CN109180822B - 一种猪链球菌b细胞优势表位串联疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪链球菌B细胞优势表位串联蛋白，同时本发明涉及一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的制备方法，第三方面，本发明公开了B细胞优势表位串联基因和融合蛋白在制备疫苗中的应用，本发明通过软件筛选出猪链球菌保护性抗原GAPDH、MRP和DLDH的B细胞优势表位并以氨基酸序列为GGGG的柔性片段进行串联，将上述串联片段构建重组表达载体进行原核表达，纯化表达的融合蛋白并与弗氏佐剂制成疫苗制剂，经小鼠免疫效力评价表明该疫苗能够对2型猪链球菌提供高效的免疫保护效力，相对于传统灭活疫苗和弱毒疫苗，本发明提供的基因工程疫苗具备制备流程方便安全，生产效率高，所得产物纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。

Description

一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程亚单位疫苗生产领域，尤其涉及一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗及其制备方法。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis)是一类重要的人兽共患病原菌，可引起猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎和败血症等疾病。目前已知35个血清型(1-34，1/2)，其中1、2、7、9型为致病型，又以2型的致病性为最强，在我国流行最广，猪群携带率较高(XU J,MU Y,ZHANG Y,et al.Antibacterial effect of porcine PTX3 against Streptococcus suis type2infection.[J]Microb Pathog,2015,89:128-139)。1998年江苏和2005年四川先后暴发猪链球菌疫情，对我国养猪业造成较大冲击(YU H,JING H,Chen Z,etal.HumanStreptococcus suis outbreak,Sichuan,China.[J]Emerg Infect Dis,2006,12(6):914-920)。
当前，猪群中猪链球菌的防治主要依靠疫苗接种，但是传统疫苗存在交叉保护力不佳以及生物安全隐患等多种问题，而基因工程亚单位疫苗具有纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。
抗原表位是免疫识别的标志，是抗原特异性的结构基础，同时也是全抗原引起的保护性免疫应答的主要途径。因此，基于B细胞优势表位的疫苗设计，可以激发机体产生强力有效的特异性免疫应答，发挥高效的免疫保护力。
现有技术表明磷酸-3-甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH)是猪链球菌中的三个重要保护性抗原，然而目前尚未有针对以上三种抗原分子尤其是三种抗原分子相结合进行B细胞优势抗原表位分析设计，并由此生产基因工程疫苗的的相关报道。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于优势B细胞抗原表位筛选的新型高效猪链球菌基因工程疫苗及其制备方法，具有制备流程方便安全，生产效率高，所得产物纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点，相对于存在灭活工艺安全性隐患的传统灭活疫苗，以及存在毒力返强以及潜在的生物安全性问题的弱毒疫苗具有明显优势。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种基于优势B细胞抗原表位筛选的新型高效猪链球菌基因工程疫苗及其制备方法，该疫苗能够激发机体产生强力有效的特异性免疫应答，发挥高效的免疫保护力。
为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种猪链球菌B细胞优势表位串联蛋白，该串联蛋白为融合蛋白。
进一步地，进一步地，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，本发明提供了一种制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，步骤包括：
(1)B细胞优势表位筛选；
(2)B细胞优势表位串联基因设计及质粒的构建；
(3)融合蛋白表达及纯化；
(4)制备所述B细胞优势表位串联疫苗；
(5)所述疫苗的免疫效力评价。
进一步地，猪链球菌为猪链球菌ZY05719菌株；
