CN105906716A - 埃可病毒9型vp1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用 - Google Patents

埃可病毒9型vp1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用 Download PDF

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Abstract

本发明埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析埃可病毒9型表面蛋白VP1氨基酸序列，筛选出含强特异性抗原表位的蛋白片段，即第75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸，这4个蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，形成一个抗原表位融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成该抗原表位融合蛋白的全新基因序列，利用基因工程技术，表达制备埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位融合蛋白，用于埃可病毒抗体检测试剂的研制，及用于埃可病毒单抗和多抗制备。

Description

埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、 应用
技术领域
本发明埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用涉及的是筛选出含强抗原表位的埃可病毒9型的表面VP1蛋白片段，利用基因工程技术，制备埃可病毒9型的VP1蛋白抗原表位的融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的VP1蛋白抗原表位融合蛋白的基因序列，利用基因工程技术表达融合蛋白，表达的融合蛋白可用于埃可病毒疫苗及抗体检测试剂的研制等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
背景技术
人肠道致细胞病变孤儿病毒（Enteric Cytopathogenichuman Orphan Virus，ECHO），简称埃可病毒，是一类单股正链RNA的肠道病毒，有34个血清型。最初对其致病性并不清楚，后来证明埃可病毒与无菌脑膜炎、婴儿腹泻、手足口病等多种疾病有关。大量研究和数据分析最终显示，本病遍布世界各地，在人群中引起广泛传播或流行，其感染可引起无菌性脑膜炎、发疹、胃肠道疾病、肝炎和肺炎等多种人类疾病，其中无菌性脑膜炎最为常见，可通过呼吸道和消化道传播。孕妇感染后可通过胎盘传播给胎儿，可引起胎儿畸形甚至死胎。埃可病毒9型（E9）是肠道病毒引起无菌性脑炎的主要血清型，E9感染常表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍和脑膜刺激症状等，严重的会有后遗症，甚至导致死亡，近年来也有了E9可引起手足口病的报道。
埃可病毒VP1与决定血清型的抗原决定因子密切相关，由于VP1区序列分型结果与中和试验鉴定结果具有一致性，而VP1蛋白是病毒中和的主要决定因子，其保守性有利于疫苗开发，也使其作为检测试剂提供可行性和可能性。目前对其全基因序列已经测定，为利用基因工程技术研究诊断试剂、疫苗及筛选抗病毒药物奠定了基础。
目前，对埃可病毒的检测方法主要包括平板分离培养法、酶联免疫吸附试验、分子生物学方法。但是，这些方法所需成本较高、需要特定设备、耗时且需要对样品进行复杂的处理，限制其在生活中的广泛应用。建立一种简单、快速、适合现场应用的埃可病毒的检测方法有重要意义。而研制特异的基因重组抗原是建立埃可病毒特异抗体检测试剂的发展方向。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供一种埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用，本发明是筛选出含强抗原表位的埃可病毒9型的表面VP1蛋白片段，利用基因工程技术，制备埃可病毒9型的表面VP1蛋白片段的融合蛋白。通过计算机分析，从埃可病毒9型表面蛋白VP1中筛选出4个含强抗原表位的蛋白片段，分别为第75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，四段蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，构成总长度为128个氨基酸的序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌BL21（DE3）中表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗研制，亦可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，为埃可病毒检测方法的建立奠定了基础。
埃可病毒外层的VP1蛋白，是介导病毒和宿主细胞结合的主要蛋白，同时其又具有较高的保守性，在各型的埃可病毒中变异很小，所以是用作抗原研制埃可病毒抗体检测试剂的理想蛋白。通过计算机分析埃可病毒9型VP1蛋白的氨基酸序列，我们筛选出抗原表位的富集区，选择真核和原核生物均偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达融合蛋白，表达的融合蛋白具有较好的抗原性和特异性，可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，组装胶体金试剂条，为埃可病毒快速检测方法的建立奠定基础。
埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用是采取以下步骤实施的：
一种埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由4段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段组成，4段蛋白片段之间由甘氨酸和丝氨酸连接，整合为全长128个氨基酸的融合蛋白，氨基酸序列如下：
所述的埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中4段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段具体为第75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸，各段氨基酸序列如下：
Seqence1: 第75位aa － 第102位aa：
Seqence2:第127位aa － 第140位aa：
Seqence3:第204位aa － 第237位aa：
Seqence4:第257位aa － 第300位aa：
所述的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白中，4段含强特异性抗原表位的表面VP1蛋白片段，这4段VP1蛋白片段的单个或任意组合的融合蛋白。
所述的埃可病毒9型表面蛋白VP1的融合蛋白，通过基因重组技术，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
所述的埃可病毒9型4个VP1蛋白片段的单个或任意组合的融合蛋白用于埃可病毒抗体检测试剂的制备及用于免疫制备抗埃可病毒单抗和多抗制备。
埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备方法如下：
