CN101356274A - 脑膜炎球菌nmb1870的嵌合型、杂交和串联多肽 - Google Patents

Abstract

NMB1870是脑膜炎奈瑟球菌的一种蛋白质。已知NMB1870有三个家族。为增强NMB1870蛋白质引发在家族之间有交叉反应性的抗体的能力，工程改造了NMB1870。可用一个NMB1870家族的序列取代另一家族的相应位置。不同家族的NMB1870蛋白质序列可彼此相连。

Description

脑膜炎球菌NMB1870的嵌合型、杂交和串联多肽

本文引用的所有文件通过引用全文纳入。

技术领域

本发明属于免疫接种，特别是免疫接种抵御奈瑟球菌(Neisseria)属，例如脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)(脑膜炎球菌)病原菌所致疾病的领域。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是荚膜革兰氏阴性细菌，其寄居在约10％人群的上呼吸道中。虽然已有抗血清群A、C、W135和Y的多糖和偶联物疫苗，但该方法不能应用于血清群B，因为其荚膜多糖是聚唾液酸的聚合物，是一种人体自身抗原。现已利用外膜囊泡(OMV)中所含的表面暴露蛋白来开发抗血清群B的疫苗。这些疫苗能引发血清杀细菌抗体应答并提供保护以抵御疾病，但它们不能诱导交叉菌株保护作用[1]。因此，一些研究人员将注意力集中在疫苗所用的特定脑膜炎球菌抗原上[2]。

一种这样的抗原是“NMB1870”。该蛋白质最初披露为菌株MC58的蛋白质“741”[参考文献3中的SEQ ID 2535和2536；本文SEQ ID 1]，也称为“GNA1870”[参考文献4-6，根据参考文献2]和“ORF2086”[7-9]。该脂蛋白在所有脑膜炎球菌血清群中表达，也见于多种脑膜炎球菌菌株中。NMB1870序列分成三个家族(在本文中称为家族I、II和III)，发现针对某给定家族的抗血清在同一家族中具有杀菌活性，但对于表达其它两家族之一的菌株无此活性，即具有家族内交叉保护作用，但不具有家族间保护作用。

因此，为利用NMB 1870实现交叉菌株保护作用，利用了多个家族的此蛋白。有人提出可将不同家族蛋白表达成杂交蛋白[10-12]，包括将两种或三种所述家族中的此蛋白表达在一条多肽链中，从而无需分别表达和纯化蛋白质。检验了几种杂交体，得到令人鼓舞的抗脑膜炎球菌效力。

本发明的目的之一是提供其它改进方法来克服NMB1870所致保护作用的家族特异性，并利用这些方法来提供抵御脑膜炎球菌疾病和/或感染，特别是血清群B的免疫力。

发明内容

作为补充参考文献13所述的工作，本发明人用一个家族的NMB1870序列取代入另一家族的相应位置，其目的是产生不具有野生型多肽的家族特异性的嵌合型NMB1870。

除了工程改造一种NMB1870使之具有所有三个家族的特征，本发明人还制备了包含多个家族的NMB1870序列的新杂交多肽和串联多肽，从而补充了参考文献10和12所述的工作。

虽然各家族的NMB1870多肽能引发仅对同一NMB1870家族内的菌株有效的抗体(例如，在小鼠中)，但本发明的嵌合型杂交和串联多肽能引发识别多个家族的NMB1870多肽的抗体。

本发明还鉴定了NMB1870的各种新的多态性形式，包括与以前报道的三种家族不同的序列(家族IV)。

NMB1870家族取代

参考文献13披露了将一个NMB1870家族的序列取代入另一NMB1870框架中，从而产生了嵌合型NMB1870多肽。本发明人对杂交体实施了进一步研究，鉴定到在家族I NMB1870序列中进行取代的许多关键残基。这些残基的取代可以提高此多肽引发能与家族II多肽交叉反应的抗体的能力。

因此，本发明提供包含与SEQ ID NO：57有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个以下残基被另一氨基酸取代或删除：F14；T16；Q18；Q20；D21；S22；E23；H24；S25；G26；K27；K31；Q33；R35；136；G37；139；K48；E51；G52；R54；T56；A67；G68；K70；T72；A78；A79；N83；K85；D97；D102；P105；G107；R109；S114；S116；L118；N120；Q121；A122；K135；T147；V148；N149；G150；1151；R152；H153。

优选以下残基中至少一个倍被取代：F14；T16；Q18；K31；Q33；R35；136；G37；139；T56；K70；T72；A78；A79；K85；D97；D102；S114；S116；L118；K135。参考文献13未选择这些残基中的任一个进行取代。

优选进行取代或删除的氨基酸是：F14；T16；Q18；Q20；D21；S22；E23；H24；S25；G26；K27；K31；Q33；R35；136；G37；K48；E51；G52；R54；T72；A79；K85；P105；G107；R109；L118；N120；Q121；A122；T147；V148；N149；G150；1151；R152；H153。优选取代这些残基，而优选删除E51。

优选用家族II或III的NMB1870中相应氨基酸来取代所述残基。因此，优选的取代是：F14L；T16I；Q18K；Q20N；D21N；S22P；E23D；H24K；S25I；S25T；G26D；K27S；K31Q；Q33S；R35L；I36V；G37S；I39L；K48Q；G52D；R54K T56E；A67P；G68N；K70R；T72H；A78T；A79K；N83H；N83Y；K85R；D97E；D102E；P105A；G107E；R109S；S114L；S116D；L118R；N120G；Q121S；A122E；K135R；T147I；V148G；N149E；G150K；I151V；R152H；H153E。该清单中只有残基25和83具有一个以上的优选取代残基，因为所有其它残基在家族I、II和III的两个家族中具有相同的氨基酸。

所述氨基酸序列与SEQ ID NO：57有至少70％相同性，例如≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或更高。该序列可以是更大序列的一部分。

给予宿主动物后，该多肽能诱导杀细菌的抗-脑膜炎球菌抗体，在优选的实施方式中，该多肽能诱导抵御三个NMB1870家族I-III中各家族菌株的杀细菌抗体。下文给出了杀细菌应答的其它信息。

一种优选的氨基酸序列是SEQ ID NO：58，与SEQ ID NO：57相比，其以下残基被取代：F14；T16；Q18；Q20；D21；S22；E23；H24；S25；G26；K27；K31；Q33；R35；136；G37；K48；G52；R54；T72；A79；N83；K85；P105；G107；R109；L118；N120；Q121；A122；T147；V148；N149；G150；1151；R152；H153。残基E51被删除。

另一取代的序列是SEQ ID NO：59。另一取代的序列是SEQ ID NO：60。

用于取代的表面环

已鉴定的SEQ ID NO：1表面环为：(1)氨基酸164-168；(2)氨基酸179-182；(3)氨基酸188-196；(4)氨基酸203-208；(5)氨基酸216-224；(6)氨基酸233-237；(7)氨基酸247-251；和(8)氨基酸262-263。

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通过比对SEQ ID NO：1与任何其它NMB1870序列，技术人员能鉴定出该序列中环(1)-(8)的位置。然而，为便于引用，本文将环的坐标定义为NMB1870序列中一个或多个氨基酸的串，在采用两两比对算法与SEQ ID NO：1比对时，所述氨基酸串始于和以上SEQ ID NO：1中所鉴定环的第一个氨基酸残基比对的氨基酸，终于以上SEQ ID NO：1中所鉴定环的最后一个氨基酸。

用一个家族的环序列取代入另一家族该环位置能产生具有多家族抗原性的嵌合型NMB1870。

因此，本发明提供含有NMB1870第一家族的氨基酸序列修饰的多肽，其中所述修饰的序列包含NMB1870第二家族的至少1个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)表面环序列替代了第一家族的表面环序列。

本发明还提供包含分成九部分的骨架序列的多肽，骨架序列中具有插入的八个环(骨架序列的各连续部分之间有一个)，其中至少一个所述环序列取自不同于该骨架序列的NMB1870家族的NMB1870序列。优选利用一个以上不同NMB1870序列的表面环，可将这些环插入一条骨架序列中，因此，本发明提供含有以下氨基酸序列的多肽：

-B₁-L₁-B₂-L₂-B₃-L₃-B₄-L₄-B₅-L₅-B₆-L₆-B₇-L₇-B₈-L₈-B₉-

其中：

(a)所述B₁、B₂、B₃、B₄、B₅、B₆、B₇、B₈和B₉各自是：(i)SEQ ID NO：M的片段；或(ii)与(i)所述片段有至少m％序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少d个连续氨基酸的片段的氨基酸序列；

(b)所述L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆、L₇和L₈各自是：(i)SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和/或SEQ ID NO：3的片段；或(ii)与(i)所述片段有至少n％序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少e个连续氨基酸的片段的氨基酸序列，

前提是，所述L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆、L₇和L₈中至少一个不是SEQ IDNO：M的片段。

本发明还提供所述多肽的片段，只要所述片段包含L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆、L₇和/或L₈中的至少一个，和B₁、B₂、B₃、B₄、B₅、B₆、B₇、B₈和B₉中两个或多个的至少一个氨基酸。因此，在一些实施方式中，最小的片段包含一个环，与该环N末端相连的一个氨基酸和与该环C末端相连的一个氨基酸。

M值选自1、2或3，B₁、B₂、B₃、B₄、B₅、B₆、B₇、B₈和B₉以及L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆、L₇和L₈的定义取决于M值而不同。

