CN110903400A

CN110903400A - B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110903400A
Application number: CN201911087686.1A
Authority: CN
Inventors: 于旭博; 陈瑞勤; 蒋浩然; 胡浩
Original assignee: Suzhou Weichao Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Weichao Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明提供了一种B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列为将fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列通过连接子依次连接，制备得到包含上述多肽片段的融合蛋白，该蛋白易表达、能够正确折叠。采用该融合蛋白制备得到的疫苗，相对于现有疫苗中以变体V1、变体V2和变体V3任一单变体或其三种变体的混合蛋白制备的疫苗，具有更好的免疫原性，免疫动物后能得到更高滴度的抗体，其抗原谱比现有的疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。

Description

B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

B群脑膜炎球菌(Neisseria.meningitidis,MenB)不同于其他4种脑膜炎球菌(A,C,W135和Y)的荚膜多糖。研究显示，MenB的荚膜多糖与许多人类细胞(如胎儿的大脑发育期间细胞)表面的糖相似，这种荚膜多糖是α(2→8)N-乙酰神经氨酸(也称多唾液酸)的同聚物。因此，MenB的荚膜多糖在人体内被识别为一种自身抗原，且免疫原性差，不适合作为MenB疫苗开发的有效组分。

目前对MenB疫苗开发主要集中于非荚膜多糖免疫原，尤其是纯化后重组蛋白形式的膜蛋白或外膜囊泡(OMVs)。新的MenB疫苗发现方法，包括基因组采集、蛋白质组学和免疫学途径，已经鉴定出多个用于免疫预防MenB疾病的新疫苗靶标。这些疫苗靶标包括转铁结合蛋白、肝素结合蛋白(NHA，也称GNA2132)，人类因子H结合蛋白(fHBP，也称为LP2086或GNA1870)，铁调控的外膜蛋白(FetA)，黏附素A(NadA，也称为GNA 1994)，和其他的蛋白。fHBP是目前MenB最有前景的一种疫苗抗原，它几乎在所有MenB菌株的细胞膜上表达，为一种脂蛋白。fHBP是一种序列高度多样性的表面抗原，可被分为3个变体，每个变体内的氨基酸序列保守性为89-100％，而每个变体间的序列相似性只有59％左右，尤其是变体1(V1)和其他两个变体(V2、V3)之间没有明显的交叉保护反应。

fHBP的一个重要功能是它可结合人补体因子(fH)。fH与细菌表面结合会加速C3/C5转化酶衰退，这会降低旁路途经激活，且有助于生物体的活力，从而避免非免疫人血清或血液补体介导的杀伤。fHBP作为一个疫苗抗原，抗fHBP抗体即可直接激活经典补体途径溶菌，也可阻止fH与细菌表面结合。

已有学者对fHBP的结构和抗原表位作了较为深入的研究。fHBP包含A、B、C这3个结构域，结构域A在3个变体中具有高度保守性。V1表达一个位于结构域B的抗原表位，V2和V3的抗原表位主要位于结构域C中，且在V2和V3的结构域C中仅有个别氨基酸差异。已有近12种抗fHBP的单克隆抗体(MAbs)被研究出，而且大多数MAbs对fH与fHBP或细菌表面的结合有明显抑制作用，从而使得细菌对旁路途径介导的溶菌更为敏感。

目前已上市的2种MenB蛋白疫苗产品中fHBP均以单变体的形式单独或与非fHBP蛋白融合表达。产品针对性预防欧美地区流行性MenB菌株，而对其他的变体菌株并不具有广泛的覆盖性。因此，有必要提供一种提高fHBP的抗原谱、减少生产工序、可刺激机体产生针对不同变体菌株的抗体的蛋白，以制备一种更加简单和更加有效的MenB疫苗。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种制备方法简单、可刺激机体产生针对不同变体菌株的抗体的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白及其制备方法。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，其氨基酸序列包括：fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列，所述fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列通过连接子依次连接。

本发明还提供了一种编码所述B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因，具体技术方案如下：

一种编码如上所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因，其核苷酸序列为a:如SEQ ID NO.10所示的序列；或b:与a的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列。

本发明还提供了一种所述B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的制备方法，具体技术方案如下：

一种如上所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

提供权利要求8所示的重组质粒；

将重组质粒转化至重组细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养。

本发明还提供了所述B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的应用，具体技术方案如下：

如上所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白在制备防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗中的应用。

如上所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白在制备抗B群脑膜炎球菌的抗体中的应用。

本发明还提供了一种防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗，具体技术方案如下：

一种防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗，包括：如上所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白。

