CN102099052A - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含肺炎链球菌抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳状液，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂。

Description

疫苗
技术领域
本发明涉及改良的疫苗和免疫原性组合物和它们在医学中的应用。具体地，本发明涉及包含水包油乳状液佐剂的疫苗或免疫原性制剂和它们在医学中的应用，尤其是它们在增强对不同抗原(包括肺炎链球菌抗原)的免疫应答中的应用，也涉及制备方法，其中所述水包油乳状液包含母育酚、可代谢油和乳化剂。
背景技术
总是需要具有提高的免疫原性的新组合物或疫苗。作为一个策略，已经将佐剂用于试验和提高对任意特定抗原产生的免疫应答和/或减少宿主中的致反应力/毒性。
水包油乳状液本身是本领域熟知的，且已经被提议用作佐剂组合物(EP 399843；WO 95/17210)。
WO95/17210公开了包含2-10％角鲨烯、2-10％α生育酚和0.3-3％吐温80的水包油乳状液和它们单独的或与QS21和/或3D-MPL组合的应用。
WO99/12565公开了包含可代谢油、皂苷和固醇的水包油乳状液组合物。所述水包油乳状液另外包含3D-MPL。
WO99/11241公开了包含可代谢油和皂苷的水包油乳状液，其中所述油和皂苷以1∶1至200∶1的比例存在。
仍然需要改良的疫苗和免疫原性组合物，其提供合适的免疫应答，且在宿主中的致反应力更低。
发明内容
发明人已经发现，可以使用包含更低量的水包油乳状液的每种组分的疫苗或免疫原性组合物，同时仍然维持对所述组合物内的抗原或抗原性组分的相当免疫应答。它的优点是，维持对抗原的免疫原性水平，同时降低宿主受体内的致反应力。
因此，在本发明的第一个方面，提供了包含肺炎链球菌抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳状液，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂。
在本发明的另一个方面，提供了包含肺炎链球菌抗原和佐剂组合物的疫苗组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳状液，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂。
在本发明的另一个方面，提供了包含肺炎链球菌抗原和佐剂组合物的疫苗或免疫原性组合物在生产用于治疗、缓解或预防肺炎链球菌感染或疾病的免疫原性组合物中的应用，所述佐剂组合物包含水包油乳状液，其中所述水包油乳状液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂。
在另一个方面，提供了上文定义的方法或应用，用于保护免于病原体造成的感染或疾病，所述病原体是免疫原性组合物中的抗原的来源病原体的变体。在另一个实施方案中，提供了上文定义的方法或应用，用于保护免于病原体造成的感染或疾病，所述病原体包含抗原，该抗原是免疫原性组合物中的抗原的变体。
附图说明
图1：临床试验：在不同时间点的抗-HA抗体的几何平均滴度(GMT)(免疫原性的ATP队列)。
图2：临床试验：在第0天和第21天时具有95％置信区间的HI抗体滴度的血清保护率(SPR)(免疫原性的ATP队列)。
图3：临床试验：在第21天时具有95％置信区间的HI抗体滴度的血清转化率(SCR)(免疫原性的ATP队列)。
图4：临床试验：在第21天时具有95％置信区间的HI抗体滴度的血清转化系数(SCF)(免疫原性的ATP队列)。
图5：小鼠试验：用异亚型菌株(剂量范围AS03)引发的BALB/c小鼠中的血凝素抑制实验(GMT+/-IC95)。图5A：抗-A/新喀里多尼亚/20/99HI滴度；图5B：抗-A/巴拿马/2007/99HI滴度.图5C：抗-B/山东/7/97HI滴度。
图6：小鼠试验：用异亚型菌株(剂量范围AS03)引发的C57Bl/6小鼠中的血凝素抑制实验(GMT+/-IC95)。
图7：小鼠试验：用异亚型菌株(剂量范围AS03)引发的C57Bl/6小鼠的PBMC中的细胞免疫应答(CD4+T细胞)。
图8：小鼠试验：用异亚型菌株引发并用剂量范围AS03佐剂化的低剂量抗原(0.5μg)免疫的C57Bl/6小鼠的PBMC中的细胞免疫应答(CD4+T细胞)。
图9：小鼠试验：2种不同抗原剂量免疫后第14天的H5N1-特异性的血清Ig ELISA滴度(A和B)和抗-H5N1IgG1(C和D)和IgG2b(E和F)同种型应答(GMT+/-IC95)：1.5μg(A、C和E)或0.38μg(B、D和F)。
图10：小鼠试验：2种不同抗原剂量免疫后第21天的血凝抑制实验(GMT+/-IC95)：1.5μg(A)或0.38μg(B)。
图11：小鼠试验：用剂量范围AS03佐剂化的不同剂量的H5N1疫苗(1.5或0.38μg)免疫的首次用于实验的C57Bl/6小鼠中的细胞免疫应答(CD4+T细胞)：(A)1.5μg HA Ag(抗原)或(B)0.38μg HA Ag(抗原)。
图12：猪试验。用同源菌株(剂量范围AS03)引发的猪中的血凝素抑制实验(GMT+/-IC95)。
图13：小鼠试验。通过ELISA在C57bl小鼠中测量的体液免疫应答，所述小鼠用在含有250、125或62.5μg SB62的AS03佐剂中的各3μg dPly、PhtD和蛋白D免疫。
图14：小鼠试验。通过ELISA在C57bl小鼠中测量的体液免疫应答，所述小鼠用在含有250、125或62.5μg SB62的AS03佐剂中的6、3或1.5μgdPly、PhtD和蛋白D免疫。
发明详述
发明人意指，在每种情况下，本文的术语“包含”和“包括”可任选地用术语“由......组成”替换。
本文中关于本发明的“疫苗组合物”的实施方案也适用于关于本发明的“免疫原性组合物”的实施方案，反之亦然。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含抗原或抗原组合物和佐剂组合物的疫苗或免疫原性组合物，所述佐剂组合物由水包油乳状液组成，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含抗原或抗原组合物和佐剂组合物的疫苗或免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳状液，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油(诸如角鲨烯)、0.5-11mg母育酚(诸如α-生育酚和0.4-4mg乳化剂(诸如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)。
水包油乳状液组分
本发明的佐剂组合物包含水包油乳状液佐剂，优选地所述乳状液包含量为0.5-10mg的可代谢油、量为0.5-11mg的母育酚和量为0.4-4mg的乳化剂，且具有油滴，其中至少70％(按强度计算)的油滴具有小于1μm的直径。
为了使任意水包油组合物适合人施用，乳状液系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的意思在本领域是公知的。可代谢被定义为“能被代谢作用转化的”(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版(1974))。该油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，这些油对受体是无毒的，并且能被代谢作用转化。坚果、种子和谷物是植物油的常用来源。合成油也是本发明的一部分，并且可包括商品油如和其它。一种特别合适的可代谢油是角鲨烯。角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是被发现在鲨鱼肝油中大量存在而在橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中较少量存在的不饱和油，并且是适用于本发明的一种特别优选的油。角鲨烯是可代谢油，这依据了角鲨烯是胆固醇生物合成过程中的中间体的事实(Merck index，第10版，条目号8619)。
合适地，可代谢油存在于佐剂组合物中，其量为0.5-10mg、优选1-10、2-10、3-9、4-8、5-7、或5-6mg(例如2-3、5-6、或9-10mg)、尤其是5.35mg或2.14mg。在本发明的另一个实施方案中，可代谢油存在于疫苗(或免疫原性的)组合物中，其量为0.5-10mg、优选1-10、2-10、3-9、4-8、5-7、或5-6mg(例如2-3、5-6、或9-10mg)、尤其是5.35mg或2.14mg。
可代谢油在疫苗或免疫原性组合物中的量可以表示为总组合物的百分比。合适地，可代谢油存在于疫苗组合物中，其量为总组合物体积的0.5％-2％、优选0.25-2或0.25-1.75或0.5-1.65或0.6-1.5或0.8-1.4或1-1.25％(v/v)油。
在另一个具体实施方案中，可代谢油以疫苗(或免疫原性的)组合物总体积的约1.25％的最终量存在。在另一个具体实施方案中，可代谢油以总组合物体积的0.25％(v/v)的最终量存在。
作为澄清，通过应用下述转化系数，可以将以v/v给出的浓度转换成以w/v计算的浓度：5％(v/v)角鲨烯浓度相当于4.28％(w/v)角鲨烯浓度。
水包油乳状液包含母育酚。母育酚是本领域熟知的，且描述在EP0382271中。合适地，母育酚是α-生育酚或其衍生物，诸如琥珀酸α-生育酚酯(也称作维生素E琥珀酸酯)。所述母育酚合适地存在于佐剂组合物中，其量为0.5-11mg、优选1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6(例如10-11、5-6、2.5-3.5或1-3mg)。在一个具体的实施方案中，母育酚以5.94mg或2.38mg的量存在。在另一个实施方案中，母育酚合适地存在于疫苗(或免疫原性的)组合物中，其量为0.5-11mg、优选1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6(例如10-11、5-6、2.5-3.5或1-3mg)。在一个具体的实施方案中，母育酚以5.94mg或2.38mg的量存在。
母育酚的量可以表示为总疫苗或免疫原性组合物体积的百分比。合适地，母育酚存在于疫苗组合物中，其量为免疫原性组合物总体积的0.25％-2％(v/v)，优选地0.25-2包含总体积的0.25-2或0.25-1.75或0.5-1.65或0.6-1.5或0.8-1.4或1-1.25％(v/v)的母育酚。
优选地母育酚以疫苗(或免疫原性的)组合物总体积的0.2％至2％(v/v)的量存在，更优选地量为0.5ml剂量体积中的1.25％(v/v)。
在一个具体的实施方案中，母育酚以疫苗或免疫原性组合物总体积的约1.25％的最终量存在。在另一个具体实施方案中，母育酚以总体积的0.25％(v/v)、或0.5ml剂量体积中的1.25％(v/v)、或0.7ml剂量体积中的0.9％(v/v)、或0.5ml剂量中的0.5％(v/v)、或0.7ml疫苗或免疫原剂量中的0.35-0.37％、优选0.36％的最终量存在。
作为澄清，通过应用下述转化系数，可以将以v/v给出的浓度转换成以w/v计算的浓度：5％(v/v)α-生育酚浓度相当于4.8％(w/v)α-生育酚浓度。
水包油乳状液另外包含乳化剂。乳化剂可以合适地是聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。在一个具体的实施方案中，乳化剂可以选自包含下列的组：聚山梨醇酯
Figure BPA00001277879100051
80或吐温80。
所述乳化剂合适地存在于佐剂组合物中，其量为0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或2-3mg(例如0.4-1.2、2-3或4-5mg)乳化剂。在一个具体的实施方案中，乳化剂以0.97mg或2.425mg的量存在。
另外，所述乳化剂合适地存在于疫苗或免疫原性组合物中，其量为0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或2-3mg(例如0.4-1.2、2-3或4-5mg)乳化剂。在一个具体的实施方案中，乳化剂以0.97mg或2.425mg的量存在。
乳化剂的量可以表示为总疫苗或免疫原性组合物体积的百分比。合适地，乳化剂存在于疫苗(或免疫原性的)组合物中，其量为组合物总体积的0.125-0.8％(v/v)，优选总体积的0.08-.05或0.1-0.7或0.2-0.6或0.25-0.55或0.3-0.52或0.4-0.5％(v/v)。在一个具体的实施方案中，乳化剂以总疫苗或免疫原性组合物体积的1％、0.5％或0.2％(v/v)的量存在。
作为澄清，通过应用下述转化系数，可以将以v/v给出的浓度转换成以w/v计算的浓度：1.8％(v/v)聚山梨醇酯80浓度相当于1.91％(w/v)聚山梨醇酯80浓度。
在一个具体的实施方案中，0.5ml疫苗或免疫原剂量体积含有0.45％(v/v)吐温80，0.7ml剂量体积含有0.315％(v/v)吐温80。在另一个具体的实施方案中，0.5ml剂量含有0.18％(v/v)乳化剂，0.7ml疫苗或免疫原性组合物剂量含有0.126％(v/v)乳化剂。
术语“人剂量”是指其体积适合人用的剂量。通常，这是在0.25至1.5ml之间。在一个实施方案中，人剂量是0.5ml。在另一个实施方案中，人剂量高于0.5ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1ml。在另一个实施方案中，人剂量是在1ml至1.5ml之间。在另一个实施方案中，具体地，当免疫原性组合物用于儿科人群时，人剂量可以小于0.5ml，诸如在0.25至0.5ml之间。本发明的特征在于，免疫原性组合物内的佐剂的每种或所有单个组分的水平比以前认为有用的水平更低，且典型地是如上所述。特别合适的组合物包含下述量的下述佐剂组分，它们是在0.5ml的人剂量终体积中：
表1
Figure BPA00001277879100071
本发明另外提供了佐剂组合物，其包含上述量的上述各个组分，例如但非排它地如表1所示。通常，这样的佐剂组合物是人剂量合适的体积。在佐剂是要与液体形式的抗原性组分相组合的液体形式的情况下，佐剂组合物是人剂量合适的体积，它是人剂量的预期终体积的一部分，例如人剂量的预期终体积的约一半，例如350μl体积(对于0.7ml的预期人剂量)或250μl体积(对于0.5ml的预期人剂量)。当与抗原组分相混合以提供疫苗的最终人剂量时，稀释佐剂组合物。这样的剂量的终体积当然随佐剂组合物的初始体积和加入佐剂组合物中的抗原组分的体积而变化。在一个替代实施方案中，使用液体佐剂来重配冻干的抗原组分。在该实施方案中，佐剂组合物的人剂量合适的体积大约等于人剂量的终体积。将液体佐剂组合物加入装有冻干的抗原组分的瓶中。最终的人剂量可以是在0.5至1.5ml之间。
产生水包油乳状液的方法是本领域技术人员众所周知的。通常，所述方法包括将含母育酚的油相与表面活性剂例如PBS/吐温80TM溶液混合，然后用均化器均化，包括使所述混合物两次通过注射器针头的方法适合于将小体积液体均化，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。同样地，本领域技术人员可修改在微流化装置(microfluidiser)(M110S微流体机器，最多为50次通过，在6巴的最大压力输入下2分钟的时间段(输出压力为约850巴))中的乳化方法以产生更小体积或更大体积的乳状液。这种修改可通过常规实验完成，所述实验包括：测量所得乳状液，直到得到具有所需直径的油滴的制剂。在水包油乳状液中，油和乳化剂应该在水性载体中。水性载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水。
