CN108623663B - 猪肺炎支原体p97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用 - Google Patents

猪肺炎支原体p97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用。所述免疫原性功能多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。通过确定P97蛋白可以在体内诱导抗体反应的免疫原性功能区，在应用时可以去除P97上的非功能区，提高该蛋白表达效率和应用范围。因此对该蛋白应用于早期诊断和将来的疫苗开发均具有重要意。

Description

猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和 应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用。
背景技术
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是一种广泛流行的只感染猪的支原体，能够引起猪慢性肺炎，导致体重增长缓慢和食物转化率下降，对猪规模化饲养具有重要影响。
Mhp的膜蛋白P97是Mhp膜上的一种粘附蛋白，有研究表明，P97是猪肺炎支原体最主要的抗原蛋白之一，Mhp感染时，P97引发的免疫反应早于其他抗原蛋白所引起的免疫反应，其诱导机体产生的IgA和IgM抗体要比其它抗原的抗体早35-60天。
目前，已有使用P97在疫苗及诊断方面应用的研究报道，但是这些应用只是基于P97的全基因或者R1区，这些基因或区域在体内诱导抗体反应的特点目前也没有研究报道。
有研究表明，对于某一个特定的病原蛋白，当病原感染宿主后并不是整个蛋白均可以诱导抗体免疫反应，只是其中一部分发挥免疫原性功能，这些抗原功能区是作为诊断和疫苗开发的理想靶点。尽管有研究使用MHP的P97蛋白作为诊断靶点和疫苗开发，但是这个蛋白上有哪些免疫原性功能区，目前没有研究报道。由于P97蛋白太大，分子量大小约300kD，这样大的分子表达效率非常低，而且全基因很难表达。如果能知道P97上哪些部分可以在体内诱导抗体反应的免疫原性功能区，我们在应用时可以去除P97上的非功能区，提高该蛋白表达效率和应用范围。因此对该蛋白应用于早期诊断和将来的疫苗开发均具有重要意义。
发明内容
本发明通过将猪肺炎支原体P97蛋白编码基因进行DNAseI随机酶切成100-250bp的小片段,然后将这些小片段连接到酵母展示表达载体构建成酵母随机展示文库，通过天然感染猪的高免血清染色后进行流式分选出阳性反应抗原克隆，并通过测序分析这些克隆的编码序列，最后通过分析这些序列后确定P97蛋白的能在体内诱导抗体免疫应答的抗原区。
本发明的目的是提供猪肺炎支原体P97蛋白上具有免疫原性的功能区域。
本发明的再一目的是提供上述猪肺炎支原体P97蛋白上免疫原性功能区域的应用。
P97氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
MSKKSKTFKIGLTAGIVGLGVFGLTVGLSSLAKYRSESPRKIANDFAAKVSTLAFSPYAFETDSDYKIVKRWLVDSNNNIRNKEKVIDSFSFFTKNGDQLEKINFQDPEYTKAKITFEILEIIPDVVNQNFKVKFQALQKLHNGGIAKSDIYEQTVAFAKQSNLLVAEFNFSLKKITEKLNQQIENLSTKITNFADEKTSSQKDPSTLRAIDFQYDLNTARNAEDLDIKLANYFPVLKNLINRLNNAPENKLPNNLGNIFEFSFAKDSSTNQYVSIQNQIPSLFLKADLSQSAREILASPDEVQPVINILRLMKKDNSSYFLNFEDFVNNLTLKNMQKEDLNAKGQNLSAYEFLADIKSGFFPGDKRSSHTKAEISNLLNKKENIYDFGKYNGKFNDRLNSPNLEYSLDAASASLDKKDKSIILIPYRLEIKDKFFADDLYPDTKDNILVKEGILKLTGFKKGPKIDLPNINQQIFKTEYLPFFEKGKEEQAKLDYGNILNPYNTQLAKVGVEALFKGNKNQEIYQALDGNYAYEFGAFKSVLNSWTGKIQHPEKADIQRFTRHLEQVKLGSNSVLNQPQTTKEQVISSLKSNNFFKNGHQVASYFQDLLTKDKLTVLETLYDLAKKWGLETNRAQFPKEVFQYTKDIFAEADKLKFLEGKKKDPYNQIKEIHQLSFNILARNDVIKSDGFYGVLLLPQSVKTELEGKNEAQIFEALKKYSLIENSAFKTTILDKNLLEGTDFKTFGDFLKAFFLKAAQFNNFAPWAKLDDNLQYSFEAIKKGETTKEGKREEVDKKVKELDNKIKGILPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPETTKPVAAKPEAAKPVAAKPVAAKPVATNTNTNTGFSLTNKPKEDYFPMAFSYKLEYTDENKLSLKTPEINVFLELVHQSEYEEQKIIKELDKTVLNLQYQFQEVKVTSEQYQKLSHPMMTEGSPNQGKKAEGAPNQGKKAEGAPSQGKKAEGAPNQGKKAEGAPSQGKKAEGASNQQSTTTELTNYLPELGKKIDEIIKKQGKNWKTEVELIEDNIAGDAKLLYFVLRDDSKSGDPKKSSLKVKITVKQSNNNQELKSK.