1．埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析埃可病毒9型VP1蛋白的全氨基酸序列，筛选出4个含强抗原表位的蛋白片段，分别为第75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸含有较强的抗原表位。4段蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，构成总长度为128个氨基酸的融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成该融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了BamHI的酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点（下画线部分），使合成的基因片段易于克隆至质粒pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I酶切位点内。
筛选的埃可病毒9型VP1蛋白内4个含强抗原表位的蛋白片段：
Seqence1: 第75位aa － 第102位aa：
Seqence2:第127位aa － 第140位aa：
Seqence3:第204位aa － 第237位aa：
Seqence4:第257位aa － 第300位aa：
4个含强抗原表位蛋白片段连接在一起形成融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列：
化学合成的埃可病毒9型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列（399bp）
2．表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白重组质粒的构建:
提取质粒pGEX-4T-2,用 BamHI和Xho I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内；同时用BamHI和Xho I双酶切化学合成埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白的基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使化学合成埃可病毒9型VP1蛋白基因片段插入到载体pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白。
3．重组质粒的筛选与鉴定:
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨苄霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含pGEX-4T-2质粒的对照菌，接种至含4mlLB培养基（含氨苄霉素100μg／ml）的试管内振摇，分别提取质粒,用BamHI和Xho I双酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，切下399bp的目的片段。同时，将含有外源基因的质粒进行DNA测序分析，测序结果证实重组质粒含有埃可病毒9型表面蛋白VP1基因片段，序列完全正确：
构建的重组质粒表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（128个氨基酸），在其N端融合了载体上的226个氨基酸，全长354个氨基酸，其氨基酸序列如下：
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr ArgLeu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp GluGly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu ProTyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr IleAla Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser MetLeu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser LysAsp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys MetPhe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His ProAsp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys LeuAsp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln IleAsp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln AlaThr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser ArgMet Ala Lys Tyr Glu Ala Arg Gly Asp Ser Glu Ser Thr Asp Arg Phe Asp Ala TrpGlu Ile Ser Ile Arg Asp Met Val Gly Gly Ser Tyr Gln His Gln Gly Thr Ile AsnGln Asp Met Pro Pro Met Gly Gly Ser Asn Ser Lys Gly Ala Tyr Gly Phe Asn ThrLeu Asn Lys Met Gly His Ile Tyr Cys Arg His Val Asn Arg Glu Thr Pro Thr GluVal Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gln Tyr Lys Asn Lys Ala Asn Val Asn Phe AspAla Thr Ala Val Thr Glu Thr Arg Glu Thr Ile Asn Thr Val Pro Val Ser Asn HisGly Gly Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Asn Thr
4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含4ml LB培养基(含氨苄毒素100μg／ml)的试管内，37℃振荡培养4h，加IPTG至终浓度0.2 mmol/L,继续振荡培养诱导4h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量为39 kD的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白，而对照菌pGEX-4T-2无此蛋白条带。
5．表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白的纯化:
1）表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000 rpm、20 min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1／10体积的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘油)内，冰浴超声破菌75次，8000rpm，4℃，离心20min收集上清。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。
2）表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白的纯化
