante y sin adyuvante en cerdos Large White (Grandes Blancos) primeramente inoculados.

VIII.1. Diseño experimental y objetivo El experimento en los cerdos primeramente inoculados con influenza se llevó a cabo con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas humorales mediante las vacunas de influenza inducidas por AS03 formuladas con este adyuvante de aceite en agua.

Se utilizaron cerdos con el objeto de evaluar un intervalo de dosis de AS03 en un modelo animal cercano a los seres humanos. Los cerdos muestran una larga lista de analogías biológicas que establecen este animal como fisiológicamente el más cercano al hombre con muy pocas excepciones (Douglas R., 1972). Más aún, comúnmente se observa la manifestación de la infección por influenza en cerdos.

Vlll.1.1. Grupo de tratamiento (Tabla 17) Los grupos de 10 cerdos Large White (Grandes Blancos) adultos hembras se inocularon primeramente en el día 0 con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (25 microgramos de hemaglutinina (HA) para cada cepa) intranasalmente en un volumen total de 200 microlitros. Las cepas de primera inoculación consistieron en cepas homologas a las cepas de vacuna (25 microgramos de H1N1 inactivado integral de hemaglutinina (HA) A / Nueva Caledonia / 20/99, H3N2 A / Panamá / 2007/99 y B / Shangdong / 7/97). Veintiocho días más tarde, los cerdos se vacunaron con una sola dosis de la vacuna candidata intramuscularmente en un volumen total de 500 microlitros. Los cerdos se inmunizaron con formulaciones que contenían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de un intervalo de dosis de AS03 (completa, 1/2 o 1/5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos virales H1N1 A / Nueva Caledonia / 20/99, H3N2 A / Panamá / 2007/99 y B / Shangdong / 7/97 (15 microgramos de hemaglutinina (HA) para las cepas de H1N1 A / Nueva Caledonia / 20/99, H3N2 A / Panamá / 2007/99, y 17.5 microgramos para la cepa B / Shangdong / 7/97 como en una dosis humana).

Grupos (10 cerdos/grupo): Tabla 17 VI I I . 1 .2. Preparación de las formulaciones de vacuna Disociado trivalente / llano Se prepara una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X1 00, y Succinato de vitamina E (VES) , con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microg ramos/mililitro de Tween 80, de 1 10 microgramos/mililitro de Tritón X1 00, y de 1 00 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla toman en cuenta su contenido en las cepas.

La formulación de una dosis de 500 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Reg ulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 1 0 veces, pH de 7.4, preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 17.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

Disociado trivalente /AS03 Una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X100, y Succinato de vitamina E (VES), se prepara con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microgramos/mililitro de Tween 80, 110 microgramos/mililitro de Tritón X100, y 100 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla toman en cuenta su contenido en las cepas.

La formulación de una dosis de 500 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4, preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 17.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 250 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de dosis completa, o 125 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de media dosis, ó 50 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de media dosis, 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

VIII. .3 Lecturas (Tabla 18) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió antes de la primera inoculación intranasal (día 0) antes de la inmunización (día 28), y 14 días después de la inmunización (10 cerdos/grupo). Las muestras de suero se probaron mediante la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl).

Tabla 18 VIII.2. Resultados y conclusiones VI 11.2.1. Inmunidad humoral Los resultados se presentan en la Figura 12. Cualquiera que sea la dilución del adyuvante, las formulaciones trivalentes disociadas con adyuvante AS03 indujeron una respuesta de inhibición de hemaglutinación (Hl) más fuerte a todas las cepas que a la formulación trivalente llana en este modelo de primera inoculación homologa, aunque no siempre se alcanzó el significado estadístico para las tres cepas. Se observó un efecto de la dosis de adyuvante con ligeras diferencias de cepa a cepa. Para las cepas menos inmunogénicas, tales como B/Shangdong, solamente la vacuna disociada trivalente con adyuvante de una dosis completa de AS03 fue significativamente diferente de la vacuna llana. En contraste con la vacuna disociada trivalente con adyuvante de una dosis completa de AS03, una dosis reducida de AS03 fracasó para aumentar las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) para las tres cepas por arriba de las que se ven con la vacuna llana.

