MXPA02006962A

MXPA02006962A - Vacuna de vesicula de membrana exterior que comprende proteinas de membrana exterior de neisseria meningitidis serogrupo b.

Info

Publication number: MXPA02006962A
Application number: MXPA02006962A
Authority: MX
Inventors: Rino Rappuoli
Original assignee: Chiron Spa
Priority date: 2000-01-17
Filing date: 2001-01-17
Publication date: 2002-12-13
Also published as: EP2281571A3; NZ520466A; ES2507100T3; US20040249125A1; US20160030546A1; JP2013181036A; DK2289545T3; EP2275129A3; EP1897555A2; PT1248647E; CN102172398A; ES2588917T3; US20120328643A1; JP2011116793A; EP2289545B1; RU2279889C2; EP1897555B1; CY1117957T1; EP2281570A3; BRPI0107679B1

Abstract

proporciona una composicion que comprende: (a) vesiculas de membrana exterior (OMV, por sus siglas en ingles) de Neisseria meningitidis serogrupo B, y (b) un componente inmunogenico que se selecciona de otras proteinas de Neisseria o fragmentos inmunogenicos de las mismas. El componente (b) preferiblemente incluye una proteina de una cepa diferente NmB a partir de la cual se deriva la OMV del componente (a). Las OMV preferiblemente se obtienen por extraccion con desoxicolato. Opcionalmente, la composicion tambien puede comprender un antigeno protector contra otros patogenos.

Description

VACUNA DE VESÍCULA DE MEMBRANA EXTERIOR QUE COMPRENDE PROTEÍNAS DE MEMBRANA EXTERIOR DE Neisseria meningitidis SEROGRUPO B Todos los documentos mencionados en la presente se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.

CAMPO TÉCNICO Esta invención se relaciona con vacunas contra Neisseria meningi tidis , serogrupo B (NmB) .

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA Neisseria meningi tidis, es un patógeno humano diplococo gramnegativo móvil. Coloni?ia la faringe, provoca meningitis y, en ocasiones, septicemia en ausencia de meningitis. En los Estados Unidos la tasa de ataque es de 0.6-1 por 100,000 personas al año y puede ser mucho mayor durante las epidemias (véase Lieberman et al . (1996) JAMA 275(19.1499-1503; Schuchat et al . (1997) N Engl J Med 337 (14) : (970-976) . En los países en desarrollo, las tasas de morbilidad endémica son much mayores y durante las epidemias las tasas de incidencia pueden llegar a 500 casos por Ref: 140526 100,000 personas al año. La mortalidad es extremadamente alta, de 10-20% en los Estados Unidos y mucho mayor en países en desarrollo. Posterior a la introducción de una vacuna conjugada contra Haemophilus influenzae, N. meningi tidis, es la causa principal de meningitis bacteriana en todas las edades en Estados Unidos (Schuchat et al . (1997) supra) . En base en los polisacáridos capsulares del organismo, se han identificado 12 serogrupos de N. meningi tidis. La vacuna meningocócica actualmente en uso es una vacuna de un polisacárido tetravalente constituida de los serogrupos A, C, Y y W135. Después del éxito de la vacunación contra H. influenzae, sin embargo, se han desarrollado vacunas conjugadas contra los serogrupos A y C. Sin embargo, el serogrupo B permanece como un problema y actualmente es responsable de aproximadamente 50% de los casos totales de meningitis en Estados Unidos, Europea y Sudamérica. El enfoque por polisacáridos no se puede utilizar debido a que el polísacárido capsular menB es un polímero de ácido ?-acetil neuramínico unido a(2-8), que también está presente en tejido de mamíferos. Esto resulta en tolerancia al antígeno; en realidad, si se indujera una respuesta, sería contra uno mismo y por lo tanto sería indeseable. Para evitar la inducción de autoinmunidad o para inducir una respuesta inmunitaria protectora, el polisacárido capsular debe ser modificado químicamente, por ejemplo, al sustituir los grupos N-acetilo con grupos N-propionilo, dejando inalterada la antigenicidad específica (Romero & Outschoorn (1994) Clin Microbiol Rev 7(4):559-575) . Una vacuna eficaz de vesícula de membrana exterior (OMV, por sus siglas en inglés) contra el serogrupo B se ha producido por el Norwegian National Institute of Public Health [por ejemplo, Bjune et al . (1991) Lancet 338(8775) : 1093-96] . Aunque esta vacuna es inocua y evita la enfermedad por NmB, su eficacia se limita a la cepa utilizada para elaborar la vacuna. Otras vacunas basadas en preparaciones de membrana exterior también se han reportado. Un objetivo de la presente invención es ampliar la eficacia de estas vacunas a otras cepas .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente se ha encontrado que la adición de componentes definidos adicionales a las vacunas de OMV amplían de manera significativa su eficacia. Así, la presente invención proporciona una composición que comprende: (a) una preparación de membrana exterior de NmB y (b) un componente .inmunogénico que se selecciona de uno o más de los siguientes: una proteína descrita en O99/57280, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita _en 099/36544, o un i fragmento inmunogénico de la misma; • una proteína descrita en 099/24578, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en 099/66791, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en Tettelin et al . [Science (2000) 287:1809-1815], o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en Parkhill et al .

[Nature (2000) 404:502-506], o un fragmento inmunogénico de la misma; • una proteína descrita en W097/28273, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en 096/29 12, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en O95/03413, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en 099/31132, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en 099/58683, o un fragmento inmunogénico de la misma; • una proteína descrita en 099/55873, o un fragmento inmunogénico de la misma; o bien la proteína PorA, TbpA, TbpB, PilC, OpA, u Omp85 de Neisseria meningi tidis . Si la composición comprende una proteína descrita en W099/24578, tal proteína preferiblemente tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224," 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470 484, 486, 488, 490, 492, 494 508, 510, 512, 514, 516, 518 532, 534, 536, 538, 540, 542 556, 558, 560, 562, 564, 566 580, 582, 584, 586, 588, 590 604, 606, 608, 610, 612, 614 628, 630, 632, 634, 636, 638 652, 654, 656, 658, 660, 662 676, 678, 680, 682, 684, 686 700, 702, 704, 706, 708, 710 724, 726, 728, 730, 732, 734 748, 750, 752, 754, 756, 758 772, 774, 776, 778, 780, 782 796, 798, 800, 802, 804, 806 820, 822, 824, 826, 828, 830 844, 846, 848, 850, 852, 854 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890 y 892, ccoommoe ssee describe en 099/24578 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de una o más de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN, o una proteína que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con una de estas secuencias de identificación) .

Si la composición comprende una proteína descrita en WO 99/36544, la proteína preferiblemente compende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 y 90, como se describe en W099/36544 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de uno o más de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN, o una proteína que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con una de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN) . Si la composición comprende una proteína que se describe en Tettelin et al . (es decir, una proteína codificada por uno de los genes descritos en la presente) , la proteína preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de NMBOOOl a NMB2160 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de uno o más de estos 2160 genes, o una proteína que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con uno de estos 2160 genes) . Si la composición comprende una proteína descrita en Parkhill et al . , la proteína preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las 2121 secuencias codificantes que se describen en ese documento (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de una o más de esas 2121 secuencias de una proteína que comprende una secuencia que tiene una i identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con una de estas 2121 secuencias) . Si la composición comprende una proteína que se describe en WO99/57280, la proteína preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos ^que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70", 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94,' 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120," 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268,^ 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 324 334, 348 358, 372 382, 396 406, 420 430, 444 454, 468 478, 492 502, 516 526, 540 550, 564 574, 588 598, 612 622, 636 646, 660 670, 684 694, 708 718, 732 742, 756 766, 780 790, 804 814, 828 838, 852 862, 886, 910, 912, 914, ! 916, 918, 920, 922 924, 926, .928, 930, 932 934, 936, 938, ! 340, 942, 944, 946 948, 950, . 952, 954, 956 958, 960, 962, ! 364, 966, 968, 970, 972, 974, ! 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 99' 1, 996 998, 1000, 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016," 1018, 1020, 1022, 1024, Í026 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086 1088, Í090 1092 1094 1096, 1098, 1100, "1102, 1104, 1106 1108, 1110 1112, 1114 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126 1128 1130 1132 1134 1136, 1138 1140, 1142, 1144, 1146 1148 1150 1152 1154 1156, 1Í58 1160, 1162, 1164, 1168 1170 1172 1174 1176 1178, 1180, 1182, 1184, 1186, 1188 1190 1192 1194 1196 1198, 1200 1202, 1204, 1206, 1208 , 1210 1212 , 1214 1216 1218, 1220 1222 1224, 1226, 1228 , 1230, 1232 1234 1236 1238, 1240 1242 1244, 1246, 1248 , 1250 1252 , 1254 1256 1258, 1260 1262 1264, 1266, 1268 , 1270 1272 1274 1276 1278, 1280 1282 1284, 1286, 1288 , 1290 , 1292 , 1294 , 1296 , 1298, 1300 , 1302 1304, 1306, 1308 , 1310 , 1312 , 1314 , 1316 , 1318, 1320 , 1322 1324, 1326, 1328 , 1330 , 1332 , 1334 , 1336 , 1338, 1340 1342 1344, 1346, 1348 , 1350 1352 , 1354 1356 , 1358, 1360 1362 1364, 1366, 1368 , 1370 , 1372 , 1374 , 1376 , 1378, 1380 , 1382 1384, 1386, 1388 , 1390 , 1392 , 1394 , 1396 , 1398, 1400 , 1402 r 1404, 1406, 1408 , 1410 , 1412 , 1414 , 1416 , 1418, 1420 , 1422 r 1424, 1426, 1446, 1466, 1486, 1506, 1526, 1546, 1566, 1586, 1606, 1626, 1646, 1666, 1686, 1706, 1726, 1746, 1766, 1786, 1806, 1826, 1846, 1866, 1886, 1906, 1926, 1946, 1966, 1986, 2006, 2026, 2046, 2066, 2086, 2106, 2126, 2146, 2168, 2188, 2208, 2228, 2248, 2268, 2288, 2308, 2328, 2348, 2368, 2388, 2408, 2428, 2448, 2468, 2488, 2508, 2528, 2548, 2568, 2588, 2608, 2628, 2648, 2668, 2688, 2708, 2728, 2748, 2768, 2788, 2808, 2828, 2848, 2868, 2888, 2908, 2928, 2930, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 2950, 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 3016, 3018 y 3020, como se describe en WO99/57280 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de una o más de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN, o una proteína que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, .95%, 99% o mayor) con una de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN) . Si la composición comprende una proteína descrita en W099/28273, la proteína preferiblemente es una proteína como se describe en la figura 4 o la figura 13 de W097/28273. Si la composición comprende una proteína descrita en W096/29412, la proteína preferiblemente comprende una i. secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1 a 8 que se describen en W096/29412 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de una o más de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN, o una proteína que comprende una secuencia que tiene identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por 'ejemplo 60%,* 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con una de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN) .

Si la composición comprende una proteína descrita en WO95/03413, la proteína preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1 a 23 descritas en WO95/03413 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de una o más de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN, o una proteína que comprende una secuencia que tiene identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con una de estas SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN) . Si la composición comprende una proteína descrita en W099/31132, la proteína preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 descrita en W099/31132 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, . o una proteína que comprende una secuencia que tiene identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2) . _ Si la composición, comprende una proteína descrita en W099/58683, la proteína preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NOj 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4 descritas en W099/58683 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, o una proteína que comprende una secuencia que tiene identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo " 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4) . Si la composición comprende una proteína descrita en W099/55873, la proteína preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4 descritas en W099/58873 (o una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, o una proteína que comprende una secuencia que tiene identidad de secuencia (preferiblemente mayor de 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4) . Se pueden encontrar detalles de Opa y PorA en Wiertz et al . [Infect . Immun . (1996) 61:298-304]. Se describe PilC en Nassif et al . [PNAS USA (1994) 91:3769-73]. Se describe Omp85 en Manning et al . [Microb . Pathog. (1998) 25:11-21] . Se describen TbpA y TbpB en Ala'Aldeen & Borriello [Vaccine (1996) 14:49-53] y también en Legrain et al . [Prorein Expr Purif (1995) 6:570-578] . Las proteínas preferidas para el componente (b) son: proteína '919' , tipificada por las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 3069 a 3074 y 3207 a 3241 de WO99/57280 (véase también la figura 23 y el Ejemplo 15 de la misma) . proteína '235', tipificada por las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 869 a 874 y 3149 a 3178 de WO99/57280 (véase también la figura 20 y el Ejemplo 12 de la misma) . proteína '519', tipificada por las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 3045 a 3056 y 3185 a 3206 de WO99/57280 (véase también la figura 22 y el Ejemplo 14 de la misma) . • proteína '225', tipificada por las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 793 a 804 y 3115 a 3148 de WO99/57280 (véase también la figura 19 y el Ejemplo 11 de la misma) . proteína 'ORF40', tipificada por el ejemplo 1 (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1 a 6) de W099/36544 (véase también la figura 1 de WO00/66741; véase también W099/31132 y W099/58683) . proteína '287', tipificada por el ejemplo 9 de WO99/57280 (véanse SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1199 a 1204, 3103 a 3108 y 3179 a 3184 de la misma) . • proteína ' ORF1 ' , tipificada por el ejemplo 77 (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 647, a 654) de W099/24578 (véase también W099/55873 y número de acceso AJ242535) . proteína 'ORF4 ' , tipificada por el ejemplo 26 (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN* NOS: 215-226) de W099/24578 (véase también la figura 2 de WO00/66741) . proteína 'ORF46', tipificada, por el ejemplo 55 (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 457-466) de W099/24578 (véase también la figura 12 de WO00/66741) . El componente (b) de la composición preferiblemente es una proteína NmB. Se prefiere que el componente (b) incluya una proteína de una estirpe NmB diferente de aquélla de la cual se derivan las OMV del componente (a) , es decir, las OMV del componente (a) preferiblemente se suplementa por el componente (b) inmunogénico de una estirpe NmB diferente. Uno o más de los componentes (o_ todos ellos) se pueden absorber en Al(OH)3.

El componente de la preparación de membrana exterior Las composiciones de la invención incluyen una preparación de membrana exterior NmB como componente (a) . Este preferiblemente está en forma de vesículas de membrana exterior (OMV, por sus siglas en inglés) . La preparación de las OMV a partir de NmB es bien conocida en la técnica. Los métodos para obtener preparaciones adecuadas se describen, por ejemplo en: Claassen et al . [Vaccine (1996) 14:1001-1008]; Cartwright et al. [Vaccine (1999) 17:2612-2619]; Peeters et al . [Vaccine (1996) 14:1009-1015]; Fu et al . [Biotechnology NY (1995) 12:170-74]; Davies et al . [J. Immunol . Meth (1990) 134:215-225]; Saunders et al . [Infect Immun . (1999) 67:113-119]; Draabick et al . [Vaccine (2000) 18:160-172]; Moreno et al . [Infect Immun . (1985) 47:527-533]; Milagres et al . [Infect . Immun . '(1994) 62 :4419-4424] ; Naess et al . [Infect . Immun . (1998) 66:959-965]; Rosenqvist et al . [Dev. Biol . Stand. (1998) 92:323-333]; Haneberg et al . [Infect . Immunn . (1998) 66:1334-41]; Andersen et al . [ Vaccine (1997) 15:1225-34]; Bjune et al . [Lancet (1991) 338:1093-96] etc. Las OMV preferiblemente son un extracto de desoxicolato de NmB (es decir, que se obtienen de NmB por extracción con desoxicolato) . El protocolo de extracción preferido es el que se ^describe por Fredriksen et al . [Production, characterization and control of MenB-vaccine "Folkehelsa" : an outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease (1991) NIPH Ann . 14 (2) : 67-80] . Una estirpe preferida a partir de la cual se extraen las OMV, es la estirpe 44/76 (B:15 :P1.7, 16:P5.5:L3, 7, 9) de N. meningi tidis . Se pueden encontrar detalles adicionales del componente de las OMV, por_ ejemplo, en Bjune et al . [Lancet (1991) 338(8775) :1093-96] , o Fredriksen et al .

[Characterization of high molecular weight component in MeBN-vaccine ' Folkehelsa ' , an outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease. Páginas 818-824 de Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae (eds. Conde- Glez et al . ) ISB*N 968-6502-13-0]. El componente de las OMV se puede adsorber a un adyuvante de hidróxido de aluminio. Una relación preferida de proteína: adyuvante es 1:67 (p/p). Una dosis típica de vacuna para un humano contiene µg de proteína, 2 µg de LPS y 1.67 mg de A1(0H)3, y se puede inyectar en volúmenes de 0.5 ml dentro del músculo deltoide . El componente de las OMV (por ejemplo, como se obtiene por extracción con desoxicolato) se puede tratar para eliminar ciertos componentes. Por ejemplo, se pueden eliminar pirógenos o componentes tóxicos (por ejemplo LPS) . Se prefiere que el componente de las OMV retenga el componente antigénico de 80 kDa descrito por Fredriksen et al . [páginas 818-824 de Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae] . De manera más preferible, el componente de las OMV debe retener una proteína que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13 [o bien (i) una proteína que tenga una identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13 - en base en la secuencia de identificación particular, el grado de identidad de secuencia preferiblemente es mayor de 50%, (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor) , lo cual incluye mutantes y variantes alélicas, o bien (ii) una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9 , SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13 -el fragmento debe comprender por lo menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia y, en base en la secuencia particular, n es 7 o mayor (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o mayor) ] .