优选地，本发明的水包油乳状液系统具有在亚微米范围内的小油滴尺寸。合适地，微滴尺寸是在直径120至750nm的范围内，更优选直径从120至600nm的尺寸。最优选地，水包油乳状液含有这样的油滴，其中至少70％(按强度计算)的直径小于500nm、更优选至少80％(按强度计算)的直径小于300nm、更优选至少90％(按强度计算)的直径是在120至200nm的范围内。
根据本发明的油滴尺寸(即直径)是按强度计算。有几种确定油滴尺寸直径(按强度计算)的方法。使用尺寸测量仪器，合适地，通过动态光散射诸如Malvern Zetasizer 4000或优选Malvern Zetasizer 3000HS，测量强度。在实施例II.2中，给出了详细操作。第一种可能是，通过动态光散射(PCS-光子相联光谱学)测定z平均直径ZAD；该方法另外给出了多分散性指数(PDI)，且用累积量算法计算ZAD和PDI。这些值不需要颗粒折射率的知识。第二种方法是，通过另一种算法Contin或NNLS或自动化的“Malvern”算法(由尺寸测量仪器提供的默认算法)测定测定整体粒度分布，计算油滴的直径。在大多数情况下，复合组合物的颗粒折射率是未知的，仅考虑强度分布，且如果必要，强度平均值源自该分布。
任选的免疫刺激剂
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含抗原或抗原组合物和佐剂组合物的疫苗或免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳状液和任选的一种或更多种其它免疫刺激剂，其中所述水包油乳状液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂。
在一个实施方案中，佐剂组合物包含本文所述的油和水乳状液。在另一个实施方案中，佐剂组合物可以另外包含一种或更多种其它佐剂或免疫刺激剂。在另一个实施方案中，佐剂组合物任选地包含一种或更多种除了QS21和/或MPL以外的其它佐剂或免疫刺激剂。
任选的其它佐剂选自：皂苷、脂质A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸、金属盐、toll-样受体激动剂或其组合。优选地，佐剂是Toll样受体激动剂，特别是Toll样受体2、3、4、7、8或9的激动剂，或皂苷。进一步优选地，所述佐剂系统包含来自上述列表的两种或更多种佐剂。组合优选地含有皂苷(特别是QS21)佐剂和/或Toll样受体4激动剂(诸如3D-MPL)或Toll样受体9激动剂(诸如含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸)。其它优选的组合包含皂苷(特别是QS21)和Toll样受体4激动剂诸如皂苷(特别是QS21)和Toll样受体4配体诸如3D-MPL或烷基氨基葡糖苷磷酸。
在一个实施方案中，其它佐剂是Toll样受体(TLR)4配体，优选激动剂，例如脂质A衍生物、特别是单磷酰基脂质A，或更特别的是3脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MPL)。
3D-MPL可从GlaxoSmithKline Biologicals North America在商标
Figure BPA00001277879100091
下得到，主要促进IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞应答。它可以根据在GB 2 220 211 A中公开的方法产生。化学上，它是3-脱酰基单磷酰基脂质A与3、4、5或6酰化的链的混合物。优选地，在本发明的组合物中，使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有一定的颗粒大小，使它可以通过0.22μm过滤器无菌过滤。在国际专利申请号WO 94/21292中描述了这种制品。脂质A的合成衍生物是已知的，被认为是TLR 4激动剂，包括但不限于：
OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸)，(WO 95/14026)
OM 294 DP(3S，9R)-3--[(R)-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-二(二氢磷酸)(WO99/64301和WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-二氢磷酸10-(6-氨基己酸)(WO 01/46127)
可以使用的其它TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸(AGP)，例如在WO9850399或US6303347中公开的那些(还公开了制备AGP的过程)，或US6764840中公开的AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，一些是TLR4拮抗剂。认为这两种都可用作佐剂。
能通过TLR-4造成信号传递应答(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)的其它合适的TLR-4配体是，例如，来自革兰氏阴性细菌的脂多糖和它的衍生物或其片段，特别是LPS的无毒衍生物(诸如3D-MPL)。其它合适的TLR激动剂是：热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性剂蛋白A、透明质烷寡糖、硫酸类肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防卫素-2、胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP60、70或90。
Toll-样受体(TLR)是I型跨膜受体，在昆虫和人之间是进化上保守的。迄今已经建立了10种TLR(TLR 1-10)(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。TLR家族的成员具有类似的细胞外和细胞内结构域；已经证实，它们的胞外结构域具有富含亮氨酸的重复序列，且它们的细胞内结构域与白介素-1受体(IL-1R)的细胞内区域类似。在免疫细胞和其它细胞(包括血管上皮细胞、脂肪细胞、心肌细胞和肠上皮细胞)中，TLR细胞差别化表达。TLR的细胞内结构域可以与衔接蛋白Myd88相互作用，后者也在它的细胞质区域中具有IL-1R结构域，导致细胞因子的NF-KB活化；该Myd88途径是TLR活化影响细胞因子释放的一种途径。TLR的主要表达是在诸如抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬细胞等)等细胞类型中。
TLR的刺激对树突细胞的活化，导致树突细胞的成熟和诸如IL-12等炎性细胞因子的生成。迄今进行的研究已经发现，TLR会识别不同类型的激动剂，尽管有些激动剂对于几种TLR是共同的。TLR激动剂主要源自细菌或病毒，包括诸如鞭毛蛋白或细菌脂多糖(LPS)等分子。
“TLR激动剂”是指，能通过TLR信号传递途径造成信号传递应答的组分，无论是作为直接配体还是间接地通过内源性或外源性配体的产生(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。
在另一个实施方案中，将TLR分子的其它天然的或合成的激动剂用作任选的其它免疫刺激剂。它们包括、但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。
在本发明的一个实施方案中，使用能通过TLR-1造成信号传递应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。合适地，能通过TLR-1造成信号传递应答的TLR激动剂选自：三酰化的脂肽(LP)；苯酚-可溶的调控蛋白；结核分枝杆菌LP；S-(2，3-二(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸化物(Pam3Cys)LP(它模仿细菌脂蛋白的乙酰化的氨基末端)，和来自伯氏疏螺旋体的OspA LP。
在一个替代实施方案中，使用能通过TLR-2造成信号传递应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。合适地，能通过TLR-2造成信号传递应答的TLR激动剂是下述的一种或更多种：来自结核分枝杆菌、伯氏疏螺旋体、苍白密螺旋体的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌在内的物种的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟球菌孔蛋白、细菌纤毛、耶尔森氏菌致病因子、CMV病毒体、麻疹血球凝集素和来自酵母的酵母聚糖。
在一个替代实施方案中，使用能通过TLR-3造成信号传递应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。合适地，能通过TLR-3造成信号传递应答的TLR激动剂是：双链RNA(dsRNA)或聚肌苷酸聚胞苷酸(聚IC)，与病毒感染有关的分子核酸形式。
在一个替代实施方案中，使用能通过TLR-5造成信号传递应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。合适地，能通过TLR-5造成信号传递应答的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。
在一个替代实施方案中，使用能通过TLR-6造成信号传递应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。合适地，能通过TLR-6造成信号传递应答的TLR激动剂是：分支杆菌脂蛋白、二酰化的LP和苯酚-可溶的调控蛋白。在WO2003043572中描述了其它TLR6激动剂。
在一个替代实施方案中，使用能通过TLR-7造成信号传递应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。合适地，能通过TLR-7造成信号传递应答的TLR激动剂是：单链RNA(ssRNA)、洛索立宾、在N7和C8位的鸟苷类似物、或咪唑并喹啉化合物、或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特。在WO02085905中描述了其它TLR7激动剂。
在一个替代实施方案中，使用能通过TLR-8造成信号传递应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)。合适地，能通过TLR-8造成信号传递应答的TLR激动剂是：单链RNA(ssRNA)，具有抗病毒活性的咪唑并喹啉分子，例如瑞喹莫德(R848)；瑞喹莫德也能被TLR-7识别。可以使用的其它TLR-8激动剂包括在WO2004071459中描述的那些。
也可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它Toll-样受体(TLR)9激动剂。用于本发明的佐剂或疫苗或免疫原性组合物中的优选的寡核苷酸是含CpG的寡核苷酸，优选含有由至少三个、更优选至少六个或更多核苷酸分隔的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸继之以鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。在优选的实施方案中，在寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯、或更优选硫代磷酸酯键，但是磷酸二酯和其它核苷酸间键也在本发明的范围内。在本发明的范围内还包括，具有混合的核苷酸间连键的寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中。
优选的寡核苷酸的实例具有以下序列。该序列优选地含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸间连键。
寡核苷酸1(SEQ ID NO：1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
寡核苷酸2(SEQ ID NO：2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
寡核苷酸3(SEQ ID NO：3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
寡核苷酸4(SEQ ID NO：4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
寡核苷酸5(SEQ ID NO：5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
寡核苷酸6(SEQ ID NO：6)：TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)
备选的CpG寡核苷酸可以包含上述优选的序列，在其中具有不重要的删除或添加。在本发明中利用的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法(例如参见EP 468520)合成。方便地，这种寡核苷酸可以利用自动化合成仪合成。
因此，在另一个实施方案中，佐剂组合物另外包含其它免疫刺激剂，其选自：TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂或其组合。
用于本发明中的另一种优选的免疫刺激剂是Quil A和它的衍生物。Quil A是分离自南美树木Quilaja Saponaria Molina的皂苷制品，最初于1974年由Dalsgaard等人描述具有佐剂活性(″Saponinadjuvants″，Archiv.für die gesamte Virusforschung，Vol.44，SpringerVerlag，Berlin，p243-254)。已经通过HPLC分离了纯化的Quil A片段，其保持佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)。QS-21是来自Quillaja saponariaMolina的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和优势的IgG2a抗体应答，且是本发明的上下文中优选的皂苷。
已经描述了特别优选的特定QS21制剂，这些制剂进一步包含固醇(WO96/33739)。当包括角鲨烯和皂苷(任选QS21)时，在制剂中也包括固醇(任选胆固醇)会有益处，因为这允许降低乳状液中的总油水平。这将导致生产成本降低，疫苗的总舒适度提高以及所产生的免疫应答在数量和质量上的提高，例如IFN-γ产量的提高。因此，本发明的佐剂系统典型地包含比例范围从200∶1到300∶1的可代谢油∶皂苷(w/w)，本发明也可以以“低油”的形式使用，其任选的范围是1∶1-200∶1，任选20∶1-100∶1，或基本上48∶1，此疫苗保留了所有组分的有利佐剂特性，并且致反应力特征大大降低。因此，有些实施方案具有比例范围是1∶1至250∶1、或20∶1至200∶1、或20∶1至100∶1、或基本上48∶1的角鲨烯∶QS21(w/w)。任选地，也包括固醇(例如胆固醇)，并以本文所述的皂苷∶固醇比例存在。
抗原和抗原组合物
疫苗或免疫原性制剂含有能引起针对人或动物病原体的免疫应答的肺炎链球菌抗原。当肺炎链球菌抗原是蛋白时，所述蛋白任选地缀合至例如糖类。任选地，蛋白是未缀合的，或作为游离蛋白存在于免疫原性组合物中。未缀合的蛋白没有共价结合作为载体蛋白的糖类。
