DE69838992T2

DE69838992T2 - Öl-in-Wasser Emulsionen mit Saponinen

Info

Publication number: DE69838992T2
Application number: DE1998638992
Authority: DE
Inventors: Nathalie Rue de l'Institut 89 GARCON; Patricia Marie Christine Aline Franc rue de l'Institut 89 Momin
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-09-02
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2018-09-03
Also published as: CA2302554C; ES2298316T3; US20030095974A1; EP1009382A1; AU1145699A; DE69815692D1; ES2201551T3; US20080160047A1; CA2302554A1; EP1009382B1; WO1999011241A1; DE69838992D1; US7323182B2; JP2001514208A; EP1279401A1; DE69815692T2; JP4426091B2; EP1279401B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Öl-in-Wasser-Emulsion-Impfstoffzusammensetzung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Impfstoffadjuvans-Formulierung auf Basis einer Öl-in-Wasser-Emulsion, die ein metabolisierbares Öl und ein Saponin umfaßt. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der Emulsion und ihre Verwendung in der Medizin.
Die Induktion von Reaktionen cytotoxischer T-Zellen (CTL) tritt in natürlicher Weise während der Infektion einer Zielzelle oder der ungesteuerten Synthese eines Tumor-Antigens auf, worin der enzymatische Abbau des Ziel-Antigens im Zellcytoplasma stattfindet. Dieses Phänomen erlaubt es cytoplasmatischen Peptiden, die aus dem Pathogen stammen, oder tumorspezifischem Antigen, die Th1-Reaktionswege (die endogene Antigen-Reifung) zu betreten und an die Oberfläche der Zelle zu gelangen, verbunden mit einem Molekül der MHC-Klasse I. Falls ein Impfstoffantigen nicht in das Cytoplasma der Wirtszelle eintritt, dann könnte es möglicherweise von der Zelle aufgenommen werden und den exogenen Antigen-Reifungsweg betreten und schließlich an die Oberfläche der Zelle gelangen, verbunden mit einem Molekül der MHC-Klasse II. Dieser alternative Weg führt allgemein zu T-Helferreaktionen und antigenspezifischen Antikörper-Reaktionen.
Nach der herkömmlichen Impfung mit Untereinheit- oder nicht-lebenden Impfstoffen betritt das Antigen allgemein nicht das Cytoplasma einer Wirtszelle und wird daher nicht den endogenen Antigen-Reifungsweg betreten und wird letztlich keine CTL-Reaktion induzieren. Es wird angenommen, daß die CTL-Induktion mit Th-1-Cytokinprofil-Reaktionen korreliert, spezifisch mit der IFN-γ- und IL-2-Sekretion. Die IFN-γ-Sekretion ist mit Schutzreaktionen gegen intrazelluläre Pathogene, einschließlich Parasiten, Bakterien und Viren, verbunden. Die Aktivierung von Leukozyten durch IFN-γ steigert die Abtötung intrazellulärer Pathogene und erhöht die Expression von Fc-Rezeptoren. Eine direkte Cytotoxizität kann ebenfalls auftreten, speziell im Synergismus mit Lymphotoxin (ein weiteres Produkt von TH1-Zellen). IFN-γ ist ebenfalls sowohl ein Induktor als auch ein Produkt von NK-Zellen, die hauptsächliche eigene Schutzeffektoren sind. Reaktionen vom TH1-Typ, entweder durch IFN-γ oder andere Mechanismen, stellen die bevorzugte Hilfe für mausartige IgG2a- und humane IgG1-Immunglobulin-Isotypen bereit.
Die internationale Patentanmeldung WO 95/17210 offenbart ein Adjuvans-Emulsionssystem auf Basis von Squalen, α-Tocopherol und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80), das mit dem Immunstimulans QS21 formuliert ist, gegebenenfalls mit 3D-MPL. Diese Adjuvansformulierung ist ein sehr wirksamer Induktor einer großen Reihe von Immunreaktionen.
Immunologisch aktive Saponin-Fraktionen (z. B. Quil A) mit Adjuvans-Aktivität, die aus der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja Saponaria Molina stammen, sind in diesem Fach bekannt. Derivate von Quil A, z. B. QS21 (ein Derivat von Quil A aus der HPLC-gereinigten Fraktion) und das Verfahren zu seiner Herstellung werden in US-PS 5 057 540 offenbart. Neben QS21 (ebenfalls als QA21 bekannt) werden ebenfalls andere Fraktionen wie QA17 offenbart. Die Verwendung solcher Saponine bei der Isolierung ist mit dem Nachteil behaftet, daß eine lokale Nekrose, d. h. ein lokalisierter Gewebstod, an der Injektionsstelle auftritt, wodurch Schmerz hervorgerufen wird.
Immunologisch aktive Saponin-Fraktionen mit Adjuvans-Aktivität, die aus der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja Saponaria Molina stammen, sind in diesem Fach bekannt. Zum Beispiel werden QS21, eine HPLC-gereinigte Fraktion aus dem Baum Quillaja Saponaria Molina, und das Verfahren zu seiner Herstellung (bekannt als QA21) in US-PS 5 057 540 offenbart. Die Verwendung solcher Saponine ist mit dem Nachteil behaftet, daß eine lokale Nekrose, d. h. ein lokalisierter Gewebstod, an der Injektionsstelle auftritt, wodurch Schmerz hervorgerufen wird.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A ist ein wohlbekanntes Adjuvans, das von Ribi Immunochem, Montana, hergestellt wird. Chemisch wird es häufig als Mischung von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryl-Lipid A mit entweder 4, 5 oder 6 acylierten Ketten zur Verfügung gestellt. Es kann durch die in GB-B-2 122 204 gelehrten Verfahren hergestellt werden. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryl-Lipid A ist in Form einer Emulsion mit einer geringen Teilchengröße von weniger als 0,2 μm Durchmesser, und sein Herstellungsverfahren wird in EP-B-0 671 948 offenbart.
Damit eine beliebige Öl-in-Wasser-Zusammensetzung zur menschlichen Verabreichung geeignet ist, muß die Ölphase des Emulsionssystems ein metabolisierbares Öl umfassen. Die Bedeutung des Begriffs metabolisierbares Öl ist in diesem Fach wohlbekannt. Metabolisierbar kann als "in der Lage zur Umwandlung durch Metabolismus" definiert werden (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25. Auflage (1974)). Das Öl kann jedes pflanzliche Öl, Fischöl, Tieröl oder synthetische Öl sein, das nicht toxisch für den Empfänger ist und durch Metabolismus umgewandelt werden kann. Nüsse, Samen und Körner sind übliche Quellen für pflanzliche Öle. Synthetische Öle sind ebenfalls Teil dieser Erfindung und können handelsübliche Öle wie NEOBEE^® und andere einschließen. Squalen (2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaen) ist ein ungesättigtes Öl, das in großen Mengen in Haileberöl und in geringeren Mengen in Olivenöl, Weizenkeimöl, Reiskleieöl und Hefe gefunden wird, und ist ein besonders bevorzugtes Öl zur Verwendung in dieser Erfindung. Squalen ist ein aufgrund der Tatsache metabolisierbares Öl, daß es eine Zwischenstufe in der Biosynthese von Cholesterol ist (Merck Index, 10. Auflage, Eintrag Nr. 8619).
Öl-in-Wasser-Emulsionen als solche sind in diesem Fach bekannt und wurden als nützlich als Adjuvanszusammensetzungen vorgeschlagen ( EP 399 843 ).
Die immunologischen Reaktionen auf die Verabreichung von Antigen, das in den in der internationalen Patentanmeldung WO 95/17210 beschriebenen Öl-in-Wasser-Emulsionen formuliert ist, können dadurch charakterisiert werden, daß sowohl Th2- als auch Th1-Reaktionen beobachtet werden. In Anbetracht der Tatsache, daß in vielen Fällen Reaktion vom Th1-Typ als kritisch für die Prophylaxe und Behandlung einer Krankheit identifiziert wurden, ist es daher wünschenswert, daß ein stärker auf Th1 gerichtetes Adjuvans entwickelt wird. Dies wurde höchst überraschend durch die Autoren der vorliegenden Erfindung erreicht, nicht durch Zugabe zusätzlicher Immunstimulatoren, sondern durch eine Reduzierung einer der ursprünglichen Komponenten.
Die in der internationalen Patentanmeldung WO 95/17210 beschriebenen Öl-in-Wasser-Adjuvansemulsionen besitzen ein hohes Verhältnis Squalen:Saponin (G/G) von 240:1. Die vorliegende Erfindung weist das Verhältnis Squalen:QS21 von im wesentlichen 48:1 auf. Diese Reduzierung einer der Komponenten hat die überraschende Wirkung der qualitativen Verbesserung der resultierenden Immunreaktion. Unter Verwendung dieser neuen Adjuvansformulierung werden starke Reaktionen vom Th2-Typ beibehalten, aber darüber hinaus weisen solche Formulierungen eine gesteigerte Immunreaktion auf, die spezifisch mit Reaktionen vom Th1-Typ verbunden ist, gekennzeichnet durch hohe IFN-γ-, T-Zell-proliferative und CTL-Reaktionen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Adjuvans oder eine pharmazeutische Formulierung, das/die QuilA oder ein Derivat davon, wie QS21, und eine Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt, worin die Öl-in-Wasser-Emulsion ein metabolisierbares Öl wie Squalen und ein Polysorbat (einschließlich Polyoxyethylensorbitanmonooleat, TWEEN 80^TM) umfaßt, wobei die Emulsionen dadurch gekennzeichnet sind, daß das Verhältnis Öl:QS21 im wesentlichen 48:1 ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Adjuvansformulierung ferner andere Immunmodulatoren, einschließlich α-Tocopherol und 3D-MPL.