本发明还提供了一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，具体技术方案如下：

一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，由如上所述的疫苗免疫动物而制备得到。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，通过将fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列通过连接子依次连接，制备得到包含上述多肽片段的融合蛋白，该蛋白易表达、能够正确折叠。采用该融合蛋白制备得到的疫苗，相对于现有疫苗中以变体V1、变体V2和变体V3任一单变体或其三种变体的混合蛋白制备的疫苗，具有更好的免疫原性，免疫动物后能得到更高滴度的抗体，其抗原谱比现有的疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。

附图说明

图1为fHBP的3个变体融合方式示意图；

图2为重组质粒pET28a-B01-A19-A05双酶切鉴定图；泳道1和2是不同菌落经经XhoI和BamH I双酶切结果；泳道4和5是不同菌落经Nde I和BamH I双酶切结果；泳道3是DNAmarker；

图3为Ni-柱纯化的融合蛋白B01-A19-A05的SDS-PAGE检测图；泳道3为蛋白marker；其余泳道为重组蛋白经镍柱纯化不同阶段鉴定结果；泳道7箭头所指为目的蛋白；

图4融合蛋白B01-A19-A05的抗原表位Western Blot检测图；泳道1为阴性对照；泳道2和3分别为重组融合蛋白与JAR4和JAR5两个单抗反应的结果；

图5常规ELISA检测血清抗体滴度结果；柱状图反映的是针对不同变体包被抗原检测的不同免疫组特异性抗体血清水平。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的一种B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，其氨基酸序列包括：fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列，所述fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列通过连接子依次连接。

优选地，所述fHBP变体V1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

优选地，所述fHBP变体V2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

优选地，所述fHBP变体V3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

优选地，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.16所示。

优选地，所述fHBP变体V1的氨基酸序列的N端，还连接有多肽序列SEQ ID NO.12。

优选地，所述B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明的一种编码如上任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因，其核苷酸序列为a:如SEQ ID NO.10所示的序列；或b:与a的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列。

优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的一种如上任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

提供权利要求8所示的重组质粒；

可选的，所述重组质粒为pET32a载体；

可选的，所述重组细胞和/或表达菌株为原核细胞，优选重组细胞为E.coli DH5α，表达细胞为E.coli BL21(DE3)。

优选地，所述双酶切为NdeI和XhoI双酶切。更优选地，酶切反应为于3735℃酶切反应0.8-1.2h。进一步优选为于37℃酶切反应1h。

优选地，编码B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。

更优选地，所述编码B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因，制备方法包括：

以SEQ ID NO.1为模板，SEQ ID NO.2-3为引物，扩增得到序列A；

以SEQ ID NO.4为模板，SEQ ID NO.5-6为引物，扩增得到序列B；

以SEQ ID NO.7为模板，SEQ ID NO.8-9为引物，扩增得到序列C；

将所述序列A、所述序列B、所述序列C连接。

其中，上述引物中带有酶切位点，及设计有能够表达得到N端多肽序列、连接子的编码基因，用于编码融合蛋白N端的多肽及连接子，有利于融合蛋白的表达和正确折叠。

优选地，PCR扩增体系为：10×buffer 3-7μL，dNTP 3-7μL，MgCl₂ 1-3μL，DNA模板80-120ng，引物F1-2μL，引物R1-2μL，KOD-plus-neo高保真PCR酶0.5-1.5μL，ddH₂O补足至50μL。进一步优选为：10×buffer 5μL，dNTP 5μL，MgCl₂ 2μL，DNA模板100ng，引物F1.5μL，引物R1.5μL，KOD-plus-neo高保真PCR酶1μL，ddH₂O补足至50μL。

优选地，PCR条件为：9431℃预变性230.2min，9831℃变性9-11s，6531℃退火28-32s，6831℃延伸130.1min，循环28-32次，最后683℃延伸4-6min。进一步优选为：94℃预变性2min,98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸1min，循环30次，最后68℃延伸5min。

优选地，将所述序列A、所述序列B、所述序列C连接的步骤为：将所述序列A、所述序列B、所述序列C等摩尔质量混合，采用T4连接酶连接。更优选地，连接条件为于23-25℃反应0.8-1.2h。进一步优选为于24℃反应1h。

优选地，所述筛选为采用含卡那霉素的平板进行筛选。更优选地，采用含40-60μg/mL卡那霉素的平板对其进行筛选。进一步优选地为采用含50μg/mL卡那霉素的平板对其进行筛选，3731℃倒置孵育过夜。

本发明所述的是B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白在制备防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗中的应用。并提供了一种防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗，组分包括所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白。该融合蛋白制备得到的疫苗，相对于以单变体形式存在的蛋白或3个单变体混合的蛋白混合物，具有更好的免疫原性，免疫动物后能得到更高滴度的抗体，其抗原谱比现有的疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。