在本发明的一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含肺炎链球菌蛋白，后者任选地是聚组氨酸三联体家族(Pht，polyhistidine triadfamily)蛋白，其片段或其融合蛋白或其免疫功能等效物中的成员。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白的氨基酸序列可以与公开于WO 00/37105或WO 00/39299中的序列(例如对于PhtD蛋白，与WO 00/37105的SEQ ID NO：4的氨基酸序列1-838或21-838)具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE中的2、3或4种的全长或者片段组成。融合蛋白的实例是PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E.PhtD/A.PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中这些蛋白与提及的前者在N-末端连接(参见例如WO01/98334)。
当使用Pht蛋白的片段(分别使用或作为融合蛋白的一部分使用)时，每个片段任选包含一个或更多个组氨酸三联体基序和/或这些多肽的卷曲螺旋区。组氨酸三联体基序是具有序列HxxHxH的多肽的一部分，其中H是组氨酸，x是非组氨酸的氨基酸。卷曲螺旋区是由“Coils”算法(Lupus，A等(1991)Science 252；1162-1164)预测的区域。在一个实施方案中，该片段或各个片段包含一个或更多个组氨酸三联体基序以及至少一个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，该片段或各个片段包含恰好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序(任选地，在两个或更多个三联体之间包含天然Pht序列，或者包含与天然肺炎链球菌三联体内Pht序列具有超过50、60、70、80、90或100％同一性的三联体内序列——例如示于WO 00/37105中SEQ ID NO：4的PhtD的三联体内序列)。在一个实施方案中，该片段或各个片段包含恰好或至少2、3或4个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，本文公开的Pht蛋白包括：连接了信号序列的全长蛋白、移除了信号肽(例如N-末端的20个氨基酸)的成熟全长蛋白、Pht蛋白的天然变体以及Pht蛋白的免疫原性片段(例如前文描述的片段，或者包含WO00/37105或WO00/39299的氨基酸序列中至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够诱导针对WO00/37105或WO00/39299中所述氨基酸序列的特异性免疫应答)。
具体地，本文使用的术语“PhtD”包括：连接了信号序列的全长蛋白、移除了信号肽(例如N-末端的20个氨基酸)的成熟全长蛋白、PhtD的天然变体以及PhtD的免疫原性片段(例如，前文描述的片段，或者包含WO00/37105或WO00/39299的PhtD氨基酸序列中至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够诱导针对WO00/37105或WO00/39299中的所述PhtD的氨基酸序列(例如对于PhtD而言，WO 00/37105中的SEQ ID NO：4)的特异性免疫应答。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少1种选自下述的蛋白：聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含2种或更多种选自以下的蛋白：聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含2种或更多种选自以下的蛋白：聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)和Sp128。
Pht(聚组氨酸三联体)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族的特征为：脂化序列；被富含脯氨酸区域和若干组氨酸三联体分开的两个结构域，其可能参与金属或核苷结合活性或酶活性；(3-5个)卷曲螺旋区、保守的N末端和异质的C末端。它存在于所有检测过的肺炎链球菌菌株中。在其它的链球菌和奈瑟氏菌中也发现了同源蛋白。在本发明的一个实施方案中，本发明的Pht蛋白是PhtD。但是，应该理解，术语Pht A、B、D和E指的是：具有以下引用文献中所公开的序列的蛋白，以及与参比蛋白具有至少90％同一性的序列同源性的其天然的(和人造的)变体。任选地，它具有至少95％同一性或至少97％同一性。
关于PhtX蛋白，PhtA在WO 98/18930中公开，并且也被称为Sp36。如上所述，它是来自聚组氨酸三联体家族的蛋白，并具有LXXC的II型信号基序。PhtD在WO 00/37105中公开，并且也被称为Sp036D。如上所述，它也是来自聚组氨酸三联体家族的蛋白，并具有II型LXXC信号基序。PhtB在WO 00/37105中公开，并且也称为Sp036B。PhtB家族的另一个成员是C3降解性多肽，在WO 00/17370中公开。该蛋白也是来自聚组氨酸三联体家族，并具有II型LXXC信号基序。例如，免疫功能等效物是公开于WO 98/18930中的Sp42蛋白。PhtB截短物(大约79kD)在WO99/15675中公开，其也被认为是PhtX家族成员。PhtE在WO00/30299中公开，并且称为BVH-3。当本文提及任何Pht蛋白时，是指可以使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提及的PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提及的PhtD或PhtB也是提及如在例如WO0198334中发现的PhtDE或PhtBE融合体。
肺炎链球菌溶血素是一种具有不同溶细胞(溶血)活性和补体激活活性的多功能毒素(Rubins等人，Am.Respi.Cit Care Med，153：1339-1346(1996))。该毒素并不由肺炎链球菌分泌，但它在自溶素的影响下裂解肺炎链球菌时释放。其作用包括，例如刺激人单核细胞产生炎性细胞因子、抑制人呼吸道上皮的纤毛摆动、和降低嗜中性粒细胞的杀菌活性和迁移。肺炎链球菌溶血素最明显的作用在于裂解红细胞，其包括结合胆固醇。因为它是毒素，所以在它可以体内施用之前去毒(即，当以适于保护的剂量提供时对人无毒)。野生型或天然肺炎链球菌溶血素的表达和克隆为本领域所知。参见，例如，Walker等人(Infect Immun，55：1184-1189(1987))，Mitchell等人(Biochim BiophysActa，1007：67-72(1989)和Mitchell等人(NAR，18：4010(1990))。ply的去毒通过化学手段实施，例如经过福尔马林或戊二醛处理或两者的组合(WO 04081515、PCT/EP2005/010258)。用于各种毒素的这些方法是本领域所熟知的。或者，可以将ply遗传地去毒。因此，本发明包括肺炎链球菌蛋白的衍生物，其可以是例如突变的蛋白。本文使用的术语“突变的”是指，使用已熟知的用于定点突变的技术或任何其它常规方法，使其经历了一个或更多个氨基酸缺失、插入或替换的分子。例如，如前文所描述的，可以改变突变型ply蛋白，致使其无生物活性同时仍保留其免疫原性表位，参见，例如，WO90/06951，Berry等人(Infect Immun，67：981-985(1999))和WO99/03884。
如本文所使用的，应该明白术语“Ply”指的是适合医药应用(即无毒的)的突变型或去毒型肺炎链球菌溶血素。
关于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族的成员最初被确定为可以通过胆碱亲和色谱法纯化的肺炎链球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白与细胞壁磷壁酸的以及膜相关脂磷壁酸的磷酰胆碱部分非共价结合。在结构上，它们在整个家族中具有若干共同的区域，尽管这些蛋白的确切性质(氨基酸序列、长度等)可以不同。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区域(N)、保守的重复区(R1和/或R2)、脯氨酸富集区(P)以及由包含了约该蛋白一半的多个重复序列组成的保守胆碱结合区(C)。正如在本申请中所使用的，术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自：在WO97/41151中公开的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA在WO97/41151中公开。CbpD和CbpG在WO00/29434中公开。PspC在WO97/09994中公开。PbcA在WO98/21337中公开。SpsA是在WO 98/39450中公开的胆碱结合蛋白。任选地，胆碱结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
本发明的一个实施方案包含CbpX截短物，其中“CbpX”在上文有定义，而“截短物”指的是缺少50％或以上胆碱结合区(C)的CbpX蛋白。任选地，这种蛋白缺少整个胆碱结合区。任选地，这种蛋白截短物缺少：(i)胆碱结合区和(ii)蛋白N-末端一半的一部分，但保留至少一个重复区(R1或R2)。任选地，截短物具有2个重复区(R1和R2)。这种实施方案的实例是在WO99/51266或WO99/51188中说明的NR1×R2和R1×R2，但是，缺少类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白同样意图包括在本发明的范围内。
LytX家族是与细胞裂解有关的膜相关蛋白。N-末端结构域包含一个或复数个胆碱结合结构域，但是LytX家族并不具有前文所述的在CbpA家族中发现的所有特征，因此对于本发明来说，LytX家族被认为有别于CbpX家族。与CbpX家族相比，C-末端结构域含有LytX蛋白家族的催化结构域。该家族包括LytA、B和C。关于LytX家族，在Ronda等人，Eur J Biochem，164：621-624(1987)中公开了LytA。LytB在WO 98/18930中公开，并且也称为Sp46。LytC同样在WO 98/18930中公开，并且也称为Sp91。本发明的一个实施方案包含LytC。
另一个实施方案包含LytX截短物，其中“LytX”如上文定义，而“截短物”指的是缺少50％或以上胆碱结合区的LytX蛋白。任选地，这些蛋白缺少整个胆碱结合区。本发明的再一个实施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)。任选地，其包含CbpX的NR1×R2(或R1×R2)和LytX的C-末端部分(Cterm，即缺少胆碱结合结构域)(例如，LytCCterm或Sp91Cterm)。任选地，CbpX选自：CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任选地，它是CbpA。任选地，LytX是LytC(也称为Sp91)。本发明另一个实施方案是PspA、或缺少胆碱结合结构域(C)并作为含有LytX的融合蛋白表达的PsaA截短物。任选地，LytX是LytC。
关于PsaA和PspA，均为本领域所知。例如，PsaA和其跨膜缺失变体已经由Berry和Paton，Infect Immun 1996Dec；64(12)：5255-62描述。PspA和其跨膜缺失变体已经在例如US 5804193、WO 92/14488和WO 99/53940中公开。
Sp128和Sp130在WO00/76540中公开。Sp125是具有LPXTG(其中X是任何氨基酸)的细胞壁锚定基序的肺炎链球菌表面蛋白的实例。该类别肺炎链球菌表面蛋白中具有该基序的任何蛋白已被发现在本发明的上下文中是有用的，因此被认为是本发明的另一蛋白。Sp125自身在WO 98/18930中公开，并且也被称为ZmpB(一种锌金属蛋白酶)。Sp101在WO 98/06734中公开(其中它参考编号为#y85993)。其特征是I型信号序列。Sp133在WO 98/06734中公开(其中它参考编号为#y85992)。其特征同样是I型信号序列。
本发明的蛋白也可以有益地联合。联合是指：免疫原性组合物包含来自以下组合中的所有蛋白，所述蛋白作为载体蛋白、作为游离蛋白或者作为两者的混合物。例如，如下文中所陈述的两种蛋白的组合中，这两种蛋白可以作为载体蛋白使用；或者两种蛋白可以作为游离蛋白存在；或者两者可以作为载体和作为游离蛋白存在；或一种可以作为载体蛋白和游离蛋白存在，同时另一种仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白存在，或一种可以作为载体蛋白存在，而另一种作为游离蛋白存在。当给出三种蛋白的组合时，存在类似的可能性。组合包括但不限于：PhtD+NR1×R2、PhtD+NR1×R2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1×R2、PhtA+NR1×R2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1×R2+LytC、NR1×R2+PspA、NR1×R2+PsaA、NR1×R2+Sp128、R1×R2+LytC、R1×R2+PspA、R1×R2+PsaA、R1×R2+Sp128、R1×R2+PhtD、R1×R2+PhtA。任选地，NR1×R2(或R1×R2)来自CbpA或PspC。任选地，其来自CbpA。其它组合包括3种蛋白的组合，例如PhtD+NR1×R2+Ply、以及PhtA+NR1×R2+PhtD。在一个实施方案中，疫苗组合物包含去毒型肺炎链球菌溶血素以及作为载体蛋白的PhtD或PhtDE。在另一个实施方案中，疫苗组合物包含去毒型肺炎链球菌溶血素和作为游离蛋白的PhtD或PhtDE。
例如通过保护测定法，诸如在实施例15中描述的保护测定法，检测抗PhtD或其融合蛋白的有效免疫应答。在用异种的菌株攻击之后7天，有效免疫应答提供至少40％、50％、60％、70％、80％或90％存活率。考虑到攻击菌株是异种的，所赋予的保护作用归因于抗PhtD或其融合蛋白的免疫应答。
或者，用如实施例14中描述的ELISA检测抗PhtD的有效免疫应答。有效免疫应答产生至少250、300、350、400、500、550或600μg/mlGMC的抗PhtD IgG应答。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含肺炎链球菌溶血素。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含在US6699703中公开的肺炎链球菌蛋白，例如，具有US6699703的序列SEQ ID NO 1-5326的肺炎链球菌蛋白，或由该序列编码的肺炎链球菌蛋白。
在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物包含不是在PCT/EP2007/060743中公开的肺炎链球菌蛋白。
