CN102596240B - 包括脑膜炎球菌fHBP序列的杂交多肽 - Google Patents

Abstract

fHBP是脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)中的一种蛋白质。已知fHBP的三个家族。为了提高fHBP蛋白引发在家族间交叉反应的抗体的能力，筛选或工程改造fHBP使其具有能在给予宿主动物后引起广谱杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的序列。

Description

包括脑膜炎球菌fHBP序列的杂交多肽

本申请要求2009年8月27日提交的美国临时申请号61/237,576的益处，其完整内容通过引用纳入本文用于所有目的。

技术领域

本发明属于免疫领域，具体地说，是针对由诸如脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis，脑膜炎球菌)的奈瑟球菌(Neisseria)属致病性细菌导致的疾病的免疫。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰氏阴性包膜细菌病原体。虽然存在针对血清群A、C、W135和Y的多糖和偶联疫苗，但是该方法无法应用于血清群B，因为荚膜多糖是一种多聚唾液酸的聚合物，是人类的一种自身抗原。为了产生针对血清群B的疫苗，使用了外膜囊泡(OMV)。这些疫苗会引起血清杀菌抗体应答和抵抗疾病，但是无法诱导菌株间的交叉保护作用[1]。一些研究者因此着重于用于疫苗的特定脑膜炎球菌抗原[2]。

一种这样的抗原是脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)，也称作‘741’蛋白[参考文献3中的SEQ ID 2535 & 2536；本文的SEQ ID 1]，‘NMB1870’，‘GNA1870’[参考文献4-6，在参考文献2之后]，‘P2086’，‘LP2086’或‘ORF2086’[7-9]。该脂蛋白在全部脑膜炎球菌血清群中都表达，在许多菌株中都有发现。fHBP序列被分成三个家族[4](本文称作家族I，II & III)，对一特定家族产生的血清在同一家族中具有杀菌性，但对表达其它家族之一的菌株无活性，即存在家族内，而非家族间的交叉保护。

因此，为了实现使用fHBP的交叉菌株保护，使用了多于一种家族。为了避免表达和纯化独立蛋白的需要，已提出将不同家族表达成杂合蛋白[10-12]，在一条多肽链中包括两或三个家族。文献13和14描述了基于诱变的修饰fHBP序列，以提高其对家族I、II和III的覆盖的方法。文献15描述了经修饰提高其家族间覆盖的fHBP的各种其它形式。

本发明的一个目的是提供fHBP具有的家族特异性保护的进一步和改良的方法，和使用这些方法提供针对脑膜炎球菌病和/或感染，特别是针对B血清群的免疫。

发明内容

全长fHBP在菌株MC58中具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK

LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ

IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG

KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG

IRHIGLAAKQ

成熟的脂蛋白缺乏SEQ ID NO：1的前19个氨基酸，fHBP的ΔG形式缺少前26个氨基酸。

MC58序列(SEQ ID NO：1)属于fHBP家族I。用MC58序列引发的抗体具有针对MC58菌株的高度杀菌活性，但是对于表达家族II或III fHBP的菌株的活性低得多。在一些实施方式中，本发明涉及修饰形式的fHBP，其中修饰作用改善了该蛋白引发家族间杀菌抗体的能力。在其他实施方式中本发明涉及融合蛋白，其中fHBP的改良形式与第二氨基酸序列，例如另一种脑膜炎球菌免疫原或另一种fHBP(包括修饰的fHBP)融合。

因此，本发明提供了一种多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78。这些氨基酸序列从MC58序列与Val-27匹配的残基开始，但包括下游位点的各种氨基酸修饰。

本发明还提供了一种多肽，包含第一免疫原性氨基酸序列和第二免疫原性氨基酸序列，其中第一氨基酸序列选自SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78。两种优选的第一免疫原性氨基酸序列是SEQ ID NO 20和23。在一些实施方式中，第一和第二氨基酸序列可以是相同的；在其它实施方式中，它们彼此不同。合适的第二免疫原性氨基酸序列在下文更详细描述，包括但不限于：(a)非脑膜炎球菌抗原；(b)脑膜炎球菌非fHBP抗原；(c)野生型脑膜炎球菌fHBP抗原；和(d)修饰的脑膜炎球菌fHBP抗原，其可以与第一免疫原性氨基酸序列相同或不同。第一和第二序列可以任何顺序从N端到C端排列。

因此，本发明提供了一种多肽，其所含氨基酸序列选自SEQ ID NO：99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137和138。

这些不同的多肽在给予宿主动物后有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力，在优选实施方式中可以诱导对三种fHBP家族I到III中每一种的菌株具有杀菌性的抗体。关于杀菌反应的其它信息在下文中给出。

第二免疫原性氨基酸序列

在一些实施方式中，本发明的多肽包括第二免疫原性氨基酸序列。可使用各种这类第二序列。

第二免疫原性氨基酸序列可以包含非脑膜炎球菌抗原。这优选来自非脑膜炎球菌病原体，例如细菌或病毒。例如，第二序列可以包含免疫原性肺炎球菌氨基酸序列或免疫原性肝炎病毒氨基酸序列。

第二免疫原性氨基酸序列除了fHBP抗原外还可包含脑膜炎球菌抗原。例如，第二序列可包含脑膜炎球菌抗原287、NadA、NspA、HmbR、NhhA、App、936或Omp85的序列。这些第二序列的其它细节如下。包括这种第二免疫原性序列的多肽序列的例子是SEQ ID NO：102、124、125、126、127、128和129。

第二免疫原性氨基酸序列可包含野生型或修饰的fHBP序列。该第二氨基酸序列在作为本发明多肽的一部分给予对象时可优选引发抗体反应，该反应包括与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、2或3之一的野生型脑膜炎球菌蛋白结合的抗体。例如，第二氨基酸序列可包含以下任一：

-选自SEQ ID NO：1、2和3的序列(野生型fHBP序列)。

-选自SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的序列(修饰的fHBP序列)。在一些实施方式中，第二免疫原性序列与第一免疫原性序列相同。

-一条氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78任一有至少x％序列相同性。

x的值是至少80，例如82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或以上。

包括这种fHBP序列作为第二免疫原性序列的多肽的例子是SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、130、131、132、133、134、135、136、137和138。

第一和第二免疫原性氨基酸序列可直接通过肽键连接，例如(i)第一免疫原性氨基酸序列的C末端氨基酸在第二免疫原性氨基酸序列N末端氨基酸直接上游，或(ii)第二免疫原性氨基酸序列的C末端氨基酸在第一免疫原性氨基酸序列N末端氨基酸直接上游。然而在其它实施方式中，第一和第二免疫原性氨基酸序列由接头氨基酸序列分隔，但仍然形成一条翻译的多肽链。这种接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即包含Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高，例如SEQ ID NO：95).本领域技术人员显然了解其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：81)或GSGSGGGG(SEQ ID NO：12)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接头。其它合适的接头是ASGGGS(SEQ ID NO：93，例如由SEQ ID NO：94编码)或Leu-Glu二肽。

可存在一种以上这样的第二序列，从而在多肽中提供第三、第四、第五等免疫原性序列。这些多肽包括那些含第一免疫原性氨基酸序列、第二免疫原性氨基酸序列和第三免疫原性氨基酸序列的多肽，其中：第一和第二氨基酸序列如上定义；第三氨基酸序列选自SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78。第一和第三序列可以彼此相同或不同；第二序列可以与第一或第三序列相同，或与它们都不相同。包括第一、第二和第三序列的多肽的例子是SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126和127。

一组有用的多肽包含(i)独立选自SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的两条氨基酸序列，和(ii)一种脑膜炎球菌非fHBP抗原。这些多肽的例子包括SEQ ID NO：124、125、126、127、140、141和142。部分(i)的两条氨基酸序列可以相同或不同。非fHBP抗原可以在部分(i)的两条氨基酸序列，部分(i)的两条氨基酸序列的C末端，或部分(i)的两条氨基酸序列的N末端之间。