“(i)SEQ ID NO：M的片段”的意义如下所示：

类似地，“(iii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的片段”如下定义：

例如，本发明提供包含以下氨基酸序列的多肽：

-B₁-L₁-B₂-L₂-B₃-L₃-B₄-L₄-B₅-L₅-B₆-L₆-B₇-L₇-B₈-L₈-B₉-

其中：B₁是SEQ ID NO：1的氨基酸1-163，或其氨基酸序列与所述氨基酸1-163有至少m％序列相同性和/或包含所述氨基酸1-163的至少d个连续氨基酸的片段；B₂是SEQ ID NO：1的氨基酸169-178，或其氨基酸序列与所述氨基酸169-178有至少m％序列相同性和/或包含所述氨基酸169-178的至少d个连续氨基酸的片段...B₉是SEQ ID NO：1的氨基酸264-274，或其氨基酸序列与所述氨基酸264-274有至少m％序列相同性和/或包含所述氨基酸264-274的至少d个连续氨基酸的片段；L₁是SEQ ID NO：2的氨基酸164-168，或其氨基酸序列与所述氨基酸164-168有至少n％序列相同性和/或包含所述氨基酸164-168的至少e个连续氨基酸的片段；L₂是SEQ ID NO：2的氨基酸179-182，或其氨基酸序列与所述氨基酸179-182有至少n％序列相同性和/或包含所述氨基酸179-182的至少e个连续氨基酸的片段...L₇是SEQ ID NO：2的氨基酸269-270；或其氨基酸序列与所述氨基酸269-270有至少n％序列相同性和/或包含所述氨基酸269-270的至少e个连续氨基酸的片段；等等。

m值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。n值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。d值选自6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、45、50、60、70、75、100或更高。e值选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。e值优选小于20。

本发明还提供了包含如上所述的以下嵌合型氨基酸序列的多肽：

-B₁-L₁-B₂-L₂-B₃-L₃-B₄-L₄-B₅-L₅-B₆-L₆-B₇-L₇-B₈-L₈-B₉-

在所述嵌合型序列的N-末端或C-末端还包含NMB1870序列，其中所述NMB1870序列与SEQ ID NO：M的NMB1870序列家族相同。因此，所述多肽包含(i)某特定家族的NMB1870和(ii)同一家族但含不同NMB1870家族的其至少一个表面环取代的NMB1870。

本发明提供了包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：Q的总序列相同性为q％，其中：q值至少为r；在SEQ ID NO：Q的骨架区，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：Q的序列相同性大于q％；在SEQ ID NO：Q的环区域，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：Q的序列相同性小于q％。r值选自80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和99.5。

Q值是1、2或3，环区域和骨架区域的边界从上表相应地选择(L₁-L₈是环，B₁-B₉是骨架)。

如果Q是1，环区域中的氨基酸序列可与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的相应环区域具有大于q％的序列相同性。如果Q是2，环区域中的氨基酸序列可与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的相应环区域具有大于q％的序列相同性。如果Q是3，环区域中的氨基酸序列可与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的相应环区域具有大于q％的序列相同性。

杂交和串联多肽

参考文献10-13披露其中一条肽链包含NMB1870序列和不同脑膜炎球菌多肽序列的杂交多肽。例如，参考文献10披露了含有NMB1870和NadA的杂交体。参考文献12披露了称为串联多肽的特异性杂交多肽亚组，其中一条多肽链包含多个NMB1870序列，例如每个家族的序列。本发明提供许多新的杂交和串联多肽。

杂交多肽通常如下式所示：

-A-[-X-L-]_n-B-

其中X是包含奈瑟球菌序列的氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选是C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数。

n值可以是2、3、4、5、6、7、8或更高，但优选2或3。-A-序列优选位于多肽的N-末端，-B-序列优选位于多肽的C-末端。

按照本发明，至少一个-X-部分是NMB1870序列。用作-X-部分的优选NMB1870序列截短最多可包括在成熟N-末端附近发现的聚-甘氨酸序列，即它们是ΔG序列。SEQ ID NO：1-3的ΔG形式分别是SEQ ID NO：22-24。

对于X部分，特别是除X₁以外的那些部分，优选删去其天然前导肽。在一个实施方式中，应删除前导肽，除了位于此杂交多肽N-末端的-X-部分的前导肽外，即X₁的前导肽保留，但删去了X₂...X_n的前导肽。这等于删除了所有前导肽，而用X₁的前导肽作为部分-A-。

对于[-X-L-]的各n例子，接头氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如，当n＝2时，杂交体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH，等等。一个或多个接头氨基酸序列-L-通常是短序列(例如，20个或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有助于克隆的短肽序列、聚-甘氨酸接头(即，Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)和组氨酸标签(即，His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本领域技术人员知道其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGGGG(SEQ IDNO：15)，其中Gly-Ser二肽由BamHI限制性位点形成，从而有助于克隆和操作，Gly₄四肽(SEQ ID NO：16)是另一典型的聚-甘氨酸接头。另一有用的接头是SEQ ID NO：17，任选其前方是Gly-Ser二肽(SEQ ID NO：18，由BamHI形成)或Gly-Lys二肽(SEQ ID NO：19，由HindIII形成)。

-A-是任选的N-末端氨基酸序列。该序列通常是短序列(例如，40或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括引导蛋白质运输的前导序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本领域技术人员知道其它合适的N-末端氨基酸序列。如果X₁缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-可在翻译的多肽中提供这种甲硫氨酸残基(例如，-A-是一个Met残基)。Met可以与接头序列，例如SEQ ID NO：17的N-末端相连(即，SEQ ID NO：21)或位于短序列的N-末端(例如，SEQ ID NO：26)。-A-序列的例子包括SEQ ID NO：21、26和43。

-B-是任选的C-末端氨基酸序列。该序列通常是短序列(例如，40或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括引导蛋白质运输的序列，有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，包含组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高，如SEQ ID NO：20)，或能提高多肽稳定性的序列。本领域技术人员知道其它合适的C-末端氨基酸序列。一个合适的-B-部分是SEQ ID NO：41，其中SEQ ID NO：20上游的Leu-Glu(SEQ ID NO：44)来源于XhoI限制性位点。

在本发明优选的杂交多肽中，X部分之一是“蛋白质936”序列。参考文献3首先披露了蛋白质936，即SEQ ID NO：2884(本文中是SEQ ID NO：14)，在本文中该序列的信号肽截短形式(signal-truncated version)是SEQ ID NO：25。本发明所用的“936”序列包括以下序列：(i)与SEQ ID NO：25至少有z％序列相同性的序列，和/或(ii)包含SEQ ID NO：25的至少f个连续氨基酸的片段的序列。z值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。f值选自6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、45、50、60、70、75、100、150、200或更高。

一些优选的杂交多肽包含一条936序列和两条NMB1870序列。所述两条NMB1870序列来自两个不同的家族，例如I和II、I和III或II和III。优选的杂交体包含936序列，家族I的NMB1870序列和家族II的NMB1870序列。936(序列)优选位于这三种序列的最N-末端。SEQ ID NO：28、29、34和35是杂交多肽的例子，所述多肽包含与两个不同家族的NMB1870序列的N-末端相连的936序列。

例如，如果n＝2，则X₁可以是“936”序列，X₂可以是NMB1870序列。类似地，如果n＝3，则X₁可以是“936”序列，X₂可以是第一家族的NMB1870序列，并且X₂可以是第二家族的NMB1870序列。

在本发明的优选串联多肽中，n是2或3。

本发明的14种特异性杂交和串联多肽如SEQ ID NO：27-40所示，作为指导，其SEQ ID NO的构成如下所示：

SEQ ID	n	A	X1	L1	X2	L2	X3	L3	B
										27	2	21	23	15	22	44	-	-	20
28	3	26	25	15	22	18	23	44	20
										29	3	26	25	18	23	45	22	44	20
30	3	21	23	15	22	18	24	42	20
										31	3	21	23	18	24	15	22	44	20
32	3	43	22	18	23	18	24	42	20
										33	2	21	23	15	22	-	-	-	-
34	3	26	25	15	22	18	23	-	-
										35	3	26	25	18	23	15	22	-	-
36	3	21	23	18	24	15	22	-	-
										37	3	21	23	15	22	18	24	-	-
38	3	43	22	18	23	18	24	-	-
										39	3	43	22	18	24	19	23	44	20
40	3	43	22	18	24	19	23	-	-

本发明的其它优选杂交和串联多肽包含家族IV的序列。因此，至少一个X部分可以(i)与SEQ ID NO：95具有至少v％序列相同性，和/或(ii)包含SEQID NO：95的至少vv个连续氨基酸的片段。v值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。vv值选自6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、45、50、60、70、75、100、150、200或更高。包含家族IV序列可以增强抗269cpx菌株的血清活性。

NMB1870的片段和结构域

除了利用全长NMB1870序列(例如，SEQ ID NO：1)，本发明通常使用片段。例如，通常删去成熟N-末端的上游氨基酸(SEQ ID NO：1中的Cys-20)。优选利用“ΔG”序列，其中删除了最多可包括NMB1870的聚-甘氨酸序列的所有氨基酸，即删除了SEQ ID NO：1中的氨基酸1-26。例如，在SEQ ID NO：27-40中，上表显示利用了NMB1870的ΔG形式(即，SEQ ID NO：22-24)。

如参考文献13所述，NMB1870可以分成称为A、B和C的三个结构域。以家族I序列(SEQ ID NO：1)为例，其中成熟加工的脂蛋白的N-末端是Cys-20，所述三个结构域是(A)1-119，(B)120-183和(C)184-274：

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自其C-末端半胱氨酸开始的结构域“A”的成熟形式称为“A_成熟”。