本发明另外提供了疫苗，其含有本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含选自下述的肺炎链球菌蛋白：PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、LytB、LytC、LytA、Sp125、SP101、Sp128、Sp130、Sp133，或在US6699703中公开的蛋白，包括由US6699703的SEQ ID NO：5225、5200、3166、4360、5137、4263、3166、5226、3716、4360、5243、3964、5179、3850、4263、5137、5226、5325、3850、5179或5325表示或编码的肺炎链球菌蛋白，或其免疫功能等效物。免疫功能等效物包括与所述序列具有至少80、90、95、98或99％同一性的序列。免疫功能等效物也包括具有至少6、10、20、30、40或50个来自所述序列的连续氨基酸的片段。免疫功能等效物能引起识别天然抗原的免疫应答。
疫苗接种
借助于通过全身途径或粘膜途径施用所述疫苗，含有本发明免疫原性组合物的疫苗制剂可以用于保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些施用可以包括通过肌内、腹膜内、真皮内或皮下途径注射；或通过粘膜施用到口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量给药，但其组分也可以于同一时间或不同时间共同施用(例如可以同时地或在施用疫苗的任何细菌蛋白组分1-2周后，分开施用肺炎链球菌糖缀合物，使两者相互之间的免疫应答达到最佳协同)。此外，本发明的疫苗对于引发剂量可以肌内施用，而对于增强剂量可以IN施用。
疫苗中的蛋白抗原含量典型地在1-100μg、优选5-50μg、最典型地5-25μg的范围。在初次疫苗接种之后，受试者可接受一次或几次适当间隔的加强免疫。
疫苗制备一般地描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”)(Powell M.F.& Newman M.J.编)(1995)Plenum Press纽约)中。在脂质体中的包囊化描述于Fullerton的美国专利4,235,877中。
本发明的疫苗可保存在溶液中或者冻干。优选地，在存在诸如蔗糖或乳糖等糖的情况下冻干溶液。还进一步优选的是，将它们冻干，在使用之前临时重配。
在本发明的一个方面，提供了疫苗试剂盒，其包含装有本发明的免疫原性组合物(任选地以冻干形式)的瓶子，且另外包含装有本文所述佐剂的瓶子。预见到，在本发明的该方面，佐剂将用于重配冻干的免疫原性组合物。
尽管本发明的疫苗可通过任何途径给药，但是将所述疫苗施用到皮肤中(ID)构成本发明的一种实施方案。人体皮肤包含外部“角质的”外皮，称为角质层，它覆盖表皮。在该表皮之下是称为真皮的层，它又覆盖皮下组织。研究人员已经证明，疫苗注射进皮肤中，特别是真皮中，刺激了免疫应答，这也可能与许多另外的优点相关联。用本文描述的疫苗进行的真皮内接种构成本发明的优选特征。
真皮内注射的常规技术“mantoux方法”包括如下步骤，清洁皮肤，然后用一只手拉胀，用窄规针(26-31规格)朝向针上部的斜面以10-15°的角度插入。一旦针的斜面插入，就降低针管，进一步推进，同时提供低压以在皮肤下抬高它。然后极慢地注射液体从而形成皮肤表面上的疱或隆起，接着慢慢抽出针。
更为近来，已经描述了特别地设计来将液体试剂施用于到皮肤中或穿过皮肤的设备，例如描述于WO 99/34850和EP 1092444中的设备，以及描述于例如WO 01/13977；US 5,480,381、US 5,599,302、US5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO97/13537中的快速注射设备。真皮内施用疫苗制剂的作为选择的方法可包括常规注射器和针，或者设计来冲击递送固体疫苗的设备(WO99/27961)，或者透皮贴剂(WO 97/48440；WO 98/28037)；或者施加到皮肤表面上(经皮或经皮肤的递送WO 98/20734；WO 98/28037)。
当将本发明的疫苗施用于皮肤时，或者更特别地施用于真皮中时，疫苗是较低的液体体积，特别是在大约0.05ml和0.2ml之间的体积。
本发明的皮肤或真皮内疫苗中抗原的含量可以类似于肌内疫苗中存在的常规剂量(见上文)。但是，皮肤或经皮疫苗的一个特征是，制剂可以是“低剂量”。因此，“低剂量”疫苗中的蛋白抗原优选存在为每剂仅仅0.1到10μg，优选每剂0.1到5μg；糖类(优选缀合的)抗原可以在每剂0.01-1μg的范围内存在，优选每剂0.01-0.5μg糖类。
本文使用的术语“真皮内递送”意指将疫苗递送到皮肤中的真皮区域。但是，疫苗将不必全部位于真皮中。真皮是位于距离人体皮肤表面大约1.0和大约2.0mm之间的皮肤层，但是在个体之间以及身体不同部分中存在一定量的变化。通常，可预期的是通过到达皮肤表面下1.5mm来到达真皮。真皮位于表面的角质层和表皮以及下面的皮下层之间。根据递送模式，疫苗可能最终完全或主要位于真皮中，或者它可能最终分布在表皮和真皮中。
每个疫苗剂量中每种抗原的量选择为，诱导免疫保护性的应答但没有典型疫苗的显著不良副作用的量。这样的量会随采用的具体免疫原和它的存在形式而变化。
在另一个实施方案中，提供了通过施用基本上如本文描述的组合物来治疗个体的方法，所述个体对疾病易感或患有疾病。
也提供了防止个体感染疾病的方法，包括向所述个体施用基本上如本文描述的组合物，所述疾病选自：传染性细菌和病毒疾病，寄生虫疾病，特别是细胞内病原性疾病、增殖性疾病，例如前列腺、乳腺、结肠直肠、肺、胰腺、肾脏、卵巢或黑素瘤癌症；非癌症慢性失调，过敏症。
在另一个实施方案中，提供了用于预防性治疗或治疗病症或疾病的疫苗组合物，其中疫苗组合物包含抗原或抗原组合物和由水包油乳状液组成的佐剂组合物，所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂。
在另一个实施方案中，提供了疫苗组合物在生产药剂中的应用，所述药剂用于预防性治疗或治疗病症或疾病，其中疫苗组合物包含抗原或抗原组合物和由水包油乳状液组成的佐剂组合物，所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂。
将结合下面的非限制性实施例进一步描述本发明：
实施例I描述了在小鼠、雪貂、猪和人试验中使用的免疫学读出方法。
实施例II描述了在举例的试验中使用的水包油乳状液和佐剂制剂的制备。
实施例III显示了用含有裂解流感抗原制剂和不同剂量的AS03佐剂的疫苗在18-59岁的成年群体中进行的临床试验。
实施例IV显示了佐剂化的和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂)在引发的(primed)BALB/c小鼠中的临床前评价。
实施例V显示了佐剂化的和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂)在引发的C57Bl/6小鼠中的临床前评价。
实施例VI显示了佐剂化的和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂和低剂量抗原)在引发的C57Bl/6小鼠中的临床前评价。
实施例VII显示了佐剂化的和未佐剂化的裂解H5N1疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂和抗原)在首次用于实验的C57Bl/6小鼠中的临床前评价。
实施例VIII显示了佐剂化的和未佐剂化的流感疫苗在引发的大白猪中的临床前评价。
实施例I——免疫学读出方法
I.1.小鼠方法
I.1.1.血凝抑制实验
实验原理(经典程序)。
使用血凝抑制实验(HI)，测定对3种(季节性的)流感病毒株的抗-血凝素抗体滴度。HI实验的原理是基于特异性的抗-流感抗体抑制流感病毒血凝素(HA)的红细胞(RBC)的血凝集的能力。用高岭土和RBC处理热灭活的血清，以去除非特异性的抑制剂。预处理后，将血清的2倍稀释液与4个血凝集单位的每种流感株一起温育。然后加入红细胞，对凝集的抑制评分。将滴度表示为完全抑制血凝集的最高血清稀释度的倒数。由于第一个血清稀释度是1∶20，将不可检测的水平评分为等于10的滴度。
适应H5N1(使用马红细胞的HI的具体描述)：
由于据文献记载，用于测定抗-HA抗体的经典HI测定法对于H5N1株不能很好地起作用，采用了使用马RBC的适应性方案。
将马红细胞用于H5N1大范围流行株。使用在含有0.5％BSA(牛血清白蛋白，终浓度)的磷酸盐缓冲液中的0.5％(终浓度)马红细胞悬浮液。通过用相同的磷酸盐缓冲液洗涤红细胞，并随后离心(10min、2000rpm)，每天制备该悬浮液。该洗涤步骤必须重复一次。将马红细胞加入血清和病毒悬浮液的反应混合物以后，由于马红细胞的低沉降率，必须在室温(RT、20℃±2℃)温育平板2小时。
统计分析
使用UNISTAT，对疫苗接种后HI滴度进行统计分析。用于分析差异的方案可以简述如下：
◆数据的对数变换
◆对每个群体(组)进行Shapiro-Wilk检验，以便验证组的正态分布
◆Cochran检验，以便验证不同群体(组)之间的差异均一性
◆在选择的数据上进行差异分析
◆检验双因素ANOVA的相互作用
◆进行多重对比的Tukey-HSD检验
I.1.2.细胞内细胞因子染色
该技术允许在细胞因子生产的基础上定量抗原特异性的T淋巴细胞：效应T细胞和/或效应记忆T细胞生产IFN-γ，和/或中心记忆T细胞生产IL-2。在免疫后第7天收获PBMC。
在有分泌抑制剂(Brefeldine)存在下，在体外重新刺激淋巴样细胞。
然后使用荧光抗体(CD4、CD8、IFN-γ和IL-2)，通过常规免疫荧光操作，处理这些细胞。将结果表示为CD4/CD8T细胞内细胞因子阳性细胞的频率。在第二次免疫后7天，对PBMC进行T细胞的细胞因子的细胞内染色。从小鼠收集血液，并合并在肝素盐化的介质RPMI+Add中。对于血液，根据推荐的方案(在2500rpm和室温离心20min)，将RPMI+Add-稀释的PBL悬浮液在Lympholyte-Mammal梯度上分层。取出在界面处的单核细胞，在RPMI+Add中洗涤2次，在RPMI 5％胎牛血清中将PBMC悬浮液调至2x106细胞/ml。
用Whole FI(1μgHA/株)，以终浓度1x107细胞/ml(试管FACS)，进行PBMC的体外抗原刺激，然后在加入抗-CD28和抗-CD49d(二者都是1μg/ml)的情况下，在37℃温育2小时。
抗原重新刺激步骤后，在有布雷菲德菌素(1μg/ml)存在下，在37℃温育PBMC过夜，以抑制细胞因子分泌。
如下进行IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色：洗涤细胞悬浮液，重新悬浮于50μl含有2％Fc封闭剂(1/50；2.4G2)的PBS 1％FCS中。在4℃温育10min后，加入50μl抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8perCp(3/50)的混合物，并在4℃温育30min。在PBS 1％FCS中洗涤后，通过重新悬浮于200μlCytofix-Cytoperm(Kit BD)中，使细胞透化，并在4℃温育20min。然后用Perm Wash(Kit BD)洗涤细胞，并用50μl在Perm Wash中稀释的抗-IFN-γAPC(1/50)+抗-IL-2FITC(1/50)混合物重新悬浮。在4℃温育最少2h、最多过夜后，用Perm Wash洗涤细胞，并重新悬浮于PBS 1％FCS+1％低聚甲醛中。通过FACS进行样品分析。将活细胞门控(FSC/SSC)，并在CD4+T细胞上获取约20,000个(淋巴细胞)或35,000个事件。在CD4+和CD8+门控的群体上，计算IFN-γ+或IL2+的百分比。
I.1.3.抗-H5N1ELISA。
使用裂解H5N1作为覆盖层，通过ELISA定量抗-H5N1 Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度。以100μl/孔，使用病毒和抗体溶液。以在PBS中1μg/ml的终浓度，稀释裂解病毒H5N1，并在4℃过夜吸附至96孔微量滴定板(Maxisorb Immunoplate Nunc 439454)的孔上。然后用200μl/孔的含有1％BSA和0.1％吐温20(饱和缓冲液)的PBS，在37℃温育平板1小时。将12份血清在饱和缓冲液中的2倍稀释液加入H5N1-包被的平板，并在37℃温育1小时30分钟。用PBS 0.1％吐温20洗涤平板4次。将在PBS1％BSA 0.1％吐温20中1/500稀释的生物素标记缀合的抗-小鼠Ig(Prozan-E0413)或生物素标记缀合的抗-小鼠IgG1(Imtech 1070-08)、或1/4000稀释的生物素标记的抗-小鼠IgG2b(Imtech 1090-08)加入每个孔，并在37℃温育1小时30分钟；洗涤步骤后，用在PBS 1％BSA吐温20中1/10000稀释的抗生蛋白链菌素-生物素-过氧化物酶缀合物(ProzanP0397)温育平板30min。
对于比色显示，用在0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 4.2中的邻苯基二胺(Sigma P4664)0.04％H2O20.03％溶液在22℃温育平板20min。用H2SO42N终止反应，并在490-630nm读出微板。
I.2.雪貂方法
I.2.1.血凝抑制实验(HI)
实验程序。
使用血凝抑制实验(HI)，测定对3种流感病毒株的抗-血凝素抗体滴度。HI实验的原理是基于特异性的抗-流感抗体抑制流感病毒血凝素(HA)的鸡红细胞(RBC)的血凝集的能力。首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理血清，并热灭活，以去除非特异性的抑制剂。预处理后，将血清的2倍稀释液与4个血凝集单位的每种流感株一起温育。然后加入鸡红细胞，对凝集的抑制评分。将滴度表示为完全抑制血凝集的最高血清稀释度的倒数。由于第一个血清稀释度是1∶10，将不可检测的水平评分为等于5的滴度。
统计分析。
使用UNISTAT，对HI滴度(第41天，攻击前)进行统计分析。用于分析差异的方案可以简述如下：
◆数据的对数变换
◆对每个群体(组)进行Shapiro-Wilk检验，以便验证组的正态分布
◆Cochran检验，以便验证不同群体(组)之间的差异均一性
◆检验单因素ANOVA的相互作用
◆进行多重对比的Tuckey-HSD检验
I.2.2.体温监视
通过遥测记录，在递质攻击阶段中监视个体温度。检查并整修所有植入物，在放入腹膜内腔之前，通过DSI(Data Sciences International，Centaurusweg 123，5015 TC Tilburg，荷兰)进行新的校准。在这些测量期间，将所有动物单个地圈养在单个笼子中。
在攻击前4天至攻击后7天，每隔15分钟记录温度。
I.2.3.鼻洗液
通过在醒着的动物的2个鼻孔中施用5ml PBS，得到鼻洗液。将接种物收集在培养皿中，并放入在干冰上的样品容器中。
鼻洗液中的病毒滴定
首先通过Spin X过滤器(Costar)，将所有鼻样品无菌过滤，以去除任何细菌污染。将50μl鼻洗液的系列10-倍稀释液转入含有50μl培养基(10孔/稀释液)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4x105细胞/ml)加入每个孔，并在35℃温育5-7天。
温育5-7天后，轻轻取出培养基，加入100μl含有1/20WST-1的培养基，并温育另外18小时。
在病毒滴定测定结束时，活细胞在WST-1还原后生成的黄色formazan染料的强度与孔中存在的活细胞的数目成比例，并通过测量每个孔在适当波长(450纳米)的吸光度，进行定量。将截止值定义为未感染的对照细胞的OD平均值——0.3OD(0.3OD对应着未感染的对照细胞的OD+/-3标准偏差)。当OD＜截止值时，定义为正评分，相反，当OD＞截止值时，定义为负评分。通过“Reed和Muench”测定病毒脱落滴度，并表示为Log TCID50/ml。
I.3.猪方法
I.3.1.血凝抑制实验(HI)
实验程序。