Solche Formulierungen, sobald sie mit einem Antigen oder einer antigenen Zubereitung kombiniert werden, sind geeignet für einen breiten Bereich von monovalenten oder polyvalenten Impfstoffen. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion Polyoxyethylensorbitantrioleat (SPAN 85) enthalten. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acetyliertem Monophosphoryl-Lipid A wird in der unter der Nr. 92116556 – SmithKline Beecham Biologicals S. A. veröffentlichten internationalen Patentanmeldung offenbart.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Impfstoff-Formulierungen ein Antigen oder eine antigene Zusammensetzung, die zur Hervorrufung einer Immunreaktion gegen ein menschliches Pathogen fähig ist, wobei das Antigen oder die antigene Zusammensetzung aus folgenden stammt: HIV-1 (wie tat, nef, gp120 oder gp160), menschlichen Herpesviren, wie gD oder Derivaten davon, oder Unmittelbar Frühem Protein, wie ICP27 aus HSV1 oder HSV2, Cytomegalovirus (speziell menschlich) (wie gB oder Derivate davon), Rotavirus (einschließlich lebend abgeschwächter Viren), Epstein-Barr-Virus (wie gp350 oder Derivate davon), Varizella Zoster-Virus (wie gpI, II und IE63), oder aus einem Hepatitis-Virus wie Hepatitis B-Virus (z. B. Hepatitis B-Oberflächenantigen oder ein Derivat davon), Hepatitis A-Virus, Hepatitis C-Virus und Hepatitis E-Virus, oder aus anderen viralen Pathogenen: Pyramyxoviren, respiratorischem Synzytial-Virus (wie F- und G-Proteine oder Derivate davon), Parainfluenza-Virus, Masern-Virus, Mumps-Virus, menschlichen Papilloma-Viren (z. B. HPV6, 11, 16, 18, ...), Flaviviren (z. B. Gelbfieber-Virus, Dengue-Virus, Zecken-bärtiges Enzephalitis-Virus, japanisches Enzephalitis-Virus) oder Influenza-Virus, oder aus bakteriellen Pathogenen wie Neisseria spp. einschließlich N. gonorrhea und N. meningitidis (z. B. Kapsel-Polysaccharide und Konjugate davon, Transferin-bindende Proteine, Lactoferin-bindende Proteine, PilC, Adehesine); Streptococcus spp., einschließlich S. pneumoniae (z. B. Kapselpolysaccharide und Konjugate davon, PsaA, PspA, Streptolysin, Cholin-bindende Proteine), S. pyogenes (z. B. M-Proteine oder Fragmente davon, C5A-Protease, Lipoteichonsäuren), S. agalactiae, S. mutans; Haemophilus spp., einschließlich H. influenzae Typ B (z. B. PRP und Konjugate davon), nicht-typifizierbarem H. influenzae (z. B. OMP26, Adhesine mit hohem Molekulargewicht, P5, P6, Lipoprotein D), H. ducreyi; Moraxella spp., einschließlich M. catarrhalis, ebenfalls bekannt als Branhamella catarrhalis (z. B. Adhesine und Invasine mit hohem und niedrigem Molekulargewicht); Bordetella spp., einschließlich B. pertussis (z. B. Pertactin, Pertussis-Toxin oder Derivate davon, filamentöses Hämagglutinin, Adenylatcyclase, Fimbrien), B. parapertussis und B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., einschließlich M. tuberculosis (z. B. ESAT6, Antigen 85A, -B oder -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp., einschließlich L. pneumophila; Escherichia spp., einschließlich enterotoxisches E. coli (z. B. Kolonisierungsfaktoren, hitzelabiles Toxin oder Derivate davon, hitzestabiles Toxin oder Derivate davon), enterohämorrhagisches E. coli, enteropathogenes E. coli (z. B. Shigatoxin-artiges Toxin oder Derivate davon); Vibrio spp., einschließlich V. cholera (z. B. Cholera-Toxin oder Derivate davon); Shigella spp., einschließlich S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., einschließlich Y. enterocolitica (z. B. ein Yop-Protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., einschließlich C. jejuni (z. B. Toxine, Adhesine und Invasine) und C. coli; Salmonella spp., einschließlic S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., einschließlich L. monocytogenes; Helicobacter spp., einschließlich H. pylori (z. B. Urease, Catalase, vakuolisierendes Toxin); Pseudomonas spp., einschließlich P. aeruginosa; Staphylococcus spp., einschließlich S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., einschließlich E. faecalis, E. faecium; Chlostridium spp., einschließlich C. tetani (z. B. Tetanus-Toxin und Derivate davon), C. botulinum (z. B. Botulinum-Toxin und Derivate davon), C. difficile (z. B. Clostridium-Toxine A oder B und Derivate davon); Bacillus spp., einschließlich B. anthracis (z. B. Botulinum-Toxin und Derivate davon); Corynebacterium spp., einschließlich C. diphtheriae (z. B. Diphtheria-Toxin und Derivate davon); Borrelia spp., einschließlich B. burgdorferi (z. B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (z. B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (z. B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (z. B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., einschließlich E. equi und das Agens der humanen granulocytischen Ehrlichiose; Rickettsia spp., einschließlich R. rickettsii; Chlamydia spp., einschließlich C. trachomatis (z. B. MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. pneumoniae (z. B. MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. psittaci; Leptospira spp., einschließlich L. interrogans; Treponema spp., einschließlich T. pallidum (z. B. die seltenen äußeren Membranproteine), T. denticola, T. hyodysenteriae; oder aus Parasiten, wie Plasmodium spp. einschließlich P. falciparum; Toxoplasma spp., einschließlich T. gondii (z. B. SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., einschließlich E. histolytica; Babesia spp., einschließlich B. microti; Trypanosoma spp., einschließlich T. cruzi; Giardia spp., einschließlich G. lamblia; Leshamia spp., einschließlich L. major; Pneumocystis spp., einschließlich P. carinii; Trichomonas spp., einschließlich T. vaginalis; Schisostoma spp., einschließlich S. mansoni, oder aus Hefe, wie Candida spp., einschließlich C. albicans; Cryptococcus spp., einschließlich C. neoformans.
Derivate des Hepatitis B-Oberflächenantigens sind wohlbekannt in diesem Fach und schließen u. a. diejenigen PreS1, PreS2 S-Antigene ein, die in EP-A-414 374 , EP-A-0 304 578 und EP-A-198 474 beschrieben werden. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt die Impfstoff-Formulierung der Erfindung das HIV-1-Antigen, gp120, speziell bei Expression in CHO-Zellen. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Impfstoff-Formulierung der Erfindung gD2t wie hier zuvor definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden umfassen Impfstoffe, die das beanspruchte Adjuvans enthalten, die HPV-Viren, die als verantwortlich für Genitalwarzen betrachtet werden (HPV6 oder HPV11 und andere), und die HPV-Viren, die für Zervixwarzen verantwortlich sind (HPV16, HPV18 und andere). Besonders bevorzugte Formen des Impfstoffs umfassen L1-Partikel oder Capsomere und Fusionsproteine, die ein oder mehrere Antigene umfassen, ausgewählt aus den HPV6- und HPV11-Proteinen E6, E7, L1 und L2. Die am meisten bevorzugten Formen von Fusionsprotein sind: L2E7 wie in GB 95 15478.8 offenbart sowie Protein D(1/3)-E7, offenbart in GB 97 17953.5 .
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen ferner Antigene, die aus Parasiten stammen, die Malaria verursachen. Z. B. schließen bevorzugte Antigene aus Plasmodia falciparum RTS,S und TRAP ein. RTS ist ein Hybridprotein, das im wesentlichen den gesamten C-terminalen Anteil des Circumsporozoit-(CS)-Proteins von P. falciparum umfaßt, gebunden über vier Aminosäuren des preS2-Anteils des Hepatitis B-Oberflächenantigens an das Oberflächen-(S)-Antigen des Hepatitis B-Virus. Seine vollständige Struktur wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP92/02591 offenbart, veröffentlicht unter der Nr. WO 93/10152 , die eine Priorität aus der UK-Patentanmeldung Nr. 9124390.7 beansprucht. Bei Expression in Hefe wird RTS als Lipoprotein-Partikel erzeugt, und wenn es mit dem S-Antigen aus HBV co-exprimiert wird, erzeugt es ein gemischtes, als RTS,S bekanntes Partikel. TRAP-Antigene werden in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB89/00895 beschrieben, veröffentlicht als WO 90/01496 . Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Malaria-Impfstoff, in dem die antigene Zubereitung eine Kombination der RTS,S- und TRAP-Antigene umfaßt. Andere Plasmodia-Antigene, die wahrscheinliche Kandidaten für Komponenten eines Mehrstufen-Malaria-Impfstoffs sind, sind P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 und ihre Analoga in Plasmodium spp.
Die Formulierungen können ebenfalls ein Antitumor-Antigen enthalten und nützlich zur immuntherapeutischen Behandlung von Krebstypen sein. Z. B. findet die Adjuvans-Formulierung Brauchbarkeit mit Tumorabstoßungs-Antigenen, wie mit denen für Prostata-, Brust-, kolorektalen, Lugen-, Bauchspeicheldrüsen-, Nieren- oder Melanom-Krebs. Exemplarische Antigene schließen MAGE1 und MAGE3 oder andere MAGE-Antigene zur Behandlung von Melamon, PRAME, BAGE oder GAGE ein (Robbins und Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, S. 628–636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (eingereicht 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, S. 293). Tatsächlich werden diese Antigene in einem weiten Bereich von Tumor-Typen exprimiert, wie Melanom, Lungenkarzinom, Sarkom und Blasenkarzinom. Andere tumorspezifische Antigene sind zur Verwendung mit dem Adjuvans der vorliegenden Erfindung geeignet und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf prostataspezifisches Antigen (PSA) oder Her-2/neu, KSA (GA733), MUC-1 und karzinoembryonisches Antigen (CEA). Entsprechend wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Impfstoff bereitgestellt, der eine erfindungsgemäße Adjuvans-Zusammensetzung und ein Tumorabstoßungs-Antigen umfaßt.
Es wird vorausgesehen, daß Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Formulierung vom Impfstoffen verwendet werden, die aus Borrelia sp. stammende Antigene enthalten. Antigene können z. B. Nukleinsäure, aus einem Pathogen stammendes Antigen oder antigene Zubereitungen, rekombinant erzeugtes Protein oder Peptide und chimäre Fusionsproteine einschließen. Insbesondere ist das Antigen OspA. Das OspA kann ein vollständig reifes Protein in einer lipidierten Form, das aufgrund der Wirtszelle (E. coli) bezeichnet wird (Lipo-OspA), oder ein nicht-lipidiertes Derivat sein. Solche nicht-lipidierten Derivate schließen das nicht-lipidierte NS1-OspA-Fusionsprotein, das die ersten 81 N-terminalen Aminosäuren des Nicht-Strukturproteins (NS1) des Grippevirus aufweist, und das vollständige OspA-Protein ein, und ein anderes, MDP-OspA, ist eine nicht-lipidierte Form von OspA, die drei zusätzliche N-terminale Aminosäuren trägt.
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können zur Prophylaxe oder Therapie von Allergie verwendet werden. Solche Impfstoffe würden Allergen-spezifische (z. B. Der p1) und Allergen-unspezifische Antigene (z. B. das Stanworth-Decapeptid) umfassen.