对于MC58，这些结构域是“A”＝SEQ ID NO：4；“B”＝SEQ ID NO：5；“C”＝SEQ ID NO：6；和“A_成熟”＝SEQ ID NO：13。已知多种NMB1870序列[例如，见参考文献4、8和10]，采用标准方法不难比对。借助这种比对，技术人员可以通过与MC58序列中的坐标进行比较来鉴定任何给定NMB1870序列中的结构域“A”(和“A_成熟”)、“B”和“C”。然而，为便于引用，各结构域如下定义：

-任何给定NMB1870序列中的结构域“A”是该序列的片段，当采用两两比对算法与SEQ ID NO：1比对时，所述片段始于和SEQ ID NO：1的Met-1比对的氨基酸，终于和SEQ ID NO：1的Lys-119比对的氨基酸。

-任何给定NMB1870序列中的结构域“A_成熟”是该序列的片段，当采用两两比对算法与SEQ ID NO：1比对时，所述片段始于和SEQ ID NO：1的Cys-20比对的氨基酸，终于和SEQ ID NO：1的Lys-119比对的氨基酸。

-任何给定NMB1870序列中的结构域“B”是该序列的片段，当采用两两比对算法与SEQ ID NO：1比对时，所述片段始于和SEQ ID NO：1的Gln-120比对的氨基酸，终于和SEQ ID NO：1的Gly-183比对的氨基酸。

-任何给定NMB1870序列中的结构域“C”是该序列的片段，当采用两两比对算法与SEQ ID NO：1比对时，所述片段始于和SEQ ID NO：1的Lys-184比对的氨基酸，终于和SEQ ID NO：1的Gln-274比对的氨基酸。

用于确定结构域的优选两两比对算法是利用默认参数(例如，空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.5，采用EBLOSUM62评分矩阵)的Needleman-Wunsch全比对算法(Needleman-Wunsch global alignmentalgorithm)[14]。利用EMBOSS软件包中的needle工具可以方便地实施该算法[15]。

NMB1870序列属于本文称为家族I、II和III的三个家族[4、10]。家族I-III的原型序列(prototypic sequence)分别是SEQ ID NO：1-3。采用参考文献4的种系发生学和进化系统树方法不难测定任何给定NMB1870序列的家族，还可利用该三个原型NMB1870序列各自的两两比对来寻找最接近的家族匹配。诸序列明显属于这三个家族，其中家族I和II之间的序列相同性是74.1％，家族I和III之间的序列相同性是62.8％，家族II和III之间的序列相同性是84.7％，各家族内的序列差异低(例如，家族I中最低有91.6％的相同性，家族II中最低有93.4％，家族III中最低有93.2％)。快速测定序列的家族而无需种系发生学分析的方法是：如果某序列与SEQ ID NO：1有至少85％序列相同性，则其属于家族I；如果某序列与SEQ ID NO：2有至少85％序列相同性，则其属于家族II；如果某序列与SEQ ID NO：3有至少85％序列相同性，则其属于家族III。

根据参考文献4图6中的比对，NMB1870的三个原型家族(SEQ ID NO：1-3)的示范性结构域A、B和C如下所示：

↓家族结构域→	A	B	C
				I	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：6
II	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：9
				III	SEQ ID NO：10	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：12

本发明所用的优选结构域包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：4-12中的一个或多个至少有x％序列相同性的序列，和/或(b)包含SEQ ID NO：4-12中的一个或多个的至少y个连续氨基酸序列的片段的序列。

x值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。y值选自6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50或更高。在包含不同家族的NMB1870序列的多肽中，各家族的x和y值可以相同或不同。

结构域“A”序列的长度优选在α₁和α₂(包括端点)个氨基酸之间，其中：α₁选自：110、115、120、125和130；α₂选自：115、120、125、130和135。

结构域“B”序列的长度优选在b₁和b₂(包括端点)个氨基酸之间，其中：b₁选自：55、60、65和70；b₂选自：60、65、70和75。

结构域“C”序列的长度优选在c₁和c₂(包括端点)个氨基酸之间，其中：c₁选自：80、85、90、95和100；c₂选自：85、90、95、100和105。

如果需要，可用一个NMB1870结构域(A、B或C)或用两个NMB1870结构域(AB、AC或BC)取代NMB1870的任何全长形式。

NMB1870的多态性形式

NMB1870的各种多态形式已见诸报道。已鉴定了新序列，因此，本发明提供包含选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、86、87、88、89、90、91、92、93和94。SEQ ID NO：94(还可见参考文献12的SEQ ID NO：140)是家族IV序列的例子，其通过在家族I和III之间重组而产生。

多肽

本发明提供上述各种多肽。

本发明还提供包含选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56。本发明还提供具有以下氨基酸序列的多肽：(a)与选自下组的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO：27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56，和/或(b)包含选自下组的氨基酸序列片段的氨基酸序列：SEQ ID NO：27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56。序列相同性程度优选高于50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。所述片段优选包含起始序列的7个或更多个连续氨基酸(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、55、60、65、70、75、70、85、90、95、100或更多个)。

NMB1870是脑膜炎奈瑟球菌的天然脂蛋白。在大肠杆菌(E.coli)中表达时发现其还能被脂质化。本发明多肽可具有C-末端半胱氨酸残基，该残基可脂质化，例如含有棕榈酰基。

本发明优选多肽的特征是给予宿主动物后能诱导抗脑膜炎球菌的杀细菌抗体的能力。

可通过各种方法制备本发明多肽，例如通过化学合成(至少部分)，用蛋白酶消化较长的多肽，从RNA翻译，从细胞培养物中纯化(例如，从重组表达或脑膜炎奈瑟球菌培养物中纯化)，等等。用大肠杆菌宿主异源表达是优选的表达途径(例如，用DH5α、BL21(DE₃)、BLR，等等)。

本发明多肽可以与固体支持物相连或固定于其上。

本发明多肽可包含可检测标记物，例如放射性标记物，荧光标记物或生物素标记物。这在免疫测定技术中特别有用。

多肽可采取各种形式(例如，天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂质化多肽、含二硫键的多肽，等等)。

优选将多肽制备成基本纯的或基本分离的形式(即，基本上不含其它奈瑟球菌或宿主细胞的多肽)或基本分离的形式。这些多肽通常在非天然产生的环境中提供，例如使它们与其天然产生的环境分开。在某些实施方式中，所述多肽存在于相比于对照更丰富的组合物中。因此，本发明提供纯化的多肽，藉此“纯化”表示该多肽所处的组合物中基本上不含表达的其它多肽，而“基本上不含”表示构成组合物的其它表达的多肽低于90％，通常低于60％，更常见低于50％。

术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或支链的，其可包含修饰的氨基酸，并可间插有非氨基酸。这些术语还包括天然或经干预而得到修饰的氨基酸聚合物；例如形成二硫键、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记组分偶联。这些定义还包括，例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸，等等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以单链或缔合链(associated chain)存在。

核酸

本发明提供编码上述本发明多肽的核酸。本发明还提供包含以下的核酸：(a)所述核酸的至少n个连续核苷酸的片段，其中n是10或更高(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或更高)；和/或(b)与所述核酸有至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列相同性的序列。

此外，本发明提供能与编码本发明多肽的核酸杂交的核酸，优选在“高度严格性”条件下(例如，65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液)。

可将本发明核酸用于杂交反应(例如，Northern或Sourthern印迹或核酸微阵列或“基因芯片”中)和扩增反应(例如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA，等等)以及其它核酸技术中。

可以许多方法制备本发明核酸，例如完全或部分采用化学合成(例如，DNA的亚磷酰胺合成)，用核酸酶(例如，限制性内切酶)消化较长的核酸，通过连接较短核酸或核苷酸(例如，利用连接酶或聚合酶)，从基因组或cDNA文库制备，等等。

本发明核酸可采取各种形式，例如单链、双链、载体、引物、探针、作标记的、未作标记的，等等。

本发明核酸优选分离的或基本上分离的形式。

本发明包括含有上述那些序列的互补序列的核酸，例如反义(核酸)或用于检测，或用作引物。

术语“核酸”包括DNA和RNA，还包括它们的类似物，例如含有修饰骨架的那些，还包括肽核酸(PNA)，等等。

本发明的核酸可以作标记，例如含放射性或荧光标记物。如果将核酸用于核酸检测技术，例如核酸是引物或在诸如PCR、LCR、TMA、NASBA等技术中用作探针时，这特别有用。

本发明还提供包含本发明核苷酸序列的载体(例如，克隆或表达载体，例如适合于核酸免疫接种的那些)和用这种载体转化的宿主细胞。

杀细菌应答

本发明的优选多肽能引发抗脑膜炎球菌的杀细菌抗体应答。不难检测小鼠的杀细菌抗体应答，其是疫苗效力的标准指标[例如，见参考文献2的附注14]。本发明多肽优选能引发抗以下三组菌株中至少两组各自至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀细菌抗体应答：

(I)MC58、gb185(＝M01-240185)、m4030、m2197、m2937、iss1001、NZ394/98、67/00、93/114、bz198、m1390、nge28、Inpl7592、00-241341、f6124、205900、m198/172、bz133、gb149(＝M01-240149)、nm008、nm092、30/00、39/99、72/00、95330、bz169、bz83、cu385、h44/76、m1590、m2934、m2969、m3370、m4215、m4318、n44/89、14847。

(II)961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013(＝M01-240013)、e32、m1090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、c11、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38、L93/4286。

(III)M1239、16889、gb355(＝M01-240355)、m3369、m3813、ngp165。

例如，嵌合型多肽能引发有效抵御血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中两种或多种的杀细菌应答。