优选地，所述疫苗还包括佐剂。其中，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)中的至少一种。更优选地，所述佐剂为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，或者氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐与适用于人体的其他佐剂的组合物。其中，虽然弗氏佐剂不能用于人用疫苗中，但应当理解的是，其可以作为用于科研中小鼠试验的B群脑膜炎球菌疫苗的佐剂。

其中，对本发明所涉及的名词，解释如下：

佐剂：是与抗原同时或预先注射到动物体内，可非特异性地增强机体对该抗原的免疫应答的物质，或称为非特异性免疫增强剂。

铝盐佐剂：以铝盐作为材料，通过传统工艺制备的一种佐剂，主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾3种，目前常用的铝盐佐剂为氢氧化铝和磷酸铝。

脂质体佐剂：由类脂质组成的人造细胞膜样小球体，主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构。可包括多种疫苗，并有效地引入细胞内，延长在体内停留时间，减少疫苗用量、降低毒副作用，提高免疫功能。

TLR类佐剂：以Toll样受体的配体为基准开发的一类新型疫苗佐剂，如细菌脂多糖是TLR4的配体，鞭毛蛋白是TLR5的配体，细菌或病毒的非甲基化CpG序列为TLR9的配体，以及其他具有佐剂活性TLR配体也包括在内。

MF59：一种由角鲨烯、山梨糖醇三油酸酯(Span85)、吐温80和柠檬酸缓冲液组成的水包油乳剂。

MPL：单磷酰脂质A，为TLR4配体，是已成功开发的TLR类佐剂中的一种。

CpG-ODN：人工合成含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核酸的寡聚脱氧核苷酸序列，为TLR9配体。

Poly(I.C)：为一段人工合成的双链RNA分子类似物，是TLR3配体。

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

Native-PAGE：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

ELISA：酶联免疫吸附测定。

SBA：杀菌活性检测。

CFA：完全弗氏佐剂。

实施例1

1、设计B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白

将fHBP的3个变体序列全长进行融合，这个融合多肽氨基酸序列形式为：NH₂-A-[-X-L]₃-B-COOH，A表示N端氨基酸序列，X-表示不同变体中一个(V1或V2或V3)，L表示Linker接头序列，B表示C端氨基酸序列。

本实施例中，B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的融合顺序为V1-V2-V3。由于本实验中采用的3个变体序列之间有一定的相似性，因此采用双酶切连接的方式将其进行连接(如图1所示)。

2、技术方法

1)PCR分别扩增3个变体基因：

采用高保真DNA聚合酶将变体V1(B01株)、变体V2(A19株)和变体V3(A05株)分别扩增出来，且这3个PCR产物均包含各自的限制性内切酶识别位点。具体如下：

以含有V1变体全长基因序列(SEQ ID NO.1)的pPUC57质粒为模板，以V1F(SEQ IDNO.2)和V1R(SEQ ID NO.3)为引物，采用高保真DNA聚合酶扩增，得B01，其中加粗划线为相应的限制性内切酶识别序列。

V1,B01(SEQ ID NO.1)：

ATGAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGCGGTGTCACCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTGCGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCCCTGACATTGGAAGACTCCATTTCCCAAAACGGAACACTGACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTTAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGTTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAGTGTACAAACAAAGCCATTCCGCCTTAACCGCCCTTCAGACCGAGCAAGAACAAGATCCAGAGCATTCCGAGAAGATGGTTGCGAAACGCCGGTTCAGAATCGGCGACATAGCGGGCGAACATACATCTTTTGACAAGCTTCCCAAAGACGTCATGGCGACATATCGCGGGACGGCGTTCGGTTCAGACGATGCCGGCGGAAAACTGACCTATACTATAGATTTTGCTGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCGGAACTCAATGTCGATCTGGCCGTCGCCTATATCAAGCCGGATGAAAAACACCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTTCTTTACAACCAAGACGAGAAAGGCAGTTACTCCCTCGGTATCTTTGGCGAAAAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCGGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACACCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAA

V1F(SEQ ID NO.2)：

V1R(SEQ ID NO.3)：

以含有V2变体全长基因序列(SEQ ID NO.4)的pPUC57质粒为模板，以V2F(SEQ IDNO.5)和V2R(SEQ ID NO.6)为引物，采用高保真DNA聚合酶扩增，得A19，其中加粗划线为相应的限制性内切酶识别序列。

V2,A19(SEQ ID NO.4)

ATGAGCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCGCGGGGCTTGCCGATGCACTAACCGCACCGCTCGACCATAAAGACAAAAGTTTGCAGTCTTTGACGCTGGATCAGTCCGTCAGGAAAAACGAGAAACTGAAGCTGGCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTCAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGCTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCTGACGGCAAAGCCGAGTATCACGGCAAAGCATTCAGCTCCGACGATGCTGGCGGAAAACTGACCTATACCATAGATTTCGCCGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACACCTGAAAACACCCGAGCAAAATGTCGAGCTTGCCGCCGCCGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCCCTTTTCGGCGACCGCGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAGGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAACAGTAG

V2F(SEQ ID NO.5)：

V2R(SEQ ID NO.6)：

以含有V3变体全长基因序列(SEQ ID NO.7)的pPUC57质粒为模板，以V2F(SEQ IDNO.8)和V2R(SEQ ID NO.9)为引物，采用高保真DNA聚合酶扩增，得A19，其中加粗划线为相应的限制性内切酶识别序列。

V3,A05(SEQ ID NO.7)

ATGAGCAGCGGAAGCGGAAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACAGGGCTTGCCGATGCACTAACTGCGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCCCTGACATTGGAAGACTCCATTTCCCAAAACGGAACACTGACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGTCGGCGACAAAGACAACAGTCTCAATACAGGCAAATTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTTGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCAGCGGCAAAGCCGAGTATCACGGCAAAGCATTCAGCTCCGACGATGCCGGCGGAAAACTGACCTATACCATAGATTTTGCCGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACACCTGAAAACACCCGAGCAGAATGTCGAGCTTGCCTCCGCCGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCTCTTTTCGGCGACCGAGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAACAGTAG

V3F(SEQ ID NO.8)：

5’-CCCAAGCTTGGAGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCAC-3’

V3R(SEQ ID NO.9)：

5’-CCGCTCGAGCTGTTTGCCGGCGATGCCGATTTCG-3’

PCR扩增体系为：

10×buffer 5μL，dNTP 5μL，MgCl₂ 2μL，DNA模板100ng，引物F1.5μL，引物R1.5μL，KOD-plus-neo高保真PCR酶1μL，ddH₂O补足至50μL。

PCR条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸1min，循环30次，最后68℃延伸5min。将获得的PCR产物经DNA电泳检测，并采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR正确的产物进行纯化回收。

2)双酶切3个变体基因和表达载体pET28a，并分别回收酶切产物。即分别采用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切B01、BamHI和HindIII双酶切A19、HindIII和XhoI双酶切A05、NdeI和XhoI双酶切pET28a，均于37℃酶切反应1h。经DNA检测后，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物分别进行纯化回收，并测定回收产物的DNA浓度。

3)先将双酶切回收的B01、A19和A05进行等摩尔质量混合，在T4连接酶作用下于24℃反应1h，再将适量的pET28a双酶切产物加入上述的连接反应液中，反应体系定容至20μL，于24℃继续反应过夜。取适量连接产物通过热激法转化至克隆菌株E.coli DH5α中，由于pET28a含有卡那霉素抗性基因(简称Kan+)，采用含50μg/mL卡那霉素的LB平板对其进行筛选，37℃倒置孵育过夜。

4)挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，挑选鉴定正确的阳性克隆进行扩大培养，再采用质粒小提试剂盒从菌液中提取重组质粒，pET28a-B01-A19-A05。

5)采用限制性内切酶Nde I、BamH I和Xho I对提取的重组质粒进行酶切鉴定，即于37℃反应30min后进行DNA检测，电泳结果如图2所示，泳道3是DNA marker；泳道1是质粒2-5经Xho I和BamH I双酶切结果；泳道2是质粒2-8经Xho I和BamH I双酶切结果；理论上双酶切后显示2个条带(约1600bp和6100bp)，实验结果与此相符。泳道4是质粒2-5经Nde I和BamH I双酶切结果；泳道5是质粒2-8经Nde I和BamH I双酶切结果，理论上双酶切后显示2条带(约800bp和7000bp)，实验结果与此相符。经上述3种限制性酶切酶鉴定，这2个质粒均正确。

再将鉴定正确的重组质粒送至测序公司进行测序鉴定。

6)将构建正确的重组质粒转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)。挑取单菌落扩大培养，于37℃、200rpm培养至OD₆₀₀达到0.8，加入终浓度为1mM IPTG，诱导培养4h，收集菌体。

7)采用SDS-PAGE检测该融合蛋白是否成功表达。

8)Ni-柱亲和层析纯化融合蛋白，即将收集的菌体的用适量的裂解缓冲液悬匀，并经超声破碎处理，使细胞破碎释放胞内蛋白，离心后的上清进行Ni-柱上样、漂洗和洗脱后收集样品，并经SDS-PAGE检测，结果如图3所示，其中，泳道1为菌体经超声破碎处理并离心后的上清液的电泳结果，泳道2为菌体经超声破碎处理并离心后的沉淀结果，泳道3为分子量Marker的结果，经Ni柱纯化时，泳道4和5显示流穿和50mM咪唑缓冲液漂洗这2步可以出去大部分杂蛋白，泳道6、7、8依次表示纯化过程中经100mM、250mM、500mM咪唑缓冲液洗脱出的组分。目的蛋白从100mM-500mM咪唑缓冲液条件下可被洗脱出，获得纯度相对较高的融合蛋白，大小约88kDa。