使用血凝抑制实验(HI)，测定对3种流感病毒株的抗-血凝素抗体滴度。HI实验的原理是基于特异性的抗-流感抗体抑制流感病毒血凝素(HA)的鸡红细胞(RBC)的血凝集的能力。首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理血清，并热灭活，以去除非特异性的抑制剂。预处理后，将血清的2倍稀释液与4个血凝集单位的每种流感株一起温育。然后加入鸡红细胞，对凝集的抑制评分。将滴度表示为完全抑制血凝集的最高血清稀释度的倒数。由于第一个血清稀释度是1∶10，将不可检测的水平评分为等于5的滴度。
统计分析。
使用UNISTAT，对HI滴度(第41天，攻击前)进行统计分析。用于分析差异的方案可以简述如下：
◆数据的对数变换
◆对每个群体(组)进行Shapiro-Wilk检验，以便验证组的正态分布
◆Cochran检验，以便验证不同群体(组)之间的差异均一性
◆检验单因素ANOVA的相互作用
◆进行多重对比的Tuckey-HSD检验
I.4.用于评估在人中的免疫应答的测定
I.4.1.血凝集抑制测定
使用WHO流感合作中心(WHO Collaborating Centre for influenza)、美国亚特兰大疾病控制中心(Centres for Disease Control，Atlanta，USA)所述的方法(1991)，通过测量HI抗体，测定免疫应答。
使用标准化的且广泛验证过的微量测定法，使用4个血凝集-抑制单位(4HIU)的适当抗原和0.5％鸡红细胞悬浮液，在解冻的冷冻血清样品上进行抗体滴度测量。通过热处理和受体-破坏酶，去除非特异性的血清抑制剂。
评价得到的血清的HI抗体水平。从1∶10的起始稀释度开始，制备稀释系列(因子为2)，直到1∶20480的终稀释度。
将滴定终点作为表现出血凝集的完全抑制(100％)的最高稀释度步骤。一式两份地进行所有测定。
I.4.2.神经氨酸酶抑制测定
在胎球蛋白-包被的微量滴定板中进行测定。制备抗血清的2-倍稀释系列，并与标准量的流感A H3N2、H1N1或流感B病毒相混合。该实验基于神经氨酸酶的生物活性，其酶促地从胎球蛋白释放神经氨酸。切割末端神经氨酸后，暴露出β-D-半乳糖-N-乙酰基-半乳糖胺。将辣根过氧化物酶(HRP)-标记的来自落花生的花生凝集素(其特异性地结合半乳糖结构)加入孔中。在含有四甲基联苯胺(TMB)的底物反应中，可以检测和定量结合的凝集素的量。将仍然抑制病毒神经氨酸酶活性至少50％的最高抗体稀释度指定为NI滴度。
I.4.3.中和抗体测定
在解冻的冷冻血清样品上进行中和抗体测量。
在微量中和试验中，测定血清中包含的抗体的病毒中和。将血清不经进一步处理地用于该试验中。
一式三份地测试每份血清。将标准量的病毒与血清的系列稀释液相混合，并温育，以允许抗体结合病毒。然后将含有确定量的MDCK细胞的细胞悬浮液加入病毒和抗血清的混合物，并在33℃温育。温育阶段后，通过鸡红细胞的血凝集，显示病毒复制。通过Reed和Muench的方法，计算血清的50％中和滴度。
I.4.4.通过细胞因子流式细胞术(CFC)评价细胞-介导的免疫
如果与它们的对应抗原一起温育，可以在体外重新刺激外周血抗原-特异性的CD4和CD8T细胞，以生成IL-2、CD40L、TNF-α和IFN。
结果，在常规地免疫荧光标记细胞表型以及细胞内细胞因子生产后，通过流式细胞术，可以计数抗原-特异性的CD4和CD8T细胞。在本研究中，将流感疫苗抗原以及从特定流感蛋白衍生出的肽用作抗原，以重新刺激流感-特异性的T细胞。将结果表示为CD4或CD8T细胞亚群内细胞因子-阳性的CD4或CD8T细胞的频率。
I.4.5.统计方法
I.4.5.1.首要终点
●在疫苗接种后7天随访期(即疫苗接种当天和以后6天)期间和全部时间内，诱发的局部和全身体征和症状的百分比、强度和与疫苗接种的关系。
●在疫苗接种后21天随访期(即疫苗接种当天和以后20天)期间和全部时间内，诱发的局部和全身体征和症状的百分比、强度和与疫苗接种的关系。
●在整个试验期间严重不良事件的发生率。
I.4.5.2.次要终点
对于体液免疫应答：
观察的变量：
●在第0天和第21天：针对在疫苗中存在的3种流感病毒株(抗-H1N1、抗-H3N2 &抗-B-抗体)中的每一种分别测试的血清血凝集-抑制(HI)和NI抗体滴度。
●在第0天和第21天：针对在疫苗中存在的3种流感病毒株中的每一种分别测试的中和抗体滴度。
派生的变量(95％置信区间)：
●疫苗接种之前和之后，血清HI抗体的几何平均滴度(GMT)，具有95％置信区间(95％CI)
●在第21天的血清转化率*，具有95％CI
●在第21天的转化系数**，具有95％CI
●在第21天的血清保护率***，具有95％CI
●在所有时间点的血清NI抗体GMT’(具有95％置信区间)。
*将血清转化率定义为，对于每种疫苗株，在第21天的血清HI滴度比第0天增加至至少4-倍的疫苗的百分比。
**将转化系数定义为，对于每种疫苗株，在第21天的血清HI GMT相对于第0天的倍数增加。
***将保护率定义为，疫苗接种(对于每种疫苗株)后血清HI滴度＝40的疫苗的百分比，该滴度值通常被认为指示保护。
应当理解，对于有些临床试验，致反应力/安全性可能是次要终点，而免疫原性可能是首要终点。
对于细胞介导的免疫(CMI)应答
观察的变量
在第0天和第21天：在不同实验中，每106中细胞因子-阳性的CD4/CD8细胞的频率。每个实验定量CD4/CD8T细胞对下述的应答：
●肽流感(pf)抗原(需要给出/解释这些抗原的确切性质和来源)
●裂解流感(sf)抗原
●全流感(wf)抗原。
派生的变量：
●至少生产2种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞
●至少生产CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞
●至少生产IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞
●至少生产IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞
●至少生产TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞
I.3.5.3.免疫原性分析
免疫原性分析是基于所有接种过的队列。对于每个治疗组，计算下述参数(95％置信区间)：
●在第0天和第21天的HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
●在第0天和第21天的中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
●在第21天的转化系数。
●在第21天的血清转化率(SC)定义为，在第21天的血清HI滴度比第0天增加至至少4-倍的疫苗的百分比。
●在第21天的保护率定义为，血清HI滴度＝1∶40的疫苗的百分比。
●每个时间点(第0天、第21天)且对于每种抗原(肽流感(pf)、裂解流感(sf)和全流感(wf))，为每个疫苗接种组总结(描述性统计)响应性分泌的CD4/CD8T-淋巴细胞的频率。
●在每5个不同的检验中，对于每个疫苗接种组和每种抗原(pf、sf，和wf)的应答前后(Post-Pre)时间点之间的个体差异的描述性统计。
●使用非参数检验(Kruskall-Wallis检验)来对比3个组之间的位置差异，并在每5个不同的检验中，为每种抗原计算统计p-值。所有显著性检验都是双尾的(two-tailed)。小于或等于0.05的P-值认为是统计上显著的。
实施例II——水包油乳状液和佐剂制剂的制备
除非另有说明，在以后的实施例中使用的油/水乳状液由下列组成：由2种油(α-生育酚和角鲨烯)制成的有机相和含有吐温80作为乳化剂的PBS水相。除非另有说明，在以后的实施例中使用的水包油乳状液佐剂制剂包含下述水包油乳状液组分(给出终浓度)：2.5％角鲨烯(v/v)、2.5％α-生育酚(v/v)、0.9％聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(v/v)(吐温80)，参见WO 95/17210。如下制备该乳状液的2倍浓缩物，在以后的实施例中称作AS03。
II.1.乳状液SB62的制备
该方法用于在临床和临床前实施例部分中记录的研究中。通过在强烈搅拌下混合由疏水组分(DL-α-生育酚和角鲨烯)组成的油相和含有水溶性组分的水相(阴离子去污剂吐温80和PBS mod(改良的)、pH 6.8)，制备SB62乳状液。在搅拌的同时，将油相(1/10总体积)转入水相(9/10总体积)，并在室温搅拌混合物15分钟。然后在微流化装置(microfluidizer)的相互作用室中对得到的混合物施加切应力、撞击力和空化力(15000PSI-8个周期，或在实施例III记载的临床试验使用的佐剂中，是3个周期)，以生成亚微米微滴(分布在100至200nm)。得到的pH是在6.8±0.1。然后通过0.22μm膜过滤，将SB62乳状液除菌，将无菌散装乳状液在Cupac容器中在2-8℃低温储存。将无菌的惰性气体(氮或氩)充入SB62乳状液终散装容器的死体积至少15秒。
SB62乳状液的最终组成如下：
吐温80：1.8％(v/v)19.4mg/ml；角鲨烯：5％(v/v)42.8mg/ml；α-生育酚：5％(v/v)47.5mg/ml；PBS-mod：NaCl 121mM、KCl 2.38mM、Na2HPO47.14mM、KH2PO4 1.3mM；pH 6.8±0.1。
实施例III——用含有裂解流感抗原制剂和不同剂量的AS03佐剂(Flu-LD-004)的疫苗在18-59岁的成年群体中的临床试验
III.1.简介
在2006年，在18-59岁的成年群体中，进行了II期受控的、随机化的、单盲研究，以评价含有2剂量的AS03佐剂的GlaxoSmithKlineBiologicals低剂量流感候选疫苗(即每株含有5μg HA)的免疫原性、安全性和致反应力。
在肌肉内施用一剂AS03佐剂化的疫苗后21天，测量体液免疫应答(即抗血凝素)。使用福禄立适TM作为参照。
III.2.研究设计
3组受试者平行地肌肉内地接受下述疫苗：
■一组100位受试者接受一次低剂量裂解病毒流感疫苗注射，该疫苗含有5μg用AS03佐剂化的HA(FluLD1/1)
■一组100位受试者接受一次低剂量裂解病毒流感疫苗注射，该疫苗含有5μg用半剂量的AS03(AD031/2)佐剂化的HA(FluLD1/2)
■一组100位受试者接受1剂福禄立适TM(福禄立适)
时间表：在第0天肌肉内注射流感疫苗1次，在第0天和第21天回访研究地点，收集血样(HI抗体测定)，并在在第30天另外电话访问(研究结束)。
在该研究中使用的标准的三价裂解流感疫苗福禄立适TM，是由GlaxoSmithKline Biologicals开发和生产的从2006年开始销售的疫苗。
III.3.研究目的
III.3.1.首要目的
-根据抗血凝素抗体滴度，评价研究疫苗诱导的体液免疫应答
在第0天和第21天观察的变量：血清血凝集-抑制抗体滴度。
派生的变量(95％置信区间)：
-在第0天和第21天的血清抗体的几何平均滴度(GMT)
-在第21天的血清转化率*
-在第21天的转化系数**
-在第0天和第21天的保护率***
*将血凝素抗体应答的血清转化率定义为，疫苗接种前滴度＜1∶10且疫苗接种后滴度≥1∶40、或疫苗接种前滴度≥1∶10且疫苗接种后滴度增加至至少4倍的疫苗的百分比。
**将转化系数定义为，在疫苗接种后的血清HI GMT相对于第0天的倍数增加。
***将保护率定义为，在疫苗接种后血清HI滴度≥40的疫苗的百分比，该滴度通常被认为指示保护。
III.3.2.次要目的
-根据诱发的局部的和全身的不良事件、未诱发的不良事件和严重不良事件，评价研究疫苗的安全性和致反应力：
1.在每个组在每次疫苗接种后7天随访期(即疫苗接种当天和以后6天)期间，诱发的局部和全身体征和症状的发生率、强度和与疫苗接种的关系。
2.在每个组在疫苗接种后30天随访期(即疫苗接种当天和以后29天)期间，未诱发的局部和全身体征和症状的发生率、强度和与疫苗接种的关系。
3.在每个组在整个研究期间严重不良事件的发生率和关系。
III.4.疫苗组合物和施用
III.4.1.疫苗制剂
未佐剂化的流感疫苗是三价裂解病毒体灭活流感疫苗，它由3个单价病毒抗原部分(分别从流感株A/H1N1、A/H3N2和B制备)组成。在该疫苗中存在的抗原与在许可的福禄立适TM疫苗中相同，所述福禄立适TM疫苗从1992年以后可以在市场上作为福禄立适TM(FluarixTM)
Figure BPA00001277879100321
买到，且每剂含有15μg HA/株。在FluLD临床批次中包含的流感株是为2006/2007北半球选择的菌株：
●A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)-样菌株：A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)IVR-116
●A/威斯康辛/67/2005(H3N2)-样菌株：A/威斯康辛/67/2005(H3N2)NYMCX-161
●B/马来西亚/2506/2004。
抗原源自卵培养的病毒。用脱氧胆酸钠进行裂解，然后进行灭活步骤，后者通过随后的脱氧胆酸钠和甲醛的作用来进行。
AS03佐剂化的低剂量流感(FluLD)疫苗(临床批次)是基于可商业得到的福禄立适TM疫苗(分别从流感株A/H1N1、A/H3N2和B制备)，但是具有更低的抗原含量，且用GSK佐剂系统AS03佐剂化。AS03由水包油乳状液(SB62)组成，其含有两种生物可降解的油角鲨烯和α-生育酚(维生素E)，以及表面活性剂聚山梨醇酯80(吐温80)。通过与乳状液简单混合，将流感抗原掺入佐剂系统的水相中。已经测试了2种制剂，它们的差别在于疫苗批次中与Flu抗原一起引入的佐剂的量。佐剂化的疫苗每剂含有每种流感病毒株的5μg血凝素(HA)，其与全剂量(AS03)或半剂量(AS031/2)的佐剂系统AS03相组合。赋形剂是如下的：聚山梨醇酯80(吐温80)、辛苯昔醇10(Triton X-100)、琥珀酸氢α-生育酚酯(alpha-tocopherylhydrogen succinate)、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、注射用水。
AS03佐剂化的低剂量流感疫苗(FluLD、全或半剂量的AS03)是不含防腐剂的疫苗。但是，它们含有痕量的硫柳汞(每剂＜1.25μg Hg)，后者来自生产工艺的早期。它们二者作为单剂疫苗存在于玻璃(I型)预充注射器中，体积为0.5ml/剂。
III.4.1.1.AS03佐剂化的流感疫苗的组成
1剂量的FluLD(全或半剂量的AS03)对应着0.5ml。在表3中提供了组成。每剂的HA含量是5μg(对于两种制剂)，唯一的差异是在最终容器中存在的AS03的量。
表3  AS03佐剂化的低剂量流感疫苗的组成(全和半剂量的AS03)
Figure BPA00001277879100331
缩写：HA＝血凝素。
聚山梨醇酯80的总含量对应着每剂4.972mg(当使用AS03全剂量时)和每剂2.547mg(当使用AS03半剂量时)。
III.4.1.2.灭活的裂解流感抗原制剂的制备
流感抗原与在福禄立适TM(流感病毒疫苗)中包含的那些相同。单价部分由纯化的灭活裂解病毒组成，后者从各自在含胚鸡蛋中培养的3种流感病毒株A型(H1N1和H3N2)和B型的工作种子制备。按照WHO年度推荐，这些工作种子源自从WHO合作中心接收的菌株。制备抗原参照的方法，作为解释，在WO 02/097072中给出。3个单价部分的体积是基于配制之前在每个单价部分中测得的HA含量和目标生产体积。
在注射用水中稀释10倍浓缩的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4，当1倍浓缩时)以及吐温80和琥珀酸氢α-生育酚酯的预混合物，随后在室温搅拌5-30分钟。
然后在得到的磷酸盐缓冲盐水/吐温80-琥珀酸氢α-生育酚酯溶液中，连续稀释3种浓缩的单价部分至下述浓度：