上清溶液加已经平衡的High-Affinity GST Resin 10ml，4℃结合过夜，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS（含1mM PMSF）洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50mmol/L Tris-HCl pH8.5 ＋ 10 mmol/L GSH，分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白。
6．纯化的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白用于埃可病毒疫苗研制；
7．将表达的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白，用于免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。
8．将制备的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白和多克隆抗体组装胶体金试剂条，把埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白作为抗原，研制抗体检测试剂。
9．将埃可病毒9型表面蛋白VP1筛选优化的抗原表位连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。
10．通过基因重组技术，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白。
上述所述的方法制备的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白的基因片段，用于埃可病毒抗体的检测及单抗和多抗的制备，并用于胶体金试剂条的组装。
英文缩写说明：EDTA: 四甲基乙二胺；IPTG：异丙基硫代半乳糖苷 ； DTT：二硫苏糖醇；SDS：十二烷基磺酸纳；PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳； PB：磷酸盐缓冲液； DNA：脱氧核糖核酸； RNA：核糖核酸； kD：千道尔顿；PMSF: 苯甲基磺酰氟；GSH：谷胱甘肽。
本发明与现有技术相比具有的优点
我们表达的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白，有较多优点:
1．现在应用的埃可病毒抗体检测试剂，多采用进口抗原或病毒培养抗原，生产不便、且成本高。表达的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白用作抗原可克服上述缺点。
2．根据筛选出的埃可病毒9型VP1抗原表位氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，该基因适宜在真核及原核细胞内高表达。
3．构建表达埃可病毒9型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的工程菌，表达量高，且表达的蛋白以可溶性形式存在，易于纯化，且不需要复性处理。
4．传统的灭活疫苗的研究取得了一定进展，但是生产成本高、危险大，使临床应用受限。埃可病毒9型表面蛋白VP1是病毒中和的主要决定因子，是病毒与宿主结合的主要蛋白，并且具有良好的保守性，所以VP1蛋白是研制疫苗的首选蛋白。本发明就筛选出的VP1蛋白中抗原表位富集区进行重组，利用基因工程技术进行表达制备，得到的全新融合蛋白为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗具有安全、成本低的优点。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明：
图1是分子生物学软件对埃可病毒9型表面蛋白VP1的抗原表位进行分析结果。结果显示，在埃可病毒9型VP1蛋白N端从75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸，含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。
图2是表达埃可病毒9型VP1蛋白4个片段的融合蛋白的重组质粒构建流程图。
图3是用1.0％的Agarose凝胶检测重组质粒的双酶切图。M: DNA marker DL10000（TaKaRa）； 1：重组质粒pGEX-4T-2-VP1经BamHI和Xho I双酶切下399bp的目的基因片段，即图中箭头标示的位置；2：质粒pGEX-4T-2经BamHI和Xho I双酶切没有目的条带出现。
图4是表达埃可病毒9型表面蛋白VP1重组菌的SDS-PAGE分析结果。将构建的重组质粒转化到大肠杆菌中，挑单菌落后筛选高产菌株的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白marker（赛默飞）；E9①-⑥：埃可病毒9型表面蛋白VP1重组菌，六个重组子均表达相对分子量39kDa的融合蛋白，即图中箭头标示的位置；阴参：对照菌含pGEX-4T-2质粒。
图5是表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果。M: 蛋白marker；1:BSA，浓度为1mg/ml；2：High-Affinity GST Resin 亲和层析柱纯化后的埃可病毒9型表面蛋白VP1，OD280=0.9，浓度为0.8mg/ml，相对分子量39kDa处的蛋白条带。
图6是ELISA检测兔抗血清结果。表达的埃可病毒9型表面蛋白VP1免疫的新西兰大白兔
制备抗血清，血清效价达1:640000。
具体实施方式
本发明实施方式的详细说明：
埃可病毒9型表面蛋白VP1抗原表位的分析、基因合成及表达
通过计算机分析埃可病毒9型的表面蛋白VP1的氨基酸序列，筛选出含强抗原表位的埃可病毒9型的VP1蛋白片段，发现4个含有较强抗原表位的蛋白片段，分别为75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸。4个蛋白片段之间通过2个甘氨酸和1个丝氨酸连接，构成总长度为128个氨基酸的抗原表位融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成上述表位融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了BamHI的酶切位点，在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点，使合成的基因片段易于克隆至质粒pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I酶切位点内，与载体上的起始密码子的翻译框架一致，表达埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得了高效表达埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白的工程菌，表达的埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白约占菌体蛋白总量的25%，并且为可溶性蛋白。
材料与方法
1. 菌种与质粒: 宿主菌BL21(DE3)及表达载体pGEX-4T-2为南京军区军事医学研究所医药生物所保存。
2. 分子生物学试剂:限制性内切酶BamHI、Xho I、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为TaKaRa公司产品。DTT及IPTG为BIOSHARP公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。
3. 基因片段的合成: 由南京金斯瑞生物科技有限公司帮助合成。
4. 基因克隆方法: DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化； 蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。