表达融合蛋白B01-A19-A05的基因序列(SEQ ID NO.10)如下：

ATGGGTCCTGACAGCGACCGCTTGCAGCAACGCCGCGTCACCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTGCGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCCCTGACATTGGAAGACTCCATTTCCCAAAACGGAACACTGACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTTAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGTTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAGTGTACAAACAAAGCCATTCCGCCTTAACCGCCCTTCAGACCGAGCAAGAACAAGATCCAGAGCATTCCGAGAAGATGGTTGCGAAACGCCGGTTCAGAATCGGCGACATAGCGGGCGAACATACATCTTTTGACAAGCTTCCCAAAGACGTCATGGCGACATATCGCGGGACGGCGTTCGGTTCAGACGATGCCGGCGGAAAACTGACCTATACTATAGATTTTGCTGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCGGAACTCAATGTCGATCTGGCCGTCGCCTATATCAAGCCGGATGAAAAACACCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTTCTTTACAACCAAGACGAGAAAGGCAGTTACTCCCTCGGTATCTTTGGCGAAAAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCGGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACACCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGGGATCCGGAGGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCGCGGGGCTTGCCGATGCACTAACCGCACCGCTCGACCATAAAGACAAAAGTTTGCAGTCTTTGACGCTGGATCAGTCCGTCAGGAAAAACGAGAAACTGAAGCTGGCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTCAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGCTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCTGACGGCAAAGCCGAGTATCACGGCAAAGCATTCAGCTCCGACGATGCTGGCGGAAAACTGACCTATACCATAGATTTCGCCGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACACCTGAAAACACCCGAGCAAAATGTCGAGCTTGCCGCCGCCGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCCCTTTTCGGCGACCGCGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAGGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAACAGGGTAAGCTTGGAGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACAGGGCTTGCCGATGCACTAACTGCGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCCCTGACATTGGAAGACTCCATTTCCCAAAACGGAACACTGACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGTCGGCGACAAAGACAACAGTCTCAATACAGGCAAATTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTTGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCAGCGGCAAAGCCGAGTATCACGGCAAAGCATTCAGCTCCGACGATGCCGGCGGAAAACTGACCTATACCATAGATTTTGCCGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACACCTGAAAACACCCGAGCAGAATGTCGAGCTTGCCTCCGCCGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCTCTTTTCGGCGACCGAGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAACAGTAG

B01-A19-A05融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)如下：

其中单下划线部分为构建融合蛋白的表达质粒时，由扩增引物序列中引入。第一段单下划线部分是通过设计在三个变体的融合蛋白的N端额外添加的一小段序列(SEQ IDNO.12)，目的是确保连接好的融合序列能够异源表达且蛋白正确折叠。中间的GS(SEQ IDNO.13)连接V1变体(SEQ ID NO.14，双下划线)与V2变体(SEQ ID NO.15，波浪下划线)、GKLG(SEQ ID NO.16)连接V2变体与V3变体(SEQ ID NO.17，虚线下划线)，一方面用于将这3个变体连接起来，另一方面促进融合蛋白(SEQ ID NO.11)的有效折叠和表达。

9)Western Blot(蛋白印迹)检测蛋白抗原特性，即先采用Native-PAGE胶电泳融合蛋白，再转至PVDF膜上，经封闭、一抗、酶标二抗结合、显色后拍照检测。其中一抗为：单克隆抗体JAR4(NIBSC，09/170)和JAR5(NIBSC，13/216)。检测结果如图4所示，泳道1表示阴性对照；泳道2表示B01-A19-A05与JAR4的反应结果；泳道3表示B01-A19-A05与JAR5的反应结果。可见该B01-A19-A05融合蛋白与针对MenB fHBP中两个主要抗原表位的单克隆抗体JAR4和JAR5发生结合反应。

实施例2疫苗制备与免疫效果测试

疫苗制备：在无菌条件下，分别将实施例1制备得到的融合蛋白与弗氏佐剂(第1次免疫用完全弗氏佐剂，第2次免疫用不完全弗氏佐剂)以体积比1:1混合、3个等量的变体蛋白(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.12-14)混匀后与弗氏佐剂以体积比1:1混合，且确保3个等量变体蛋白的总摩尔数和融合蛋白的摩尔数同等，于冰浴条件下进行超声乳化。

SEQ ID NO.18[V1，B01，成熟肽]

MSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQSEQ ID NO.19[V2，A19，成熟肽]

MSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQSEQ ID NO.20[V3，A05，成熟肽]

MSSGSGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ

小鼠免疫：4-6周龄小鼠20只，分为4组，分别用以下4种试剂免疫小鼠：阴性对照(PBS)、实施例1所述的融合蛋白、3个变体蛋白混合物、实施例1所述的融合蛋白-弗氏佐剂，除了对照组，每只小鼠的免疫剂量中蛋白含量为10μg。在第0周和第4周各免疫1剂，共免疫2剂，腹腔注射，且在最后一次免疫后的第2周进行眼球采血。

一、常规ELISA检测血清抗体滴度

先用等量的三个变体蛋白的单体分别包被96孔板，封闭后，依次加入不同稀释倍数的一抗血清孵育、酶标二抗孵育、加入酶检测底物、检测，结果如图5所示。可见，以变体V1(B01株)、变体V2(A19株)和变体V3(A05株)三个变体融合形成的B01-A19-A05融合蛋白免疫小鼠，要比三个单体蛋白的混合物具有更强的免疫原性，而且在CFA的辅助下嵌合体诱导了更高滴度的血清抗体。V1+V2+V3未加佐剂，和V1-V2-V3进行对照。意在说明，嵌合体的重组蛋白要比单体蛋白的混合物免疫原性强，而嵌合体在CFA的辅助下诱导了更强的抗体应答水平。通过这个实施案例，由此我们推测，在其他适合于人体免疫的佐剂的辅助下嵌合体重组蛋白可能会诱导增强的抗体应答和有效的杀菌活性，从而具有成苗的可能性。

二、SBA检测血清的杀菌活性

先将MenB菌株涂布于巧克力平板上，于37℃、5％CO₂条件下培养过夜，将单菌落接种于Mueller-Hinton培养基中将菌液初始OD₆₂₀控制在0.05-0.08，于37℃摇床培养至OD₆₂₀达到0.23-0.24，并测定菌活力。所有所需被测试的小鼠血清先于56℃加热灭活30min，每孔中总体积为50μL，包括25μL连续两倍稀释的测试血清、12.5μL细菌工作液和12.5μL兔补体。PBS对照组的比值(1:1)指的是，对照组血清不稀释与菌液和抗体混合后菌落如不加血清的对照组一样正常生长。免疫血清组的比值指的是将免疫血清2倍系列稀释，分别与菌液和补体混合涂板，以不出现菌落的免疫血清最高稀释度作为免疫血清的SBA效价。加入补体后，立即取10μL对照涂布于Mueller-Hinton琼脂平板上，于37℃孵育1h。每个样品各取7μL点在Mueller-Hinton琼脂平板上，于37℃孵育18h。表1数据表示的是小鼠免疫血清对不同fHBP变异体菌株的杀菌活性。可见融合蛋白形成的嵌合体所诱导的杀菌活性与变体蛋白的单体混合物所诱导的杀菌活性无差异，但与前两组相比，佐剂化的嵌合蛋白诱导了明显增强的杀菌活性。

表1小鼠血清对不同fHBP变异体菌株的杀菌活性

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州微超生物科技有限公司

<120> B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白及其制备方法与应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

atgagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtca ccgccgacat cggcacgggg 60

cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120

ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 180

acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 240

ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 300

ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 360

gatccagagc attccgagaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 420

ggcgaacata catcttttga caagcttccc aaagacgtca tggcgacata tcgcgggacg 480

gcgttcggtt cagacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ctatagattt tgctgccaaa 540

cagggacacg gcaaaatcga acatttgaaa tcgccggaac tcaatgtcga tctggccgtc 600

gcctatatca agccggatga aaaacaccat gccgtcatca gcggttccgt tctttacaac 660

caagacgaga aaggcagtta ctccctcggt atctttggcg aaaaagccca ggaagttgcc 720

ggcagcgcgg aagtggaaac cgcaaacggc atacaccata tcggtcttgc cgccaagcag 780

taa 783

<210> 2

<211> 71

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

ggaattccat atgatgggtc ctgacagcga ccgcttgcag caacgccgcg tcaccgccga 60

catcggcacg g 71

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

cgggatcctt agtggtggtg gtggtggtgt tcaagctgct tggcggcaag accg 54

<210> 4

<211> 765

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60

accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120

aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180

gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240

caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300

caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360

gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420

ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480

gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540

gaacacctga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgccg ccgccgaact caaagcagat 600

gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcagcgaaga aaaaggcact 660

taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720

ataggggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

cgggatccgg aggcggcggt gtcgccgccg acat 34

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

cccaagctta ccctgtttgc cggcgatgcc g 31

<210> 7

<211> 786

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

atgagcagcg gaagcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacagggctt 60

gccgatgcac taactgcgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 120

gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 180

ttcaaagtcg gcgacaaaga caacagtctc aatacaggca aattgaagaa cgacaaaatc 240

agccgcttcg actttgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 300

ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 360

atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 420

ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccagcg gcaaagccga gtatcacggc 480