进一步地，步骤(1)具体操作步骤为：分析猪链球菌GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白一级结构信息，设计B细胞优势表位串联疫苗时删除信号肽段、膜锚定结构域和处于膜内的肽段，利用ABCpred工具、BepiPred工具预测GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白的B细胞优势表位片段，分析GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白的二级结构，确定GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白的B细胞优势表位。
进一步地，最终确定GAPDH蛋白的优势B细胞表位区段为：79-85，188-200，268-278；MRP蛋白优势B细胞表位区段为:245-260，296-311，443-472，611-619，659-669，809-837，880-905，923-938，1034-1049，1202-1217；DLDH蛋白优势B细胞表位区段为：21-32，451-457。
进一步地，步骤(2)具体操作步骤为：将步骤(1)所得的B细胞优势表位的不同片段按照GAPDH-MRP-DLDH的顺序通过柔性肽段串联在一起，在N端和C端分别引入酶切位点，完成B细胞优势表位串联基因设计，形成融合蛋白基因，进而构建质粒。
进一步地，N端引入的酶切位点为BamHI位点。
进一步地，C端引入的酶切位点为XhoI位点。
进一步地，柔性肽段的氨基酸序列为GGGG。
进一步地，步骤(3)具体操作步骤为：将步骤(2)所得的质粒利用热激转化法转入大肠杆菌中，经测定评价后，确认串联蛋白表达菌株，经诱导培养后，采用His镍柱纯化表达的融合蛋白。
进一步地，步骤(4)具体操作步骤为：利用弗氏佐剂和步骤(3)获得的融合蛋白制备所述B细胞优势表位串联疫苗。
进一步地，融合蛋白与弗氏佐剂的体积比为1:1。
第三个方面本发明提供了B细胞优势表位串联基因和融合蛋白的应用。
上述应用为，B细胞优势表位串联基因和融合蛋白在制备疫苗中的应用，用于提供抗2型猪链球菌的免疫应答。
本发明将通过生物信息学软件筛选出的猪链球菌保护性抗原GAPDH、MRP和DLDH优势B细胞表位通过氨基酸序列为GGGG的柔性片段进行串联(简称GMD蛋白)，构建重组质粒GMD-pET28a，将原核表达并纯化后的GMD蛋白配合弗氏佐剂制成的疫苗制剂免疫雌性BALB/c小鼠，该蛋白对2型猪链球菌HA9801菌株能够提供高效的免疫保护效力，相对于存在灭活工艺安全性隐患的传统灭活疫苗，以及存在毒力返强以及潜在的生物安全性问题的弱毒疫苗，本发明提供的基因工程疫苗具备制备流程方便安全，生产效率高，所得产物纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明实施例1由TMHMM工具预测的GAPDH蛋白跨膜区结果示意图；
图2是本发明实施例1由TMHMM工具预测的MRP蛋白跨膜区结果示意图；
图3是本发明实施例1由TMHMM工具预测的DLDH蛋白跨膜区结果示意图；
图4是本发明实施例1由SignalP工具预测的GAPDH蛋白信号肽结果示意图；
图5是本发明实施例1由SignalP工具预测的MRP蛋白信号肽结果示意图；
图6是本发明实施例1由SignalP工具预测的DLDH蛋白信号肽结果示意图；
图7是本发明实施例1由SOPMA工具预测的GAPDH-MRP-DLDH蛋白二级结构结果示意图；
图8是本发明实施例1由Protean软件预测的GAPDH蛋白亲水性及抗原性结果示意图；
图9是本发明实施例1由Protean软件预测的MRP蛋白亲水性及抗原性结果示意图；
图10是本发明实施例1由Protean软件预测的DLDH蛋白亲水性及抗原性结果示意图；
图11是本发明实施例3表位蛋白GMD原核表达PCR鉴定结果示意图；
图12是本发明实施例3表位蛋白GMD原核表达裂解后SDS-PAGE凝胶电泳结果示意图；
图13是本发明实施例4由ELISA法检测各受试小鼠血清特异性抗体结果示意图；
图14是本发明实施例4中受试小鼠攻击实验后存活状况示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所涉及的猪链球菌即2型猪链球菌HA9801菌株由南京农业大学陆承平教授惠赠(姚火春,陈国强,陆承平.猪链球菌1998分离株病原特性鉴定.南京农业大学学报,1999(02):70-73.)。
本发明使用的溶液配方如下：
初始缓冲液(pH 7.4):20mM磷酸钠，0.5mM氯化钠，20mM咪唑；
溶解缓冲液(pH 7.4，0.22微米过滤)：20mM磷酸钠，0.5mM氯化钠，40mM/60mM/80mM咪唑；
洗脱缓冲液(pH 7.4，0.22微米过滤)：20mM磷酸钠，0.5mM氯化钠，0.2M咪唑；
PBS(pH 7.4，0.01M)：8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠，0.27g磷酸二氢钾，800ml双蒸水，0.1M的盐酸或氢氧化钠调pH至7.4±0.05，定容至1L；
PBST：PBS+0.05％吐温-20
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠；