5. DNA序列分析：用TaKaRa公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。
结果
1．埃可病毒9型的表面蛋白VP1抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析埃可病毒9型VP1蛋白的全氨基酸序列（GeneBank，接通号：AAK13325.1），发现VP1蛋白的75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸含有较强的抗原表位 (如图1) 。
筛选出的氨基酸序列如下：
Seqence1: 第75位aa － 第102位aa：
Seqence2:第127位aa － 第140位aa：
Seqence3:第204位aa － 第237位aa：
Seqence4:第257位aa － 第300位aa：
根据筛选出的埃可病毒9型的表面蛋白VP1内的抗原表位氨基酸序列，4个蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，整合为一个全长为128个氨基酸的表位融合蛋白，氨基酸序列如下：
根据筛选和设计连接的氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成上述表位融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了BamH I的酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点（下画线部分），使合成的基因片段易于克隆至质粒pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I酶切位点内。
化学合成的埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位融合蛋白的DNA 序列（399 bp）：
2．表达埃可病毒9型VP1表位融合蛋白重组质粒的构建:
提取质粒pGEX-4T-2,用 BamHI和Xho I双酶切，1.0%的琼脂糖凝胶电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内；同时用BamHI和Xho I双酶切化学合成埃可病毒9型VP1表位融合蛋白基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶16℃，过夜连接，使化学合成埃可病毒9型VP1表位融合蛋白基因片段插入到载体pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白。构建流程见图2。
3．重组质粒的筛选与鉴定:
将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),将转化产物涂布含氨苄霉素（100µg／ml）的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选6个转化子菌落（分别标记为1－6号），同时，挑一个空质粒pGEX-4T-2转化的对照菌，标记为阴参，分别接种到含4 ml液体LB培养基（含氨苄霉素100μg／ml）的试管内，置37℃振荡培养5h，提取重组质粒。用BamHI和Xho I双酶切，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。重组质粒切出399bp的目的基因片段，见图3，而含质粒pGEX-4T-2的对照菌没有切出该基因片段。初步证实，转化子含有埃可病毒9型VP1表位融合蛋白的基因片段。
提取重组子的质粒，DNA序列分析证实，重组质粒含有埃可病毒9型VP1表位融合蛋白的基因片段，序列完全正确：
构建的重组质粒可表达埃可病毒9型VP1表位融合蛋白，长128个氨基酸，在其N端融合了载体上的226个氨基酸，全长354个氨基酸，其氨基酸序列如下：
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr ArgLeu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp GluGly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu ProTyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr IleAla Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser MetLeu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser LysAsp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys MetPhe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His ProAsp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys LeuAsp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln IleAsp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln AlaThr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser ArgMet Ala Lys Tyr Glu Ala Arg Gly Asp Ser Glu Ser Thr Asp Arg Phe Asp Ala TrpGlu Ile Ser Ile Arg Asp Met Val Gly Gly Ser Tyr Gln His Gln Gly Thr Ile AsnGln Asp Met Pro Pro Met Gly Gly Ser Asn Ser Lys Gly Ala Tyr Gly Phe Asn ThrLeu Asn Lys Met Gly His Ile Tyr Cys Arg His Val Asn Arg Glu Thr Pro Thr GluVal Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gln Tyr Lys Asn Lys Ala Asn Val Asn Phe AspAla Thr Ala Val Thr Glu Thr Arg Glu Thr Ile Asn Thr Val Pro Val Ser Asn HisGly Gly Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Asn Thr
4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:
将含有重组质粒的阳性转化子和一个空质粒pGEX-4T-2转化的对照菌，接种至含4mlLB培养基的试管中，试管内培养基含氨苄霉素100μg／ml，37℃振荡培养4h，保存菌种并对于编号后，加IPTG至终浓度0.2mmol/L，继续在25℃下振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，第1-6号6个转化子均表达了相对分子量为39 kDa的埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白，表达量为25%，并选取1号菌种为高表达菌株，用于后面的蛋白纯化，而对照菌无此蛋白条带，见图4。
表达埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白的纯化