每个A单价部分(H1N1、H3N2)的20μg HA
B单价部分的23.32μg HA
每ml中间体三价部分(每个A单价部分的5μg HA，和B的5.83μgHA/500μl三价终部分)。
在加入每个单价部分之间，在室温搅拌混合物10-30分钟，并在加入最后的单价部分之后，搅拌15-30分钟。该中间体三价部分也称作“pre-pool”，其可以在+2至+8℃保存，或可以在同一天进一步加工至最终制剂步骤。pre-pool的终体积是250μl/剂。
III.4.1.3.含有AS03佐剂的疫苗组合物的制备
佐剂化的疫苗：LD AS031/1(表4)
将10倍浓缩的PBS mod(pH 7.4，当1倍浓缩时；137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、1.47mM KH2PO4、pH 7.4)以及含有吐温80、Triton X-100和VES的混合物(量考虑在菌株中存在的去污剂)加入注射用水。搅拌5至30分钟后，加入20μg HA/ml的每株H1N1和H3N2以及23.32μg HA/ml的B株，在每次加入之间搅拌10至30分钟。搅拌15至30分钟后，取出小体积的所谓“中间部分”用于分析，并在+2至+8℃之间保存。该中间部分是在1倍浓缩的PBS mod中。目标去污剂浓度是488μg吐温80/ml、73.6μg Triton X-100/ml和66.6μg VES/ml。
然后制备最终制剂：将等体积的SB62(参见实施例II中的制备)加入每个250μl的pre-pool中间部分，并在室温混合30至60分钟。检查pH在6.8至7.5之间。用氮冲洗制剂，然后在填充之前在+2至8℃保存。
表4  AS03佐剂化的低剂量疫苗
Figure BPA00001277879100351
(1)：缓冲液最终部分组成是：137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mMNa2HPO4、1.47mM KH2PO4、pH 7.4
佐剂化的疫苗：LD AS03 1/2(表5)
将10倍浓缩的PBS mod(pH 7.4，当1倍浓缩时——参见上面的组合物)以及含有吐温80、Triton X-100和VES的混合物(量考虑在菌株中存在的去污剂)加入注射用水。搅拌5至30分钟后，加入20μg HA/ml的每株H1N1和H3N2以及23.32μg HA/ml的B株，在每次加入之间搅拌10至30分钟。搅拌15至30分钟后，取出小体积的所谓“中间部分”用于分析，并在+2至+8℃之间保存。PBS mod在该中间部分中1倍浓缩。目标去污剂浓度是488μg吐温80/ml、73.6μg Triton X-100/ml和66.6μgVES/ml。
然后制备最终制剂：首先用PBS mod缓冲液稀释SB62，并在室温混合15-30分钟。然后将等体积的该稀释的SB62加入每个250μl的pre-pool中间部分。在室温搅拌30至60分钟后，检查pH在6.8至7.5之间。用氮冲洗制剂，然后在填充之前在+2至8℃保存。
两种制剂的终体积是每剂500μl，最终HA浓度是10μg每个A单价部分和11.66μg B单价部分/ml三价最终部分。最终的吐温80、TritonX-100(来自H3N2单部分生产的残余物)和琥珀酸氢α-生育酚酯(琥珀酸氢α-生育酚酯是RRR(D异构体)-α-生育酚的酯形式)目标浓度分别是244μg/ml、58.6μg/ml和33.3μg/ml。
表5  AS03佐剂化的低剂量疫苗(半剂量的佐剂)
Figure BPA00001277879100371
(1)：缓冲液最终部分组成是：137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mMNa2HPO4、1.47mM KH2PO4、pH 7.4
III.4.2.疫苗施用
将疫苗装入1.25-ml无菌I型(欧洲药典)玻璃注射器中。将每个注射器填充至0.57ml靶位(范围：0.54-0.60ml)。在非优势臂的三角肌区域中肌肉内地施用疫苗。所有疫苗都存在于预填充的注射器(0.5ml)中。为了确保疫苗的适当肌肉内注射，使用至少25G和至少2.5cm长的针。
III.5研究群体结果
在该研究中登记了共300位受试者：每组100位受试者，分成3组。在疫苗接种时所有接种的队列的平均年龄是36.7岁，标准偏差是13.67岁。3个疫苗组之间的受试者平均年龄和性别分布是类似的。
III.6免疫原性结果
在免疫原性的ATP队列(297位受试者)上进行免疫原性分析。
体液免疫应答
为了评价用AS03佐剂化的低剂量流感候选疫苗诱导的体液免疫应答，为每个治疗组计算下述参数(95％置信区间)：
·在第0天和第21天的HI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
·在第21天的血清转化率(SC)
·在第21天的转化系数
·在第0天和第21天的保护率
III.6.1  HI几何平均滴度(GMT)
在表10和图1中显示了HI抗体的GMT，具有95％CI。在表11中显示了调整的组之间的GMT比。
在3个治疗组中，所有3个疫苗株的HI抗体的疫苗接种前GMT是在相同范围内。对于所有3种菌株，在第21天对佐剂化的组观察到的GMT倾向于高于福禄立适组，且对于A/成斯康辛疫苗株，FluLD1/1和福禄立适之间存在统计差异(没有95％CI的重叠，且调整的GMT比不含有值1)。对于B/马来西亚疫苗株，在FluLD1/2和福禄立适之间也观察到统计差异(调整的GMT比不含有值1)。
表10-在第0天和第21天的抗-HA抗体的血清阳性率和几何平均滴度(GMT)(免疫原性的ATP队列)
Figure BPA00001277879100381
FluLD1/1＝含有全剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
福禄立适＝福禄立适疫苗
GMT＝几何平均抗体滴度
N＝具有可利用的结果的受试者的数目
n/％＝血清阳性(HI滴度＞＝1∶10)受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
MIN/MAX＝最小/最大
PRE＝疫苗接种前，在第0天
PI(D21)＝疫苗接种后，在第21天
表11-在第21天每个疫苗株的组之间的调整的GMT比(免疫原性的ATP队列)
Figure BPA00001277879100391
FluLD1/1＝含有全剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
福禄立适＝福禄立适疫苗
调整的GMT＝为基线滴度调整的几何平均抗体滴度
N＝具有可利用的疫苗接种之前和之后的结果的受试者的数目
95％CI＝调整的GMT比的95％置信区间(Ancova模型：为基线滴度调整——超过2组的合并方差)；LL＝下限，UL＝上限
III.6.2  抗-HI抗体滴度的转化系数、血清保护率和血清转化率(对于在人中确立的流感疫苗的保护相互关联)
血清保护率的结果显示在表6和图2中，血清转化率的结果显示在表7和图3中，转化系数的结果显示在表8和图4中。
在所有组(至少94.9％)中达到了欧洲当局对血清保护率要求的阈值(70％)。对于每个疫苗株，3组在第21天的血清保护率是在相同范围内。
在所有组(至少65％)中达到了欧洲当局对血清转化率要求的阈值(40％)。
对于A/新喀里多尼亚疫苗株，3组在第21天的SCR是在相同范围内。
对于A/威斯康辛疫苗株，FluLD1/1组在第21天的SCR倾向于高于福禄立适组。FluLD1/2组在第21天的SCR与福禄立适组在同一范围内。
对于B/马来西亚疫苗株，FluLD1/2组在第21天的SCR倾向于高于福禄立适组。FluLD1/1组在第21天的SCR与福禄立适组在同一范围内。
在所有组(至少6.2)中达到了欧洲当局对血清转化系数要求的阈值(2.5)。
对于A/新喀里多尼亚疫苗株，3组在第21天的SCF似乎是在相同范围内。对FluLD1/2组观察到的值低于对福禄立适组观察到的值，但是可以通过FluLD1/2组中更高的疫苗接种前血清保护率来解释。
对于A/威斯康辛疫苗株，FluLD1/1组在第21天的SCF倾向于高于福禄立适组。FluLD1/2组在第21天的SCF与福禄立适组在同一范围内。
对于B/马来西亚疫苗株，2个佐剂化的组在第21天的SCF倾向于高于福禄立适组。
表6-在第0天和第21天的HI抗体滴度的血清保护率(SPR)(免疫原性的ATP队列)
FluLD1/1＝含有全剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
福禄立适＝福禄立适疫苗
N＝具有可利用的结果的受试者的数目
n/％＝血清受保护的(HI滴度＞＝401/DIL)受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
PRE＝疫苗接种前，在第0天
PI(D1)＝疫苗接种后，在第21天
数据来源＝附表IIIA
表7-在第21天的HI抗体滴度的血清转化率(SCR)(免疫原性的ATP队列)
Figure BPA00001277879100411
FluLD1/1＝含有全剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
福禄立适＝福禄立适疫苗
血清转化定义为：
对于最初血清阴性的受试者，疫苗接种后抗体滴度＞＝401/DIL
对于最初血清阳性的受试者，疫苗接种后抗体滴度＞＝4倍疫苗接种前抗体滴度
N＝具有可利用的疫苗接种之前和之后的结果的受试者的数目
n/％＝血清转化的受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
表8-在第21天的HI抗体滴度的血清转化系数(SCF)(免疫原性的ATP队列)
Figure BPA00001277879100421
FluLD1/1＝含有全剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量的AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ug HA/株)
福禄立适＝福禄立适疫苗
N＝具有可利用的疫苗接种之前和之后的结果的受试者的数目
SCF＝血清转化系数或几何平均比例(平均[log10(PI(D21)/PRE)])
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
III.7安全性结论
根据诱发的(局部的/全身的)和未诱发的症状，佐剂化的疫苗组的致反应力高于福禄立适组，是在该研究中观察到的总趋势。
佐剂化的疫苗中AS03含量的减少，对所有全身的和局部的三级症状有显著影响。
与福禄立适组(35％)相比，未诱发的症状的发生率倾向于在佐剂化的疫苗组中更高(55％和47％的受试者)。
从这些结果可以得出结论，候选疫苗的致反应力和安全性是令人满意的，且是临床上可接受的。
III.8.总结论
III.8.1.免疫原性结果
该研究的首要目的是，评估含有2种不同浓度的AS03佐剂的低剂量流感疫苗和福禄立适引起的体液免疫应答(抗-HI抗体滴度)。
在第21天，3种疫苗超过了欧洲当局关于裂解病毒体流感疫苗的年度注册的要求(“Note for Guidance on Harmonisation of Requirements forinfluenza Vaccines”，年度菌株变化的免疫学评估-CPMP/BWP/214/96)。与福禄立适组相比，佐剂化的组中的GMT倾向于更高，对于A/威斯康辛(FluLD1/1相对于福禄立适)和B/马来西亚疫苗株(FluLD1/2相对于福禄立适)，观察到统计上显著的差异。在所有3个疫苗组中观察到了类似的血清保护率，从94.9％到99％。在佐剂化的组中观察到的血清转化率和血清转化系数高于福禄立适组。来自该试验的数据也揭示，含有半剂量的AS03佐剂的疫苗诱导的免疫原性与用全剂量佐剂诱导的相当。
III.8.2.致反应力和安全性结果
AS03佐剂化的低剂量流感候选疫苗的施用，在研究群体(即18至59岁的成年人)中是安全的，且在临床上很好地耐受。与全剂量佐剂化的疫苗相比，半剂量佐剂化的疫苗表现出诱发的局部的和全身的症状的发生率的显著降低。
实施例IV-佐剂化的和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂)在引发的BALB/c小鼠中的临床前评价
IV.1.实验设计和目的
在流感-引发的小鼠中进行实验，以便评价AS03对用该水包油佐剂配制的流感疫苗诱导的体液应答的增强。
为了模拟人情形，使用用异亚型菌株引发的小鼠进行实验。
IV.1.1.治疗/组(表9)
在第0天用福尔马林灭活的三价全流感病毒(每株5μg HA)鼻内地(20μl体积)引发27只成年雌性BALB/c小鼠组。引发株由疫苗中包含的菌株的早期飘变变体(5μg HA完整的灭活的H1N1 A/约翰内斯堡/82/96、H3N2 A/悉尼/5/97、B/哈尔滨/7/94)组成。28天后，用单剂量的疫苗候选物肌肉内地接种小鼠，总体积为50μl。用只含有裂解抗原的制剂(三价裂解平常疫苗)或含有用2种剂量的AS03(完全的或1/5)佐剂化的裂解抗原的制剂，免疫小鼠。用于免疫的菌株包括H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/巴拿马/2007/99、B/山东/7/97病毒抗原(1.5μg/株，人剂量的1/10)。
表9
  组   抗原/制剂   其它处理
  1   三价裂解/平常疫苗(未佐剂化的)   D0异源引发
  2   三价裂解/AS03   D0异源引发
  3   三价裂解/AS03 1/5   D0异源引发
IV.1.2.疫苗制剂的制备
制备吐温80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便达到750μg/ml吐温80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的疫苗终浓度。考虑在菌株中已经存在的去污剂和VES的量，计算在预混合物中使用的量。
1升10倍浓缩的盐水缓冲液(PBS pH 7.4)的配制：向0.800升注射用水中，加入NaCl 80g、KCl 2g、Na2HPO4 11.44g、KH2PO4 2g。溶解后，用注射用水调至1.0L。当10倍稀释时，pH将是7.4。
三价裂解/平常疫苗
根据下述次序，临时制备1个50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(10倍浓缩的PBS pH 7.4)+预混合物，5min室温磁力搅拌，+1.5μgHA H1N1株，10min室温磁力搅拌，+1.5μg HA H3N2株，10min室温磁力搅拌，+1.5μg HA B株，15min室温磁力搅拌。在它们制备结束后1小时内，注射该制剂。
三价裂解/AS03
制备吐温80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便达到750μg/ml吐温80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的疫苗终浓度。考虑在菌株中已经存在的去污剂和VES的量，计算在预混合物中使用的量。
根据下述次序，临时制备1个50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(10倍浓缩的PBS pH 7.4)+预混合物，5min室温磁力搅拌，+1.5μgHA H1N1株，10min室温磁力搅拌，+1.5μg HA H3N2株，10min室温磁力搅拌，+1.5μgHA B株，15min室温磁力搅拌，+25μl SB62乳状液(对于全剂量AS03)或5μl SB62乳状液(对于1/5剂量AS03)，15min室温磁力搅拌。在它们制备结束后1小时内，注射该制剂。
IV.1.3.读出(表10)