非-fHBP脑膜炎球菌抗原

本发明的组合物可包含287抗原。287抗原作为基因NMB2132包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(GenBank登录号GI：7227388；本文的SEQ ID NO：83)。迄今已发表了来自许多菌株的287抗原序列。例如，参考文献17的图5和15以及文献18的实施例13和图21提供了287的等位基因形式(文中的SEQ ID 3179-3184)。也已报道了287抗原的各种免疫原性片段。本发明所用的优选287抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：83具有50％或更高相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：83至少’n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：83的表位。本发明最有用的287抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：83组成的脑膜炎球菌多肽结合。本发明使用的有利287抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可包含NadA抗原。NadA抗原作为基因NMB1994包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(GenBank登录号GI：7227256；本文的SEQ ID NO：84)。迄今已发表了来自许多菌株的NadA抗原序列，详细描述了该蛋白作为奈瑟菌粘附素的活性。还报导了NadA的各种免疫原性片段。本发明所用的优选NadA抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：84具有50％或更高相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：84至少’n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：84的表位。本发明最有用的NadA抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：84组成的脑膜炎球菌多肽结合。本发明使用的有利NadA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO：6是这样一个片段。

本发明的组合物可包含NspA抗原。NspA抗原作为基因NMB0663包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(GenBank登录号GI：7225888；本文的SEQ ID NO：85)。先前参考文献19和20提到该抗原。之后已发表了来自许多菌株的NspA抗原序列。还报导了许多NspA的免疫原性片段。本发明所用的优选NspA抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：85具有50％或更高相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：85至少’n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：85的表位。本发明最有用的NspA抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQID NO：85组成的脑膜炎球菌多肽结合。本发明使用的有利NspA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可包含脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列作为基因NMB1668包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(本文的SEQ ID NO：86)。本发明可使用包含HmbR全长序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含与SEQ ID NO：86具有至少i％序列相同性的氨基酸序列，其中i值是50、60、70、80、90、95、99或以上。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含SEQ ID NO：86的至少j个连续氨基酸的片段，其中j值是7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或以上。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含一氨基酸序列，其(i)与SEQID NO：86具有至少i％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：86至少j个连续氨基酸的片段。j个氨基酸的优选片段包含来自SEQ ID NO：86的表位。这些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR与血凝素结合的氨基酸，因为与这些表位结合的抗体能够阻断细菌与宿主血凝素结合的能力。HmbR的拓扑学及其关键功能性残基如参考文献21所述。本发明最有用的HmbR抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：86组成的脑膜炎球菌多肽结合。本发明使用的有利HmbR抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可包含NhhA抗原。NhhA抗原作为基因NMB0992包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(GenBank登录号GI：7226232；本文的SEQ ID NO：87)。自从例如参考文献17和22发表了来自许多菌株的NhhA抗原序列以来，也已报导了许多NhhA的免疫原性片段。它也称为Hsf。本发明所用的优选NhhA抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：87具有50％或更高相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：87至少’n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：87的表位。本发明最有用的NhhA抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：87组成的脑膜炎球菌多肽结合。本发明使用的有利NhhA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可包含App抗原。App抗原作为基因NMB1985包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(GenBank登录号GI：7227246；本文的SEQ ID NO：88)。之后已发表了来自许多菌株的App抗原序列。还报导了许多App的免疫原性片段。本发明所用的优选App抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：88具有50％或更高相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：88至少’n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：88的表位。本发明最有用的App抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：88组成的脑膜炎球菌多肽结合。本发明使用的有利App抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可包含Omp85抗原。Omp85抗原作为基因NMB0182包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(GenBank登录号GI：7225401；本文的SEQ ID NO：89)。之后已发表了来自许多菌株的Omp85抗原序列。Omp85的其它信息可见参考文献23和24。还报导了许多Omp85的免疫原性片段。本发明所用的优选Omp85抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ IDNO：89具有50％或更高相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：89至少’n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO：89的表位。本发明最有用的Omp85抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：89组成的脑膜炎球菌多肽结合。本发明使用的有利Omp85抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可包含936抗原。936抗原作为基因NMB2091包括在脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已发表基因组序列中(本文的SEQ ID NO：98)。本发明所用的优选936抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：98具有50％或更高相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：98至少’n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：98的表位。本发明最有用的936抗原可在给予对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ IDNO：98组成的脑膜炎球菌多肽结合。936抗原是fHBP的良好融合伴侣(例如见参考文献108和109)。

多肽

可通过许多方法制备本发明的多肽，例如通过化学合成(至少部分)，通过蛋白酶消化较长多肽，通过RNA翻译，通过细胞培养物纯化(例如来自重组表达或脑膜炎奈瑟球菌培养物)等。在大肠杆菌宿主中的异源表达是一种优选的表达途径。

fHBP是脑膜炎奈瑟球菌中天然存在的一种脂蛋白。已发现其在大肠杆菌中以天然前导序列表达时发生脂化。本发明中的多肽可以具有一个N末端半胱氨酸残基，其可以被脂化例如包含棕榈酰基团，通常会形成三棕榈酰-S-甘油-半胱氨酸。在其它实施方案中，所述多肽不发生脂化。

本发明中优选多肽的一个特征是在给予宿主动物后具有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力。

多肽优选以基本纯或基本分离的形式(即基本不含其它奈瑟球菌或宿主细胞多肽)或基本分离的形式制备。一般来说，在非天然发生环境中提供所述多肽，例如，将其从非天然发生环境中分离出。在一些实施方式中，对象多肽存在于相较对照该多肽富集的组合物中。照此提供纯化多肽，其中纯化指所述多肽存在于基本不含其它表达多肽的组合物中，其中基本不含指少于90％、通常少于60％、更加通常少于50％的所述组合物由其它表达多肽构成。

多肽可以采取多种形式(例如，天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、二硫桥等)。

SEQ ID NO 4-78不包括N末端甲硫氨酸。如果本发明中的多肽通过在生物宿主中的翻译产生，则需要起始密码子，其在大多数宿主中提供N末端甲硫氨酸。所以本发明中的多肽至少在新生阶段包括位于所述SEQ ID NO序列上游的甲硫氨酸残基。

在一些实施方式中，所述多肽在N末端具有单个甲硫氨酸，其后紧接着所述SEQ ID NO序列；在其它实施方式中，可以使用更长的上游序列。这些上游序列可较短(如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多，例如SEQ ID NO：95)。其它合适的N末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明中的多肽还可以包括位于所述SEQ ID NO序列终末氨基酸下游的氨基酸。这些C末端延伸可较短(如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白运输的序列，或有利于克隆的短肽序列(例如Leu-Glu二肽)或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多，例如SEQ ID NO：95)，或增强多肽稳定性的序列。可使用这些的组合，例如提供了Leu-Glu二肽和六组氨酸标签的SEQ ID NO：96，。其它合适的C末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。

术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链或支链聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸打断。该术语也包括天然修饰或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知其它修饰的多肽。多肽可以单链或结合链的形式产生。

本发明中的多肽可以连接于或固定于固体支持物。

本发明中的多肽可以包含可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记或生物素标记。这在免疫测定技术中特别有用。

如参考文献13所述，fHBP可分成三个结构域，称为A、B和C。根据SEQ IDNO：1，这三个结构域为(A)1-119，(B)120-183和(C)184-274：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK

LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ

IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG

KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG

IRHIGLAAKQ

结构域“A”的成熟形式从N末端的Cys-20到Lys-119，称作“A成熟”。

已知多个fHBP序列，可以利用标准方法很容易地进行比对。通过这种比对，技术人员可以(a)经与MC58序列中的坐标比较来鉴定任何给定fHBP序列中的结构域“A”(和A_成熟)、“B”和“C”，和(b)鉴定多个fHBP序列中的单个残基，例如，用于鉴定取代。然而，为便于参考，所述结构域定义如下：

-给定fHBP序列中的结构域‘A’是该序列的片段，当其与SEQ ID NO：1用成对比对算法对齐时，从与SEQ ID NO：1的Met1对齐的氨基酸开始，到与SEQ IDNO：1的Lys-119对齐的氨基酸结束。

-给定fHBP序列中的结构域‘A_成熟’是该序列的片段，当其与SEQ ID NO：1用成对比对算法对齐时，从与SEQ ID NO：1的Cys-20对齐的氨基酸开始，到与SEQ IDNO：1的Lys-119对齐的氨基酸结束。

-给定fHBP序列中的结构域‘B’是该序列的片段，当其与SEQ ID NO：1用成对比对算法对齐时，从与SEQ ID NO：1的Gln-120对齐的氨基酸开始，到与SEQ IDNO：1的Gly-183对齐的氨基酸结束。

-给定fHBP序列中的结构域‘C’是该序列的片段，当其与SEQ ID NO：1用成对比对算法对齐时，从与SEQ ID NO：1的Lys-184对齐的氨基酸开始，到与SEQ IDNO：1的Gln-274对齐的氨基酸结束。