本发明在P97上筛选到3个主抗原区，这些抗原区可以在MHP天然感染过程中诱导产生很强的抗体免疫应答反应，因此可以作为该病原感染的检测靶点。
根据本发明的具体实施方式，获得猪肺炎支原体P97蛋白的主抗原区为D2、D4和D6，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
鉴定出的D2氨基酸序列，SEQ ID No.2：
EKLNQQIENLSTKITNFADEKTSSQKDPSTLRAIDFQYDLNTARNAEDLDIKLANYFPVLKNLINRLNNAPENKLP
鉴定出的D4氨基酸序列，SEQ ID No.3：
KEGILKLTGFKKGPKIDLPNINQQIFKTEYLPFFEKGKEEQAKLDYGNILNPYNTQLAKVGVEALFKGNKNQEIYQALDGNY
鉴定出的D6氨基酸序列，SEQ ID No.4：
LDDNLQYSFEAIKKGETTKEGKREEVDKKVKELDNKIKGILPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPETTKPVAAKPEAAKPVAAKPVAAKPVATNTNTNTGFSLTNKPKEDYFPMAFSYKLEYTDENKLSLKTPEINVFLELVHQSEYEEQKI
本发明还提供了编码上述猪肺炎支原体P97蛋白的主抗原区的基因。
本发明还提供了包含上述基因的重组载体。
本发明还提供了包含上述基因重组细胞。
本发明还提供了上述猪肺炎支原体P97蛋白的主抗原区用于制备诊断猪肺炎病的药物的应用。
P97的蛋白质大小为1093个氨基酸，该蛋白用于原核表达非常困难，本发明鉴定出的抗原功能区最大只有151个氨基酸，这样小的蛋白在细菌上很容易表达，而且也没有影响这些抗原区在检测诊断中的应用。因此提高了这些诊断抗原的制备效率。
附图说明
图1显示P97基因的扩增结果，其中，泳道1:P97突变后PCR扩增的片段，泳道2：DL5000DNA ladder。
图2显示P97基因随机酶切结果，其中泳道1:DL2000DNA ladder；泳道2：P97基因用DNase I随机酶切产物电泳结果。
图3显示酵母文库流式分选后的结果。
图4显示阳性克隆质粒中P97随机抗原肽中氨基酸分布结果。
图5显示抗原区验证的实验结果。
图6显示主抗原区的免疫血清的检测结果。
具体实施方式
实施例1
1.猪肺炎支原体P97基因的突变和随机化酶切
在支原体中终止密码子TGA编码氨基酸色氨酸，P97上存在3个终止密码子，它们会影响P97的随机片段在酵母上的展示表达。因此，通过基因定点突变的方法先将P97基因上的TGA终止密码子突变成TGG。然后通过PCR扩增的方法大量扩增P97编码基因，P97基因的扩增结果如图1所示。扩增的P97基因片段通过胶回收的方法纯化。获得的P97基因片段用酶切缓冲液稀释，酶切缓冲液的配方为20mmol·L-1Tris-HCl PH＝7.5；5mmol·L-1MnCl2，然后加入终浓度为0.1U·μL-1的DNaseⅠ进行37℃酶切，使其获得的随机片段大小在100-250bp之间，P97基因随机酶切结果如图2所示。酶切反应用0.5M的EDTA进行终止后通过胶回收试剂盒纯化随机片段。
2.P97随机片段3’端加A
将10μgP97随机酶切后的片段用Ex Taq DNA聚合酶在72℃下反应30min进行末端加A处理，随后加A产物通过柱回收试剂盒纯化。
3.酵母表面展示表达载体的酶切处理
将酵母表面展示表达载体pCTCON-T用XcmI进行单酶切,获得的载体通过1％琼脂糖凝胶电泳回收。
4.酵母感受态的制备
将酿酒酵母EBY100菌接种于5mlYPD液体培养基(20g·L-1蛋白胨，10g·L-1酵母提取物)，30℃，220rpm过夜培养。将过夜培养的酵母细胞液按1：100转接于500ml新的YPD液体培养基中继续培养至OD600值为0.6-0.8。在室温条件下1500g离心5min，收集酵母细胞，加入25ml缓冲溶液Ⅰ(0.6M·L-1sorbitol，100mmol·L-1LiAc,10mmol·L-1Tris-Cl,PH＝7.5,10mmol·L-1DTT),并在30℃，220rpm培养30min。于4℃和1500g条件下离心收集酵母细胞，弃上清，用50ml预冷的1M山梨醇洗液洗涤酵母细胞2次。随后在4℃条件下1500g离心5min，弃上清，沉淀用1ml的1M山梨醇洗液重悬，分装后放置于-80℃保存。
5.酵母表达文库的构建与库容量评价
将XcmⅠ酶切后回收的pCTCON-T载体与加A的P97随机酶切片段按照质量比3：1混合，然后加入400U的T4DNA连接酶，在16℃连接24小时。连接产物用PCR产物回收试剂盒纯化后通过电击法同时转化到10支酵母感受态中。取少量电转化后的酵母按照10-1，10-2，10-3梯度稀释涂布于SDCAA固体培养基，通过计算板上长的酵母克隆数确定库容量。其余酵母细胞液在1500g条件下离心5min，弃上清，加入50mlSDCAA选择液体培养基进行扩大培养，培养产物即为酵母文库。
6.P97酵母随机表达文库的诱导表达及阳性克隆的流式分选
取10ml酵母选择培养基SDCAA(6.7g Yeast nitrogen base，5g Casamino acids，13.6g Na2HPO4·12H2O，8.56g NaH2PO4·H2O，20g dextrose，加入1L ddH2O)培养酵母文库细胞液，并添加终浓度为2％的半乳糖，在30℃对酵母细胞进行诱导表达48h。然后，取约1×107个酵母细胞，用PBS洗2次，通过离心弃上清。用200μL PBS重悬酵母细胞，加入MHP天然感染猪的阳性血清，室温孵育30min，用PBS洗3次；用200μLPBS重悬酵母细胞，加入FITC标记的抗猪IgG的二抗，室温孵育30min，用PBS洗三次，最后用1mlPBS重悬，最后通过流式细胞仪进行分选。
图3所示，将酵母文库诱导24h，然后用MHP阳性血清染色，并用荧光二抗标记后，在流式细胞仪上进行分选，分选后的细胞进行诱导培养，最后通过流式细胞仪分析分选的结果：白色的柱形图为二抗对照组，灰色的柱形图为阳性血清实验组。
7.阳性酵母克隆的质粒提取和测序