Das Verhältnis QS21:3D-MPL (G/G) in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird typischerweise in der Größenordnung 1:10 bis 10:1 sein; bevorzugt 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlichen 1:1. Der bevorzugte Bereich zur optimalen Synergie ist von 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21. Typischerweise werden die Dosierungen von QS21 und 3D-MPL in einem Impfstoff zur menschlichen Verabreichung im Bereich von 1 bis 1000 μg sein, bevorzugt 10 bis 500 μg und am meisten bevorzugt 10 bis 100 μg pro Dosis. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion 2 bis 10% Squalen, 2 bis 10% α-Tocopherol und 0,4 bis 2% Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80) umfassen. Bevorzugt ist das Verhältnis Squalen:α-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies eine stabilere Emulsion bereitstellt. Polyoxyethylensorbitantrioleat (SPAN 85) kann ebenfalls in einer Menge von 0,5 bis 1% vorhanden sein. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die erfindungsgemäßen Impfstoffe ferner einen Stabilisator enthalten, z. B. andere Emulgatoren/Tenside, einschließlich Caprylsäure (Merck Index, 10. Auflage, Eintrag Nr. 1739), von denen Tricaprylin eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist.
Daher ist eine andere Ausführungsform dieser Erfindung ein Impfstoff, der QS21 und eine Öl-in-Wasser-Emulsion enthält, die in das gewünschte Verhältnis fällt, die in Gegenwart eines Sterols, bevorzugt Cholesterol, formuliert wird, um die lokale Reaktogenität zu reduzieren, die durch das QS21 verliehen wird. Das Verhältnis von QS21 zu Cholesterol (G/G), das in einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, wird im Bereich von 1:1 bis 1:20, im wesentlichen 1:10 vorhergesehen.
Die früheren Emulsionen, die in der internationalen Patentanmeldung WO 95/17210 verwendet werden, beinhalten offensichtlich einige Vorteile gegenüber herkömmlichen nicht-Th1-induzierenden Adjuvantien.
Jedoch hat der Einschluß von QS21 dieses wirksame Adjuvans reaktogen gemacht, was dadurch zu Schmerz führte. Es wurde beobachtet, daß die Formulierung des QS21 in Cholesterol enthaltende Liposome bei der Verhinderung von Nekrose helfen kann, die an der Injektionsstelle auftritt. Diese Beobachtung ist Gegenstand der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP96/01464 .
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das bevorzugte Sterol Cholesterol. Andere Sterole, die in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, schließen β-Sitosterol, Stigmasterol, Ergosterol, Ergocalciferol und Cholesterol ein. Sterole sind in diesem Fach wohlbekannt. Cholesterol ist wohlbekannt und wird z. B. im Merck Index, 11. Auflage, Seite 341 als natürlich vorkommendes Sterol offenbart, das in Tierfett gefunden wird.
QS21 in wäßriger Lösung ist dafür bekannt, sich im Verlauf der Zeit zu einer Adjuvans-inaktiven Form, QS21-H, abzubauen, wobei der Abbau durch OH-Hydrolyse durch das wäßrige Medium vermittelt wird. Ein solcher Abbau kann auftreten, wenn das QS21 in der wäßrigen Phase eins Öl-in-Wasser-Adjuvans vorhanden ist. Überraschend wurde gefunden, daß die Zugabe von Cholesterol zur Ölphase der Öl-in-Wasser-Emulsion die Wirkung hat, das QS21 in seiner aktiven Form zu bewahren, mit offensichtlichen Vorzügen für die Haltbarkeit der Adjuvans/Impfstoff-Formulierung. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Stabilisierung einer Zubereitung aus einem Saponin, bevorzugt QS21, in seiner nicht-hydrolysierten Adjuvans-aktiven Form bereit, wenn das QS21 in einem Adjuvans auf Basis einer Öl-in-Wasser-Emulsion vorhanden ist. Dieses Verfahren umfaßt die Zugabe eines Sterols, bevorzugt Cholesterol, zur Ölphase einer Öl-in-Wasser-Emulsion.
Solche Zubereitungen werden als Impfstoff-Adjuvans-Systeme verwendet und, sobald formuliert, zusammen mit Antigen oder antigenen Zubereitungen für wirksame Impfstoffe. Vorteilhaft induzieren sie bevorzugt eine Th1-Reaktion.
Die Emulsionssysteme der vorliegenden Erfindung besitzen eine geringe Öltröpfchengröße im Submikrometer-Bereich. Bevorzugt wird die Öltröpfchengröße im Bereich von 120 bis 750 nm sein und am meisten bevorzugt mit einem Durchmesser von 120 bis 600 nm.
Die Protein-Menge in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine Immunschutzreaktion ohne signifikante, nachteilige Nebenwirkungen bei typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird in Abhängigkeit davon variieren, welches spezifische Immunogen eingesetzt wird und wie es angeboten wird. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 1000 μg Protein, bevorzugt 1 bis 500 μg, bevorzugt 1 bis 100 μg, am meisten bevorzugt 1 bis 50 μg umfassen wird. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, die die Beobachtung der geeigneten Immunreaktionen bei Patienten beinhalten. Im Anschluß an eine Erstimpfung können die Patienten eine oder mehrere, angemessen auseinanderliegende Auffrischimmunisierungen erhalten.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können sowohl für prophylaktische als auch therapeutische Zwecke verwendet werden. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff wie hier beschrieben zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt. Die Impfstoffzubereitung wird allgemein beschrieben in New Trends and Developments in Vaccines, Herausgeber Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978.
Es wird vorhergesehen, daß Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Impfstoffe zu formulieren, die aus einer großen Vielzahl von Quellen stammende Antigene enthalten. Z. B. können Antigene menschliche, bakterielle oder virale Nukleinsäure, aus einem Pathogen stammendes Antigen oder antigene Zubereitungen, aus einem Tumor stammendes Antigen oder antigene Zubereitungen, aus einem Wirt stammende Antigene, einschließlich des Histamin-freisetzenden Decapeptids von IgE (bekannt als das Stanworth-Decapeptid), rekombinant erzeugtes Protein oder Polypeptide und chimäre Fusionsproteine einschließen.
Die Impfstoffzubereitungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um ein Säugetier, das anfällig für eine Krankheit ist oder daran leidet, durch Verabreichung des Impfstoffs über den systemischen oder Schleimhautweg zu schützen oder zu behandeln. Diese Verabreichungen können die Injektion über den intramuskulären, intraperitonealen, intradermalen oder subkutanen Weg; oder über die Schleimhaut-Verabreichung an den oralen/Verdauungstrakt oder die Atemwege einschließen.
Beispiel 1
Herstellung der Öl-in-Wasser-Emulsion-Adjuvantien
Die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten Öl-in-Wasser-Emulsion-Adjuvansformulierungen wurden jeweils hergestellt, um die folgenden Öl-in-Wasser-Emulsionskomponenten zu umfassen: 5% Squalen, 5% α-Tocopherol, 2,0% Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80).
Die Emulsion wurde wie folgt als 2-faches Konzentrat hergestellt. Alle in den immunologischen Experimenten verwendeten Beispiele werden unter Zugabe der zusätzlichen Komponenten und Verdünnungsmittel verdünnt, um eine einfache Konzentration (entsprechend einem Squalen:QS21-Verhältnis (G/G) von 240:1) oder weitere Verdünnungen davon zu ergeben.
Kurz gesagt wird TWEEN 80 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, um eine 2%ige Lösung in PBS zu ergeben. Um 100 ml einer 2-fachen Konzentratemulsion zu ergeben, werden 5 ml DL-α-Tocopherol und 5 ml Squalen sorgfältig wirbelvermischt. 95 ml PBS/TWEEN-Lösung werden zum Öl hinzugegeben und sorgfältig vermischt. Die resultierende Emulsion wird dann durch eine Spritzennadel geführt und schließlich unter Verwendung einer M110S Microfluidics-Maschine mikrofluidisiert. Die resultierenden Öltröpfchen haben eine Größe von ca. 145–180 nm (ausgedrückt als z-Durchschnitt, gemessen durch PCS) und werden als SB62 "voller Dosis" bezeichnet.
Die anderen Adjuvans/Impfstoff-Komponenten (QS21, 3D-MPL oder Antigen) werden zur Emulsion durch einfaches Zumischen hinzugegeben.
Die hier verwendeten Antigen-enthaltenden Impfstoffe werden entweder mit SB62-Adjuvans voller Dosis formuliert, um ein hohes Squalen:QS21-Verhältnis zu ergeben (240:1), oder mit einer geringeren Menge SB62, um eine Formulierung mit niedrigem Verhältnis (48:1) zu ergeben. Diese Adjuvans-Formulierungen werden SB62 bzw. SB62' genannt. Andere Impfstoffe können gegebenenfalls bei der Zugabe von Cholesterol zur Ölphase der Emulsion formuliert werden (bezeichnet durch die Hinzufügung des Buchstaben "c").
Beispiel 2
Immunogenitätsuntersuchungen mit rekombinantem Antigen S,L*.
Eine Untersuchung wurde in Balb/C-Mäusen durchgeführt, um die Immunogenität verschiedener S,L*-haltiger Formulierungen zu vergleichen. S,L* ist ein zusammengesetztes Antigen, das ein modifiziertes Oberflächenantigen-L-Protein (L*) und ein S-Protein umfaßt, die beide aus dem Hepatitis B-Virus stammen (HB). Dieses zusammengesetzte Antigen ist Gegenstand der europäischen Patentanmeldung EP 0 414 374 . Dieses Immunisierungsschema wurde im transgenen HBs-Maus-Modell verwendet, von dem zuvor gezeigt wurde, daß es die Induzierung von CTL in Balb/c-Mäusen fördert.
Unterschiedliche Adjuvans-Formulierungen, die die wie in Beispiel 1 beschriebenen Emulsionssysteme verwenden, mit unterschiedlichen Verhältnissen von Squalen:QS21, und die gegebenenfalls Cholesterol umfassen (QS21:Cholesterol-Verhältnis (G/G) von 1:10), wurden mit S,L* kombiniert und in ihrer Fähigkeit verglichen, humoral und Zell-vermittelte Immunreaktionen zu induzieren (Cytokin-Produktion und CTL). An Aluminiumhydroxid (AlOH₃) adsorbiertes S,L* wurde als Th2-induzierende Kontrolle verwendet.
Kurz gesagt wurden Gruppen von 10 Mäusen 4-mal in Intervallen von 3 Wochen mit 2 μg lyophilisiertem S,L*, das mit verschiedenen Öl-in-Wasser-Emulsionssystemen kombiniert wurde (SB62), intramuskulär immunisiert. 14 Tage nach der vierten Immunisierung wurde die Produktion von Cytokinen (IL5 und IFN-γ) und die CTL-Aktivität nach in vitro-Restimulierung von Milz- und Lymphknotenzellen mit S,L*-Antigen analysiert. Die Antikörperreaktion auf S,L* und das induzierte isotypische Profil wurden durch ELISA 21 Tage nach II und 14 Tage nach IV überwacht.
Gruppen von Mäusen