根据表达埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。我们所表达的埃可病毒9型的VP1表位融合蛋白融合有载体上的GST蛋白，表达的GST融合蛋白可很方便的用GSH琼脂糖凝胶FF分离，因此我们决定采用亲和层析法，用High-Affinity GST Resin进行纯化。具体步骤如下：
材料和方法
1.主要试剂：
High-Affinity GST Resin为南京金斯瑞生物科技有限公司产品，IPTG、DTT为BIOSHARP公司产品。其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。
2. 表达埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白工程菌的诱导表达及超声裂解：
把保存的1号菌株接种到含200ml LB液体培养基的三角烧瓶内，加氨苄霉素至终浓度100µg/ml,置37℃摇床内培养过夜。次日，将菌液接种到4个分别含200ml LB液体培养基的三角烧瓶，每瓶接种菌液50ml，置37℃摇床内振荡培养1小时，然后加IPTG至终浓度0.2mmol/L, 诱导表达4小时。
将诱导表达融合蛋白的1000ml工程菌离心(8000 rpm、20 min、4℃)收菌，菌体重悬于300ml的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘油)内，冰浴超声破菌10 min，离心(8000rpm、20 min、4℃)收集上清。收集的上清用于亲和层析纯化。
3．表达埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白的纯化：
上清溶液加已经平衡的High-Affinity GST Resin 10ml，4℃结合过夜，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS（含1mM PMSF）洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50mmol/L Tris-HCl pH8.5 ＋ 10mmol/L GSH，分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的埃可病毒9型VP1蛋白片段。
结果
将High-Affinity GST Resin凝胶柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示，经诱导明显表达出VP1-GST融合蛋白，表达产物主要存在于上清液中，分子量39kDa，见图5。洗脱测得的OD280=0.9，通过计算得浓度为0.8mg/ml， SDS-PAGE显示表达产物纯度在90%以上。
纯化的埃可病毒9型VP1表位融合蛋白的应用
将纯化的重组埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白用作抗原，免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体血清。采用间接ELISA法检测抗血清效价，结果证实，埃可病毒9型VP1表位融合蛋白具有较好的免疫原性和抗原性。
材料和方法
1.主要材料：
新西兰大白兔购自南京市浦口区莱芙养殖场，96孔酶标板为美国Costar公司产品，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为sigma公司产品，Goat Anti-rabbit IgG HRP为北京博奥森公司产品，TMB显色液为Beyotime公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。
2.动物免疫及抗血清制备：
挑取两只2kg左右的健康雌性新西兰大白兔，耳缘静脉取血约1ml，制备免疫前正常血清，作为阴性对照。首次免疫将纯化获得的埃可病毒9型VP1表位融合蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1:1在注射器内推成乳剂，进行背部皮下多点注射。在初次免疫后第2W、第4W将纯化获得的VP1表位融合蛋白与弗氏不完全佐剂按体积比1:1在注射器内推成乳剂，进行背部皮下多点注射。在第6W注射VP1表位融合蛋白，1W后取血检测血清效价。劲动脉取血，室温放置1h，4℃静置过夜，以3000rpm离心15 min，取上清，重复离心一次，取上清，即为得到的多克隆抗体，-20℃保存。
3.免疫动物血清的ELISA检测：
将纯化获得的埃可病毒9型VP1表位融合蛋白稀释至1μg／ml，每孔100μl包被96孔酶联板，4℃过夜。用TBST洗涤3次，每孔加20%的小牛血清封闭液150μl，37℃封闭2h。兔抗血清从1:1000开始稀释，阴性对照按相同比例稀释，37℃反应1h。PBST洗涤3次后，加入有HRP标记的山羊抗兔的IgG（1:5000），37℃反应30 min。PBST洗涤5次后，加入TMB显色液，37℃避光显色20 min，以1mol/L HCl终止反应，用酶标仪检测A450值。以P/N≥2.1的抗体最大稀释度作为效价终值。
结果
采用ELISA法检测抗血清的效价，兔抗血清从1:1000开始稀释，同时取免疫前的血清作为阴性对照，ELISA结果显示，VP1表位融合蛋白加强免疫后血清效价大于1:640000，阴性对照不显色，见图6。说明制备的埃可病毒9型VP1表位融合蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。
化学合成的VP1表位融合蛋白的基因片段序列表见附件文档：核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体。
埃可病毒9型的VP1蛋白抗原表位融合蛋白序列表
<110> 李越希
<120> 埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用
<160> 6
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 埃可病毒9型的VP1蛋白片段
<220>
<223> 含强抗原表位的埃可病毒9型的VP1蛋白片段，第75位氨基酸 — 第102位氨基酸，共28个氨基酸。
<400> 1
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 埃可病毒9型的VP1蛋白片段
<220>
<223> 含强抗原表位的埃可病毒9型的VP1蛋白片段，第127位氨基酸 - 第140位氨基酸，共14个氨基酸。
<400> 2
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 埃可病毒9型的VP1蛋白片段
<220>
<223> 含强抗原表位的埃可病毒9型的VP1蛋白片段，第204位氨基酸 - 第237位氨基酸，共34个氨基酸。
<400> 3
<210> 4
<211> 44
<212> PRT
<213> 埃可病毒9型的VP1蛋白片段
<220>
<223> 含强抗原表位的埃可病毒9型的VP1蛋白片段，第257位氨基酸 - 第300位氨基酸，共44个氨基酸。
<400> 4
<210> 5
<211> 128
<212> PRT
<213> 埃可病毒9型的VP1蛋白抗原表位融合蛋白
<220>
<223> 埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白，即将上述4段氨基酸序列通过2个甘氨酸和一个丝氨酸连接，构成总长度为128个氨基酸的序列。
<400> 5
<210> 6
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(384)
<223> 人工合成的基因片段，编码埃可病毒9型的VP1抗原表位融合蛋白。
<220>
<221> mis-feature
<222> (385)...(387)