Combinación de los componentes (a) y (b) Los componentes (a) y (b) se pueden combinar al simplemente mezclar el componente (a) con una preparación de membrana exterior (por ejemplo por mezclado del ORF4 con las OMV Norwegian) . ^ Como una alternativa, se pueden combinar al manipular una bacteria tal como se produce (preferiblemente superproducé) componente (a) en su membrana exterior - una preparación de membrana exterior a partir de la cual la bacteria recombinante comprenderá tanto al componente (a) como al componente (b) . Las bacterias adecuadas para manipulación de esta manera incluyen Neisseria meningi tidis (cualquier serogrupo o cepa) , Neisseria lactamica, Neisseria cinérea o cualquier Neisseria no tipificable. Se pueden utilizar también otras bacterias gramnegativas tales como E. coli , Salmonella, Shigella, Bordetella, Yersinia, Helicobacter, etc. Los métodos de transformación son bien conocidos en la técnica.

Vacunas polivalentes Opcionalmente la composición de la invención también puede comprender uno o más de los siguientes componentes : un antígeno protector contra Neisseria meningi tidis serogrupo A; ^ un antígeno protector contra Neisseria meningi tidis serogrupo C; un antígeno protector contra Neisseria meningi tidis serogrupo Y; • un antígeno protector contra Neisseria meningi tidis serogrupo W; un antígeno protector contra Haemophilus influenzae; un antígeno protector contra pneumococcus; un antígeno protector contra difteria; un antígeno protector contra tétanos; un antígeno protector contra tosferina; un antígeno protector contra Helicobacter pyl ori ; un antígeno protector contra la polio; y un antígeno protector contra el virus de la hepatitis B. Los ejemplos preferidos de estos componentes opcionales son: un antígeno polisacárido contra Neisseria meningi tidis serogrupo A; un antígeno polisacárido contra Neisseria meningi tidis serogrupo C, tal como el que se describe en Constantino et al . (1992) Vaccine 10:691-698; t • un antígeno polisacárido contra Neisseria meningi tidis serogrupo Y; un antígeno polisacárido contra Neisseria meningitidis serogrupo W; un antígeno polisacárido contra Haemophilus influenzae; un antígeno polisacárido contra pneumococcus ; un antígeno^ protector contra difteria, que consiste de un toxoide de difteria, tal como el mutante CRM197 [por ejemplo Del Guidice et al . (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70] un antígeno protector contra tétanos, que "consiste de toxoide tetánico [por ejemplo Wassilak & Orenstein, Capítulo 4 de Vaccines (eds. Plotkin & Mortimer) , 1988] • Un antígeno protector contra tosferina, que comprende la holotoxina Pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA, por sus siglas en inglés) ; y que opcionalmente comprende además pertactina o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo Gustafsson et al . (1996) N. Engl . J. Med. 334:349-355; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9 : 232 -238] . Un antígeno protector contra H. pylori , que comprende uno o más de CagA (por ejemplo WO93/18150) , VacA (por ejemplo WO93/18150) , ?AP (por ejemplo WO99/53310) , HopX (por ejemplo WO98/04702) , HopY (por ejemplo WO98/04702) , ureasa.

Un antígeno protector contra el virus de la hepatitis B, que consiste del antígeno de superficie de HBV o bien del antígeno de núcleo de HBV. Cuando la ^composición comprende un antígeno contra difteria, preferiblemente también comprende un antígeno contra "el tétanos y contra la polio. Cuando la composición comprende un antigeno contra el tétanos, preferiblemente también comprende antígenos contra difteria y contra polio. Cuando la composición comprende un antígeno contra la polio, preferiblemente también comprende antígenos contra la difteria y el tétanos. La toxina de Pertussis es una proteína tóxica y, cuando está presente en la composición, preferiblemente se destoxifica. La destoxificación puede ser por medios químicos o genéticos. Un mutante destoxificado preferido es el mutante doble 9K/129G [por ejemplo Rappuoli (1997) Nature Medicine 3:374-376] . Cuando la composición incluye una proteína que existe en formas diferentes tanto naciente como madura, la forma madura de la proteína es la que se utiliza de manera preferible,. Por ejemplo, cuando se incluye NspA (W096/29412; véase también Martin et al . (1997) J. Exp . Med 185 1173-1183) , se utiliza preferiblemente la forma madura de la proteína que carece del péptido señal . Cuando la composición incluye un antígeno polisacárido, el polisacárido preferiblemente se conjuga a una proteína portadora.

Terapia, profilaxis y diagnóstico La composición de la invención preferiblemente es uña vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para evitar la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la infección) . La invención también proporciona las composiciones de la invención para uso como medicamentos (preferiblemente como vacunas) o como reactivos de diagnóstico. También proporciona el uso de una composición de acuerdo con la invención en la elaboración de: (i) un medicamento para tratar o evitar infección debida a bacterias neiseriales; (ii) un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de bacterias neiseriales o de anticuerpos generados contra bacterias neiseriales; o (iii) un reactivo el cual genera anticuerpos contra bacterias neiseriales. Tales bacterias neiseriales pueden ser cualquier especie o estirpe (tal como N. gonorrhoeae) , pero preferiblemente N. meningi tidis , especialmente serogrupo B (?mB) . La invención también proporciona un método para tratar a un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de acuerdo con la invención. El método preferiblemente es inmunización.

Procedimi en tos De acuerdo con aspectos adicionales, la invención proporciona diversos procedimientos . Se proporciona un procedimiento para producir una composición de la invención, que comprende la etapa de extracción (por ejemplo extracción con desoxicolato) de las OMV de N. meningi tidis .

LISTA DE SECUENCIAS Las secuencias en la lista de, secuencias son: MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION Sigue un resumen de las técnicas estándar y de los «# procedimientos que se pueden utilizar para llevar a cabo la invención (por ejemplo, utilizar las secuencias descritas para vacunación o propósitos de diagnóstico) . Este resumen no es una limitación de la invención, más bien proporciona ejemplos que se pueden utilizar, pero que no se requieren.

Generalidades -A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención utilizará técnicas convencionales - de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, las cuales están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, por ejemplo Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) ; DNA Cloning, Volúmenes I e ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Ppress, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; the Methods in Enzymology ' series (Academic Press, Inc.), especialmente volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells , (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer y Walker, eds. (1987), I munochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres) ; Scopes, (1987) Protein Purification : Principies and Practice, Segunda Edición (Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I -IV (D.M. Weir y C. C. Blackwell eds. 1986) . Las abreviaturas estándar para nucleótidos y aminoácidos se utilizan en esta especificación. Las proteínas utilizadas con la invención se pueden preparar por diversos medios (por ejemplo expresión recombinante) , purificación de cultivp celular, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo nativa, fusiones,, etc.). Preferiblemente se preparan en forma sustancíalmente pura (es decir, sustancialmente libre de otras proteínas de Neisseria o células huéspedes) . El ácido nucleico utilizado con la invención se puede preparar de diversas maneras (por ejemplo por síntesis química, a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, del organismo mismo, etc.), y que puede tomar diversas formas (por ejemplo cadena sencilla, cadena doble, vectores, sondas, etc.) . El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, así como sus análogos, tales como aquéllos que contienen estructuras principales modificadas, y también ácidos nucleicos peptídicos, péptidos (PNA), etc.

Definí ci ones Una composición que contiene X está "sustancialmente libre de" Y cuando por lo menos 85% en peso del total de X+Y en la composición es X. Preferiblemente, X comprende por lo menos aproximadamente 90% en peso del total de X+Y en la composición, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 95%, o incluso 99% en peso. El término "que comprende" significa "que incluye", y también que "consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional a X, tal como X+Y. El término ."heterólogo" se refiere a dos componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza . Los componentes pueden ser células huéspedes, genes o regiones reguladoras, tales como promotores. Aunque los componentes heterólogos no se encuentran juntos en la naturaleza, pueden funcionar juntos, por ejemplo cuando un promotor heterólogo para un gen se une operablemente a un gen. Otro ejemplo es cuando la secuencia Neisserial es heteróloga a una célula huésped de ratón. Los ejemplos adicionales pueden ser dos epítopos de la misma proteína o de proteínas diferentes las cuales se han ensamblado en una sola proteína en una distribución que no se encuentra en la naturaleza. Un "origen de replicación" es una secuencia polinucleotídica que inicia y regula la replicación de polinucleótidos tales como un vector de expresión. El origen de replicación se comporta como una unidad autónoma en la replicación de polinucleótidos dentro de una célula, capaz de replicación bajo su propio control. Un origen de replicación puede ser necesario para que un vector se replique en una célula huésped particular. Con algunos orígenes de replicación, un vector de expresión se puede reproducir con un número elevado de copias en presencia de las proteínas apropiadas dentro de la célula. Los ejemplos de orígenes son las secuencias de replicación autónoma, las cuales son efectivas en levaduras; y el antígeno T viral, efectivo en células COS-7. ' a identidad entre las proteínas preferiblemente se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como el implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , utilizando una búsqueda de separación de afinidad con un castigo por abertura de separación de parámetro = 12 y un castigo por extensión de separación = 1.

Típicamente, 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera como una indicación de equivalencia funcional. Como se utiliza en la presente, una "variante alélica" de una molécula o región de ácido nucleico, para la cual se proporciona una secuencia de ácido nucleico en la presente, es una molécula de ácido nucleico o una región que se presenta esencialmente en el mismo lugar en el genoma de otro aislado o segundo aislado y que, debido a la variación natural provocada por ejemplo, por mutación o recombinación, tiene una secuencia de ácido nucleico similar pero no idéntica. Una región codificante de una variante alélica habitualmente codifica para una proteína que tiene actividad similar a la de la proteína codificada por el gen al cual se compara. Una variante alélica también puede comprender una -fe alteración en las regiones no traducidas 5 ' ó 3 ' del gen, tal como en las regiones de control regulador (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 5,753,235).

Sistemas de expresión ' • Las secuencias nucleotídicas neiseriales se pueden expresar en diversos sistemas de expresión diferentes; por ejemplo, aquéllos utilizados con células de mamífero, baculovirus, plantas, bacterias y levaduras. i. Sistemas de mamífero Se conocen en la técnica los sistemas de expresión de mamífero. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unir ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción hacia el extremo 3 ' de una secuencia codificante (por ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción, la cual habitualmente se coloca proximal al extremo 5 ' de la secuencia codificante, y una caja o secuencia TATA, habitualmente localizada 25-30 pares de bases (pb, por sus siglas en inglés) hacia el extremo 5' del sitio de inicio de transcripción. La secuencia TATA se considera que dirige la ARN polimerasa II para comenzar la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero también contendrá un elemento promotor hacia el extremo 5 ' , que habitualmente se localiza dentro de las 100 a 200 pb hacia el extremo 5' de la secuencia TATA. Un elemento promotor hacia el extremo 5' determina la velocidad a la cual se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación [Sambrook et al . (1989) "Exprression of Cloned Genes in Mammalian Cells". En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.] . Los genes virales de mamífero con frecuencia están altamente expresados y tienen una gama amplia de huéspedes; por lo tanto, las secuencias que codifican para genes virales de mamífero proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen el promotor temprano de SV40, el promotor de LTR de virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP) , y el promotor del virus de herpes simple. Además, i las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de metalotioneína murino, también proporciona secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser constitutiva o regulada (inducible) , dependiendo de si el promotor se puede inducir con glucocorticoide en células que responden a hormonas . La presencia de un elemento mejorador (mejorador) , combinado con los elementos promotores descritos antes, habitualmente incrementarán los niveles de expresión. Un mejorador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se enlaza a promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de inicio de ARN normal. Los mejoradores también son activos cuando se colocan hacia el extremo 5 ' o hacia el extremo 3 ' del sitio de inicio de transcripción, ya sea en orientación normal o invertida, o a una distancia mayor de 1000 nucleótidos desde el promotor [Maniatis et al . (1987) Science 236:1237; Alberts et al . (1989) Molecular Biology of the Cell , 2a. ed.] . Los elementos mejoradores derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que habitualmente tienen una gama de huéspedes más amplia. Los ejemplos incluyen al mejorador del gen temprano de SV40 [Dijkema et al . (1985) EMBO J. 4:761] y mej oradores/promotores derivados de la secuencia repetida terminal larga (LTR, por sus siglas en inglés) del virus de sarcoma de Rous [Gorman et al . (1982b) Proc . Nati . Acad. Sci . 79:6777] y del citomegalovirus humano [Boshart et al . (1985) Cell 41:521]. Adicionalmente, algunos mejoradores son regulables y se vuelven activos únicamente en presencia de un inductor, tal como una ^ hormona o un ion metálico [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends. Genet . 2 : 215 ; i Maniatis et al . (1987) Science 236:1237]. Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente en células de mamífero. Una secuencia i promotora se puede unir directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en la parte N-terminal de la proteína recombinante siempre será una metionina, la cual es codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la parte N-terminal se puede separar de la proteína por incubación j.n vi tro con bromuro de cianógeno. 1 'Alternativamente, también se pueden secretar proteínas extrañas de la célula al medio de crecimiento creando" moléculas de ADN quiméricas que codifiquen para una proteína de fusión constituida de un fragmento de secuencia líder que proporcione la secreción de la proteína extraña en células de mamífero. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y un gen extraño que se pueden separar ya sea in vivo o in vi tro. El fragmento de secuencia líder habitualmente codifica para un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrofóbicos que elige la secreción de la proteína desde la célula. El líder tripartita de adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que proporciona secreción de una proteína extraña en células de mamífero. Habitualmente, las secuencias de terminación de transcripción de poliadenilación reconocidas por células de mamífero son regiones reguladoras que se localizan 3 ' respecto al codón de detención de traducción y por lo tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. La parte 3' terminal del ARNm maduro se forma por separación postranscripcional específica del sitio y poliadenilación [Birnstiel et al . (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover) ; Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci . 14:105]. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de señales de terminador de transcripción/poliadenilación incluyen las derivadas de SV40 [Sambrook et al . (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". In Molecular Cloning: A Laboratory Manual] . Habitualmente, los componentes descritos antes comprenden un promotor, una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción y se colocan juntos en montajes de expresión. Los mejoradores, intrones, con sitios donador y asceptor de empalme funcionales y secuencias líder también se pueden incluir en un montaje de expresión, sí se desea. Los montajes de expresión con frecuencia se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tales como células de mamífero o bacterias. Los sistemas de replicación de v mamífero incluyen los derivados de virus animales, los cµales requieren factores de acción trans para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los sistemas de replicación de papovavirus tales como SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] o poliomavirus, se replican con un número de copias extremadamente alto en presencia del antígeno viral T apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones de mamífero incluyen los derivados de papilomavírus bovino y del virus de Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede ? . *"* tener dos sistemas de replicación, y por lo tanto se permite que se mantengan, por ejemplo en células de mamífero por expresión y en un huésped procariota para clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores lanzadera de mamífero en bacteria incluyen pMT2 [Kaufman et al . (1989) Mol . Cell . Biol . 9:946] y pHEBO [Shimizu et al . (1986) Mol . Cell . Biol . 6:1074] . El procedimiento de transformación utilizado -¡1 depende del huésped que se va a transformar. Los métodos para_ introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Las líneas de células de mamífero disponibles como huéspedes para expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de American Type Culture Collection (ATCC, por sus siglas en inglés) que incluyen, pero que no se limitan a células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) , células de riñon de mono (COS, por sus siglas en inglés) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2) y muchas otras líneas de células. ii. Sistemas de baculovirus El polinucleótido que codifica para la proteína también se puede insertar en un vector de expresión de insecto adecuado, y se une operablemente a elemnentos de control dentro de ese vector. El vector de construcción utiliza técnicas las cuales se conocen en el arte.

Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, habitualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus y un sitio de restricción conveniente para inserción del gen o genes heterólogos que se van a expresar; un baculovirus de tipo silvestre con una secuencia homologa al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo en el genoma de baculovirus) ; y células huéspedes de insecto apropiadas así como medio de f crecimiento. Después de insertar la secuencia de ADN que codifica para la proteína dentro del vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo silvestre sé' transfecta a una célula huésped de insecto en donde se permite que se recombine el vector y el genoma viral. El virus recombinante empacado se expresa y las placas recombinantes se identifican y purifican. Los materiales y ?. " métodos de los sistemas de expresión de células de baculovirus/insecto están disponibles comercialmente en forma de equipos, por ejemplo, Invitrogen, San Diego CA (equipo "MaxBac") . Estas técnicas generalmente se conoce por los expertos en la técnica y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricul tural Experiment Station Bulletín No . 1555 (1987) (a continuación " Summers y Smi th" ) . Antes de insertar la secuencia de ADN que codifica para la proteína, en el genoma del baculovirus, los componentes descritos antes, que comprenden un promotor, un líder (sd, se desea) , la secµencia codificante de interés y una secuencia de terminación de transcripción habitualmente se ensamblan en un montaje de transcolocación intermedia (vector.de transferencia). Este montaje puede contener un solo gen y elementos reguladores unidos operablemente; genes múltiples, cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos operablemente; o genes múltiples, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Los montajes de transcolocación intermedios con frecuencia se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, por lo que se permite que se mantenga en un huésped adecuado para clonación y amplificación. Actualmente, el vector de transferencia utilizado más comúnmente para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores, conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (el cual altera el codón de inicio de poliedrina de ATG a ATT, y el cual introduce un sitio de clonación BamHl de 32 pares de bases hacia el extremo 3' de ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989) 17:31.

El plásmido habitualmente contiene la señal de poliadenilación de poliedrina (Miller et al . (1988) Ann.