所述多肽优选能引发抵御临床相关脑膜炎球菌血清群B的至少50％菌株(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更高)的杀细菌抗体应答。所述多肽可引发抵御血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株和血清群A、C、W135和Y中至少一种(例如，1、2、3、4种)的菌株的杀细菌抗体应答。所述多肽可引发抵御淋病奈瑟球菌(N.gonococcus)和/或灰色奈瑟球菌(N.cinerea)菌株的杀细菌抗体应答。所述多肽可引发抗参考文献4中图5所示进化系统树的三个主要分枝中至少两分枝的菌株的杀细菌应答。

所述多肽可引发抗以下超毒谱系(hypervirulent lineage)中至少2个(例如，2、3、4、5、6、7)的脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀细菌抗体应答：ET-37、ET-5、簇A4、谱系3、亚群I、亚群III和亚群IV-I[16，17]。这些多肽还可诱导抗一种或多种超侵袭性谱系(hyperinvasive lineage)的杀细菌抗体应答。

这些多肽可引发抗以下多基因座序列类型中至少2种(例如，2、3、4、5、6、7)的脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀细菌抗体应答：ST1、ST4、ST5、ST8、ST11、ST32和ST41[18]。所述多肽还可引发抗ST44菌株的杀细菌抗体应答。

所述多肽无需诱导抗所述谱系或MLST内各种和每一种MenB菌株的杀细菌抗体应答；而是，就具体超毒谱系或MLST内多种血清群B脑膜炎球菌菌株中四种的任何给定组而言，该组合物诱导的杀细菌抗体优选抗该组的至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或更多)。优选的菌株组包括在至少4个以下国家中分离的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。血清的杀细菌滴度优选至少1024(例如，2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，即1∶1024稀释的血清能杀伤具体测试菌株的至少50％细菌，例如参考文献2的附注14所述。优选的嵌合型多肽在小鼠中引发的抗体应答即使其血清作1∶4096稀释或进一步稀释仍能杀细菌。

免疫接种

本发明多肽优选作为免疫原性组合物提供，本发明提供用作药物的免疫原性组合物。

本发明还提供在哺乳动物中产生抗体应答的方法，所述方法包括将本发明的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。所述抗体应答优选保护性和/或杀细菌抗体应答。

本发明还提供保护哺乳动物免遭奈瑟球菌(例如，脑膜炎球菌)感染的方法，所述方法包括将本发明的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。

本发明提供用作药物(例如，作为嵌合型组合物或疫苗)或诊断试剂的本发明嵌合型多肽。本发明还提供本发明的核酸、多肽或抗体在制备用于预防哺乳动物的奈瑟球菌(例如，脑膜炎球菌)感染的药物中的应用。

所述哺乳动物优选人。人可以是成年人，或者优选儿童。如果疫苗是预防性应用，则人优选儿童(例如，学步童或婴儿)；如果疫苗是治疗性应用，则人优选成年人。也可将用于儿童的疫苗给予成年人，例如以检验其安全性、剂量、免疫原性，等等。

这些应用和方法特别可用于预防/治疗包括但不限于脑膜炎(特别是细菌性脑膜炎)和菌血症在内的疾病。

可通过监测给予本发明组合物后的奈瑟球菌感染来测试治疗性治疗的效力。可通过监测给予所述组合物后抗NMB1870的免疫应答来测试预防性治疗的效力。可将本发明组合物给予测试对象(例如，12-16月龄的儿童，或动物模型[19])，然后测定包括血清杀细菌抗体(SBA)和ELISA滴度(GMT)在内的标准参数来测定其免疫原性。通常在给予组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予组合物前的测定值作比较。最好SBA升高至少4倍或8倍。如果给予多剂量组合物，则可进行多次给药后测定。

本发明的优选组合物能赋予患者的抗体滴度优于各抗原性组分对于可接受百分比的人对象的血清保护标准。具有相关抗体滴度(高于该滴度则认为宿主对该抗原是血清转化的)的抗原是熟知的，这种滴度由诸如WHO等组织发布。优选超过80％的对象的统计学显著样本是血清转化的，更优选超过90％，还更优选超过93％，最优选96-100％。

本发明的组合物通常应直接给予患者。可以经胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜给药实现直接递送。优选大腿或上臂肌肉内给药。注射可以通过针(例如皮下注射针)，或者可使用无针注射。典型的肌肉内剂量是0.5ml。

可采用本发明引发全身性和/或粘膜免疫力。

剂量疗法可以是单一剂量用药法或多剂量用药法。多剂量可以用于初次免疫接种程序表和/或加强免疫接种程序表。初次给药方案之后可以是加强给药方案。致敏给药之间(例如4-16周之间)以及致敏和加强之间的适当时间可以按常规确定。

本发明的免疫原性组合物通常含有药学上可接受的载体，所述载体可以是自身不诱导对接受该组合物的患者产生有害抗体的任何物质，并且给予所述载体不会产生过分的毒性。药学上可接受的载体可以包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。在这种载体中还可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。合适载体的详尽讨论见参考文献20。

奈瑟球菌感染影响身体的各个部位，因此可将本发明组合物制成各种形式。例如，可将该组合物制成可注射的(液体溶液或悬浮液)。还可制备成适合于先溶解或悬浮在液体运载体中再注射的固体形式。可将组合物制备成用于局部给药的，例如软膏、乳膏或粉末。可将组合物制备成用于口服给药的，例如片剂或胶囊，或糖浆(任选加入调味剂)。可将组合物制备成用于肺部给药的，例如使用细粉末或喷雾的吸入器。可将组合物制备成栓剂或阴道栓剂。可将组合物制备成用于鼻、耳或眼睛给药的，例如滴剂。

所述组合物优选无菌。优选无热原。优选缓冲至，例如pH 6-pH 8之间，通常约为pH 7。如果某组合物含有氢氧化铝盐，优选使用组氨酸缓冲液[21]。本发明组合物对人体是等渗透压的。

免疫原性组合物包含免疫学有效量的抗原以及所需要的任何其它特定组分。“免疫学有效量”表示给予个体该用量(单一剂量或作为系列剂量的一部分)对于治疗或预防有效。该用量取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学分组(例如非人灵长类、灵长类等等)、该个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗剂型、主治医生对医学状况的评估以及其他相关因素而不同。估计该用量的范围较宽，可通过常规试验确定。剂量疗法可以是单剂量用药法或多剂量用药法(例如，包括加强给药)。可联合给予所述组合物和其它免疫调节剂。

本发明组合物可用的佐剂包括但不限于：

A.含有矿物质的组合物

适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献22的第8和9章]，或不同矿物质化合物的混合物，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(具有)吸附性。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒[23]。

特别优选磷酸铝，尤其是在包含流感嗜血杆菌(H.influenzae)糖抗原的组合物中，典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比在0.84和0.92之间的无定形羟基磷酸铝，含量为0.6mg Al³⁺/ml。可用低剂量磷酸铝吸附，例如每剂每种偶连物50-100μgAl³⁺。当组合物中含有一种以上偶连物时，不需要吸附所有偶连物。

B.油乳剂

适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献22的第10章；也可参见参考文献24](利用微流化剂配制成亚微米颗粒的5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85)。也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。本发明可利用水包油乳液佐剂。

C.皂苷制剂[参考文献22的第22章]

皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologous group)。皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophillapaniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根(soaproot))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为Stimulon^TM。

也可利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术专门纯化的组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。参考文献25公开了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[26]。

可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献22的第23章]。ISCOM一般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC的一种或多种。参考文献26-28进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它去污剂[29]。

皂苷佐剂开发的综述见参考文献30和31。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选与磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常无致病性、非复制性，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离这些病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白质：流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)。参考文献32-37进一步讨论了VLP。例如，参考文献38进一步讨论了病毒体。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文献39公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0.22μm膜除菌过滤[39]。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[40、41]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，例如OM-174。例如，OM-174描述于参考文献42和43。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。

CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链的。参考文献44、45和46公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献47-52进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。

CpG序列可导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[53]。CpG序列，例如CpG-A ODN能特异性诱导Th1免疫应答，或者，例如CpG-B ODN能更特异性诱导B细胞应答。参考文献54-56讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。

优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选在它们的3’端相连而形成“免疫聚物”(immunomer)。参见，例如参考文献53和57-59。

细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。此种蛋白质优选源自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。参考文献60描述了脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，参考文献61描述了其作为胃肠外佐剂的应用。所述毒素或类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有脱毒性突变；B亚基优选未突变。佐剂优选脱毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献62-69。氨基酸取代的数字基准优选以参考文献70所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础，该文献通过引用专门全文纳入本文。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[71]等)[72]、干扰素(如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

G.生物粘附剂和粘膜粘附剂

生物粘附剂(bioadhesive)和粘膜粘附剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球[73]，或者粘膜粘附剂，例如聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[74]。

H.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。可用生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到约150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成表面带负电(例如，用SDS)或表面带正电(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。

I.脂质体(参考文献22的第13和14章)

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献75-77。

J.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[78]。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[79]以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[80]。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂描述于，例如参考文献81和82中。

L.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。

M.咪唑并喹啉化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物包括参考文献83和84中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，“瑞喹莫德3M”)。

本发明也包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[85]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[86]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[87]；(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂[88]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或旋振(vortex)产生较大粒度的乳剂；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi免疫化学公司(Ribi Immunochem))，其中含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和单磷酸酰脂质A(monophosphorylipid A)(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种由，优选MPL+CWS(Detox^TM)组成的细菌细胞壁组分；和(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)。

参考文献22的第7章公开了可用作免疫刺激剂的其它物质。

铝盐(磷酸铝，尤其是羟基磷酸铝，和/或氢氧化铝，尤其是羟基氧化铝(oxyhydroxide))和MF59是肠胃外免疫的优选佐剂。毒素突变体是优选的粘膜佐剂。QS21是NMB1870的另一种有用佐剂，它可单独使用或与一种或多种其它佐剂如铝盐联用。

胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。

其它抗原性组分

本发明组合物包含NMB1870序列。尤其优选该组合物不应当包括复杂或不明确的抗原混合物，例如，优选组合物中不包含外膜囊泡。本发明多肽优选以重组方式在异源宿主中表达，然后纯化。

除了包含NMB1870序列，本发明组合物还包含一种或多种其它奈瑟球菌抗原，因为靶向每种细菌的多种抗原的疫苗降低了选择逃逸突变体的可能性。该组合物中包含的奈瑟球菌抗原包括含有一种或多种以下成分的多肽：

(a)参考文献89中所公开的446种偶数SEQ ID(即2、4、6、...、890、892)；

(b)参考文献90中所公开的45种偶数SEQ ID(即2、4、6、...、88、90)；

(c)参考文献3中所公开的1674种偶数SEQ ID 2-3020、偶数SEQ ID3040-3114，以及所有的SEQ ID 3115-3241；

(d)参考文献2中NMB0001到NMB216的共2160条氨基酸序列；

(e)任何亚型的脑膜炎球菌PorA蛋白，优选重组表达的亚型；

(f)(a)-(e)的变体、同系物、直系同源物、旁系同源物、突变体等等；或

(g)从脑膜炎奈瑟球菌制备的外膜囊泡[例如见参考文献182]。

除了奈瑟球菌多肽抗原，所述组合物可以包括能赋予抗其他疾病或感染免疫力的抗原。例如，该组合物可以包括以下一种或多种其它抗原：

-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献91所述的血清群C的寡糖[也可参见参考文献92]或参考文献93的寡糖。

-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如，94、95、96]。

-甲肝病毒抗原，如灭活的病毒[例如，97、98]。

-乙肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原[例如，98、99]。

-白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献100第3章]，例如CRM₁₉₇突变体[例如，101]。

-破伤风抗原，诸如破伤风类毒素[例如参考文献100第4章]。

-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，任选也可以与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3[例如参考文献102和103]联用。

-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B的糖抗原[例如92]。

-脊髓灰质炎病毒抗原[例如，104、105]，如IPV。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹病毒抗原[例如参考文献100的第9、10、11章]。

-流感病毒抗原[例如参考文献100的第19章]，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如，106]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)蛋白抗原[例如，107、108]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)糖抗原。

-化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)抗原[例如，108、109、110]。

-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原[例如，111]。

所述组合物可包含这些其它抗原中的一种或多种。

如需要，可以对有毒的蛋白抗原进行脱毒处理(例如通过化学和/或遗传手段对百日咳毒素的脱毒处理[103])。

如果所述组合物包含白喉抗原，优选同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，如果组合物包含破伤风抗原，优选也包含白喉和百日咳抗原。类似地，如果组合物包含百日咳抗原，优选也包含白喉和破伤风抗原。因此优选DTP组合。

糖抗原优选偶连物的形式。下文详细描述了偶连物的载体蛋白。

组合物中的各抗原的浓度通常应至少1μg/ml。通常，任何特定抗原的浓度应足以引发抗该抗原的免疫反应。

本发明免疫原性组合物可以用于治疗(即治疗已存在的感染)或预防(即防止将来的感染)。

本发明免疫原性组合物中除了使用蛋白抗原，还可使用编码该抗原的核酸(优选DNA，例如质粒形式)。

本发明尤其优选的组合物包含(a)脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任选的)A的糖抗原；(b)B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)糖抗原；和/或(c)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原中的一种、两种或三种。

脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任选的)A

抗血清群A、C、W135和Y的多糖疫苗是多年来已知的。这些疫苗(MENCEVAX ACWY^TM和MENOMUNE^TM)基于生物体的荚膜多糖，虽然它们在青少年和成人中有效，但它们产生的免疫反应弱且保护时间短，而且不能用于婴儿。

与这些疫苗中非偶连多糖相反，最近批准的血清群C疫苗(Menjugate^TM[112、91]、Meningitec^TM和NeisVac-C^TM)包含偶连糖。Menjugate^TM和Meningitec^TM含有与CRM₁₉₇载体偶连的寡糖抗原，而NeisVac-C^TM使用与破伤风类毒素载体偶连的完整多糖(脱-O-乙酰化的)。MenActra^TM疫苗包含血清群Y、W135、C和A中各自的偶连的荚膜糖抗原。

本发明组合物优选包含一种或多种脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任选的)A的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白偶连，和/或是寡糖。例如，该组合物可以包含以下血清群的荚膜糖抗原：血清群C；血清群A和C、血清群A、C和W135；血清群A、C和Y；血清群C、W135和Y；或血清群A、C、W135和Y的所有4种。

每剂量的各脑膜炎球菌糖抗原的典型含量介于1μg和20μg之间，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg、或约10μg(以糖表示)。

如果混合物同时包含血清群A和C荚膜糖，MenA糖：MenC糖的比例(w/w)可以大于1(例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。如果混合物包含血清群Y荚膜糖以及血清群C和W135的一种或两种荚膜糖，MenY糖∶MenW135糖的比例(w/w)可以大于1(例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)和/或MenY糖∶MenC糖的比例(w/w)可以小于1(例如1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。血清群A∶C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)是：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。血清群C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)是：1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1；和2∶1∶1。各种糖的用量优选基本相同。

荚膜糖通常应以寡糖形式使用。这不难通过破碎纯化的荚膜多糖(例如通过水解)形成，随后通常纯化具有所需大小的片段。

优选片段化多糖以产生最终小于30平均聚合度(DP)的寡糖(例如对于血清群A的DP在10和20之间，优选10左右；血清群W135和Y在15和25之间，优选15-20左右；血清群C的DP在12和22之间；等等)。DP可以通过离子交换色谱或比色试验方便地测量[113]。

如果进行水解，应对水解产物进行筛分以去除短的寡糖[92]。这可以通过多种方法实现，例如超滤后进行离子交换色谱。对于血清群A，优选去除聚合度小于或等于约6的寡糖，对于血清群W135和Y，优选去除那些聚合度小于约4的寡糖。

参考文献112中公开了如Menjugate^TM中所用的优选MenC糖抗原。

糖抗原可以进行化学修饰。这对于减少血清群A糖的水解尤其有用[114；见下文]。可以进行脑膜炎球菌糖的脱-O-乙酰化。对于寡糖，修饰可发生在解聚之前或之后。

如果本发明组合物包含MenA糖抗原，该抗原优选其中天然糖的一个或多个羟基已被封闭基团(blocking group)取代的修饰的糖[114]。该修饰提高了对水解的耐受性。

一般通过包括以下步骤的方法制备脑膜炎球菌荚膜多糖：多糖沉淀(例如使用阳离子洗涤剂)、乙醇分馏、冷苯酚抽提(以去除蛋白质)和超速离心(去除LPS)[例如参考文献115]等。然而，更优选的方法[93]包括多糖沉淀，随后用低级醇溶解所沉淀的多糖。可以用诸如四丁基铵盐和十六烷基三甲基铵盐(如溴盐)、或海美溴铵(hexadimethrinr bromide)和十四烷基三甲基铵盐等阳离子洗涤剂实现沉淀。尤其优选十六烷基三甲基溴铵(CTAB)[116]。通过使用诸如甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二醇等低级醇溶解沉淀的物质，但乙醇尤其适于溶解CTAB-多糖复合物。优选将乙醇添加到沉淀的多糖中至终浓度在50％和95％之间(以乙醇和水的总含量计)。

重溶后，可进一步处理多糖以去除污染物。这在不接受哪怕些许污染的情况(例如对于人类疫苗生产)中尤其重要。这通常应包括一步或多步过滤，例如可用深层过滤、经活性碳过滤、分子大小排阻过滤和/或超滤。一旦过滤去除了污染物，可沉淀该多糖以进一步处理和/或加工。这不难通过阳离子交换(例如通过添加钙盐或钠盐)实现。

除了纯化，可以通过完全或部分合成(例如参考文献117中公开的Hib合成以及参考文献118中公开的MenA合成)来获得荚膜糖。

本发明组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的至少两种血清群的荚膜糖。所述糖优选分别制备(包括片段化、偶连、修饰等等)，然后混合以产生本发明组合物。

然而，如果该组合物包含血清群A的荚膜糖，为尽可能减少水解，优选直到使用前才将血清群A的糖与其他糖混合。这不难通过利用冻干粉末形式的血清群A的组分(通常与适当赋形剂一起)和液体形式的其它血清群的组分(也含合适赋形剂)而实现，在准备使用时用液体组分重建冻干的MenA组分。如果使用铝盐佐剂，优选在含液体疫苗的小瓶中包括佐剂，而冻干的MenA组分不添加佐剂。

因此，可将制备的本发明组合物装在试剂盒中，该试剂盒包括：(a)冻干形式的脑膜炎奈瑟球菌血清群A荚膜糖；和(b)液体形式的该组合物的其它抗原。本发明也提供了制备本发明组合物的方法，该方法包括将冻干的脑膜炎奈瑟球菌血清群A荚膜糖与其它抗原混合，其中所述其它抗原是液体形式的。

本发明也提供一种试剂盒，该试剂盒包括：(a)含有冻干形式的脑膜炎奈瑟球菌血清群C、W135和Y中两种或多种的荚膜糖的第一容器；以及(b)含有液体形式的以下物质的第二容器，(i)在给予对象后能诱导对象抗体反应的组合物，其中所述抗体反应具有抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒谱系A4、ET-5和谱系3中两种或多种(例如2或3种)谱系的杀菌活性，(ii)脑膜炎奈瑟球菌血清群C、W135和Y之一或不是这些血清群的荚膜糖，和任选的(iii)不包括脑膜炎球菌荚膜糖的其它抗原(见下文)，其中，用容器(b)的内容物重建容器(a)的内容物而提供本发明的组合物。