Ejemplo IX Inmunoqenicidad de los antígenos dPlv-PhtD-PD con adyuvante AS03 en diferentes diluciones.

IX.1 Experimento Lims 20080257 dPly (neumolisina destoxificada) y PhtD (proteína D triad de poli-histidina) son proteínas a partir de Streptococcus pneumoniae mientras que PD es proteína D a partir de Haemophilus influenzae. Los ratones C57bl se inmunizaron intramuscularmente tres veces (días 0, 14 y 28) con 1/10 de una dosis humana de dos lotes clínicos liofilizados de dPIy-PhtD-PD (DSPEA005A y 006A) con adyuvante en AS03A (250 microgramos de SB62) (Grupos 1 y 2). Se utilizó un lote pre-clínico líquido de dPIy-PhtD-PD en AS03A como vacuna de referencia (Grupo 3). También se evaluó el lote clínico DSPEA005 i reconstituido con AS03B (125 microgramos de SB62) y AS03C (62.5 microgramos de SB62) (Grupos 4 y 5). Finalmente, los dos lotes clínicos liofilizados reconstituidos con solución salina se inyectaron como comparadores con el objeto de medir el efecto del adyuvante sobre la respuesta inmunitaria inducida contra los antígenos dPly, PhtD, y PD (Grupos 6 y 7).

Los ratones se sangraron en el día 42, y se midió la respuesta del anticuerpo dirigida contra cada antígeno mediante ELISA. Los datos se presentan en las Figuras 13A-13C como GMC en microgramos/ mililitro.

Se demostró la consistencia de lo dos lotes clínicos de dPIy-PhtD-PD (DSPEA005A y 006A). No se: mostró impacto alguno de la liofilización (Grupos 1 y 2 contra Grupo 3). Se indujeron titulaciones de anticuerpos significativamente más altas contra todos los antígenos mediante las formulaciones de AS03 (Grupos 1 a 5) comparándose con las formulaciones sin adyuvante (Grupos 6 y 7). Excepto por PD en la formulación de AS03C (Grupo 5), no se observó una diferencia significativa en las titulaciones de anticuerpos inducidos contra cada antígeno mediante la formulación que contiene diferentes concentraciones de adyuvante (Grupos 1, 4 y 5)· IX.2 Experimento Lims 20080334-20080340 Los ratones C57bl se inmunizaron intramuscularmente tres veces (días 0, 14 y 28) con 1/10 de una dosis humana de los lotes clínicos liofilizados de dPIy-PhtD-PD (DSPEA006A) en diferentes concentraciones (15-15-15; 30-30-30 y 60-60-60 microgramos), y reconstituidos en solución salina o con adyuvante en AS03A (250 microgramos de SB62), AS03B (125 microgramos de SB62), y AS03C (62.5 microgramos de SB62).

Los ratones se sangraron en el día 42 y se midió la respuesta del anticuerpo dirigida contra cada antígeno mediante ELISA. Los datos se presentan en las Figuras 14A-14C como GMC en microgramos/ mililitro.

Se mostró un aumento significativo de las titulaciones de anticuerpos dirigidos contra todos los antígenos en la formulación que contenía AS03 (Grupos 1 a > 9), comparándose con las formulaciones que contenían solución salina solamente (Grupos 10 a 12). No se observó ningún impacto claro de la dosis de antígeno sobre la respuesta inmunitaria dirigida contra cada antígeno. No se observó ningún impacto significativo de la dilución del adyuvante sobre la respuesta del anticuerpo dirigida contra dPly y PhtD. Para PD, se observó una diferencia significativa entre AS03A y C en la concentración de antígeno de 3 y 6 microgramos.

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica, la cual comprende una proteína de Streptococcus pneumoniae no conjugada y una composición de adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 3 a 9 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de agente emulsionante, por dosis humana.