Rev. Microbiol . , 42:177) y un gen de procariota con resistencia a ampicilina (amp) y el origen de replicación para la selección y propagación en E. coli . Los vectores de transferencia de baculovirus habitualmente contiene un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unir una ARN polimerasa de baculovirus e inicia la transcripción hacia el extremo 3' (5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción la cual habitualmente se coloca proximal al extremo 5 ' de la , secuencia codificante. Esta región de inicio de transcripción habitualmente incluye un sitio de unión de ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un segundo dominio denominado un mejorador el cual, si está presente, habitualmente está alejado del gen estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva. > Los genes estructurales transcritos abundantemente en tiempos posteriores en un ciclo de infección viral, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias derivadas de un gen que * codifica para la proteína poliédrica viral, Friesen et al . , (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", en: Tiie Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler) ; EPO Publ. Nos 127 839 y 155 476; y el gen que codifica para la proteína plO, Vlak et al . , (1988), J. Gen . Virol . 69 : 765 . El ADN que codifica para secuencias de señal adecuadas se pueden derivar de genes para proteínas secretadas, de insecto o baculovirus, tales como el gen de poliedrina de baculovirus (Carbonell et al . (1988) Gene, 73:409) . Alternativamente, dado que las señales para las modificaciones postraduccionales de células de mamífero (tales como la señal del péptido de separación, la separación proteolítica y la fosforilación) parecen ser reconocidas por células de insecto, y las señales necesarias para la secreción y acumulación nuclear también parecen estar conservadas entre células de invertebrados y células vertebradas, líderes de origen que no es de insecto, tales como las derivadas de genes que codifican para interferón a, Maeda et al . , (1985), Nature 315:592; péptido de liberación de gastrina humana, Lebacq-Verheyden et al . , (1988), Molec. Cell . Biol . 8:3129; IL-2 humana, Smith et al . , (1985) Proc. Nat 'l Acad. Sci . E. U.A . , 82:8404; IL-3 de ratón (Miyaj ima et al . , (1987) Gene 58:273; y glucocerebrosidasa humana, Martin et al . (1988) DNA, 7:99, también , se pueden utilizar para s ' • proporcionar secreción en insectos.

Un polipéptido recombinante o poliproteína se pueden expresar intracelularmente o, si se expresan con las secuencias reguladoras apropiadas, se puede secretar. Una buena expresión intracelular de proteínas extrañas no fusionadas habitualmente requiere genes heterólogos que idealmente tienen una secuencia líder corta que contiene señalep de inicio de traducción adecuadas que preceden una señal de inicio ATG. Si se desea, la metionina en la parte N-terminal _ se puede separar de la joroteína madura por incubación in vi tro con. bromuro de cianógeno. Alternativamente, las poliproteínas recombinantes o las proteínas las cuales no son secretadas naturalmente, se pueden secretar de las células de insecto al generar moléculas de ADN quiméricas que codifican para una proteína de fusión .constituida de un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en insectos . El fragmento de secuencia líder habitualmente codifica para un péptido señal constituido de aminoácidos hidrofóbicos los cuales dirigen el cambio de posición de la proteína al retículo endoplásmico. Después de la inserción de la secuencia de ADN o del gen que codifica para el precursor del producto de expresión de la proteína, una célula huésped de insecto se cotransforma con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico del baculovirus de tipo silvestre , - habitualmente por cotransfección. El promotor y la secuencia de terminación de transcripción del montaje habitualmente comprenden una sección de 2-5 kb del genoma de baculovirus . Los métodos para introducir ADN heterólogo dentro del sitio deseado en el virus de baculovirus se conocen en la técnica (véase Summers y Smith supra; Ju et al . (1987); Smith et al . , Mol . Cell . Biol . (1983) 3:2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser dentro de un gen tal como el gen de poliedrina, mediante recombinación cruzada doble homologa; la inserción también puede ser en un sitio de enzima de restricción sometido a * ingeniería genética dentro del gen de baculovirus deseado. Miller et al . , (1989), Bioessays 4:91. La secuencia de ADN cuando se clona en el lugar del gen de poliedrina en el 1 * vector de expresión, es flanqueada tanto 5 ' como 3 ' por secuencias específicas de poliedrina y se coloca hacia el extremo 3' del promotor de poliedrina. _ El vector de expresión de baculovirus recién formado posteriormente se empaca en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homologa se produce a baja frecuencia (entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%) ; por lo tanto, la mayor parte del virus es producida después de la tranfección conjunta aún es virus de tipo silvestre. Por lo tanto, es necesario un método para identificar virus recombinantes. Una ventaja de sistema de expresión es una detección sistemática visual que permite que se diferencien los virus recombinantes. La proteína t -i poliedrina, la cual se produce por el virus nativo, se produce a concentraciones muy altas en los núcleos de células infectadas en tiempos posteriores después de la infección viral . La proteína poliedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también contienen partículas incrustadas. Estos cuerpos de oclusión, con un tamaño de hasta 15 µm, tienen un alto índice de refracción, lo que les proporciona una apariencia muy brillante que se visualiza fácilmente bajo el microscopio óptico. Las células infectadas con virus recombinante carecen de cuerpos de oclusión. Para diferenciar virus recombinantes del virus de tipo silvestre, el sobrenadante de transfección se siembra en placas sobre la monocapa de células de insecto por técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Específicamente, las placas se someten a detección sistemática bajo el microscopio óptico para determinar la presencia (indicativo de virus de tipo silvestre) o ausencia (lo que indica virus recombinante) de cuerpos de oclusión. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al. eds) a 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989). Los r vectores de expresión de baculovirus recombinante se han desarrollado para infección en varias células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinante, por ejemplo, para: Aedes aegypti , Autographa californica, Bombyx m mor i , Drosophila * ' , " melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol . 56: 153 ; Wright (1986) Nature 321 : 718 ; Smith et al., (1983) Mol . Cell . Biol . 3:2156; y véase de manera general, Fraser, et al . (1989) In vi tro Cell . Dev. Biol . 25:225). Las células y los medios de cultivo de células están disponibles comercialmente tanto para expresión directa como por fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de expresión de baculovirus; la tecnología de cultivo de células se conoce generalmente por aquellos expertos en la técnica, véase, por ejemplo, Summers y Smith supra . .' Las células de insecto modificadas después se pueden hacer crecer en un medio nutriente apropiado que permite el mantenimiento estable del o los plásmidos presentes en el huésped de insecto modificado. Cuando el gen del producto de expresión está bajo el control inducible, el huésped puede crecer a alta densidad y se puede inducir expresión. Alternativamente, cuando la expresión es constitutiva, el producto se puede expresar continuamente en el medio y el medio nutriente se puede hacer circular continuamente, mientras se extrae el producto de interés y se "aumentan los nutrientes que se agitan. El producto se puede purificar mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo CLAR, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc; electroforesis; centrifugación en el gradiente de densidad; extracción por solventes o similar. Según sea apropiado, el, producto se puede purificar adicionalmente según se requiera de manera que se elimine sustancialmente cualquier proteína de insecto que también sea secretada en el medio o que resulte de la lisis de células de insecto, de manera que se genera un producto el cual esté por lo menos sustancialmente libre de residuos del huésped, por ejemplo proteínas, lípidos y polisacáridos. Para obtener la expresión de la proteína, las células huéspedes recombinantes derivadas de los transformantes se incuban bajo condiciones que permiten la expresión de la secuencia codificante para la proteína recombinante. Estas condiciones variarán, en base en la célula huésped seleccionada. Sin embargo, las condiciones son determinables fácilmente por aquellos habitualmente expertos en la técnica en base en lo que se conoce en la técnica. iii. Sistemas Vegetales Existen muchos cultivos de células vegetales y sistemas de expresión genéticos de plantas completas conocidos en la técnica. Los sistemas de expresión genéticos celulares en plantas ejemplares incluyen los que se describen en las patentes tales como los documentos de E.U.A. 5,693,506; 5,659,122 y 5,608,143. Los ejemplos adicionales de expresión genética en cultivos de células r vegetales se ha descrito^ por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991) . Las descripciones de péptidos señal de proteína vegetales se pueden encontrar además _ de las referencias descritas antes en Vaulcombe et al., Afol . Gen . Genet . 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol . ^Chem . 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14^ (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Una descripción de la expresión del gen vegetal por fitohormonas, ha sido giberélico y enzimas secretadas inducidas por ácido giberélico se puede encontrar en R..L. Jones y J. MacMillin, Gibberellins : en: Advanced Plant Physiology, . Malcolm B. Wikms, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Las referencias que describen otros genes regulados metabólicamente son: Sheen, X r Plant Cell , 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc . Nati . Acad. Sci . 84:1337-1339 (1987).

Típicamente, utilizando técnicas conocidas en el arte, se inserta una secuencia polinucleotídica deseada en un cásete de expresión que comprende elementos reguladores genéticos diseñados para funcionamiento en plantas. El cásete de expresión se inserta dentro de un vector de expresión deseado con secuencias compañeras hacia el extremo 5 ' y hacia el extremo 3 ' desde el cásete de expresión adecuado para la expresión en un huésped vegetal . Las secuencias compañeras serán del plásmido de origen viral y proporcionarán las características necesarias al vector para 'permitir a los vectores mover el ADN de . un huésped de clonación original, tal como una bacteria al huésped vegetal deseado. El montaje de vector bacteriano/vegetal preferiblemente proporcionará una amplia gama de huéspedes de origen de replicación procariotas; un marcador seleccionable de procariota, y para transformaciones en Agrobacterium, secuencias de ADN T para transferencia, mediada por Agrobacterium, a cromosomas vegetales. Cuando el gen heterólogo no es susceptible fácilmente de detección, el montaje preferiblemente también tendrá un gen marcador seleccionable adecuado para_ determinar si se ha transformado TU . í una célula vegetal. Una revisión general de los marcadores adecuados, por ejemplo los miembros de la familia de los pastos, se encuentra en Wilmink y Dons, 1993, Plant Mol . Biol . Rep' tr, 11 (2) : 165-185.

^ Las secuencias adecuadas .para r permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma vegetal también ¡ se recomiendan. Estos pueden incluir secuencias de transposón y similares para recombinación homologa así como las secuencias Ti las cuales permiten la inserción aleatoria de un c sete de expresión heterólogo en un genoma vegetal. Los marcadores seleccionables de procariota incluyen resistencia a antibióticos^ tales como ampicilina o tetraciclina. También pueden estar presentes en el vector otras funciones adicionales que codifiquen para las secuencias de ADN, como se conoce en la técnica. . Las moléculas de ácido nucleico de ;la presente invención se pueden incluir en un cásete de expresión para la expresión en la o en las proteínas de interés. Habitualmente, únicamente habrá un cásete de expresión, aunque son factibles dos o más. El cásete de expresión recombinante contendrá, además de la secuencia que codifica para la proteína heteróloga, los siguientes elementos: una región promotora, secuencias no traducidas 5 t vegetales, codón de inicio que depende de si el gen estructural está equipado o no con uno, y una secuencia de terminación de transcripción y traducción. Los sitios de enzima de restricción únicos en los extremos 5 ' y 3 ' del cásete permiten una inserción fácil en el vector preexistente. Una secuencia codificante heteróloga _ puede ser para cualquier proteína en relación a la presente invención. La secuencia que codifica para la proteína de interés codificará para un péptido señal que permite el procesamiento y translocación de la proteína, según sea apropiado, y habitualmente carecerá de cualquier secuencia que pueda resultar en la unión ^ de la proteína deseada de la invención a una membrana. Dado que, para la mayor parte, la región de inicio transcripcional será para un gen el cual se expresa y se transloca durante la germinación, al utilizar el péptido señal que proporciona tal translocación, uno también puede proporcionar la translocación de la proteína de interés. De esta manera, la o las proteínas de interés se someterán a translocación desde las _ células las cuales expresen y se pueden cosechar con eficiencia. Típicamente, la secreción en semillas se realiza a través de una aleurona o la capa de epitelio escutelar sobre el endosperma de la semilla.4 Aunque no se requiere que la proteína sea secretada de las células en las .cuales se produce la proteína, esto facilita el aislamiento y purificación de la proteína recombinante. Dado que la expresión final del producto del gen deseado será en una célula eucariota, es deseable determinar si cualquier porción del gen clonado contiene secuencias las cuales serán eliminadas por procesamiento como intrones por la maquinaria del espliceosoma del huésped. De ser así, se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio de la región del "intrón" para evitar perder una porción del 4 mensaje genético como un código de intrón falso. Reed y Maniatis, ' Cell 41:95-105, 1985. El vector se puede microinyectar directamente en células vegetales mediante el uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombijiante . Crossway, Mol . Gen. Genet, 202:179-185, 1985. El material genético también se puede transfectar en la célula vegetal mediante la utilización de polietilenglicol, Krens, et al., Nature, 296, 72 - 14 , 1982. Otro método de introducción de segmentos de ácido nucleico es la penetración balística de alta velocidad con partículas pequeñas con ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de esferas o partículas _ pequeñas o bien en la superficie, Klein, et al., Nature, 327, 70-73, 1987 y Knudsen y Muller, 1991, _ Planta, 185:330-336 quienes describen el^ bombardeo con partículas de endosperma de 1 ** X cebada para generar cebada transgénica . Otro método adicional , de introducción puede ser la fusión de protoplastos con otras entidades, ya sea minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos con superficie lipídica que se puede fundir, Fraley, et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 79 , 1859-1863, 1982. El vector también se puede introducir en las células vegetales por electroporación (Fromm et al., Proc.

Nati . Acad. Sci . USA 82 : 5824 , 1985 ) . En esta técnica, los protoplastos vegetales se someten a electroporación en presencia de plásmidos gue contienen el montaje del gen. Los impulsos eléctricos de campos de alta resistencia permeabilizan de _ manera reversible ijiomembranas lo que permite la introducción de los plásmidos. Los protoplastos vegetales sometidos a electroporación regeneran la pared celular, se dividen y forman callos de plantas. Todas las plantas a partir de las cuales se pueden aislar y cultivar protoplastos para proporcionar plantas f _ regeneradas completas se pueden transformar por la presente invención, de manera que las plantas completas se recuperan y contengan al gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas se pueden regenerar a partir de células o tejidos _ cultivados que incluyen, pero que no se limiten todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha de azúcar, algodón, frutas y otros árboles, leguminosas y vegetales. ^Algunas de las plantas adecuadas incluyen, por ejemplo, las especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digi talis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus , Antirrhinum, Heterocallis , Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Tri ticum, Sorghum y Datura . El medio para regeneración varía de una especie a otra de. planta, pero generalmente primero se proporciona una suspensión de protoplastos que contienen copias del gen heterólogo. El tejido del callo se forma y se pueden inducir v stagos a partir de los callos y se pueden convertir en raíces subsecuentemente. De manera alternativa, se puede inducir la formación de embriones a partir de la suspensión de protoplastos . Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo generalmente contendrán diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxinas y citocininas. También es útil agregar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. Los vastagos y raíces habitualmente se desarrollan de manera simultánea. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y de los antecedentes del cultivo. Si estas tres variables se controlan, entonces la regeneración es completamente reproducible y repetible. J£n algunos sistemas de cultivo celular de plantas, la proteína deseada de la invención se puede excretar o alternativamente la proteína se puede extraer de la planta completa. Cuando la ^proteína deseada de la invención se secreta a un medio, se puede recolectar. Alternativamente, los embriones y semillas medias sin embriones u otros tejidos vegetales se pueden romper mecánicamente para liberar cualquier proteína secretada entre células y tejidos. La mezcla se puede suspender en una solución amortiguadora para recuperar las proteínas solubles. Los métodos de aislamiento y purificación convencionales para proteínas serán los que se utilizan para purificar la proteína recombinante. Los parámetros de tiempo, temperatura, pH, oxígeno y volumen se ajustarán mediante métodos sistemáticos para optimizar la expresión y recuperación de proteína heteróloga.

IV. Sistemas Bacterianos En el arte se conocen técnicas de expresión bacterianas. Un promotor bacteriano es una secuencia de ADN capaz de unir ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción hacia el extremo 3 ' de una secuencia codificante (por ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que habitualmente se coloca proximal al extremo 5 ' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de transcripción habitualmente incluye un sitio de unión de ARN polimerasa y un sitio de inicio de traducción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado un operador, que se puede superponer a ARN polimerasa adyacente al sitio de unión en el cual comienza la síntesis de ARN. El operador permite una transcripción con regulación negativa (inducible) , como una proteína represora de gen que se puede unir al operador y de esta manera inhibir la transcripción de un gen específico. Se puede presentar expresión constitutiva en ausencia de elementos reguladores negativos tales como el operador. Además, se puede obtener regulación positiva por una secuencia que une a la proteína activadora de gen, la cual, si está presente, habitualmente está hacia el extremo 5 ' de la secuencia de unión de ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es la proteína activadora de catabolito (CAP, por sus siglas en inglés) , que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173] . De esta manera, la expresión regulada puede ser positiva o negativa, por lo que se puede mejorar o reducir la transcripción. Las secuencias que codifican para enzimas de la vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizantes de azúcar, tales como galactosa, lactosa ( lac) [Chang et al. (1997) Nature 158:1056], y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel et al . (1980) Nuc . Acids Res . 8:4057; Yelverton et al . (1981) Nucí .

Acids Res . 9 : 731 ; patente de E.U.A. 4,738,921; EP-A-0036776 y EP-A-0121775] . El sistema promotor de g-laotamasa (bla) [Weissmann (1981) "The Cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (ed. I. Gresser) ] , el bacteriófago lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292 : 128] y los sistemas promotores T5 [Patente de E.U.A. 4,689,406] también proporcionan secuencias promotoras útiles . Además, los promotores sintéticos que no se presentan en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, la secuencia y activación de transcripción de un promotor bacteriano bacteriófago se pueden unir con las secuencias de operón u otro promotor bacteriano o de bacteriófago, lo que genera un promotor híbrido sintético [Patente de E.U.A. 4,551,433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido trp-lac constituido tanto del promotor trp y las secuencias del operón lac que es regulado por el represor lac [Amann et al . (1983) Gene 25 : 167 ; de Boer et al . (1983) Proc. Nati . Acad.