在免疫前(第28天)和免疫后14天，测量对疫苗接种的体液免疫应答(27小鼠/组)。通过血凝集抑制(HI)实验，测试血清样品。
表10
Figure BPA00001277879100451
IV.2.结果
IV.2.1.体液免疫
结果如图5所示。在异亚型引发、随后单疫苗接种的该小鼠模型中，证实了AS03及其稀释液会诱导比平常疫苗更高的HI滴度。对于所有流感A菌株，观察到HI滴度的统计上显著的增加(p＜0.05)。对于H1N1株，在AS03和AS031/5之间也观察到HI滴度的显著差异(p＜0.05)。与平常疫苗相比，减少剂量的AS03不能增加所有3种菌株的HI滴度。观察到针对B株(B/山东)的非常低的应答；这可能是由于用于引发的B菌株和疫苗之间的显著抗原飘变。
IV.3.结果的总结和结论
总之，与平常疫苗相比，当使用AS03佐剂化的疫苗时，在用异亚型菌株引发的动物中，观察到HI滴度的增加。全剂量的AS03能够最佳地获得针对所有3种流感疫苗株的有力的HI滴度。
实施例V-佐剂化的和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂)在引发的C57Bl/6小鼠中的临床前评价
V.1.实验设计和目的
在流感-引发的小鼠中进行实验，以便评价AS03对用该水包油佐剂配制的流感疫苗诱导的体液和细胞应答的增强。
为了模拟人情形，使用用异亚型菌株引发的小鼠进行实验。
V.1.1.治疗/组(表11)
在第0天用福尔马林灭活的三价全流感病毒(每株5μg HA)鼻内地(20μl体积)引发25只成年雌性C57Bl/6小鼠组。引发株由疫苗中包含的菌株的早期飘变变体(5μg HA完整的灭活的H1N1 A/北京/262/95、H3N2A/巴拿马/2007/99、B/山东/7/97)组成。28天后，用单剂量的疫苗候选物肌肉内地接种小鼠，总体积为100μl。用只含有裂解抗原的制剂(三价裂解平常疫苗)或含有用3种剂量的AS03(完全的、1/2或1/5)佐剂化的裂解抗原的制剂，免疫小鼠。用于免疫的菌株包括H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/纽约/55/2004、B/江苏/10/2003病毒抗原(1.5μg/株，人剂量的1/10)。
表11
  组   抗原/制剂   其它处理
  1   三价裂解/平常疫苗(未佐剂化的)   D0异源引发
  2   三价裂解/AS03   D0异源引发
  3   三价裂解/AS03 1/2   D0异源引发
  4   三价裂解/AS03 1/5   D0异源引发
  5   PBS   D0异源引发
V.1.2.疫苗制剂的制备
三价裂解/平常疫苗
根据下述次序，临时制备100μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(如在实施例IV中所教导的，制备10倍浓缩的PBS pH 7.4)+福禄立适临床批次DFLUA014(在终剂量中1.5μg/株)。
三价裂解/AS03
根据下述次序，临时制备100μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(如在实施例IV中所教导的，制备10倍浓缩的PBS pH 7.4)+福禄立适临床批次DFLUA014(在终剂量中1.5μg/株)+25μl SB62乳状液(对于全剂量)或12.5μl SB 62乳状液(对于1/2剂量)或5μl SB62乳状液(对于1/5剂量)。在它们制备结束后1小时内，注射该制剂。
V.1.3.读出(表12)
在免疫后21天(10小鼠/组)，测量对疫苗接种的体液免疫应答，通过血凝集抑制(HI)实验，测试血清样品。通过细胞内细胞因子染色(ICS)，在免疫后7天测试细胞免疫应答。
表12
  读出   时间点   样品类型   分析方法
  体液应答  D49   血清   IHA
  细胞应答  D35   PBMC   ICS
V.2.结果
V.2.1.体液免疫(10小鼠/组)。
结果如图6所示。在异亚型引发、随后单疫苗接种的该小鼠模型中，证实了AS03及其稀释液(1/2和1/5)会诱导比平常疫苗更高的HI滴度。对于所有3种菌株，在接受用全剂量AS03或减少剂量的AS03佐剂化的疫苗的小鼠之间，没有观察到HI滴度的差异。
V.2.2.细胞免疫(15小鼠/组)。
结果如图7所示。无论AS03的稀释度如何，与用三价裂解平常疫苗免疫的小鼠相比，在用AS03-佐剂化的三价裂解疫苗免疫的小鼠中观察到了更高的CD4+T细胞应答。与用全剂量AS03佐剂化的三价裂解疫苗免疫的小鼠中诱导的应答相比，当用更低剂量的AS03佐剂化的三价裂解疫苗免疫小鼠时，观察到更低的细胞应答的趋势。
V.3.结果的总结和结论
总之，与平常疫苗相比，当使用AS03佐剂化的疫苗时，在用异亚型菌株引发的动物中，观察到体液和细胞应答的增加。在用全剂量或部分剂量的AS03佐剂免疫的小鼠之间，观察到了类似的体液应答量级。但是，佐剂剂量的减少与减少的CD4+T细胞应答量级的趋势有关。
实施例VI-佐剂化的和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂和低剂量抗原)在引发的C57Bl/6小鼠中诱导的细胞免疫应答的临床前评价
VI.1.实验设计和目的
在流感-引发的小鼠中进行实验，以便评价AS03对用该水包油佐剂配制且含有低剂量抗原(0.5μg/株，人剂量的1/30)的流感疫苗诱导的细胞免疫应答的增强。
为了模拟人情形，使用用异亚型菌株引发的小鼠进行实验。
VI.1.1.治疗/组(表13)
在第0天用福尔马林灭活的三价全流感病毒(每株5μg HA)鼻内地(20μl体积)引发15只成年雌性C57Bl/6小鼠组。引发株由疫苗中包含的菌株的早期飘变变体(5μg HA完整的灭活的H1N1 A/北京/262/95、H3N2A/巴拿马/2007/99、B/山东/7/97)组成。28天后，用单剂量的疫苗候选物肌肉内地接种小鼠，总体积为50μl。用只含有裂解抗原的制剂(三价裂解平常疫苗)或含有用3种剂量的AS03(完全的、1/2或1/5)佐剂化的裂解抗原的制剂，免疫小鼠。用于免疫的菌株包括H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/纽约/55/2004、B/江苏/10/2003病毒抗原(0.5μg/株，人剂量的1/30)。
表13
  组   抗原/制剂   其它处理
  1   三价裂解/平常疫苗(未佐剂化的)   D0异源引发
  2   三价裂解/AS03   D0异源引发
  3   三价裂解/AS03 1/2   D0异源引发
  4   三价裂解/AS03 1/5   D0异源引发
  5   PBS   D0异源引发
VI.1.2.疫苗制剂的制备
三价裂解/平常疫苗
根据下述次序，临时制备50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(如在实施例IV中所教导的，制备10倍浓缩的PBS pH 7.4)+福禄立适临床批次DFLUA014(在终剂量中0.5μg/株)。
三价裂解/AS03
根据下述次序，临时制备50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(如在实施例IV中所教导的，制备10倍浓缩的PBS pH 7.4)+福禄立适临床批次DFLUA014(在终剂量中0.5μg/株)+25μl SB62乳状液(对于全剂量)或12.5μl SB 62乳状液(对于1/2剂量)或5μl SB62乳状液(对于1/5剂量)。在它们制备结束后1小时内，注射该制剂。
VI.1.3.读出(表14)
通过细胞内细胞因子染色，在免疫后7天测试细胞免疫应答。
表14
  读出   时间点   样品类型   分析方法
  细胞应答   D35   PBMC   ICS
VI.2.结果
VI.2.1.细胞免疫
结果如图8所示。与用三价裂解平常疫苗免疫的小鼠相比，在用AS03(完全的或1/2剂量)佐剂化的三价裂解疫苗免疫的小鼠中，观察到了稍稍更高的CD4+T细胞应答。与用三价裂解平常疫苗或用全剂量或半剂量的AS03佐剂化的三价裂解疫苗免疫的小鼠中诱导的应答相比，当用1/5的AS03剂量佐剂化的三价裂解疫苗免疫小鼠时，观察到了更高的细胞应答。
VI.3.结果的总结和结论
总之，与平常疫苗相比，当使用AS03佐剂化的疫苗时，在用异亚型引发的动物中，观察到CD4+T细胞应答的微小增加。在该实验中没有观察到佐剂剂量应答，实际上，与用更高的佐剂剂量所观察到的结果相比，1/5的AS03剂量诱导了更高的抗原特异性的CD4+T细胞频率。总之，这些数据与其它临床前实验不一致，可能暗示该具体实验的技术问题。
实施例VII-佐剂化的和未佐剂化的裂解H5N1疫苗(包含不同剂量的AS03佐剂和抗原)在首次用于实验的(naive)C57Bl/6小鼠中的临床前评价
VII.1.实验设计和目的
在首次用于H5N1-实验的(H5N1-naive)小鼠中进行实验，以便评价AS03对用该水包油佐剂配制的H5N1裂解疫苗诱导的体液和细胞免疫应答的增强。在大范围流行的情况下，预见到全世界群体将对新循环的大范围流行流感株是免疫学上幼稚的(naive)。由于该幼稚的免疫状态，大范围流行疫苗可能需要2疫苗剂量来保护个体免于新流感株造成的感染和严重疾病。为了代表这种以前暴露的缺乏，开发了首次用于实验的小鼠模型来评估疫苗免疫原性。
VII.1.1.治疗/组(表15)
在第0天和第28天，用大范围流行H5N1疫苗候选物肌肉内地免疫15只成年雌性首次用于实验的C57Bl/6小鼠组，总体积为50μl。用只含有裂解H5N1抗原的制剂(H5N1裂解平常疫苗)或含有用不同剂量的AS03(2倍的、完全的、1/2或1/5)佐剂化的裂解抗原的制剂，免疫小鼠。用于免疫的菌株包括H5N1 A/越南/1194/04病毒抗原(1.5或0.38μg/株，相当于人剂量的1/10)。
没有制备2倍AS03剂量的制剂，而是同时注射1个50μl H5N1裂解/AS03全剂量+1个50μl剂量AS03。
表15
  组   抗原/制剂   抗原剂量
  1   H5N1裂解/平常疫苗(未佐剂化的)   1.5μg
  2   H5N1裂解/2倍剂量AS03   1.5μg
  3   H5N1裂解/AS03   1.5μg
  4   H5N1裂解/AS03 1/2   1.5μg
  5   H5N1裂解/AS03 1/5   1.5μg
  6   H5N1裂解/平常疫苗(未佐剂化的)   0.38μg
  7   H5N1裂解/2倍剂量AS03   0.38μg
  8   H5N1裂解/AS03   0.38μg
  9   H5N1裂解/AS03 1/2   0.38μg
  10   H5N1裂解/AS03 1/5   0.38μg
  11   PBS
VII.1.2.疫苗制剂的制备
1升最终部分缓冲液(PBS pH 7.2±0.2)的制备：向0.800升注射用水中，加入NaCl 7.699g、KCl 0.200g、MgCl2x6H2O 0.100g、Na2HPO4x12H2O 2.600g、KH2PO4 0.373g。溶解后，用注射用水调至1.0L。
H5N1裂解/平常疫苗
50μl剂量的制备：
将硫柳汞(考虑它在菌株中的浓度，确定量)和Triton X100加入最终部分缓冲液。没有加入吐温80，因为通过菌株的吐温浓度，达到在制剂中的含量目标。在1.5μg制剂剂量中，硫柳汞的终浓度是10μg/ml，吐温80的终浓度是368μg/ml，Triton X100的终浓度是35μg/ml。在0.38μg制剂剂量中，硫柳汞的终浓度是10μg/ml，吐温80的终浓度是93μg/ml，Triton X100的终浓度是8.9μg/ml。5-30min磁力搅拌后，加入1.5或0.38μg的HA(H5N1株)。将制剂搅拌30-60分钟。检查pH。在制备结束后1小时内进行注射。
H5N1裂解/AS03
50μl剂量的制备：
将硫柳汞(考虑它在菌株中的浓度，确定量)和Triton X100加入最终部分缓冲液。没有加入吐温80，因为通过菌株的吐温浓度，达到在制剂中的含量目标。在1.5μg制剂剂量中，硫柳汞的终浓度是10μg/ml，吐温80的终浓度是368μg/ml，Triton X100的终浓度是35μg/ml。在0.38μg制剂剂量中，硫柳汞的终浓度是10μg/ml，吐温80的终浓度是93μg/ml，Triton X100的终浓度是8.9μg/ml。5-30min磁力搅拌后，加入1.5或0.38μg的HA(H5N1株)。30-60分钟磁力搅拌后，加入25或12.5或5μl SB62乳状液。将制剂搅拌30-60分钟。检查pH。在制备结束后1小时内进行注射。
VII.1.3.读出(表16)
在免疫后14天(10小鼠/组)，通过抗-Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度，测量体液免疫应答(图9，A-F)。还在免疫后21天(10小鼠/组)，通过抗-H5N1血凝集抑制测定，测量体液免疫应答(图10，A-B)。
在免疫后6天(5组，每组3只小鼠)，通过流式细胞术计数的抗原-特异性的CD4+T细胞的细胞内细胞因子染色(ICS)，测试细胞免疫应答(图11，A-B)。
表16
  读出   时间点   样品类型  分析方法
  体液应答   D39   血清  ELISA，同种型和HI滴度
  细胞应答   D34   PBMC  ICS
VII.2.结果
VII.2.1.体液免疫应答：ELISA和同种型。
结果如图9所示。
在每个H5N1裂解疫苗剂量，与未佐剂化的H5N1裂解疫苗相比，所有佐剂化的组诱导了更高的抗-H5N1 Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度(图9-A至F)。
在每个H5N1裂解疫苗剂量：抗-H5N1 IgG1抗体应答是抗-H5N1IgG2b抗体应答的4-5-倍高(图9-C至F)。使用H5N1裂解疫苗的1.5μg HA的剂量以及与每种剂量的佐剂相组合，没有观察到抗-H5N1 Ig、IgG1和IgG2b抗体应答的差异(图9-A、C和E)。
使用H5N1裂解疫苗的0.38μg HA的剂量，与用AS03/2(p＝0.7315)和AS031/5(p＝0.9744)佐剂化的H5N1裂解疫苗诱导的应答相比，在用2x-全剂量佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫后，得到了更高的抗-H5N1 Ig滴度的趋势(图9-B)。对于抗-H5N1 IgG1抗体应答，也观察到了该趋势(图9-D)。但是，力度不足以观察到统计上显著的差异(1.7倍差异是25％力度，或2倍差异是47％)。
VII.2.2.体液免疫应答：HI滴度。
使用1.5μg HA/小鼠的剂量：
在每个佐剂剂量，与用未佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中得到的应答相比，用AS03-佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的所有小鼠诱导了更高的HI滴度(图10-A)。当用一定剂量范围的AS03佐剂化H5N1裂解疫苗时，没有观察到HI滴度的差异(图10-A)。
使用0.38μg HA/剂的剂量：
在每个佐剂剂量，与用未佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中得到的应答相比，用AS03-佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的所有小鼠诱导了更高的HI滴度(图10B)。
与用AS03/2佐剂化的H5N1裂解疫苗得到的应答相比(p＝0.032，对于4-倍差异)，用2x全剂量AS03佐剂化的H5N1裂解疫苗观察到明显更高的HI滴度(图10B)。
在用2x全剂量AS03或全剂量AS03佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中，或在用AS03/2或AS03/5佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间，没有观察到HI滴度的差异(图10B)。