Gruppen von 10 Balb/C-Mäusen wurden intramuskulär mit den nachfolgend beschriebenen Formulierungen immunisiert. SB62 wurde zusammen mit dem Antigen mit einem hohen (240:1, SB62) oder niedrigen (48:1, SB62') Verhältnis von Squalen:QS21 formuliert, gegebenenfalls unter Zugabe von Cholesterol (c). Tabelle 1: In Beispiel 2 verwendete Gruppen von Mäusen und Impfstoffzusammensetzungen

Gruppe	Antigen S,L*	Adjuvansbezeichnung	Zusammensetzung der Adjuvansformulierung
GR 1	2 μg	SB62	25 μl SB62/5 μg QS21/5 μg 3D-MPL
GR 2	2 μg	SB62c	25 μl SB62c/5 μg QS21/5 μg 3D-MPL
GR 3	2 μg	SB62'	5 μl SB62/5 μg QS21/5 μg 3D-MPL
GR 4	2 μg	SB62'c	5 μl SB62c/5 μg QS21/5 μg 3D-MPL
GR 5	2 μg	Alaun	50 μg AlOH₃

Immunisierungsschema
Die Tiere wurden intramuskulär im Bein (50 μl für alle Gruppen, ausgenommen die Gruppe 5, in der 100 μl injiziert wurden) an den Tagen 0, 21, 42 und 63 immunisiert. Blut wurde aus dem Sinus retroorbitalis zu verschiedenen Zeitpunkten nach den Immunisierungen entnommen. Am Tag 77 wurden Tiere aus jeder Gruppe getötet, Milz und Lymphknoten, die die Injektionsstelle drainieren (Darmbein-Lymphknoten), wurden zur in vitro-Restimulierung entnommen. Ansammlungen von 3 oder 4 Milzen und eine Ansammlung von 10 Lymphknoten wurden für jede Gruppe erhalten und separat im in vitro-Test behandelt.
Maus-Serologie
Die Quantifizierung von Anti-HBs-Antikörper wurde durch ELISA unter Verwendung von HB-Oberflächenantigen als Coating-Antigen durchgeführt. Antigen- und Antikörper-Lösungen wurden mit 50 μl pro Vertiefung verwendet. Antigen wurde in einer Endkonzentration von 1 μg/ml in PBS verdünnt und wurde über Nacht bei 4°C in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dänemark) adsorbiert. Die Platten wurden dann für 1 h bei 37°C mit PBS, das 1% Rinderserumalbumin und 0,1% TWEEN 20 enthielt (Sättigungspuffer), inkubiert. Zweifache Verdünnungen der Seren (ausgehend mit einer 1/100 Verdünnung) im Sättigungspuffer wurden zu den HBs-beschichteten Platten gegeben und für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit PBS 0,1% TWEEN 20 gespült, und Biotin-konjugiertes Anti-Maus-IgG1, IgG2a, IgG2b oder Ig (Amersham, UK), verdünnt in Sättigungspuffer auf 1/1000, wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde Streptavidin-biotinylierter Peroxidase-Komplex (Amersham, UK), verdünnt in Sättigungspuffer auf 1/5000, für zusätzliche 30 min bei 37°C hinzugegeben. Die Platten wurden wie oben gespült und für 20 min mit einer Lösung aus o-Phenylendiamin (Sigma) 0,04%, H₂O₂ 0,03% in 0,1% TWEEN 20 0,05 M Citratpuffer pH 4,5 inkubiert. Die Reaktion wurde mit 2N H₂SO₄ angehalten und bei 492/620 nm ausgelesen. ELISA-Titer wurden aus einer Referenz mit SoftmaxPro (unter Verwendung einer Gleichung mit vier Parametern) berechnet und in EU/ml ausgedrückt.
T-Zell-Proliferation
Zwei Wochen nach der Immunisierung wurden die Mäuse getötet, Milz und Lymphknoten wurden aseptisch in Ansammlungen entfernt (3 oder 4 Organe pro Ansammlung für Milzzellen, 1 Ansammlung für 10 Organe für Lymphknotenzellen).
Zellsuspensionen wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO), das 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 1% syngenes normales Mausserum enthielt, hergestellt. Die Zellen wurden mit einer Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml (für Lymphknotenzellen oder Milzzellen) in 200 μl-Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (10–0,03 μg/ml) von S,L*-Antigen kultiviert (25D84). Jeder Test wurde vierfach durchgeführt. Nach 96 h Kultivieren bei 37°C unter 5% CO₂ wurden die Zellen für 18 h mit 3H-Thymidin (Amersham, UK, 5 Ci/mmol) bei 0,5 μCi/Vertiefung gepulst und dann an Glasfaserfiltern mit einem Zellernter geerntet. Aufgenommene Radioaktivität wurde in einem Flüssig-Szintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse werden in cpm ("Impulse pro Minute", counts per minute) (mittlere cpm in vierfachen Vertiefungen) oder als Stimulierungsindizes (mittlere cpm in Kulturen von Zellen mit Antigen/mittlere cpm in Kulturen von Zellen ohne Antigen) ausgedrückt.
Cytokin-Produktion
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, und Milz und Lymphknoten wurden aseptisch in Ansammlungen entfernt (3 oder 4 Organe pro Ansammlung für Milzzellen, 1 Ansammlung von 10 Organen für Lymphknotenzellen). Zellsuspensionen wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO) hergestellt, das 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% Kalbfötusserum enthielt. Die Zellen wurden in einer Endkonzentration von 2,5 bis 5 × 10⁶ Zellen/ml (jeweils für Lymphknotenzellen oder Milzzellen) in flachbödigen 1 ml-Platten mit 24 Vertiefungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (1–0,01 μg/ml) von S,L* kultiviert (25D84). Überstände wurden 96 h später geerntet und bis zum Test auf Gegenwart von IFN-γ und IL-5 durch ELISA tiefgefroren.
IFN-γ-Produktion
Die Quantifizierung von IFN-γ wurde durch ELISA unter Verwendung von Reagenzien von Genzyme durchgeführt. Proben und Antikörperlösungen wurden mit 50 μl pro Vertiefung verwendet. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl Hamster-Anti-Maus-IFN-γ beschichtet, verdünnt auf 1,5 μg/ml in Carbonatpuffer, pH 9,5. Die Platten wurden dann für 1 h bei 37°C mit 100 μl PBS inkubiert, das 1% Rinderserumalbumin und 0,1% TWEEN 20 enthielt (Sättigungspuffer). Zweifache Verdünnungen des Überstands aus einer in vitro-Stimulierung (beginnend bei 1/2) in Sättigungspuffer wurden zu den Anti-IFN-γ-beschichteten Platten hinzugegeben und für 1 h 30 bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit PBS TWEEN 0,1% (Waschpuffer) gewaschen, und Biotin-konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IFN-γ, verdünnt in Sättigungspuffer mit einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml, wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde AMDEX-Konjugat (Amersham), verdünnt 1/10000 in Sättigungspuffer, für 30 min bei 37°C hinzugegeben. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit 50 μl TMB (Biorad) für 10 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit 0,4 N H₂SO₄ beendet und bei 450 nm ausgelesen. Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standardkurve (Maus-IFN-γ-Standard) durch SoftmaxPro (Gleichung mit vier Parametern) berechnet und in pg/ml ausgedrückt.
IL-5-Produktion
Die Quantifizierung von Il-5 wurde durch ELISA unter Verwendung von Reagenzien von Pharmingen durchgeführt. Proben und Antikörper-Lösungen wurden mit 50 μl pro Vertiefung verwendet. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorb-Immuno-plate, Nunc, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl Ratte-Anti-Maus-IL-5 beschichtet, verdünnt auf 1 μg/ml in Carbonatpuffer, pH 9,5. Die Platten wurden dann für 1 h bei 37°C mit 100 μl PBS inkubiert, das 1% Rinderserumalbumin und 0,1% TWEEN 20 enthielt (Sättigungspuffer). Zweifache Verdünnungen des Überstands aus einer in vitro-Stimulierung (beginnend mit 1/2) in Sättigungspuffer wurden zu den Anti-IL-5-beschichteten Platten hinzugegeben und für 1 h 30 bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden viermal mit PBS TWEEN 0,1% (Waschpuffer) gewaschen, und Biotin-konjugiertes Ratte-Anti-Maus-IL-5, verdünnt in Sättigungspuffer auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml, wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde AMDEX-Konjugat (Amersham), verdünnt 1/10000 in Sättigungspuffer, für 30 Minuten bei 37°C hinzugegeben. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit 50 μl TMB (Biorad) für 15 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit 0,4 N H₂SO₄ beendet und bei 450 nm ausgelesen. Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standardkurve (rekombinantes Maus-IL-5) durch SoftmaxPro (Gleichung mit vier Parametern) berechnet und in pg/ml ausgedrückt.
CTL-Induzierung
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, und die Milzen wurden aseptisch in Ansammlungen von 3 oder 4 Mäusen entfernt (2 Ansammlungen von 3 und eine Ansammlung von 4 Mäusen pro Gruppe). Zellsuspensionen wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO) hergestellt, das 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% Kalbfötusserum enthielt. Die Zellen wurden mit einer Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in 10 ml Medium kultiviert, das 2 μg/ml SL* und 1,25% ConA sup (25 cm² Falcon-Kolben) enthielt, und für 8 Tage bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert.
CTL-Test
Am Tag vor dem CTL-Test (d7), wurden Zielzellen durch Inkubation von P815-Zellen (10⁶ Zellen/ml) mit S,L* (Ansatz 25D84) oder Peptid S_28-39 mit 10 μg/ml hergestellt. 1 h nach der Inkubation in 15 ml Falcon-Röhrchen in einem kleinen Volumen wurden die Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen überführt und bei 37°C über Nacht inkubiert.
Am Tag des Tests wurden 2 × 10⁶ S,L*- und S_28-39-gepulste P815-Zellen und P815-S zentrifugiert, in 50 μl FCS resuspendiert und mit 75 μl ⁵¹Cr (375 μCi) für 1 h bei 37°C inkubiert (Schütteln alle 15 min). Die Zellen werden dann 4-mal mit 10 ml Komplettmedium gewaschen und für 30 min bei 4°C im Anschluß an die vierte Waschung inkubiert. Die Zellen werden dann zentrifugiert und mit einer Konzentration von 2 × 10⁴ Zellen/ml resuspendiert.
Effektorzellen werden dann zentrifugiert, gezählt und mit 2 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Dreifache Reihenverdünnungen von Effektorzellen werden in Platten mit 96 V-Böden, beginnend mit einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung/100 μl, durchgeführt.
2 × 10³ Zielzellen in 100 μl werden zu den Effektorzellen in dreifacher Ausführung hinzugegeben. Die spontane und maximale Freisetzung werden durch Inkubieren der Zielzellen jeweils mit Medium oder Triton X100 3% getestet.
Die Platten werden für 3 min bei 700 U/min zentrifugiert und für 4 h bei 37°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubationszeit werden 50 μl Überstand aus jeder Vertiefung in Luma-Platten übertragen und über Nacht getrocknet, bevor sie in einem Top-Count-Szintillationszähler gezählt werden. Die Ergebnisse werden als spezifische Lyse ausgedrückt und wie folgt berechnet: % SR = (Mittelwert cpm Probe – Mittelwert cpm Medium/Mittelwert cmp max – Mittelwert cpm Medium) × 100
Ergebnisse
Serologie
Humorale Reaktionen (Ig- und IgG-Isotypen) wurden durch ELISA unter Verwendung von HB-Oberflächeantigen als Coating-Antigen gemessen. Nur Daten aus den 21 Tagen nach Zeitpunkt II sind gezeigt. Diese Ergebnisse sind in den 1 und 2 angegeben.
1 zeigt Hbs-spezifische Ig-Antikörper-Reaktionen, gemessen an beiden individuellen Mausseren, und den Gruppendurchschnitt 14 Tage nach II.
2 zeigt die Sub-Isotyp-Verteilung von Hbs-spezifischem IgG im Serum der geimpften Mäuse.

• Wie aus 1 ersichtlich ist, induzieren SB62-bezogene Formulierungen viel höhere Antikörper-Titer als die S,L*-Alaun-Formulierung.
• Die statistische Analyse für individuelle Seren (Anoval-Test Newman Keuls) zeigt keinen signifikanten Unterschied in den durch SB62c und SB62'c induzierten Antikörper-Titern oder gleichsam zwischen den durch SB62 und SB62'c induzierten Antikörper-Titern. Die resultierenden Anti-S,L*-Antikörper-Titer sind daher unabhängig vom Squalen:QS21-Verhältnis.
• Das Sub-Isotypen-Verteilungsprofil (wie in 2 gezeigt) ist vergleichbar für alle SB62-bezogenen Formulierungen (25–30% IgG2a), wohingegen Alaun nur 4% IgG2a induziert.

Zell-vermittelte Immunreaktionen
Zell-vermittelte Immunreaktionen (Lymphoproliferation, IFN-γ/IL-5-Produktion und CTL) wurden 14 Tage nach IV nach einer in vitro-Restimulierung von Milz- und Darmbein-Lymphknotenzellen mit S,L*-Antigen gemessen.
Cytokin-Produktion
Cytokin-Produktion (IFN-γ und IL-5) wurde im Anschluß an 96 h in vitro-Restimulierung von Milzzellen und Darmbein-Lymphknotenzellen mit S,L* gemessen. Diese Ergebnisse sind in den 3 bis 6 wiedergegeben.
3 zeigt die Ergebnisse der IFN-γ-Produktion durch Milzzellen (Mittelwert der Daten erhalten mit drei Ansammlungen/Gruppe).
4 zeigt die Ergebnisse der IL-5-Produktion durch Milzzellen (Mittelwert der Daten erhalten mit drei Ansammlungen/Gruppe).
5 zeigt die Ergebnisse der IFN-γ-Produktion durch Darmbein-Lymphknotenzellen (Mittelwert der Daten erhalten mit drei Ansammlungen/Gruppe).
6 zeigt die Ergebnisse der IL-5-Produktion durch Darmbein-Lymphknotenzellen (Mittelwert der Daten erhalten mit drei Ansammlungen/Gruppe). Tabelle 2: Verhältnis von IFN-γ:IL-5-produzierenden Zellen, nachgewiesen in Milzzellen

Restimulation Gruppen

GR 1 GR 2 GR 3 GR 4 GR 5

S,L* 10 μg/ml 22,9 10,7 51,7 17,0 0,9
Diskussion

• Kleinere Mengen Emulsion sind vorteilhaft für die IFN-γ-Produktion. Sehr hohe Mengen von IFN-γ werden nach der Restimulation von Milzzellen von Tieren produziert, die mit Formulierungen immunisiert wurden, die die Emulsion mit niedrigem Verhältnis enthielten. Diese Mengen sind signifikant größer als diejenigen, die nach Impfung mit entsprechenden Formulierungen erhalten wurden, welche eine Emulsion voller Dosis enthielten. Die stärkste IFN-γ-Produktion wird nach Restimulierung von Milzzellen von Tieren erhalten, die mit S,L* SB62 und SB62'c immunisiert wurden.
• Die vorteilhafte Wirkung der Formulierungen mit niedrigem Verhältnis (Gruppen 3 und 4 in 5 und 6) sind viel deutlicher bei Betrachtung von Zellen, die aus dem drainierenden Lymphknoten stammen (Darmbein-Lymphknoten), verglichen mit den aus der Milz entnommenen.
• Ein IFN-γ:IL-5-Verhältnis > 1 legt eindeutig nahe, daß eine Pro-TH1-Reaktion durch alle SB62-bezogenen Formulierungen induziert wird (siehe Tabelle 1).
• Höhere Mengen von IL-5 werden durch Tiere produziert, die mit S,L* SB62c-Formulierungen anstelle von S,L* SB62-Formulierungen, die kein Cholesterol enthalten, immunisiert wurden. S,L*-Alaun-immunisierte Tiere produzieren die höchsten Mengen von IL-5.
• Eine stärkere IFN-γ-Produktion wird beobachtet, wenn die Formulierungen mit einem niedrigem Verhältnis Squalen:QS21 (SB62' und SB62'c) verwendet werden.