取分选的酵母菌单克隆细胞200个，提取其中的质粒测序，将其中P97随机片段对应的编码抗原肽与P97蛋白比对，结果如图4，该比对结果可以看出P97上可以分为7个抗原区域，分别为D1区：1-177aa；D2区：178-252；D3区：253-450aa；D4区：451-532；D5区：533-768；D6区：769-919aa；D7区：920-1093aa。
8.抗原区的ELISA分析
将测序分析获得的抗原区编码序列连接到原核表达载体pET-32a，将这些基因诱导表达后通过His标签回收。将回收到的蛋白包被ELISA板，通过ELSIA的方法确定抗原区的正确性。如图5所示，用D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7区分别表达的抗原包被ELISA板检，将自然感染MHP的猪阳性血清做40倍稀释后用ELISA板检测，结果显示D2、D4和D6区为主抗原区。
9.动物免疫实验
将主抗原区原核表达纯化，然后与完全弗氏佐剂乳化后后进行免疫猪，免疫剂量为每头50mg，免疫方式为肌肉注射。首免后第14天进行二免，第21天采血通过ELISA检测试剂盒检测血清中产生的特异性免疫效果(图6)。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1092
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 1
Met Ser Lys Lys Ser Lys Thr Phe Lys Ile Gly Leu Thr Ala Gly Ile
1 5 10 15
Val Gly Leu Gly Val Phe Gly Leu Thr Val Gly Leu Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Lys Tyr Arg Ser Glu Ser Pro Arg Lys Ile Ala Asn Asp Phe Ala Ala
35 40 45
Lys Val Ser Thr Leu Ala Phe Ser Pro Tyr Ala Phe Glu Thr Asp Ser
50 55 60
Asp Tyr Lys Ile Val Lys Arg Trp Leu Val Asp Ser Asn Asn Asn Ile
65 70 75 80
Arg Asn Lys Glu Lys Val Ile Asp Ser Phe Ser Phe Phe Thr Lys Asn
85 90 95
Gly Asp Gln Leu Glu Lys Ile Asn Phe Gln Asp Pro Glu Tyr Thr Lys
100 105 110
Ala Lys Ile Thr Phe Glu Ile Leu Glu Ile Ile Pro Asp Val Val Asn
115 120 125
Gln Asn Phe Lys Val Lys Phe Gln Ala Leu Gln Lys Leu His Asn Gly
130 135 140
Gly Ile Ala Lys Ser Asp Ile Tyr Glu Gln Thr Val Ala Phe Ala Lys
145 150 155 160
Gln Ser Asn Leu Leu Val Ala Glu Phe Asn Phe Ser Leu Lys Lys Ile
165 170 175
Thr Glu Lys Leu Asn Gln Gln Ile Glu Asn Leu Ser Thr Lys Ile Thr
180 185 190
Asn Phe Ala Asp Glu Lys Thr Ser Ser Gln Lys Asp Pro Ser Thr Leu
195 200 205
Arg Ala Ile Asp Phe Gln Tyr Asp Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Asp Ile Lys Leu Ala Asn Tyr Phe Pro Val Leu Lys Asn Leu
225 230 235 240
Ile Asn Arg Leu Asn Asn Ala Pro Glu Asn Lys Leu Pro Asn Asn Leu
245 250 255
Gly Asn Ile Phe Glu Phe Ser Phe Ala Lys Asp Ser Ser Thr Asn Gln
260 265 270
Tyr Val Ser Ile Gln Asn Gln Ile Pro Ser Leu Phe Leu Lys Ala Asp
275 280 285
Leu Ser Gln Ser Ala Arg Glu Ile Leu Ala Ser Pro Asp Glu Val Gln
290 295 300
Pro Val Ile Asn Ile Leu Arg Leu Met Lys Lys Asp Asn Ser Ser Tyr
305 310 315 320
Phe Leu Asn Phe Glu Asp Phe Val Asn Asn Leu Thr Leu Lys Asn Met
325 330 335
Gln Lys Glu Asp Leu Asn Ala Lys Gly Gln Asn Leu Ser Ala Tyr Glu
340 345 350
Phe Leu Ala Asp Ile Lys Ser Gly Phe Phe Pro Gly Asp Lys Arg Ser
355 360 365
Ser His Thr Lys Ala Glu Ile Ser Asn Leu Leu Asn Lys Lys Glu Asn
370 375 380
Ile Tyr Asp Phe Gly Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Asn Asp Arg Leu Asn
385 390 395 400
Ser Pro Asn Leu Glu Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Ser Ala Ser Leu Asp
405 410 415
Lys Lys Asp Lys Ser Ile Ile Leu Ile Pro Tyr Arg Leu Glu Ile Lys
420 425 430