抗原剂量(1.5μg或0.38μg)之间的对比：
除了在用AS03/5佐剂化的1.5μg HA裂解H5N1免疫的小鼠与用2x全剂量AS03佐剂化的0.38μg HA裂解H5N1免疫的小鼠之间以外，在用AS03、AS03/2或AS03/5佐剂化的H5N1裂解疫苗的每个HA剂量免疫的小鼠之间，没有观察到HI滴度的差异(图10)。相对于与更低佐剂剂量相组合的更高抗原剂量(AS03/5的1.5μg HA，对于4-倍差异，p＝0.0193)，在用2x全剂量AS03佐剂化的0.38μg HA裂解H5N1免疫后，HI滴度明显更高(图10)。
VII.2.3.细胞免疫应答
结果如图11所示。
在每个H5N1裂解疫苗剂量(1.5或0.38μg)，与未佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠相比，在用不同剂量的AS03佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中观察到更高的CD4+T细胞应答(图11)。
在1.5μg H5N1裂解疫苗剂量，AS03剂量的减少与CD4+T细胞频率的降低相对应(图11A)。但是，在0.38μg H5N1裂解疫苗剂量，在用AS03-佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中，在不同佐剂剂量之间没有观察到CD4+T细胞应答的差异(图11B)。
VII.3.结果的总结和结论
在小鼠中的免疫原性研究证实，与未佐剂化的H5N1裂解疫苗诱导的应答相比，佐剂化的H5N1裂解疫苗诱导了明显更高的体液(抗-H5N1ELISA和HI滴度)和细胞(CD4+T细胞)应答。
在用1.5μg和0.38μg佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠的体液免疫应答之间，没有观察到抗原剂量应答效应，表明在该模型中，在有佐剂存在下，可能需要甚至更低剂量的HA来观察剂量应答效应。
与平常的H5N1疫苗相比，当使用AS03佐剂化的H5N1大范围流行疫苗时，在首次用于实验的小鼠中观察到CD4+T细胞应答的强烈增加。当将0.38μg剂量的H5N1裂解疫苗用作疫苗候选物时，没有观察到AS03稀释的影响，尽管当使用减少剂量的AS03佐剂化1.5μg H5N1裂解疫苗时观察到了CD4T细胞应答的减少。
如以前观察到的，在用全剂量AS03或用AS03/2佐剂化的H5N1裂解疫苗(在任一种抗原剂量)免疫的小鼠之间，没有观察到体液和细胞免疫应答的差异。当将2x全剂量AS03用于疫苗制剂中时，检测到免疫应答的一些增强，相应地，当将AS03/5用于疫苗制剂时，检测到免疫应答的降低。
总之，这里记载的数据支持了该新颖的佐剂系统在该疫苗制剂中的效力。
实施例VIII-佐剂化的和未佐剂化的流感疫苗在引发的大白猪中的临床前评价
VIII.1.实验设计和目的
在流感-引发的猪中进行实验，以便评价AS03对用该水包油佐剂配制的流感疫苗诱导的体液应答的增强。
使用猪，以便在接近人的动物模型中评价AS03的剂量范围。猪表现出大量生物相似性，它们确立了该动物在生理上与人最接近，具有极少的例外(Douglas R.，1972)。此外，通常观察猪流感感染的现象。
VIII.1.1.治疗/组(表17)
在第0天用福尔马林灭活的三价全流感病毒(每株25μg HA)鼻内地(200μl总体积)引发10只成年雌性大白猪组。引发株由与疫苗株同源的菌株(25μg HA完整的灭活的H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97)组成。28天后，用单剂量的疫苗候选物肌肉内地接种猪，总体积为500μl。用只含有裂解抗原的制剂(三价裂解平常疫苗)或含有用一定剂量范围的AS03(完全的、1/2或1/5)佐剂化的裂解抗原的制剂，免疫猪。用于免疫的菌株包括H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97病毒抗原(在一人剂量中，对于H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/巴拿马/2007/99菌株，是15μg HA；对于B/山东/7/97株，是17.5μg)。
组(10猪/组)：
表17
  组   抗原/制剂   其它处理
  1   三价裂解/平常疫苗(未佐剂化的)   D0异源引发
  2   三价裂解/AS03   D0异源引发
  3   三价裂解/AS03 1/2   D0异源引发
  4   三价裂解/AS03 1/5   D0异源引发
VIII.1.2.疫苗制剂的制备
三价裂解/平常疫苗
制备吐温80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便达到750μg/ml吐温80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的疫苗终浓度。考虑它们在菌株中已经存在的量，计算在预混合物中使用的量。
根据下述次序，临时制备1个500μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(如在实施例IV中所教导的，制备10倍浓缩的PBS pH 7.4)+预混合物，5min室温磁力搅拌，+15μg HA H1N1株，10min室温磁力搅拌，+15μg HA H3N2株，10min室温磁力搅拌，+17.5μg HA B株，15min室温磁力搅拌。在它们制备结束后1小时内，注射该制剂。
三价裂解/AS03
制备吐温80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便达到750μg/ml吐温80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的疫苗终浓度。考虑它们在菌株中已经存在的量，计算在预混合物中使用的量。
根据下述次序，临时制备1个500μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(如在实施例IV中所教导的，制备10倍浓缩的PBS pH 7.4)+预混合物，5min室温磁力搅拌，+15μg HA H1N1株，10min室温磁力搅拌，+15μg HA H3N2株，10min室温磁力搅拌，+17.5μg HA B株，15min室温磁力搅拌，+250μl SB62乳状液(对于全剂量AS03)或125μl SB62乳状液(对于1/2剂量AS03)或50μl SB62乳状液(对于1/5剂量AS03)，15min室温磁力搅拌。在它们制备结束后1小时内，注射该制剂。
VIII.1.3.读出(表18)
在鼻内引发前(第0天)、免疫前(第28天)和免疫后14天，测量对疫苗接种的体液免疫应答(10猪/组)。通过血凝集抑制(HI)实验，测试血清样品。
表18
  读出   时间点   样品类型   分析方法
  体液应答   D0，D28，D42   血清   IHA
VIII.2.结果和结论
VIII.2.1.体液免疫
结果如图12所示。无论佐剂的稀释度如何，在该同源引发模型中，与平常三价制剂相比，AS03佐剂化的三价裂解制剂诱导了更强的对所有菌株的HI应答，尽管对于所有3种菌株不是总是达到了统计显著性。观察到了佐剂剂量效应，在菌株之间有轻微差异。对于更低的免疫原性菌株诸如B/山东，仅有用全剂量AS03佐剂化的三价裂解疫苗明显不同于平常疫苗。与全剂量AS03佐剂化的三价裂解疫苗不同，减少剂量的AS03不能使对于所有3种菌株的HI滴度增加到超过用平常疫苗观察到的滴度。
实施例IX
用不同稀释度的AS03佐剂化的dPly-PhtD-PD抗原的免疫原性
IX.1实验批号20080257
dPly(去毒的肺炎链球菌溶血素)和PhtD(聚组氨酸三联体蛋白D)是来自肺炎链球菌的蛋白，而PD是来自流感嗜血菌的蛋白D。用在AS03A(250μg SB62)中佐剂化的2种冻干临床批次dPly-PhtD-PD(DSPEA005A和006A)(组1和2)的人剂量的1/10，肌肉内地免疫C57bl小鼠3次(第0、14和28天)。在AS03A中的dPly-PhtD-PD的液体临床前批次用作参照疫苗(组3)。也评价了用AS03B(125μg SB62)和AS03C(62.5μg SB62)重配的临床批次DSPEA005(组4和5)。最后，注射用盐水重配的2种冻干的临床批次作为对比剂(组6和7)，以便测量佐剂对针对dPly、PhtD和PD抗原诱导的免疫应答的影响。
在第42天抽取小鼠血，通过ELISA测量针对每种抗原的抗体应答。数据如图13所示，GMC的单位是μg/ml。
证实了2种dPly-PhtD-PD临床批次(DSPEA005A和006A)的一致性。证实了冻干没有影响(组1和2相对于组3)。与没有佐剂的制剂(组6和7)相比，AS03制剂诱导了针对所有抗原的明显更高的抗体滴度(组1至5)。除了在AS03C制剂(组5)中的PD以外，在含有不同浓度佐剂的制剂(组1、4和5)诱导的针对每种抗原的抗体滴度之间没有观察到显著差异。
IX.2实验批号20080334-20080340
用在盐水中重配或在AS03A(250μg SB62)、AS03B(125μg SB62)和AS03C(62.5μg SB62)中佐剂化的在不同浓度(15-15-15；30-30-30和60-60-60μg)的dPly-PhtD-PD冻干临床批次(DSPEA006A)的人剂量的1/10，肌肉内地免疫C57bl小鼠3次(第0、14和28天)。
在第42天抽取小鼠血，通过ELISA测量针对每种抗原的抗体应答。数据如图14所示，GMC的单位是μg/ml。
与只含有盐水的制剂(组10至12)相比，含有AS03的制剂(组1至9)表现出针对所有抗原的明显增加的抗体滴度。没有观察到抗原剂量对针对每种抗原的免疫应答的明显影响。没有观察到佐剂稀释度对针对dPly和PhtD的抗体应答的显著影响。对于PD，在3和6μg的抗原浓度，在AS03A和C之间观察到显著差异。

Claims (28)

1.包含未缀合的肺炎链球菌蛋白和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳状液，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂。
2.包含未缀合的肺炎链球菌蛋白和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物由水包油乳状液组成，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂。
3.包含未缀合的肺炎链球菌蛋白和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含含一种或更多种其它免疫刺激剂的水包油乳状液，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂。
4.包含未缀合的肺炎链球菌蛋白和佐剂组合物的疫苗组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳状液，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂。
5.根据权利要求1-4的免疫原性组合物，其中所述水包油乳状液每人剂量包含1-10、2-10、3-9、4-8.5-7或5-6mg(例如2-3、5-6或9-10mg)可代谢油。
6.根据权利要求1-5的免疫原性组合物，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-11、1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6(例如10-11、5-6、2.5-3.5或1-3mg)母育酚。
7.根据权利要求1-6的免疫原性组合物，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或2-3mg(例如0.4-1.2、2-3或4-5mg)乳化剂。
8.根据权利要求1-7的免疫原性组合物，其中所述可代谢油的量是每人剂量5.35mg。
9.根据权利要求1-8的免疫原性组合物，其中所述可代谢油的量是每人剂量2.14mg。
10.根据权利要求1-9的免疫原性组合物，其中所述母育酚的量是每人剂量5.94mg。
11.根据权利要求1-10的免疫原性组合物，其中所述母育酚的量是每人剂量2.38mg。
12.根据权利要求1-11的免疫原性组合物，其中所述乳化剂的量是每人剂量2.425mg。
13.根据权利要求1-12的免疫原性组合物，其中所述乳化剂的量是每人剂量0.97mg。
14.根据权利要求1-13的免疫原性组合物，其中所述可代谢油是角鲨烯。
15.权利要求1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述母育酚是α-生育酚。
16.权利要求1-15中任一项的免疫原性组合物，其中所述乳化剂是聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。
17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯选自包含下列的组：聚山梨醇酯
Figure FPA00001277879000021
80或吐温
Figure FPA00001277879000022
80。
18.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物体积是在0.4至1.5ml之间。
19.根据权利要求18的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是0.5ml。
20.根据权利要求18的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是0.7ml。
21.根据权利要求18的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是1.0ml。
22.权利要求1-21中任一项的免疫原性组合物，其中所述未缀合的肺炎链球菌蛋白选自：PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、肺炎链球菌溶血素、LytB、LytC、LytA、Sp125、SP101、Sp128、Sp130、Sp133或在US6699703中公开的蛋白，包括由US6699703的SEQ ID NO：5225、5200、3166、4360、5137、4263、3166、5226、3716、4360、5243、3964、5179、3850、4263、5137、5226、5325、3850、5179或5325代表或编码的肺炎链球菌蛋白，或其免疫功能等效物。
23.权利要求22的免疫原性组合物，其包含2种或更多种未缀合的蛋白。
24.权利要求23的免疫原性组合物，其包含未缀合的肺炎链球菌PhtD和未缀合的肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素。
25.治疗或预防肺炎链球菌疾病的方法，其包含，给患有或易感肺炎链球菌感染或疾病的患者施用根据权利要求1-24中任一项的免疫原性组合物。
26.用于预防性治疗或治疗肺炎链球菌感染或疾病的根据权利要求1-24中任一项的免疫原性组合物。
27.根据权利要求1-24中任一项的免疫原性组合物在生产用于预防性治疗或治疗肺炎链球菌感染或疾病的药剂中的应用。
28.权利要求27的应用，其中所述佐剂组合物另外包含一种或更多种免疫刺激剂。
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