Sci . 80 : 21] . Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se presenten de manera natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unir AR? polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se presenta de manera natural de origen no bacteriano también se puede acoplar con ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de ARN polimerasa/promotor de bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al . (1986) J. Mol . Biol . 189 : 113 ; Tabor et al . (1985) Proc . Nati . Acad. Sci . 82 : 1074] . Además, un promotor híbrido también puede estar constituido de un promotor de bacteriófago y una región operadora de E. coli (EPO-A-0 267 851) . Además de una secuencia promotora de funcionamiento, un sitio de unión de ribosoma eficiente también es útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli , el sitio de unión de ribosoma se denomina la secuencia de Shine-Delgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3 a 9 nucleótidos de longitud que se localiza de 3 a 11 nucleótidos hacia el extremo 5' del codón de inicio [Shine et al . (1975) Nature 254 : 34] . La secuencia SD se considera que promueve la unión "de ARNm al ribosoma por pareamiento de bases entre la secuencias SD y la parte 3 ' y el ARNr 16S de E. coli [Steitz et al . (1979) "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development : Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Para expresar genes de eucariotas y genes de procariotas con un sitio de unión de ribosoma débil [Sambrook et al . (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual] . Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente . Una secuencia promotora se puede unir directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en la parte N terminal __ siempre será una metionina, la cual es codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en la parte N terminal se puede separar de la proteína por incubación in vi tro con bromuro de cianógeno o bien ya sea in vivo o in vi tro por incubación con una peptidasa N terminal de metionina bacteriana (EPO-A-0 219 237) . Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Habitualmente, una secuencia de ADN que codifica para la porción N terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona al extremo 5' de las secuencias codificantes heterólogas. Cuando se expresa, este montaje (plásmido recombinante) proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de célula lambda de bacteriófago se puede unir a la parte 5 ' terminal de un gen extraño y se puede expresar en bacterias . La proteína de fusión resultante preferiblemente retiene un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para separar la proteína de bacteriófago del gen extraño [Nagai et al . (1984) Nature 305:810]. Las proteínas de fusión también pueden elaborarse con secuencias a partir de los genes lacZ (Jia et al . (1987) Gene 60:197], trpE [Alien et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makof et al . (1989) J. Gen. Microbiol . 135: 11] , y Chey [EP-A-0 324 647] . La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar para un sitio que se pueda separar. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Tal proteína de fusión se elabora con la región de ubiquitina que preferiblemente retenga un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, el procesamiento de una proteasa específica de ubiquitina) para separar la ubiquitina de la proteína extraña. Mediante este método, se puede aislar la proteína extraña nativa [Miller et al . (1989) Bio/Technology 7:698] . De manera alternativa, también se pueden secretar proteínas extrañas de la célula al generar moléculas de ADN quiméricas que codifiquen para una proteína de fusión constituida de un fragmento de secuencia de péptido señal que proporcione secreción de una proteína extraña en bacterias [Patente de E.U.A. 4,336,336]. El fragmento de secuencia de señal habitualmente codifica para un péptido señal constituido de aminoácidos hidrqfóbicos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La proteína es secretada al medio de crecimiento (bacterian grampositiva) o bien al espacio periplásmico, que se localiza entre las membranas interior y exterior de la célula (bacteria gramnegativa) . Preferiblemente existen sitios de procesamiento los cuales se pueden separar ya sea in vi tro o in vivo codificados entre el fragmento del péptido señal y el gen extraño . El ADN que codifica para secuencias de señal adecuadas se puede derivar de genes para proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen para proteína de membrana exterior de E. coli [ompA] [Masui et al . (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al . (1984) EMBO J. 3:2437] y la secuencia de la señal de fosfatasa alcalina de E. coli {phoA) [Oka et al . (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . 82 : 7212 ] . Como un ejemplo adicional, la secuencia de señal del gen para alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus se puede utilizar para secretar proteínas heterólogas de B . subtilis [Palva et al. (1982) .Proc. Nati . Acad. Sci . USA 79 : 5582 ; EP-A-0 244 042]. Habitualmente, las secuencias de terminación de transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras que se localizan 3 ' respecto al codón de detención de traducción, y por lo tanto junto con el promotor que flanquea a la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm el cual se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de traducción con frecuencia incluyen secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de bucle de tallo que ayudan a finalizar la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos. Habitualmente, los componentes descritos antes, que comprenden un promotor, secuencia de señal (si se desea) , codifican para la secuencia de interés y la secuencia de terminación de transcripción, se colocan juntos en montajes de expresión. Los montajes de expresión con frecuencia se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, por ejemplo una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, y por lo tanto permitirá que se mantenga en un huésped procariota ya sea para expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido con un número alto o bajo de copias. Un plásmido con un número alto de copias generalmente tendrá un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y habitualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido con un número alto de copias preferiblemente contendrá por lo menos aproximadamente 10, y de manera más preferible por lo menos aproximadamente 20 plásmidos. Ya sea que se seleccione un vector con un número alto o bajo de copias, dependiendo del efecto del vector y la proteína extraña en el huésped. Alternativamente, los montajes de expresión se pueden integrar en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración habitualmente contienen por lo menos una secuencia homologa al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, la integración de vectores construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (EP-A-0 127 328) . Los vectores de integración también pueden estar constituidos de bacteriófagos o secuencias de transposón. Habitualmente, los montajes extracromosómicos y de integración de expresión pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de extirpes bacterianas que se han transformado. Los marcadores seleccionables de pueden expresar en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que vuelvan a las bacterias resistentes a medicamentos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies et al . (1978) Annu. .Rev. Microbiol . 32 : 469] . Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos tales como los de las vías biosintéticas de histidina, triptófano y leucina. De manera alternativa, algunos de los componentes descritos antes se pueden colocar juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación habitualmente están constituidos de un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o se desarrollan en un vector de integración, como se describe en lo anterior. Los vectores de expresión y transformación, ya sea replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión, por ejemplo, para las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva et al . (1982) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 79 : 5582 ; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541]; Escherichia coli [Shimatake et al . (1981) Nature 292 : 128 ; Amann et al . (1985) Gene 40:183; Studier et al . (1986) J". Mol . Biol . 189 : 113 ; EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al . (1988) Appl . Environ . Microbiol . 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al . (1988) Appl . Environ Microbiol . 54:655]; Streptoipyces lividans [Patente de los E.U.A. 4,745,056]. Los métodos para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos son bien conocidos en la técnica, y habitualmente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. También se puede introducir ADN en células bacterianas por electroporación. Los procedimientos de transformación habitualmente varían con la especie bacteriana que se va a transformar. Véase, por ejemplo, [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:5582; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter] . [Cohén et al. (1973) Proc. Nati. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the international Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia) ; Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia] , [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus] ; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, . Pseudomonas] ; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus] , Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry et al . (1981) Infect . Immun . 32 : 1295 ; Powell et al . (1988) Appl . Environ. Microbiol . 54 : 655 ; Somkuti et al . (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1 :412 , Streptococcus] . v. Expresión en Levadura Los sistemas de expresión en levadura también se conocen por aquellos habitualmente expertos en la técnica. Un promotor en levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unir ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción hacia el extremo 3 ' de una secuencia codificante (por ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción la cual habitualmente se colocará proximal al extremo 5 ' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de transcripción habitualmente incluye un sitio de unión de ARN polimerasa (la secuencia "TATA") y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor de levadura también puede tener un segundo dominio denominado una secuencia activadora hacia el extremo 5' (UAS, por sus siglas en inglés), la cual, en caso de que este presente, habitualmente está distal al gen estructural . La UAS permite la expresión regulada (inducible) . La expresión constitutiva se presenta en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser positiva o negativa, por lo que se aumenta o reduce la transcripción. La levadura es un organismo termentador con una vía metabólica activa, y por lo tanto las secuencias que codifican para enzimas en la vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente _ útiles . Los ejemplos incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (EP-A-0 284 044) , enolasa, glucocinasa, glucosa-6-fosfatoisomerasa, gliceraldehído-3 -fosfato tdeshidrogenasa (GAP o GAPDH) , hexocinasa, fosfofructocinasa, 3-fosfogliceratomutasa y piruvatocinasa (P K) (EPO-A-0 329 203) . El gen PH05 de levadura codifica para fosfatasa acida y también proporciona secuencias promotoras útiles [Myanohara et al . (1983) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 80 : 1] . Además, los promotores sintéticos los cuales no se presentan en la naturaleza también funcionan como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de levadura se pueden unir con la región de activación de transcripción de otro promotor de levadura, lo que genera un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH unida a la región de activación de transcripción GAP (patente de E.U.A. números 4,876,197 y 4,880,734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten de secuencias reguladoras ya sea de genes ADH2, GAL4 , GALIO o POH5 , combinados con la región de activación transcripcional de un gen de enzima glucolítica tal como GAP o PyK (EP-A-0 164 556) . Además, un promotor de levadura puede incluir promotores que se presenten de manera natural de origen diferente a levadura, que tenga la capacidad de unir ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de tales promotores incluyen, por ejemplo [Cohén et al . (1980) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 77:1078; Henikoff et al . (1981) Nature 283 : 835 ; Hollenger et al . (1981) Curr. Topics Microbiol . Immunol . 96: 119 ; Hollenberg et al . (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic ^ Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae, " in: Plasmid of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler) ; Mercerau-Puigalon et al . (1980) Gene 11 : 163 ; Panthier et al . (1980) Curr. Genet . 2:109;] . Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente en levadura. Una secuencia promotora se puede unir directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en la parte N terminal de la proteína recombinante siempre será una metionina, la cual es codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina y la parte N terminal se puede separar de la proteína por incubación in vi tro con bromuro de cianógeno. Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para sistemas de expresión de levadura, así como en sistemas de expresión de mamífero, baculovirus y bacterianos. Habitualmente, una secuencia de ADN que codifica para la porción N terminal de una proteína endógena de levadura u otra proteína estable, se fusiona al extremo 5' de las secuencias codificantes heterólogas. Cuando se expresa, ese montaje proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen para superóxido dismutasa (SOD) de levadura o de humano se puede unir en la parte 5 ' terminal de un gen extraño y se puede expresar en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar para un sitio susceptible de separación. Véase, por ejemplo, EP-A-0 196 056. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Tal proteína de fusión se elabora con la región de ubiquitina que preferiblemente retenga un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo una proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para separar la ubiquitina de la proteína extraña. Mediante este método, por lo tanto, se puede aislar una proteína extraña nativa (por ejemplo, como se indica en WO 88/024066) . Alternativamente, se pueden secretar proteínas extrañas de la célula al medio de crecimiento generando moléculas de ADN quimérico que codifican para una proteína de fusión constituida de un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción en levadura de la proteína extraña. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que se pueden separar ya sea in vivo o in vi tro. El fragmento de secuencia líder habitualmente codifica para un péptido señal comprendido de aminoácidos hidrofóbicos los cuales dirigen la secreción de la proteína desde la célula. El ADN que codifica para las secuencias de señal adecuadas se puede derivar de genes para proteínas de levadura secretadas, tales como el gen para invertasa de levadura (EP-A-0 012 873; JPO. 62,096,086) y el gen para e factor A (patente de E.U.A. 4,588,684). Alternativamente, existen líderes de origen diferente a levadura, tal como un líder de interferón, que también proporcionan secreción en levadura (EP-A-0 060 057) . Una clase preferida de líderes de secreción son aquellos que utilizan un fragmento del gen de levadura de factor a, el cual contiene tanto una secuencia de señal "pre", como una región "pro". Los tipos de fragmentos de factor a que se puedan utilizar incluyen un líder de facto a pré-pro de longitud completa (de aproximadamente 83 residuos aminoácidos) , así como líderes de factor a truncados (habitualmente de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 residuos aminoácidos) (patentes de E.U.A. 4,546,083 y 4,870,008; EP-A-0 324 274]. Los líderes adicionales que utilizan un fragmento líder de factor a que proporciona para la secreción incluyen líderes de factor a híbridos elaborados con una presecuencia de una primera levadura, pero con una región pro de un factor a de una segunda levadura (véase, por ejemplo WO 89/02463). Habitualmente, las secuencias de terminación de transcripción reconocidas por levadura son regiones reguladoras que se localizan 3 ' respecto al codón de detención de traducción, y por lo tanto junto con el promotor que flanquea a la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm el cual se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de secuencia terminadora de transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por levaduras tales como aquellas que codifican para enzimas glicolíticas . Habitualmente, los componentes descritos antes, comprenden un promotor, un líder (si se desea) , una secuencia codificante de interés y una secuencia de terminación de transcripción, y se colocan juntos en montajes de expresión. Los montajes de expresión con frecuencia se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tal como una levadura o bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, por lo que se permite que se mantenga, por ejemplo, en levadura para expresión, y en un huésped procaríota para clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores lanzadera de levadura-bacteria incluyen YEp24 [Botstein et al . (1979) Gene 8:17-24]; pCl/l [Brake et al . (1984) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 81:4642-4646], y YRpl7 [Stinchcomb et al . (1982) ". Mol . Biol . 158 : 157] . Además, el replicón puede ser un plásmido con un número de copias alto o bajo. Un plásmido con un número antes de copiar generalmente tendrá un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y habitualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido con un número alto de copias preferiblemente tendrá por lo menos aproximadamente 10, y de manera más preferible por lo menos aproximadamente 20. La introducción de un vector con un número de copias alto o bajo se puede seleccionar en base en el efecto del vector y la proteína extraña en el huésped. Véase, por ejemplo, Brake et al . , supra . Alternativamente, los montajes de expresión se pueden integrar en el genoma de levadura con un vector integrante. Los vectores de integración habitualmente contienen por lo menos una secuencia homologa al cromosoma de levadura que permite que el vector se integre, y preferiblemente contienen dos secuencias homologas que flanquean al montaje de expresión. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol . 101:228-245] . Un vector integrante se puede dirigir a un locus específico en la levadura al seleccionar la secuencia homologa apropiada para inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver et al . , supra . Uno o más montajes de expresión se pueden integrar, afectando posiblemente las concentraciones de proteínas recombinantes producidas [Rhine et al . (1983) Proc.' Nati . Acad . Sci . USA 80 : 6750] . Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector se pueden presentar ya sea como un solo segmento en el vector, que resulta en la integración del vector completo, o dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean al montaje de expresión en el vector, lo cual puede resultar en la integración estable de únicamente el montaje de expresión. Habitualmente, los montajes de expresión extracromosómicos y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de estirpes de levadura que se hayan transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en la levadura huésped, tales como ADE2, HIS4 , LEU2 , TRP1 y ALG7 , así como el gen para resistencia a G418, que confiere resistencia a células de levadura contra tunicamicina y G418, respectivamente.

Además, un marcador seleccionable adecuado también puede proporcionar a la levadura la capacidad para crecer en presencia de compuestos tóxicos tales como metales. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite que la levadura crezca en presencia de iones cobre [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351] . Alternativamente, algunos de los componentes descritos antes se pueden colocar juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación habitualmente comprenden un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o que se desarrolla en un vector de integración, como se describe en lo anterior. Los vectores de expresión y transformación, ya sea replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en muchas levaduras.

Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión por ejemplo, para las siguientes levaduras: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson et al. (1986) J". Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyvero yces fragilis [Das, et al. (1984) J". Bacteriol. 158:1165]; Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141] , Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; patente de los E.U.A. Números 4,837,148 y 4,929,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706], y Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49] . Los métodos para introducir ADN exógeno en levaduras huéspedes son bien conocidos en la técnica y habitualmente incluyen la transformación de esferoplastos o de las células intactas de levadura tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación habitualmente varían con la especie de levadura que se va a transformar. Véase, por ejemplo, [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida] ; [Gleeson et al. (1986) J". Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula] ; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces] ; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J". Basic Microbiol. 25:141; Patente de los E.U.A. Números 4,837,148 y 4,929,555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 75 : 1929 ; Ito et al . (1983) J". Bacteriol . 153 : 163 Saccharomyces] ; [Beach and Nurse (1981) Nature 300 : 706 ; Schizosaccharomyces] ; [Davidow et al . (1985) Curr. Genet . 10 : 39 ; Gaillardin et al . (1985) Curr. Genet . 10 : 49 ; Yarrowia] .