LB固体培养基：LB液体培养基+15g/L琼脂粉。
实施例1
抗原表位筛选
(1)蛋白质一级结构分析
根据NCBI公布的猪链球菌ZY05719菌株的GAPDH、MRP、DLDH蛋白氨基酸序列(登录号分别为AKG39592.1、AKG40097.1、AKG41058.1)，应用在线TMHMM工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白跨膜区,应用在线SignalP工具http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析蛋白质信号肽区域。
经TMHMM工具分析预测得到的结果为：GAPDH蛋白无跨膜区，其1-336个氨基酸序列均为胞外片段(如图1所示)；MRP蛋白存在一个跨膜区，位于23-45位氨基酸，如图2所示，该蛋白的N端在胞内，46-1256位氨基酸处于胞外；DLDH蛋白的1-586位氨基酸为胞外片段，无跨膜区(如图3所示)。经SignalP工具预测得到的结果为：GAPDH和DLDH蛋白无信号肽区域(如图4和图6所示)；MRP蛋白的1-47位氨基酸为蛋白信号肽区域(如图5所示)。删除上述预测的信号肽、膜内(胞浆)片段及跨膜区片段，所得片段信息用于进行下一步的优势B细胞抗原表位预测。
(2)蛋白优势B细胞抗原表位预测
将步骤(1)最终得到的片段信息采用基于人工神经网络算法的ABCpred技术(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html)和基于氨基酸的理化性质和隐形马尔可夫模型的BepiPred 2.0技术(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)分别进行优势B细胞抗原表位预测，其中，ABCpred预测选取得分为0.85以上的表位片段，预测获得GAPDH、MRP、DLDH蛋白优势B细胞表位区段，以肽链中氨基酸的序列数表示(请见表1)。采用BepiPred方法，预测GAPDH、MRP、DLDH蛋白的优势B细胞表位区段，以肽链中氨基酸的序列数表示(请见表2)。综合ABCpred方案与BepiPred方案的重叠区段，最终获得GAPDH蛋白的优势B细胞表位区段为(以肽链中氨基酸的序列数表示)：79-85，188-200，268-278；MRP蛋白优势B细胞表位区段为:245-260，296-311，443-472，611-619，659-669，809-837，880-905，923-938，1034-1049，1202-1217；DLDH蛋白优势B细胞表位区段为：21-32，451-457。
表1 ABCpred方案预测猪链球菌蛋白优势抗原表位的肽段位置
Figure GDA0003113351180000051
表2 Bepipred方案预测猪链球菌蛋白优势表位的肽段位置
Figure GDA0003113351180000061
(3)蛋白质二级结构分析。
为验证步骤(2)中预测获得的3种蛋白优势B细胞抗原表位的合理性，利用SOPMA软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)，预测获得的蛋白优势B细胞抗原表位区段能否展示于重组蛋白表面，从而被B细胞正确识别。依据步骤(2)预测获得的GAPDH、MRP、DLDH蛋白的优势B细胞抗原表位，按照GAPDH-MRP-DLDH的顺序所有表位依次进行组合拼接，各多肽间接头氨基酸采用GGGG柔性片段连接，即得到GMD重组蛋白的氨基酸序列，SOPMA软件预测结果如图7所示，c为无规则卷曲，e为β-片层，h为α-螺旋，t为β-转角，GMD重组蛋白的氨基酸序列基本覆盖全蛋白的无规则卷曲与转角区段，属于蛋白的暴露表面，从而会增加重组蛋白的识别率。使用DNASTAR Protean软件，验证蛋白的亲水性、可柔性、表面可极性与抗原指数，验证的GAPDH、MRP和DLDH蛋白抗原性结果如图8-图10所示，结果显示预测的氨基酸片段均处于抗原性较好的区段。
实施例2
串联表位疫苗设计及质粒构建
依据实施例1预测获得的GAPDH、MRP、DLDH蛋白的优势B细胞抗原表位，按照GAPDH-MRP-DLDH的顺序将所有表位依次进行组合拼接，各多肽间接头氨基酸采用GGGG柔性片段，以减少各个表位间的相互影响。GAPDH-MRP-DLDH串联表位蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重组蛋白氨基酸数为291aa。根据GAPDH(Genbank登录号：ZY05719_00895)、MRP(Genbank登录号：ZY05719_03650)、DLDH(Genbank登录号：ZY05719_08710)原始参考序列将上述串联序列进行密码子优化并在N端和C端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，最终获得GAPDH-MRP-DLDH串联表位蛋白的核苷酸序列。基因合成和质粒构建工作由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成，以质粒pET-28a(+)为表达载体，获得GAPDH-MRP-DLDH串联表位蛋白重组质粒pET-28a(+)-GMD。