<223> 合成基因时增加的终止密码子。
<400> 6

Claims (6)

1.一种埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由4段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段组成，4段蛋白片段之间由甘氨酸和丝氨酸连接，整合为全长128个氨基酸的融合蛋白，氨基酸序列如下：
。
2.权利要求1所述的埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其特征在于：所述的埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中4段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段具体为75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸，各段氨基酸序列如下：
Seqence1: 第75位aa － 第102位aa：
Seqence2:第127位aa － 第140位aa：
Seqence3:第204位aa － 第237位aa：
Seqence4:第257位aa － 第300位aa：
。
3.权利要求1所述的埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白的制备方法，其特征在于：采用基因工程技术表达、纯化制备该蛋白，具体方法如下：
埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析埃可病毒9型VP1蛋白的全氨基酸序列，筛选出4个含强抗原表位的蛋白片段，分别为第75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸含有较强的抗原表位；4段蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，构成总长度为128个氨基酸的融合蛋白；选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成该融合蛋白的全新基因序列，在合成的基因片段的5'端增加了BamHI的酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点（下画线部分），使合成的基因片段易于克隆至质粒pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I酶切位点内；
筛选的埃可病毒9型VP1蛋白内4个含强抗原表位的蛋白片段：
Seqence1: 第75位aa － 第102位aa：
Seqence2:第127位aa － 第140位aa：
Seqence3:第204位aa － 第237位aa：
Seqence4:第257位aa － 第300位aa：
4个含强抗原表位蛋白片段连接在一起形成融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列：
化学合成的埃可病毒9型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列（399bp）
表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白重组质粒的构建:
提取质粒pGEX-4T-2,用 BamHI和Xho I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内；同时用BamHI和Xho I双酶切化学合成埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白的基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内；
取等摩尔浓度的上述酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使化学合成埃可病毒9型VP1蛋白基因片段插入到载体pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白；
重组质粒的筛选与鉴定:
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨苄霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含pGEX-4T-2质粒的对照菌，接种至含4ml LB培养基（含氨苄霉素100μg／ml）的试管内振摇，分别提取质粒,用BamHI和Xho I双酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，切下399bp的目的基因片段；同时，将含有外源基因的质粒进行DNA测序分析，测序结果证实重组质粒含有埃可病毒9型表面蛋白VP1基因片段，序列完全正确：
构建的重组质粒表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（128个氨基酸），在其N端融合了载体上的226个氨基酸，全长354个氨基酸，其氨基酸序列如下：
表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含4ml LB培养基(含氨苄毒素100μg／ml)的试管内，37℃振荡培养4h，加IPTG至终浓度0.2mmol/L,继续振荡培养诱导4h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量为39kD的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白，而对照菌pGEX-4T-2无此蛋白条带；
表达埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白的纯化:
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000 rpm、20 min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1／10体积的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘油)内，冰浴超声破菌75次，8000rpm，4℃，离心20min收集上清；
收集的上清用于下一步的亲和层析纯化；
上清溶液加已经平衡的High-Affinity GST Resin 10 ml，4℃结合过夜，上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS（含1mM PMSF）洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50mmol/L Tris- HCl pH8.5 ＋ 10mmol/L GSH，分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白。
4.根据权利要求2所述的埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其特征在于：所述的埃可病毒9型VP1抗原表位融合蛋白中，4段含强特异性抗原表位的表面VP1蛋白片段，这4段VP1蛋白片段的单个或任意组合的融合蛋白。
5.权利要求1所述的埃可病毒9型表面蛋白VP1的融合蛋白，通过基因重组技术，也可利用酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
6.权利要求1或4所述的埃可病毒9型4个VP1蛋白片段的单个或任意组合的融合蛋白用于埃可病毒抗体检测试剂的制备，及用于免疫制备抗埃可病毒单抗和多抗制备。
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