Anticuerpos Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos constituidos de por lo menos un sitio de combinación de anticuerpo. Un "sitio de combinación de anticuerpo" es un espacio de unión tridimensional con una forma de superficie interna y una distribución de carga complementaria a las características de un epítopo de un antígeno, que permite la unión del __ anticuerpo con el antígeno. "Anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos de vertebrado, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, proteínas Fab y anticuerpos de dominio único. Los anticuerpos contra las proteínas de la invención son útiles para cromatografía de afinidad, inmunoensayos y diferenciación/identificación de proteínas neiseriales . Los anticuerpos para las proteínas 'de la invención, tanto policlonales como monoclonales, se pueden preparar por métodos convencionales. En general, la proteína se utiliza primero para inmunizar un animal adecuado, preferiblemente un ratón, rata, conejo o chivo. Los conejos y chivos se prefieren para la preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero que se puede obtener, y la disponibilidad de anticuerpos marcados, contra conejo y contra chivo. La inmunización generalmente se realiza por mezclado o emulsificado de la proteína en solución salina, preferiblemente en an adyuvante tal como adyuvante completo de Freund, y al inyectar la mezcla o emulsión parenteralmente (generalmente por vía subcutánea o intramuscular) . Típicamente es suficiente una dosis de 50-200 µg/inyección. La inmunización generalmente se refuerza a las 2-6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferiblemente utilizando adyuvante incompleto de Freund. Uno alternativamente puede generar anticuerpos por inmunización in vi tro utilizando métodos conocidos en la técnica, los cuales, para los propósitos de esta invención, se consideran equivalentes a una inmunización in vivo . Se obtiene antisuero policlonal al sangrar a los animales inmunizados en un recipiente de vidrio o plástico, incubar la sangre a 25°C durante una hora, seguido por incubación a 4°C durante 2 a 18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo 1000 g durante 10 minutos) . Se obtienen de conejos aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre. Se preparan anticuerpos monoclonales utilizando el método estándar de Kohler y Milstein [Nature (1975) 256:495-96], o una modificación del mismo. Típicamente, se inmuniza a un ratón o rata como se describe en lo anterior. Sin embargo, en vez de extraerle sangre al animal para extraer el suero, se extirpa el bazo (y opcionalmente varios nodulos linfáticos grandes) y se corta hasta constituir células solas. Si se desea, las células del bazo pueden ser cribadas (después de eliminación de células adherentes inespecíficas) , aplicando una suspensión celular a una placa o un pozo recubierto con el antígeno proteínico. Los linfocitos B que expresan la inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa, y ya no se elimina por enjuagado con el resto de la suspensión. Los linfocitos B resultantes, o la totalidad de las células de bazo disociadas después se induce que se fusionen con células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo medio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se siembran en placa por dilución limitante, y se realizan ensayos para determinar la producción de anticuerpos los cuales se unen específicamente al antígeno inmunizante (y los cuales no se unen a antígenos no relacionados) . Los hibridomas secretantes de MAb seleccionados después se cultivan in vi tro (por ejemplo en frascos de cultivo de tejido o en reactores de fibra hueca) o bien in vivo (en ascitis en ratones) . Si se desea, los anticuerpos (policlonales o monoclonales) se pueden marcar utilizando técnicas convencionales. Las marcas adecuadas incluyen fluoruros, cromóforos, átomos radioactivos (particularmente 32P y 125I) , reactivos electrodensos, enzimas y ligandos que tengan asociados de unión específicos. Las enzimas típicamente se detectan por su actividad. Por ejemplo, habitualmente se detecta peroxidasa de rábano por su capacidad para convertir 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Asociado de unión específico" se refiere a una proteína capaz de unir una molécula de ligando con alta especificidad, tal como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para el mismo. Otros asociados de unión específicos incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y números pares de receptor-ligando conocidos en la técnica. Debe entenderse que la descripción anterior de ninguna manera pretende establecer categorías para las diversas etiquetas en clases distintas, pues la misma etiqueta puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, 125I puede servir como una etiqueta radioactiva o - ßl - como un reactivo electrodenso. HRP puede servir como una enzima o como un antígeno para los MAb. Además, se pueden combinar diversas etiquetas para el efecto deseado. Por ejemplo, los MAb y la avidina también requieren etiquetas en la práctica de esta invención: por lo tanto, uno puede marcar un MAb con biotina, y detectar su presencia con avidina marcada con 125I, o con un MAb contra biotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán evidentes fácilmente por aquellos habitualmente expertos en la técnica y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención.

Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas pueden comprenden polipéptidos, anticuerpos o ácido nucleico de la invención. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad terapéuticamente efectiva de polipéptidos, anticuerpos o polinucleótidos de la invención reivindicada. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, disminuir o evitar una enfermedad o condición deseada, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto se puede detectar, por ejemplo, por marcadores químicos o niveles de antígeno. Los efectos terapéuticos también incluyen reducción en los síntomas físicos, tales como una temperatura corporal disminuida. La cantidad efectiva precisa para un sujeto dependerá del tamaño y salud del sujeto, la naturaleza y grado de la condición así como las sustancias terapéuticas o combinación de sustancias terapéuticas seleccionadas para administración. De esta manera, no es útil especificar una cantidad efectiva exacta por adelantado. Sin embargo, la cantidad efectiva para una situación dada se puede determinar por experimentación sistemática y está dentro del juicio del médico. Para propósitos de la presente invención, una dosis efectiva será de aproximadamente 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, o de 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de los montajes de ADN en el individuo en el cual se administra. Una composición farmacéutica también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable", se refiere a un portador para administración de un agente terapéutico tal como anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. El término se refiere a cualquier portador farmacéutico que en si mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos al individuo que recibe la composición, y el cual se puede administrar sin toxicidad indebida. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos habitualmente expertos en la técnica. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar en la presente, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión cuidadosa de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras de pH y similares. Típicamente, las composiciones terapéuticas se preparan como inyectables, ya sea soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución, suspensión, vehículos líquidos antes de su inyección también se pueden preparar. Los liposomas se incluyen dentro de la definición de un portador farmacéuticamente aceptable.

Métodos de Suministro Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales; en particular se pueden tratar seres humanos. El suministro directo de las composiciones generalmente se llevan a cabo por inyección, ya sea por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se pueden suministrar al espacio intersticial de un tejido.

Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmica y transcutánea (véase, por ejemplo WO 98/20734), con agujas o pistolas de genes o hipoaspersiones .

El tratamiento por dosificación puede ser con un protocolo de una sola dosis o con un protocolo de dosis múltiples.

Vacunas Las vacunas que comprenden uno o varios antígenos inmunizantes, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos habitualmente en combinación con los "portadores farmacéuticamente aceptables" los cuales incluyen cualquier portador que en si mismo no induce la producción de anticuerpos dañinos al individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados típicamente son macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipidíeos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y partículas virales inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos habitualmente expertos en la técnica. Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Además, el antígeno o inmunógeno se puede conjugar a un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pylori , etc. Los adyuvantes preferidos para mejorar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alumbre) , tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase después) o componentes de pared celular bacteriana), tales como por ejemplo: (a) MF59m (WO 90/14837; capítulo 10 en Vaccine design : the subuni t and adjuvant approach, eds, Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contiene escualeno 5%, Tween 80 0.5% y Span 85 0.5% (que opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE (véase después) , aunque no se requiere) formulado en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA) , (b) SAF que contiene escualano 10%, Tween 80 0.4%, polímero bloqueado Pluronic 5% L121 y thr-MDP (véase abajo) ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometida a remolino para generar una emulsión con tamaño de partícula grande, y (c) un sistema adyuvante Ribi™1 (RAS) , (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno 2%, Tween 80 0.2% y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS, por sus siglas en inglés) , preferiblemente MPL + CWS (Detox™) ; (3) adyuvantes de saponina tales como Stimulon" (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) que puede ser utilizado o partículas generadas a partir del mismo tal como las ISCOM (complejos inmunoestimulantes) ; (4) adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) y adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) ; (5) citocinas tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón gamma) , factor estimulador de colonia de macrófagos (M-CFS, por sus siglas en inglés) , factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés), etc; y (6) otras sustancias que actúan como inmunoestimulantes para mejorar la efectividad de la composición. Se prefieren alumbre y MF59MR. Como se ha mencionado antes, los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' , 2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) etilamina (MTP-PE) , etc. Las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, la sustancia inmunizante de antígeno/inmunógeno/polipéptido/-proteína/ácido nucleico, un portador farmacéuticamente aceptable y un adyuvante) típicamente contendrán diluyentes tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras de pH y similares. Típicamente, la composición inmunogénica se prepara como inyectable, es decir, como soluciones o suspensiones líquidas; las formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión en vehículos Líquidos antes de la inyección también se pueden preparar. La preparación también se puede emulsificar o encapsular en liposomas para un efecto adyuvante mejorado, discutido antes bajo los portadores farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de los polipéptidos antigénicos o inmunogénicos, así como cualquier otro componente mencionado antes, según se necesite. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" se quiere significar que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea como una sola dosis o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o para evitar la enfermedad. Esta cantidad varía en base en la salud y condición física, del individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la determinación de la situación médica del doctor que realiza el tratamiento y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se pueda determinar mediante ensayos sistemáticos. Las composiciones inmunogénicas convencionalmente se administran por vía parenteral, por ejemplo por inyección, ya sea subcutánea, intramuscular o transdérmica/transcutánea (por ejemplo WO 98/20734) . Las formulaciones adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un protocolo de una sola dosis o bien un protocolo de dosis múltiples. La vacuna se puede administrar junto con otros agentes inmunorreguladores . Como una alternativa a las vacunas basadas en proteína, se puede utilizar la vacunación con ADN [por ejemplo Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology :271-283; Donnelly et al . (1997) Annu Rev Immunol 15: 617 - -» 648; véase esta última aquí] .

Vehículos de Suministro de Genes Los vehículos de terapia de genes para suministro de montajes incluyen una secuencia codificante de una sustancia terapéutica de la invención, que se va a suministrar al mamífero para expresión en el mamífero, la cual se puede administrar por vía local o sistémica. Estos montajes pueden utilizar enfoques de vector viral o no viral en la modalidad in vivo o ex vivo . La expresión de tal secuencia codificante se puede inducir utilizando promotores endógenos de mamífero o bien heterólogos. La expresión de la secuencia codificante in vivo puede ser constitutiva o regulada. La invención incluye vehículos de suministro de genes capaces de expresar secuencias contempladas de ácido nucleico. El vehículo de suministro de genes preferiblemente es un vector viral y, más preferiblemente, un vector retroviral, adenoviral, viral adenoasociado (AA, por sus siglas en inglés), viral de herpes o de alfavirus. El vector viral también puede ser un vector viral de astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus o togavirus. Véase de manera general, Jolly (1994) Cáncer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153. Los vectores retrovirales son bien conocidos en la técnica y contemplamos que es utilizable en la invención cualquier vector de terapia de genes retroviral, incluyendo los retrovirus tipos B, C y D, retrovirus xenotrópicos (por ejemplo, ?ZB-X1, ?ZB-X2 y ?ZB9-1 (véase O'?eill (1985) J". Virol . 53:160), retrovirus politrópicos, por ejemplo MCF y MCF-MLV .(véase Kelly (1983) J. Virol . 45:291), spumavirus y lentivirus. Véase R?A ..Tumor Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985. Las porciones del vector de terapia de gen retroviral se pueden derivar de retrovirus diferentes. Por ejemplo, los LTR de retrovector se pueden derivar del virus de sarcoma murino, un sitio que une AR?t del virus de sarcoma de Rous, una señal de empaque del virus de leucemia murino, y un origen de síntesis de la segunda cadena del virus de leucosis aviar. Estos vectores retrovirales recombinantes se pueden utilizar para generar partículas de vectores retrovirales competentes por transducción al introducirlas en líneas de células de empaqué apropiadas (véase patente de E.U.A. 5,591,624). Se pueden construir vectores de retrovirus para integración específica de sitio en ADN de célula huésped por incorporación de una enzima integrasa quimérica en una partícula retroviral (véase WO 96/37626) . Es preferible que el vector viral recombinante sea un virus recombinante defectuoso en cuanto a su replicación. Las líneas de células de empaque adecuadas para uso en los vectores de retrovirus descritos en lo anterior son bien conocidas en la técnica y se preparan fácilmente (véanse WO95/30763 y WO92/05266) , y se pueden utilizar para crear líneas de células productoras (también denominadas líneas de células vector o "VCL" , por sus s.glas en inglés), para la producción de partículas de vectores recombinantes. Preferiblemente, las líneas de células de empaque se elaboran de células progenitoras humanas (por ejemplo células HT1080) o líneas de células originales de mink, las cuales eliminan la inactivación en suero humano. Los retrovirus preferidos para la construcción de los vectores de terapia de genes retrovirales incluyen el virus de leucosis aviar, virus de leucemia bovina, virus de leucemia murina, el virus inductor de focos de células mink, virus de sarcoma murino, virus de retículoendoteliosis y virus de sarcoma de Rous . Se prefiere particularmente al virus de leucemia murino que incluye a 4070A y 1504A (Hartley and Rowe (1976) J. Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999) , Friend (ATCC No. VR-245) , Graffi, gross (ATCC Nol VR-590) , Kirsten, Harvey el virus de sarcoma y Rauscher (ATCC No. VR-998) y el virus de leucemia murino Moloney (ATCC No. VR-190) . Tales retrovirus se pueden obtener de los depositarios o las colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC", por sus siglas en inglés) en Rockville, Maryland, o se pueden aislar de fuentes conocidas utilizando técnicas disponibles comúnmente. A. Los vectores de terapia de gen retroviral conocidos ejemplares, que se pueden utilizar en esta invención incluyen los que se describen en las solicitudes de patentes GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468, WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, W093/25698, W093/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, y las patentes de E.U.A. Números 5,219,740, 4,405,712, 4,861,719, 4,980,289, 4,777,127, 5,591,624. Véase también Vile (1993) Csncer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cáncer Res 53:962-967; Ram (1993) Cáncer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J" Neurosurg 79:729-735; Mann (1983) Cell 33:153; Cañe 1984) Proc . Nati Acad Sci81 : 6349 ; y Muller (1990) Human Gene Therapy 1 . Los vectores de la terapia de gen adenoviral humano también se conocen en la técnica y son utilizables en esta invención. Véase, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 and Rosenfeld (1991) Science 252:431, y WO93/07283, WO93/06223 y WO93/07282. Los vectores de terapia de genes adenovirales conocidos ejemplares, que se pueden utilizar en esta invención incluyen los que se describen en los documentos a los que se hace referencia antes y en W094/12649, WO93/03769, W093/19191, W094/28938, W095/H984, WO95/00655, WO95/27071, W095/29993, W095/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, W094/24299, WO95/14102, W095/24297, WO95/02697, W094/28152, W094/24299, WO95/09241; WO95/25807, WO95/05835, W094/18922 y WO95/09654. De manera alternativa, la administración de ADN unido a adenovirus muerto se describe en Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154 y se puede utilizar. Los vehículos de suministro de genes de la invención también incluyen vectores de virus asociados a adenovirus (AAV) . Los ejemplos iniciales y preferidos de tales vectores para uso en esta invención son los vectores basados en AAV-2 descritos en Srivastava, WO93/09239. Los vectores AAV más preferidos comprenden dos secuencias repetidas terminales invertidas AAV en las cuales las secuencias D nativas están modificadas por sustitución de nucleótidos, de manera que se retienen por lo menos cinco nucleótidos nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, preferiblemente por lo menos 10 nucleótidos nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, y de manera más preferible 10 nucleótidos nativos, y los nucleótidos remanentes de la secuencia D se suprimen o sustituyen con nucleótidos no nativos. Las secuencias D nativas de las secuencias repetidas terminales invertidas AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada secuencia repetida terminal invertida AAV (es decir, existe una secuencia en cada extremo), la cual no está involucrada en la formación de HP. El nucleótido de sustitución no nativo puede ser cualquier nucleótido diferente del nucleótido encontrado en la secuencia D nativa en la misma posición. Otros vectores AAV ejemplares utilizables son pWP-19, pWN-1, ambos descritos en Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Otro ejemplo de tal vector AAV es psub201 (véase Samulski (1987) J. Virol . 61:3096). Otro vector AAV ejemplar es el vector de TTR doble D. La construcción, del vector ITR doble D se describe en la patente "de E.U.A. 5,478,745. Otros vectores adicionales son los que se describen en Cárter, patente de E.U.A. 4,797,368 y Muzyczka, patente de E.U.A. 5,139,941, Chartejee, patente de E.U.A. 5,474,935 y Kotin W094/288157. Un ejemplo adicional de un vector AAV utilizable en esta invención es SSV9AFABTKneo, el cual contiene un mejorador AFP y un promotor de albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado. Su estructura y construcción se describen in Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Los vectores de terapia de genes AAV adicionales se describen en los documentos de E.U.A. 5,354,678, 5,173,414, 5,139,941 y 5,252,479. Los vectores de terapia de genes de esta invención también comprenden vectores de herpes. Los ejemplos principales y preferidos son los vectores de virus de herpes simple que contienen una secuencia que codifica para un polipéptido de timidina cinasa tal como los descritos en el documento de E.U.A. 5,288,641 y EP0176170 (Roizman) . Los vectores de virus de herpes simples adicionales incluyen HFEM/ICP6-LacZ descrita en WO95/04139 (Wistar Institute) , pHSVIac descrita en Geller (1988) Science 241:1667-1669 y en WO90/09441 y WO92/07945, HSV Us3 : :pgC-lacZ descrito en Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 y HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4 descrito en EP 0452442 (Breakefield) y los depositados ante ATCC con los números de acceso ATCC VR-977 y ATCC VR-260. También se contemplan los vectores de terapia de genes de virus a que se pueden utilizar en esta invención. Los vectores de virus a preferidos son los vectores de virus Sindbis. Togavirus, el virus de Forest Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247) ; virus Middleberg (ATCC VR-370) , virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) , virus de encefalitis equina Venezolana (ATCC VR293; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532) , y los descritos en las patentes de E.U.A. 5,091,309, 5,217,879 y WO92/10578. Más particularmente, aquellos vectores de virus a descritos en el documento de E.U.A. número de serie 08/405,627, presentada el 15 de marzo de 1995, W094/21792, WO92/10578, WO95/07994, y patente de E.U.A. 5,091,309 y 5,217,879 son utilizables. Tales virus a se pueden obtener de los depositarios o las colecciones tales como ATCC en Rockville, Maryland o se pueden aislar de fuentes conocidas utilizando técnicas disponibles comúnmente. Preferiblemente, los vectores de alfavirus con citotoxicidad reducida son los que se utilizan (véase USSN 08/679640) . Los sistemas de vector de ADN tales como los sistemas de expresión estratificados de eucariotas también son útiles para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Véase WO95/07994 para una descripción detallada de sistemas de expresión estratificados de eucariotas. Preferiblemente, los sistemas de expresión estratificados de eucariota de la invención se derivan de vectores de alfavirus y de manera más preferible de vectores virales Sindbis . Otros vectores virales adecuados para uso en la presente invención incluyen los derivados de poliovirus, por ejemplo ATCC VR-58 y los descritos en Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol . Standardization 1:115; rinovirus, por ejemplo ATCC VR-1110 y los descritos en Arnold (1990) J Cell Biochem L401; poxvirus tales como el poxvirus de canario o el virus de vaccinia, por ejemplo ATCC VR-111 y ATCC VR-2010 y los descritos en Fisher-Hoch (1989) Proc Nati Acad Sci 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569 : 86 ; Flexner (1990) Vaccine 8:17; en el documento de E.U.A. 4,603,112 y E.U.A. 4,769,330 y WO89/01973; virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y los descritos en Mulligan (1979) Nature 277:108 y Madzak (1992) J" Gen Virol 73:1533; virus de influenza, por ejemplo ATCC VR-797 y virus de influenza recombinante elaborados utilizando técnicas de genética inversa, como se describe en los documentos de E.U.A. 5,166,057 y en Enami (1990) Proc Nati Acad Sci 87:3802-3805; Enami & Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 y Luytjes (1989) Cell 59:110, (véase también McMichael (1983) NEJ Med 309:13, y Yap (1978) Nature 273:238 y Nature (1979) 277:108); virus de inmunodeficiencia humana como se describe en EP-0386882 y en Buchschacher (1992) J". Virol . 66:2731; virus de sarampión, por ejemplo ATCC VR-67 y VR-1247 y los descritos en EP-0440219; virus Aura, por ejemplo ATCC VR-368; virus Bebaru, por ejemplo ATCC VR-600 y ATCC VR-1240; virus Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; virus Chikungunya, por ejemplo ATCC VR-64 y ATCC VR-1241; virus Fort Morgan, por ejemplo ATCC VR-924; virus Getah, por ejemplo ATCC VR-369 y ATCC VR-1243; virus Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR-927; virus Mayaro, por ejemplo ATCC VR-66; virus Mucambo, por ejemplo ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; virus Ndumu, por ejemplo ATCC VR-371; virus Pixuna, por ejemplo ATCC VR-372 y ATCC VR-1245; virus Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; virus Triniti, por ejemplo ATCC VR-469; virus Una, por ejemplo ATCC VR-374; virus Whataroa, por ejemplo ATCC VR-926; virus Y-62-33 por ejemplo ATCC VR-375; virus O'Nyong, virus de encefalitis oriental, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC VR-1242; virus de encefalitis occidental, por ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y los descritos en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190. El suministro de las composiciones de esta invención en células no se limita a los vectores virales mencionados antes. Se pueden utilizar otros métodos de suministro y diferentes medios tales como, por ejemplo, vectores de expresión de ácido nucleico, ADN condensado policatiónico unido o sin unirse a adenovirus inactivado solo, por ejemplo, véase el documento de E.U.A. número de serie 08/366,787, presentado el 30 de diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154 ADN unido a ligando, por ejemplo véase Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, células de vehículos de suministro celular de eucariotas, por ejemplo, véase el documento de E.U.A. número de serie 08/240,030, presentado el 9 de mayo de 1994 y el documento de E.U.A. número de serie 08/404,796, la sedimentación de materiales de hidrogel fotopolimerizados, la pistola de partículas de transferencia de genes portátil, como se describe en la patente de E.U.A. 5,149,655, la radiación ionizante, como se describe en el documento de E.U.A. 5,206,152 y en WO92/11033, la neutralización o fusión de carga nucleica con membranas celulares. Los enfoques adicionales se describen en Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 y en Woffendin (1994) Proc Nati Acad Sci 91:1581-1585. La transferencia de genes mediada por partículas se puede utilizar, por ejemplo, véase el documento de E.U.A. número de serie 60/023,867. Brevemente, se puede insertar la secuencia en vectores convencionales que contengan secuencias de control convencionales para alto nivel de expresión, y después se incuban con moléculas sintéticas de transferencia de genes tales como cationes que unen ADN polimérico como polilisina, protamina y albúmina, unidas a ligandos que de dirigen a células tales como asialoorosomucoide, como se describe en Wu & Wu (1987) J". Biol . Chem. 262:4429-4422, insulina como se describe en Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, galactosa como se describe en Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, lactosa o transferrina. También se puede utilizar el ADN desnudo. Los métodos de introducción de ADN desnudo ejemplares se describen en WO 90/11092 y el documento de E.U.A. 5,580,859. Se puede mejorar la eficiencia de captación utilizando esferas de látex biodegradables. Las esferas de látex recubiertas con ADN se transportan de manera eficiente al interior de las células después de endocitosis iniciada por las esferas. Se puede mejorar adicionalmente el método por tratamiento de las esferas para aumentar la hidrofobicidad y de esta manera facilitar la ruptura del endosoma y liberación del ADN en el citoplasma. Los liposomas que pueden actuar como un vehículo de suministro de genes se describen en las patentes de E.U.A. 5,422,120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 y EP-524,968. Como se describe en USSN. 60/023,867, ante el suministro no viral, las secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido se pueden insertar dentro de vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para expresión de alto nivel, y se pueden incubar con moléculas de transferencia de gen sintéticas tales como cationes de unión de ADN polimérico como polilisina, protamina y albúmina, unidos a ligandos dirigidos a células tales como asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa o transferrina. Otros sistemas de suministro incluyen el uso de liposomas para encapsular ADN que comprenden al gen bajo el control de diversos promotores específicos de tejido o activos de manera ubicua. Además, el suministro no viral adecuado para uso incluye _ sistemas de suministro mecánicos tales como el enfoque descrito en Woffendin et al (1994) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 91(24) : 11581. Además, la secuencia codificante y el producto de expresión de tal se puede suministrar a través de la sedimentación de materiales de hidrogel fotopolimerizados . Otros métodos convencionales para suministro de genes que se pueden utilizar para suministro de la secuencia codificante incluye, por ejemplo, el uso de una pistola de partículas de transferencia de genes portátil, como se describe en el documento de E.U.A. 5,149,655; el uso de radiación ionizante para inactivar el gen transferido, como se describe en el documento de E.U.A. 5,206,152 y WO 92/11033. Los vehículos de suministro de genes por liposomas y policatiónicos ejemplares incluyen los que describen en la patente de E.U.A. 5,422,120, y 4,762,915; WO 95/13796, WO 94/23697 y WO 91/14445; en y EP-0524968; en Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc Nati Acad Sci 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem. 176:420.