定义所述结构域的优选成对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[26]，使用默认参数(例如，缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62计分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[27]。

在一些实施方式中，本发明多肽中的fHBP氨基酸序列被截断成去除其结构域A，即将结构域A从SEQ ID中省略。

在一些实施方式中，多肽包含如上所述的氨基酸序列，除了最多有10个N末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和/或最多有10个C末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)缺失。因此，本发明提供了一种含有氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列包含选自以下的氨基酸序列的片段：SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76&77，其中所述片段是所述SEQ ID的氨基酸a-b，其中a是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，其中b是j、j-1、j-2、j-3、j-4、j-5、j-6、j-7、j-8、j-9或j-10，其中j是所述SEQ ID的长度。也可以使用更长的截断(例如，最多15个氨基酸，最多20个氨基酸等)。

核酸

本发明提供了编码上述本发明的多肽的核酸。

可以多种方式制备本发明中的核酸，例如，通过完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、来自基因组或cDNA文库等。

本发明核酸可采取各种形式，例如，单链、双链、载体、引物、探针、标记、未标记等。

本发明中的核酸优选采用分离或基本分离的形式。

术语“核酸”包括DNA和RNA，还有其类似物如含有修饰主链的类似物，以及肽核酸(PNA)等。

本发明中的核酸可以被标记，例如，使用放射性或荧光标记。

本发明还提供了包含本发明核苷酸序列的载体(如质粒)(例如克隆或表达载体，如适合核酸免疫的载体)和用这种载体转化的宿主细胞。

杀菌反应

本发明中的优选多肽可以引发对脑膜炎球菌具有杀菌作用的抗体反应。可以方便地测定小鼠的杀菌性抗体反应，其为疫苗功效的标准指标[例如，见参考文献2的尾注14]。本发明中的多肽可优选引发对来自下列三个菌株组中至少两组的至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌作用的抗体反应：

(I)MC58，gb185(＝M01-240185)，m4030，m2197，m2937，iss1001，NZ394/98，67/00，93/114，bz198，m1390，nge28，lnp17592，00-241341，f6124，205900，m198/172，bz133，gb149(＝M01-240149)，nm008，nm092，30/00，39/99，72/00，95330，bz169，bz83，cu385，h44/76，m 1590，m2934，m2969，m3370，m4215，m4318，n44/89，14847。

(II)961-5945，2996，96217，312294，11327，a22，gb013(＝M01-240013)，e32，m1090，m4287，860800，599，95N477，90-18311，c11，m986，m2671，1000，m1096，m3279，bz232，dk353，m3697，ngh38，L93/4286。

(III)M1239，16889，gb355(＝M01-240355)，m3369，m3813，ngp165。

例如，多肽可以引发有效针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中两个或三个菌株的杀菌反应。

所述多肽可优选引发对至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更多)的临床相关脑膜炎球菌血清群B菌株具有杀菌作用的抗体反应。所述多肽可引发抗体反应，其对B血清群的脑膜炎奈瑟球菌以及血清群A、C、W135和Y中至少一种(例如1、2、3、4)菌株具有杀菌性。所述多肽可引起对淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)和/或灰色奈瑟球菌(N.cinerea)菌株具有杀菌性的抗体反应。所述多肽可以引发对来自参考文献4中图5所示系统树的三条主分枝中至少两条分枝的菌株具有杀菌作用的反应。

所述多肽可以引发对超毒力谱系ET-37、ET-5、A4簇、谱系3、亚组I、亚组III和亚组IV-1中至少2个(例如，2、3、4、5、6、7)的脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌作用的抗体反应[28，29]。多肽可额外诱导对一个或多个高侵袭性谱系的杀菌性抗体反应。

多肽可以引发对下列多基因座序列类型中至少2个(例如，2、3、4、5、6、7)类型的脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌作用的抗体反应：ST1、ST4、ST5、ST8、ST11、ST32和ST41[30]。所述多肽还可以引发对ST44菌株具有杀菌作用的抗体反应。

所述多肽不需要诱导针对指定谱系或MLST中各个和每个MenB菌株的杀菌性抗体；相反，对具体超毒力谱系或MLST中更多血清群B脑膜炎球菌菌株中的任何四个菌株的特定组来说，所述组合物诱导的抗体优选地对所述组的至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或更多)具有杀菌作用。优选的菌株组包括下列国家中至少四个所分离到的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清优选具有至少为1024(例如，2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少为2¹⁴)的杀菌效价，即所述血清可以在以1∶1024稀释后杀死一个特定菌株中至少50％的测试细菌，如参考文献2的尾注14所述。优选的嵌合多肽可以引发小鼠中的抗体反应，甚至在血清以1∶4096稀释或更稀时仍保持杀菌性。

免疫

本发明中的多肽可以用作免疫原性组合物的活性成分，所以本发明提供了包含本发明多肽的免疫原性组合物。

本发明还提供了一种在哺乳动物中引起抗体反应的方法，包含将本发明中的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。所述抗体反应优选是保护性和/或杀菌性抗体反应。本发明也提供了用于这种方法的本发明多肽。

本发明还提供了一种保护哺乳动物免受奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌)感染和/或疾病(例如针对流行性脑脊髓膜炎)的方法，包含将本发明中的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。

本发明提供了本发明多肽作为药物(例如，作为免疫原性组合物或疫苗)或诊断试剂的应用。本发明还提供了本发明中的核酸、多肽或抗体在制备防止奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌)感染哺乳动物的药物中的应用。

所述哺乳动物优选人。所述人可以是成人，或优选是儿童。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，以评估(例如)其安全性、剂量、免疫原性等。

所述用途和方法特别适用于防止/治疗疾病，所述疾病包括但并不限于脑膜炎(特别是细菌性脑膜炎，如脑膜炎球菌性)和菌血症。

治疗性处理的功效可以通过在给予本发明组合物后监测奈瑟球菌感染来测试。可通过监测在给予组合物后针对fHBP的免疫应答来测试预防性治疗的效力。测定本发明组合物的免疫原性可以通过将其给予受试对象(例如，12-16个月大的儿童或动物模型[31])，然后测定标准参数，包括血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)。通常在给予该组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予该组合物之前测定的值作比较。优选至少4倍或8倍的SBA增长。给予一个以上剂量的组合物时，可以进行一次以上的给药后测定。

本发明中的优选组合物可以在患者体内产生优于可接受人对象百分比的各抗原组分血清保护标准的抗体效价。具有相关抗体效价的抗原是众所周知的，高于该效价就认为宿主针对所述抗原发生血清转化，该类效价由诸如WHO的组织公布。优选多于80％的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化，更优选多于90％，更加优选多于93％，最优选96-100％。

本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或到组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径完成直接递送。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。通常的肌肉内剂量为约0.5ml。

本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。

剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案之后，可以进行加强剂量方案。可以通过常规方法确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次和加强剂量之间的适当时间选择。

本发明中的免疫原性组合物通常会包括药学上可接受的运载体，其可以是本身不会诱导对接受所述组合物的患者有害的抗体生成的任何物质，且可以实现无异常毒性的给药。药学上可接受的载体可以包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质也可以存在于该类载体中，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于合适载体的充分讨论见参考文献32。

奈瑟球菌感染会影响身体的各个部分，因此本发明中的组合物可以制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体载剂的固体形式。所述组合物可以制备用于外用给药，例如，作为油膏、乳膏或粉末。所述组合物可以制备用于口服给药，例如，作为片剂或胶囊，或糖浆(任选调味)。所述组合物可以制备用于肺部给药，例如作为使用细粉或喷雾的吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。所述组合物可以制备用于鼻部、耳部或眼部给药，例如作为滴剂。

该组合物优选无菌。其优选无热原。优选缓冲于例如pH 6-pH 8，通常为约pH7。在组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[33]。本发明中的组合物可以与人体等张。

免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及所需的任何其它特定组分。“免疫有效量”指在一次剂量或一系列剂量的一部分中给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(例如，非人的灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配制、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(例如，包括加强剂量)。所述组合物可与其它免疫调节剂联合给药。

可以用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含矿物质的组合物

本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，见参考文献34的第8、9章]，或不同无机化合物的混合物，其中的化合物可采取任何合适形式(例如胶体、晶体、无定形等)，优选吸附。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[35]。

一种有用的磷酸铝佐剂是无定形羟基磷酸铝，PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92，包括0.6mg Al³⁺/ml。