在各剂量范围内，各糖抗原的含量通常应在1-50μg之间(以糖的质量检测)，优选每种约2.5μg、5μg或10μg。由于A∶C∶W135∶Y的重量比是1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1，所以，数字1表示的含量优选约2.5μg、5μg或10μg。因此，对于1∶1∶1∶1比例的A∶C∶W∶Y组合物和10μg的各种糖，每剂量给予40μg糖。优选的组合物每剂量包含约以下μg的糖：

A	10	0	0	0	10	5	2.5
								C	10	10	5	2.5	5	5	2.5
W135	10	10	5	2.5	5	5	2.5
								Y	10	10	5	2.5	5	5	2.5

本发明优选的组合物每剂量包含少于50μg脑膜炎球菌糖。其它优选的组合物每剂量包含≤40μg脑膜炎球菌糖。其它优选的组合物每剂量包含≤30μg脑膜炎球菌糖。其它优选的组合物每剂量包含≤25μg脑膜炎球菌糖。其它优选的组合物每剂量包含≤20μg脑膜炎球菌糖。其它优选的组合物每剂量包含≤10μg脑膜炎球菌糖，但是，本发明组合物每剂量宜包含至少10μg脑膜炎球菌糖。

Menjugate^TM和NeisVac^TM MenC偶连物使用氢氧化物佐剂，而Meningitec^TM使用磷酸盐。氢氧化铝可吸附本发明组合物中一些抗原，而其它抗原与磷酸铝结合。对于四价血清群组合，例如可以使用下面的排列：

对于三价脑膜炎奈瑟球菌血清群组合，可以使用下面的排列：

B型流感嗜血杆菌

如果组合物包括B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)抗原，该抗原通常是Hib荚膜糖抗原。B型流感嗜血杆菌糖抗原是熟知的。

优选将Hib糖与载体蛋白共价偶连以增强其免疫原性(特别是在儿童体内)。多糖偶连物(特别是Hib荚膜多糖)的制备方法一般是充分公开的[例如参考文献119-127等等]。本发明可以使用任何合适的Hib偶连物。下文描述了合适的载体蛋白，Hib糖的优选载体是CRM₁₉₇(‘HbOC’)、破伤风类毒素(‘PRP-T’)和脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合物(‘PRP-OMP’)。

偶连物的糖部分可以是多糖(例如全长的聚磷酸核糖基核糖醇(PRP))，但优选水解多糖以形成寡糖(例如分子量约1-5kDa)。

一种优选的偶连物包括经脂肪酸接头与CRM₁₉₇共价连接的Hib寡糖[128、129]。破伤风类毒素也是优选的载体。

本发明组合物可以包含多种Hib抗原。

如果组合物包含Hib糖抗原，优选不同时包含氢氧化铝佐剂。如果组合物包含磷酸铝佐剂，则Hib抗原可以吸附于佐剂[130]，或不吸附[131]。

Hib抗原可以冻干，例如与脑膜炎球菌抗原一起冻干。

肺炎链球菌

如果组合物包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)抗原，该抗原通常是优选与载体蛋白偶连的荚膜糖抗原[例如参考文献94-96]。优选包括肺炎链球菌多种血清型的糖。例如，广泛使用23种不同血清型的多糖混合物，例如使用5到11种不同血清型多糖的偶连物疫苗[132]。例如，PrevNar^TM[133]包含7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，各种糖通过还原氨化与CRM₁₉₇偶连，每0.5毫升剂量(4μg的血清型6B)含2μg各种糖，偶连物吸附于磷酸铝佐剂。本发明组合物优选至少包括血清型6B、14、19F和23F。偶连物可以吸附于磷酸铝。

除了使用肺炎球菌糖抗原，组合物可包含一种或多种多肽抗原。已知几种肺炎球菌菌株的基因组序列[134、135]，可对其进行反向疫苗学(研究)[136-139]来鉴别合适的多肽抗原[140、141]。例如，组合物可以包括一种或多种以下抗原：PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128和Sp130，如参考文献142所述。

在一些实施方式中，组合物可以同时包含肺炎球菌的糖和多肽抗原。这些糖类和多肽抗原可简单混合后使用，或可将肺炎球菌糖抗原与肺炎球菌蛋白偶连。这种实施方式的合适载体蛋白包括前一段中所列举的抗原[142]。

肺炎球菌抗原可以冻干，例如与脑膜炎球菌和/或Hib抗原一起冻干。

共价偶连

通常将本发明组合物中的荚膜糖与载体蛋白偶连。偶连通常能增强糖的免疫原性，因为将它们从T非依赖性抗原转变为T依赖性抗原，从而引发免疫记忆。偶连对于儿科疫苗尤其有用，这是熟知的技术[参见参考文献143和119-127]。

优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素。尤其优选CRM₁₉₇突变白喉毒素[144、145、146]。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[147]，合成肽[148、149]，热激蛋白[150、151]，百日咳蛋白[152、153]，流感嗜血杆菌的蛋白D[154、155]，细胞因子[156]，淋巴因子[156]，包含各种源自病原体抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[157]，链球菌蛋白、激素[156]，生长因子[156]，肺炎球菌表面蛋白PspA[158]，艰难梭菌毒素A或B[159]，铁摄取蛋白[160]，等等。优选的载体是CRM197。

在本发明组合物中，可以使用多种载体蛋白，例如以降低载体抑制的风险。因此，对于不同的血清群可以使用不同的载体蛋白，例如，血清群A糖可以与CRM₁₉₇偶连而血清群C糖可以与破伤风类毒素偶连。对一种具体糖抗原也可使用多种载体蛋白，例如血清群A糖类可以分成两组，一些与CRM₁₉₇偶连，其它与破伤风类毒素偶连。然而，所有糖通常宜用相同载体蛋白。

一种载体蛋白可以携带多种糖抗原[161]。例如，一种载体蛋白可以与血清群A和C的糖偶连。为实现这一目的，可先混合诸糖再进行偶连反应。然而，各种血清群通常宜具有不同的偶连物。

糖：蛋白比例(w/w)优选在1∶5(蛋白过量)和5∶1(糖过量)之间。比例优选在1∶2和5∶1之间，更优选在1∶1.25和1∶2.5之间。对于MenC和MenA，优选载体蛋白过量。

偶连物可以与游离载体蛋白联用[162]。当本发明组合物中同时存在某种特定载体蛋白的游离和偶连形式时，以该组合物中所有载体蛋白总量计，非偶连形式优选不超过5％，更优选以重量计低于2％。

可以使用任何适当的偶连反应，需要时可用任何合适的接头。

偶连之前通常应活化或功能化糖。活化可以涉及，例如氰化试剂，如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)[163、164等]。其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也可参见参考文献125的介绍)。

可采用任何已知方法，例如参考文献165和166所述的方法经连接基团进行连接。一种类型的连接涉及多糖的还原氨化，获得的氨基与己二酸连接基团的一端偶联，随后将己二酸连接基团的另一端与蛋白质偶联[123、167、168]。其他接头包括B-丙酰胺[169]、硝基苯-乙胺[170]、卤酰基卤(haloacylhalide)[171]、糖苷连接键[172]、6-氨基己酸[173]、ADH[174]、C₄-C₁₂部分[175]等等。除了使用接头，还可以采用直接连接。与蛋白质的直接连接可以包括先氧化多糖，再与该蛋白进行还原氨化，例如参考文献176和177所述。

优选的方法包括在糖中引入氨基(例如通过用-NH₂取代末端＝O基团)，随后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化并与载体蛋白反应。另一种优选的反应使用CDAP活化和蛋白D载体，例如用于MenA或MenC的。

偶连后，可分离游离的和偶连的糖。有多种合适的方法可用，包括疏水层析、切线超滤、渗滤等等[参见参考文献178和179等]。

如果本发明组合物包含偶连寡糖，优选先制备寡糖再偶连。

外膜囊泡

优选的本发明组合物不应包括复杂或不明确的抗原混合物，这是OMV的典型特征。然而，本发明可与OMV联用，因为发现NMB1870能增强它们的效力[6]，特别是在制备OMV所用的菌株中过量表达本发明多肽时。

此方法通常可用于改善脑膜炎奈瑟球菌血清群B微泡[180]、“天然OMV”[181]、细胞泡(bleb)或外膜囊泡[例如参考文献182-187等]的制备。这些囊泡可以从经遗传改造的细菌制备[188-191]，例如以增强免疫原性(例如超表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调ProA表达等等。它们可以从多泡(hyperblebbing)菌株制备[192-195]。可以包括非致病奈瑟球菌的囊泡[196]。可以不使用洗涤剂而制备OMV[197、198]。它们可以在其表面表达非奈瑟球菌蛋白[199]。可去除它们的LPS(LPS-depleted)。它们可以与重组抗原混合[182、200]。可以使用I型外膜蛋白不同亚型的细菌的囊泡，例如使用各自展示3种亚型的遗传改造的两种不同囊泡群的6种不同亚型[201、202]，或使用各自展示3种亚型的遗传改造的三种不同囊泡群的9种不同亚型等等。有用的亚型包括：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。