实施例3
串联表位蛋白GMD的原核表达及纯化
(1)表位蛋白的原核表达。将实施例2构建好的重组质粒pET-28a(+)-GMD 42℃热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21(购自北京全式金生物技术有限公司)，对复苏后的感受态细菌5000转/分钟离心5分钟后重悬于100μL的LB液体培养基中，重悬后的细胞涂布在具有卡那霉素的LB平板上，37℃温箱过夜培养。使用无菌枪头挑选平板上的单克隆，置于含卡那霉素(50μg/mL)的1mL LB液体培养基内，37℃恒温摇床，220转/分钟培养4小时。利用菌落PCR的方法进行克隆鉴定，PCR所用引物为：上游引物GMD-F：5’-ACGGGATCCGAACCGGGTAATATT-3’，下游引物GMD-R：5’-ACGCTCGAGTTACAGTTTTGCTTT-3’，该引物由上海睿勉公司合成。PCR 20μL反应体系为：1μL上游引物、1μL下游引物、10μL 2×ExTaqMix、1μL模板和7μL超纯水。PCR反应条件如下:95℃预变性5分钟；30个循环(94℃1分钟，55℃90秒，72℃1分钟)；72℃延伸10分钟。同时将菌液送赛默飞世尔科技(中国)有限公司进行测序。测定的序列经BLAST软件比对分析与设计的串联优势B细胞抗原表位核苷酸序列一致，由此获得验证后的pET-28a(+)-GMD重组质粒(如图11所示)；将pET-28a(+)-GMD重组质粒表达菌株以1:100的体积比例接种至含卡那霉素的LB培养液中(卡那霉素终浓度为50μg/mL)，37℃振荡培养2～3小时后，当菌液浓度达OD600为0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，购自上海翌圣公司)至终浓度1mmol/mL进行诱导，继续振荡培养4小时，离心收集沉淀，加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5分钟，含pET-28a(+)空质粒的对照菌也作同样处理，用12.5％SDS-PAGE确定蛋白正确表达。
(2)采用His镍柱(购自上海生工)纯化融合蛋白。包括如下步骤：
a.大肠杆菌表达蛋白：400mL pET-28a(+)-GMD重组质粒表达菌液37℃，150-180转摇床培养2-3小时(OD600＝0.4-0.6)，取1mL菌液离心，沉淀加80μL PBS和20μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，加入1mM/mL的IPTG，继续震摇诱导约5小时,取1mL菌液离心，沉淀加80μL PBS和20μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，确定蛋白表达；
b.菌体超声破碎：将步骤a中菌液低温(4℃)8000转/分钟离心15分钟，弃上清，沉淀加入3mL PBS缓冲液，重悬后再次低温(4℃)8000转/分钟离心15分钟，沉淀加入适量PBS缓冲液重悬，将所得菌液进行超声破碎，破碎条件为：200瓦，工作时间5秒，间隙15秒，99次；4℃，8000转/分钟,离心超声液15分钟，收集上清，取样16μL，加入4μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，同时适量PBS缓冲液重悬沉淀取样16μL，加入4μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳。如图12所示，SDS-PAGE电泳结果表明GMD蛋白大小为43.3kDa，GMD蛋白在超声裂解后的上清和沉淀中均存在。
c.镍柱纯化蛋白：将含有蛋白的上清用0.22μm滤膜过滤，同时准备镍柱，用注射器吸满5mL蒸馏水，用提供的接头将柱子和注射器连起来，以1mL/分钟的流速洗柱，之后用5mL溶解缓冲液以1mL/分钟流速过柱，将过滤好的蛋白液过柱，收集流出液，取样16μL，加入4μL5×SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后用10mL溶解缓冲液以1mL/分钟流速洗柱，收集流出液，取样16μL，加入4μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后用5mL洗脱缓冲液以1mL/分钟流速洗柱,将流出液每1mL分装在一个1.5mLEP管中，取样16μL，加入4μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后用10mL溶解缓冲液以1mL/分钟流速洗柱，再用5mL 20％乙醇洗柱，用提供的盖子将镍柱盖上，放于4℃保存；
d.透析法进行蛋白复性：将透析袋剪成适当长度(10-20cm)，放入大量含10mM碳酸氢钠和1mM EDTA(PH8.0)的溶液中煮沸30分钟，用去离子水彻底清洗透析袋，将步骤c中所得蛋白液装入透析袋中，依次放入大于10倍蛋白体积的PBS中进行透析，4℃透析12小时，之后将透析后的蛋白液12000转/分钟离心15分钟，收集上清。