Cytotoxische T-Zellreaktion
Die Anti-S,L*-CTL-Reaktionen sind in 7 angegeben.
7 zeigt die CTL-Aktivität von Milz-T-Zellen, die in vitro für 7 Tage mit S,L*-Antigen stimuliert wurden (mittlere prozentuale spezifische Lyse von drei Ansammlungen).
Diskussion der CTL-Ergebnisse

• Spezifische Lyse wird mit allen Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen erhalten.
• Eine stärkere CTL-Reaktion wird mit Formulierungen beobachtet, die SB62'-Emulsionen enthalten, wenn sie bei einem beschränkenden E/T-Verhältnis wie 3/1 betrachtet werden.

Schlußfolgerungen

1. Die stärkste IFN-γ-Produktion wird im Anschluß an Immunisierung mit SB62'-Emulsionen beobachtet.
2. Eine leicht bessere CTL-Reaktion wird durch Formulierungen induziert, die SB62'-Emulsionen enthalten, verglichen mit den entsprechenden Formulierungen, die eine Emulsion voller Dosis verwenden.
3. Das Profil vom TH1-Typ der Immunreaktion, die durch alle SB62-bezogenen Formulierungen induziert wird, wird ferner durch das IFN-γ/IL-5-Verhältnis bestätigt.
4. Kein signifikanter Unterschied wird zwischen Antikörpertitern beobachtet, die im Anschluß an Immunisierung mit SB62c voller Dosis oder SB62'c induziert werden.
5. Kein signifikanter Unterschied wird zwischen Antikörpertitern beobachtet, die im Anschluß an Immunisierung mit SB62c und SB62' induziert werden.
6. Ein vergleichbares Isotypenprofil (25–30% IgG2a) wird mit allen SB62-bezogenen Formulierungen erhalten, was die Induzierung einer HBs-spezifischen Immunreaktion vom TH1-Typ nahelegt.

Tabelle 3: Zusammenfassende Tabelle, die die Ergebnisse aus Beispiel 2 zeigt

Immunparameter	S,L*-enthaltende Formulierungen
	SB62	SB62c	SB62'	SB62'c	Alaun
Ab-Titer	+++	+++	++	+++	+
TH-Typ (% IgG2a)	TH1 (29)	TH1 (26)	TH1 (29)	TH1 (30)	TH2 (4)
IFN-γ (SPC)	+	++	+++	++++	+
IL-5 (SPC)	–	+	+	++	+++
CTL	+	+	++	++	–

Beispiel 3
Immunogenitätsuntersuchungen mit Malaria-Antigenen TRAP und RTS,S
Immunisierungsexperimente unter Verwendung der Plasmodium falciparum-Malaria-Antigene TRAP und RTS,S in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien, jeweils auf Basis eines Öl-in-Wasser-Emulsionssystems. RTS ist ein Hybrid-Protein, das im wesentlichen den gesamten C-terminalen Anteil des Circumsporozoit-(CS)-Proteins von P. falciparum enthält, gebunden über vier Aminosäuren des preS₂-Anteils des Hepatitis B-Oberflächenantigens an das Oberflächen-(S)-Antigen des Hepatitis B-Virus. Seine vollständige Struktur wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP92/02591 offenbart, veröffentlicht als WO 93/10152 unter Beanspruchung der Priorität der GB-Patentanmeldung Nr. 9124390.7 . Bei Expression in Hefe wird RTS als Lipoprotein-Partikel erzeugt, und wenn es mit dem S-Antigen von HBV co-exprimiert wird, erzeugt es ein als RTS,S bekanntes gemischtes Partikel.
TRAP-Antigene werden in der internationalem Patentanmeldung Nr. PCT/GB89/00895 beschrieben, veröffentlicht als WO 90/01496 . TRAP-Antigene sind Polypeptide, sogenannte Thrombospondin-bezogene anonyme Proteine, die eine Homologie mit verschiedenen P. falciparum-Proteinen teilen.
Unterschiedliche Adjuvans-Formulierungen, die die Emulsionssysteme wie in Beispiel 1 beschrieben verwenden, mit unterschiedlichen Verhältnissen Squalen:QS21 und gegebenenfalls Cholesterol umfassend (QS21:Cholesterol-Verhältnis G/G von 1:10), wurden mit den Malaria-Antigenen kombiniert und in ihrer Fähigkeit verglichen, humorale und Zell-vermittelte Immunreaktionen zu induzieren (T-Zellproliferation und Cytokin-Produktion). SB62 wurde zusammen mit dem Antigen mit einem hohen (240:1, SB62) oder niedrigen (48:1, SB62') Verhältnis von Squalen:QS21 formuliert, gegebenenfalls unter Zugabe von Cholesterol (c).

Gruppen von 5 Mäusen (sechs Wochen alte weibliche Mäuse, Stamm C57/BL6 × CBA/J [H-2k]) wurden zweimal (mit 2 × 50 μl Volumina) in die hintere Fußsohle, 14 Tage Abstand, mit entweder 10 μg RTS,S oder 4 μg TRAP, kombiniert mit verschiedenen Öl-in-Wasser-Emulsionssystemen (SB62), immunisiert. 14 Tage nach der zweiten Immunisierung wurde die Produktion von Cytokinen (IL-5 und IFN-γ) und T-Zellproliferation nach in vitro-Restimulierung von Milz- und Lymphknotenzellen mit den Malaria-Antigenen analysiert. Die Antikörper-Reaktion auf RTS,S und TRAP und das Isotypenprofil, das induziert wurde, wurden durch ELISA untersucht. Tabelle 4: In Beispiel 3 verwendete Gruppen von Tieren und Impfstoff-Formulierungen

Gruppe Nr.	Antigen	Adjuvans
1	RTS,S	SB62/QS21/3D-MPL
2	TRAP	SB62/QS21/3D-MPL
3	RTS,S/TRAP	SB62/QS21/3D-MPL
4	RTS,S	AlOH/QS21/3D-MPL
5	RTS,S/TRAP	AlOH/QS21/3D-MPL
6	RTS,S	SB62c/QS21/3D-MPL
7	RTS,S/TRAP	SB62c/QS21/3D-MPL
8	RTS,S	SB62'/QS21/3D-MPL
9	RTS,S/TRAP	SB62'/QS21/3D-MPL
10	-	SB62/QS21/3D-MPL
11	Vac. Vir. 3D7

Fußnoten:

SB62 – Öl-in-Wasser-Emulsion voller Dosis
SB62' – Öl-in-Wasser-Emulsion, die in den Figuren als SB62 1/5 Dosis angegeben wird
SB62c oder SB62'c – Öl-in-Wasser-Emulsion (jede Dosis) plus Cholesterol in der Öl-Phase.
Vac. Vir. 3D7 = ein rekombiniertes Vaccinia-Viruskonstrukt, das CS-Protein exprimiert und mit 10⁶ PFU pro Maus verabreicht wurde.

T-Zellproliferation
Milz- oder popliteale Lymphknotenzellen wurden aseptisch entfernt und gewaschen. 100 μl Zellen in RPMI-Medium (1% wärmeinaktiviertes Maus-Normalserum, NMS), das 2 × 10⁶/ml der Zellen enthielt, wurden in Rundbodenplatten in Gegenwart von RTS,S- oder TRAP-Antigenen kultiviert. Im Anschluß an Stimulierung für 96 Stunden mit 0,1, 0,5 und 2,5 μg Antigen oder 48 Stunden mit 2 μg/ml ConA wurden die Zellen mit ³H-Thymidin (1 μCi/Vertiefung) für 16 Stunden markiert, bevor sie geerntet und in einem β-Zähler gezählt wurden.
RPMI-Medium
RPMI 1640 ohne L-Glutamin (Life Technologies Nr. 31870025), 2 mM L-Glutamin (Life Technologies Nr. 25030024), 50 μM 2-Mercaptoethanol (Life Technologies Nr. 11360039), 1 mM Natriumpyruvat (Life Technologies Nr. 11360039), 1 × MEM nicht-essentielle Aminosäuren (10 × Vorrat, Life Technologies Nr. 11140035), 100 IU/ml Penicillin – 100 μg/ml Streptomycin (Life Technologies Nr. 15140114).
Cytokin-Detektion
Milz- oder popliteale Lymphknotenzellen wurden aseptisch entfernt und gewaschen. 1000 μl der Zellen in RPMI-Medium (5% wärmeinaktiviertes Kalbfötusserum, FCS), das 5 × 10⁶ ml der Zellen enthielt, wurden in Flachbodenplatten mit 24 Vertiefungen in Gegenwart von RTS,S- oder TRAP-Antigenen kultiviert. Die Platten wurden dann für eine Anzahl von Stunden mit 0,5 und 2,5 μg Antigen oder 4 μg/ml Endlösung von ConA inkubiert (37°C, 5% CO₂).
Die Dauer, für die die Zellen inkubiert wurden, hing vom besonderen, zu detektierenden Cytokin ab, IL-2 wurde für 72 Stunden, IL-5 für 72 oder 96 Stunden und IFN-γ für 96 Stunden stimuliert. Jedes Cytokin wurde unter Verwendung handelsüblicher ELISA-Kits detektiert (IL-2 und IFN-γ, Duoset Genzyme Nr. 80-3573-00 bzw. 80-3931-00; IL-5 wurde unter Verwendung des Pharmingen-Kit detektiert).
Serologie
Gegen TRAP gerichtete Antikörper wurden unter Verwendung eines Sandwich-ELISA analysiert. Ein Schaf-Anti-TRAP-Antiserum wurde auf ELISA-Platten aufgetragen, die verwendet wurden, um mit 0,5 μg/ml hinzugegebenes TRAP-Antigen zu fangen. Titrationen von angesammeltem Serum aus den experimentellen Gruppen wurden hinzugegeben und inkubiert. Schließlich wurden biotinylierte Isotyp-spezifische Anti-Maus-Antikörper, gefolgt von Streptavidin-Peroxidase, verwendet, um gebundene TRAF-spezifische Antikörper zu detektieren.
Humorale Anti-HBV-Reaktionen wurden durch einen direkten ELISA analysiert, HBsAg wurde auf die ELISA-Platte mit 1 μg/ml aufgetragen. Angesammelte Seren aus den unterschiedlichen experimentellen Gruppen wurden titriert und gebundene Antikörper wurden detektiert wie oben beschrieben.
Ergebnisse
Proliferation von Lymphzellen in Reaktion auf Antigen
Die proliferativen Reaktionen in Reaktion auf Antigen sind in 8 bis 11 ersichtlich. Alle Impfstoffzubereitungen stimulierten Zellen im lokalen poplitealen Lymphknoten, die fähig zur Proliferation in vitro in Reaktion auf Antigen waren, wobei das Ausmaß unabhängig von der Zugabe von Cholesterol war.
Alle Impfstoffzubereitungen waren fähig zur Stimulierung von Milzzellen, die in vitro in Reaktion auf Antigen proliferierten. Unter Berücksichtigung der Stimulationsindizes waren die Zubereitungen, die die höchsten Reaktionen in der Milz aufwiesen, diejenigen mit dem niedrigen Squalen:QS21-Verhältnis (48:1 oder 1/5 Dosis SB62).
8 zeigt die proliferativen Reaktionen von poplitealen Lymphknotenzellen (in Rohimpulsen pro Minute (CPM)), abgeleitet aus den experimentellen Gruppen nach Stimulation mit TRAP- und RTS,S-Antigenen.
9 zeigt die proliferativen Reaktionen von Milzzellen (in Rohimpulsen pro Minute (CPM)), abgeleitet aus den experimentellen Gruppen nach Stimulation mit TRAP- und RTS,S-Antigenen.
10 zeigt die proliferativen Reaktionen von poplitealen Lymphknotenzellen (Stimulationsindex), abgeleitet aus den experimentellen Gruppen nach Stimulation mit TRAP- und RTS,S-Antigenen.
11 zeigt die proliferativen Reaktionen von Milzzellen (Stimulationsindex), abgeleitet aus den experimentellen Gruppen nach Stimulation mit TRAP- und RTS,S-Antigenen.
Diskussion der Proliferationsergebnisse
1 und 2 zeigen deutlich, daß alle Impfstoff-Formulierungen lymphoide Zelle stimulieren, die zur Proliferation in vitro in Gegenwart von Antigen in einer dosisabhängigen Weise fähig sind. Die rohen cpm-Daten lassen vermuten, daß der Einschluß von Cholesterol in den Adjuvans-Formulierungen keine Wirkung auf die Größe der proliferativen Reaktionen hat (z. B. ein Vergleich zwischen Gruppe 1 und 6, bezeichnet als RTS,S/MPL/QS21/SB62 bzw. RTS,S/MPL/QS21/SB62c).
Die Untersuchung der cpm-Daten zusammen mit den Stimulationsindexergebnissen (erhalten durch Dividieren der cpm-Rohdaten für die antigenspezifische Proliferation durch diejenige, die aus der nicht-antigenspezifischen Proliferation stammt (Medium allein)) zeigt, daß die Impfstoff-Formulierung, die die höchsten proliferativen Reaktionen erzeugt, vom Ursprung der gemessen Lymphozyten abhängt. Die Adjuvans-Formulierungen, die das niedrige Squalen:QS21-Verhältnis (48:1) enthalten, erzeugen die höchsten proliferativen Reaktionen in der Milz.
In vitro-Cytokin-Produktion nach Stimulation mit Antigen
Die Cytokin-Produktion, gemessen in vitro als Reaktion auf Antigen, kann sowohl ein quantitatives als auch ein qualitatives Maß für die Induzierung von Immunreaktionen in vivo sein. Allgemein werden hohe Gehalte von IFN-γ und IL-2 als Maß für Immunreaktionen von Th1-Typ herangezogen, und IL-5 wird als ein Cytokin vom Th2-Typ betrachtet. Die folgenden Figuren (12 bis 14) zeigen, daß die Verwendung von SB62', das ein reduziertes Squalen:QS21-Verhältnis enthält (bezeichnet als SB62 1/5 Dosis), eine deutliche Wirkung in der Steigerung der Produktion von IFN-γ hatte (6). Ferner gibt es einen Nachweis, daß die Zugabe von Cholesterol keine qualitativen oder quantitativen Wirkungen auf das Cytokinprofil hat, das in vitro in Reaktion auf Antigen erzeugt wird. Diese Wirkung kann signifikante Konsequenzen in der Induzierung von Immunreaktionen und vom Th1-Typ und auch von Immuntherapeutika haben.
12 zeigt die IL-2-Produktion von Milzzellen nach Stimulation mit TRAP- oder RTS,S-Antigen 14 Tage nach VII.
13 zeigt die IFN-γ-Produktion durch Milzzellen nach Stimulation mit TRAP- oder RTS,S-Antigen 14 Tage nach VII.
14 zeigt die IL-5-Produktion durch Milzzellen nach Stimulation mit TRAP- oder RTS,S-Antigen 14 Tage nach VII.
Serologie
Ein anderes Maß für die Immunität, die mit einer Immunreaktion vom Th1-Typ oder alternativ vom Th2-Typ korrelieren kann, ist der IgG-Sub-Isotyp, der hervorgerufen wird. Eine bevorzugte Stimulation des IgG1-Sub-Isotyps wird allgemein als Maß für die Induzierung einer Immunreaktion vom Th2-Typ herangezogen, und umgekehrt werden IgG2a und IgG2b als Maß für eine Immunreaktion vom Th1-Typ herangezogen.
ELISA-Untersuchungen wurden an angesammeltem Mausserum durchgeführt, und die Mittelpunkt-Titer für sowohl HBsAg- und TRAP-spezifische Antikörper wurden sichergestellt. Aus diesen Figuren wurde das Verhältnis der antigenspezifischen IgG1- und IgG2a-Mittelpunkt-Titer berechnet und als Maß für das Th1/Th2-Gleichgewicht der humoralen Immunreaktion herangezogen (die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt). Tabelle 4: Das Verhältnis von IgG1:IgG2a, das das Th1/Th2-Gleichgewicht darstellt. Ein Verhältnis von < 1 stellt eine Immunreaktion vom Th1-Typ dar, ein Verhältnis von > 1 stellt eine Reaktion vom Th2-Typ dar.