Asp Lys Phe Phe Ala Asp Asp Leu Tyr Pro Asp Thr Lys Asp Asn Ile
435 440 445
Leu Val Lys Glu Gly Ile Leu Lys Leu Thr Gly Phe Lys Lys Gly Pro
450 455 460
Lys Ile Asp Leu Pro Asn Ile Asn Gln Gln Ile Phe Lys Thr Glu Tyr
465 470 475 480
Leu Pro Phe Phe Glu Lys Gly Lys Glu Glu Gln Ala Lys Leu Asp Tyr
485 490 495
Gly Asn Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Thr Gln Leu Ala Lys Val Gly Val
500 505 510
Glu Ala Leu Phe Lys Gly Asn Lys Asn Gln Glu Ile Tyr Gln Ala Leu
515 520 525
Asp Gly Asn Tyr Ala Tyr Glu Phe Gly Ala Phe Lys Ser Val Leu Asn
530 535 540
Ser Trp Thr Gly Lys Ile Gln His Pro Glu Lys Ala Asp Ile Gln Arg
545 550 555 560
Phe Thr Arg His Leu Glu Gln Val Lys Leu Gly Ser Asn Ser Val Leu
565 570 575
Asn Gln Pro Gln Thr Thr Lys Glu Gln Val Ile Ser Ser Leu Lys Ser
580 585 590
Asn Asn Phe Phe Lys Asn Gly His Gln Val Ala Ser Tyr Phe Gln Asp
595 600 605
Leu Leu Thr Lys Asp Lys Leu Thr Val Leu Glu Thr Leu Tyr Asp Leu
610 615 620
Ala Lys Lys Trp Gly Leu Glu Thr Asn Arg Ala Gln Phe Pro Lys Glu
625 630 635 640
Val Phe Gln Tyr Thr Lys Asp Ile Phe Ala Glu Ala Asp Lys Leu Lys
645 650 655
Phe Leu Glu Gly Lys Lys Lys Asp Pro Tyr Asn Gln Ile Lys Glu Ile
660 665 670
His Gln Leu Ser Phe Asn Ile Leu Ala Arg Asn Asp Val Ile Lys Ser
675 680 685
Asp Gly Phe Tyr Gly Val Leu Leu Leu Pro Gln Ser Val Lys Thr Glu
690 695 700
Leu Glu Gly Lys Asn Glu Ala Gln Ile Phe Glu Ala Leu Lys Lys Tyr
705 710 715 720
Ser Leu Ile Glu Asn Ser Ala Phe Lys Thr Thr Ile Leu Asp Lys Asn
725 730 735
Leu Leu Glu Gly Thr Asp Phe Lys Thr Phe Gly Asp Phe Leu Lys Ala
740 745 750
Phe Phe Leu Lys Ala Ala Gln Phe Asn Asn Phe Ala Pro Trp Ala Lys
755 760 765
Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu Ala Ile Lys Lys Gly Glu
770 775 780
Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu
785 790 795 800
Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys
805 810 815
Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro
820 825 830
Glu Thr Thr Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val
835 840 845
Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Asn Thr
850 855 860
Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro
865 870 875 880
Met Ala Phe Ser Tyr Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser
885 890 895
Leu Lys Thr Pro Glu Ile Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser
900 905 910
Glu Tyr Glu Glu Gln Lys Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu
915 920 925
Asn Leu Gln Tyr Gln Phe Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Glu Gln Tyr
930 935 940
Gln Lys Leu Ser His Pro Met Met Thr Glu Gly Ser Pro Asn Gln Gly
945 950 955 960
Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala
965 970 975