e.BCA蛋白定量检测试剂盒(购自北京雷根公司)检测蛋白含量：用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度为3.34mg/ml，将GMD蛋白保存于结合缓冲液中，-20℃储存备用。
实施例4
小鼠体内的免疫效力评价
(1)GMD表位蛋白对小鼠免疫实验：使用弗氏佐剂(CFA/IFA)制备GMD疫苗。选取6周龄SPF级别雌性BALB/c小鼠40只，随机分成4组，每组10只。其中第1组小鼠免疫200μL(250μg/mL)GMD蛋白，第2组小鼠免疫100μL(500μg/mL)蛋白+100μL弗氏佐剂(V:V＝1:1)；第3组小鼠免疫100μL PBS+100μL弗氏佐剂(V:V＝1:1)，作为阴性对照；第4组小鼠免疫200μLPBS，作为空白对照。各试验组小鼠均采用皮内注射的免疫途径。第一次免疫10天后进行第二次免疫，再过10天后进行第三次免疫。所有小鼠在免疫实验过程中，均无发生死亡情况，即GMD疫苗在动物实验中安全。
(2)血清抗体滴度测定：在第一次免疫后第9天、19天、29天分别取各组小鼠进行眼球内眦静脉采血，分离血清用于特异性抗体水平检测。采用间接ELISA法检测各试验组小鼠血清特异性IgG抗体滴度消长规律。分别使用100μL 50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释的灭活HA9801菌液按照8×107CFU的浓度包被96孔板，于4℃过夜。包被过夜的平板使用PBST清洗三遍后，每孔加入300μL使用PBST溶解的5％脱脂奶，在37℃下温育2小时后再使用PBST清洗三遍；以2.5μL分装的血清样品中加入97.5μL PBST，再加入96孔板的每孔中，于37℃下温育1小时。使用PBST清洗3遍后，加入使用PBST以1:1000稀释的羊抗鼠二抗，每孔加入100μL在37℃下温育1小时。96孔板再次使用PBST清洗3遍，每孔分别加入100μL TMB显色液(购自Solarbio公司)，避光放置10分钟，之后每孔加入50μL 2M硫酸终止反应。使用酶标仪在450nm下对96孔板进行读数。实验组的OD450为阴性对照的OD450的2倍的最大稀释度计为抗体效价。结果如图13所示，GMD蛋白和弗氏佐剂配合使用的试验组均可诱导机体产生高水平的特异性抗体，其中GMD蛋白加弗氏佐剂试验组在第三次免疫后的抗体效价达到1:102400，GMD蛋白无弗氏佐剂组)在第三次免疫后抗体效价达到1:12800，GMD蛋白组(包括加弗氏佐剂和不加弗氏佐剂组)均与空白对照组和阴性对照组(PBS+弗氏佐剂)差异显著(P＜0.05)。
(3)小鼠攻击实验：参照Korbor氏法测定BALB/c小鼠对于强毒株HA9801菌株的LD50，以确定该菌株的致病力和攻击剂量，LD50为4×107CFU。按照步骤(1)进行小鼠免疫，第三次免疫后7天对小鼠用10倍LD50的HA9801进行腹部注射攻击，根据IgG抗体数据，只对GMD蛋白加弗氏佐剂试验组，阴性对照组(PBS+弗氏佐剂)和空白对照组(PBS)进行攻击。在48小时内，每6小时观察一次小鼠死亡情况，48小时后，每12小时观察一次小鼠死亡情况，连续观察7天。结果显示，空白对照组和阴性对照组的小鼠全部死亡，死亡前出现毛发竖起，弓背，精神萎靡等症状，且从其体内均可分离出HA9801菌株。GMD蛋白加弗氏佐剂试验组小鼠存活率为90％；各实验组存活率曲线如图14所示，GMD蛋白疫苗能够对HA9801产生较好的免疫保护作用。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗及其制备方法
<130> 01335-18193PIX
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 1
Glu Pro Gly Asn Ile Asp Trp Gly Gly Gly Gly Leu Asp Gly Pro His
1 5 10 15
Arg Gly Gly Asp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Gly Gly Thr Glu Ser Phe
20 25 30
Gly Tyr Thr Glu Asp Gln Leu Gly Gly Gly Gly Thr Phe Glu Ser Tyr
35 40 45
Asp Leu Tyr Ser Tyr Asn Lys Asn Met Ala Ser Gly Gly Gly Gly Asp
50 55 60
Val Leu Glu Lys Tyr Thr Ile Glu Pro Gly Glu Ser Val Thr Phe Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Leu Lys Phe Tyr Tyr Leu Asp Pro Thr Tyr Lys Gly Glu
85 90 95