Verhältnis der Mittelpunkt-Titer IgG1:IgG2a

Gruppe HBsAg TRAP

1 0,44

2 0,36

3 1,46 1,68

4 0,37

5 0,39 11,83

6 0,28

7 0,2 7,21

8 0,66

9 0,3 0,77
Diskussion der serologischen Ergebnisse
Ansammlungen von Mausserum wurden für jede Gruppe analysiert, und es wurde gefunden, daß sie erfolgreich HBsAg- und TRAP-spezifische Antikörper stimuliert hatten. Allgemein waren Antikörper-Mittelpunkt-Titer gegen HBsAg höher als diejenigen, die gegen TRAP gefunden wurden. Die Isotyp-Verteilung unterschied sich zwischen den zwei Antigenen. RTS,S in allen Formulierungen rief ein klares Th1-Muster hervor, wie es durch ein IgG1:IgG2a-Verhältnis von unter 1 angezeigt wird.
Im Gegensatz wiesen TRAP-spezifische Antikörper ein Isotyp-Muster vom Th2-Typ auf. Die einzigen Ausnahmen bei dieser Beobachtung waren Gruppe 2, die allein TRAP erhielt, und Gruppe 9, die TRAP/RTS,S in einer SB62'-Formulierung (enthaltend ein niedriges Squalen:QS21-Verhältnis, bezeichnet als SB62 1/5 Dosis) erhielt. Die Verwendung von SB62' kann daher nützlich in der Entwicklung von Th1-induzierenden Impfstoffen mit Antigenen sein, die dafür bekannt sind, daß sie vorzugsweise Immunreaktionen vom Th2-Typ induzieren.
Beispiel 4
Immunologische Untersuchungen unter Verwendung eines Maustumor-Regressionsmodells
Dieses Experiment untersuchte die potentielle Verwendung von Öl-in-Wasser-Emulsionsadjuvantien zur therapeutischen Behandlung von Tumoren, die das menschliche Papilloma-Virus (HPV) exprimieren. Tumorzellen (TC1), die dafür bekannt sind, daß E7-Protein von HPV 16 zu exprimieren, wurden in 6 bis 8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse übergeimpft. Diese Tumorzellen, falls unbehandelt, wachsen zu Tumoren meßbarer Größe. Das Potential von E7-umfassenden Impfstoffen, die auf Öl-in-Wasser-Emulsionsadjuvantien beruhen, zur Verhinderung der Ausbildung dieser Tumoren wurde untersucht. Das therapeutische Potential verschiedener Öl-in-Wasser-Emulsionen (für Einzelheiten siehe Beispiel 1), SB62 voller Dosis, SB62 1/5, SB62c voller Dosis und SB62c 1/5 in Kombination mit ProtD1/3 E7 HPV16 rekombinantem Antigen, wurde im TC1-E7-Tumormodell ausgewertet. Ferner wurde der Beitrag der Impfungsschemata verglichen.
Kurz gesagt wurden Gruppen von 8 bis 10 C57BL/6-Mäusen mit 5 × 10⁵ TC1-Tumorzellen (in der Seite) in Kontakt gebracht. Die Gruppen von Mäusen wurden dann im Fußballen mit 5 μg ProtD1/3 E7, kombiniert mit verschiedenen Formulierungen, 7 und 14 Tage nach einem subkutanen Tumorkontakt immunisiert.
Andere Impfungsschemata wurden verglichen: 2 Impfungen mit 5 μg ProtD1/3 E7 in SB62 (Tage 14 und 21 nach dem Tumorkontakt); und 4 Impfungen mit 5 μg ProtD1/3 E7 in SB62 (7, 14, 21, 28 Tage nach Tumorkontakt).

Antikörperreaktionen auf E7 wurde durch ELISA zu den Zeitpunkten 2 und 4 Wochen nach der zweiten Impfung überwacht. Die lymphproliferative Reaktion wurde durch in vitro-Restimulation von Milz- und Lymphknotenzellen für 72 h mit dem Protein E7 (10, 1, 0,1 μg/ml) 2 und 4 Wochen nach der zweiten Impfung analysiert. CTL-Reaktionen wurden nach in vitro-Restimulation von Milzzellen mit bestrahlten Tumorzellen (TC1) oder einem aus E7 stammenden Peptid gemessen. Der Chrom-Freisetzungstest wurde an TC1-Zellen, an einer syngenen Tumorzellinie: EL4 gepulst oder nicht mit einem aus E7 stammenden Peptid oder infiziert entweder mit einem E7-rekombinanten Vaccinia-Virus oder mit dem Vaccinia-Virus vom Wildtyp durchgeführt. Tabelle 5: Gruppen von Mäusen

Gruppe	Impfschema (Tage nach Kontakt)	Antigen (HPV 16)	Hilfsstoff
a	7, 14	-	PBS
b	7, 14	ProtD1/3 E7	PBS
c	7, 14	ProtD1/3 E7	DQ
d	7, 14	-	DQ
e	7, 14	ProtD1/3 E7	SB62
f	7, 14	-	SB62
g	7, 14	ProtD1/3 E7	SB62'
h	7, 14	-	SB62'
i	7,14	ProtD1/3 E7	SB62c
j	7, 14	-	SB62c
k	7, 14	ProtD1/3 E7	SB62'c
l	7, 14	-	SB62'c
m	7, 14, 21, 28	ProtD1/3 E7	SB62
n	14, 21	ProtD1/3 E7	SB62

Therapeutische Experimente: Protokoll

• 5 × 10⁵ TC1-E7 exprimierende Tumorzellen wurden subkutan (200 μl) in die Seite von immunkompetenten C57BL/6-Mäusen injiziert.
• Impfungen wurden entweder 7, 14, 21 oder 28 Tage nach dem Tumorkontakt mit einer Injektion von 5 μg ProtD1/3 E7 HPV16 in den Fußballen (100 μl: 50 μl/Fußballen) durchgeführt. Jeder Impfstoff wurde in Gegenwart unterschiedlicher Adjuvantien formuliert: SB62, SB62c, SB62' oder SB62'c.
• 2 und 4 Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, und Milzen oder popliteale Lymphknoten wurden entnommen und in Lymphproliferations- oder CTL-Tests untersucht.