蛋白质表达

细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶并启动下游(3’)编码序列(例如结构基因)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子应具有通常位于靠近编码序列5’端的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可含称为操纵子的第二区，它可以与RNA合成开始处的毗邻RNA聚合酶结合位点重叠。由于基因阻遏蛋白可以结合操纵子而抑制具体基因的转录，故操纵子能负调节(可诱导性)转录。在不存在诸如操纵子等负调节元件时，可以发生组成型表达。此外，通过基因激活蛋白结合序列(如果存在的话通常位于RNA聚合酶结合序列5’附近)可实现正调节。基因激活蛋白的一个实例是分解代谢激活蛋白(CAP)，它能协助启动大肠杆菌lac操纵子的转录[Raibaud等，(1984)Annu.Rev.Genet.18：173]。因此，受调节的表达可以是正或负调节，从而能增强或降低转录。

编码新陈代谢途径酶的序列提供了尤其有用的启动子序列。实例包括衍生自诸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等，(1977)Nature 198：1056]和麦芽糖等糖代谢酶的启动子序列。其它实例包括衍生自诸如色氨酸(trp)等生物合成酶的启动子序列[Goeddel等，(1980)Nuc.Acids Res.5：4057；Yelverton等，(1981)Nucl.AcidsRes.9：731；美国专利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775]。β-内酰胺酶(bla)启动子系统[见I.Gresser编的《干扰素3》(Interferon 3)中Weissmann(1981)著《干扰素的克隆及其它错误》(The cloning of interferon and other mistakes)]、lambda噬菌体PL[Shimatake等，(1981)Nature，292：128]和T5[美国专利4,689,406]启动子系统也提供了有用的启动子序列。另一种感兴趣的启动子是可诱导的阿拉伯糖启动子(pBAD)。

此外，自然界中不存在的合成启动子也可以作为细菌启动子起作用。例如，可将一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列相连，从而产生合成的杂合启动子[美国专利4,551,433]。例如，tac启动子是由trp启动子和lac操纵子序列构成，由lac阻遏物调节的杂合trp-lac启动子[Amann等，(1983)Gene 25：167；de Boer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：21]。此外，细菌启动子可以包含天然产生的、能结合细菌RNA聚合酶并启动转录的非细菌来源的启动子。还可将天然产生的非细菌来源启动子与相容的RNA聚合酶偶联从而在原核细胞中高水平表达一些基因。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的一个实例[Studier等，(1986)J.Mol.Biol.759：113；Tabor等，(1985)Proc Natl Acad.Sci.52：1074]。此外，杂合启动子也可以由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域构成(EPO-A-0267 851)。

除了功能性启动子序列，有效的核糖体结合位点也可用在原核细胞中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称为Shine-Dalgarno(SD)序列，其包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处长3-9个核苷酸的序列。据认为SD序列通过SD序列和大肠杆菌16S rRNA 3’末端之间的碱基配对而促进mRNA与核糖体结合[R.F.Goldberger主编《生物学调控和发育：基因表达》(Biological Regulation and Development：Gene Expression)一书中Steitz等(1979)所著《信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列》(Genetic signals andnucleotide sequences in messenger RNA)]。为了表达含弱核糖体结合位点的原核基因与真核基因[Sambrook等，(1989)《分子克隆：实验手册》(MolecularCloning：A Lavoratory Manual)一书中《大肠杆菌中克隆基因的表达》(Expressionof cloned genes in Escherichia coli.)]。

启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，N末端的第一个氨基酸总是ATG起始密码子编码的甲硫氨酸。如果需要，可以通过与溴化氰体外培育或通过与细菌甲硫氨酸N末端肽酶体外或体内培育切去蛋白的N末端甲硫氨酸(EP-A-0219237)。

通常，细菌识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3’端的调控区，从而与启动子一起位于编码序列的侧翼。这些序列指导能翻译成DNA编码的多肽的mRNA转录。转录终止序列经常包括能形成有助于终止转录的茎环结构的约50个核苷酸的DNA序列。实例包括源自含强启动子的基因，例如大肠杆菌trp基因以及其它生物合成基因的转录终止序列。

通常，包括启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列的上述组分组合在一起形成表达构件。表达构件经常维持在复制子中，例如能稳定维持在诸如细菌等宿主中的染色体外元件(例如质粒)。该复制子含有复制系统，从而能维持在原核宿主中表达或克隆和扩增。此外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数质粒。高拷贝数质粒通常的拷贝数应为约5到200之间、通常是约10到150个拷贝数。包含高拷贝数质粒的宿主优选应包含至少约10个、更优选至少约20个质粒。可根据载体和外来蛋白对宿主的影响选择高拷贝数或低拷贝数载体。

或者，可以用整合载体将表达构件整合入细菌基因组。整合载体通常包含至少一段与细菌染色体同源从而允许其整合的序列。整合似乎是载体和细菌染色体的同源DNA之间重组的结果。例如，将用各种棒状杆菌菌株的DNA构建的整合载体整合入棒状杆菌染色体(EP-A-0127328)。整合载体也可以包含噬菌体或转座子序列。

通常，染色体外的和整合的表达构件可以包含可选择标记从而能选择已转化的细菌菌株。可选择标记可以在细菌宿主中表达并可包含赋予细菌对诸如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素等药物的抗性的基因[Davies等，(1978)Annu.Rev.Microbiol.32：469]。可选择标记也可包含生物合成基因，例如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些基因。

或者，上述有些组分可以一起置于转化载体中。如上所述，转化载体通常包含维持在复制子中的可选择标记或开发成整合载体。

已经开发了用于转化入多种细菌的表达和转化载体，或是染色体外复制子或是整合载体。例如，特别开发了以下细菌的表达载体：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[Palva等，(1982)Proc.Natl.Acad Sci.USA 79：5582；EP-A-0 036 259和EP-A-0 063 953；WO 84/04541]、大肠杆菌[Shimatake等，(1981)Nature 292：128；Amann等，(1985)Gene.40：183；Studier等，(1986)J.Mol.Biol.189：113；EP-A-0036 776、EP-A-0 136 829和EP-A-0 136 907]、变铅青链球菌(Streptococcuslividans)[Powell等，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)[美国专利4,745,056]。

将外源DNA引入细菌宿主的方法是本领域熟知的，通常包括用CaCl₂或诸如二价阳离子和DMSO等其它试剂处理而转化细菌。也可通过电穿孔将DNA引入细菌细胞。转化方法常随所转化的细菌种属而不同。参见例如[Masson等，(1989)FEMS Microbiol.Lett.60：273；Palva等，(1982)Proc.Natl Acad.Sci.USA79：5582；EP-A-0 036 259和EP-A-0 063 953；WO 84/04541，棒状杆菌]、[Miller等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.55：856；Wang等，(1990)J.Bacteriol.772：949，弧杆菌]、[Cohen等，(1973)Proc.Natl.Acad Sci.69：2110；Dower等，(1988)NucleicAcids Res.76：6127；H.W.Boyer和S.Nicosia主编《遗传工程：遗传工程国际论坛会议录》(Genetic Engineering：Proceedings of the International Symposium onGenetic Engineering)中Kushner(1978)所著《一种用ColE1来源质粒转化大肠杆菌的改进方法》(An improved method for transformation of Escherichia coli withColEl-derived plasmids)；Mandel等，(1970)J.Mol.Biol.53：159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949：318；埃希氏菌]、[Chassy等，(1987)FEMSMicrobiol.Lett.44：173乳酸菌]、[Fiedler等，(1988)Anal.Biochem 770：38，假单胞菌]、[Augustin等，(1990)FEMS Microbiol.Lett.66：203，葡萄球菌]、[Barany等，(1980)J.Bacteriol.144：698；J.Ferretti和R.Curtiss主编《链球菌遗传学》(Streptococcal Genetics)中Harlander(1987)所著《通过电穿孔转化乳链球菌》(Transformation of Streptococcus lactis by electroporation)；Perry等，(1981)Infect.Immun.32：1295；Powell等，(1988)Appl.Environ Microbiol.54：655；Somkuti等，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1：412，链球菌]。

概述

术语“包含”意味着“包括”以及“由...构成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X构成，或可以包括其它物质，例如X+Y。

与数值x有关的术语“约”表示，例如x±10％。

“基本上”不排斥“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。需要时，“基本上”这个词可以从本发明定义中省略。

“序列相同性”优选通过如MPSRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))所执行的Smith-Waterman同源检索算法测定，该算法使用参数为空位开放罚分＝12及空位延伸罚分＝1的仿射(affine)空位检索。

血清群分类后，脑膜炎球菌的类型包括血清型、血清亚型和随后的免疫型，标准命名法列出了血清群、血清型、血清亚型和免疫型，各自用冒号分隔，例如B:4:P1.15:L3，7，9。在血清群B中，有些谱系经常引发疾病(高侵袭性)，有些谱系比其它谱系引发更严重形式的疾病(超毒性)，其它的根本很少引发疾病。已识别了7个超毒性谱系，即亚群I、III和IV-1、ET-5复合物、ET-37复合物、A4群落和谱系3。已经通过多基因座酶电泳(MLEE)确定了这些谱系，但是多基因座序列分型(MLST)也已用于脑膜炎球菌的分类[参考文献18]。4种主要的超毒性群落是ST32、ST44、ST8和ST11复合物。

本发明一般不包括参考文献4、5、7、8、9、10、11、12、13和203中专门披露的各种NMB1870序列，尽管这些NMB1870序列也可用于本发明，例如用于构建嵌合序列，等等。

本发明的实施方法

参考文献13披露了取代SEQ ID NO：59，用作家族I、II和III的NMB1870嵌合体。通过取代产生的该肽含有以下鉴定的SEQ ID NO：1的7个区域：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK

LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ

IQDSEHSGKNVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG

KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG

IRHIGLAAKQ   {SEQ ID NO：1)