Una composición de polinucleótido puede comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un vehículo de terapia de gen, como se define el término antes. Para los propósitos de la presente invención, una dosis efectiva será de aproximadamente 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, o de 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de los montajes de ADN en el individuo en el cual se administran.

Métodos de Suministro Una vez formuladas, las composiciones polinucleotídicas de la invención se pueden administrar: (1) directamente al sujeto; (2) se pueden suministrar ex vivo a células derivadas del sujeto; o bien (3) in vi tro para expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos que se van a tratar pueden ser mamíferos o aves. También se pueden tratar sujetos humanos. A El suministro directo de las composiciones generalmente estará acompañado por inyección, ya sea por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se pueden suministrar al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar dentro de una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios y aplicación transdérmica o transcutánea (véase, por ejemplo, WO 98/20734), agujas y pistolas de genes o hipoaspersiones . El tratamiento de dosificación puede ser un protocolo de una sola dosis o bien un protocolo de dosis múltiples. Los métodos para el suministro ex vivo y la reimplantación de células transformadas en un sujeto se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en WO 93/14778. Los ejemplos de células útiles para aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, hemocitoblastos, particularmente células hematopoyéticas, linfáticas, macrófagos, células dendríticas o células tumorales. , Generalmente, el suministro de los ácidos nucleicos para aplicaciones ex vivo e in vi tro se puede llevar a cabo por los siguientes procedimientos, por ejemplo transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de el o los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos, como es bien conocido en la técnica.

Composi ci ones farmacéu ti cas polinucleotídicas polipeptídicas Además de los portadores y sales farmacéuticamente aceptables descritos antes, se pueden utilizar los siguientes agentes adicionales con composiciones polinucleotídicas o polipeptídicas.

A. Polipéptidos Un ejemplo son los polipéptidos que incluyen, sin limitación: asioloorosomucoide (ASOR, por sus siglas en inglés); transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos, fragmentos de anticuerpos; ferritina; interleucinas; interferones, granulocitos, factor estimulador de colonia de macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) , factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés) , factor estimulador de colonia de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés) , factor de hemocítoblastos y eritropoyetina. También se pueden utilizar antígenos virales tales como proteínas de envoltura. Además, proteínas de otros organismos invasivos, tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína de circunsporozoito de Plasmodium falciparum conocida como RII.

B. Hormonas, Vitaminas, etcétera Otros grupos que se pueden incluir son, por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona tiroidea o vitaminas y ácido fólico.

C. Polialquilenos, Polisacáridos, etcétera Además, se puede incluir polialquilenglicol con el polinucleótido/polipéptido deseado. En una modalidad preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, se pueden incluir monosacáridos, disacáridos o polisacáridos. En una modalidad preferida de este aspecto, el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano . También se puede utilizar quitosana y poli (lactida-co-glicolida) .

D. Lípidos y Liposomas El polinucleótido/polipéptido deseado también puede ser encapsulado en lípidos o se puede empacar en liposomas antes de su suministro al sujeto o a las células derivadas del mismo. La encapsulación lipídica generalmente se lleva a cabo utilizando liposomas los cuales son capaces de unirse de manera estable o atrapar y retener ácido nucleico. La relación de polinucleótido condensado respecto a preparación lipídica puede variar, pero generalmente será de aproximadamente 1:1 (mg de ADN: micromoles de lípidos) o más, de lípido. Para una revisión del uso de liposomas como portadores para el suministro de ácidos nucleicos véase Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys . Acta . 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth . Enzymol . 101:512-527. Las preparaciones liposómicas para uso en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (con carga positiva) aniónica (con carga negativa) y neutras. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos median el suministro intracelular de ADN plasmídico (Felgner (1987) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 84:7413-7416); ARNm (Malone (1989) .Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86:6077-6081); y factores de transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol . Chem. 265: 10189-10192) , de forma funcional. Los liposomas catiónicos están disponibles fácilmente. Por ejemplo, están disponibles liposomas de N[l-2, 3-dioleiloxi) propil] -N,N,N-trietilamonio (DOTMA) bajo la marca comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Véase también Felgner supra) . Otros liposomas disponibles comercialmente incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger) . Se pueden preparar otros liposomas catiónicos a partir de materiales disponibles fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, véase, por ejemplo Szoka (1978) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 75:4194-4198; WO 90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas DOTAP (1, 2 -bis (oleoiloxi) -3- (trimetilamonio) propano) . De manera similar, los liposomas aniónicos y neutros están disponibles fácilmente, tales como Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) , o se pueden preparar fácilmente utilizando materiales disponibles fácilmente. Tales materiales incluyen fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleoilfosfatidil colina (DOPC) , dioleilfosfatidilglicerol (DOPG) , dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) entre otros. Estos materiales también se pueden mezclar con los materiales iniciales DOTMA y DOTAP en relaciones apropiadas. Los métodos para elaborar liposomas utilizando estos materiales son bien conocidos en la técnica. Los liposomas pueden comprender vesículas multilamelares (MLV, por sus siglas en inglés) , vesículas unilamelares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) o vesículas unilamelares grandes (LUV, por sus siglas en inglés) . Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se preparan utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Straubinger (1983) Meth . Immunol . 101:512-527; Szoka (1978) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Bíochim . Biophys . Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:17; Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys . Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys . Res . Commun; 76:836; Fraley (1979) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 76:145; Fraley (1980) J". Biol . Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978). Proc.

Nati . Acad. Sci . USA 75 : 145 ; y Schaef er-Ridder ( 1982 ) Science 215 : 166 .

E. Lipoproteínas Además, se pueden incluir lipoproteínas con el polinucleótido/polipéptido que se va a suministrar. Los ejemplos de lipoproteínas que se pueden utilizar incluyen: quilomicrones, HDL, IDL, LDL y VLDL. También se pueden utilizar mutantes, fragmentos o fusiones de estas proteínas. Además, se pueden utilizar modificaciones de lipoproteínas que se presenten de manera natural tales como LDL acetilada. Estas lipoproteínas pueden dirigir el suministro de polinucleótidos a células que expresen receptores para lipoproteína. Preferiblemente, si son lipoproteínas, se incluyen con el polinucleótido para ser suministradas, en la composición no se incluye otro ligando de direccionamiento. Las lipoproteínas que se presenten de manera natural comprenden una porción de lípido y una proteína. La porción proteínica se conoce como apoproteínas . Hasta la fecha, se han aislado e identificado apoproteínas A, B, C, D y E. Por lo menos dos de estas contienen varias proteínas, denominadas por los números romanos AI, AII, AIV; Cl, CU, CIII. La lipoproteína A puede comprender más de una apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones que se presentan de manera natural están comprendidos de A, B, C y E con respecto al tiempo, estas lipoproteínas pierden las apoproteínas A y adquieren C y E. VLDL comprenden las apoproteínas A, B, C y E, LDL comprende la apoproteína B; y HDL comprende las apoproteínas A, C y E. El aminoácido de estas apoproteínas es conocido y se describe, por ejemplo, por Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol Chem 261:12918; Kane (1980) Proc Nati Acad Sci USA 77:2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65:232. Las lipoproteínas contienen diversos lípidos e incluyen triglicéridos, colesterol (libre y esteres) y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en lipoproteínas que se presentan de manera natural . Por ejemplo, los quilomicrones comprenden principalmente triglicéridos. Se puede encontrar una descripción más detallada del contenido de lípidos de las lipoproteínas que se presenten de manera natural, por. ejemplo, en Meth . Enzymol . 128 (1986) . La composición de los lípidos se elige con la ayuda en la conformación de la apoproteína para actividad de unión de receptor. La composición de los lípidos también se puede elegir para facilitar la interacción hidrofóbica en relación con la molécula de unión polinucleotídica.

Se pueden aislar lipoproteínas que se presentan de manera natural del suero por medio de ultracentrifugación, por ejemplo. Tales métodos se describen en Meth. Enzymol . (supra) ; Pitas (1980) J". Biochem . 255:5454-5460 y Mahey (1979) J Clin . Invest 64:743-750. También se pueden producir lipoproteínas mediante métodos in vi tro o recombinantes o bien por expresión de los genes para la apoproteína en una célula huésped deseada. Véase, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Bey Biophys Chem 15:403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443. También se pueden adquirir lipoproteínas de proveedores comerciales tales como Biomedical Techniologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Una descripción adicional de lipoproteínas se puede encontrar en Zuckermann et al . WO 98/06437.

F. Agentes Policatiónicos Se pueden incluir agentes policatiónicos, con o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido/polipéptido deseado que se va a suministrar. Habitualmente los agentes policatiónicos muestran una carga positiva neta a pH fisiológico relevante y son capaces de neutralizar la carga eléctrica de ácidos nucleicos para facilitar el suministro al lugar deseado. Estos agentes tienen aplicaciones in vitro, ex vivo e in vivo. Se pueden utilizar agentes policatiónicos para suministrar ácidos nucleicos a un ser vivo ya sea por vía intramuscular, subcutánea, etcétera. Los siguientes son ejemplos de polipéptidos útiles, agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina y protamina. Otros ejemplos incluyen histonas, protaminas, albúmina sérica humana, proteínas que unen ADN, proteínas cromosómicas que no son histonas, proteínas de recubrimiento de ADN virus tales como (XI74, factores de transcripción que también contienen dominios que unen ADN y por lo tanto pueden ser útiles como agentes de condensación de ácido nucleico. Brevemente, factores de transcripción tales como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP y TFIID que contienen dominios básicos que unen secuencias de ADN. Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen: espermina, espermidina y putrescina. Las dimensiones y las propiedades físicas de un agente policatiónico se pueden extrapolar de la lista anterior, para construir otros agentes policatiónicos polipeptídicos o para producir agentes policatiónicos sintéticos . Los agentes policatiónicos sintéticos los cuales son útiles incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno, LipofectinaMR y lipofectAMINE*^ que son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos/polipéptidos .

Ensayos de Inmunodiagnóstico Se pueden utilizar los antígenos neiseriales de la invención en inmunoensayos para detectar concentraciones de anticuerpos (e inversamente, se pueden utilizar anticuerpos antineiseriales para detectar concentraciones de antígeno) . Se pueden desarrollar inmunoensayos basados en antígenos recombinantes bien definidos para sustituir métodos de diagnóstico invasivos. Se pueden detectar anticuerpos para proteínas neiseriales dentro de muestras biológicas incluyendo, por ejemplo, muestras de sangre o suero. El diseño de inmunoensayos se somete en gran medida a variación, y en la técnica se conocen diversos de estos. Los protocolos para el inmunoensayo se pueden basar, por ejemplo, en la competencia, o reacción directa, o bien los ensayos de tipo interposición (emparedado) . Los protocolos también pueden utilizar, por ejemplo, soportes sólidos o pueden ser por inmunoprecipitación. La mayor parte de los ensayos involucran el uso de un anticuerpo o polipéptido marcado; las marcas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o moléculas de colorante. Los ensayos los cuales amplifican las señales de la sonda también se conocen; los ejemplos de los cuales son ensayos que utilizan biotina y avidina, así como inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, tales como los ensayos ELISA. Se construyen equipos adecuados para inmunodiagnóstico que contengan los reactivos marcados apropiados, por medio de empaque de los materiales apropiados que incluyen las composiciones de la invención, recipientes adecuados junto con los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, amortiguadores adecuados, soluciones salinas, etcétera) necesarios para llevar a cabo el ensayo, así como el conjunto adecuado de instrucciones para el ensayo .