aaagcattca gctccgacga tgccggcgga aaactgacct ataccataga ttttgccgcc 540

aaacagggac acggcaaaat cgaacacctg aaaacacccg agcagaatgt cgagcttgcc 600

tccgccgaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgccgtca ttttgggcga cacgcgctac 660

ggcagcgaag aaaaaggcac ttaccacctc gctcttttcg gcgaccgagc ccaagaaatc 720

gccggctcgg caaccgtgaa gataagggaa aaggttcacg aaatcggcat cgccggcaaa 780

cagtag 786

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

cccaagcttg gaggcggtgt cgccgccgac atcggcac 38

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

ccgctcgagc tgtttgccgg cgatgccgat ttcg 34

<210> 10

<211> 2310

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

atgggtcctg acagcgaccg cttgcagcaa cgccgcgtca ccgccgacat cggcacgggg 60

cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120

ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 180

acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 240

ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 300

ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 360

gatccagagc attccgagaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 420

ggcgaacata catcttttga caagcttccc aaagacgtca tggcgacata tcgcgggacg 480

gcgttcggtt cagacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ctatagattt tgctgccaaa 540

cagggacacg gcaaaatcga acatttgaaa tcgccggaac tcaatgtcga tctggccgtc 600

gcctatatca agccggatga aaaacaccat gccgtcatca gcggttccgt tctttacaac 660

caagacgaga aaggcagtta ctccctcggt atctttggcg aaaaagccca ggaagttgcc 720

ggcagcgcgg aagtggaaac cgcaaacggc atacaccata tcggtcttgc cgccaagcag 780

ggatccggag gcggcggtgt cgccgccgac atcggcgcgg ggcttgccga tgcactaacc 840

gcaccgctcg accataaaga caaaagtttg cagtctttga cgctggatca gtccgtcagg 900

aaaaacgaga aactgaagct ggcggcacaa ggtgcggaaa aaacttatgg aaacggcgac 960

agcctcaata cgggcaaatt gaagaacgac aaggtcagcc gcttcgactt tatccgtcaa 1020

atcgaagtgg acgggcagct cattaccttg gagagcggag agttccaaat atacaaacag 1080

gaccactccg ccgtcgttgc cctacagatt gaaaaaatca acaaccccga caaaatcgac 1140

agcctgataa accaacgctc cttccttgtc agcggtttgg gcggagaaca taccgccttc 1200

aaccaactgc ctgacggcaa agccgagtat cacggcaaag cattcagctc cgacgatgct 1260

ggcggaaaac tgacctatac catagatttc gccgccaaac agggacacgg caaaatcgaa 1320

cacctgaaaa cacccgagca aaatgtcgag cttgccgccg ccgaactcaa agcagatgaa 1380

aaatcacacg ccgtcatttt gggcgacacg cgctacggca gcgaagaaaa aggcacttac 1440

cacctcgccc ttttcggcga ccgcgcccaa gaaatcgccg gctcggcaac cgtgaagata 1500

ggggaaaagg ttcacgaaat cggcatcgcc ggcaaacagg gtaagcttgg aggcggtgtc 1560

gccgccgaca tcggcacagg gcttgccgat gcactaactg cgccgctcga ccataaagac 1620

aaaggtttga aatccctgac attggaagac tccatttccc aaaacggaac actgaccctg 1680

tcggcacaag gtgcggaaaa aactttcaaa gtcggcgaca aagacaacag tctcaataca 1740

ggcaaattga agaacgacaa aatcagccgc ttcgactttg tgcaaaaaat cgaagtggac 1800

ggacaaacca tcacgctggc aagcggcgaa tttcaaatat acaaacagga ccactccgcc 1860

gtcgttgccc tacagattga aaaaatcaac aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac 1920

caacgctcct tccttgtcag cggtttgggc ggagaacata ccgccttcaa ccaactgccc 1980

agcggcaaag ccgagtatca cggcaaagca ttcagctccg acgatgccgg cggaaaactg 2040

acctatacca tagattttgc cgccaaacag ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca 2100

cccgagcaga atgtcgagct tgcctccgcc gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc 2160

gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc gaagaaaaag gcacttacca cctcgctctt 2220

ttcggcgacc gagcccaaga aatcgccggc tcggcaaccg tgaagataag ggaaaaggtt 2280

cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag 2310

<210> 11

<211> 769

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 11

Met Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg Val Thr Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn

50 55 60

Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg

65 70 75 80

Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu

85 90 95

Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr

100 105 110

Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met

115 120 125

Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr

130 135 140

Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr

145 150 155 160

Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp

165 170 175

Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro

180 185 190

Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys

195 200 205

His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys

210 215 220

Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu

245 250 255

Ala Ala Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly

260 265 270

Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys

275 280 285

Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys

290 295 300

Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp

305 310 315 320

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp

325 330 335

Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser

340 345 350

Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu

355 360 365

Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn

370 375 380

Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe

385 390 395 400

Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser

405 410 415

Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala

420 425 430

Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn

435 440 445

Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala

450 455 460

Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr

465 470 475 480

His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala

485 490 495

Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys

500 505 510

Gln Gly Lys Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu

515 520 525

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys

530 535 540

Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu

545 550 555 560

Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn

565 570 575

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp

580 585 590

Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser

595 600 605

Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu

610 615 620

Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn

625 630 635 640

Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe

645 650 655

Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser

660 665 670

Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala

675 680 685

Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn

690 695 700

Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala

705 710 715 720

Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr

725 730 735

His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala

740 745 750

Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys

755 760 765

Gln

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 12

Met Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 13

<211> 2

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 13

Gly Ser

1

<210> 14

<211> 248

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 14

Val Thr Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

1 5 10 15

Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser

20 25 30

Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys

35 40 45

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

50 55 60

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

65 70 75 80

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

85 90 95

Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His

100 105 110

Ser Glu Lys Met Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala

115 120 125

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr

130 135 140

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr

145 150 155 160

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His

165 170 175

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys

180 185 190

Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

195 200 205

Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala

210 215 220

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His

225 230 235 240

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245

<210> 15

<211> 251

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala

1 5 10 15

Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr

20 25 30

Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln

35 40 45

Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys

50 55 60

Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu

65 70 75 80

Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr

85 90 95

Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn

100 105 110

Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val

115 120 125

Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly

130 135 140

Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly

145 150 155 160

Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys

165 170 175

Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala

180 185 190

Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr

195 200 205

Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly

210 215 220

Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu

225 230 235 240

Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

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<400> 16

Gly Lys Leu Gly

1

<210> 17

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<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 17

Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr

1 5 10 15

Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu

20 25 30

Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala

35 40 45

Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly

50 55 60

Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile

65 70 75 80

Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile

85 90 95

Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile

100 105 110

Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu

115 120 125

Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser

130 135 140

Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly

145 150 155 160

Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly

165 170 175

Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser

180 185 190

Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp

195 200 205

Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe

210 215 220

Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg

225 230 235 240

Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

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<212> PRT

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Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn

50 55 60

Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg

65 70 75 80

Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu

85 90 95

Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr

100 105 110

Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met

115 120 125

Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr

130 135 140

Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr

145 150 155 160

Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp

165 170 175

Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro

180 185 190

Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys

195 200 205

His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys

210 215 220

Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu

245 250 255

Ala Ala Lys Gln

260

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Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 20

<211> 261

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 20

Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly

35 40 45

Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly

50 55 60

Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile

85 90 95

Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala

100 105 110

Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp

115 120 125

Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu

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His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly

145 150 155 160

Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile

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Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr

180 185 190

Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu

195 200 205

Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu

210 215 220

Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly

245 250 255

Ile Ala Gly Lys Gln

260

Claims

1.一种B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列包括：fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列，所述fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列通过连接子依次连接。

2.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，其特征在于，所述fHBP变体V1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；及/或

所述fHBP变体V2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；及/或

所述fHBP变体V3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，其特征在于，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.16所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，其特征在于，所述fHBP变体V1的氨基酸序列的N端，还连接有多肽序列SEQ ID NO.12。

5.根据权利要求1-3任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.一种编码如权利要求1-5任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因。

7.根据权利要求6所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为a:如SEQ ID NO.10所示的序列；或b:与a的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列。

8.一种重组质粒，其特征在于，包含有权利要求6或7所述的编码基因。

9.一种重组细胞，其特征在于，转化有如权利要求8所述的重组质粒。

10.一种如权利要求1-5任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供权利要求8所示的重组质粒；

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，编码B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述编码B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白的基因，制备方法包括：

以SEQ ID NO.1为模板，SEQ ID NO.2-3为引物，扩增得到序列A；

以SEQ ID NO.4为模板，SEQ ID NO.5-6为引物，扩增得到序列B；

以SEQ ID NO.7为模板，SEQ ID NO.8-9为引物，扩增得到序列C；

将所述序列A、所述序列B、所述序列C连接。

13.权利要求1-5任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白在制备防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗中的应用。

14.一种防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗，其特征在于，包括：权利要求1-5任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白。

15.根据权利要求14所述的防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗，其特征在于，还包括：佐剂。

16.根据权利要求15所述的防治B群脑膜炎球菌感染的疫苗，其特征在于，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)中的至少一种。

17.权利要求1-5任一项所述的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白在制备抗B群脑膜炎球菌的抗体中的应用。

18.一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，其特征在于，由如权利要求14-16任一项所述的疫苗免疫动物而制备得到。