Vergleichende Formulierungen auf Liposom-Basis (DQ)
ProtD1/3-E7-Antigen (5 μg) wurde 30 min mit MPL (5 μg) vor Pufferzugabe als Mischung von 10-fach konzentriertem PBS pH 7,4 und H₂O inkubiert. Nach 30 min wurde QS21 (5 μg) zur Formulierung hinzugegeben, die mit Liposomen in einem Gewichtsverhältnis QS21/Cholesterol von 1:5 vermischt war (bezeichnet als DQ). 50 μg/ml Thiomersal wurden zur Formulierung als Konservierungsmittel 30 Minuten nach der Zugabe des QS21 hinzugegeben. Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt.
Zellinien
TC1 (erhalten von John Hopkin's University) oder EL4-Zellen wurden in RPMI 1640 (Bio Whittaker) gezüchtet, das 10% FCS und Additive enthielt: 2 mM L-Glutamin, 1% Antibiotika (10000 U/ml Penicillin, 10000 μg/ml Streptomycin), 1% nicht- essentielle Aminosäure 100×, 1% Natriumpyruvat (Gibco), 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol. Vor der Injektion in die Seite der Mäuse wurden die TC1-Zellen trypsinisiert und in serumfreiem Medium gewaschen.
Tumorwachstum
Das individuelle Tumorwachstum wurde zeitlich verfolgt. Die zwei Hauptdurchmesser (A, B) wurden unter Verwendung von Meßzirkeln zweimal wöchentlich gemessen. A × B stellt die "Tumoroberfläche" dar und wird als Durchschnitt der 5 Werte in jeder Gruppe ausgedrückt.
In vitro Lymphproliferation
Lymphproliferation wurde an individuellen Milzen und an Lymphknotenansammlungen durchgeführt. Die Zellsuspensionen wurden mit Tris-gepuffertem Ammoniumchlorid für 4 min bei 4°C inkubiert, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. 2 × 10⁵ Milzzellen oder popliteale Lymphknotenzellen wurden dreifach in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen in RPMI-Medium, das 1% normales Mausserum enthielt, plattiert. Nach 72 Stunden Inkubation mit unterschiedlichen Mengen von E7 (10-1-0,1 μg/ml) wurden 100 μl Kulturüberstand entfernt und durch frisches Medium ersetzt, das 1 μCi 3H-Thymidin enthielt. Nach Pulsen für 16 Stunden wurden die Zellen auf Filterplatten geerntet. Die aufgenommene Radioaktivität wurde in einem β-Zähler gezählt. Die Ergebnisse werden in Impulsen pro Minute (CPM, Mittelwert von dreifachen Vertiefungen) oder als Stimulationsindizes (Mittelwert CPM in Kulturen mit Antigen/Mittelwert CPM in Kulturen ohne Antigen) ausgedrückt.
CTL-Test
2 × 10⁶ Milzzellen wurden zusammen mit 2 × 10⁶ bestrahlten (18000 rad) TC1-Zellen für 7 Tage kultiviert. Die Zielzellen waren entweder Cr⁵¹ (DuPont NEN 37 MBq/ml) beladene (1 h bei 37°C) TC1-Zellen oder EL4-Zellen (syngene Tumorzellen), die mit einem E7-rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert waren (erhalten von T. C. Wu von John Hopkins University). Die aus diesen Zellen stammenden Ergebnisse wurden mit denjenigen aus EL4-Zielen verglichen, die mit dem Vaccinia-Virus vom Wildtyp infiziert worden waren (die Vaccinia-Infektion wird mit einem MOI von 10 in einem kleinen Volumen von serumfreiem Medium für 1 h bei 37°C in einem CO₂-Inkubator durchgeführt. Frisches Medium wurde hinzugegeben, und die Zellen wurden über Nacht vor der Verwendung inkubiert). 10 μg/ml aus E7 stammendes Peptid (49–57) (QCB) wurde verwendet, um EL4-Zellen für 1 h bei 37°C während der Cr⁵¹-Beladung der Zellen zu pulsen. 2000 Zielzellen wurden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen hinzugegeben (V-Boden Nunc 2-45128), wobei 100/1 das höchste Effektor/Zielverhältnis ist. Kontrollen für spontane oder maximale Cr⁵¹-Freisetzung wurden 6-fach durchgeführt und waren Ziele im Medium oder in 1,5% Triton. Alle Platten wurden vorsichtig zentrifugiert und für 4 h bei 37°C in 7% CO₂ inkubiert. 50 μl des Überstands wurden auf einer Lumaplate mit 96 Vertiefungen (Packard) abgelegt, über Nacht trocknen gelassen und in einem Top Count-Zähler gezählt. Die Daten werden als prozentuale spezifische Lyse ausgedrückt, die aus dem c. p. m. durch die Formel (experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung) × 100 berechnet wird.
Serologie
Die Quantifizierung von Anti-E7-Antikörper wurde durch ELISA unter Verwendung E7 als Coating-Antigen durchgeführt. Antigen- und Antikörper-Lösungen wurden mit 50 μl pro Vertiefung verwendet. Antigen wurde mit einer Endkonzentration von 3 μg/ml in Carbonat-Puffer pH 9,5 verdünnt und über Nacht bei 4°C in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen adsorbiert (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dänemark). Die Platten wurden dann für 1 h bei 37°C mit PBS inkubiert, das 1% Rinderserumalbumin und 0,1% TWEEN 20 enthielt (Sättigungspuffer). Zweifache Verdünnungen der Seren (ausgehend von einer Verdünnung von 1/100) im Sättigungspuffer wurden zu den E7-beschichteten Platten hinzugegeben und für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS 0,1% Tween 20 gewaschen, und Biotin-konjugierts Anti-Maus-IgG1, -IgG2a oder -IgG2b oder -IgGtot (Amersham, UK), verdünnt 1/5000 in Sättigungspuffer, wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde Streptavidin-biotinylierter Peroxidase-Komplex (Amersham, UK), verdünnt 1/5000 in Sättigungspuffer, für weitere 30 min bei 37°C hinzugegeben. Die Platten wurden wie oben gewaschen und für 10 min mit TMB (Tetramethylbenzidin) inkubiert. Die Reaktion wurde mit 4N H₂SO₄ beendet und bei 450 nm ausgelesen. Die Mittelpunktverdünnung wurde durch SoftmaxPro (unter Verwendung einer Gleichung mit 4 Parametern) berechnet.
Immunohistochemie
Die Tumoren wurden herausgeschnitten und in Aceton und Paraformaldehyd vor dem Schneiden fixiert. Die 5 μm dicken Cryostat-Schnitte wurden dann untersucht und angefärbt auf Eindringen von CD4, CD8 und CD3 exprimierenden T-Zellen. Vor der Zugabe der anfärbenden monoklonalen Antikörper wurden die Schnitte gewaschen und mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 5% normalem Kaninchenserum (NRS) in PBS gesättigt. Nach diesem Schritt wurden die Ratte-Anti-CD3, -CD4 und -CD8 monoklonalen Antikörper hinzugegeben und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Schnitte wurden dann gewaschen, und die Bindung der monoklonalen Ratte-Antikörper wurde mit biotinyliertem Kaninchen-Anti-Ratte-Ig gezeigt. Nach Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (RT) wurde Streptavidin-Meerrettichperoxidase hinzugegeben und für weitere 30 min bei RT inkubiert. Die Bindung der Streptavidin-Meerrettichperoxidase wurde mit DAB für 10 min bei RT gezeigt. Die Schnitte wurden dann mit Hämatoxylin gegengefärbt und mit Ethanol, Isopropanol und schließlich Xylol entwässert.
Ergebnisse
Tumorwachstum (für eine Darstellung des mittleren Tumorwachstums/Gruppe sie 15)
15 zeigt das mittlere Tumorwachstum nach Kontakt und Impfung an Tagen 7 und 14 mit verschiedenen ProtD1/3 E7-haltigen Formulierungen.
16 zeigt das über einen Zeitraum von 4 Wochen beobachtete mittlere Tumorwachstum für die Gruppen, die das Antigen in DQ- und SB62-Formulierungen erhielten, ebenfalls dargestellt sind die Ergebnisse, die die unterschiedlichen Impfschemata vergleichen. Die Impfstoffe wurden an den Tagen 7 und 14 oder an den Tagen 14 und 21 oder an den Tagen 7, 14, 21 und 28 verabreicht.
16: Vergleich mit vergleichenden Formulierungen und anderen Impfschemata.
Diskussion der Tumorregressionsuntersuchungen mit dem ProtD1/3 E7-Antigen

• Impfung mit entweder ProtD1/3 E7 oder Adjuvans allein hat keine Wirkung auf das Wachstum des TC1-E7-exprimierenden Tumors.
• Die Analyse des individuellen Tumorwachstums zeigte eine vollständige Tumorabstoßung in verschiedenen Gruppen:

Gruppe	Prozentuale Tumorabstoßung
c	40%
e	40%
g	60%
j	20%
1	10%

Die beste Formulierung zur Induzierung von Tumorabstoßung wurde mit der SB62' Öl-in-Wasser-Emulsion mit niedriger Dosis formuliert.
• Eine bessere therapeutische Wirkung wurde nach 4 Impfungen anstelle nach 2 beobachtet. Die Analyse des individuellen Tumorwachstums zeigte, daß 60% der Tiere vollständig ihren Tumor nach 4 Impfungen mit einer Formulierung auf SB62-Basis abstießen, während nur 40% der Mäuse, die zwei Impfungen erhalten hatten, eine vollständige Regression zeigten.
• Falls die erste Impfung bis zum Tag 14 nach dem Tumorkontakt verzögert wurde, konnte keine vollständige Abstoßung beobachtet werden. Jedoch schien das Tumorwachstum aufgehoben zu sein.

Proliferationsergebnisse

• Eine proliferative Reaktion wurde in diesem Experiment weder mit Milz- noch mit Lymphknotenzellen von Mäusen beobachtet, die ProtD1/3 E7 oder Adjuvantien allein erhielten.
• Die Antigen-spezifische Lymphproliferation war in den Gruppen von Mäusen erhöht, die ProtD1/3 E7 in Gegenwart von Adjuvantien erhielten. Hohe proliferative Reaktionen wurden sowohl mit DQ als auch SB62' in der Milz beobachtet. Siehe 17 und 18.

17: In Milzzellen 2 Wochen nach der zweiten Impfung beobachtete Lymphproliferation.
18: In Milzzellen 2 Wochen nach der zweiten Impfung beobachtete Lymphproliferation.
Serologie
Anti-E7-Antikörperreaktion: IgG gesamt und Sub-Isotypen (IgG1, IgG2a, IgG2b) wurden durch ELISA unter Verwendung des E7-Proteins als Coating-Antigen gemessen. Die Anti-E7-Ig-Titer, die zwei Wochen nach der zweiten Impfung beobachtet wurden, sind in Tabelle 6 angegeben. 19 zeigt den relativen Prozentwert der unterschiedlichen IgG-Isotypen im Serum von Mäusen, die zwei Wochen nach der zweiten Impfung geimpft wurden.

• Die nach zwei Impfungen mit ProtD1/3 E7 allein induzierte schwache Antikörperreaktion war in Tieren stark erhöht, die ein Adjuvans erhielten. Die stärkste Antikörperreaktion wurde mit SB62 erhalten.
• Der hauptsächliche E7-spezifische, durch alle untersuchten Impfstoff-Formulierungen induzierte Antikörper-Sub-Isotyp war IgG2b (80–90% der gesamten IgGs).

Gruppe	Ig-Sub-Isotyp-Titer
Gruppe	IgG1	IgG2a	IgG2b
a	0	0	0
b	1420	0	4070
c	7850	1110	70170
d	0	0	0
e	11880	470	86610
f	0	0	0
g	13670	1580	62560
h	0	0	0
i	13073	1650	89930
j	0	0	0
k	260	0	2630
l	0	0	0

19: Relativer Prozentwert der unterschiedlichen IgG-Isotypen im Serum von geimpften Mäusen 2 Wochen nach der zweiten Impfung.
CTL-Ergebnisse

• Eine CTL-Reaktion konnte zu den Zeitpunkten 2 und 4 Wochen nach der Endimpfung nachgewiesen werden.
• Keine Lyse wurde beobachtet, wenn Mäuse das Protein oder das Adjuvans allein erhielten. Die beste spezifische Lyse wurde beobachtet, wenn Mäuse das Antigen in DQ oder SB62' erhielten (siehe Tabelle 7).

Tabelle 7: Zusammenfassung der CTL-Reaktionen nach Stimulation von Milz-Lymphozyten mit TC1 EL4 + EL7.