B.油乳剂

适用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括水包鲨烯乳剂，例如MF59[参考文献34的第10章；也可参见参考文献36](5％鲨烯、0.5％吐温80、和0.5％司盘(Span)85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。还可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

有用的水包油乳液通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。所述乳液中的油滴直径通常小于5μm，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

所述乳液可以包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。可以使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，其为本文特别优选。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可以使用油的混合物。

表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol^TMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂的含量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，具体是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，具体是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，具体是0.1-1％或约0.5％。

优选地，基本所有(例如至少90％数量的)油滴的直径均小于1μm，例如，≤750nm、≤500nm、≤400nm、≤300nm、≤250nm、≤220nm、≤200nm或更小。

一种特定有用的乳液是角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[37-39]，参考文献40的第10章和参考文献41的第12章有更详细的描述。所述MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。

C.皂苷制剂[参考文献34的第22章]

皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献42。皂苷制剂也可以包含甾醇，如胆固醇[43]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献34的第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献43-45中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可以不含另外的去污剂[46]。

关于开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献47和48。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白质。其通常无病原性，不能复制，且通常不含任何天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括源自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在参考文献49-54中有进一步描述。病毒体在(例如)参考文献55中有进一步描述。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献56中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以经0.22μm膜过滤除菌[56]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529[57，58]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)，如OM-174的脂质A衍生物。例如参考文献59和60中描述了OM-174。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。

CpG可以包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献61、62和63公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献64-69中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

所述CpG序列可以导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[70]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。参考文献71-73中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-AODN。

CpG寡核苷酸优选构建成5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献70和74-76。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC31^TM[77]。因此，本发明使用的佐剂可以包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5′-(IC)₁₃-3′(SEQ ID NO：79)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK的肽(SEQ ID NO：80)。

细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。参考文献78中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献79中描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素和类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚单位。A亚单位优选含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献80-87中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，具体是LT-K63和LT-R72用作佐剂。一种有用的CT突变体是CT-E29H[88]。氨基酸取代的编号优选是根据参考文献89所列ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对，该参考文献特定通过引用全文纳入本文。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[90]等)[91]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。

G.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[92]或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明的佐剂[93]。

H.微粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径～100nm-～150μm，更优选～200nm-～30μm，最优选～500nm-～10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酯-乙交酯共聚物)，并任选经处理而具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂处理，如CTAB)。

I.脂质体(参考文献34的第13和14章)。

适用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献94-96所述。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[97]。该类制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇的组合[98]，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种额外非离子表面活性剂如辛苯糖醇的组合[99]。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂参见例如参考文献100和101。

L.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

M.咪唑并喹诺酮化合物。

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，“雷西莫特3M”)，更多描述见参考文献102和103。

本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳液[104]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)[105]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[106]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳液的组合[107]；(6)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普流罗尼-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化形成亚微米乳液或涡旋产生粒度较大的乳液。(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(RibiImmunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献34的第7章。

特别优选使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂，抗原通常吸附于这些盐。其它优选的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合。

其它抗原组分

本发明中的组合物包括经修饰的fHPB序列。所述组合物不含复杂或未明确抗原混合物是有益的，例如，优选组合物中不含外膜囊泡。本发明中的多肽优选在异源宿主中重组表达并随后纯化。

除包括含fHBP的多肽之外，本发明中的组合物还可以包含一种或多种其它奈瑟球菌抗原，因为在每个细菌中具有靶向多于一种抗原的疫苗可以降低选择逃逸突变体的可能性。因此，组合物可以包含第二多肽，在给予哺乳动物时可以引发对脑膜炎球菌具有杀菌作用的抗体反应。所述第二种多肽不是脑膜炎球菌fHBP，但其可以是例如287序列、NadA序列、953序列、936序列等。一种组合物可包含以下的一种或多种：包含SEQ ID NO：90的多肽；包含SEQ ID NO：91的多肽；和/或包含SEQ ID NO：92或139的多肽(见参考文献108和109)。

包含第一多肽、第二多肽和第三多肽的组合物是有用的，其中第一多肽包含936抗原与至少一种经修饰fHBP的融合，第二多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：90，第三多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：92。例如，第一多肽可包含氨基酸序列SEQ IDNO：124、125、126、127、128、129中的任一种。

包含第一多肽、第二多肽和第三多肽的组合物是有用的，其中第一多肽包含936抗原与至少一种经修饰fHBP的融合，第二多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：90，第三多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：139。例如，第一多肽可包含氨基酸序列SEQ IDNO：124、125、126、127、128、129中的任一种，优选包含SEQID NO：126。该组合物可包含如本文他处所述的脑膜炎球菌外膜囊泡，但优选不包含。

包含于所述组合物中的抗原包括包含一个或多个下列序列的多肽：

(a)参考文献110中公开的446个偶数编号的SEQ ID(即2，4，6，…，890，892)；

(b)参考文献110中公开的45个偶数编号的SEQ ID(即2，4，6，…，88，90)；

(c)参考文献3中公开的1674个偶数编号的SEQ ID 2-3020，偶数SEQ ID3040-3114，和全部SEQ ID 3115-3241；

(d)参考文献2中公开的2160条氨基酸序列NMB0001-NMB2160；

(e)任何亚型的脑膜炎球菌PorA蛋白，优选是重组表达的；

(f)(a)-(e)的变体、同源物、直向同源物、横向同源物、突变体等；或

(g)脑膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡制备物[见参考文献173]，但优选不包含。

除奈瑟球菌的多肽抗原之外，所述组合物可以包括针对其它疾病或感染免疫的抗原。例如，所述组合物可以包括一种或多种下列其它抗原：

-来自脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，例如来自血清群C的参考文献112所述[另见文献113]或文献114中所述的糖。

-来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如115、116、117]。

-来自甲肝病毒的抗原，例如灭活病毒[例如118，119]。

-来自乙肝病毒的抗原，例如表面和/或核心抗原[例如119，120]。

-白喉抗原，例如白喉类毒素[例如参考文献121的第3章]，例如CRM₁₉₇突变体[例如122]。

-破伤风抗原，例如破伤风类毒素[例如参考文献121的第4章]。

-来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，例如百日咳全毒素(PT)和百日咳博德特氏菌的丝状血细胞凝集素(FHA)，可任选地与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3联合[例如参考文献123和124]。

-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B的糖[例如113]。

-脊髓灰质炎抗原[例如125、126]，例如IPV。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献121的第9、10和11章]。

-流感抗原[例如参考文献121的第19章]，例如血凝素和/或神经酰胺酶表面蛋白。

-卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如127]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白抗原(B型链球菌)[例如128、129]。

-无乳链球菌的糖抗原(B型链球菌)。

-来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)的抗原[例如129、130、131]。

-来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[例如132]。

所述组合物可以包含一种或多种这些其它抗原。

必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[124])。

在所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，在包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。

糖抗原优选偶联物形式。下文中将更详细地讨论所述偶联物的载体蛋白。

所述组合物中各抗原的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫反应。

本发明中的免疫原性组合物的使用可以是治疗性(即治疗已有的感染)或预防性(即防止将来的感染)的。

作为在本发明免疫原性组合物中使用蛋白质抗原的替代方式，可以使用编码该抗原的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)。

在一些实施方式中，本发明中的组合物除fHBP序列之外还包含来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中1、2、3或4种的偶联荚膜糖抗原。在其它实施方式中，本发明中的组合物除fHBP序列之外还包含至少一种偶联肺炎球菌荚膜糖抗原。

脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A

现有的血清群C疫苗(Menjugate^TM[133，112]，Meningitec^TM和NeisVac-C^TM)含有偶联糖。Menjugate^TM和Meningitec^TM具有与CRM₁₉₇载体偶联的寡糖抗原，而NeisVac-C^TM使用的是与破伤风类毒素载体偶联的完整多糖(去-O-乙酰化)。Menactra^TM疫苗含有血清群Y、W135、C和A的偶联荚膜糖抗原。

本发明中的组合物可以包含来自一种或多种脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白偶联和/或其为寡糖。例如，所述组合物可以包含来自以下的荚膜糖抗原：血清群C；血清群A和C；血清群A、C和W135；血清群A、C和Y；血清群C、W135和Y；或血清群A、C、W135和Y全部四组。

每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的通常量为1μg-20μg，例如，约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(以糖表达)。