2. Una composición inmunogénica, la cual comprende una proteína de Streptococcus pneumoniae no conjugada y una composición de adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 3 a 9 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de agente emulsionante, por dosis humana.

3. Una composición inmunogénica, la cual comprende una proteína de Streptococcus pneumoniae no conjugada y una composición de adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua, la cual comprende uno o más inmunoestimulantes adicionales, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 3 a 9 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de agente emulsionante, por dosis humana.

4. Una composición de vacúna, la cual comprende una proteína de Streptococcus pneumoniae no conjugada y una composición de adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metaboiizable, de 3 a 9 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de agente emulsionante, por dosis humana.

5. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 1 a 10, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, ó de 5 a 6 miligramos (por ejemplo, de 2 a 3, de 5 a 6, ó de 9 a 10 miligramos) de aceite metaboiizable, por dosis humana.

6. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 4 a 8, de 5 a 7, ó de 5 a 6 miligramos de tocol, por dosis humana.

7. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.1 a 5, de 0.2 a 5, de 0.3 a 4, de 0.4 a 3 ó de 2 a 3 miligramos (por ejemplo, de 0.4 a 1.2, de 2 a 3, ó de 4 a 5 miligramos) de agente emulsionante, pór dosis humana.

8. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde la cantidad de aceite metaboiizable es de 5.35 miligramos, por dosis humana.

9. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde la cantidad de aceite metaboiizable es de 2.14 miligramos, por dosis humana.

10. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, en donde la cantidad de tocol es de 5.94 miligramos, por dosis humana. '

11. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, en donde la cantidad de tocol es de 2.38 miligramos, por dosis humana.

12. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad de agente emulsionante es de 2.425 miligramos, por dosis humana.

13. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, en donde la cantidad de agente emulsionante es de 0.97 miligramos, por dosis humana.

14. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, en donde el aceite metabolizable es escualeno.

15. Una composición inmunogénica como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el tocol es alfa-tocoferol.

16. Una composición inmunogénica como se reclama en cualquiera de reivindicaciones 1 a 15, en donde el agente emulsionante es mono-oleato de sorbitán de polioxietileno.

17. Una composición inmunogénica como se reclama en la reivindicación 16, en donde el mono-oleato de sorbitán de polioxietileno se selecciona a partir del grupo que comprende: Polisorbato® 80 ó Tween® 80.

18. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el volumen de la composición de vacuna es de entre 0.4 y 1.5 mililitros.

19. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el volumén de dosis mencionado es de 0.5 mililitros.

20. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el volumen de dosis mencionado es de 0.7 mililitros.

21. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el volumen de dosis mencionado es de 1.0 mililitro.

22. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde la proteína de Streptococcus pneumoniae no conjugada se selecciona a partir del grupo que consiste en PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, neumolisina, LytB, LytC, LytA, Sp125, SP101, Sp128, Sp130, Sp133, o las proteínas que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6699703, incluyendo las proteínas de S. pneumoniae representadas o codificadas por las SEQ ID NOs: 5225, 5200, 3166, 4360, 5137, 4263, 3166, 5226, 3716, 4360, 5243, 3964, 5179. 3850, 4263, 5137, 5226, 5325, 3850, 5179 Ó 5325 de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6699703, o los equivalentes inmunológicamente funcionales de las mismas.

23. La composición inmunogénica de la reivindicación 22, la cual comprende 2 o más proteínas no conjugadas.

24. La composición inmunogénica de la reivindicación 23, la cual comprende la PhtD neumocócica no conjugada y la neumolisina neumocócica no conjugada.

25. Un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neumocócica, el cual comprende administrar a un paciente que sufra de, o que sea susceptible a, una infección o enfermedad neumocócica, una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

26. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una infección o enfermedad neumocócica.

27. El uso de una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en la elaboración de un medicamento para utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una infección o enfermedad neumocócica.

28. El uso de la reivindicación 27, en donde la composición de adyuvante comprende además uno o más inmunoestimulantes.