Val Asp Trp Arg Gly Thr Asp Thr Thr Gly Phe Ile Glu Leu Leu Thr
100 105 110
Thr Gly Gly Gly Gly Asp Thr Asp Gly Lys Gln Ile Val Asn Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ser Ala Lys Thr Thr Gly Thr Val Val Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ala Pro Val Gly Asp Ala Tyr Thr Thr Thr Asp Lys Lys Pro Asn
145 150 155 160
Glu Ile Ile Thr Lys Asp Gly Ser Arg Tyr Val Leu Val Pro Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Val Pro Tyr Pro Phe Asp Pro Thr Glu Pro Asp Glu Pro Ile
180 185 190
Asp Pro Thr Thr Pro Gly Thr Asn Gly Glu Val Pro Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Pro Leu Lys Pro Ile Asp Pro Asn Asp Pro Gly Lys Gly Tyr Val Pro
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ser Pro Glu Gly Thr Pro Tyr Asp Thr
225 230 235 240
Thr Asp Asn Lys Gly Gly Gly Gly Thr Pro Glu Lys Glu Thr Pro Ala
245 250 255
Lys Pro Gln Ala Gly Lys Thr Ala Gly Gly Gly Gly Glu Trp Lys Lys
260 265 270
Gln Glu Gly Asp Phe Val Asn Glu Gly Gly Gly Gly Asn His His Lys
275 280 285
Ala Lys Leu
290

Claims (6)

1.一种制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)B细胞优势表位筛选；
(2)B细胞优势表位串联基因设计及质粒的构建；
(3)融合蛋白表达及纯化；
(4)制备所述B细胞优势表位串联疫苗；
(5)所述疫苗的免疫效力评价；
其中，所述猪链球菌为猪链球菌ZY05719菌株；
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
步骤(1)具体操作步骤为：分析所述猪链球菌GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白一级结构信息，设计所述B细胞优势表位串联疫苗时删除信号肽段、膜锚定结构域和处于膜内的肽段，利用ABCpred工具、BepiPred工具预测所述GAPDH蛋白、所述MRP蛋白和所述DLDH蛋白的B细胞优势表位片段，分析所述GAPDH蛋白、所述MRP蛋白和所述DLDH蛋白的二级结构，确定所述GAPDH蛋白、所述MRP蛋白和所述DLDH蛋白的B细胞优势表位；
步骤(4)具体操作步骤为：利用弗氏佐剂和步骤(3)获得的所述融合蛋白制备所述B细胞优势表位串联疫苗。
2.如权利要求1所述的制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，步骤(2)具体操作步骤为：将步骤(1)所得的所述B细胞优势表位的不同片段按照GAPDH-MRP-DLDH的顺序通过柔性肽段串联在一起，在N端和C端分别引入酶切位点，完成所述B细胞优势表位串联基因设计，形成所述融合蛋白基因，进而构建质粒。
3.如权利要求2所述的制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，所述N端引入的所述酶切位点为BamHI位点。
4.如权利要求2所述的制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，所述C端引入的所述酶切位点为XhoI位点。
5.如权利要求2所述的制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，所述柔性肽段的氨基酸序列为GGGG。
6.如权利要求1所述的制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，步骤(3)具体操作步骤为：将步骤(2)所得的所述质粒利用热激转化法转入大肠杆菌中，经测定评价后，确认融合蛋白表达菌株，经诱导培养后，采用His镍柱纯化表达的所述融合蛋白。
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