在混合物包含血清组A和C的荚膜糖时，MenA糖与MenC糖的比例(w/w)可以大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。在混合物包含来自血清群Y与血清群C和W135中一种或两种的荚膜糖时，MenY糖和MenW135糖的比例(w/w)可以大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)，和/或MenY糖和MenC糖的比例(w/w)可以小于1(例如，1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。血清群A∶C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)为：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。血清群C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)为：1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1；和2∶1∶1。优选使用质量基本相等的各种糖。

使用的荚膜糖可以是寡糖形式。通过对纯化荚膜多糖进行片段化(例如通过水解)可以方便地形成所述寡糖，片段化后通常要纯化具有所需尺寸的片段。

优选进行多糖的片段化，以使寡糖的最终平均聚合程度(DP)小于30(例如，血清群A为10-20，优选约10；血清群W135和Y为15-25，优选约15-20；血清组C为12-22等)。可以通过离子交换色谱或比色测定方便地测量DP[134]。

如果进行水解，通常对水解产物进行筛分，以去除长度较短的寡糖[113]。这可以用各种方法实现，如超滤后进行离子交换色谱。对于血清群A，优选去除聚合程度小于或等于约6的寡糖；对于血清群W135和Y，优选去除聚合程度小于4左右的寡糖。

参考文献133描述了Menjugate^TM中使用的优选MenC糖抗原。

所述糖抗原可以经化学修饰。这对降低血清群A的水解特别有用[135；见下文]。可以进行脑膜炎球菌糖的脱-O-乙酰化。对寡糖的修饰可以在解聚之前或之后进行。

本发明中的组合物包含MenA糖抗原时，优选所述抗原为天然糖上有一个或多个羟基被封闭基团取代的修饰糖[135]。该修饰可以改善耐水解性。

共价偶联

本发明组合物中的荚膜糖通常会与载体蛋白偶联。一般，偶联可以增强糖的免疫原性，因为偶联可以将糖由T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，由此可启动免疫记忆。偶联对儿科疫苗特别有用，是一项众所周知的技术。

典型的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或者其类毒素或突变体。可以使用CRM₁₉₇白喉毒素突变体[136]，其为PREVNAR^TM产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[137]、合成肽[138，139]、热激蛋白[140，141]、百日咳蛋白[142，143]、细胞因子[144]、淋巴因子[144]、激素[144]、生长因子[144]、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[145]如N19[146]、来自流感嗜血杆菌的蛋白D[147-149]、肺炎球菌溶血素[150]或其无毒衍生物[151]、肺炎球菌表面蛋白PspA[152]、摄铁蛋白[153]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[154]、重组铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[155]等。

可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。

一般在偶联前活化或官能化所述糖。活化可以包括例如使用氰化试剂，如CDAP(例如1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐[156，157等])。其它合适的技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU等。

可以用任何已知方法通过接头基团进行连接，例如参考文献158和159所述的方法。一种连接类型包括多糖的还原胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，再将蛋白质偶联到该己二酸接头基团的另一端[160，161]。其它接头包括B-丙酰胺基[162]、硝基苯基-乙基胺[163]、卤代酰基卤化物[164]、糖苷键[165]、6-氨基己酸[166]、ADH[167]、C₄-C₁₂部分[168]等。作为采用接头的替代方法，可以采用直接连接。直接连接蛋白质可以包括氧化多糖，然后与蛋白质进行还原胺化，如例如参考文献169和170所述。

优选包括以下步骤的方法：将氨基引入到糖中(例如用-NH₂取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生，与载体蛋白反应。另一种优选的反应采用CDAP活化与蛋白D载体，例如用于MenA或MenC。

外膜囊泡

优选本发明组合物不含复杂或未明确抗原复合物，此为OMV的典型特征。然而，本发明可以与OMV联用，因为已发现fHBP可以增强其功效[6]，特别是通过在用于制备OMV的菌株中过量表达本发明多肽，使多肽在OMV表面展示。

通常使用该方法来改善脑膜炎奈瑟球菌血清群B微囊泡[171]、“天然OMV”[172]、水泡或外膜囊泡[例如参考文献173-178等]的制备。这些可以从经遗传操作处理的细菌制备得到[179-182]，例如，以增加免疫原性(例如超表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。这些可以从高发泡的菌株制备得到[183-186]。可以包括非致病性奈瑟球菌的囊泡[187]。制备OMV可以不使用去污剂[188，189]。其可以在表面表达非奈瑟球菌蛋白[190]。其可以为LPS耗尽型。其可以与重组抗原混合[173，191]。可以使用具有不同I类外膜蛋白亚型的细菌的囊泡，例如六种不同亚型[192，193]，使用各展示三种亚型的两种不同遗传工程改造囊泡群，或九种不同亚型，使用各展示三种亚型的的三种不同遗传工程改造囊泡群，等等。可用的亚型包括：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。

当囊泡存在于组合物中时，其量可根据囊泡中的总蛋白确定。组合物可包含1-100100μg/ml囊泡，例如15-30μg/ml，或优选较低剂量，例如2-10μg/ml。

有关囊泡的更多的细节在下文中给出。

蛋白质表达

细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是任何能够与细菌RNA聚合酶结合并启动下游(3’端)编码序列(例如结构基因)转录为mRNA的DNA序列。启动子具有通常位于编码序列5’末端附近的转录起始区域。该转录起始区域通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称为操纵基因的另一个结构域，其可以与相邻的RNA合成开始的RNA聚合酶结合位点发生重叠。所述操纵基因允许负调节(诱导型)转录，因为基因阻抑蛋白可以与操纵基因结合，从而抑制特定基因的转录。组成型表达可以在负调节元件如操纵基因不存在的条件下发生。此外，正调节可以通过(如果存在)通常靠近(5’)RNA聚合酶结合序列的基因激活蛋白结合序列来实现。基因激活蛋白的一个例子是分解代谢物激活蛋白(CAP)，其在大肠杆菌(E.coli)中协助乳糖操纵子启动转录[Raibaud等(1984)Annu.Rev.Genet.18：173]。因此，受调节的表达可以是正调节表达或负调节表达，从而增强或减弱转录。

编码代谢途径酶的序列可以提供特别有用的启动子序列。例子包括来自糖代谢酶的启动子序列，如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等(1977)Nature 198：1056]和麦芽糖。其它例子包括衍生自生物合成酶的启动子，例如色氨酸(trp)[Goeddel等(1980)Nuc.Acids Res.8：4057；Yelverton等(1981)Nucl.Acids Res.9：731；美国专利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775]。β内酰胺酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″The cloning of interferon and other mistakes(干扰素的克隆和其它错误)″，Interferon 3(《干扰素3》，I.Gresser编)]，噬菌体λPL[Shimatake等(1981)Nature 292：128]和T5[美国专利4,689,406]启动子系统也提供了有用的启动子序列。另一个感兴趣的启动子是诱导型阿拉伯糖启动子(pBAD)。

此外，自然界不存在的合成启动子也具有和细菌启动子一样的功能。例如，一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列可以与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列结合，生成一种合成杂交启动子[美国专利4,551,433]。例如，tac启动子是杂交trp-lac启动子，其由trp启动子和lac抑制子调控的lac操纵子序列组成[Amann等(1983)Gene 25：167；de Boer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21]。此外，细菌启动子可以包括非细菌来源的天然存在的启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合和启动转录的能力。非细菌来源的天然存在的启动子也可以与相容的RNA聚合酶偶联，以在原核生物中产生一些基因的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的一个例子[Studier等(1986)J.Mol.Biol.l89：113；Tabor等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：1074]。此外，杂合启动子也可以包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域(EP-A-0 267 851)。

除功能性启动子序列之外，有效的核糖体结合位点也有用于在原核生物中表达外源基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称为Shine-Dalgarno(SD)序列，包括起始密码子(ATG)和一段位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的3-9个核苷酸长度的序列。据信SD序列能通过SD序列和大肠杆菌16S rRNA的3’末端之间碱基配对促进mRNA与核糖体结合[Steitz等(1979)″Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA.(信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列)″，BiologicalRegulation and Development：Gene Expression(《生物学调控和发育：基因表达》R.F.Goldberger编)]。为了表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等(1989)″Expression of cloned genes in Escherichia coli(大肠杆菌中克隆基因的表达)″，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》]。

启动子序列可以直接与DNA分子连接，在这种情况下，N末端的第一个氨基酸总是由起始密码子ATG编码的甲硫氨酸。如果需要，可以通过用溴化氰进行体外孵育或用细菌甲硫氨酸N末端肽酶进行体内或体外孵育将N末端的甲硫氨酸从蛋白质上切割下来。