Hibridación de Ácido Nucleico El término "hibridación" se refiere a la asociación de dos secuencias de ácido nucleico entre sí por unión con hidrógeno. Típicamente, se fijará una secuencia a u? soporte sólido y la otra se encontrará libre en solución. Después se colocarán las dos secuencias en contacto entre sí bajo condiciones que favorezcan la formación de uniones de hidrógeno. Los factores que alteran esta unión incluyen: el tipo y volumen de solvente; la temperatura de reacción, el tiempo de hibridación, la agitación; agentes que bloqueen la unión no específica de la secuencia en fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO) ; la concentración de las secuencias; en uso de los compuestos para aumentar la tasa de asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o polietilenglicol) ; y la rigurosidad de las condiciones de lavado después de la hibridación. Véase Sambrook et al. [supra] Volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 a 9.57. La "rigurosidad" se refiere a condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de secuencias muy similares sobre, secuencias que difieren. Por ejemplo, la combinación de temperatura y concentración salina se puede elegir para que sea aproximadamente de 120 a 200°C por debajo de Tm calculado del híbrido bajo estudio. La temperatura y las condiciones salinas con frecuencia se pueden determinar empíricamente en experimentos preliminares en los cuales las muestras, de ADN genómico inmovilizadas sobre filtros se hibridizan con la secuencia de interés y después "se lavan bajo condiciones de rigurosidad diferente. Véase Sambrook et al. en la página 9.50. Las variables a considerar cuando se realiza, por ejemplo, la transferencia Southern son: (1) la complejidad del ADN que se somete a transferencia, y (2) la homología entre la sonda y las secuencias que se van a detectar. La cantidad total de el o los fragmentos que se van a estudiar puede variar de magnitud de 10 a 0.1, hasta 1 µg para un plásmido o un digerido de fago hasta 10"9 a 10~8 g para un gen de una sola copia en un genoma de eucariota altamente complejo. Para polinucleótidos de complejidad menor, sustancialmente transferencia más corta, hibridación y tiempos de exposición, se pueden utilizar una cantidad más pequeña de polinucleótidos iniciales y una actividad específica menor de las sondas. Por ejemplo, se puede detectar un gen de levadura de una sola copia con un tiempo de exposición de únicamente 1 hora comenzando con 1 µg de ADN de levadura, sometiéndolo a. transferencia durante 2 horas, e hibridizando durante 4 a 8 horas con una sonda de 108 cmp/µg. Para un gen de mamíferos de una sola copia, un enfoque conservador sería iniciar con 10 µg de ADN, someter a transferencia durante la noche e hibridizar durante la noche en presencia de sulfato de dextrano 10% utilizando una sonda de más de 108 cpm/µg, lo que resulta en un tiempo de exposición de -24 horas. Existen varios factores que pueden alterar la temperatura de fusión (Tm) de un híbrido ADN-ADN entre la sonda y el fragmento de interés, y en consecuencia, las condiciones apropiadas para hibridación y lavado. En muchos casos la sonda no es 100% homologa al fragmento. Otras variables que se encuentran habitualmente incluyen la longitud y el contenido total de G+C de las secuencias hibridizantes así como la fuerza iónica y el contenido de formamida del amortiguador de hibridación. Los efectos de la totalidad de estos factores se pueden aproximar en una sola ecuación: Tm = 81 + 16.6(log10Ci) + 0.4[%(G + C)]-0.6(% de formamida) -600/n-l .5 (% de malpareamiento) . en donde Ci es la concentración salina (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido, en pares de bases (ligeramente modificado de Meinkoth & Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284). Al diseñar un experimento de hibridación, se pueden alterar de manera conveniente algunos factores que afecten la hibridación de ácido nucleico. La temperatura de la hibridación y los lavados de la concentración salina durante los lavados son los más fáciles de ajustar. Conforme se incrementa la temperatura de hibridación (es decir, la rigurosidad) , se vuelve menos probable que se produzca la hibridación entre cadenas que no son homologas y, como resultado disminuirá la interferencia. Si . la sonda radiomarcada no es completamente homologa al fragmento inmovilizado (como con frecuencia es el caso en la familia de genes y en experimentos de hibridación entre especies) , debe reducirse la temperatura de hibridación y aumentará la interferencia. La temperatura de los lavados afecta la intensidad de la banda de hibridación y el grado de interferencia de una manera similar. La rigurosidad de los lavados también aumenta al disminuir la concentración salina. En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida 50% son de 42 °C para una sonda que es de 95% a 100% homologa al fragmento objetivo, de 37°C para una homología de 90% a 95%, y de 32 °C para una homología de 85% a 90%. Para homologías menores, se debe disminuir el contenido de formamida y se debe ajustar la temperatura en consecuencia, utilizando la ecuación anterior. Si no se conoce la homología entre la sonda y el fragmento objetivo, la solución más sencilla es comenzar con condiciones tanto de hibridación como de lavado que no sean rigurosas. Si se observan bandas no específicas o una interferencia alta después de la autorradiografía, se puede lavar el filtro con condiciones de alta rigurosidad y se puede volver a exponer. Si no es práctico el tiempo necesario para realizar estas exposiciones, se pueden llevar a cabo pruebas en paralelo a varias hibridaciones y con diversas rigurosidades de lavado.

Identificación de la proteína meningocósica de 80-85 kDa Se observa que diversas preparaciones de vesícula de membrana exterior de N. meningi tidis serogrupo B contienen un componente de aproximadamente 80-85 kDa. Esta proteína se purifica a partir de geles de SDS-PAGE y se ha determinado la secuencia de la parte N-terminal (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) . Los anticuerpos generados contra la proteína purificada por SDS-PAGE dan reacción cruzada con proteínas equivalentes en más de 50 cepas de N. meningi tidis de diversos serogrupos y serotipos. También se ha observado reactividadj cruzada con N. gonorrhoeae, N. polysaccharia y N. lactamica . El suero posterior a la inmunización de pacientes vacunados también reacciona con la proteína. Se clonó el gen completo de N. meningi tidis serogrupo B (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) y se infirió la proteína codificada (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3) . Por comparación con el secuencias N-terminal descritas antes, se infirió la secuencia de la señal (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4) así como la secuencia madura (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5) .

Identificación de los genes correspondientes en N. meningitidis serogrupo A y N. gonorrhoeae ' En base en la secuencia de N. meningitidis serogrupo B, se clonaron y secuenciaron los genes correspondientes de N. meningi tidis serogrupo A y de N. gonorrhoeae .

En la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 se muestra el gen completo de serogrupo A de N. meningi tidis, con la proteína codificada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7. El péptido señal y la secuencia madura son las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 8 y 9. En la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10 se muestra el gen completo de N. gonorrhoeae, con la proteína codificada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11. El péptido señal y la secuencia madura son las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 12 y 13.

Comparación de secuencias Se comparan las secuencias proteínicas, y se descubre que son altamente homologas. La secuencia de N. meningi tidis serogrupo B y la secuencia de N. gonorrhoeae muestran 95.4% de identidad con una superposición de 797 aminoácidos: 20 30 40 50 60 orf21.pep MKLKQIASAMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFY PVKVGDTY?DTHGSA srf21ng.pep mK KiQiIiAmSALiMiMiLiGiImSPIiAFAiDMFTiIiQiDiImRVEiGiLiQiRiTmEPSmTVFi?MYLiPiVmKVGiDiTmY?DmTHGmSA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Orf21.pep IIKS YATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSL?ITGAKM Q?DAIKK?LESFGLAQ orf21ng .pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQL LTVIERPTIGSL?ITGAKMQ?DAIKK 1.ESFGAQ 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 srf21.pep SQYFNQATLNQAVAG KEEYLGRG LNIQITPKV KARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE iiiiiiiiMiMiiiimimiiiiiiiiimiimimimimiJiiiii orf 1ng .pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKNIQITP VTKliAR RVDIDITIDEGKSAKITDIE 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 o f21.pep FEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTW TRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL orf21ng .pep FEGNQVYSDRKI^MRQMSLTEGGIWTW TRSDRFDRQKFAQDMEKVTDFYQN GYFDFRII, 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 orf21.pep DTDIQT EDKTKQTI rTVHEe^.RFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKL TMKPGKWYERQQ 11111111111 : 111 i 1111111111 II 1111111 i 111111 II 11 II 111111111 i i I orf lng . ep DTDIQ NEDKTRQTIKITVHEGGRFRGKVSIEGDT EVPKAELEKLLTMKPGK YERQQ 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 orf 1.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT III I II lil III II I III 11 II lllll I II lllll lllll I INI 11 III 11 orf2lng .pep MTAV GEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAGTKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 orf21. ep RDEVVRRELRQMESAPYDTSKQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPD VDLNMS TE orf21ng.pep RDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVE LGYFDVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 orf21.pep RS GS DLSAGWVQDTGLVMSAGVSQD LFGTGKSAALRASRSKTTLNGSIiSFTDPYFTA orf21ng.pep RSTGSLD SAG VQDTGLVMSAGVSQDN FGTGKSAALRASRSKTTNGS SFTDPYFTA 430 " 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 orf21.pep DGVSLGYDVYGKAFDPRKASTS1KQYKT TAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVN 11 II 1111 : 1 II 1111111111 111111111 •• 1 : 11 « : 111111111111 : 11111111 srf 21ng . pep DGVSIK3YDIYGKAFDPRKASTSVKQYKTTTAGGGVW1GIPV EYDRVNFGIAAEHL VNT 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 or f 21. pep YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGW YKGTVG GRNKTDSAri PTRGYLTGVNAEIA 1111111111111 II I 111111111111 II I orf21ng.pep YNKAPKRYADFIRKYGKTDGADGSFKGI.LYKGTVGWGR KTDSAS PTRGYTGVNAEIA 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 orf21.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGG GSVR miiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiijiimmiiiiiiiiinim or£21ng.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFT MLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 orf 21. pep GYESGT GPI<?YDEYGEKISYGGNKKANVSAE FPMPGAKlAR VRLSLFADAGSVWDG iiii iiiiimmniiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiimiiiimipiii orf21ng.pep GYESGT GPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAE LFPMPGAKDARTVR SLFADAGSVWDG 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 orf21.pep KTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGP KFSYAYP KK 'II »H :| ------ \ -- 1 = 1111 II 111111111111111111111111111111 orf21pg.pep RTY TAAENGNNKSVYSE-NAHKSTFTNE RYSAGGAVTWLSP GPMKFSYAYPLKK 730 740 750 760 . 770 790 orf21.pep KPEDEIQRFQFQLGTTF orf21ng.pep KPEDEIQRFQFQLGTTFX 780 790 Las secuencias de N. meningitidis serogrupo A y B muestran 99.9% de identidad en una superposición de 797 aminoácidos: 20 30 40 50 60 orf21.pep MK KQIASAIJ4MlX3ISPI?tM3FTIQDlRVEG QRTEPSTVFMYLPVKVGDTY?DTHGSA orf21a .pep M iKimKQIiAiSnAiMhVLMGIiSiPmLALiAmDFTiIiQmDIRiVmEGiQiRiTiEiPiSmTVFm?YLmPVKmVGDmYiDmTHGmSA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 orf21. ep IIKS YAGFFDDVRVETADGQ LLTVIERPTIGS?I GAKM Q?DAIKK?LESFGLAQ miiiMiiimiMimiiiiiiMiiiiiiiiiiiiiimimiiiiiiiiii orf21a.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSL?ITGAKMQ?T?IKK LESFGLAQ 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 orf21.pep SQYF?QATL?QAVAG KEEYLGRGK IQITPKV KLARRVDIDITIDEGKSAKITDIE orf21a.pep S IQIYIFI?IQIAMTLI?MQAIVIAIGILIKIEIEIYILIGIRIsIKII?IIIQIIITIPlKiVllKiLpARilRlVlDlIlDlIlTlIlDlElGlKMSAIKIIITIDIIIEI 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 orf21.pep FEG?QVYSDRKIjMRQMSLTEGGIWrWLTRS?QF?EQKFAQDMEKVTDFYQ??sYFDFRIIi IIMMIIIMII IIIMIIIMIMI MMIIIIMMIMII MJIIIIIMMMM orf2la .pep FEG?QVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTW TRS?QF?EQKFAQDMEKVTDFYQ??GYFDFRIli 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 orf21.pep DTDIOT?EDKTKQTIKITVHEGGRFR GKVSIEGD?EVPKAELEK LTMKPGKWYERQQ orf 2 la . pep I^DIQ ?EDKTKQTIKIIVHEGGRFR GKVSIEGDT?EVPKAE EK L MKPGK YERQQ 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 orf 21.pep MTAV GEIQ RMGSAGYAYSEISVQP P?AETKTVDFVLHIEPGRKIYV?EIHITG??KT miiimimmiiiiiiimiMiimmimiimmimiiiiiii orf21a .pep MTAVGEIQ RMGSAGYAYSEISVQP P?AETKVDFVLHIEPGRKIYV EIHITG??KT 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 orf21.pep RDEWRRELRQMESAPYDTSÍCI.QRSKERVE LGYFDNVQFDAVPIAGTPDKVDLNMSLTE orf 2 l . pep R mDEViViRiRiEimRQMmESAmPYDiTiSMKIiiQiRmSKEmRVEimLGYiFiDiNiViQmFDAmVPiAiGmTPDiKmVDLiNiMiSmTEi 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 orf 21. pep RSTGSLDLSAGWQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALPASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA iiimmimmiiimmiiiniMiiiiiiiiiimimiimiiiii orf21a. ep RSTGSLD SAGWVQDTGLVMSAGVSQDN FGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA 430 440 450 460 470 480 490 500 510 , 520 530 540 orf21.pep DGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFG VAEH TV T orf21 .pep DGVS GYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTT AGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 orf21.pep YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKG LYKGTVGWGRNKTDSA WPTRGY GVNAEIA iimiiiunmiiiiiiiminimiiiiiimmiiiimiiiiiiiii orf21a .pep YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVG GRNKTDSA PTRGYLTGVNAEIA 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 orf21.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLM GGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR orf21a .pep LPGSK QYYSATHNQ WFFP SKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFE FYGGGLGSVR 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 orf21.pep GYESGT GPKVYDEYGEKISYCMNKKAVSAE LFPMPGAKDARTVRLS FADAGSVW8 orf21a.pep GYESG I?PK YDEYGEKIS GsNKKA^WSAE FPMPsAKDAR VRLSLFADAGSVWDG 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 orf21. ep KTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGN HKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK orf21 .pep KTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNE RYSAGGAVTWLSP GPMKFSYAYP KK 730 740 750 760 770 780 790 orf21.pep KPEDE?QRFQFQ GTTF IIIIMIIIIMIMII orf21a. ep KPEDEIORFQFQ GTTFX 790 El alto grado de conservación sugiere que una sola proteína puede ser capaz de inducir respuestas inmunitarias contra diversas especies de Neisseriae.

Vacunas Se expresan 3 proteínas identificadas antes y se utilizan para inmunización. Se observan buenas respuestas inmunitarias contra las proteínas.

Vacunas combinadas Además, cada una de las proteínas se combinó con antígenos contra otros organismos patógenos (por ejemplo la vacuna de polisacárido de Chiron contra meningitis serogrupo C) , y se utilizaron para inmunización. Se observaron buenas respuestas inmunitarias.

Componentes adicionales de NmB Aunque es eficaz, la protección inducida por la vacuna de OMV Norwegian se restringe a la cepa utilizada para elaborar la vacuna. Los ensayos clínicos y la vacuna obtienen una eficacia de sólo 57.2% después de 29 meses en adolescentes, aunque las respuestas de IgG se observan en casi 100% de los pacientes [por ejemplo, Rosenqyist et al. (1995) Infect . Immun . 63:4642-4652]. Sorprendentemente, se ha encontrado que la adición de componentes definidos adicionales a la vacuna OMV Norwegian amplía significativamente su eficacia. La vacuna Norwegian no induce protección contra NmB cepa 2996. Se agregan proteínas definidas de la cepa 2996 a la vacuna Norwegian, y se ha demostrado que la eficacia de la vacuna aumenta en un grado sorprendente. Además, la adición de un antígeno conjugado a polisacárido de NmC [por ejemplo Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698] proporciona excelentes resultados. En la siguiente tabla se muestran las actividades bactericidas de las combinaciones: * Se utilizan tres antígenos NmB diferentes: #1: ORF1 - por ejemplo, ejemplo 77 de W099/24578 (véase también W099/55873) #2: proteína '287' - por ejemplo figura 21 de WO99/57280 (véanse también las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 3103 a 3108) #3: una mezcla, en Al (OH) 3 de #1, #2 y la proteína '919' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 14 en la Á< presente; véase también WO99/57280 figura 23 y las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 3069 A 3074 en la presente) . Se puede ver fácilmente que __ la ineficacia de la vacuna OMV Norwegian contra la cepa 2996 (grupo 1) se puede x> . y resolver al agregar antígenos definidos de la cepa 2996. Los cepas diferentes. - t Esta vacuna también ofrece protección contra cepas "'- ' * .. .-*_ MenB heterólogas. Las mismas vacunas, preparadas utilizando ... i las proteínas de la cepa 2996, se prueban contra cinco de * * , -otras estirpes. Los títulos fueron los siguientes: * Controles: estirpes 2996, BZ133 & 1000 = las OMV preparadas a partir de la estirpe homologa; t estirpe BZ232 = las OMV preparadas a partir de 2996; MC58 & NGH38 = SEAM3 Un segundo estudio suplementado con las OMV "Norwegian" con proteínas de NmB estirpe 2996: - prote?na 919, expresada en E. coli sin ningún asociado de fusión - ORF1, expresado en E. coli como fusión etiquetada con His - Proteína 287, expresada en E. coli como una fuaión de GST Una mezcla de estas tres proteínas, opcionalmente con el conjugado NmC. Las preparaciones se preparan con adyuvante con Al (OH) 3 y se prueban contra la cepa homologa utilizando el ensayo bactericida. Los resultados son los siguientes: * los anticuerpos son bacterioestáticos, no bactericidas Trabajo adicional con el antígeno 287 Se investigaron adicionalmente las combinaciones de las OMV Norwegian con el antígeno 287. Se combinan 20 µg del antígeno 287 con la vacuna OMP Norwegian (15 µg OMP + Al (OH3) ) y se utiliza para inmunizar ratones. Se prueban los anticuerpos en el ensayo bactericida y son efectivos contra todas las cepas probadas. Los resultados fueron como sigue: En casi todos los casos, por lo tanto, la combinación de las OMV + proteína 287 sorprendentemente proporciona mejores resultados en comparación con las OMV solas .