Gruppe Anti-E7-CTL (E:T-Verhältnis 100:1)

a –

b –

c +++

d –

e ++

f –

g ++++

h –

i +

k ++

l +
Immunohistochemie-Ergebnisse

Tumoren wurden aus den Mäusen (2 Mäuse pro Gruppe) entfernt, und Schnitte wurden tiefgefroren. Ein Kryo-Schnitt der Tumoren wurde mit Anti-CD4- und Anti-CD8-Antikörpern angefärbt. Die Ergebnisse für die beobachtete Tumoreindringung durch CD4- und CD8 + ve-Zellen sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8: Ergebnisse des lymphozytischen Tumoreindringens nach Impfung mit

Gruppe (Maus Nr.)	Negativkontrolle	CD4 + ve Lymphozyteneindringen	CD8 + ve Lymphozyteneindringen
a(1)	–	–	+/–
a(2)	-	–	+/–
b(1)	–	+/–	+
b(2)	–	–	+
c(1)	–	+	+++
c(2)	–	+	+++
d(1)	–	–	+/–
d(2)	–	+/–	+
e(1)	–	+/–	+++
e(2)	–	+/–	+++
f(1)	–	–	+/–
f(2)	–	–	+/–

Schlußfolgerungen

• Die regressierenden Tumore in der Gruppe der Mäuse, die ProtD-1/3 E/ in DQ oder SB62 erhielten, zeigten ein massives Eindringen mit CD8+-Zellen und wenigen CD4+-Zellen.
• Aus den Tieren, die PBS, Antigen oder Adjuvantien allein erhalten hatten, entfernte Tumoren enthielten kein CD8 + ve-lymphozytisches Eindringen.
• Zwei Impfungen (an Tagen 7, 14) mit 5 μg ProtD 1/3 in unterschiedlichen Formulierungen auf SB62-Basis induzierten die Abstoßung von vor-ausgebildeten E7-exprimierenden Tumoren, die an einer entfernten Stelle implantiert waren.
• Tumorabstoßung ist mit einer anti-E7-spezifischen CTL-Reaktion verbunden. Es besteht ein Trend zu einer etwas besseren CTL-Reaktion in den Individuen, die ihre Tumoren abstießen.
• Die Immunochemie zeigte ein massives Eindringen von CD8+-T-Zellen in Tumoren, die nach Impfung mit ProtD1/3 E7 + DQ und SB62 regressierten.
• Zwei Impfungen (an Tagen 114 und 21 nach Tumorkontakt) mit 5 μg ProtD1/3 E7 HPV16 in SB62 reduzierten das Wachstum dieser größeren Tumoren, aber induzierten keine vollständige Regression.
• Vier Impfungen (Tage 7, 14, 21 und 28 nach Tumorkontakt) mit 5 μg ProtD 1/3 E7 HPV16 in SB62 induzierten die vollständige Abstoßung der ausgebildeten Tumoren in 60% der Tiere. 40% vollständige Abstoßung wurde nach 2 Impfungen mit dem gleichen Adjuvans beobachtet.
• Die Verwendung des SB62'-Adjuvans mit geringer Dosis hatte keine Wirkung auf die Größe der Anti-E7-Antikörper-Titer, induzierte jedoch den höchsten Grad der Milz-Lymphozytenproliferation und Anti-E7-CTL-Reaktionen.

Gesamtschlußfolgerungen für die Erfindung
Es ist aus den obigen Beispielen ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung eine Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt, die bevorzugt starke Immunreaktionen vom Th1-Typ induziert, speziell IFN-γ-Produktion. Es wurde gezeigt, daß diese Formulierungen Immunreaktionen auf eine große Vielzahl von Antigenen stimulieren, und daher wird vorhergesehen, daß diese vorliegende Erfindung Anwendung in einer großen Vielzahl von Pathogenen finden wird, die nicht auf die hier gefunden beschränkt sind.
Beispiel 5: Stabilisierung von QS21 durch Zugabe von Cholesterol
Es wurde zuvor beschrieben, daß QS21-H das Hydrolyse-Produkt von QS21 ist, welches nicht mehr als Adjuvans aktiv ist. Es wird durch Spaltung des QS21-Moleküls durch OH^– aus der wäßrigen Lösung gebildet. Diese Reaktion tritt auf, wenn der pH-Wert des wäßrigen Mediums oberhalb eines Wertes von 6,5 ist, und wird durch höhere Temperaturen beschleunigt. Die in dieser Patentanmeldung beschriebenen Öl-in-Wasser-Emulsionen (z. B. SB62) sind dafür bekannt, eine stabilisierende Wirkung auszuüben, so daß die Hydrolyse von QS21 zu QS21-H gehemmt wird. Bei Verdünnung der Öl-in-Wasser-Emulsion in Gegenwart von konstantem QS21 verlieren sie diese stabilisierende Eigenschaft, und das QS21 wird zur inaktiven QS21-H-Form abgebaut. Überraschend behalten Emulsionen, die zusätzlich Cholesterol enthalten und die bei einem 1/1-Verhältnis keine verbesserte QS21-Stabilität zeigen, die stabilisierende Wirkung selbst bei einer 1/5 Verdünnung bei.
QS21 und QS21-H werden direkt in der Emulsion getestet. Dies wird durch chemische Derivatisierung der vollständigen Formulierung und durch Durchführung eines selektiven Extraktionsschrittes durchgeführt, der das QS21 löst, aber die meisten störenden Matrix-Verbindungen zurückläßt. Der Test beruht auf HPLC, und die Verbindungen werden dansyliert. Die Dansylierung wird durch Heruntertrocknen einer Probe der Emulsion und Zugabe von 100 μl 3,5 mg Dansylhydrazin/ml C/M 2/1 und 100 μl 1:4 Essigsäure:C/M 2/1 in dieser Reihenfolge durchgeführt. Die Mischung wird gut verwirbelt und für 2 h bei 60°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird im Speedvac getrocknet. Sie wird in 500 μl 30%igen ACN in H₂O rekonstituiert und zweimal mit 14000 U/min für 2 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden dann in einem Autosampler-Röhrchen gesammelt. Eine Standardkurve wird erhalten durch Zubereiten von QS21 und QS21-H in einer Mischung, die die gleichen Verbindungen wie die untersuchte Emulsion enthält.
Der HPLC-Test wird an einer 5 μ-Teilchengröße C18-RP-Säule Vydac 218TP54, 250 × 4,6 mm durchgeführt. Lösungsmittel sind A:H₂O + 0,05% TFA (Trifluoressigsäure) und B:Acetonitril + 0,05% TFA. Die Gradiententabelle ist:

Zeit (min) % A % B

0 70 30

2 70 30

15 50 50

17 50 50

17,1 10 90

19 10 90

21 70 30

25 70 30
Die Fließgeschwindigkeit beträgt 1 ml/min. Die Detektion ist die Fluoreszenz mit einer Erregung bei 345 nm und einer Emission bei 515 nm. 50 μl sowohl der Probe als auch der Standards werden injiziert. Die Säulenwärmequelle wird für diese Trennung auf 37°C eingestellt. Peaks für QS21, QS21-iso und QS21-H werden auf dem Chromatogramm unterschieden.
Eine Reihe von Proben mit der folgenden Zusammensetzung wurde analysiert:

Zusammensetzung SB62 SB62c MPL QS21

SB62 250 μl - 50 μg 50 μg

SB62' 50 μl - 50 μg 50 μg

SB62c - 250 μl 50 μg 50 μg

SB62'c - 50 μl 50 μg 50 μg
Der Test von QS21/QS21-H wurde nach Inkubation der Proben bei verschiedenen Zeitintervallen und Temperaturen (4°C und 37°C) durchgeführt. Die Daten für 1 Monat bei 37°C in diesem Modell korrelieren gut mit der Stabilität von QS21 nach längerer Lagerung bei 4°C (z. B. 2 Jahre). Tabelle 9: HPLC QS21-Test: Im Zeitverlauf erzeugter %-Wert von QS21-H

Zusammensetzung 3 Monate (4°C) 6 Monate (4°C) 3 Monate (4°C) + 7 Tage (37°C) 1 Monat (37°C)

SB62 1% 2% 3% 15%

SB62' 1% 1% 9% 31%

SB62c 2% 2% 3% 17%

SB62'c 2% 2% 3% 21%
Diese in der obigen Tabelle gezeigten Ergebnisse zeigen eindeutig (sowohl für 7 Tage als auch 1 Monat) die Wirkung der Zugabe eines Sterols, in diesem Fall Cholesterol, zu SB62' bei der Aufrechterhaltung der Stabilität von QS21.

Claims

Zusammensetzung, die eine Öl-in-Wasser-Emulsion und ein Saponin umfasst, worin das Öl ein metabolisierbares Öl ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis des metabolisierbaren Öls zu Saponin (G/G) im wesentlichen 48:1 ist.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Saponin QuilA oder ein Derivat davon wie QS21 ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 2, worin das metabolisierbare Öl Squalen ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, die ferner ein Sterol umfasst.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 4, worin das Sterol Cholesterol ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, die ferner einen oder mehrere Immunmodulatoren umfasst.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, die ferner einen oder mehrere andere Immunmodulatoren umfasst, wobei der Immunmodulator aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgendes umfasst: 3D-MPL und α-Tocopherol.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin das Verhältnis von QS21 zu 3D-MPL (G/G) 1:10 bis 10:1 ist.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 7 oder 8, worin das Verhältnis von QS21 zu 3D-MPL (G/G) 1:1 bis 1:2,5 ist.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 5, worin das Verhältnis von QS21 zu Cholesterol (G/G) im Bereich von 1:1 bis 1:20 ist.
Impfstoffzusammensetzung, die eine Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst, die ferner ein Antigen oder eine antigene Zubereitung umfasst.
Impfstoffzusammensetzung gemäss Anspruch 11, worin das Antigen oder die antigene Zubereitung aus der Gruppe hergestellt wird, die folgendes umfasst: menschliches Immundefizienzvirus; Herpes-Simplex-Virus Typ 1; Herpes-Simplex-Virus Typ 2; menschliches Cytomegalovirus; Hepatitis A, B, C oder E; respiratorisches Syncitial-Virus, menschliches Papilloma-Virus; Influenza-Virus; Salmonella; Neisseria; Borrelia; Chlamydia; Bordetella; TB; EBV; Plasmodium und Toxoplasma.
Impfstoffzusammensetzung gemäss Anspruch 11, worin das Antigen oder die antigene Zubereitung eine Kombination der Malaria-Antigene RTS,S und TRAP ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäss Anspruch 11, worin das Antigen oder die antigene Zubereitung ein Tumor- oder Wirt-abstammendes Antigen ist oder von diesem abstammt.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin die Öl-in-Wasser-Emulsion Öltröpfchen umfasst, die einen Durchmesser von weniger als 1 μm aufweisen.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin die Öl-in-Wasser-Emulsion Öltröpfchen umfasst, die einen Durchmesser im Bereich von 120 bis 750 nm aufweisen.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin die Öl-in-Wasser-Emulsion Öltröpfchen umfasst, die einen Durchmesser im Bereich von 120 bis 600 nm aufweisen.
Impfstoffzusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 11 bis 14, die in der Lage ist, in einem Säugetier eine cytolytische T-Zell-Antwort auf das Antigen oder die antigene Zusammensetzung hervorzurufen.
Impfstoffzusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 11 bis 14, die in der Lage ist, in einem Säugetier eine Interferon-γ-Produktion auf das Antigen oder die antigene Zusammensetzung zu stimulieren.
Impfstoffadjuvanszusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Medizin.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäss Ansprüchen 11 und 14, das das Vermischen einer Öl-in-Wasser-Emulsion; QS21; Cholesterol; 3D-MPL; α-Tocopherol und eines Antigens oder einer antigenen Zubereitung umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beschrieben, bei der Herstellung eines Impfstoffs, der für die prophylaktische Behandlung eines Menschen geeignet ist, der für eines der folgenden empfänglich ist oder daran leidet: menschliches Immundefizienzvirus; Herpes-Simplex-Virus Typ 1; Herpes-Simplex-Virus Typ 2; menschliches Cytomegalovirus; Hepatitis A, B, C oder E; respiratorisches Syncitial-Virus, menschliches Papilloma-Virus; Influenza-Virus; Salmonella; Neisseria; Borrelia; Chlamydia; Bordetella; TB; EBV; Plasmodium und Toxoplasma.
Verfahren zum Stabilisieren eines in einer Zusammensetzung des Anspruchs 1 vorliegenden Saponins, das die Zugabe eines Sterols in die Ölphase der Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 23, worin das Saponin QS21 ist.
Verfahren gemäss Anspruch 23 oder 24, worin das Sterol Cholesterol ist.