通常，细菌识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3’的调控区域，因而与启动子一起侧接编码序列。这些序列指导可翻译为DNA编码多肽的mRNA的转录。转录终止序列通常包括能够形成有助于终止转录的茎-环结构的约50个核苷酸的DNA序列。例子包括源自带有强启动子的基因的转录终止序列，如大肠杆菌中的trp基因以及其它生物合成基因。

通常，上述组分包含启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列和转录终止序列，一起组成表达构建物。表达构建物通常保持在复制子中，如能够在宿主如细菌中稳定保持的染色体外元件(例如质粒)。所述复制子具有复制系统，允许其保持在原核宿主中进行表达或克隆扩增。此外，复制子可以是高拷贝或低拷贝质粒。高拷贝数的质粒一般具有约5-约200的拷贝数，通常约10-约150。包含高拷贝数质粒的宿主优选包含至少约10个质粒，更优选至少约20个质粒。根据载体和外源蛋白对宿主的效果，可以选择高拷贝数或低拷贝数的载体。

或者，可以用整合载体将表达构建物整合入细菌基因组。整合载体通常包含至少一段与允许载体整合的细菌染色体同源的序列。整合似乎是通过载体和细菌染色体中同源DNA之间的重组而产生。例如，用来自各种杆菌菌株的DNA构建的整合载体均可以整合入杆菌染色体(EP-A-0127328)。整合载体也可以包含噬菌体或转座子序列。

通常，染色体外和整合表达构建物可以包含选择性标记物，以允许对转化的细菌菌株进行选择。选择性标记物可以在细菌宿主中表达，可以包括使细菌对如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环霉素等药物产生抗性的基因[Davies等(1978)Annu.Rev.Microbiol.32：469]。选择性标记物也可以包括生物合成基因，如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成通路中的基因。

或者，可以在转化载体中将一些上述组分合在一起。转化载体通常包含保持在复制子中或构建入上述整合载体的选择性标记物。

已开发出转化许多细菌的染色体外复制子或整合载体作为表达和转化载体。例如，已开发出用于但不限于下列细菌的表达载体：枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis}[Palva等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0036259和EP-A-0063953；WO84/04541]，大肠杆菌[Shimatake等(1981)Nature 292：128；Amann等(1985)Gene40：183；Studier等(1986)J.Mol.Biol.189：113；EP-A-0 036 776，EP-A-0 136 829和EP-A-0 136 907]，乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)[Powell等(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]；变铅青链球菌(Streptococcus lividans)[Powell等.(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)[美国专利4,745,056].

将外源DNA引入细菌宿主的方法是本领域众所周知的，通常包括转化经CaCl₂或其它试剂处理的细菌，如二价阳离子和DMSO处理。还可以通过电穿孔将DNA引入细菌细胞。转化步骤通常随待转化的细菌种类而变化。参见例如[Masson等(1989)FEMS Microbiol.Lett.60：273；Palva等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：5582；EP-A-0036259和EP-A-0063953；WO84/04541，杆菌]，[Miller等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：856；Wang等(1990)J.Bacteriol.172：949，Campylobacter]，[Cohen等(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.69：2110；Dower等(1988)Nucleic AcidsRes.16：6127；Kushner(1978)″An improved method for transformation of Escherichiacoli with ColE1-derived plasmids.(用ColE1衍生质粒转化大肠杆菌的改良方法)”，Genetic Engineering：Proceedings of the International Symposium on GeneticEngineering(《遗传工程：遗传工程国际研讨会论文集》，H.W.Boyer和S.Nicosia编)；Mandel等(1970)J.Mol.Biol.53：159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta949：318；埃希氏菌]，[Chassy等(1987)FEMS Microbiol.Lett.44：173乳杆菌]；[Fiedler等(1988)Anal.Biochem 170：38，假单胞菌]；[Augustin等(1990)FEMS Microbiol.Lett.66：203，葡萄球菌]，[Barany等(1980)J.Bacteriol.144：698；Harlander(1987)″Transformation of Streptococcus lactis by electroporation(通过电穿孔转化乳酸链球菌)”，于：Streptococcal Genetics(《链球菌遗传学》，J.Ferretti和R.Curtiss III编)；Perry等(1981)Infect.Immun.32：1295；Powell等(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655；Somkuti等(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1：412，链球菌]。

宿主细胞

本发明提供了一种表达本发明所述多肽的细菌。所述细菌可以是脑膜炎球菌。所述细菌可以组成型表达所述多肽，但是在一些实施方式中，表达可以处于诱导型启动子的控制下。所述细菌可以超表达所述多肽(参见参考文献194)。所述多肽的表达可以不是相变化的。

本发明还提供了由本发明所述细菌制备的外膜囊泡。还提供了从本发明所述细菌生产囊泡的过程。从这些菌株制备的囊泡优选包括本发明所述多肽，该多肽在囊泡中应为免疫可及形式，即可以与本发明所述纯化多肽结合的抗体也应能结合囊泡中存在的多肽。

这些外膜囊泡包括任何由脑膜炎球菌外膜的破坏或发泡而获得的脂蛋白体囊泡以形成包含外膜蛋白组分的囊泡。因此该术语包括OMV(有时称为“小泡”)、微囊泡(MV[195])和“天然OMV”(“NOMV”[196]))。

MV和NOMV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长时自发形成并释放到培养基中。MV可以通过以下方法获得：在肉汤培养基中培养奈瑟球菌，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如，通过过滤或低速离心，从而仅沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从细胞耗尽的培养基中收集MV(例如，通过过滤、示差离心或MV聚集，通过高速离心沉淀MV)。一般可以根据培养基中产生的MV量来选择用于生产MV的菌株，例如，参考文献197和198描述了具有高MV生成的奈瑟球菌。

从细菌中人工制备OMV，可以利用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非去污剂方式(例如参见参考文献199)进行制备。形成OMV的技术包括：用胆酸盐去污剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[200和201]处理奈瑟球菌)在不会沉淀去污剂的充分高的pH下[202]处理细菌。其它技术基本可以在没有去污剂存在的情况下[199]利用如超声、均化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、弗氏压碎、混合等技术进行。不使用或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[199]。因此一种方法可以使用含有约0.5％或更低如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或0浓度的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。

参考文献203描述了一种制备OMV的有用过程，涉及对粗OMV进行超滤，代替高速离心。该过程可以涉及在超滤后进行超离心的步骤。

本发明使用的囊泡可以从任何脑膜炎球菌菌株中制备。所述囊泡通常来自血清群B菌株，但是也可能从除B以外的血清群进行制备(例如，参考文献202公开了一种用于血清群A的过程)，如A、C、W135或Y。所述菌株可以属于任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3，3，7；L10等)。脑膜炎球菌可以来自任何适当谱系，包括高侵袭性与超毒力谱系，如以下7种超毒力谱系中任一种：亚组I、亚组III、亚组IV 1、ET-5复合物、ET-37复合物、A4簇、谱系3。

除编码本发明所述的多肽外，本发明所述的细菌还可以具有一个或多个进一步的修饰。例如，其可以具有经修饰的fur基因[204]。参考文献212教导，应当通过伴随的porA和cps的敲除上调nspA的表达，可以使用这些修饰。参考文献212-214公开了用于生产OMV的脑膜炎奈瑟球菌进一步的敲除突变体。参考文献205公开了从表达6种不同PorA亚型的修饰菌株进行囊泡构建。也可以使用通过敲除参与LPS生物合成的酶而获得具有低内毒素水平的奈瑟球菌突变体[206，207]。这些或其它突变体均可与本发明一起使用。

因此本发明使用的菌株在一些实施方式中可以表达多于一种的PorA亚型。之前已构建出6价和9价PorA菌株。所述菌株可表达2、3、4、5、6、7、8或9种PorA亚型：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.121.13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1和/或P1.18-1，3，6。在其它实施方式中，可以下调菌株的PorA表达，例如，PorA的量相对于野生型水平(例如相对于H44/76菌株)减少了至少20％(例如，≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％等)，或甚至被敲除。

在一些实施方式中，菌株可以超表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如，菌株可以超表达NspA、蛋白287[208]、fHBP[194]、TbpA和/或TbpB[209]、铜，锌超氧化物歧化酶[209]、HmbR等。