虽然该嵌合体能引发抗各种NMB1870家族脑膜炎球菌的杀细菌抗体，但抗家族II和家族III菌株的应答总不高。

通过组合各种方法，包括家族I多肽BC结构域的NMR-衍生3D结构，发明人发现围绕残基162-168(第二个下划线区域)的一片氨基酸在脑膜炎球菌MC58(家族I)与2996(家族II)之间保守。因此，这种取代在MC58多肽的表面产生了广泛的2996-样区域，这可以解释为何含有该取代的嵌合体能引发抗家族II菌株的杀细菌应答。

第三下划线区域的取代(ProAsn取代AlaGly)可能改变局部骨架构型，引入高度刚性，从而改变多肽的折叠并降低杀细菌活性。

根据(i)家族II内的序列比对和(ii)家族内血清交叉反应性的比较，鉴定了能提高嵌合体引发良好抗-II反应能力的许多氨基酸残基。这些残基是：(a)根据NMR结构，表面暴露的，因而是免疫可接近的；(b)在抗-2996血清无法杀伤的家族II菌株内保守的；和(c)不处于疏水性袋内的。根据SEQ ID NO：2的编号，这些残基是：D121；D165；A180；G181；K183；T185；T187；A191；A192；H196；K198；A213；S234和G261。除了D121和D165外，这些残基各自在对2996序列所产生的抗血清具有抗性的三种菌株内保守。对该三种菌株的一种D121是N，对该三种菌株的两种D165是S。

因此，改变SEQ ID NO：57产生的SEQ ID NO：60是全长NMB1870序列的一部分。

将SEQ ID NO：57中的KLPEGGR 7-聚体序列(SEQ ID NO：61)用QLPDGK6-聚体(SEQ ID NO：62)替代。因此，删除了一个氨基酸。根据这两条序列的比对结果，可确定删除的残基是E51、G52、G53或R54。最终的结果并不取决于哪个残基名义上据称被删除，而是根据参考文献4中的比对结果，删除的残基最好是E51。

串联多肽

如参考文献12所述，制备所有三种NMB1870家族的三-串联(triple-tandem)多肽，其中从N-末端到C-末端这三个家族的次序为I-III-II。含或不含C-末端组氨酸标签的该多肽引发了对含有家族I和III的NMB1870的脑膜炎球菌良好的免疫反应(通常可观察到对100％的测试菌株血清杀细菌滴度≥1∶128)，但对NMB1870家族II的菌株的反应较弱(通常可观察到对60％的测试菌株滴度≥1∶128)。具体地说，利用串联多肽的反应低于利用三种不同蛋白质的混合物。相反，II-III串联多肽得到良好的结果，因此家族II序列不是天生与该串联表达方法不相容。

对家族I和II的反应至关重要，但家族III菌株较为罕见。为提高对家族II菌株的效力，目前采用了三种方法：(a)改变家族次序，可以是I-II-III、II-III-I或II-I-III；(b)删去了家族III序列，并将家族I和II表达为I-II或II-I；或(c)将家族I和II表达在“蛋白质936序列”下游，即936-I-II或936-II-I。表达的这些多肽可含有各种接头，前导肽等，可含有/不含C-末端聚-His标签。

这三种方法的实施方式见SEQ ID NO：27-38：

SEQ ID	描述		SEQ ID	描述
					27	II-I-His6		33	II-I
28	936-I-II-His6		34	936-I-II
					29	936-II-I-His6		35	936-II-I
30	II-I-III-His6		36	II-III-I
					31	II-III-I-His6		37	II-I-III
32	I-II-III-His6		38	I-II-III

利用这些蛋白质免疫小鼠。测试了不同的佐剂，包括完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、MF59水包油乳剂和MF59与免疫刺激性寡核苷酸的混合物。采用杀细菌试验测试小鼠的血清。

总体上，SEQ ID NO：28和29是等效的。有时，SEQ ID NO：34显示活性优于SEQ ID NO：28。对于包含所有三个家族的蛋白质，利用SEQ ID NO：37通常可观察到最好的结果。

家族II序列

选择NMB1870家族II的5种不同菌株：M3153、M00-0243143、1000、NGH38和M0579。利用以下引物扩增片段，将其插入pET大肠杆菌表达载体的NdeI/XhoI位点。这些序列扩增为ΔG序列；在“嵌合ΔG(chimΔG)”序列中，引物将SEQ ID NO：66加到N-末端。正向引物提供NdeI位点；反向引物提供XhoI位点。

新的NMB1870序列

可利用NMB1870的广泛序列信息[例如，参考文献4、7、8和10]。现已发现其它新的NMB1870序列。这些序列是SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、63、64、65、86、87、88、89、90、91、92、93和94。

用菌株NM117测试了针对不同NMB1870蛋白质所产生的血清。家族I、II或III的蛋白质所产生的血清的杀细菌活性低于同源血清的。类似地，NM117序列所产生的血清抗NMB1870家族I、II或III菌株的BSA活性较低。

应该知道以上只是借助实施例描述了本发明，可作出改进而依旧属于本发明的范围和构思。

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[198]WO2004/019977.

[199]WO02/062380.

[200]WO00/25811.

[201]Peeters等(1996)Vaccine 14：1008-1015.

[202]Vermont等(2003)Infect Immun 71：1650-1655.

[203]WO2004/094596

序列表简述

SEQ ID NO：	描述
		1	菌株MC58的NMB1870-家族I
2	菌株961-5945和2996的NMB1870-家族II
		3	菌株M1239的NMB 1870-家族III
4-6	SEQ ID NO：1的结构域A-C
		7-9	SEQ ID NO：2的结构域A-C
10-12	SEQ ID NO：3的结构域A-C
		13	SEQ ID NO：4的成熟结构域A
14	蛋白质936
		15-21	接头等
22-24	SEQ ID NO：1、2和3的ΔG形式
		25	截短的SEQ ID NO：14
26	接头
		27-40	杂交和串联
41-45	接头等
		46-56	NMB1870的多态性形式
57	取代的参比序列
		58-60	嵌合序列
61-62	替换入SEQ IDNO：57中的序列
		63-65	各种菌株的NMB1870
66	接头
		67-85	引物
86-94	各种菌株的NMB1870
		95	菌株nm117的NMB1870的ΔG形式

Claims (16)

1.一种多肽，所述多肽含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：57有至少70％相同，其中一个或多个以下残基被另一氨基酸取代或删除：F14；T16；Q18；Q20；D21；S22；E23；H24；S25；G26；K27；K31；Q33；R35；136；G37；139；K48；E51；G52；R54；T56；A67；G68；K70；T72；A78；A79；N83；K85；D97；D102；P105；G107；R109；S114；S116；L118；N120；Q121；A122；K135；T147；V148；N149；G150；I151；R152；H153。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，至少一个以下残基被取代或删除：F14；T16；Q18；Q20；D21；S22；E23；H24；S25；G26；K27；K31；Q33；R35；136；G37；K48；E51；G52；R54；T72；A79；K85；P105；G107；R109；L118；N 120；Q121；A122；T147；V148；N149；G150：1151；R152；H153。

3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，E51被删除。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，至少一个以下残基被取代：F14；T16；Q18；K31；Q33；R35；136；G37；139；T56；K70；T72；A78；A79；K85；D97；D102；S114；S116；L118；K135。

5.如权利要求2或4所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自以下的取代：F14L；T161；Q18K；Q20N；D21N；S22P；E23D；II24K；S25I；S25T；G26D；K27S；K31Q；Q33S；R35L；I36V；G37S；I39L；K48Q；G52D；R54K；T56E；A67P；G68N；K70R；T72H；A78T；A79K；N83H；N83Y；K85R；D97E；D102E；P105A；G107E；R109S；S114L；S116D；L118R；N120G；Q121S；A122E；K135R；T147I；V148G；N149E；G150K；I151V；R152H；H153E。

6.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：57有至少80％相同。

7.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：57有至少90％相同。

8.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。

9.一种多肽，其包含修饰的NMB1870第一家族的氨基酸序列，其中所述修饰的氨基酸序列包含NMB1870第二家族的至少一个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)表面环序列而取代了第一家族的表面环序列。

10.一种多肽，其包含以下氨基酸序列：

-B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-

此序列中：

(a)所述B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和B9各自是：(i)SEQ IDNO：M的片段；或(ii)与(i)所述片段有至少75％序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少10个毗连氨基酸的片段的氨基酸序列；和

(b)所述L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8各自是：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的片段；或(ii)与(i)所述片段有至少75％序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少10个毗连氨基酸的片段的氨基酸序列，

前提是所述L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8中至少一个不是SEQID NO：M的片段，

其中M是1、2或3，而B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8根据M选自以下：

11.权利要求10所述多肽的片段，前提是该片段包含L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或L8中的至少一个和B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和/或B9中两个或多个的至少一个氨基酸。

12.一种多肽，所述多肽包含权利要求10或11所述的以下嵌合氨基酸序列：

-B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-，

所述多肽还包含与所述嵌合序列的N-末端或C-末端相连的NMB1870序列，其中所述NMB1870序列与SEQ ID NO：M为同一NMB1870家族。

13.一种如下式所示的杂交多肽：

-A-[X-L-]_n-B-

式中：X是包含奈瑟球菌序列的氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N末端氨基酸序列，B是任选的C末端氨基酸序列，n是2或更高，其中至少一个-X-部分是NMB1870序列。

14.如权利要求13所述的杂交多肽，其特征在于，所述杂交多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40。

15.如权利要求13所述的杂交多肽，其特征在于，所述至少一个-X-部分与SEQ ID NO：95有至少90％序列相同性。

16.一种多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、86、87、88、89、90、91、92、93和94。

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