Pro Ser Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys
980 985 990
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ser Asn
995 1000 1005
Gln Gln Ser Thr Thr Thr Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Pro Glu Leu Gly
1010 1015 1020
Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln Gly Lys Asn Trp Lys Thr
1025 1030 1035 1040
Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala Gly Asp Ala Lys Leu Leu
1045 1050 1055
Tyr Phe Val Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser Gly Asp Pro Lys Lys Ser
1060 1065 1070
Ser Leu Lys Val Lys Ile Thr Val Lys Gln Ser Asn Asn Asn Gln Glu
1075 1080 1085
Leu Lys Ser Lys
1090
<210> 2
<211> 76
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 2
Glu Lys Leu Asn Gln Gln Ile Glu Asn Leu Ser Thr Lys Ile Thr Asn
1 5 10 15
Phe Ala Asp Glu Lys Thr Ser Ser Gln Lys Asp Pro Ser Thr Leu Arg
20 25 30
Ala Ile Asp Phe Gln Tyr Asp Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Glu Asp
35 40 45
Leu Asp Ile Lys Leu Ala Asn Tyr Phe Pro Val Leu Lys Asn Leu Ile
50 55 60
Asn Arg Leu Asn Asn Ala Pro Glu Asn Lys Leu Pro
65 70 75
<210> 3
<211> 82
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 3
Lys Glu Gly Ile Leu Lys Leu Thr Gly Phe Lys Lys Gly Pro Lys Ile
1 5 10 15
Asp Leu Pro Asn Ile Asn Gln Gln Ile Phe Lys Thr Glu Tyr Leu Pro
20 25 30
Phe Phe Glu Lys Gly Lys Glu Glu Gln Ala Lys Leu Asp Tyr Gly Asn
35 40 45
Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Thr Gln Leu Ala Lys Val Gly Val Glu Ala
50 55 60
Leu Phe Lys Gly Asn Lys Asn Gln Glu Ile Tyr Gln Ala Leu Asp Gly
65 70 75 80
Asn Tyr
<210> 4
<211> 151
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 4
Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu Ala Ile Lys Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu
20 25 30
Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys
35 40 45
Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro
50 55 60
Glu Thr Thr Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val
65 70 75 80
Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Asn Thr
85 90 95
Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro
100 105 110
Met Ala Phe Ser Tyr Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser
115 120 125
Leu Lys Thr Pro Glu Ile Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser
130 135 140
Glu Tyr Glu Glu Gln Lys Ile
145 150

Claims (5)

1.猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽，其特征在于，所述免疫原性功能多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
2.编码权利要求1所述猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽的基因。
3.包含权利要求2所述基因的重组载体。
4.包含权利要求2所述基因的重组细胞。
5.权利要求1所述的猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽用于制备诊断猪肺炎病的制剂的应用。
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