OMV Recombinantes Se transforma E. coli para expresar ORF1, ORF40 y ORF46. Las OMV preparadas a partir de_ E. coli recombinante son capaces de inducir anticuerpos bactericidas contra N. meningi tidis . La ORF1, ORF40 y ORF46 (estirpe 2996) se expresan como fusiones etiquetadas con His en E. coli y se preparan ya sea como proteínas puras o en forma de OMV. Los títulos bactericidas contra ambas preparaciones se prueban utilizando la estirpe 2996 como exposición: Los títulos bactericidas utilizando cepas de exposición heteróloga también se miden. 0RF46 proporciona un título contra la estirpe MC58 de 4096 en forma pura, pero esto aumenta a 32000 cuando está en forma de OMV. El ORF1 proporciona un título contra NmA estirpe F6124 de 128 en forma pura, pero esto aumenta a 512 cuando está en forma de OMV. ORF40 proporciona un título contra la estirpe MC58 de 512 en forma pura, pero se duplica cuando está en forma de OMV. Estos datos muestran que _los antígenos NmB retienen inmunogenicidad cuando se preparan en E. coli como OMV y, además, que la inmunogenicidad en realidad aumenta. Se comprenderá que esta solicitud describe la invención a modo de ejemplo únicamente y que pueden realizarse modificaciones y aún estar dentro del alcance y espíritu de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición, caracterizada porque comprende: (a) preparación de membrana exterior de N. meningi tidis serogrupo B, y (b) un componente inmunogénico que se selecciona de uno o más de los siguientes: una proteína descrita en WO99/57280, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/36544, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/24578, o un fragmento inmunogénico de la misma; • una proteína descrita en W099/66791, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en Tettelin et al . [Science (2000) 287:1809-1815], o un fragmento inmunogénico de la misma; • una proteína descrita en W097/28273, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W096/29412, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en WO95/03413, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/31132, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/58683, o un fragmento inmunogénico de la misma; • una proteína descrita en W099/55873, o un fragmento inmunogénico de la misma; o • Proteína PorA, TbpA, TbpB, PilC, OpA, Omp85 de Neisseria meningitidis .
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente (b) es una proteína NmB.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína NmB es la proteína 919, la proteína 235, la proteína 519, la proteína 225, la proteína ORF40, la proteína 287, ORF 1, ORF4 u 0RF46.
4. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el componente (b) incluye una proteína de una estirpe diferente de NmB de la que se deriva el componente (a) .
5. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque uno o más de sus componentes se adsorben en Al (OH) 3.
6. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el componente (a) comprende las OMV.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque las OMV son un extracto de desoxicolato de NmB.
8. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el componente (a) se adsorbe en A1(0H)3.
9. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende además uno o más de los siguientes componentes : un antígeno protector contra Neisseria meningi tidis serogrupo A; un antígeno protector contra Neisseria meningi tidis serogrupo C; un antígeno protector contra Neisseria meningitidis serogrupo Y; un antígeno protector contra Neisseria meningi tidis serogrupo W; un antígeno protector contra Heamophilus influenzae; un antígeno protector contra pneumococcus ; un antígeno protector contra difteria; un antígeno protector contra tétanos; un antígeno protector contra tosferina; un antígeno protector contra Helicobacter pylori ; • un antígeno protector contra polio; o • un antígeno protector contra virus de hepatitis B.
10. La composición, de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la composición es una vacuna.
11. La composición, de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque se utiliza como un medicamento.
12. El uso de la composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en la elaboración de: (i) un medicamento para tratar o evitar infecciones debidas a bacterias neiseriales; (ii) un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de bacterias neiseriales o de anticuerpos generados contra bacterias neiseriales; o (iii) un reactivo el cual genera anticuerpos contra bacterias neiseriales .
13. Un método de tratamiento para un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
14. Una preparación de membrana exterior bacteriana, caracterizada porque comprende un componente inmunogénico que se selecciona de uno o más de los siguientes: una proteína descrita en WO99/57280, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/36544, o un fragmento inmunogénico de la misma; - una proteína descrita en W099/24578, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/66791, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en Tettelin et al. [Science (2000) 287:1809-1815], o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W097/28273, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W096/29412, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita sn WO95/03413, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/31132, o un fragmento inmunogénico de la misma; • una proteína descrita^ en W099/58683, o un fragmento inmunogénico de la misma; una proteína descrita en W099/55873, o un fragmento inmunogénico de la misma; o • Proteína PorA, TbpA, TbpB, PilC, OpA, Omp85 de Neisseria meningi tidis . RESUMEN DE LA INVENCION proporciona una composición que comprende: (a) vesículas de membrana exterior (OMV, por sus siglas en inglés) de Neisseria meningi tidis serogrupo B, y (b) un componente inmunogénico que se selecciona de otras proteínas de Neisseria o fragmentos inmunogénicos de las mismas. El componente (b) preferiblemente incluye una proteína de una cepa diferente NmB a partir de la cual se deriva la OMV del componente (a) . Las OMV preferiblemente se obtienen por extracción con desoxicolato. Opcionalmente, la composición también puede comprender un antígeno protector contra otros patógenos . £>2> ?62 LISTA DE SECUENCIAS <110> CHIRON SpA <120> Vacuna de vesícula de membrana exterior que comprende proteínas de Neisseria meningitidis serogrupo B. <130> P023785 O <140> <141> 2001-01-17 <150> GB-0001067.8 <151> 2000-01-17 <150> GB-0005699.4 <151> 2000-03-09 <160> 14 <170> Se?[Win 9, versión 1.02 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1 Asp Phe Thr He Gln Asp He Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr 1 5 10 15 <210> 2 <211> 2394 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 2 atgaaactga aacagattgc ttccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc tttggcactt 60 gccgacttca ccatccaaga catccgcgtc gaaggcttgc agcgtaccga gcsgagtacc 120 gtattoaact asctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc 180 atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgcgtcga aactgcggac 240 gggcagc cc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc 300 gcaaaaatgc tgcaaaacga cgccattaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag 360 tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaat caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac 420 ctcgggcgcg gcaaactcaa tatscaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac 480 cgcgtcgaca tcgacatcac gat gacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa 540 tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcaaatgtc cctgaccgaa 600 ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc aaccaattca acgagcagaa atttgcccaa 660 gatatggaaa aagtaaccga cttctaccaa aataacggct acttcgattt ccgtatcctc 720 gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac 780 gaaggcggac gtttccgttg gggcaaagtc tccatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc 840 aaagccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag 900 atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc 960 gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgct gaaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac 1020 atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac gaaatacaca tcaccggcaa caacaaaacc 1080 cgcgacgaag tcgtccgccg tgaattacgc caaatggaat ccgcacctta cgacacctcc 1140 aagctgcaac gttccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa tgtccagttt 1200 gatgctgtcc cgcttgccgg cacgcccgac aaagtcgatt tgaacatgag tctgaccgaa 1260 cgttccaccg gttccctgga tttgagcgcg ggttgggttc aagataccgg gttggtcatg 1320 tccgcaggcg tttcccaaga caacctgttc ggtacgggca agtcggccgc actgcgcgcc 1380 tccaggagca aaaccacgct taacggctcg ctgtcgttta ctgacccgta cttcacggca 1440 -2- gacggggtca gcctgggcta cgatgtttac ggaaaagcct tcgacccgcg caaagcatcg 1500 accagcatca aacaatataa aaccaccacg gcaggcgcag gcatccgcat gagcgtgcct 1560 gttaccgaat acgaccgcgt gaatttcggt ttggtggcag aacacctgac cgtcaacacc 1620 tacaacaaag cgcccaaaca ctatgccgac tttatcaaga aatacggcaa aaccgacggc 1680 acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac aaaggtaccg tcggctgggg gcgcaacaaa 1740 accgacagcg cgttatggcc gacgcgcggc tacctgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc 1800 ctgcctggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc 1860 ctgagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc 1920 agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc 1980 ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa gtctatgacg aatacggcga aaaaatcagc 2040 tacggcggca acaaaaaagc caacgtctcc gccgagctgc tcttcccgat gcccggcgcg 2100 aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggacggc 2160 aaaacctacg acgacaacag cagttccgcg accggcggca gggttcaaaa catttacggc 2220 gccggcaata cccataaatc cacctttacc aacgaattgc gctattccgc cggcggcgcg 2280 gttacctggc tctcgccttt aggcccgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa 2340 aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt ctaa 2394 <210> 3 <211> 797 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3 Met Lys Leu Lys Gln He Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly He Ser 1 5 10 15 Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr He Gln Aep He Arg Val Glu Gly 20 25 30 Leu Gln Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys 35 40 45 Val Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala He He Lys Ser 50 55 60 Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp 65 70 75 80 Gly Gln Leu Leu Leu Thr Val He Glu Arg Pro Thr He Gly Ser Leu 85 90 95 Asn He Thr Gly Ala Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala He Lys Lys Asn 100 105 110 Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr 115 120 125 Leu Asn Gln Ala Val Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly 130 135 140 Lys Leu Asn He Gln He Thr Pro Lys Val Thr Lye Leu Ala Arg Asn 145 150 155 160 Arg Val Asp He Asp He Thr He Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys He 165 170 175 Thr Asp He Glu Phe Glu Gly Asn Gln Val Tyr Ser Asp Arg Lys Leu 180 185 190 Met Arg Gln Met Ser Leu Thr Glu Gly Gly He Trp Thr Trp Leu Thr -3- 195 200 205 Arg Ser Asn Gln Phe Asn Glu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys 210 215 220 Val Thr Asp Phe Tyr Gln Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg He Leu 225 230 235 240 Aep Thr Asp He Gln Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gln Thr He Lys 245 250 255 He Thr Val His Glu Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lye Val Ser He 260 265 270 Glu Gly Asp Thr Asn Glu Val Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu 275 280 285 Thr Met Lys Pro Gly Lys Trp Tyr Glu Arg Gln Gln Met Thr Ala Val 290 295 300 Leu Gly Glu He Gln Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser 305 310 315 320 Glu He Ser Val Gln Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp 325 330 335 Phe Val Leu His He Glu Pro Gly Arg Lys He Tyr Val Asn Glu He 340 345 350. His He Thr Gly Asn Asn Lye Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu 355 360 365 Leu Arg Gln Met Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gln Arg 370 375 380 Ser Lys Glu Arg Val Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Val Gln Phe 385 390 395 400 Asp Ala Val Pro eu Ala Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu Asn Met 405 410 415 Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp 420 425 430 Val Gln Asp Thr Gly Leu Val Met Ser Ala Gly Val Ser Gln Asp Asn 435 440 445 Leu Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys 450 455 460 Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala 465 470 475 480 Asp Gly Val Ser Leu Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Pro 485 490 495 Arg Lys Ala Ser Thr Ser He Lys Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly 500 505 510 Ala Gly He Arg Met Ser Val Pro Val Thr Glu Tyr Asp Arg Val Asn 515 520 525 Phe Gly Leu Val Ala Glu His Leu Thr Val Asn Thr Tyr Asn Lys Ala 530 535 540 Pro Lys His Tyr Ala Asp Phe He Lys Lys Tyr Gly Lys Thr Asp Gly 545 550 555 560 Thr Asp Gly Ser Phe Lys Gly Trp Leu Tyr Lys Gly Thr Val Gly Trp 565 570 575 Gly Arg Asn Lys Thr Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu 580 585 590 Thr Gly Val Asn Ala Glu He Ala Leu Pro Gly Ser Lys Leu Gln Tyr 595 600 605 Tyr Ser Ala Thr His Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr 610 615 620 Phe Thr Leu Met Leu Gly Gly Glu Val Gly He Ala Gly Gly Tyr Gly 625 630 635 640 Arg Thr Lys Glu He Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu 645 650 655 Gly Ser Val Arg Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr 660 665 670 Asp Glu Tyr Gly Glu Lys He Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn 675 680 685 Val Ser Ala Glu Leu Leu Phe Pro Met Pro Gly Ala Lys Asp Ala Arg 690 695 700 Thr Val Arg Leu Ser Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Val Trp Asp Gly 705 710 715 720 Lys Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gln 725 730 735 Asn He Tyr Gly Ala Gly Asn Thr His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu 740 745 750 Leu Arg Tyr Ser Ala Gly Gly Ala Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly 755 760 765 Pro Met Lys Phe Ser Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp 770 775 780 Glu He Gln Arg Phe Gln Phe Gln Leu Gly Thr Thr Phe 785 790 795 <210> 4 <211>- 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 4 Met Lys Leu Lys Gln He Ala Ser Ais Leu Met Met Leu Gly He Ser -5- 10 15 Pro Leu Ala Leu Ala 20 <210> 5 <211> 776 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 5 Asp Phe Thr He Gln Asp He Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr Glu 1 5 10 15 Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys Val Gly Asp Thr Tyr 20 25 30 Asn Asp Thr His Gly Ser Ala He He Lys Ser Leu Tyr Ala Thr Gly 35 40 45 Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp Gly Gln Leu Leu Leu 50 55 60 Thr Val He Glu Arg Pro Thr He Gly Ser Leu Asn He Thr Gly Ala 65 70 75 80 Lys Met Leu Gln Asn Aep Ala He Lys Lys Asn Leu Glu Ser Phe Gly 85 90 95 Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr Leu Asn Gln Ala Val 100 105 110 Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly Lys Leu Asn He Gln 115 120 125 He Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn Arg Val Asp He Asp 130 135 140 He Thr He Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys He Thr Asp He Glu Phe 145 150 155 160 Glu Gly Asn Gln Val Tyr Ser Asp Arg Lys Leu Met Arg Gln Met Ser 165 170 175 Leu Thr Glu Gly Gly He Trp Thr Trp Leu Thr Arg Ser Asn Gln Phe 180 185 190 Asn Glu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys Val Thr Asp Phe Tyr 195 200 205 Gln Asn Aen Gly Tyr Phe Asp Phe Arg He Leu Asp Thr Asp He Gln 210 215 220 Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gln Thr He Lys He Thr Val Hie Glu 225 230 235 240 Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Val Ser He Glu Gly Asp Thr Asn 245 250 255 Glu Val Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu Thr Met Lys Pro Gly 260 265 270 Lys Trp Tyr Glu Arg Gln Gln Met Thr Ala Val Leu Gly Glu He Gln 275 280 285 Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser Glu He Ser Val Gln 290 295 300 Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp Phe Val Leu His He 305 310 315 320 Glu Pro Gly Arg Lye He Tyr Val Aen Glu He His He Thr Gly Asn 325 330 335 Asn Lys Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu Leu Arg Gln Met Glu 340 345 350 Ser 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Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu Thr Gly Val Asn Ala 565 570 575 Glu He Ala Leu Pro Gly Ser Lys Leu Gln Tyr Tyr Ser Ala Thr His -7- 580 585 590 Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr Phe Thr Leu Met Leu 595 600 605 Gly Gly Glu Val Gly He Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Thr Lys Glu He 610 615 620 Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu Gly Ser Val Arg Gly 625 630 635 640 Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr Asp Glu Tyr Gly Glu 645 650 655 Lye He Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn Val Ser Ala Glu Leu 660 665 670 Leu Phe Pro Met Pro Gly Ala Lys Asp Ala Arg Thr Val Arg Leu Ser 675 680 685 Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Val Trp Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Asp 690 695 700 Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gln Asn He Tyr Gly Ala 705 710 715 720 Gly Asn Thr His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu Leu Arg Tyr Ser Ala 725 730 735 Gly Gly Ala Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly Pro Met Lys Phe Ser 740 745 750 Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Aep Glu He Gln Arg Phe 755 760 765 Gln Phe Gln Leu Gly Thr Thr Phe 770 775 <210> 6 <211> 2379 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 6 atgaaactga aacagattgc ctccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc tttggcattt 60 gccgacttca ccatccaaga catccgtgtc gaaggcttgc agcgtaccga gccgagcacc 120 gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc 180 atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgagtcga aactgcggac 240 gggcagcttc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc 300 gccaaaatgc tgcaaaacga cgccatcaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag 360 tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaac caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac 420 ctcgggcgtg gcaaactcaa tatccaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac 480 cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa 540 tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcagatgtc gctgaccgaa 600 ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc gaccggttcg accgccagaa attcgcccaa 660 gacatggaaa aagtaaccga cttctaccag aacaacggct acttcgattt ccgtatcctc 720 gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaggcaga ccatcaaaat caccgtccac 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