编码本发明所述多肽的基因可以整合入细菌染色体，或可以游离体形式存在，例如在质粒中。

对囊泡生产来说，宜对脑膜炎球菌进行遗传工程改造，以确保多肽的表达不会发生相变异。参考文献210描述了减少或消除脑膜炎球菌中基因表达相变化的方法。例如，可以将基因置于组成型或诱导型启动子的控制下，或通过去除或取代引起相变化的DNA基序。

在一些实施方式中，菌株可以包括参考文献211-214描述的一个或多个敲除和/或超表达突变。下调和/或敲除的优选基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[211]；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[212]；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[213]；和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC[214]。

使用突变菌株时，在一些实施方式中，可以具有一个或多个或全部下列特征：(i)LgtB和/或GalE下调或敲除，以截短脑膜炎球菌LOS；(ii)TbpA上调；(iii)NhhA上调；(iv)Omp85上调；(v)LbpA上调；(vi)NspA上调；(vii)PorA敲除；(viii)FrpB下调或敲除；(ix)Opa下调或敲除；(x)Opc下调或敲除；(xii)cps基因复合体缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以为半乳糖缺陷型LOS。所述LOS可以没有α链。

根据用于制备囊泡的脑膜炎球菌菌株，其可以包含或不包含菌株的天然fHBP抗原[215]。

如果LOS存在于囊泡中，可以对囊泡进行处理，以将其LOS与蛋白质组分连接起来(“泡内”偶联[214])。

概述

术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10％。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可以从本发明的定义中省略。

优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定“序列相同性”，参数为缺口开放罚分＝12，缺口延伸罚分＝1。

脑膜炎球菌分类在血清群之后包括血清型、血清亚型和免疫型，标准命名法列出血清群、血清型、血清亚型和免疫型，彼此之间由冒号隔开，例如B：4：P1.15：L3，7，9。在血清群B中，一些谱系经常引起疾病(高侵袭性)，一些谱系引起比其它谱系更严重的疾病形式(超毒力)，其余的很少引起疾病。识别出7个超毒力谱系，即亚组I、III和IV-1、ET-5复合体、ET-7复合体、A4簇和谱系3。通过多位点酶电泳(MLEE)对这些进行了定义，但是也可以使用多位点序列分型(MLST)对脑膜炎球菌分类[参考文献30]。4种主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和ST11复合体。

一般，本发明不包含在文献4、5、7、8、9、10、12、13、14和216中特定公开的各种fHBP序列。

具体实施方式

实施例1

用野生型MC58序列(SEQ ID NO：1)作为基线，参考文献15制备了72种修饰的fHBP序列。这些是SEQ ID NO：4-75。用相似的途径，发明人现在提供SEQ IDNOs：77和78。

在大肠杆菌中表达的多肽具有N末端甲硫氨酸，其后紧接着SEQ ID NO氨基酸序列。合并所述多肽与氢氧化铝佐剂，有时也包括IC31^TM，然后用于免疫接种小鼠。在针对一组脑膜炎球菌菌株的杀菌试验中对小鼠的抗血清进行了测试。该组中包括来自三个fHBP家族中各家族的菌株。来自家族I和II的野生型MC58多肽也用于接种小鼠以比较。

包括SEQ ID NO：78的多肽得到了特别良好的结果。针对这种多肽的血清对5种不同的家族I菌株(MC58、NM008、M4030、GB185、NZ)和4种不同的家族II菌株(961-5945、M3153、C11、M2552)具有杀菌作用。对所述菌株的效价通常比使用来自特定家族的野生型序列时要低，但是野生型序列都未显示良好的家族间杀菌活性。因此，修饰有效提高了对fHBP的菌株交叉保护。

实施例2

各种修饰的fHBP序列融合于：

(i)彼此；(ii)野生型fHBP序列；或(iii)其它脑膜炎球菌抗原。这些在有或没有C末端聚组氨酸标签情况下表达，用IMAC从大肠杆菌中纯化。

融合蛋白分成四个主要类别：(a)相同或不同的两种经修饰fHBP序列的融合；(b)相同或不同的三种经修饰fHBP序列的融合；(c)野生型fHBP序列与一种或两种经修饰fHBP序列的融合；和(d)经修饰fHBP序列与非fHBP脑膜炎球菌抗原的融合。这些不同融合蛋白包含以下氨基酸序列：

(a)相同或不同的两种经修饰fHBP序列的融合，

9C-9C............SEQ ID NO：132

10A-10A........SEQ ID NO：134

10A-9C..........SEQ ID NO：135

8B-8B............SEQ ID NO：138

9C-10A..........SEQ ID NO：133

(b)相同或不同的三种经修饰fHBP序列的融合，

10A-10A-10A SEQ ID NO：113

10A-10A-9C..SEQ ID NO：117

10A-9C-10A..SEQ ID NO：112

10A-9C-9C....SEQ ID NO：118

8B-8B-8B......SEQ ID NO：123

9C-10A-10A..SEQ ID NO：105

9C-10A-9C....SEQ ID NO：108

9C-9C-10A....SEQ ID NO：104

9C-9C-9C......SEQ ID NO：107

(c)野生型fHBP序列与一种或两种经修饰fHBP序列的融合

10A-MC58....SEQ ID NO：131

10A-10A-MC58  SEQ ID NO：114

10A-MC58-10A  SEQ ID NO：115

10A-MC58-9C    SEQ ID NO：116

10A-9C-MC58    SEQ ID NO：111

MC58-10A....SEQ ID NO：137

MC58-10A-10A   SEQ ID NO：121

MC58-10A-9C    SEQ ID NO：119

MC58-9C.......SEQ ID NO：136

MC58-9C-10A    SEQ ID NO：120

MC58-9C-9C.SEQ ID NO：122

9C-10A-MC58    SEQ ID NO：109

9C-MC58.......SEQ ID NO：130

9C-MC58-10A    SEQ ID NO：106

9C-MC58-9C.SEQ ID NO：110

9C-9C-MC58.SEQ ID NO：103

(d)经修饰fHBP序列与非fHBP脑膜炎球菌抗原的融合。例如：

936-10A-10A SEQ ID NO：126

936-10A-9C...SEQ ID NO：125

936-9C-10A...SEQ ID NO：124

936-9C-9C.....SEQ ID NO：127

936-10A.........SEQ ID NO：129

936-9C...........SEQ ID NO：128

NB：10A序列是SEQ ID NO：23；9C序列是SEQ ID NO：20；8B序列是SEQ IDNO：17；MC58序列是SEQ ID NO：97(即SEQ ID NO：1的氨基酸27-274)；而936序列是SEQ ID NO：98，包括其自身的N端甲硫氨酸。

例如，为了制备9C-9C融合，编码PATCH_9C(SEQ ID NO：20)的序列通过BamHI限制性位点和甘氨酸接头(因此编码SEQ ID NO：81)与编码序列的第二个拷贝连接，然后是XhoI限制性位点和C-末端六组氨酸标签(SEQ ID NO：95)。上游序列提供了N末端甲硫氨酸，得到以下最终表达的511聚序列(SEQ ID NO：99，comprising SEQ ID NO：99(包含SEQ ID NO：132)：

MVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDK

VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEH

TSFDKLPEGGRATYHGKAFGSDDPNGRLHYTIDFAAKQGYGRIEHLKTPEQNVDLAAADIKPDGKR

HAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKIGEGIRHIGLAAKQVAADIGAGL

ADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQI

EVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGG

RATYHGKAFGSDDPNGRLHYTIDFAAKQGYGRIEHLKTPEQNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLY

NQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKIGEGIRHIGLAAKQLEHHHHHH

类似的，为了制备10A-10A-10A融合，三条编码PATCH_10A(SEQ ID NO：23)的序列通过BamHI限制性位点和甘氨酸接头连接(因此编码SEQ ID NO：81)，然后是XhoI限制性位点和C末端六组氨酸标签(SEQ ID NO：95)。上游序列提供了N末端甲硫氨酸，得到以下最终表达的762-聚序列(SEQ ID NO：100(包含SEQ ID NO：113)：

MVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDK

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GGRAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQLEHHHHHH

类似的，为了制备10A-MC58融合，将编码PATCH_10A(SEQ ID NO：23)的序列通过BamHI限制性位点和甘氨酸接头(因此编码SEQ ID NO：81)与MC58序列(编码SEQ ID NO：97)连接，然后是XhoI限制性位点和C末端六组氨酸标签(SEQ IDNO：95)。上游序列提供了N末端甲硫氨酸，得到表达的509聚序列(SEQ ID NO：101(包含SEQ ID NO：131)：

MVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDK

VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDLGGEH

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DALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIE

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ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYN

QAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQLEHHHHHH

类似的，为了制备936-9C融合，将编码936(SEQ ID NO：98)序列通过BamHI限制性位点和甘氨酸接头(因此编码SEQ ID NO：81)与MC58序列(编码SEQ IDNO：97)连接，然后是XhoI限制性位点和C末端六组氨酸标签(SEQ ID NO：95)。上游序列提供了N末端甲硫氨酸，得到最终表达的442聚序列(SEQ ID NO：102，包含SEQ ID NO：128)：

MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYDRHLL

LLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATRARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQRVAADIGAGLADA

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用融合蛋白免疫小鼠。为了比较，还使用了下列抗原：来自菌株MC58或2996的野生型fHBP；修饰的fHBP 9C或10A；还使用了参考文献13中公开的家族I、II、和III的杂交物。测试得到的血清针对一组来自fHBP家族I、II和III的菌株的杀菌活性。用明矾+IC31^TM混合物作为佐剂免疫两次后的效价如下：

虽然MC58(家族I)和2996(家族II)序列仅显示针对具有同源fHP菌株的效力，用本发明的融合蛋白显示交叉菌株效力显著提高。另外，通过将修饰的9C和10A序列与936或野生型MC58fHBP序列融合可提高其效力。9C-10A-9C融合显示了跨越整组的非常良好的结果。

因此，将修饰的序列与其它抗原融合提供了一种改善其引发抗脑膜炎球菌免疫反应的能力的通用方法。

佐剂研究

用PATCH_2S、PATCH_5bis、PATCH_5penta、PATCH_9C、PATCH_9F和PATCH_10A多肽，以及来自菌株2996的野生型fHBP序列，和氢氧化铝(Al-H)和/或IC31TM佐剂一起免疫小鼠。针对一组10种不同的脑膜炎球菌菌株测试血清。

当用含有PATCH_9C和/或PATCH_10A和/或野生型MC58 fHBP序列和/或936抗原的融合蛋白测试时，Al-H+IC31^TM的组合比Al-H单独得到了更好的结果，例如当使用含有936与两个拷贝的PATCH_10A(SEQ ID NO：18)融合的融合蛋白时，用Al-H将仅对1/10菌株的效力转化为对9/10菌株的效力。

使用936-10A-10A序列或936-9C-10A序列，针对一组10种菌株的杀菌效价为：

因此，除了一个例外，加入IC31提高效价。

936-10A-10A

筛选936-10A-10A融合物用于进一步研究(即SEQ ID NO：126)。该多肽与Al-H配制于包含9mg/ml NaCl和10mM组氨酸，pH6.5的组合物中。混合注射用水和组氨酸缓冲液，然后加入NaCl，最终渗透压为308mOsm/kg。加入Al-H得到3mg/ml的终Al⁺⁺⁺浓度。加入多肽，得到的终浓度为100μg/ml，室温搅拌15分钟，然后4℃储存过夜。在给予前，加入作为水悬液的IC31^TM(肽：DNA的摩尔比为25∶1，1μmol肽)，等体积混合。最终混合物是等渗的，处于生理pH。多肽吸收＞90％(与单独Al-H观察到的水平类似)。

每组8只动物(6周龄CD1雌性小鼠)在第0天腹膜内接受20μg添加了佐剂的多肽，在第21和35天接受增强剂量。第49天抽取血样用于分析，并在兔或人补体存在下，对于一组11种脑膜炎球菌菌株通过杀菌试验分析。效价如下：

^*＝抑菌效价

不论936-10A-10A多肽具有C末端聚组氨酸标签与否，都观察到类似的结果，但是根据所用的佐剂，有时在使用具有组氨酸标签的936-10A-10A多肽时会观察到更好的效价。

936-10A-10A多肽取代了参考文献108所述‘5CVMB’疫苗中的’936-fHBP’多肽，得到三种多肽的混合物，所述多肽具有SEQ ID NO：90、139和126的氨基酸序列。该混合物在下文中被称为‘5CVMB*’。杀菌效价类似，但是如上根据所用的佐剂，有时在使用具有组氨酸标签的936-10A-10A多肽时观察到更好的效价。

将其中936-10A-10A具有C末端组氨酸纯化标签的5CVMB*混合物与2.5μg(以蛋白质计)来自MeNZB^TM疫苗的外膜囊泡混合。将该混合物(‘5CVMB^*+1/4OMV’)与单独5CVMB^*，5CVMB，或5CVMB与10μg OMV的组合作比较。测试用这四种组合物免疫后获得的血清对一组13种菌株的杀菌活性。用936-10A-10A替换5CVMB的936-fHBP多肽在OMV存在或不存在时都改善了菌株覆盖。用5CVMB^*的杀菌效价≥1024的菌株百分数相比5CVMB^*高出7个百分点，用5CVMB^*+1/4OMV相比5CVMB+OMV高出15个百分点。用不同组的菌株观察到不同的结果。

NL096杂合体

参考文献15公开了一种称作’NL096’(本文的SEQ ID NO：76)的fHBP序列。这种fHBP蛋白可提供跨越几乎全部11种菌株的杀菌性血清，而且在使用氢氧化铝佐剂时，NL096获得的菌株覆盖率优于PATCH_10A。

因此设计了NL096序列的杂合体，包括：

936-10A-NL096 SEQ ID NO：140

936-NL096-P10A SEQ ID NO：141

936-NL096-NL096 SEQ ID NO：142

这三条序列中的每一条都可与N末端序列一起表达(例如与一个甲硫氨酸残基)和/或与C末端组氨酸标签一起表达，例如在C末端加入SEQ ID NO：96。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。

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序列表中序列1-78的别称

Claims (20)

1.一种多肽，所述多肽含有第一免疫原性氨基酸序列和第二免疫原性氨基酸序列，其中所述第一免疫原性氨基酸序列是SEQ ID NO 23。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第二免疫原性氨基酸序列是(a)非脑膜炎球菌抗原；(b)脑膜炎球菌非fHBP抗原；(c)野生型脑膜炎球菌fHBP抗原；或(d)选自SEQ ID NO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第二免疫原性氨基酸序列是(b)脑膜炎球菌非fHBP抗原；(c)野生型脑膜炎球菌fHBP抗原；或(d)选自SEQ IDNO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO 126、124、125、133、134、135、112、113、117、118、104、105、108、111、114、115、116、131、137、119、121、120、109、106、129、100、101、99、102、103、107、110、122、123、127、128、130、132、136、138、140、141、142、77和78。

5.一种多肽，所述多肽包含第一免疫原性氨基酸序列、第二免疫原性氨基酸序列和第三免疫原性氨基酸序列，其中：

所述第一免疫原性氨基酸序列是SEQ ID NO:23；

所述第二免疫原性氨基酸序列是(a)非脑膜炎球菌抗原；(b)脑膜炎球菌非fHBP抗原；(c)野生型脑膜炎球菌fHBP抗原；或(d)选自SEQ ID NO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的氨基酸序列；和

所述第三免疫原性氨基酸序列，选自SEQ ID NO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78。

6.编码上述权利要求中任一项所述多肽的核酸。

7.一种包含编码权利要求1到5中任一项所述多肽的核苷酸序列的质粒。

8.一种用权利要求7所述的质粒转化的宿主细胞。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是脑膜炎球菌。

10.从权利要求9所述的宿主细胞制备的膜囊泡，其特征在于，所述囊泡包含权利要求1-5中任一项所述的多肽。

11.一种免疫原性组合物，所述组合物包含权利要求1-5中任一项所述的多肽或权利要求10所述的囊泡。

12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括含氨基酸序列SEQ ID NO:90的第一多肽，含氨基酸序列SEQ ID NO:139的第二多肽，含氨基酸序列SEQ ID NO:126的第三多肽。

13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括脑膜炎球菌外膜囊泡。

14.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物不包括脑膜炎球菌外膜囊泡。

15.如权利要求11-14中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括佐剂。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包含铝盐。

17.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含第二种多肽，在给予哺乳动物时可以引发对脑膜炎球菌具有杀菌作用的抗体反应，限制条件是所述第二种多肽不是脑膜炎球菌fHBP。

18.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的偶联荚膜糖。

19.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含偶联肺炎球菌荚膜糖。

20.权利要求11-19中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于在哺乳动物中产生抗体应答的药物中的用途。